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KR20250007549A - Nk 세포종양 치료제 - Google Patents

Nk 세포종양 치료제 Download PDF

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KR20250007549A
KR20250007549A KR1020247037662A KR20247037662A KR20250007549A KR 20250007549 A KR20250007549 A KR 20250007549A KR 1020247037662 A KR1020247037662 A KR 1020247037662A KR 20247037662 A KR20247037662 A KR 20247037662A KR 20250007549 A KR20250007549 A KR 20250007549A
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KR
South Korea
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antibody
cells
human
cell
tfr436
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Application number
KR1020247037662A
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요시다 코타니 아이
우카이 요시노리
마츠우라 타다시
케이스케 이시이
Original Assignee
토카이 유니버시티 에듀케이셔널시스템
가부시키가이샤 페르세우스 프로테오믹스
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Publication date
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Abstract

본 발명의 과제는 NK 세포종양 치료제를 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 NK 세포종양 치료제가 제공된다.

Description

NK 세포종양 치료제
본 발명은 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)를 인식하는 물질을 포함하는 NK 세포종양 치료제에 관한 것이다.
트랜스페린 수용체(transferrin receptor, TfR)는 트랜스페린(transferrin: Tf)과 결합한 철을 세포 내로 흡수하기 위한 세포막 구조로서, 처음에는 망상 적혈구 상에 있는 것으로 동정되었다. 그 후, TfR은 태반의 영양막 세포나, 활성화 림프구, 나아가 다양한 종양 세포 등에서 발현되는 것이 알려져 있다. 예를 들어, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 대장암, 위암, 방광암, 간암, 자궁 경부암, 뇌종양, 만성 림프성 백혈병 및 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 성인 T세포 백혈병에서 TfR의 고발현이 보고되었다. 또한, TfR은 다양한 암세포 표면에 고발현되고 정상세포에서의 발현이 낮아 암 치료의 분자 표적으로 인식되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 1에는 트랜스페린 수용체를 특이적으로 인식할 수 있는 항체 및 상기 항체를 이용한 항암제가 기재되어 있다.
한편, NK(natural killer cell) 세포종양으로는 1) 공격적 NK 세포 백혈병(aggressive NK-cell leukemia: ANKL), 2) 결절외 NK/T세포 림프종, 비강형(extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type: ENKL), 및 3) 만성 NK 세포 증식증(chronic lymphoproliferative disorders of NK cell: CLPD-NK)의 3가지 병태가 알려져 있다. 공격적 NK 세포 백혈병은 면역세포의 일종인 NK 세포에서 유래한 악성 림프종(혈액암)이다. 공격적 NK 세포 백혈병은 발병하면 급격히 병태가 악화되는 극증형 난치성 조혈계 악성질환(fulminant, refractory malignment disease)이다. 발병 사례는 아시아 및 중남미의 일부와 지역 한정적인 데다 일본의 신규 발병자 수는 연간 수십 명 정도라는 초희귀 질환이기 때문에, 그 발병 원인은 밝혀지지 않아 효과적인 표준 치료법의 조기 확립이 요구되고 있다.
1: 국제공개 WO 2014/073641호 공보
트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 항암제로서 사용하는 것은 알려져 있었으나, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질이 NK 세포종양에 대해 치료효과를 나타내는지 여부는 불분명하였다. 본 발명은 NK 세포종양의 치료제를 제공하는 것을 해결해야 하는 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 검토한 결과, 트랜스페린 수용체 결합물질이 NK 세포종양에 대해 치료효과를 나타내는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 의하면, 이하의 발명이 제공된다:
(1) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 NK 세포종양 치료제.
(2) NK 세포종양이 공격적 NK 세포 백혈병(aggressive NK-cell leukemia: ANKL), 또는 결절외 NK/T세포 림프종, 비강형(extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type: ENKL)인, (1)에 기재된 치료제.
(3) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질이 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체인, (1) 또는 (2)에 기재된 치료제.
(4) 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 인간 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체인, (3)에 기재된 치료제.
(5) 인간 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 인간 트랜스페린 수용체의 629번 내지 633번째 아미노산을 인식하는 항체 또는 인간 트랜스페린 수용체의 629번 내지 633번째 아미노산에 대한 다른 항체의 결합을 저해하는 항체인, (4)에 기재된 치료제.
(6) 상기 항체가 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 1, 2 및 3이며, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 4, 5 및 6인 항체인, (3) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재.
(7) 상기 항체가 중쇄가 서열번호 7을 갖고 경쇄가 서열번호 8을 갖는 항체인, (3) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 치료제.
(8) 항체가 인간 항체 또는 인간화 항체인, (3) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 치료제.
(9) 항체가 Fab, Fab', F(ab')2, 단일 가닥 항체(scFv), 다중 특이성 항체, 디설파이드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 항체 단편인, (3) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 치료제.
(A) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, NK 세포종양을 치료하는 방법.
(B) NK 세포종양 치료에 사용하기 위한 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질.
(C) NK 세포종양 치료제 제조를 위한 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질의 용도.
본 발명의 치료제는 NK 세포종양의 치료에 있어서 유용하다.
도 1은 각각의 TfR 변이 단편(mutant fragment)의 점 돌연변이(point mutation) 부위를 나타낸다.
도 2는 TfR436과 가용성 야생형(wild type) TfR(sTfR) 및 TfR 변이 단편(mutant fragment)의 반응성을 나타낸다.
도 3은 TfR436의 Tf-TfR 결합저해 활성을 나타낸다.
도 4는 TfR436에 의한 NK 세포종양 유래 세포주에 대한 세포독성 시험결과를 나타낸다.
도 5는 TfR436에 의한 마우스에서의 ANKL 세포 억제 효과를 나타낸다.
도 6은 TfR436에 의한 마우스에서의 ANKL 세포 억제 효과를 나타낸다.
도 7은 마우스 체중의 추이를 나타낸다.
도 8은 마우스의 생존 시험 결과를 나타낸다.
도 9는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 생체조건에서의 경합분석 방법을 나타낸다.
도 10은 간에서의 sgNT 또는 sgTFRC 도입 ANKL1-Cas9 세포 비교를 나타낸다.
도 11은 다양한 농도의 TfR436 항체로 처리한 ANKL 세포주의 생존율을 나타낸다.
도 12는 다양한 농도의 TfR436 항체로 처리한 초대(primary) ANKL 세포의 생존율을 나타낸다.
도 13은 ANKL-PDX 마우스를 이용한 TfR436 항체의 생체조건(in vivo)에서의 유효성을 검증하기 위한 절차를 나타낸다.
도 14는 마우스 CD45+ 세포에 대한 인간 CD45+ 세포의 비율을 나타낸다.
도 15는 ANKL1-PDX 마우스의 RNAseq 분석 방법을 나타낸다.
도 16은 RNA-seq 데이터의 볼케이노 플롯(volcano plot)을 나타낸다.
도 17은 ANKL 3 세포의 철분량 측정 결과를 나타낸다.
도 18은 TfR436 항체의 치료효과의 생체조건에서의 평가 절차를 나타낸다.
도 19는 ANKL1, ANKL3, ANKL5 PDX 마우스의 생존 곡선을 나타낸다.
도 20은 증상이 진행된 ANKL-PDX 마우스에서 TfR436 항체에 의한 치료효과를 평가하기 위한 절차를 나타낸다.
도 21은 증상이 진행된 ANKL1-PDX 마우스에서 TfR436 항체의 치료효과를 나타낸다.
