KR20230145961A - 단백질 제제의 안정성 향상을 위한 단백질 마이크로비드의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 제제의 안정성 향상을 위한 단백질 마이크로비드의 제조 방법에 관한 것으로서, 단백질에 트레할로스를 혼합하고 SPG 멤브레인 유화 기술을 이용하여 n-옥탄올에서 단백질을 탈수시킬 경우 입자 크기 분포가 좁고 가역성이 높은 마이크로비드가 형성되며, 이는 단백질 용액에 비해 외부 충격 또는 고온 스트레스에 대해 높은 안정성을 나타내는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 단백질 마이크로비드 제조 방법은 고농도 단백질 의약품 등의 제조에 적용하여 보관 안정성을 향상시키기 위한 방법으로서 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

단백질 제제의 안정성 향상을 위한 단백질 마이크로비드의 제조 방법 {Method for manufacture of protein microbead for improving stability of protein therapeutics}

본 발명은 단백질 제제의 안정성 향상을 위한 단백질 마이크로비드의 제조 방법에 관한 것이다.

고 부가가치 생물 제제 및 고농축 치료용 단백질에 대한 대규모 생산과 협력하여 보다 경제적인 기술에 대한 수요가 증가하고 있다. 상기 수요는 10 g/L 이상의 단백질을 증가시키는 업스트림 생산성을 크게 향상 시켰다. 바이오매스와 불순물을 제거하는 추가 정제 단계 후, 용액은 용기로 충진되거나 장기 보관을 위해 바이알에서 동결 건조된다. 최근에는 동결 건조 공정에 비해 그 자체로 투여하는 것이 편리하고 제조 비용이 저렴하여 치료용 단백질 취급 과정에서 미리 충전된 주사기 또는 카트리지(즉, 쉽게 충전된 약물 용액)가 선호되고 있다. 그럼에도 불구하고, 단백질의 장기 저장 안정성은 사전 충전된 주사기보다 동결 건조 바이알에서 더 높기 때문에 약물 함량의 변화율이 최소화된다.

액체 제형의 단백질은 건조된 고체 상태보다 물리적 변성에 더 취약하다. 예를 들어, 용기에 단백질 용액을 전달하는 것과 같은 주입 펌프 작동은 계면 스트레스로 인해 단백질성 입자를 유발할 수 있다. 더욱이, 단백질이 로드된 플라스틱 주사기를 튕기거나 떨어뜨려 잘못 취급할 경우 실리콘 오일과 캐비테이션(cavitation)으로 인해 단백질성 입자를 유발할 수도 있다. 마찬가지로, 단백질성 입자는 제조 중 또는 투여 직전에 다양한 기계적 스트레스에 의해 실질적으로 발생할 수 있다.

이와 관련하여, 전이 용융 온도(T _m)는 고농도의 에타네르셉트(etanercept)에서 더 높았지만 가속화된 저장 안정성 테스트 동안 더 높은 단량체 손실이 관찰되었다. 결과는 단백질 응집이 특히 고농축 단백질 제형의 경우 제조 후 중요한 문제가 될 것임을 시사했다. 이에, 액상 제제는 단백질 응집을 최소화하기 위하여 통상 100 mg/mL 이하 농도 제한이 있으나, 피하 투여를 위한 일반적인 주사량은 1.5 mL 미만으로 제한된다. 이는 주사된 약물을 밀어낼 수 있는 피하 조직의 배압과 더 큰 부피로 투여할 때 발생하는 주사 통증 때문인 것으로 알려져 있다. 이에, 고농축 단백질 제형은 통상 150 mg/mL 이상 작은 부피에 적합해야 한다.

단백질 응집을 최소화하는 방법 중 하나는 충돌 횟수를 줄이기 위해 단백질의 이동성을 제한하는 것이며, 적절한 부형제를 사용한 동결 건조는 단백질 이동성을 최소화하여 단백질 안정성을 향상시키고 단백질 응집을 억제할 수 있다. 더욱이, 단백질 용액에서 물을 제거하면 가수 분해 반응이 최소화되어 구조적 유연성이 제한된다. 이러한 이유로 동결 건조는 냉동 및 건조 공정 모두에서 단백질 안정성 측면에서 잘 검증된 공정을 통해 단백질을 탈수시키는 데 자주 사용된다. 그러나, 동결 건조된 단백질은 투여 전에 재구성 되어야 하기 때문에 단백질의 동결 건조는 궁극적인 해결책이 아니며, 이것은 단백질이 고농도의 재수화에 대한 문제를 해결하는 지점이다. 더욱이, 동결 건조된 단백질의 침전물은 낮은 유동성으로 인해 추가 제약 공정에 적합하지 않다. 결과적으로, 그 자체로 투여하기 위한 사전 충전 주사기로 제조하기 위해서는 비용이 더 많이 필요하다. 그러나, 저온 보관을 피하는 장기 보관에 더 효율적일 수 있다.

한편, 일반적으로 "마이크로 캡슐"이라는 용어는 코어 물질을 포함하는 50 nm에서 2 mm 사이의 크기를 가진 구형 입자로 정의된다. 그러나 단백질 침전물은 외부 층에 대한 추가 처리 없이 단백질의 단일 분산이다. 본 발명에서는 상기 단백질 침전물을 "단백질 마이크로비드"로 명명하였다. 이는 실제로 건조된 고체 상태의 마이크론 크기의 구체이며, 다루기 쉽고 잠재적으로 재구성 없이 그 자체로 주입될 수 있다.

이론적으로 비혼화성 유기 용매에서 단백질의 탈수는 실온에서 가능하여 빠른 고체화를 초래할 수 있다. 이전 연구에서는 안정적이고 가역적인 단백질 침전물 생성에 있어서, 다양한 침전 조건을 관찰하기 위해 리소자임을 평가하였으며, 침전물은 비혼화성 유기 용매에서 탈수될 때 가역적이었다. 그러나 침전물은 느린 탈수 속도(즉, 30 rpm 쉐이킹)로 인한 것으로 추측되는 결정과 단백질 마이크로비드의 혼합물이었다.

이에, 본 발명자들은 광범위한 입자 크기 분포를 가져와 일관되지 않은 방출 프로파일과 효능을 유발할 수 있는 기존 단백질 침전 방법의 문제점을 극복하고, 보다 안정적이고 가역적인 단백질 마이크로비드를 형성하고 이의 크기 분포 범위를 좁힐 수 있는 방법을 개발하여, 고농도의 단백질 제제 제조 시 안정성 유지 등에 적용하고자 하였다.

F. Qi, J. Wu, T. Yang, G. Ma, Z. Su, Acta Biomater, 10 (2014) 4247-4256.

본 발명자들은 단백질 제제에서 단백질의 응집을 억제하는 등 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있는 방법에 대해 연구한 결과, 유기 용매를 이용한 단백질의 탈수, 부형제의 첨가, 및 SPG 멤브레인 유화 기술을 이용하여 단백질 마이크로비드를 제조할 경우, 외부 충격, 고온 등에 안정적이고 가역성이 높으며 좁은 크기 분포를 나타내는 것을 확인하였으며, 이때 단백질 마이크로비드 제조에 있어서 유기 용매의 종류, 부형제의 종류, SPG 멤브레인 유화 기술의 사용 유무에 따른 마이크로비드의 크기, 안정성 등을 비교함으로써 최적의 조건을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 단백질 마이크로비드의 제조 방법 및 상기 제조 방법으로 제조된 단백질 마이크로비드를 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 하기 단계를 포함하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법을 제공한다:

(a) 단백질을 공정용 안정화제 및 유기 용매에 혼합하여 제조한 에멀젼을 교반(stirring)하고 단백질을 탈수하는 단계;

(b) 상기 에멀젼을 교반하고 단백질을 탈수하여 생긴 침전물을 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및

(c) 상기 상층액 제거 후 건조하는 단계.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 단백질은 항체, 압타머, 융합 단백질, Fc 융합 단백질, PEG 화 단백질, 합성 폴리펩티드, 단백질 단편, 리포단백질, 효소, 호르몬, 면역원성 단백질, 구조 펩티드, 및 펩티드 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 유기 용매는 물과 섞이지 않는 비수성 유기 용매로서 f(water saturation fraction) 값이 0.5 이하인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 유기 용매는 카보네이트계, 에스테르계, 에테르계, 케톤계, 알코올계, 비양성자성 용매, 및 이들의 이성질체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 유기 용매는 n-옥탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 공정용 안정화제는 희석제 및 사카라이드(saccharide)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 공정용 안정화제는 트레할로스, 만니톨, 및 수크로오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (a) 단계에서 에멀젼을 교반하기 전 시라스 다공성 유리(Shirasu porous glass, SPG) 멤브레인 또는 마이크로 칩을 통해 단백질을 유화시키는 단계를 더 포함하여 단백질 마이크로비드의 입자 형태 및 크기를 균일하게 만들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질 마이크로비드는 가역성이 90 % 내지 100 %일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질 마이크로비드는 물리적 충격 또는 40 ℃ 내지 70 ℃의 고온 스트레스에 대한 안정성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (a) 단계에서 탈수는 10초 내지 20분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 건조는 25 ℃ 내지 40 ℃에서 24시간 내지 130 시간 동안 50 mTorr 내지 300 mTorr의 압력으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질 마이크로비드는 주사제, 흡입제, 패취제, 및 외용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 단백질 마이크로비드로서,

상기 단백질 마이크로비드는 가역성이 90 % 내지 100 %이고, 물리적 충격 또는 40 ℃ 내지 70 ℃의 고온 스트레스에 대한 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드를 제공한다.

