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KR20220121826A - 시료 처리 바코딩된 비드 조성물, 방법, 제조, 및 시스템 - Google Patents

시료 처리 바코딩된 비드 조성물, 방법, 제조, 및 시스템 Download PDF

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KR20220121826A
KR20220121826A KR1020227023181A KR20227023181A KR20220121826A KR 20220121826 A KR20220121826 A KR 20220121826A KR 1020227023181 A KR1020227023181 A KR 1020227023181A KR 20227023181 A KR20227023181 A KR 20227023181A KR 20220121826 A KR20220121826 A KR 20220121826A
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KR
South Korea
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barcode
composition
molecules
region
sequence
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227023181A
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English (en)
Inventor
아담 맥코이
칼리안 핸디크
조나단 벨
비샬 샤르마
시다 왕
Original Assignee
바이오 래드 래버러토리스 인코오포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오 래드 래버러토리스 인코오포레이티드 filed Critical 바이오 래드 래버러토리스 인코오포레이티드
Publication of KR20220121826A publication Critical patent/KR20220121826A/ko
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Abstract

표적 물질 분리용 조성물의 실시예는 본체 및 본체에 결합되고 조성물의 기능화를 위해 구조화된 하나 이상의 분자를 포함한다. 실시예에서, 하나 이상의 분자 각각은 링커 영역; 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 절편 또는 올리고 결합 영역; 하나 이상의 바코드 영역(들); 고유 분자 식별자; 제조-촉진 절편; 활성 절편; 및 분자 가위 또는 절단 영역; 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 여기서 다양한 영역은 조성물에 기능성을 제공하기 위하여 함께 결합될 수 있다. 또한, 본 발명(들)은 표적 물질 포집의 맥락에서 (예를 들어, 단일 세포 또는 기타 생물학적 물질로부터), 조성물의 제조 및 다양한 적용을 포함한다.