도 22는 증상이 진행된 ANKL1-PDX 마우스에서 TfR436 항체의 치료효과를 나타낸다.
도 23은 TfR436 항체 또는 PBS로 처리한 ANKL1-PDX 마우스의 IVIS 분석을 나타낸다.
도 24는 TfR436 항체를 투여한 마우스의 간을 면역염색한 결과를 나타낸다.
이하에서는, 본 발명에 대해 보다 구체적으로 설명한다.
정의 및 일반기술
본 명세서에서 특별히 정의하지 않는 한, 본 발명에 대하여 사용된 과학기술용어는 당업자에게 통상 이해되고 있는 의미를 포함하는 것으로 한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 단백질 및 핵산화학, 및 혼성화에 대해 사용한 명명법 및 그 기술은 당해 기술분야에서 알려진 것으로 통상 사용된다.
본 발명의 제반 방법 및 기술은 일반적으로, 특정하지 않는 한, 당해 기술분야에서 주지되는 종래의 방법에 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐서 인용되어 설명한 여러가지 일반적 참조문헌과 보다 구체적인 참조문헌에 기재된대로 실행된다.
TfR
인간 트랜스페린 수용체(TfR)는 인간 3번 염색체에 암호화되는 760개의 아미노산으로 구성되는 일회성 막투과형 단백질(single-pass transmembrane protein)이다(서열번호 9). 이 단백질은 CD71 항원으로도 알려져 세포의 철 흡수에 관여하고, 세포의 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서의 TfR은 구조가 특별히 한정되지 않고, 단량체, 다량체, 세포막에서 발현된 천연형태(intact form), 세포 외 영역으로 구성된 가용화 형태(soluble form), 띠 형태(truncted form), 또한, 유전자 변이나 결손 등의 변이형태(mutation form), 인산화 등의 번역 후 수식(post-translational modification) 형태 등을 포함하여 모두 인간 TfR을 의미한다.
반응 및 반응성
본 명세서에서 '반응하다(react)'와 '반응성(reactivity)'은 특별히 한정하지 않는 한 동일한 것을 의미한다. 즉, 이들 용어는 항체가 항원을 인식하는 것을 의미한다. 이 항원은 세포막에서 발현되는 천연형 TfR이라도 좋고, 띠형이나 가용형이라도 무방하다. 또한, 입체구조를 유지한 TfR도 좋고, 변성된 TfR도 무방하다. 반응성을 검토하는 수단으로는 유세포분석법(FACS: flow cytometry), 효소결합면역흡착검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(Western-blot), 형광미량측정기술(FMAT: microfluorescence measuring technique), 표면 플라스몬공명(surface plasmon resonance, BI Acore), 면역염색(immunostaining), 면역침강(immunoprecipitation) 등이 있다.
유세포분석법에 사용하는 항체는 FITC 등의 형광물질, 비오틴 등에 의하여 표지된 항체나, 표지되지 아니한 항체라도 좋다. 사용한 항체의 표지 유무 및 그 종류에 따라, 형광표지 아비딘, 형광표지 항-인간 면역글로블린 항체 등을 사용한다. 반응성은 충분한 량의 항-TfR 항체(통상 최종농도가 0.01~10μg/mL)를 검체에 가하고, 음성대조 항체, 양성대조 항체의 반응성과 비교함으로써 평가할 수 있다.
트랜스페린 수용체를 인식하는 물질
　
본 발명에서는 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 사용한다. 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 핵산(핵산 앱타머(nucleic acid aptamer), 데코이 핵산(decoy nucleic acid) 등), 리보자임, 항체 및 그의 단편, 펩티드, 고리형 펩티드, 펩티드 모방체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 사용할 수 있다. 예를 들면, Wilner et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e21; doi:10.1038/mtna. 2012.14에는 트랜스페린을 모방한 앱타머가 기재되어 있다. 또한, Jae H. Lee et al., Eur. J. Biochem. 268, 2004-2012(2001)에는 트랜스페린 수용체를 표적으로 한 펩티드가 기재되어 있다. 본 발명에서는 이러한 핵산이나 펩티드 등을 사용할 수 있다.
항체
본 명세서에서는 필요에 따라, 이하의 약호(괄호 안)를 사용한다:
중쇄(H쇄), 경쇄(L쇄), 중쇄 가변영역(VH), 경쇄 가변영역(VL), 상보성 결정영역(CDR), 제1 상보성 결정영역(CDR1), 제2 상보성 결정영역(CDR2), 제3 상보성 결정영역(CDR3), 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3), 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3).
본 명세서에서 '항체(antibody)'라는 용어는 면역글로블린과 같은 의미로, 본 기술분야에서 통상 알려진 대로 이해되어야 한다. 구체적으로, 항체라는 용어는 항체를 만드는 임의의 특정방법에 의하여 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 항체라는 용어에는 그것에만 국한되지 않으나, 재조합 항체, 모노클로널 항체 및 폴리클로널 항체가 있다.
본 명세서에서 '인간 항체(human antibody)'라는 용어는 가변영역 및 불변영역의 서열이 사람 서열인 임의의 항체를 의미한다. 그 용어는 인간 유전자에서 유래하는 서열을 가지는데, 예를 들어 생각할 수 있는 면역원성의 저하, 친화성의 증대, 바람직하지 않은 접힘(folding)을 일으킬 가능성이 있는 시스테인을 제거하도록 변화시키는 항체를 포함한다. 그 용어는 인간 세포에 특이적이지 않은 글리코실화(glycosylation)할 수 있는 비인간 세포 내에서 재조합으로 만들어진 이러한 항체를 포함한다. 이들 항체는 여러 형태로 제조할 수 있다.
본 명세서에서 '인간화 항체(humanized antibody)'라는 용어는 비인간 유래 항체를 의미하며, 비인간 항체(non-human antibody) 서열에서 특징적인 아미노산 잔기가 인간 항체가 대응하는 위치로 인정되는 잔기로 치환된다. 이러한 '인간화(humanization)' 공정은 그 결과 얻어진 항체의 인체 면역원성을 저하시킬 것으로 예견된다. 당해 기술분야에서 알려진 기술을 사용하여 비인간 유래의 항체를 인간화할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 윈터(Winter) 등의 Immunol. Today 14:43~46(1993)을 참조하기 바란다. 대상으로 하는 항체는 CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인 및/또는 프레임워크 도메인을 대응하는 사람 서열으로 치환하는 치환 DNA 기술에 의해 공학적으로 작제할 수 있다. 예를 들어, WO92/02190 및 미합중국특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,792호, 제5,714,350호 및 제5,777,085호를 참조할 수 있다. 본 명세서에서 '인간화 항체(humanized antibody)'라는 용어는 그 의미의 범위 내에서 키메라 인간 항체 및 CDR 이식 항체를 포함한다.
항체의 가변영역에서 프레임워크 영역(FR)의 서열은 대응하는 항원에 대한 특이적 결합성에 실질적인 영향이 없는 한 특별히 한정되지 않는다. 인간 항체의 FR 영역을 이용하는 것이 바람직하지만, 사람 이외의 동물종(예를 들어, 마우스나 랫트)의 FR 영역을 이용할 수도 있다.