본 발명은 단백질에 트레할로스를 혼합하고 SPG 멤브레인 유화 기술을 이용하여 n-옥탄올에서 단백질을 탈수시킬 경우 입자 크기 분포가 좁고 가역성이 높은 마이크로비드가 형성되며, 이는 단백질 용액에 비해 외부 충격 또는 고온 스트레스에 대해 높은 안정성을 나타내는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 단백질 마이크로비드 제조 방법은 고농도 단백질 의약품 등의 제조에 적용하여 보관 안정성을 향상시키기 위한 방법으로서 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 BSA 마이크로비드의 제조에서 비 SPG 방법을 순서대로 간략하게 도식화한 것이다.
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 n-옥탄올에서 생성된 BSA 마이크로비드의 SEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 1c 내지 1e는 본 발명의 일 구현예에 따른 BSA 마이크로비드의 재구성 후 나타나는 BSA의 생물리학적 특성을 나타낸 것으로서, 도 1c는 동적 광산란(DLS)으로 BSA의 크기 분포를 확인한 도면이고, 도 1d는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 BSA의 단량체 가역성을 확인한 도면이며, 도 1e는 시차 주사 열량 측정법(DSC)으로 BSA의 폴딩 가역성을 확인한 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 IgG 마이크로비드의 제조에서 SPG 방법을 순서대로 간략하게 도식화한 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 SPG 멤브레인 유화 시스템을 위한 소규모 장비의 개략도 및 볼텍싱을 이용한 단백질 탈수 과정을 나타낸 도면이다.
도 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 진공 건조 전 비 SPG 방법 및 SPG 방법을 이용하였을 때의 마이크로비드 관찰 결과를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 2d는 본 발명의 일 구현예에 따른 진공 건조 후 비 SPG 방법 및 SPG 방법을 이용하였을 때의 마이크로비드 관찰 결과를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 SPG 방법으로 제조된 IgG 마이크로비드의 탈수 시간에 따른 박스-차트(box-chart) 기반 입자 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 SPG 방법으로 제조된 IgG 마이크로비드의 탈수 시간에 따른 평균 입자 크기를 나타낸 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 구현예에 따른 SPG 방법으로 제조된 IgG 마이크로비드의 탈수 시간에 따른 입자 농도를 나타낸 도면이다.
도 3d는 본 발명의 일 구현예에 따른 단일 IgG 마이크로비드의 FI 이미지를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3e는 본 발명의 일 구현예에 따른 응집된 IgG 마이크로비드의 FI 이미지를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3f는 본 발명의 일 구현예에 따른 비 SPG 방법에서 IgG 마이크로비드의 가역성을 확인한 도면이다.
도 4a는 본 발명의 일 구현예에 따른 비 SPG 방법 및 SPG 방법으로 제조된 IgG 마이크로비드의 부형제 사용 여부 및 온도에 따른 박스-차트 기반 입자 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 비 SPG 방법 및 SPG 방법으로 제조된 IgG 마이크로비드의 부형제 사용 여부 및 온도에 따른 평균 입자 크기를 나타낸 도면이다.
도 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 비 SPG 방법 및 SPG 방법으로 제조된 IgG 마이크로비드의 부형제 사용 여부 및 온도에 따른 입자 농도를 나타낸 도면이다.
도 4d는 본 발명의 일 구현예에 따른 SPG 방법으로 제조된 IgG 마이크로비드의 부형제 사용 여부 및 온도에 따른 SEM 이미지 결과를 확인한 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한5 mg/mL의 IgG 마이크로비드의 가역성을 확인한 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한100 mg/mL의 IgG 마이크로비드의 가역성을 확인한 도면이다.
도 5c는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 DSC 온도 기록을 나타낸 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80을 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 건조 조건에 따른 박스-차트 기반 입자 크기를 나타낸 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80을 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 건조 조건에 따른 입자 크기의 평균 값 및 스팬 값을 나타낸 도면이다.
도 6c는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80을 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 건조 조건에 따른 입자 농도를 나타낸 도면이다.
도 6d는 본 발명의 일 구현예에 따른 두 개의 상이한 초기 IgG 농도에서 PS80을 사용하여 제조한 5 mg/mL IgG 마이크로비드의 단량체 가역성을 나타낸 도면이다.
도 6e는 본 발명의 일 구현예에 따른 두 개의 상이한 초기 IgG 농도에서 트레할로스를 사용하여 제조한 5 mg/mL IgG 마이크로비드의 단량체 가역성을 나타낸 도면이다.
도 6f는 본 발명의 일 구현예에 따른 50 mg/mL의 IgG 초기 농도에서 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 100 mg/mL의 IgG 마이크로비드의 단량체 가역성을 나타낸 도면이다.
도 6g는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 IgG 초기 농도에 따른 박스-차트 기반 입자 크기를 나타낸 도면이다.
도 6h는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 IgG 초기 농도에 따른 입자 크기의 평균 값 및 스팬 값을 나타낸 도면이다.
도 6i는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 IgG 초기 농도에 따른 입자 농도를 나타낸 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일 구현예에 따른 165 mg/mL IgG 용액이 담긴 바이알을 50 cm 높이에서 떨어뜨렸을 때 변화를 확인한 도면이다.
도 7b는 본 발명의 일 구현예에 따른 165 mg/mL IgG 마이크로비드가 담긴 바이알을 50 cm 높이에서 떨어뜨렸을 때 변화를 확인한 도면이다.
도 7c는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 낙하 스트레스에 대한 단량체 가역성을 나타낸 도면이다.
도 7d는 본 발명의 일 구현예에 따른 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드의 열 스트레스에 대한 단량체 가역성을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 IgG 용액 및 마이크로비드의 단일 근육 주사 후 래트 혈청에서 IgG의 평균 농도-시간 프로파일을 나타낸 도면이다.

본 발명의 일 실험예에서는 에탄올, 에소프로필 알코올(IPA), 펜탄올, 및 n-옥탄올을 사용하여 BSA 마이크로비드를 탈수시킨 결과, 다른 용매에 비해 n-옥탄올에서 BSA 마이크로비드의 결정이나 불순물이 전혀 나타나지 않았고, 응집체를 형성하지 않았으며 높은 가역성을 나타내는 것을 확인하였다(실험예 1 참조).

본 발명의 다른 실험예에서는 IgG 마이크로비드 형성에 대한 SPG 멤브레인의 영향을 확인한 결과, 마이크로비드 제조 시 SPG 멤브레인을 사용할 경우 입자 형태가 균일하고 더 작은 크기를 나타내는 것을 확인하였다(실험예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 IgG 마이크로비드 형성에 대한 탈수 시간의 영향을 확인한 결과, 가장 최적의 탈수 시간은 30초인 것을 확인하였다(실험예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 IgG 마이크로비드 형성에 대한 온도 및 부형제의 영향을 확인한 결과, 실온(RT)에 비해 4 ℃에서, PS80 및 트레할로스를 부형제로 사용한 경우 입자 크기가 작고, 입자 크기 분포가 좁은 것을 확인하였다(실험예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 PS80 및 트레할로스에 의한 IgG 마이크로비드의 가역성을 확인한 결과, PS80에 비해 트레할로스를 사용한 경우 더 높은 가역성을 나타내는 것을 확인하였다(실험예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 IgG 마이크로비드 형성에 대한 건조 조건 및 초기 농도의 영향을 확인한 결과, 35 ℃에서 진공 압력을 200 mTorr로 48시간 동안 건조하는 조건을 최적의 조건으로 확인하였으며, IgG의 초기 농도는 50 mg/mL일 때에 비해 10 mg/mL일 때 마이크로비드의 가역성이 더 높은 것을 확인하였다(실험예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 IgG 마이크로비드에 낙하 및 열 스트레스를 가했을 때 PS80에 비해 트레할로스를 사용한 마이크로비드의 경우 가역성이 높게 나타나, 트레할로스를 사용한 마이크로비드는 안정성이 높은 것을 확인하였다(실험예 7 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 래트에서 재구성된 IgG 마이크로비드의 PK 프로파일을 확인한 결과, 전반적으로 재구성 후 IgG 마이크로비드는 시판된 제품에서 유래된 IgG와 PK 프로파일에서 거의 동일하게 나타난 것을 확인하였다(실험예 8 참조).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법을 제공한다:

(a) 단백질을 공정용 안정화제 및 유기 용매에 혼합하여 제조한 에멀젼을 교반하고 단백질을 탈수하는 단계;

(b) 상기 에멀젼을 교반하고 단백질을 탈수하여 생긴 침전물을 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및

(c) 상기 상층액 제거 후 건조하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 단백질 마이크로비드를 제공한다.

본 발명에 있어서, “단백질”은 전형적으로 약 1-3000 kiloDaltons(kDa)의 분자량을 가지는 아미노산 서열 (즉, 폴리펩티드)를 의미한다. 약 1 kDa 이상의 분자량을 가지는 폴리펩티드는 본 발명의 목적을 위한 단백질인 것으로 간주된다. 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이, 충분한 사슬 길이를 가지는 폴리펩티드는 3차 또는 4차 구조를 가질 수 있는 반면, 더 짧은 폴리펩티드는 3차 또는 4차 구조를 결여할 수 있다. 광범위한 바이오폴리머가 용어 "단백질" 범위 내에 포함된다. 예컨대, 상기 단백질은 항체, 압타머, 융합 단백질, Fc 융합 단백질, PEG 화 단백질, 합성 폴리펩티드, 단백질 단편, 리포단백질, 효소, 호르몬, 면역원성 단백질(예를 들어, 백신 내 사용되는 것과 같은), 구조 펩티드, 펩티드 약물 등을 포함하는, 치료 단백질 또는 비-치료 단백질을 의미할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 단백질은 소혈청 알부민(BSA) 및 면역 글로불린 G(IgG)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 마이크로비드는 단백질 마이크로비드 그 자체로 제공되거나, 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있으며, 이때 상기 단백질은 치료 단백질일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 단백질 마이크로비드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 비경구용 주사제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 외용제(점막)는 크림, 겔, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

연고제는 공지 또는 통상 사용되고 있는 처방에 의해 제조된다. 예컨대, 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 기제에 연화(硏和; levigate), 또는 용융시켜 제조된다. 연고 기제는 공지 또는 통상 사용되고 있는 것으로부터 선택된다. 예컨대, 고급 지방산 또는 고급 지방산 에스테르(미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 미리스트산에스테르, 팔미트산에스테르, 스테아린산에스테르, 올레인산에스테르 등), 납류(밀랍, 경랍, 세레신 등), 계면활성제(폴리옥시에틸렌알킬에테르인산에스테르 등), 고급 알코올(세타놀, 스테아릴알코올, 세토스테아릴알코올 등), 실리콘유(디메틸폴리실록산 등), 탄화수소류(친수 바셀린, 백색 바셀린, 정제 라놀린, 유동 파라핀 등), 글리콜류(에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 매크로골 등), 식물유(피마자유, 올리브유, 참깨유, 테레핀유), 동물유(밍크유, 난황유, 스쿠알란, 스쿠알렌 등), 물, 흡수 촉진제, 염증 방지제로부터 선택되는 것 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 이용된다. 보습제, 보존제, 안정화제, 항산화제, 착향제 등을 더 함유하고 있어도 좋다.

겔제는 공지 또는 통상 사용되고 있는 처방에 의해 제조된다. 예컨대, 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 기제에 용융시켜 제조된다. 겔 기제는 공지 또는 통상 사용되고 있는 것으로부터 선택된다. 예컨대, 저급 알코올(에탄올, 이소프로필알코올 등), 겔화제(카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 등), 중화제(트리에탄올아민, 디이소프로판올아민 등), 계면활성제(모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 등), 검류, 물, 흡수 촉진제, 염증 방지제로부터 선택되는 것 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 이용된다. 보존제, 항산화제, 착향제 등을 더 함유하고 있어도 좋다.

크림제는 공지 또는 통상 사용되고 있는 처방에 의해 제조된다. 예컨대, 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 기제에 용융 또는 유화시켜 제조된다. 크림 기제는 공지 또는 통상 사용되고 있는 것으로부터 선택된다. 예컨대, 고급 지방산 에스테르, 저급 알코올, 탄화수소류, 다가 알코올(프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등), 고급 알코올(2-헥실데칸올, 세타놀 등), 유화제(폴리옥시에틸렌알킬에테르류, 지방산 에스테르류 등), 물, 흡수 촉진제, 염증 방지제로부터 선택되는 것 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 이용된다. 보존제, 항산화제, 착향제 등을 더 함유하고 있어도 좋다.

리니먼트제는 공지 또는 통상 사용되고 있는 처방에 의해 제조된다. 예컨대, 하나 또는 그 이상의 활성물을 물, 알코올(에탄올, 폴리에틸렌글리콜 등), 고급 지방산, 글리세린, 비누, 유화제, 현탁화제 등으로부터 선택되는 것 단독 또는 2종 이상으로 용해, 현탁 또는 유화시켜 제조된다. 보존제, 항산화제, 착향제 등을 더 함유하고 있어도 좋다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 흡입제에는 에어로솔제, 흡입용 분말제 또는 흡입용 액제가 포함되며, 이 흡입용 액제는 물 또는 다른 적당한 매체에 용해 또는 현탁시켜 사용하는 형태라도 좋다. 이들 흡입제는 공지의 방법에 준하여 제조된다. 예컨대, 흡입용 액제의 경우에는 방부제(염화벤잘코늄, 파라벤 등), 착색제, 완충화제(인산나트륨, 아세트산나트륨 등), 등장화제(염화나트륨, 농글리세린 등), 증점제(카르복시비닐 폴리머 등), 흡수 촉진제 등을 필요에 따라 적절하게 선택하여 조제된다.

흡입용 분말제의 경우에는 활택제(스테아린산 및 그의 염 등), 결합제(전분, 덱스트린 등), 부형제(젖당, 셀룰로오스 등), 착색제, 방부제(염화벤잘코늄, 파라벤 등), 흡수 촉진제 등을 필요에 따라 적절하게 선택하여 조제된다.

흡입용 액제를 투여할 때에는 통상 분무기(아토마이저, 네뷸라이저)가 사용되며, 흡입용 분말제를 투여할 때에는 통상 분말 약제용 흡입 투여기가 사용된다.

분무제, 흡입제, 스프레이제는 일반적으로 이용되는 희석제 이외에 아황산수소나트륨과 같은 안정제와 등장성을 부여하는 완충제, 예컨대 염화나트륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산과 같은 등장제를 함유하고 있어도 좋다.

본 발명에 따른 패취제에는 통상의 조성성분으로서 흡수촉진제, 용해제, 용해보조제, 점착성고분자 등이 더 포함될 수 있다.

상기 용해제로는 알칼리금속의 수산화물 수용액; 트리에탄올아민, 디에탄올아민, 에탄올아민, 이소프로판올아민, 디이소프로판올아민에서 선택된 알칸올아민; 알킬아민인 이소프로필아민, 디이소프로필아민, 트리에틸아민, 디에틸아민 및 에틸렌디아민에서 선택된 알킬아민중에서 선택된 아민류를 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 알칼리금속의 수산화물은 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화 리튬에서 선택될 수 있다.