Description

시료 처리 바코딩된 비드 조성물, 방법, 제조, 및 시스템
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/945,006호의 이익을 주장하며, 이는 전체 참조로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 세포 포집 및 세포 처리 분야에 관한 것으로, 더 구체적으로는, 표적 물질 반응용 시료 처리 바코딩된 비드를 위한 새롭고 유용한 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다.
세포-특이적 약물 검사, 진단 및 기타 분석에 대한 관심이 높아짐에 따라, 개별 세포 분리, 식별 및 회수(retrieval)를 허용하는 시스템 및 방법이 매우 바람직해지고 있다. 단일 세포 포집 시스템 및 방법은 이러한 적용에 특히 유리한 것으로 나타났다. 그러나, 단일 세포 포집 및 후속 분석을 위한 관련 공정 및 프로토콜은 종종 세포를 적당히 유지하기 위하여 특정 방식으로 및 높은 정밀도로 수행되어야 한다. 또한, 고밀도 플랫폼에서 표적 물질의 효율적인 회수는 많은 과제를 안고 있다. 또한, 단일-세포 분석을 허용하는 방식으로 표적 물질의 포집 및 회수를 포함하는 적용을 위해 물질의 조성이 상당히 개선될 수 있다. 따라서, 이러한 공정은 사용자에게 시간이 많이 소요될 수 있으며, 광범위하고 반복적인 수동 라이브러리 제조 및 선택 공정을 필요로 할 수 있고, 자동화에 적합하지 않을 수 있으며, 따라서 세포 손상 (예를 들어, 원치 않는 생존력 손실 면에서), 높은 배경 잡음율 (background noise rates), 상승된 위양성율(elevated false positive rates), 또는 신뢰할 수 없는 실험 결과를 야기할 수 있다.
따라서, 세포 포집 및 세포 처리 분야에서 시료 처리 및 표적 물질 회수를 위한 새롭고 유용한 시스템 및 방법을 만들고 표적 생체물질의 라이브러리 제조에 필요한 단계를 최소화할 필요가 있으며, 여기서 일 실시예는 (예를 들어, 일반적으로 기능성 입자를 포함하는 반응 환경으로 전달되는 작업흐름(workflow)에서 바코딩된 올리고뉴클레오티드의 사용을 통해) 분자 바코팅을 이용한다. 또한, 바코딩된 비드의 기재된 실시예의 간소화된 제조 방법을 대량으로 생성할 필요가 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대한 하기의 기재는 본 발명을 이들 바람직한 실시예로 제한하기 위한 것이 아니라, 통상의 기술자가 본 발명을 만들고 사용할 수 있도록 하기 위한 것이다.
1. 이점
본 발명(들)은 종래의 시스템, 방법, 및 조성물에 비해 여러 이점을 부여할 수 있다.
본 발명(들)은 시료로부터 표적 생물학적 물질의 포집, 추출, 및/또는 회수를 용이하게 하기 위한 비-자연적으로 발생하는 조성물을 제공하는 동시에, 시료에서 분리된 단일 세포일 수 있는 시료의 분배로부터 회수된 각 바이오마커 분자에 대한 바코딩을 제공하는 이점을 부여한다. 이러한 조성물은 자연 상태에서 변형된 물질을 포함할 수 있다 (예를 들어, 천연 조성물과 구조적 차이를 제공한다는 점에서). 또한, 본 발명(들)은 물질의 조합에 관한 것으로, 여기서 물질의 조합은 비-자연적으로 발생한다 (예를 들어, 기재되고 청구된 조성물에 대해 자연적으로 발생하는 대응물이 없다).
또한, 본 발명(들)은 라이브러리 제조 공정의 단순화를 생성하기 위해, 기저 물질(base material)의 신규한 조성물 및 성분의 화학을 포함한다.
또한, 본 발명(들)은 절단을 모니터링하고 및/또는 생물학적 시료로부터 처리된 성분을 정량화는 능력을 갖는, 표적 물질의 분리를 허용하는 절단가능한 부위를 갖는 신규한 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명(들)은 고-밀도 포집 플랫폼의 고-측면 웰로부터 표적 물질 (예를 들어, 비드, 세포, 방출된 핵산 물질 등)의 효율적인 회수를 위한 메커니즘을 제공하는 이점을 부여한다. 포집 플랫폼의 웰의 밀집(close packing)으로 인해, 일반적으로 이 시나리오에서 회수가 어렵고 비-효율적이다. 또한, 기재된 회수 메커니즘은 표적 물질에 허용가능한 양의 전단 응력 및 그렇지 않으면 후속 처리 단계를 방해할 기타 잠재적인 응력을 가한다.
또한, 본 발명(들)은 표적 분자 및/또는 기질 (예를 들어, 챔버 벽)에 결합된 분자를 포집하기 위한 비드의 제조 방법을 제공하는 이점을 부여하며, 여기서 분자는 시료 처리를 위해 감지될 수 있는 고유 바코드 세트를 포함한다.
또한, 본 발명(들)은 표준 공정이 비효율적/노동 집약적(labor intensive)일 수 있는 웰로부터의 표적 물질 회수 공정과 관련하여 시스템 작업자의 부담을 줄이는 이점을 부여한다.
또한, 본 발명(들)은 표적 물질이 회수되는 (비-표적 물질이 회수되지 않는) 효율성을 증가시키는 이점을 부여한다. 따라서, 선택적인 회수 효율성은 처리 시약 및 기타 물질 비용 (필요한 부피 감소로 인한), 처리 부담, 및 개선된 신호 대 잡음 비와 관련된 후속 비용을 줄일 수 있다. 예를 들어, 본 발명(들)은 시스템 작업자가 소량의 시약을 구입하며, 표적 분자의 성공적인 증폭에 필요한 분할 수를 줄이고, 생성물을 함유하지 않으나 하나의 공정 단계에서 다음 공정 단계로 넘어가는 다른 올리고뉴클레오티드 태그로부터 표적 올리고뉴클레오티드 생성물의 SPRI-기반 정리(clean-up) 및 크기 선택을 수행할 필요성을 제거할 수 있게 한다. 이러한 표적 생성물의 개선된 회수 및 비-표적 생성물의 이월(carryover)의 감소는 자료 분석의 복잡성을 감소시킬 수도 있으며, 원하는 바이오마커 분석과 관련된 더 사용가능한 자료를 제공할 수도 있다. 이것은 비용을 절약하거나, 시약 낭비를 줄이거나, 또는 다른 적당한 결과를 가져오는 기능을 할 수 있다.
또한, 본 발명(들)은 기재된 조성물, 방법 및 시스템에 의해 제공되는 더 많은 수의 표적 판독으로 인해, 원하는 표적에 대해 더 큰 시퀀싱 깊이를 제공하는 이점을 부여한다.