항체의 한 형태에 따르면, 가변영역(variable region)과 더불어 불변영역(constant region)을 포함한다(예를 들어, IgG형 항체). 불변영역의 서열은 특별히 한정되지 않는데, 예를 들면 공지의 인간항체의 불변영역을 사용할 수 있다. 인간 항체의 중쇄 불변영역(CH)으로는 인간 면역글로블린(이하에서는, 'hIgG'로 표기함)에 속하면 어떠한 것이든 좋으나 hIgG 등급이 적합하며, 나아가 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4와 같은 서브 클래스 모두 이용할 수 있다. 또한, 경쇄 불변영역(CL)은 hIg에 속하면 어떠한 것이든 가능하며, κ 클래스 또는 λ 클래스를 사용할 수 있다. 또한, 인간 이외의 동물종(예를 들어, 마우스나 렛트)의 불변영역을 이용할 수도 있다.
본 명세서에서 '개변체(modified form)'나 '개변항체(modified antibody)'란 친항체(parent antibody)의 가변영역(CDR 서열 및/또는 FR 서열)의 아미노산 서열에 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있는 것이다.
본 명세서에서 '친항체(parent antibody)'란, VH는 서열번호 7, VL은 서열번호 8로 나타내는 아미노산 서열을 가지는 TfR436 항체이다. 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개(예를 들어, 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개)의 아미노산이 결실, 부가, 치환 및/또는 삽입된다. TfR에 대한 결합활성을 가지는 항체의 아미노산 서열을 제조하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법으로는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 당업자라면 부위특이적 변이유발법(site-directed mutagenesis, 참조: Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y,, Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA, 82, 488-492) 등을 이용하여, TfR에 대한 결합활성을 가지는 항체의 아미노산 서열에 적절히 변이를 도입함으로써 TfR에 대한 결합활성을 가지는 항체와 기능적으로 동등한 개변항체를 제조할 수 있다. 이와 같이 항체의 가변영역 또는 불변영역에서 1개 또는 복수 개의 아미노산 변이를 포함하는 TfR에 대한 결합활성을 가지는 항체를 사용할 수도 있다.
본 명세서에서, '친항체와 동등한 활성(an activity equivalent to the activity of the parent antibody)'은 인간 TfR에 대한 결합활성이 동등함을 의미한다. '동등(equivalent)'이란 반드시 동일한 정도의 활성일 필요는 없고, 활성이 증강되도 되고, 또한, 활성이 있는 한 활성이 감소되도 무방하다. 활성이 감소하고 있는 항체로는, 원래 항체에 비해 30% 이상의 활성, 바람직하게는 50% 이상의 활성, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 활성, 좀 더 바람직하게는 90% 이상의 활성, 특히 바람직하게는 95% 이상의 활성을 가지는 항체를 예로 들 수 있다.
본 명세서에서, '결합 활성(binding activity)'이란 용어는 항원을 인식하는 정도를 의미한다. 이 항원은 세포막에서 발현되는 천연(intact) TfR이라도 좋고, 띠형(truncted form)이나 가용화형(soluble form)이라도 무방하다. 또한, 입체구조를 유지한 TfR도 좋고, 변성된 TfR도 무방하다. 결합활성을 측정하는 방법의 예로서는, 유세포분석법(FACS: flow cytometry), 효소결합면역흡착검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(Western-blot), 형광미량측정기술(FMAT: microfluorescence measuring technique), 표면 플라스몬공명(surface plasmon resonance, BI Acore) 등을 들 수 있다.
항체의 Tf-TfR 결합저해 활성은 후술하는 '실시예 2(2): Tf-TfR 결합저해에 있어서 TfR436 항체 및 타사 항체의 비교'에 기술된 방법에 따라 측정할 수 있다. TfR 용액을 기판(96-웰 플레이트 등)에 분주하여 정치하고 고상화하여 정지시킨다. 이어, HRP 표지한 Tf 용액을 분주하고, 항체를 첨가하여 실온에서 반응시킨다. 그런 다음, 기판을 세척하고 발색시약(TMB 등)을 첨가하여 반응시켜 플레이트 판독기로 흡광도를 측정한다. 상기 조작에 의하여 당해 항체가 Tf-TfR 결합저해 활성을 평가할 수 있다.
항체는 그 기원을 한정하지 않으며, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체 등 어떠한 동물 유래의 항체라도 무방하다. 또한, 키메라 항체, 인간화 항체 등도 좋다. 본 발명에서의 항체의 바람직한 태양의 하나는 인간 항체이다.
항체는 후술하는 항체를 생산하는 세포나 숙주나 정제방법에 따라, 아미노산서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄의 유무나 형태 등이 다를 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 기재되어 있는 아미노산 서열에 번역 후 수식을 받는 경우도 본 발명에 포함된다. 또한, 기존의 번역 후 수식 이외의 부위에 대한 번역 후 수식도, 본 발명에 포함된다. 또한, 항체를 원핵세포, 예컨대 대장균에서 발현시킨 경우 원래 항체의 아미노산 서열 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명에서는 이러한 항체를 사용해도 좋다. 기존의 번역 후 수식 이외의 부위에 대한 번역 후 수식도 본 발명에 포함된다.
항체의 작제
본 발명에서 사용하는 항체로는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 중 어느 것이라도 좋다. 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작될 수 있다.
항체로는 동물의 혈중에 생성되는 것, 하이브리도마에 의해 생성되는 것, 및 유전공학적 방법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에 의해 생성되는 것, 파지 디스플레이에 의해 클론 라이브러리로부터 최적의 항체가 스크리닝되어 그 유전자를 CHO 세포로 생산한 것, 또는 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 직접 인간 항체를 얻을 수 있는 것 등을 들 수 있다.
폴리클로날 항체를 제조하기 위해서는, 항원을 토끼 등의 동물에 면역시켜 혈청을 수득한다. 얻어진 혈청을 예를 들어 황안 침전(ammonium sulfate precipitation), 프로테인 A 컬럼(protein A column), 프로테인 G 컬럼(protein G column), DEAE 이온교환 크로마토그래피(DEAE-ion exchange chromatography), 친화성 컬럼(affinity column) 등에 의해 정제함으로써, 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해서는, 항원을 원하는 바에 따라 어쥬번트와 함께 동물에 면역한다. 면역된 동물의 혈청 중 원하는 항체 수준이 상승하는 것을 확인한 다음, 동물에게서 면역세포(비장세포 등)를 채취하여 포유동물인 미엘로마 세포와 세포융합시킨다. 세포융합에 의해 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택배지, 예를 들면 HAT 배지(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배지)에 배양함으로써 선택할 수 있다. 이후 한계희석법을 이용하여 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별할 수 있다.
이하에서는, 파지 디스플레이법(phage display method)에 의한 항체의 제조에 대해 설명한다.
(1) 파지 디스플레이 라이브러리에 의해 항원과 반응하는 scFv
파지 디스플레이 기술(phage display technique)을 사용하여 TfR에 대한 친화성이 다양한 항체의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리를 제공할 수 있다. 그런 다음, 이러한 라이브러리를 스크리닝하고, TfR에 대한 항체를 동정하고 단리할 수 있다. 바람직한 것은 인간 B세포에서 분리된 mRNA에서 만들어진 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성되는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리이다. 이러한 라이브러리를 만들어 스크리닝하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 인간 TfR을 항원으로서 스크리닝한 반응성을 나타내는 파지 클론으로부터 유전물질을 회수한다. 선택된 파지의 유전자를 분석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 암호화하는 VH 및 VL의 DNA 서열을 결정할 수 있다. 이 scFv의 서열을 이용하여 scFv를 IgG화하면 인간 항체를 수득할 수 있다.