상기 용해보조제로는 에탄올, 이소프로필알콜, 메틸프로판올, 메틸렌클로라이드, 메틸에틸케톤, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르, 글리세롤, 아세틸아세톤, 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, N-알킬 피롤리딘 및 트윈 80 중에서 시약을 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 흡수촉진제로는 라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르를 포함하는 라우릴에테르; 올레일알콜, 스테아릴알콜을 포함하는 지방산 알콜; 올레인산, 라우릴산, 팔미탈산, 스테아린산, 카프린산, 카프릴산 및 미리스틴산 중에서 선택된 지방산; 이소프로필 미리스트레이트, 프로필렌글리콜 카프릴레이트, 프로필렌글리콜 라우레이트, 폴리에틸렌글리콜 라우레이트, 프로필렌글리콜 올레에이트를 포함하는 지방산 에스테르; 그리고 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 라우릴 디메탄올아미드를 포함하는 지방산 알칸올아미드 중에서 선택된 단독 또는 2종이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 점착성 고분자로는 아크릴계 수지와 함께 아크릴레이트 중합체, 비닐아세테이트-아크릴레이트, 아크릴레이트-아크릴아마이드 공중합체, 또는 이들의 혼합물을 사용하고, 필요에 따라 로진계 수지, 폴리테르펜 수지, 석유계 수지, 테르펜 페놀 수지, 천연 또는 합성고무류, 실리콘 중합체 중에서 단독 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 단백질 마이크로비드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 단백질 마이크로비드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 단백질 마이크로비드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 단백질 마이크로비드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에 있어서, “치료 단백질”은 치료 효과를 가지는 단백질을 의미하며, 호르몬 및 프로호르몬(예컨대, 인슐린 및 프로인슐린, 합성 인슐린, 인슐린 유사체, 글루카곤, 칼시토닌, 갑상선 호르몬(T3 또는 T4 또는 갑상선-자극 호르몬), 부갑상선 호르몬, 가스트린, 콜레시스토키닌, 렙틴, 여포-자극 호르몬, 옥시토신, 바소프레신, 심방나트륨이뇨 펩티드, 황체 형성 호르몬, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 소마토스타틴 등); 응고 또는 항응고 인자(예컨대, 조직 인자, von Willebrand 인자, 인자 VIIIC, 인자 VIII, 인자 IX, 단백질 C, 플라스미노겐 활성제(유로키나아제, 조직형 플라스미노겐 활성제, 트롬빈); 사이토카인, 케모카인, 및 염증 매개체(예컨대, 종양 괴사 인자 억제제); 인터페론; 집락-자극 인자; 인터류킨(예컨대, IL-1 내지 IL-10); 성장 인자(예컨대, 혈관내피성장인자, 섬유아세포성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 형질 전환 성장인자, 신경 성장인자, 인슐린-유사 성장인자 등); 알부민; 콜라겐 및 엘라스틴; 조혈 인자(예를 들어, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴 등); 골 유도 인자(예컨대, 골 형성 단백질); 수용체(예컨대, 인테그린, 카드헤린 등); 표면 막 단백질; 수송 단백질; 조절 단백질; 항원성 단백질(예컨대, 백신 내에서와 같이, 항원으로서 작용하는 바이러스 성분)과 같은 포유류 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료 단백질은 의약으로서 사용될 수 있는 단백질의 완전한 보체, 예컨대, 에타네르셉트(etanercept), 데니루킨 디프티톡스(denileukin diftitox), 알레파셉트(alefacept), 아바타셉트(abatacept), 리놀라셉트(rinolacept), 로미플로스팀(romiplostim), 코리폴리트로핀-알파(corifollitropin-alpha), 벨라타셉트(belatacept), 아플리베르셉트(aflibercept), 집-아플리베르셉트(ziv-aflibercept), 에프트레노나코그-알파(eftrenonacog-alpha), 알비글루티드(albiglutide), 에프라록토코그-알파(efraloctocog-alpha), 둘라글루티드(dulaglutide) 등과 같은 융합단백질을 포함할 수 있으며, 모노클론 항체(예컨대, 면역글로불린 Fc 부위를 가지는 전장 항체를 포함), 단일 사슬 분자, 이중-특이성 및 다중-특이성 항체, 디아바디(diabodies), 항체-약물 컨쥬게이트, 폴리에피토프 특이성을 가지는 항체 조성물, 및 항체 단편(예컨대, Fab, Fv, Fc 및 F(ab')2를 포함)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “유기 용매(organic solvent)”란 유기물질로 이루어져 다른 물질을 녹이는 물질을 말하며, 유상의 물질로서 물에 잘 녹지 않고 휘발이 잘되며 세정력이 높고 특이한 냄새를 가지는 것이 특징이다. 상기 유기 용매는 친수성 유기 용매 및 비수성 유기 용매로 나뉠 수 있으며, 본 발명에 있어서, 상기 유기 용매는 물과 섞이지 않는 비수성 유기 용매로서 f(water saturation fraction) 값이 0.5 이하인 것일 수 있고, 예컨대 상기 비수성 유기 용매는 카보네이트계, 에스테르계, 에테르계, 케톤계, 알코올계, 비양성자성 용매, 및 이들의 이성질체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 카보네이트계 용매로는 디메틸 카보네이트(DMC), 디에틸 카보네이트(DEC), 디프로필 카보네이트(DPC), 메틸프로필 카보네이트(MPC), 에틸프로필 카보네이트(EPC), 메틸에틸 카보네이트(MEC), 에틸렌 카보네이트(EC), 프로필렌 카보네이트(PC), 부틸렌 카보네이트(BC) 등이 사용될 수 있으며, 상기 에스테르계 용매로는 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 디메틸아세테이트, 메틸프로피오네이트, 에틸프로피오네이트, γ-부티로락톤, 데카놀라이드(decanolide), 발레로락톤, 메발로노락톤(mevalonolactone), 카프로락톤(caprolactone), 등이 사용될 수 있다. 상기 에테르계 용매로는 디부틸 에테르, 테트라글라임, 디글라임, 디메톡시에탄, 2-메틸테트라히드로퓨란, 테트라히드로퓨란 등이 사용될 수 있으며, 상기 케톤계 용매로는 시클로헥사논 등이 사용될 수 있다. 또한 상기 알코올계 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, n-옥탄올, 노난올, 데칸올, 이소프로필 알코올 등이 사용될 수 있으며, 상기 비양성자성 용매로는 R-CN(R은 탄소수 2 내지 20의 직쇄상, 분지상, 또는 환 구조의 탄화수소기이며, 이중결합 방향 환 또는 에테르 결합을 포함할 수 있음) 등의 니트릴류, 디메틸포름아미드 등의 아미드류, 1,3-디옥솔란 등의 디옥솔란류 설포란(sulfolane)류 등이 사용될 수 있다.

리소자임을 대상으로 안정적이고 가역성이 높은 단백질 침전물을 생성하기 위한 다양한 침전 조건을 확인한 이전 연구(D.G. Lim, J.C. Lee, D.J. Kim, S.J. Kim, H.W. Yu, S.H. Jeong, Effects of precipitation process on the biophysical properties of highly concentrated proteins, Journal of Pharmaceutical Investigation, (2020) 1-11.)에 따르면, 펜탄올 및 n-옥탄올과 같은 비수성 유기 용매에서 탈수될 때 단백질의 가역성이 높은 것을 알 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 유기 용매는 n-옥탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “공정용 안정화제”란 본 발명에 따른 단백질 마이크로비드 제조 공정에서 단백질 마이크로비드의 안정성을 향상시키는 데 사용되는 물질로서, 희석제, 사카라이드(당류), 폴리올, 염, 또는 계면 활성제일 수 있고, 예컨대, 트레할로스, 수크로오스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스, 글루코스, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 트레이톨, 솔비톨, 글리세롤, L-글루코네이트, NaCl, CaCl, 폴리소르베이트 80(PS80), 폴리소르베이트 20(PS20), 소르비탄 트리올레이트, 및 틸록사폴로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

트레할로스는 비환원당으로 삼투질 및 단백질 안정제로 자주 사용되어 벌크 용액에서 스트레스 유발 응집을 감소시키고 고유 상태의 접힘 안정성을 증가시킴이 보고되었으며(N.K. Jain, I. Roy, Effect of trehalose on protein structure, Protein Sci, 18 (2009) 24-36., N.K. Jain, I. Roy, Trehalose and protein stability, Curr Protoc Protein Sci, Chapter 4 (2010) Unit 4 9., S. Ohtake, Y.J. Wang, Trehalose: current use and future applications, Journal of pharmaceutical sciences, 100 (2011) 2020-2053.), 본 발명의 일 실시예에 따르면 트레할로스를 사용하여 마이크로비드를 제조할 경우 폴리소르베이트 80 또는 NaCl을 사용한 경우와 비교했을 때 단백질 마이크로비드의 가역성이 가장 높게 나타난 바, 본 발명에 있어서 상기 공정용 안정화제로서 트레할로스를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 트레할로스는 100 mM 내지 500 mM, 100 mM 내지 400 mM, 100 mM 내지 350 mM, 200 mM 내지 500 mM, 200 mM 내지 400 mM, 200 mM 내지 350 mM, 또는 300 mM의 농도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “마이크로비드”란 단백질을 유기 용매에 혼합하여 제조된 에멀젼을 탈수시켰을 때 생성되는 단백질 침전물로서, 입자의 직경이 0.1 μm 내지 50 μm, 0.1 μm 내지 30 μm, 0.1 μm 내지 20 μm, 0.1 μm 내지 10 μm, 1 μm 내지 50 μm, 1 μm 내지 30 μm, 1 μm 내지 10 μm, 1 μm 내지 5 μm, 5 μm 내지 50 μm, 5 μm 내지 30 μm, 또는 5 μm 내지 10 μm일 수 있으며, 평균 직경이 10 μm 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “에멀젼(emulsion)”이란 유상 또는 수상의 섞이지 않는 액체 중 하나 이상을 미립자 상태(분산질)로 다른 액체(분산매)에 분산시켜 놓은 혼합상을 말하며, 분산상의 입도 크기에 따라, 통상적으로, 마크로에멀션, 마이크로에멀션, 나노에멀션으로 나누어진다. 에멀젼이 "유중수"(water in oil, W/O)이면, 오일이 연속상이며, "수중유"(oil in water, O/W)이면, 물이 연속상이다.

본 발명에 있어서, “탈수”란 단백질 마이크로비드로부터 물을 제거하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 에멀젼을 교반하기 전 시라스 다공성 유리(Shirasu porous glass, SPG) 멤브레인 또는 마이크로 칩을 통해 단백질을 유화시키는 단계를 더 포함하여 단백질 마이크로비드의 입자 형태 및 크기를 균일하게 만들어 입자 크기의 분포 범위를 좁힐 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 SPG 멤브레인은 종래의 방법에서 마이크로비드의 광범위한 입자 크기 분포에 의해 일관되지 않은 방출 프로파일 및 효능을 유발할 수 있는 문제점을 극복하기 위해 사용될 수 있으며, 상기 SPG 멤브레인의 기공 직경은 1 μm 내지 10 μm, 1 μm 내지 7 μm, 1 μm 내지 5 μm, 1 μm 내지 4 μm, 2 μm 내지 4 μm, 2 μm 내지 5 μm, 2 μm 내지 7 μm, 또는 3 μm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 탈수는 10초 내지 20분, 10초 내지 15분, 10초 내지 10분, 10초 내지 5분, 10초 내지 1분, 10초 내지 40초, 20초 내지 40초, 30초 내지 20분, 30초 내지 10분, 1분 내지 15분, 1분 내지 20분, 5분 내지 15분, 5분 내지 20분, 30초, 또는 10분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 1 ℃ 내지 25 ℃, 1 ℃ 내지 20 ℃, 1 ℃ 내지 15 ℃, 1 ℃ 내지 10 ℃, 1 ℃ 내지 5 ℃, 3 ℃ 내지 25 ℃, 3 ℃ 내지 15 ℃, 3 ℃ 내지 10 ℃, 3 ℃ 내지 5 ℃, 또는 4 ℃에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 단백질은 초기 농도가 1 mg/mL 내지 100 mg/mL, 1 mg/mL 내지 70 mg/mL, 1 mg/mL 내지 50 mg/mL, 1 mg/mL 내지 40 mg/mL, 1 mg/mL 내지 20 mg/mL, 5 mg/mL 내지 100 mg/mL, 5 mg/mL 내지 50 mg/mL, 5 mg/mL 내지 10 mg/mL, 10 mg/mL 내지 100 mg/mL, 10 mg/mL 내지 50 mg/mL, 10 mg/mL, 또는 50 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계에서 유기 용매로서 n-옥탄올을 단백질 1 mL 당 30 mL 내지 60 mL, 30 mL 내지 55 mL, 30 mL 내지 50 mL, 35 mL 내지 60 mL, 35 mL 내지 55 mL, 35 mL 내지 50 mL, 40 mL 내지 60 mL, 40 mL 내지 55 mL, 또는 40 mL 내지 50 mL 혼합하여 단백질을 탈수시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 원심분리는 5,000 rpm 내지 15,000 rpm, 7,000 rpm 내지 15,000 rpm, 9,000 rpm 내지 15,000 rpm, 5,000 rpm 내지 12,000 rpm, 7,000 rpm 내지 12,000 rpm, 9,000 rpm 내지 12,000 rpm, 또는 10,000 rpm으로 10초 내지 10분, 10초 내지 7분, 10초 내지 5분, 10초 내지 3분, 30초 내지 10분, 30초 내지 5분, 30초 내지 3분, 1분 내지 5분, 1분 내지 3분, 또는 2분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 건조는 25 ℃ 내지 40 ℃, 25 ℃ 내지 38 ℃, 25 ℃ 내지 36 ℃, 30 ℃ 내지 40 ℃, 30 ℃ 내지 38 ℃, 30 ℃ 내지 36 ℃, 32 ℃ 내지 40 ℃, 32 ℃ 내지 38 ℃, 32 ℃ 내지 36 ℃, 또는 35 ℃에서 24시간 내지 130 시간, 24시간 내지 120시간, 24시간 내지 100시간, 24시간 내지 70시간, 24시간 내지 50시간, 36시간 내지 120시간, 36시간 내지 70시간, 36시간 내지 50시간, 또는 48시간 동안 50 mTorr 내지 300 mTorr, 50 mTorr 내지 250 mTorr, 50 mTorr 내지 220 mTorr, 50 mTorr 내지 150 mTorr, 50 mTorr 내지 100 mTorr, 100 mTorr 내지 300 mTorr, 100 mTorr 내지 250 mTorr, 100 mTorr 내지 220 mTorr, 150 mTorr 내지 300 mTorr, 150 mTorr 내지 250 mTorr, 150 mTorr 내지 220 mTorr, 또는 200 mTorr의 압력으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “가역성”이란 시간이 흐르는 동안 물체의 운동이 변화했을 때 시간을 거꾸로 되돌린다면 처음의 물체 상태로 되돌아갈 수 있는 성질을 의미하는 것으로, 본 발명의 제조 방법에 따라 단백질 마이크로비드는 가역성이 90 % 내지 100 %일 수 있으며, 바람직하게는 90 % 이상, 91 % 이상, 92 % 이상, 93 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상, 또는 100 %의 높은 가역성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “단백질 마이크로비드의 안정성”이란 단백질 마이크로비드를 정해진 기간 동안 보관할 경우 단백질 마이크로비드의 구조, 기능, 및/또는 생물학적 활성을 보유하는 정도를 의미하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 단백질 마이크로비드의 안정성은 물리적 충격 또는 고온 스트레스 하에서 유지될 수 있으며, 예컨대, 본 발명의 단백질 마이크로비드는 40 ℃ 내지 70 ℃, 40 ℃ 내지 65 ℃, 40 ℃ 내지 60 ℃, 40 ℃ 내지 57 ℃, 45 ℃ 내지 70 ℃, 45 ℃ 내지 65 ℃, 45 ℃ 내지 60 ℃, 45 ℃ 내지 57 ℃, 50 ℃ 내지 70 ℃, 50 ℃ 내지 65 ℃, 50 ℃ 내지 60 ℃, 50 ℃ 내지 57 ℃, 또는 55 ℃의 온도에서 안정성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “유지”란 단백질 마이크로비드의 안정성이 그대로 보존되거나 계속해서 존재하는 상태를 의미한다.

본 발명에 있어서, “응집”이란 단백질의 접힘(folding)과 풀어짐(unfolding) 과정에 존재하는 부분적으로 접힌 중간체(partially folded intermediate)로부터 적어도 두 단백질이 비정상적으로 서로 접촉하는 현상을 포함한다. 이는 단백질 고유의 기능적 활성의 손실을 포함할 수 있다. 단백질 응집의 경우, 접힘중간체 유도는 단백질 소수성영역의 노출을 초래하며, 그들 영역에 의한 분자간 선택적 상호작용이 단백질 침전의 주원인으로 작용한다. 단백질 응집에 영향을 미치는 인자들로는 단백질(중간체)농도, 단백질 내 아미노산서열, pH, 온도, 용액의 이온세기, 공존용질(단백질 리간드, 단백질 변형제), 분자샤페론 등이 있다.

본 발명에 있어서, “단백질 응집 억제”란 단백질 응집의 양을 감소시키거나, 응집 속도를 늦추거나, 응집을 완전하게 방지하는 의미를 모두 포함한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 재료 준비

감마 글로불린(Gamma-globulin) Inj^®는 녹십자(경기, 대한민국)에서 구입하였다. 이는 22.5 mg 글리신(glycine), 5 mg 염화나트륨(NaCl), 및 1 mL 당 165 mg 인간 면역글로불린 G(IgG)(총 2 mL)로 구성되어 있으며, 본 발명 전체에 걸쳐 2개의 로트(lot)가 사용되었다(Lot. 020A18001 및 Lot. 020A19001). 사용하기 전에 IgG는 10,000 분자량 컷오프(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)로 Slide-A-Lyzer 투석 카세트를 사용하여 pH 4의 25 mM 아세트산 나트륨 완충액에서 탈염시켰다. 그런 다음, 디지털 pH 측정기(827 pH 실험실, Metrohm, 스위스)를 사용하여 최종 pH를 측정하였다. 투석 완충액을 8 시간 간격으로 3 회 교체하여 냉장 상태(즉, 약 4 ℃)에서 24 시간 투석을 완료하였다. 투석 후, 모든 샘플을 멸균 Spin-X 0.22 μ셀룰로오스 아세테이트 원심분리 필터(Costar, Corning Incorp., Salt Lake, UT, 미국)를 통해 8,000 rpm에서 2분 동안 여과하였다.

소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, 미국)에서 구입하였으며, 사용 전 이는 pH 7의 25 mM 인산 나트륨 완충액에 녹여 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene)(SH13P045NL, Hyundai Micro Co., 서울, 대한민국)으로 구성된 0.45 μ멤브레인을 통해 여과하였다. 트레할로스 이수화물(Trehalose dihydrate), 염화나트륨(NaCl), 아세트산 나트륨3수화물(sodium acetate trihydrate), 아세트산, 및 펜탄올(pentanol)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, 미국)에서 구입하였으며, 에탄올, 이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol, IPA) 및 폴리소르베이트(polysorbate) 80(PS80)은 대정 화학(경기, 대한민국)에서 구입하였다. n-옥탄올(n-Octanol)은 Junsei Chemical(도쿄, 일본)에서 구입하였다.

실시예 2. SPG 멤브레인 유화

유화를 위해 튜브형 시라스 다공성 유리(Shirasu porous glass(SPG); 기공 직경 3 μm, 20 mm ×10 mm) 멤브레인을 사용한 분산 유화 시스템으로 내부 압력 마이크로 키트(IMK-20; MCtech, 시흥, 대한민국)를 사용하였다. 유화 공정에 앞서, SPG 멤브레인을 머플로(muffle furnace)(DF-2; Dae Heung Science, 안산, 대한민국)에서 500 ℃에서 10 시간 동안 점화시키고 1.75 %(v/v) 유기 실리콘 수지(KP-18C; Shin-Etsu Chemical Co., 도쿄, 일본)에서 4시간 동안 초음파 처리하여 소수성 막으로 전환시켰다. 이를 60 ℃에서 90분 동안 오븐에서 건조하고 n-옥탄올에서 10분 동안 다시 초음파 처리하여 탈기시켰다. 그런 다음, 소수성화된 SPG 멤브레인을 O-링(AN-008; MCtech, 시흥, 대한민국)으로 고정하고 멤브레인 모듈에 나사로 조였다. SPG 멤브레인 내부의 분산상 탱크는 단백질 용액으로 채워졌고, SPG 멤브레인 외부의 연속상은 n-옥탄올로 채워졌다. 외부 압력형 마이크로 키트를 연결하여 50 kPa의 압력에서 N₂ 가스를 제거하고 단백질 용액을 10 초 동안 방출하였다.

실시예 3. 유기 용매에서 단백질 탈수 및 진공 건조 공정

단백질 탈수는 4가지 알코올(에탄올, IPA, 펜탄올, 및 n-옥탄올)에서 단백질 용액으로 구성된 유중수적형(W/O) 에멀젼을 볼텍싱(vortexing)(VM-10, Daihan Scientific Co., 서울, 대한민국)함으로써 수행하였다. 비-SPG 방법의 경우 단백질 용액을 단순히 알코올에 피펫팅 하였다. 4.5 mL 에탄올, 4.5 mL IPA, 10.71 mL 펜탄올, 및 23.4 mL n-옥탄올을 0.5 mL 단백질 용액을 탈수하는데 사용하였다. 에탄올과 IPA는 물과 섞일 수 있어 단백질 용액과 1 : 9의 비율로 간단히 혼합했지만 빠른 탈수를 위해 0.5로 고정된 수분 포화 부분(water saturation fraction, f)를 기준으로 펜탄올과 n-옥탄올을 계산하였다. 단백질 용액의 부피 V _w는 하기 수학식 1에 따라 계산되었다.

[수학식 1]

V _w = f ×V _s ×C _s ×ρ

여기서 f는 원하는 수분 포화 부분, V _s는 유기 용매의 부피, C _s는 유기 용매에서의 물 용해도(g 단위의 물/용매), ρ는 유기 용매의 밀도이다. 침전물을 수집하기 위해 상기 에멀젼을 10,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였으며, 상층액 제거 후 샘플을 에탄올로 채우고, 이 과정을 2회 반복했다. 기존 용매를 제거하기 위해 최종 추출물은 -80 ℃로 설정된 콜드 트랩(LP-20; 일신 바이오베이스, 양주, 대한민국)이 장착된 동결 건조기에서 건조하였다. 초기 진공 압력은 48시간 동안 25 ℃에서 57 mTorr로 설정하였고, 그 후 35 ℃에서 48시간 동안 200 mTorr로 조정하였다.

실시예 4. 유체 이미징(fluid imaging, FI) 분석

입자 농도 및 단백질 마이크로비드의 이미지는 10x 확대 카메라(Fluid-imaging Technologies, ME, 미국)가 장착된 Flowcam 8100 기기를 사용하여 얻었다. 샘플 준비를 위해 3 mg IgG 마이크로비드를 스톡으로 1 mL 에탄올에 분산시키고 50배 희석하였다. 각 측정 전에 탈이온수를 평가한 다음 에탄올을 평가하여 유체 경로 및 유동 세포(flow cell)의 청결도(cleanliness)를 확인하였다. 100 입자/mL 미만의 값은 허용 가능한 배경 값으로 간주되었다. 각 측정에 대해 1 mL의 희석된 용액을 로드하고, 0.2 mL를 시스템 프라이밍(priming)에 사용하였다. 그런 다음 0.1 mL/분의 유속에서 후속 0.2 mL에 대한 데이터를 획득하였다. 측정된 가장 작은 입자 크기는 1 μm였으며, 입자 크기는 등가 구면 직경(equivalent spherical diameter, ESD)으로 표시하였다.

평균 및 표준 편차는 각 샘플에 대한 세 가지 개별 측정값에서 얻었다. 분석은 기기와 함께 제공된 Visual spreadsheet 소프트웨어(버전 4.17.14)를 사용하여 수행하였다.