(2) scFv의 IgG화 (인간 항체의 작제)
H 사슬 또는 L 사슬의 발현벡터를 만들어 숙주세포에서 발현시킨다. 분비된 상등액을 회수하고 정제하여 인간항체를 취득한다. 또한, VH 및 VL을 동일 벡터에서 발현시킴으로써(탠덤형, tandem type), 인간 항체를 취득할 수도 있다. 이러한 방법은 널리 알려져 있으며, WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/1236, W093/19172, WO95/01438, WO95/15388, WO97/10354 등을 참고하여 실행될 수 있다.
구체적으로, VH를 암호화하는 DNA를 중쇄 불변영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자와 연결함으로써 완전장 중쇄 유전자를 취득할 수 있다. 인간 중쇄 불변영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에서 알려져 있으며(예를 들어, Kabat, E. A. 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역이 좋으나, 가장 바람직한 것은 IgG1 또는 IgG2의 불변영역이다. IgG1 불변영역 서열은 Gm(1), Gm(2), Gm(3)이나 Gm(17) 등 서로 다른 개인 간에 생기는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립유전자(allele) 또는 알로타입(allotype)을 포함할 수 있다. 이들 알로타입은 IgG1 불변영역 중 천연에 존재하는 아미노산 치환에 해당한다.
VL을 암호화하는 DNA를 경쇄 불변영역 CL을 암호화하는 다른 DNA 분자와 연결함으로써 완전장 L 사슬 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)를 취득할 수 있다. 인간 경쇄 불변영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에서 알려져 있으며(예를 들어, Kabat, E.A. 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준적인 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다, 경쇄 불변영역은 κ 또는 λ의 불변영역으로 좋다. κ 불변영역은 Inv(1), Inv(2), Inv(3) 등 서로 다른 개인간에 생기는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립 유전자이다. λ 불변영역은 3가지 λ 유전자 중 어느 것에서 유래하는 것이라도 좋다.
상기와 같이 얻은 H 사슬 또는 L 사슬을 암호화하는 DNA를 발현벡터 내에 삽입함으로써 발현벡터를 만들어 숙주세포에서 발현시키고 분비한 상등액의 회수·정제에 의해 인간 항체를 취득한다. 발현벡터로는 플라스미드, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스(AAV), 컬리플라워 모자이크 바이러스나 담배 모자이크 바이러스 등의 식물 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀(episome) 등을 들 수 있다. 발현벡터 및 발현조절 서열은 사용하는 발현용 숙주세포와 적합하도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터 내에 삽입할 수 있으며, 양쪽 유전자를 같은 발현벡터 내에 삽입할 수도 있다. 항체 유전자를 표준적인 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편상의 상보적인 제한부위와 벡터의 연결, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활말단 연결)에 의해 발현벡터 내에 삽입한다.
적합한 벡터는 상술한 바와 같이 임의의 VH 또는 VL 서열을 쉽게 삽입하여 발현시킬 수 있도록 공학적으로 작제된 적당한 제한부위를 가지는 기능적으로 완전한 사람 CH 또는 CL 면역글로블린 서열을 암호화하는 것이다. 이러한 벡터에서는 일반적으로 삽입된 J 영역 중의 스플라이스 공여 부위(splice donor site)와 인간 C 도메인에 선행하는 스플라이스 수용 부위(splice acceptor site) 사이에서, 또는 인간 CH 엑손 내에 존재하는 스플라이스 영역에서도 스플라이싱이 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사종결은 코드영역 하류 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현벡터는 또한, 숙주세포에서 유래된 항체 사슬 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수도 있다. 항체사슬 유전자는 신호 펩티드가 인프레임(in-frame)으로 면역글로블린 사슬의 아미노 말단과 연결되도록 벡터 내에 클론화할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로블린(immunoglobulin) 신호 펩티드도 좋고, 또는 이종성(heterogeneous) 신호 펩티드(즉, 비면역글로블린 단백질 유래 신호 펩티드)도 무방하다.
항체의 발현벡터는 항체 유전자 및 제어서열 외에 숙주세포 내에서의 벡터의 복제를 제어하는 서열(예를 들어, 복제기점(replication origin))이나 선택 마커유전자(selective marker gene) 등의 서열을 가져도 된다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포의 선택을 촉진한다. 예를 들어, 보통 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포 상에 G418, 하이그로마이신이나 메토트렉세이트 등의 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자에는 탈수소엽산 환원효소(DHFR) 유전자(dhfr-숙주세포에서 메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 사용함), 네오마이신 포스포전달효소 유전자(G418 선택용) 및 글루탐산 합성효소 유전자가 있다.
이상의 방법으로 작제된 항체 유전자 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환한다. 숙주세포로는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등 항체를 생산시킬 수만 있다면, 어떤 세포라도 좋지만 동물세포가 바람직하다. 동물세포로는 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO/dhfr(-) 및 CHO/DG44, 원숭이 유래세포 COS 세포(참조: A. Wright & S. L. Morrison, J. Immunol. 160, 3393-3402(1998)), SP2/O 세포(마우스 미엘로마)(참조: K. Motmans, Eur. J. Cancer Prev. 5, 512-5199(1996), R. P. Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495-1502(1990)) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 형질전환에는 리포펙틴법(lipofectin method, 참조: R. W. Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 6007(1989), P. L. Felgner et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413(1987)), 전기천공법(electroporation method), 인산칼슘법(calcium phosphate method)(참조: F. L. Graham & A. J. van der Eb, Virology 52,456-467 (1973)), DEAE-덱스트란법(DEAE-Dextran method) 등의 방법을 이용하는 것이 바람직하다.
형질전환체를 배양한 후 형질전환체의 세포 내 또는 배양액에서 인간 항체를 분리한다. 항체의 분리, 정제에는 원심분리(centrifugation), 유안분획(ammonium sulfate fractionation), 염석(salting-out), 한외여과(ultrafiltration), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 겔여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography) 등의 방법을 적절히 조합하여 이용할 수 있다.
항체단편
　
항체에 기반하거나 항체를 암호화하는 유전자의 서열정보를 기초로 하여 항체단편을 만들 수 있다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv 항체를 예로 들 수 있다.
Fab은 IgG를 시스테인 존재 하에서 파파인(papain) 소화함으로써 얻을 수 있는 L 사슬과 H 사슬 가변영역 및 CH1 도메인 및 힌지부의 일부로 이루어진 H 사슬 단편으로 구성된 분자량 약 5만의 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 파파인 소화함으로써 얻을 수 있다. 또한, 상기 항체의 H 사슬 일부 및 L 사슬을 암호화하는 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 Fab를 제조할 수도 있다.
Fab'은 후술하는 F(ab')2의 H 사슬간 이황화 결합을 절단함으로써 얻어지는 분자량이 약 5만인 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 펩신(pepsin) 소화하고, 환원제를 사용하여 이황화 결합을 절단함으로써 얻는다. 또한, Fab과 마찬가지로, F(ab')2 를 암호화하는 DNA를 이용하여 유전공학적으로 제조할 수도 있다.