실시예 5. 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)

크기 배제 크로마토그래피는 280 nm의 자외선 파장에서 다이오드(diode) 어레이 검출기가 장착된 Agilent HPLC 1260(Agilent, Santa Clara, CA, 미국)을 사용하여 수행하였다. 사용된 컬럼은 300 mm 길이의 TSKgel G3000SWXL SEC 컬럼(TOSOH Bioscience, King of Prussia, PA, 미국)과 프리(pre)-필터(Trident^TM 고압 인라인 필터, Restek, Bellefonte, PA, 미국)였다. IgG에 대한 이동상은 유속 0.5 mL/분에서 3배 농축된 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하였으며 20 μL를 주입하였다. 또한 BSA에 대한 이동상으로는 유속 1 mL/분에서 300 mM NaCl을 함유한 pH 7의 50 mM 인산 나트륨 완충액을 사용하였으며 10 μL를 주입하였다. 모든 샘플은 분석 전에 0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 스핀-X 원심분리 필터(Costar, Corning Incorporated, Corning, NY, 미국)로 여과하였으며, 하기 수학식 2를 사용하여 단백질의 가역성을 계산하였다.

[수학식 2]

남아있는 단량체(Remaining monomer) % = (A _s ÷ A ₀) × 100

여기서 'A _s'는 주어진 샘플에서 단량체 피크의 면적이고 'A ₀'은 마이크로비드화 이전의 대조군의 단량체 피크 면적이다. 모든 단백질 농도는 측정 전에 5 mg/mL로 조정되었다.

실시예 6. 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)

n-옥탄올 및 에탄올은 DB-624 ultra-inert(UI) 컬럼(내부 직경 60 m x 0.25 mm x 필름 두께 1.4 μm) 및 화염 이온화 검출기(flame ionization detector, FID)가 장착된 Agilent 7890A(Agilent, Santa Clara, CA, 미국)에 의해 준비된 IgG 마이크로비드로부터 정량화되었다. 헬륨(130 mL/분의 분할 흐름)은 1.3 mL/분의 일정한 흐름에서 운반 가스로 사용되었다. 오븐 온도 프로그램은 40 ℃에서 5분, 18 ℃/분으로 최대 240 ℃(2 분 유지 시간)까지로 설정하였다. 샘플 측정 전에 에탄올의 표준 곡선은 6.35 μg/mL, 25.40 μg/mL, 및 50.80 μg/mL로 플롯하여 R² 선형성과 정량의 한계(limit of quantification, LOQ)를 각각 0.9999 및 2 μg/mL로 나타내었다. 마찬가지로, n-옥탄올의 표준 곡선은 69.69 μg/mL, 139.38 μg/mL, 278.75 μg/mL, 및 1115.00 μg/mL로 플롯하여 R² 선형성과 LOQ를 각각 0.9998 및 14 μg/mL로 나타내었다. 50 mg의 IgG 마이크로비드를 계량하고, 각 측정 전에 탈이온화된 물 10 mL에 용해시켰다.

실시예 7. 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)

재구성된 BSA 마이크로비드의 유체 역학적 크기는 Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments, Worcestershire, 영국)을 사용하여 측정하였으며, BSA 마이크로비드는 5 mg/mL 농도의 초기 완충액으로 재구성하였다. 1 mL의 각 샘플을 90°의 고정 각도로 일회용 큐벳(Kartell Labware, Milan, 이탈리아)에서 분석하였고, Zetasizer 소프트웨어 버전 7.11을 자동 상관 기능으로부터 매개 변수를 획득하기 위해 사용하였다.

실시예 8. 시차 주사 열량 측정법(differential scanning calorimetry, DSC)

Nano DSC(TA Instruments, New Castle, 미국)를 사용하여 마이크로비드의 열역학적 특성을 평가하였다.

IgG 및 BSA 마이크로비드는 2 mg/mL의 농도에서 초기 버퍼로 재구성하였으며, 초기 버퍼는 기준선 차감을 위한 참조로 사용하였다. 모든 샘플은 측정 전에 탈기시켰으며, 샘플 모세관 세포에 로드하였다. 측정은 1 ℃/분의 가열 속도로 25 ℃에서 95 ℃까지 수행하였다. 최종 온도 기록(thermogram)은 버퍼 기준선을 차감하여 처리하고, 장비와 함께 제공된 Nanoanalyze 소프트웨어 버전 3.7(TA Instruments, 미국)을 사용하여 전이 용융 온도(transition melting temperature, T _m)를 계산하였다.

실시예 9. 주사 전자 현미경(Scanning electronic microscopy, SEM)

IgG 및 BSA 마이크로비드의 형태는 20.0 kV 가속 전압에서 EM-30 SEM(COXEM, 대전, 대한민국)을 사용하여 주사 전자 현미경(SEM)을 스캔함으로써 관찰하였다. 관찰에 앞서 SPT-20 이온 코터(coater)(COXEM, 대전, 대한민국)를 사용하여 샘플을 금으로 코팅하였다.

실시예 10. 광학 현미경

W/O 에멀젼에서 IgG 및 BSA의 형태는 Olympus BX53 광학 현미경(Olympus Corporation, 도쿄, 일본)을 사용하여 관찰하였다. 배율은 20x로 설정하였고, 이미지 분석에는 cellSens 이미징 소프트웨어(Olympus Corporation, 도쿄, 일본)를 가진 Olympus DP26 디지털 카메라를 사용하였다.

실시예 11. 약물 동태(pharmacokinetic, PK) 분석

무게 210-230 g, 8주령의 20마리 수컷 Sprague-Dawley 랫트를 4개의 그룹으로 나누었다(각 그룹에 5마리의 랫트). 4개 그룹은 저농도 및 고농도의 IgG(즉, 25 mg/kg 및 50 mg/kg) 및 마이크로비드화 전후의 IgG 주입을 나타낸다. IgG 마이크로비드는 pH 4.0 아세테이트 완충액에 용해되어 50 mg/mL 및 100 mg/mL IgG를 달성하고, IgG 용액은 주사용 물을 사용하여 동일한 농도로 희석하였다. 준비된 샘플을 26 게이지 바늘을 가진 멸균된 Injekt-F 1 mL 실리콘 오일이 없는 라텍스-프리 플라스틱 주사기(Injekt^®)(B. Braun Medical Inc, Melsungen, 독일)에 넣고, 25 및 50 mg/kg 용량으로 대퇴 이두근에 투여하였다. 이때, 단일 주입의 부피는 래트 1마리 당 약 100 μL였다. 근육 내 투여 후 4, 8, 및 24 시간 및 2, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 21 및 28 일에 쇄골 하 정맥에서 주사기를 사용하여 200 μL의 혈액 샘플을 수집하였다. 모든 샘플을 17,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 혈청을 얻고 수용체 결합 직접 효소-결합 면역 흡착 분석(ELISA)까지 -70 ℃에서 보관하였다.

본 발명은 중앙대학교 동물 실험 이용위원회의 승인을 받았다(제 202000118호). 혈청 IgG 프로파일은 Origin Pro V.2016 소프트웨어(Originlab Corp., Northampton, MA, 미국)를 사용하여 플롯하였으며, 이의 PK 매개 변수(즉, AUC_0-28; 0에서 마지막 정량화 가능한 시점까지 시간-농도 곡선 아래 영역, C_max; 최대 관찰 피크 농도, T_max; C_max 도달 시간, T_1/2; 말단 반감기)는 비 구획 분석(모델 200, WinNonlin Pro, 버전 5.0.1; Pharsight Corporation; Mountain View, CA, 미국)을 이용하여 계산하였다. 이 IgG에 대한 이전 경험을 바탕으로 AUC_0-28이 본 발명의 종점으로 선택되었다. PK 매개 변수의 비교는 대응 t-테스트(paired t-test)을 사용하여 수행되었으며, p-value<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 12. ELISA

희석된 혈청 샘플은 인간 IgG ELISA 키트(MyBioSource, CA, 미국, # MBS2511279)를 사용하여 항체 농도에 대해 분석하였다. 이 분석에서는 인간 IgG 분자에 특이적인 재조합 항원 수용체를 포획 시약으로 사용하고, 검출 시약으로 아비딘(avidin)-HRP(horseradish peroxidase)에 접합된 인간 IgG Fc를 사용하였다. 검출 가능한 최소 농도는 1.65 ng/mL였다.

구체적으로, 키트와 함께 제공된 마이크로 플레이트는 인간 IgG에 특이적인 항체로 사전 코팅되어 있고, 처음에는 키트 또는 희석된 혈청과 함께 제공된 100 μL 표준을 각 마이크로 플레이트 웰에 로드한 다음 37 ℃에서 90분 동안 배양하였다. 연속적으로, 인간 IgG 및 HRP 접합체에 특이적인 100 μL 비오틴화된 검출 항체를 각 마이크로 플레이트 웰에 첨가한 다음 37 ℃에서 각각 60분 및 30분 동안 배양하였으며, 유리(free) 성분을 세척 용액으로 3회 세척하였다. 그런 다음, 90 μL 기질 용액을 첨가하고 37 ℃에서 15분 동안 배양한 후, 50 μL 정지 용액을 첨가하여 효소-기질 반응을 종결시켰다. 광학 밀도(OD)는 SpectraMax M3 분광 광도계(Molecular Devices, Sunnyvale, 미국)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

실시예 13. 박스-차트 플롯팅 및 평균과 스팬 값(span value) 계산

Origin Pro V.2016 소프트웨어(Originlab Corp., Northampton, MA, 미국)를 사용하여 박스 차트 플로팅 및 IgG 마이크로비드의 평균값 계산을 수행하였다. D₁₀, D₅₀ 및 D₉₀ 값을 포함하여 수집된 마이크론 크기 입자의 누적 정보는 FI 분석에서 얻었으며, 스팬 값(span value)은 하기 수학식 3을 이용하여 계산하였다.

[수학식 3]

스팬 값(Span value) = (D₉₀ - D₁₀) / D₅₀

[실험예]

실험예 1. 단백질 탈수에 대한 유기용매의 영향

본 발명에서 성공의 초기 핵심 요소는 불안정화 메커니즘 없이 단백질을 즉시 탈수시키고 침전시킬 수 있는 적합한 용매를 찾는 것이었다. 용매는 물과 혼합되지 않아야 하며 단백질 분자에 대한 물리 화학적 반응의 원천이 아니어야 한다. 단백질 마이크로비드의 제조 방법은 다음과 같은 4 단계로 나뉜다: 유화, 탈수(침전), 수집 및 건조. SPG 유화 기술을 사용하지 않고 단순히 단백질 용액을 용매에 분산시키는 방법을 '비SPG(non-SPG) 방법'이라고 하며 이를 BSA를 이용하여 탈수에 적합한 용매를 찾는 데 활용하였다.

도 1a는 BSA 마이크로비드의 제조에서 비 SPG 방법을 순서대로 간략하게 도식화한 것이고, 도 1b는 n-옥탄올에서 생성된 BSA 마이크로비드의 SEM 이미지를 나타낸 것이며, 도 1c 내지 1e는 BSA 마이크로비드의 재구성 후 나타나는 BSA의 생물 물리학적 특성을 나타낸 것이다.

에탄올, 에소프로필 알코올(IPA), 펜탄올, 및 n-옥탄올을 오일상으로 사용하여 30초 동안 간단한 볼텍싱으로 200 mg/mL BSA를 탈수시킨 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 비혼화성 물 용매로 알려진 탈수 용매로 펜탄올 및 n-옥탄올을 적용했을 때 재구성 후 고도로 단분산된 BSA가 관찰되는 것을 DLS 결과를 통해 확인하였다. 그러나, 에탄올과 IPA에서 탈수 시 다분산 BSA가 관찰되었으며, 그 결과, 볼텍싱되는 동안 형성되었을 BSA 응집체(> 20 nm)의 형성이 나타났다.

더욱이, BSA 마이크로비드의 재구성 후 SEC를 확인한 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이 에탄올은 가장 많은 양의 용해성 응집체를 유도했으며, DSC 온도 기록(thermogram)을 확인한 결과, 도 1e에 나타낸 바와 같이 에탄올은 T_m을 더 높은 온도로 이동시켰다. 결과는 에탄올에서 탈수하는 동안 열역학적으로 더 유리한 올리고머의 형성을 나타냈다.

반면, 도 1d에 나타낸 바와 같이 펜탄올 및 n-옥탄올은 용해성 응집체를 증가시키지 않았지만 더 높은 가역적 단량체를 나타내었으며, 가역성이 각각 약 92 %와 97 %에 도달하였다. 또한, 도 1e에 나타낸 바와 같이 T_m은 이동하지 않았으며, 이는 탈수 전후에 BSA의 동일한 접힘 역학을 나타내는 것을 시사한다.

또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이 n-옥탄올에서 준비된 BSA 마이크로비드의 형태는 결정이나 불순물이 전혀 나타나지 않았고 크기가 다양한 마이크로비드만을 보여주었다. 이전 연구에서 리소자임(lysozyme) 마이크로비드의 형태는 미세한 구체를 나타내지 않았다. 이와 같은 차이는 속도를 30 rpm에서 3,000 rpm으로 증가시키고 지속 시간을 30분에서 30초로 줄인 준비 방법에서 쉐이커를 볼텍스(vortex)로 변경하는 것에 의해 나타났으며, 속도가 빨라지고 지속 시간이 단축되어 마이크로비드의 형성이 증가하였다.

따라서, 본 발명에서는 n-옥탄올의 볼텍싱 단백질 용액을 적절한 탈수 공정으로 선택하고 공정 최적화를 진행하였다. 반면에, 에탄올은 마이크로비드 수집 시 적용되었으며 건조 공정 전에 n-옥탄올 수준을 낮추었다.

실험예 2. IgG 마이크로비드 형성에 대한 SPG 멤브레인의 영향

SPG 멤브레인 유화 기술을 사용하여 단백질 마이크로비드의 더 작고 좁은 분포를 생성하였다. 상기 기술은 O/W 및 W/O 모두의 단분산 에멀젼을 생산할 때 유화 공정을 정밀하게 제어하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔다. 이 기술의 장점은 균일한 크기의 기공(0.1-50 μm)을 사용하는 균일성, 확장성 및 연속성이다. 생물학적 제제의 경우, 제어된 약물 방출 프로파일을 달성하기 위해 키토산 또는 폴리머에 의해 형성된 마이크로 캡슐을 제조하는 데 이 기술이 사용되었다.

도 2a 내지 2e는 IgG W/O 방울을 생성한 후 탈수, 수집 및 건조하여 미세한 IgG 마이크로비드를 얻기 위한 SPG 유화 시스템의 개략적 설정을 나타낸다.

도 2a는 IgG 마이크로비드의 제조에서 SPG 멤브레인을 이용한 방법을 순서대로 간략하게 도식화한 것이고, 도 2b는 SPG 유화 시스템을 위한 소규모 장비의 개략도 및 이에 이어 물을 제거하기 위해 볼텍싱을 이용한 단백질 탈수 과정을 나타낸 것이다. 도 2c는 10분 볼텍싱 후 건조 전 n-옥탄올에서 비 SPG 방법과 SPG 방법을 이용하였을 때의 현미경 관찰 결과를 비교하여 나타낸 것이고, 도 2d는 진공 건조 후 비 SPG 방법 및 SPG 방법을 사용하였을 때 마이크로비드의 관찰 결과를 나타낸 것이다.

3 μm 기공 크기의 소수성 SPG 멤브레인은 멤브레인에서 방출되는 동안 물방울의 붕괴 또는 융합을 방지하기 위해 교반 없이 n-옥탄올에 배치되었다. IgG W/O 방울이 SPG 멤브레인에서 방출된 후, IgG 마이크로비드를 생성하기 위한 탈수를 위해 10분 동안 볼텍싱하였다.

SPG 멤브레인에서 방출된 IgG W/O 방울의 광학 현미경 관찰 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 멤브레인을 사용하지 않는 것보다 상대적으로 작은 크기를 나타내었으며, 이와 같은 차이는 도 2d에 나타낸 바와 같이 57 mTorr의 진공 압력 하에서 25 ℃에서 48 시간 동안 진공 챔버에서 건조 공정 후 IgG 마이크로비드에서의 결과와도 일치하였다.

한편, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 비 SPG 방법으로부터 IgG 마이크로비드는 몇 개의 비 구형 마이크로비드를 보였을 뿐만 아니라 5초 동안 볼텍싱했을 때 크기가 더 커졌는데, 이는 탈수 시간에 대한 품질의 상관 관계를 시사한다. IgG 마이크로비드의 품질 및 크기 분포와 관련하여 탈수 시간, n-옥탄올 온도, 제약 부형제, 및 건조 조건과 같은 공정 변화를 평가하기 위해 추가 연구를 수행하였다.

실험예 3. IgG 마이크로비드 형성에 대한 탈수 시간의 영향

탈수 시간은 볼텍스를 사용하여 5초 내지 45분 범위였으며, IgG 마이크로비드의 크기 분포를 평가하기 위해 FI 분석을 이용하였다. FI 분석은 입자를 추가로 코팅하지 않고도 실시간으로 형태를 시각화하고 1 μm보다 큰 크기의 눈에 보이지 않는(subvisible) 입자를 정량화 할 수 있다. 등가 입자 크기(ESD)는 구의 직경으로 정의되는 마이크로비드의 크기를 평가할 때 사용된다. 더욱이 입자 정량화의 감도와 정확성이 기존의 빛 차단 방법보다 더 신뢰할 수 있음이 입증되었다. 제품 개발 관련 품질 별 설계 또는 공정 최적화에 FI를 사용할 수 있도록 연구 전반에 걸쳐 분석 접근 방식을 사용하였다.

진공 챔버에서 건조 후, 준비된 IgG 마이크로비드 3 mg을 에탄올 1 mL에 분산시킨 후 용해 없이 마이크로비드를 정량화하고 입자 수에서 더 높은 감도를 확보하기 위한 FI 분석을 위해 50배 희석하였다(즉, < 1,000,000 P/mL). IgG 용액의 초기 농도는 100 mg/mL로 설정하였다.

도 3a 내지 3c는 탈수 시간이 다른 SPG 방법으로 제조된 IgG 마이크로비드의 크기 분포를 나타낸 것으로서, 박스-차트(box-chart) 기반 입자 크기(도 3a), 평균값(도 3b), 및 입자 농도(도 3c)로 각각 나타내었다.

그 결과, IgG 마이크로비드의 75 %가 10 μm 미만으로 확인되었고, 99 %는 20 μm 미만으로 준비된 모든 샘플에서 확인되었다. 탈수 시간이 5초, 15초, 30초인 IgG 마이크로비드의 평균값은 각각 5.45 μm, 4.99 μm, 및 5.24 μm였다. 또한, 5분, 10분, 30분, 및 45분과 같은 연장된 시간의 평균값은 각각 6.06 μm, 5.39 μm, 6.40 μm, 및 6.86 μm였다. 10분을 제외하고는 평균값이 약 20 μm 이상의 이상치(outlier)로 증가하였다.

도 3d 및 3e는 상기 이상치가 응집된 마이크로비드임을 확인한다. 이에 국한되지는 않지만 도 3d에 나타낸 바와 같이 단일 IgG 마이크로비드의 크기는 1 내지 약 19 μm 범위로 보였으며, 도 3e에 나타낸 바와 같이 응집된 마이크로비드는 19 μm 이상에서 크기가 다양했다. 또한, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 가장 작고 수가 가장 적은 응집된 마이크로비드가 30초에 감지되었으며, 1 μm보다 큰 입자 농도도 가장 높았다. 이는 응집과 확장된 탈수 시간과의 상관 관계를 나타내며, 볼텍싱하는 동안 더 많은 응집을 유발하였다. 이론적으로, 100 μm 큐브 하나에는 1 μm 큐브 백만 개가 포함될 수 있는 것과 마찬가지로, 여러 번의 응집은 입자 농도를 크게 감소시킬 수 있다.

도 3f는 비 SPG 방법에서 IgG 마이크로비드의 가역성을 나타낸다. 제조된 IgG 마이크로비드는 탈수 시간에 따라 재구성시 가역적이었다. 예를 들어, 비 SPG 방법으로 재구성된 5 mg/mL IgG 마이크로비드의 대부분은 가역성이 93 % 이상에 도달했다. 그러나, 도 3f에 나타낸 바와 같이 5초 볼텍싱으로 제조된 IgG 마이크로비드는 가역성이 45 %에 불과했다. 결과는 불충분한 탈수로 인해 재구성되는 동안 또는 제조 과정에서 과도한 수분이 남아있어 단백질 응집을 유발할 수 있으며, 이는 품질 저하와 관련이 있을 수 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, SPG 멤브레인에서 제조된 IgG 마이크로비드에서는 이와 같은 현상이 관찰되지 않았으나, 단백질 응집이 증가하는 것으로 나타났다. 30초가 입자 농도에 따라 적절한 탈수 시간인 것처럼 보였으나, 추가 연구를 위해 10분을 선택하여 약학적 부형제의 효과와 n-옥탄올의 온도가 확장된 시간에 응집을 감소시킬 수 있는지 여부를 평가하였다.

실험예 4. IgG 마이크로비드 형성에 대한 온도 및 부형제의 영향

용액 내 단백질은 구형 방울을 형성하는 n-옥탄올을 만나는 즉시 최소 표면적으로 축소된다. 이는 W/O 방울 표면에 응집력을 갖는 n-옥탄올보다 물의 표면 장력이 높아 방울이 수축하기 때문이다. 일반적으로, 물의 표면 장력은 온도 감소와 염분 첨가에 따라 증가한다. 대조적으로, 덱스트란 및 그 단량체 포도당과 같은 다당류는 물의 표면 장력을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 계면 활성제는 또한 물의 표면 장력을 감소시키고 미셀 형성에 의해 다양한 에멀젼에서 안정제로 자주 사용되어 W/O 또는 O/W 방울의 응집을 억제한다. SPG 멤브레인을 사용하는 항체 관련 W/O 에멀젼에 대한 연구는 보고되지 않았으며 크기 분포 및 가역성에 대한 온도 및 제약 부형제의 영향도 보고된 바가 없다. 따라서, IgG 용액을 300 mM NaCl, 10배 CMC(임계 미셀 형성)의 폴리소르베이트 80(PS80), 및 300 mM 트레할로스와 독립적으로 사전 혼합함으로써 추가 실험을 수행하여 다른 효과를 확인하였다. 또한, 사전 혼합된 IgG 용액은 실온(RT) 및 냉장 온도(약 4 ℃)에서 n-옥탄올로 배출하여 테스트하였다. 이 경우, 사전 혼합된 IgG의 초기 단백질 농도는 100 mg/mL에서 50 mg/mL로 감소하였고, 10분 동안 볼텍싱된 후 동일한 후처리가 이어졌다.

도 4a는 SPG 멤브레인이 있거나 없는 다양한 조건에서 준비된 박스-차트에서 IgG 마이크로비드의 크기 분포를 나타내며, 도 4b는 SPG 멤브레인 사용 여부에 따른 IgG 마이크로비드의 평균 값, 도 4c는 입자 농도를 나타낸다.

도 4a에 나타낸 바와 같이 제조된 모든 IgG 마이크로비드의 크기 분포는 n-옥탄올의 낮은 온도로 좁혀졌고, SPG 멤브레인을 사용한 경우 크기 분포가 더욱 좁아졌다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이 IgG 마이크로비드(즉, 부형제 없음)의 평균 값은 단순히 온도를 낮추는 것만으로 9.01 ±6.16 μm에서 5.60 ±3.23 μm로 감소하였다. 이러한 결과는 n-옥탄올의 온도가 낮아지면 방울의 표면 장력이 증가하여 방울의 융합이 줄어드는 것으로 추측할 수 있다. 입자 농도는 도 4c에 나타낸 바와 같이 SPG 멤브레인을 적용했을 때 거의 2배 증가하는 것을 확인하였다.

도 4a 내지 4c에서 확인한 바와 같이 IgG 용액에 NaCl, PS80 및 트레할로스를 첨가하면 IgG 마이크로비드 형성 동안 서로 다른 크기 분포와 응집 성향이 나타났다. 단백질 안정성과 IgG 마이크로비드의 크기 분포에 영향을 미치는 유체 역학에 기반한 복잡성으로 인해 모든 세부 사항을 완전히 설명할 수는 없으나, 흥미롭게도 PS80 및 트레할로스는 SPG 멤브레인을 사용하지 않아도 4 ℃ n-옥탄올에서 생산된 IgG 마이크로비드 입자 크기의 평균 값을 감소시켰다(도 4b 참조). 이 현상은 단순히 물의 표면 장력을 감소시키는 것 보다는 각각 PS80과 트레할로스에 의해 미셀 형성 및 우선적으로 제외된 물 때문일 수 있다. 이와 같은 결과는 SPG 멤브레인을 사용하지 않아도 부형제가 마이크로비드 형성에 유리하다는 것을 시사한다. 그럼에도 불구하고, IgG 마이크로비드의 입자 농도는 PS80과 사전 혼합된 후 SPG 멤브레인을 통해 4 ℃ n-옥탄올에서 방출되었을 때 약 150,000 P/mL에 도달하여 가장 높은 것을 알 수 있었다(도 4c 참조).