F(ab')2는 IgG를 펩신 소화함으로써 얻을 수 있는 L 사슬과 H 사슬 가변영역 및 CH1 도메인 및 힌지부 일부로 구성된 H 사슬 단편과 함께 구성된 단편(Fab')이 이황화 결합으로 결합한 분자량 약 10만의 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 펩신 소화함으로써 얻을 수 있다. 또한, Fab과 마찬가지로 F(ab')2를 암호화하는 DNA를 이용하여 유전공학적으로 제조할 수도 있다.
scFv는 H 사슬 가변영역과 L 사슬 가변영역으로 구성된 Fv를, 한쪽 사슬의 C 말단과 다른 쪽 N 말단을 적당한 펩티드 링커로 연결하여 단일 사슬화한 항체 단편이다. 펩티드 링커로서는 예를 들어 유연성이 높은 (GGGGS)3 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역을 암호화하는 DNA와 펩티드 링커를 암호화하는 DNA를 사용하여 scFv 항체를 암호화하는 DNA를 구축하고, 이를 적당한 벡터에 삽입하여 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 scFv를 제조할 수 있다.
dsFv는 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역의 적절한 위치에 Cys 잔기를 도입하여 H 사슬 가변영역과 L 사슬 가변영역을 이황화 결합으로 안정화시킨 Fv 단편이다. 각 사슬에서의 Cys 잔기 도입 위치는 분자 모델링에 의해 예측되는 입체구조에 근거해 결정할 수 있다. 본 발명에서는 예를 들어 상기 항체의 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역의 아미노산 서열로부터 입체구조를 예측하고, 이러한 예측에 따라 변이를 도입한 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역을 각각 암호화하는 DNA를 구축한 다음, 이를 적당한 벡터에 삽입하고 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 dsFv를 제조할 수 있다.
또한, 적당한 링커를 이용하여 scFv 항체, dcFv 항체 등을 연결하거나 스트렙토아비딘을 융합시킴으로써, 항체 단편을 다량체화(multmerization)할 수도 있다.
다중특이성 항체
　
항체는 한쪽이 TfR을 인식한다면, 동시에 그 이외의 표적도 인식하는 다중특이성 항체(multi-specific antibody)라도 좋다. 특히, 이중특이성 항체(bispecific antibody)는 자주 이용된다.
이중특이성 항체는 한쪽이 TfR을 인식하는 분자로 다른 쪽이 다른 분자를 표적으로 하는 분자가 조합된 항체를 나타낸다. 예를 들어, 2분자의 모노클로날 항체를 화학적으로 가교함으로써 얻어지는 이중특이성(mab)2, 2분자의 Fab 단편을 화학적으로 가교함으로써 얻어지는 이중특이성 F(ab')2, quadroma, bsDb(bispecific diabody), scBsDb(single-chain bispecific diabody), scBsTaFv(single-chain bispecific tandem variable domain), Bite(bispecific T cell Engager antibody), DNL-F(ab)3(docl-and-lock trivalent Fab) 등을 열거할 수 있으나(참조: Eng, H. Bispecific Antibodies and Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy: Technological Considerations. Biomolecules 2020, 10, 360), 형태는 이에 한정되지 않는다.
NK 세포종양
NK 세포종양으로는 공격적 NK 세포 백혈병(aggressive NK-cell leukemia: ANKL), 결절외 NK/T세포 림프종, 비강형(extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type: ENKL), 및 만성 NK 세포증다증(chronic lymphoproliferative disorders of NK 세포: CLPD-NK)의 3가지 병태를 예로 들 수 있다.
의약 조성물 및 제제
본 발명의 NK 세포종양 치료제는 의약조성물 또는 제제로 제공될 수 있다.
본 발명의 NK 세포종양 치료제는 NK 세포종양 치료를 필요로 하는 대상에서 NK 세포종양 치료를 위해 사용할 수 있다
본 발명의 NK 세포종양 치료제는 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질에 더해 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 담체를 포함한다. 적절한 담체로는 생리적 식염수, 인산완충 생리식염수, 인산완충 생리식염수 글루코스액 및 완충 생리식염수가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또는, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질은 동결건조(freeze-drying)) 또는 동결하고, 필요할 때 상기와 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성하여 사용해도 된다. 투여 형태로는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등에 의한 경구 투여 또는 주사제(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강내 주사 등), 경피(經皮)·경점막(經粘膜)·경비(經鼻)·경폐(經肺)·좌약(坐藥) 등에 의한 비경구 투여를 예로 들 수 있다.
본 발명의 NK 세포종양 치료제의 투여량은 증상, 나이, 체중 등에 따라 다르나, 일반적으로 경구투여에서는 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질의 양으로 성인에게 1일 약 0.001mg/kg 내지 1,000 mg/kg이며, 이들을 1회 또는 여러 차례로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여에서는 1회 약 0.001mg/kg 내지 1,000 mg/kg을 피하주사, 근육주사 또는 정맥주사로 투여할 수 있다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에서는 국제공개 WO2014/073641호 공보의 단락 [0090] 및 [0091]에 기재되어 있는 TfR436 항체를 사용하였다.
TfR436 항체의 CDR서열은 다음과 같다:
VH CDR1: SYGMH (서열번호 1)
VH CDR2: VISYDGSNKYADSVKG (서열번호 2)
VH CDR3: DSNFWSGYYSPVDV(서열번호 3)
VL CDR1: TRSSGSIASNSVQ (서열번호 4)
VL CDR2: YEDTQRPS (서열번호 5)
VL CDR3: QSYDSAYHWV (서열번호 6)
TfR436 항체의 VH서열 및 VL서열은 다음과 같다:
TfR436 VH(서열번호 7)
ＤＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＦＫＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤNＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＮＦＷＳＧＹＹＳＰＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
TfR436 VL(서열번호 8)
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＳＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＡＰＩＴＶＩＹＥＤＴＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＱＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＡＹＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＡＶＬ
TfR436 항체의 결합부위 동정
TfR436 항체는 마우스 TfR과 교차 반응하지 않지만, 햄스터 TfR와 교차 반응성을 나타내었다. TfR에서의 트랜스페린(TF) 결합부위(569번 내지 760번째 아미노산)의 아미노산 서열을 정렬하였다. 인간 TfR 서열에서 햄스터와 같고, 마우스와는 다른 아미노산을 선택하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 선택된 아미노산을 점 돌연변이(point mutation)시키고, 가용성 TfR 변이 단편을 작제하였다.
(1) 가용성 야생형 TfR(sTfR) 및 TfR 변이 단편(MF1~MF7)의 작제
　 인간 TfR 세포외 영역(89번 내지 760번째 아미노산), 또는 도 1에 나타낸 각각 TfR 변이 단편(MF1~MF7)과 AAARGGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(서열번호 10)를 암호화하는 염기서열을 전체 합성하였다. 발현벡터 pCAGGS(비특허문헌 2: Niwa et al. 1991)에 네오마이신 내성 유전자와 DHFR 유전자를 함유하는 벡터의 멀티클로닝 사이트에 각각 합성한 유전자를 삽입하고, pCAGGS-Neo-DHFR-sTFR-myc-his 발현 플라스미드를 작제하였다. Expifectamine(Thermo Fischer Scientific)을 이용하여 Expi293 세포(Thermo Fischer Scientific)에 상기 플라스미드를 트랜스펙션하고, 37℃, 8% CO2, 135rpm의 조건에서 5일간 배양하였다. 그런 다음, 원심분리하여 배양 상등액을 회수한 다음, AKTA prime(Cytiva)에 HisTrapHP(Cytiva) 컬럼을 접속하고, 결합용 완충용액으로 20mM Imidazole/DPBS, 용출용 완충용액으로는 500mM 이미다졸/DPBS를 이용하여 sTfR 또는 MF1~MF7을 정제하였다. 용출된 단백질은 Zeba spin column(Thermo Fischer Scientific)을 이용하여, 30mM HEPES, 5% 트레할로스(trehalose), pH 7.2로 완충용액 교환하였다.