PS80은 비이온성 계면 활성제로, 종종 미셀 형성에 의해 단백질 응집 억제제로 사용되며, 공기-액체 또는 액체-고체 계면에 대한 계면 스트레스를 억제하는 전 미셀(pre-micelles)로 사용되고, 유화제로도 작용할 수 있다. 현재의 연구는 많은 수의 마이크로비드를 형성하는 마이크로비드의 방울의 융합 및 응집을 억제함으로써 단백질 마이크로비드 형성에 유용성을 나타내었다. 이에 비해 트레할로스는 비환원당으로 삼투질 및 단백질 안정제로 자주 사용되어 벌크 용액에서 스트레스 유발 응집을 감소시키는 고유 상태의 접힘 안정성을 증가시킨다. 그러나 당 및 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리올은 교반하면서 단백질 응집을 가속화하는 것으로 보고되었다.

도 4d는 FI를 이용한 IgG 마이크로비드의 SEM 이미지를 나타낸 것으로서, 적색 화살표는 응집을 나타내며, 황색 화살표는 NaCl 유사 결정을 나타낸 것이다.

하기 실험예 5를 참고하면 재구성 후 트레할로스를 사용한 IgG 마이크로비드의 가역성은 현저한 단량체 손실이나 응집 증가를 나타내지 않았으며, PS80을 사용한 IgG 마이크로비드보다 상대적으로 높았다.

결과적으로, 도 4d에 나타낸 바와 같이 PS80보다 트레할로스에 의한 입자 농도가 낮은 현상은 단백질 불안정화에 의한 응집이 아니라 마이크로비드 표면의 점성/점착성 증가에 의해 나타날 수 있다.

다른 한편으로, 서로 표면 흡착된 것으로 나타난 유리 IgG 마이크로비드(즉, 부형제 없음)의 응집은 SPG 멤브레인에 로딩된 초기 IgG 농도에 대한 의존성을 나타냈다. 초기 IgG 농도가 100 mg/mL(도 3a 참조)에서 50 mg/mL(도 4a 참조)로 감소했을 때 IgG 마이크로비드에서 이상치의 수와 크기는 점차 거의 2배 감소하였다. 즉, 표면 흡착은 IgG 밀도 증가에 따른 IgG 마이크로비드 간의 소수성 상호 작용과 관련이 있다. 단백질의 소수성 상호 작용은 단백질의 자기 결합을 유도하는 지배적인 힘으로 알려져 있다. 이와 같은 해석은 또한 NaCl이 비 SPG 방법에서 입자 농도를 감소시킨 이유를 뒷받침할 수 있다. 이전에는 단백질 용액의 이온 강도가 증가하여 단일 클론 항체 및 기타 단백질의 단백질 응집 속도가 증가했다. 이는 단백질 분자의 전기적 반발이 감소하여 단백질-단백질 상호 작용이 증가했기 때문이다. 결과는 이온 강도의 증가가 단백질-단백질 상호 작용의 증가로 인해 볼텍싱하는 동안 마이크로비드의 더 많은 응집 또는 W/O 방울의 융합을 유도할 수 있음을 시사하였다.

그럼에도 불구하고, 상기IgG 마이크로비드의 입자 농도는 SPG 멤브레인에 NaCl을 첨가하여 PS80과 거의 동일한 수로 점차 증가하였다. 이 현상은 SEM 이미지에서 관찰된 NaCl 유사 결정(즉, 도 4d의 황색 화살표)의 존재에 의한 위양성 판독으로 인해 설명될 수 있다. 탈수 과정에서 물에 용해된 염은 물과 함께 추출된 후, n-옥탄올에 대한 낮은 용해도로 인해 결정화된다. 현재 FI 이미지는 재료의 크기가 상대적으로 작기 때문에(< 2 μm) IgG 마이크로비드에 대해 이물질을 구별하도록 설정되지 않았다. 따라서 추가 연구는 PS80과 트레할로스만을 사용하여 수행하였다.

실험예 5. PS80 및 트레할로스에 의한 IgG 마이크로비드의 가역성

본 발명의 목적은 동결 건조 공정에 비해 매우 유익하고 동결 건조 제품으로 충분히 생물 물리학적으로 안정할 수 있는 고농축 단백질에 적용할 수 있는 새로운 제형을 개발하는 것이다. 지금까지의 결과는 단백질의 마이크로비드화가 1분 안에 단백질을 탈수하고, 제품 자체가 구형이고 필링(filling) 후 공정을 위한 우수한 유동성을 얻는 미세한 분말이기 때문에 잠재적으로 대체 방법이 될 수 있음을 시사할 수 있다. 그러나 단백질 제품은 고단백 농도의 재수화에 여전히 문제가 있을 수 있다.

따라서 이의 가역성은 5 mg/mL 및 100 mg/mL의 IgG 마이크로비드의 두 가지 다른 농도에서 평가하였다. 마이크로비드는 최신 공정 조건을 사용하여 준비하였다; 50 mg/mL 초기 IgG 농도, 4 ℃ n-옥탄올, 소수성 SPG 멤브레인, 10분 볼텍싱, 에탄올로 3회 헹굼, 그런 다음 25 ℃에서 48 시간 동안 57 mTorr 진공 압력으로 진공 건조.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 5 mg/mL IgG 마이크로비드의 단량체 가역성은 제조 공정 전의 것과 비교했을 때 98 %였으며 PS80를 첨가한 경우에는 97 %로 더 감소하였다. 손실은 미미한 것처럼 보일 수 있지만 PS80 사용 유무에 따른 마이크로비드 모두 고 분자량 종(즉, HMW1 및 HMW2)이 증가하여 단량체 손실이 제조 중 가용성 응집체 형성과 관련이 있음을 나타낸다. 비 SPG 방법의 IgG 마이크로비드가 HMWs의 증가를 나타내지 않았기 때문에 SPG 멤브레인을 통과할 때 응집체가 유도될 수 있었다(도 3e 참조).

또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이 PS80을 사용하는 100 mg/mL IgG 마이크로비드의 단량체 가역성은 85 %로, 단량체 손실이 가장 높은 것으로 나타났다. 일반적으로 계면 활성제는 재구성으로 인한 단백질 응집을 최소화하기 위해 희석제에 사용된다. 그러나 사전 혼합된 PS80은 본 발명에서 더 높은 단백질 농도에서 재구성시 가역성에 유용하지 않았다. 이는 PS80의 잔류 과산화물의 수준이 낮기 때문에 특히 건조 상태에서 단백질 안정성에 잠재적으로 영향을 미치기 때문일 수 있다.

그러나, 도 5c에 나타낸 바와 같이 PS80은 DSC가 마이크로비드 형성 전후에 T _m1(즉, △T _m1 <1 ℃)에서 큰 차이를 보이지 않았기 때문에 IgG의 변성제가 아니다. 또한, 부형제 없이 재구성된 IgG 마이크로비드의 낮은 온도로의 약간의 이동이 있었다. DSC와 SEC의 결합 결과는 IgG가 소수성으로 변형된 SPG 멤브레인과 접촉하는 동안 부분적인 단백질 전개를 경험할 수 있다고 추측되었다. 건조 조건의 영향을 평가하기 위해 추가 조사를 수행하였다.

대조적으로, 트레할로스를 사용한 IgG 마이크로비드는 두 농도에서 약 100 % 가역성을 보였을 뿐만 아니라 HMWs 증가가 없었다(도 5a 및 5b 참조). 상기 기재한 바와 같이, 트레할로스를 함유한 IgG 마이크로비드의 응집은 불안정 요인이 아니라 점착성(sticky) 환경으로 결론을 내릴 수 있다. 트레할로스는 준비 및 재구성 중에 IgG 응집을 효율적으로 억제하였으며, 이는 탈수 스트레스로 인해 물이 없을 때 단백질과 효과적인 수소 결합을 형성하는 트레할로스의 메커니즘으로 설명될 수 있다. 결과적으로 트레할로스는 단백질 안정성과 관련하여 마이크로비드화에서 PS80보다 더 나은 부형제인 것을 확인하였다.

실험예 6. IgG 마이크로비드 형성에 대한 건조 조건 및 초기 농도의 영향

하기 표 1은 50 mg IgG 마이크로비드에 존재하는 에탄올 및 n-옥탄올의 양을 나타낸다.

Time (hours)	25°57 mTorr		35°57 mTorr		35°200 mTorr
	Ethanol	Octanol	Ethanol	Octanol	Ethanol	Octanol
24	22.1	507.6	n/d	n/d	n/d	n/d
48	26.3	314.8	LOQ	44.8	24.3	17.5
72	31.5	239.5	n/d	n/d	n/d	n/d
120	3.6	133.5	LOQ	39.7	2.2	16.2

n/d : Not determined

모든 샘플은 50 mg/mL 초기 IgG 농도, 4 ℃ n-옥탄올, 소수성 SPG 멤브레인, 10분 볼텍싱, 에탄올로 3회 헹굼의 최신 공정 조건을 통해 준비하였으며, 건조 시간, 온도 및 진공 압력은 다른 조건을 사용하여 준비하였다. 25 ℃에서 48 시간 건조할 경우 약 314.8 ppm의 n-옥탄올이 유지되었다. 이는 재구성 후 IgG의 T _m1 이동, PS80의 갑작스런 가역성 감소, 및 트레할로스에 의한 점착성 환경의 원인이 될 수 있다(도 5c 참조).

또한, 25 ℃에서 120시간 건조 후 에탄올과 n-옥탄올은 각각 3.6 ppm과 133.5 ppm으로 감소하였다. n-옥탄올의 감소는 온도를 35 ℃로 증가시킴으로써 지속적으로 나타났으며, 결과적으로 48시간 및 120시간 후에 각각 44.8 ppm 및 39.7 ppm이 되었다. 더 높은 온도는 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 더 이상 고려되지 않았다. 대신에, 진공 압력을 35 ℃에서 200 mTorr로 조정하였다. 이 값은 문헌(K. Nasirzadeh, R. Neueder, W. Kunz, Journal of Chemical & Engineering Data, 51 (2006) 7-10.)에 보고된 n-옥탄올의 여러 온도 의존적 증기압 측정을 기반으로 선택되었다. 결과는 n-옥탄올이 각각 48시간 및 120 시간 후에 17.5 ppm 및 16.2 ppm으로 감소했기 때문에 효과적이었다. 두 시점 간의 차이가 적었기 때문에 추가 연구를 위해 35 ℃에서 200 mTorr로 48시간 건조를 선택하였다.

도 6a는 조정된 진공 건조 공정 전후의 IgG 마이크로비드의 크기 분포 비교를 보여준다. 그 결과, PS80의 사용 유무에 따른 IgG 마이크로비드는 더 높은 진공 압력과 온도에서 건조되었을 때 상대적으로 좁은 크기 분포를 나타내었다. 또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이 평균 값 및 스팬 값도 그에 따라 감소한 것으로 확인되어, 잔류 용매가 마이크로비드의 크기 분포에 영향을 미쳤음을 나타내었다. 더욱이, 도 6c에 나타낸 바와 같이 IgG 마이크로비드의 입자 농도는 조정된 진공 건조 공정에 따라 증가할 뿐만 아니라 더 큰 입자 형성(즉 > 5 μm)이 감소되어 마이크로비드의 응집이 적음을 시사한다.

따라서 잔류 용매를 줄이는 것은 안정적인 단백질 마이크로비드를 생산하는 또 다른 핵심 요소가 될 것임을 알 수 있었다.