(2) TfR436 항체의 결합부위 동정
　 상기에서 정제한 sTfR 또는 MF1~MF7을 PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween 20, TaKaRa)로 희석하고, 600ng/mL으로부터 3배 희석을 7단계로 실시하였다. 그런 다음, Ni-NTA HisSorb Strips 96-웰 플레이트(QIAGEN)에 희석액을 100μL/웰로 분주하여 진탕기에 옮기고 실온에서 반응시켰다. 1시간 후 PBST 완충용액으로 5회 세정하고, TfR436 항체(1ug/mL)를 100μL/웰에 분주하여 진탕기에 옮기고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, PBST 완충용액으로 5회 세정하고 50,000배 희석한 2차 항체 F(ab')2 Fragment Anti-Human IgG Fcγ(Jackson Immuno Research) 100μL/웰로 분주하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST 완충용액으로 5회 세척한 다음, TMB Soluble Reagent (High Sensitivity) (Scy Tek)를 100μL/웰로 분주하고, 실온, 암소 조건에서 3분간 반응시켰다. 그런 다음, TMB 정지용 완충용액(Stop Buffer(Scy Tek))을 100μL/웰로 첨가하고 1분간 진탕기에서 진탕한 다음, 플레이트 판독기로 450nm(ref: 620nm)에서의 흡광도를 측정하였다.
　 그 결과를 도 2에 나타내었다. TfR 436 항체는 TfR 변이 단편 MF5와의 반응성 저하가 나타났지만, 기타 변이 단편와의 반응성 저하는 나타나지 않았다. 즉, TfR의 629번째, 630번째, 633번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하면, TfR436 항체가 TfR로 인식하지 못하게 된다. 아미노산 제629번 내지 제633번은 TfR436 항체의 인식 에피토프(epitope)임이 시사되었다.
Tf-TfR 결합저해에 있어서 TfR436 항체 및 비교용 항체의 비교
(1) 비교용 항체 A24의 작제
　 특허문헌 US2008/0193453에 인간 TfR에 대한 A24 항체가 기재되어 있다. TfR436 항체와 이 항체를 비교하기 위하여 기탁받은 하이브리도마를 입수하여 항체를 생산하였다. 구체적으로, 하이브리도마를 RPMI1640(GIBCO), FBS 10%의 배지에 세포농도가 1~2 x 105/mL가 되도록 하여, 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 확대 배양(cell expansion) 후 원심분리하여 세포를 회수하여 PBS로 2회 세정하고, 무혈청 배지 cosmedium 005(코스모바이오), 0.5% Nutridoma-CS(Roche)에서 다시 550mL가 될 때까지 확대 배양하였다. 세포가 콘플루엔트(confluent)가 되고 5일 후, 원심분리하여 배양 상등액을 회수하였다.
　 회수된 상등액을 프로테인 A 담체(Ab-Capcher ExTra: 프로테노바사)에 적용하고, 프로테인 A와 결합하고 있는 항체를 0.1M 글리신 염산 완충용액(pH 2.7)으로 용출하고, 신속하게 1M Tris 염산 완충액(pH 8.5)으로 중화하였다. 그런 다음, 울트라셀 한외여과 디스크(Merck)를 이용하여 완충용액을 PBS로 교환하였다.
(2) Tf-TfR 결합저해에 있어서 TfR436 항체 및 타사 항체의 비교
실시예 1에 기재된 sTfR을 PBST로 5.0μg/mL가 되도록 조정한 다음, MaxiSorp 96-웰 플레이트(Nunc)에 희석액을 100μL/웰로 분주하여 4℃에서 하룻밤 정치하여 고상화하였다. 다음날 고상액(solid phase liquid)을 버리고, 100% 블록 에이스(Block Ace, DS Pharma Biomedical) 200μL/웰로 실온에서 정지시켰다. 1시간 후 PBST 완충용액으로 5회 세정한 다음, HRP 표지한 Tf(2μg/mL) 50μL/웰을 분주하고, 추가로 TfR436 항체, A24 항체(10μg/mL에서 2배 희석) 또는 holo-Tf(Sigma) 300μg/mL에서 2배 희석)로 첨가한 것)을 50μL/mL로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBST 완충용액으로 5회 세척하고 TMB Soluble Reagent(High Sensitivity)를 100μL/웰로 분주하여 실온 암소에서 반응시켰다. 25분 후, TMB 정지용 완충용액을 100μL/웰의 양으로 첨가하고, 1분간 진탕기에서 진동시킨 다음, 플레이트 판독기로 450nm(ref: 620nm)의 흡광도를 측정하였다.
　 그 결과를 도 3에 나타내었다. TfR436 항체는 훨씬 낮은 용량으로(100ng/mL) 완전히 Tf-TfR의 결합을 저해하였다. 반면, A24 항체는 10μg/mL의 용량으로도 완전히 Tf-TfR의 결합을 저해할 수 없고, Tf-TfR의 결합을 50% 밖에 저해할 수 없었다. 이로써, Tf-TfR의 결합저해 측면에서 TfR436 항체가 우수하다는 것이 시사되었다.
세포독성시험(in vitro)
　 세포로서 KHYG-1, NK92, SNK1, SNK10, SNK6를 사용하였다.
　 KHYG-1, NK92는 ANKL 세포로부터 수립한 세포주이고, SNK1, SNK10, SNK6는 ENKL 세포로부터 수립한 세포주이다. ENKL은 ANKL과 같은 NK 세포종양인 결절외 NK/T 세포 림프종, 비강형(extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type: ENKL)이다. 적당량의 세포수(cell line은 3×104, 환자유래 세포는 5×105)를 Artemis-Medium 1 +2% human serum 800μL로 24웰 플레이트 18웰에 파종하였다. 각 농도(10,000ng/mL, 1,000ng/mL, 100ng/mL, 10ng/mL, 1ng/mL, 0ng/mL)가 되도록 TfR436 항체를 배양액 중에 첨가하였다. 37℃에서 48시간 배양하였다(5% CO2 조건).
　 각 웰(well)별 원심분리로 세포 회수 후 지적 농도(각 시약 첨부문서 참조)에 FACS 완충용액(1% FBS 후나코시; PBS 후나코시)로 희석한 항-인간 CD45-APC 항체와 항-인간 CD56-PE 항체(Biolegend)로 15분간 염색하였다(항체 염색은 세포주에서는 불필요함).