잔류 용매가 마이크로비드의 크기 분포에 미치는 영향을 결정한 후, SPG 멤브레인의 초기 단백질 농도의 평균을 이용하여 마지막 공정 변형 하나를 조사하였다. 이전에는 50 mg/mL IgG 마이크로비드에 비해 100 mg/mL IgG 마이크로비드에서 더 많은 수와 더 큰 크기의 이상치가 검출되어 이는 초기 단백질 농도에 대한 응집의 의존성을 나타내었다. 더 나은 이해를 위해 조정된 공정 조건을 사용하여 10 mg/mL 및 50 mg/mL의 초기 IgG 농도를 비교하였다; 4 ℃ n-옥탄올, 소수성 SPG 멤브레인, 30초 볼텍싱, 에탄올로 3회 헹굼, 그런 다음 35 ℃에서 48 시간 동안 200 mTorr 진공 압력으로 진공 건조. 여기서, 탈수 시간을 10분에서 30초로 변경하여 상기 실험예 3에서 확인한 최적의 시간 조건으로 수행하였다.

도 6d 및 6e는 두 개의 상이한 초기 IgG 농도에서 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 5 mg/mL IgG 마이크로비드의 단량체 가역성을 나타낸다. 도 6d에 나타낸 바와 같이 PS80을 사용하여 제조한 마이크로비드의 가역성은 두 농도에서 동일하게 98 %에 도달하였다. 흥미롭게도, HMW2는 초기 IgG 농도가 10 mg/mL로 감소했을 때 상대적으로 감소하여, 더 낮은 농도에서 마이크로비드화 과정 동안 더 적은 단백질이 영향을 받았음을 확인하였다. 가역성은 약 98 %로 상기 실험예 5에서 확인한 결과 및 50 mg/mL의 IgG 초기 농도에서 PS80 및 트레할로스를 사용하여 제조한 100 mg/mL의 IgG 마이크로비드의 단량체 가역성을 나타낸 도 6f의 결과보다 상대적으로 높았다. 이러한 결과는 PS80을 함유하는 100 mg/mL IgG 마이크로비드의 가역성이 n-옥탄올의 최소화된 함량으로 변하지 않았기 때문에, 잔류 용매(주로 n-옥탄올)의 원인으로 초기 결과를 해석할 수 있었다.

또한, 도 6g 및 6h에 나타낸 바와 같이, 더 빠른 탈수 시간은 크기 분포를 감소시켜 더 낮은 초기 단백질 농도에서 3.47 μm의 최소 평균 값 및 1.27의 최소 스팬 값을 나타내었다. 상기 결과는 단백질 마이크로비드의 크기 분포 및 가역성에 영향을 미치는 공정 변형의 효과를 나타내었다.

트레할로스를 함유한 IgG 마이크로비드는 단백질 응집의 증가 징후 없이 두 단백질 농도에서 재구성 후 가장 높은 가역성을 나타내었다. 그러나, 100 %에서 99 %로 약간의 회복 감소가 있었으며, 이는 건조 온도 상승으로 인한 손실로 예측된다. 반면에, 더 낮은 초기 단백질 농도에서 더 큰 크기의 이상치가 관찰되었다. 그럼에도 불구하고 트레할로스에 의한 응집이 낮은 위험으로 결정되었기 때문에 더 이상의 조사는 수행되지 않았다. 또한, 조정된 건조 공정이나 초기 단백질 농도에 의해 트레할로스를 함유하는 IgG 마이크로비드의 입자 농도는 도 6i에 나타낸 바와 같이 큰 변화가 없었으며, 이는 점착성이 잔류 용매가 아닌 수성 수분에 의해 발생했음을 시사한다.

실험예 7. IgG 마이크로비드에 대한 낙하 테스트 및 열 노출

도 7a는 단단한 벤치(bench)에 10회 반복적으로 떨어뜨리기 전후에 바이알(vial)에서 165 mg/mL IgG 용액(즉, pH 6.8, 22.5 mg/mL 글리신 내)의 광학적 차이를 보여준다. 이는 충돌하자마자 캐비테이션(cavitation) 버블 및 거품이 생성되었으며 거품만 남기고 버블은 빠르게 사라졌다. 이에 비해, 도 7b에 나타낸 IgG 마이크로비드는 10회 반복적으로 떨어뜨린 후에 유리 바이알에 표면 흡착을 나타냈으며, 부드럽게 흔들어 재구성하는 동안 녹았다.

또한, 도 7c에 나타낸 바와 같이 트레할로스 및 PS80을 사용하여 제조한 마이크로비드에서 IgG의 가역성은 각각 약 94 %와 90 %를 나타낸 반면, 용액에 남아있는 단량체는 가장 낮은 약 81 %를 나타내었다. 결과적으로, 마이크로비드에서 IgG는 용액에서보다 기계적 스트레스 하에서 더 안정한 것을 확인하였다.

바이알과 주사기의 부주의한 낙하는 거의 생산 후, 특히 배송 및 보관 중 또는 투여 직전에 발생한다. 기계적 충격은 입자 형성 및 단백질 응집을 유발하는 치료용 단백질에 대한 부작용으로 나타났다. 그 효과는 용액 내 단백질에 국한되지 않고 동결 건조된 제품으로 단백질 침전물 파손을 유발하여 재구성시 눈에 보이지 않는 입자와 탁도를 증가시킨다. 더욱이 플라스틱 주사기에 실리콘 오일이 존재함으로써 눈에 보이지 않는 입자의 형성이 가속화되었다. 낙하 시험에 의한 해로운 영향은 캐비테이션의 원인과 그 붕괴로 인해 자유 라디칼, 고온 및 2 차 충격파 또는 거품이 공기-액체 층 표면에 흡착된 단백질 분자가 상호 작용하도록 유발하는 원인으로 설명될 수 있다. 사실, 용액 내 고농도의 IgG는 캐비테이션 스트레스의 영향을 더 많이 받아 단량체 감소와 HMW 증가로 이어졌다. 대조적으로, 마이크로비드의 IgG는 스트레스의 영향을 받지 않았으며 재구성시 더 높은 단량체 함량을 유지하였다.

반면, 트레할로스를 함유하는 IgG 마이크로비드는 PS80 함유 IgG 마이크로비드보다 단량체 가역성이 상대적으로 높았다. 이는 트레할로스가 PS80보다 IgG의 기계적 스트레스를 부분적으로 예방했음을 시사한다. 그 결과는 낙하로 인한 산화 또는 열로부터 단백질을 보호하기 때문에 추측할 수 있다. 이전에 트레할로스는 동물 모델에서 활성산소종의 과잉 생산을 억제하고, 열 충격 동안 효모 세포에서 단백질을 안정화시켰으며, 산화 스트레스로부터 마이크로 캡슐화된 어유를 보호했다. 상기 결과로부터 트레할로스가 단백질과 마이크로 입자에 대한 스트레스 내성과 같은 역할을 한다는 가설을 세울 수 있다.

추가로, 새로 준비된 샘플을 2시간 동안 55 ℃의 고온에서 바이알에 배양하여 수행하였다. 그 결과, 도 7d에 나타낸 바와 같이 용액 내 IgG 165 mg/mL는 약 78 %에 달하는 단량체 손실이 가장 높은 반면, 트레할로스와 PS80을 사용하여 제조한 IgG 마이크로비드는 각각 약 97 %와 87 %를 나타내었다. 결과는 트레할로스를 첨가할 경우 마이크로비드에서 IgG의 안정성을 일관되게 보여준다. 또한 단량체 함량의 손실이 느리고 고온에 의한 단백질 응집 형성이 적기 때문에 용액보다 보관 기간이 더 길다는 것을 잠재적으로 나타낸다.

실험예 8. 래트에서 재구성된 IgG 마이크로비드의 PK 프로파일

생체 내(in vivo) 연구를 위한 IgG 마이크로비드는 이전에 최적화된 마이크로비드 준비 방법을 기반으로 준비되었다; pH 4.0에서 25 mM 아세테이트 완충액에 미리 혼합된 300 mM 트레할로스를 함유하는 25 mg/mL의 초기 IgG 농도, 4 ℃ n-옥탄올, 소수성 SPG 멤브레인, 30초 볼텍싱, 에탄올로 3회 헹굼, 그런 다음 35 ℃에서 48시간 동안 200 mTorr에서 진공 압력으로 진공 건조.

하기 표 2는 도 8에 표시된 두 가지 다른 용량에서 용액 및 마이크로비드(즉, 재구성 후)에서 IgG에 걸친 약동학적 매개 변수 목록을 요약한다.

Test materials	Dose (mg/kg)	Route	AUC 0-28 (μg·day/mL)	C max (μg/mL)	T max (day)	T 1/2 (day)
IgG solution	25	IM	2000 ±520.4	156 ±22.9	3.4 ±2.1	7.9 ±6.5
IgG microbead (dissolved)	25	IM	1955 ±340.5	169 ±46.6	3.1 ±2.8	9.1 ±6.3
IgG solution	50	IM	4655 ±489.7	382 ±32.5	3.9 ±2.6	7.2 ±3.9
IgG microbead (dissolved)	50	IM	4975 ±1099	363 ±41.1	4.4 ±2.7	7.4 ±2.9

상기 표 2 및 도 8에 나타낸 바와 같이, PK 매개 변수는 두 가지 다른 용량에서 용액 및 마이크로비드 내 IgG를 비교하였을 때 유의한 차이를 나타내지 않았다(p-value > 0.05). IgG 마이크로비드에 의해 25 mg/kg에서 T_1/2가 7.9일에서 9.1일로 약간의 이동이 있었지만 통계적으로 차이가 발견되지 않았기 때문에 이상치로 인해 고려되었다. 더욱이, 다른 전하 변이를 가진 정제된 단일 클론 항체에 대한 초기 PK 연구가 생물학적 기능에 덜 영향을 미쳤기 때문에 pH 차이(즉, pH 4.0에서의 마이크로비드 및 pH 6.8에서의 용액)의 영향이 적었고, 상기 현상은 고용량에서 관찰되지 않았다.

결론적으로, 단일 IM 주입 후 용액 및 마이크로비드에서 IgG의 모든 T_max 및 T_1/2 값은 동일했다. 마찬가지로, 용액 내 IgG의 AUC_0-28 및 C_max는 97 % 이상의 생물학적 동등성에 도달하는 용량 강도에 따라 유사했다(즉, AUC_{마이크로비드}/AUC_용액). 전반적으로 재구성 후 IgG 마이크로비드는 시판된 제품에서 유래된 IgG와 PK 프로파일에서 거의 동일하게 나타났다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (14)

1. 하기 단계를 포함하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법:
   (a) 단백질을 공정용 안정화제 및 유기 용매에 혼합하여 제조한 에멀젼을 교반하고 단백질을 탈수하는 단계;
   (b) 상기 에멀젼을 교반하고 단백질을 탈수하여 생긴 침전물을 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및
   (c) 상기 상층액 제거 후 건조하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 단백질은 항체, 압타머, 융합 단백질, Fc 융합 단백질, PEG 화 단백질, 합성 폴리펩티드, 단백질 단편, 리포단백질, 효소, 호르몬, 면역원성 단백질, 구조 펩티드, 및 펩티드 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 유기 용매는 물과 섞이지 않는 비수성 유기 용매로서 f(water saturation fraction) 값이 0.5 이하인 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 유기 용매는 카보네이트계, 에스테르계, 에테르계, 케톤계, 알코올계, 비양성자성 용매, 및 이들의 이성질체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 유기 용매는 n-옥탄올인 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 공정용 안정화제는 희석제 및 사카라이드(saccharide)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 공정용 안정화제는 트레할로스, 만니톨, 및 수크로오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서 에멀젼을 교반하기 전 시라스 다공성 유리(Shirasu porous glass, SPG) 멤브레인 또는 마이크로 칩을 통해 단백질을 유화시키는 단계를 더 포함하여 단백질 마이크로비드의 입자 형태 및 크기를 균일하게 만드는 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 단백질 마이크로비드는 가역성이 90 % 내지 100 %인 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 마이크로비드는 물리적 충격 또는 40 ℃ 내지 70 ℃의 고온 스트레스에 대한 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
    
11. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 탈수는 10초 내지 20분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
    
12. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 건조는 25 ℃ 내지 40 ℃에서 24시간 내지 130 시간 동안 50 mTorr 내지 300 mTorr의 압력으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
    
13. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 마이크로비드는 주사제, 흡입제, 패취제, 및 외용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드의 제조 방법.
    
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 단백질 마이크로비드로서,
    상기 단백질 마이크로비드는 가역성이 90 % 내지 100 %이고, 물리적 충격 또는 40 ℃ 내지 70 ℃의 고온 스트레스에 대한 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는, 단백질 마이크로비드.