　 FACS 완충용액으로 세척하고, 500μL/웰의 FACS 완충용액으로 다시 세포 부유액을 조정하였다. 각 웰당 low speed, 30초간 고정으로 유세포분석기(flow cytometer, Becton Dickenson)로 APC 양성·PE 양성 세포 집단의 이벤트 수를 계수하여 생존 세포수로 기록하였다. 0 ng/mL를 대조구로서 각 농도에서의 생존 세포수의 비율을 계산하여 플롯하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
항체 투여 유무 마우스에서의 IVIS와 조직상을 나타내는 7~11주령의 암컷 NOG 마우스 1마리당 렌티바이러스(lentivirus)로 반딧불 루시페라제 유전자를 도입한 환자 유래 ANKL 세포(1×106씩)를 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여 5일 후, 7일 후, 14일 후, 18일 후, 25일 후 이소플루란(isoflurane)에 의한 흡입 마취로 전신 마취를 도입한 마우스에 루시페린(luciferin) 150 mg/kg을 복강 내 투여하고, 투여 10분 후부터 시간 경과에 따라 IVIS로 통상 감도·1분간 노광으로 촬상하였다. TfR436 항체는 투여 후 6일째 투여하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
　간과 비장을 4% 포르말린으로 고정한 후 박편(thin section)을 제작하여 EBER in situ 혼성화(Bond ISH EBER; Probe, #PB0589)하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
7~11주령의 암컷 NOG 마우스 1마리당 1×106의 환자 유래 ANKL 세포를 투여하였다. 투여 5일 후, 8일 후, 12일 후, 15일 후 TfR436 항체 20 mg/kg(PBS로 총량 200μL로 증량) 또는 PBS 200μL를 마우스에 투여하였다. 피크 체중(peak body weight)에서 15% 이상의 체중 감소, 현저한 쇠약(자력 보행이 어려운 수준) 또는 사망을 인도적 평가변수(humane endpoint)로 설정하고, 평가변수까지의 일수를 Kaplan-Meier법으로 분석하였다.
　 도 7에는 마우스의 체중 추이를, 도 8에는 마우스의 생존 시험 결과를 각각 나타낸다.
CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 생체조건에서의 경합분석(competitive assay)
　
도 9는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 생체조건에서의 경합분석 방법을 나타낸다. 암컷 NOD/Sci-scid, IL2-Rgnull(NOG) 마우스에 환자 유래 ANKL 세포를 꼬리정맥 투여하고 3-4주 후 간에서 ANKL 세포를 채취한다(이하에서는 환자 유래 세포(ANKL1)를 투여한 마우스는 'PDX 마우스'라 한다). 이 ANKL 세포를 FUGW-Cas9-Venus vector(lentiCas9-Blast(Addgene, 비영리 플라스미드 뱅크)에 YFP(Venus)를 삽입개변)로 형질 도입하고, 이를 ANKL1-Cas9 세포로서 새로운 NOG 마우스에 꼬리정맥 투여하고, 수립된 PDX 마우스 간으로부터 3-4주 후에 회수하였다. 그런 다음, Venus의 발현을 기준으로 세포 선별기(cell sorter)로 세포를 선별한 후, 이를 NOG 마우스에 다시 투여하였다. 이 회수-선별-투여 공정을 2회 수행하여 순수 Venus+ANKL(ANKL-Cas9) 세포를 수득하였다. ANKL-Cas9 세포는, 그 후의 실험에 이용하기 위해 동결 보존하였다. 그 후 CSII-sgRNA-mOrange 벡터(CSII 벡터: RIKEN #RDB04378에 대하여 Mol Ther. 2002 Mar;5(3):242-51. doi: 10.1006/mthe. 2002.0549. PMID: 11863413에 기재된 렌티바이러스 패키징 유전자를 클로닝한 것)을 이용하여 트랜스페린 수용체 항체 유전자를 표적으로 한 싱글 가이드 RNA (sgTFRC) 및 인간 유전자 배열 상에 존재하지 않는 배열을 표적으로 한 싱글 가이드 RNA(sgNT)를 ANKL-Cas9 세포에 도입하고 48시간 후, 세포 선별기에서 hCD45+mOrange+ 세포(싱글 가이드 RNA에 의해 표적 유전자가 녹아웃된 ANKL 세포, 2,000세포 대 1,000세포의 비율로 혼합하고 이를 마우스에 이식 투여한다. 3-4주 후, 간에서 ANKL 세포를 채취하여 hCD45+mOrange+ 세포의 존재비율을 분석함으로써, 표적 유전자 녹아웃이 간 내 생존능력에 미치는 변화를 분석하였다.
도 10은 간에서의 sgNT 또는 sgTFRC 도입 ANKL1-Cas9 세포 비교를 나타낸다. 도 9의 방법으로 수립한 sgNT 또는 sgTFRC를 도입한 ANKL1-Cas9 세포를 NOG 마우스에 이식하고 0일째 및 14일째에 마우스 간에서의 mOrange+ 세포의 비율(n=3)을 유세포분석법을 이용하여 분석하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, sgTFRC 도입 ANKL1-Cas9 세포는 TFRC가 결손된 것을 확인하였다. 도 10의 결과로부터, 공격적 NK 세포의 TFRC를 녹아웃함으로써 공격적 NK 세포의 증식을 억제할 수 있다(공격적 NK 세포가 생존할 수 없게 된다)는 것이 밝혀졌다.
다양한 농도의 TfR436 항체로 처리한 ANKL 세포주의 생존율
　 도 11은 다양한 농도의 TfR436 항체로 처리한 ANKL 세포주의 생존율을 보여준다. 웰 주변 1,000개의 NK 세포 백혈병 세포주(NK92, KHYG-1)에 대해 다양한 농도의 TfR436 항체를 96시간 처리한 후의 각 세포주의 생존율을 MTT 세포수 측정 키트(Nacalai Tesque, #23506-80)로 평가하였다. 각각의 세포주의 IC50은 NK92; 1155ng/mL, KHYG-1; 242ng/mL였다.
다양한 농도의 TfR436 항체로 처리한 초대 ANKL 세포(primary ANKL 세포)의 생존율
　 도 12는 다양한 농도의 TfR436 항체로 처리한 초대 ANKL 세포의 생존율을 나타낸다. 각 ANKL 환자세포(ANKL1, ANKL3, ANKL5)를 꼬리 정맥주사함으로써 이식하고 3-4주 경과 후 PDX 마우스의 간에서 얻은 ANKL 세포를 웰 주변 1,000개 파종하고, 다양한 농도의 TfR436 항체로 48시간 처리한 후에 실험실 조건에서의 생존율을 MTT 세포수 측정 키트(Nacalai Tesque, #23506-80)로 평가하였다. 각 환자 유래 세포에서의 IC50은 ANKL1; 117 ng/mL, ANKL3; 754 ng/mL, ANKL5; 262 ng/mL였다.
ANKL-PDX 마우스를 이용한 TfR436 항체의 생체조건에서의 유효성 검증
　 도 13은 ANKL-PDX 마우스를 이용한 TfR436 항체의 생체조건에서의 유효성을 검증하기 위한 절차를 나타낸다. ANKL1 세포를 NOG 마우스에 정맥주사하여 이식하고, 7일 후에 TfR436 항체를 0, 1, 3, 10 mg/kg의 용량으로 투여하고, 11일 후에 채혈하였다. 14일째에는 살처분하고 간장으로부터 ANKL 세포를 채취하였다.
　 도 14는 마우스 CD45+ 세포에 대한 인간 CD45+ 세포의 비율을 나타낸다. TfR436 항체를 0, 1, 3, 10 mg/kg 투여한 ANKL1-PDX 마우스 이식 후 11일째와 14일째 말초혈에서 마우스 CD45+ 세포에 대한 인간 CD45+ 세포의 비율을 유세포 분석기로 분석하였다(왼쪽). ANKL1-PDX 마우스의 TfR436 항체의 0, 1, 3, 10 mg/kg 투여 간에서의 체중 당 간 중량(n=4)을 측정한 결과(오른쪽), TfR436 항체를 투여함으로써 PDX 마우스 간에서의 ANKL 세포 증식이 억제되었다.
ANKL1-PDX 마우스의 RNAseq 분석
　 도 15는 ANKL1-PDX 마우스의 RNAseq 분석방법을 나타낸다. 1 x 106 세포의 ANKL1 세포를 NOG 마우스에 꼬리정맥 주사하여 수립한 PDX 마우스에 대하여 ANKL1 세포 투여 14일 후 TfR436 항체(10 mg/kg) 또는 PBS를 꼬리정맥 투여하고, 투여 8시간 후 간에서 ANKL 세포를 채취한 후 RNAseq 분석(n=3)을 수행하였다.
　 도 16은 RNA-seq 데이터의 볼케이노 플롯(volcano plot)을 나타낸다. 가로축에 발현량비, 세로축에 -log10(조정 p값)을 플롯한 결과, TFRC가 두드러진 변화를 나타내었다.
ANKL3 세포 철분량 측정
　 도 17은 ANKL3 세포의 철분량 측정 결과를 나타낸다.
(방법) ANKL3 세포를 0, 1, 10, 100, 1000, 10000 ng/mL의 TfR436 항체로 실험실 조건에서 처리하고 48시간 후에 세포 내 철 이온 측정시약(Ferro Orange(등록상표); Dojindo, #342-09533)으로 염색하고, 공초점 현미경으로 형광 강도를 정량함으로써 세포 내 Fe2+ 농도를 측정하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. TfR436 항체의 처리량에 따라 세포 내 Fe2+ 양이 감소하였다.
TfR436 항체 치료효과 생체조건에서의 평가(in vivo evaluation)
　
도 18은 TfR436 항체의 치료효과의 생체조건에서의 평가 절차를 나타낸다. ANKL-PDX 마우스에 1 x 106개의 ANKL 세포를 이식한 후, 5, 8, 12, 15일차에 PBS 또는 10 mg/kg의 TfR436 항체를 투여하고 평가변수까지 모니터링하였다.
　 도 19는 ANKL1, ANKL3, ANKL5 PDX 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. 7~11주령의 암컷 NOG 마우스 1마리당 1×106의 환자 유래 ANKL 세포를 투여하였다. 투여 5, 8, 12, 15일째에 TfR436 항체를 10 mg/kg(PBS로 총량 200μL로 증량) 또는 PBS 200μL를 마우스에 투여하였다. 피크 체중에서 15% 이상의 체중 감소, 현저한 쇠약(자력 보행이 어려운 수준) 또는 사망을 인도적 평가변수로 설정하고 평가변수까지의 일수를 Kaplan-Meier법으로 분석하였다(각 군에서 n=3~4). 체중은 14일째 몸무게로 보정하였다. 모든 ANKL 세포에서 생존 기간이 연장되었다.
증상이 진행된 ANKL-PDX 마우스에서의 TfR436 항체에 의한 치료효과 평가
　 도 20은 증상이 진행된 ANKL-PDX 마우스에서 TfR436 항체에 의한 치료효과 평가 절차를 나타낸다. ANKL-PDX 마우스에 ANKL1 세포를 이식 후 쇠약해진 시점에 PBS 또는 TfR436 항체를 투여하고 평가변수(endpoint)까지 모니터링하였다.
　도 21 및 도 22는 증상이 진행된 ANKL1-PDX 마우스에서 TfR436 항체의 치료효과를 나타낸다. 7~11주령의 암컷 NOG 마우스 1마리당 1×106의 환자 유래의 ANKL 세포를 투여하였다. 투여 14일 후, 17일 후, 21일 후, 24일 후 TfR436 항체를 10 mg/kg(PBS로 총량 200μL로 증량) 또는 PBS 200μL를 PDX 마우스에 투여하였다.
　피크 체중에서 15% 이상의 체중감소, 현저한 쇠약(자력보행이 어려운 수준) 또는 사망을 인도적 평가변수(humane endpoint)로 설정하고, 평가변수까지의 일수를 Kaplan-Meier법으로 분석하였다(n=6). 체중은 14일째 체중으로 보정하였다. 증상이 진행된 PDX 마우스에서도 TfR436 항체 투여로 생존 기간이 연장되어, 치료효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
TfR436 항체 또는 PBS로 처리한 ANKL1-PDX 마우스의 IVIS 분석
　 도 23은 TfR436 항체 또는 PBS로 처리한 ANKL1-PDX 마우스의 IVIS 분석을 나타낸다. 7~11주령의 암컷 NOG 마우스 1마리당 렌티바이러스(lentivirus)에서 반딧불 루시페라제 유전자를 도입한 환자 유래의 ANKL 세포(1×106씩)를 꼬리 정맥에 투여하여 PDX 마우스를 수립하였다. ANKL1 세포 투여 14일 후, 17일 후, 21일 후, 24일 후 TfR 436 항체(10 mg/kg) 또는 PBS를 꼬리 정맥주사하였다.
　 투여 14일 후, 17일 후, 21일 후, 24일 후(모두 TfR436 항체 또는 PBS 투여 직전)에 이소플루란에 의한 흡입 마취로 전신 마취를 도입한 마우스에 루시페린(luciferin) 150 mg/kg을 복강 내 투여하고 투여 10분 후부터 시간 경과에 따라 IVIS에서 통상 감도·1분간 노광하여 촬상하였다. TfR436 항체 투여로 ANKL 세포가 소실되었다.
TfR436 항체의 치료효과
　
도 24는 TfR436 항체를 투여한 마우스의 간을 면역염색한 결과를 나타낸다. 1 x 106 세포의 ANKL1 및 ANKL3를 각각 2마리씩 다른 NOG 마우스에 투여하여 PDX 마우스를 수립하였다. 각각 한 마리씩 수립 14일 만에 간을 적출하였다. 나머지 한 마리씩 수립 14일 후, 17일 후, 21일 후, 24일 후 TfR436 항체 10 mg/kg을 꼬리정맥 투여하고, 25일 후 간을 적출하였다. 적출한 간은 신속하게 적당량을 4% 포르말린으로 고정하여 박편을 만들고, Helatoxylin-Eosin 염색 및 임상진단 규격의 항 인간 CD56 항체를 이용한 면역염색을 수행하였다. 스케일 바, 100μm. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. 투여 25일 후 ANKL 세포가 관찰되지 않는 것으로 보아 치료효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 NK 세포종양 치료제.
  2. 제1항에 있어서,
    NK 세포종양이 공격적 NK 세포 백혈병(aggressive NK-cell leukemia: ANKL), 또는 결절외 NK/T세포 림프종, 비강형(extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type: ENKL)인 것을 특징으로 하는 치료제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    트랜스페린 수용체를 인식하는 물질이 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 치료제.
  4. 제3항에 있어서,
    트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 인간 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 치료제.
  5. 제4항에 있어서,
    인간 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 인간 트랜스페린 수용체의 629번 내지 633번째 아미노산을 인식하는 항체 또는 인간 트랜스페린 수용체의 629번 내지 633번째 아미노산에 대한 다른 항체의 결합을 저해하는 항체인 것을 특징으로 하는 치료제.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 항체가 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 1, 2 및 3이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 4, 5 및 6인 항체인 것을 특징으로 하는 치료제.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 항체가 중쇄는 서열번호 7을 갖고, 경쇄는 서열번호 8을 갖는 항체인 것을 특징으로 하는 치료제.
  8. 제3항에 있어서,
    항체가 인간 항체 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 치료제.
  9. 제3항에 있어서,
    항체가 Fab, Fab', F(ab')2, 단일 가닥 항체(scFv), 다중 특이성 항체, 디설파이드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 치료제.

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