또한, 본 발명(들)은 단일 세포 포집, 표적 물질 회수, 및 후속 처리에 관련된 프로토콜의 적어도 부분적인 자동화를 가능하게 하는 이점을 부여한다. 예를 들어, 인간 작업자 사용자는 방법의 일부 또는 전체에서 제거될 수 있다. 또한, 시스템(들) 및/또는 방법(들)은 종래의 시스템 및 방법에 비해 프로토콜의 성능에서 더 나은 정확도를 가능하게 할 수 있다. 또한, 이러한 발명 중 일부는 액체 처리 로봇을 이용한 완전 자동화에 훨씬 더 적합하다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명(들)은 임의의 다른 적당한 이점을 부여할 수 있다.
2. 기능성 비드 조성물
도 1에 나타낸 바와 같이, 표적 물질 분리용 조성물 (100)의 실시예는 본체 (110) 및 본체 (110)에 결합되고 조성물 (100)의 기능화를 위해 구조화된 하나 이상의 분자 (120)를 포함한다. 실시예에서, 하나 이상의 분자 (120) 각각은 링커 영역 (130); 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 절편 또는 올리고뉴클레오티드 결합 영역 (140); 하나 이상의 바코드 영역(들) (150); 고유 분자 식별자 (160); 제조-촉진 절편 (170); 활성 절편 (180); 및 분자 가위 또는 절단 영역 (190); 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 여기서 다양한 영역은 조성물에 기능성을 제공하기 위하여 함께 (예를 들어, 순서대로) 결합될 수 있다. 적용에서, 조성물 (100)은 추출 작업, 증폭 공정, 크기-기반 정제 공정, 결합 공정, 방출 및 회수 공정, 및 단일-세포 분석을 위한 기타 반응 (예를 들어, 분자 반응)을 용이하게 하도록 구성된 다양한 분석을 위한 결합된 올리고뉴클레오티드 분자 세트를 각각 기능화된 입자 세트로 제공될 수 있다.
조성물 (100)은 수동, 반-자동, 및/또는 자동 작동 모드에서 단일-세포 분석을 수행하도록 구성된 시스템으로 작동하도록 구성될 수 있다. 이러한 시스템의 실시예, 변화 및 예는 2012년 7월 25일에 출원된 "세포 포집 시스템 및 사용 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 13/557,510호, 2014년 5월 28일에 출원된 "세포의 분리 및 분석을 위한 시스템 및 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 14/289,155호, 2017년 2월 24일에 출원된 "세포의 분리 및 분석을 위한 시스템 및 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 15/422,222호, 2017년 11월 16일에 출원된 "입자의 회수 및 분석을 위한 시스템 및 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 15/815,532호, 및 2018년 8월 28일에 출원된 "세포의 분리 및 분석을 위한 시스템 및 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 16/115,059호 중 하나 이상에 기재되며, 이들 각각은 전체 참조로 포함된다.
조성물 (100)은 역전사 반응 (RT-반응), 면역화학, DNA 반응, mRNA FISH 반응, 근접 결찰 반응, 다리 증폭 반응, 촉매 효소 반응, 혼성화 반응, 제한 분해 반응, 증폭 반응 (예를 들어, mRNA 및/또는 DNA PCR), 및 기타 적당한 반응 중 하나 이상과 관련된 공정 및 반응에 대해 구성될 수 있다. 이러한 반응은 온-칩(on-chip) 및/또는 오프-칩(off-chip)에서 수행될 수 있으며, 여기서, 단일-세포 분석을 위한 미세유체 칩의 실시예, 변화, 및 예는 2012년 7월 25일에 출원된 "세포 포집 시스템 및 사용 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 13/557,510호, 2014년 5월 28일에 출원된 "세포의 분리 및 분석을 위한 시스템 및 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 14/289,155호, 2017년 2월 24일에 출원된 "세포의 분리 및 분석을 위한 시스템 및 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 15/422,222호, 및 2017년 11월 16일에 출원된 "입자의 회수 및 분석을 위한 시스템 및 방법"이라는 제목의 미국 출원 번호 제 15/815,532호에 기재되며, 이들 각각은 전체 참조로 포함된다.
2.1 기능성 비드 코어
본체 (110)는 각각의 분석 및 반응의 실행에 관하여 조성물에 대한 기능화를 제공하기 위하여, 하나 이상의 분자 (120)가 결합될 수 있는 기질을 제공하는 기능을 한다.
형태와 관련하여, 본체 (110)는 미소구체(microsphere)의 형태를 가질 수 있다. 대안적으로, 본체 (110)는 본체 (110)를 통해 취한 단면이 비-원형인, 비-구형 (예를 들어, 타원형, 프리즘형, 다면형, 무정형 등) 본체의 형태를 가질 수 있다. 그러나, 본체 (110)는 대안적으로 다른 적당한 형태를 가질 수 있다. 치수와 관련하여, 본체 (110)는 ± 0.05 내지 5 미크론의 허용오차를 갖는, 5-50 미크론의 직경 (또는 특성 폭)을 가질 수 있다. 또한, 입자 집단에 걸친 본체 (110)의 균일성은 의도된 단일 세포 공정의 다양한 단계의 완료 시 원하는 회수 효율 거동을 가능하게 할 수 있다. 특정 예에서, 본체 (110)는 20 미크론 ± 1 미크론의 직경을 가진다; 그러나, 예시적인 본체 (110)의 변화는 다른 형태를 가질 수 있다.
실시예에서, 본체 (110)는 개별 웰 내에서 단일 세포-입자 쌍을 공동-국소화하고 공동-포집하기 위하여, 단일 표적 세포와 함께, 조성물 (100)의 단일 본체 (110)만이 상기 기재된 칩의 웰에 들어갈 수 있도록 구성된 특성 치수를 가진다. 그러나, 조성물 (100)의 본체 (110)는 다른 미세유체 또는 비-미세유체 분석 적용을 위해 구성된 또 다른 적당한 특성 치수를 가질 수 있다.
밀도와 관련하여, 본체 (110)는 조성물 (100)이 작업 동안 중력에 의해 공정 액체(들) 내에 침전되도록, (예를 들어, 특정 반응 또는 분석과 관련하여) 조성물 (100)과 함께 사용하도록 의도된 공정 액체의 밀도보다 더 큰 밀도를 갖도록 구성된다. 실시예에서, 본체 (110)의 밀도는 1.02 g/cm3보다 크지만, 본체 (110)는 변화에서 다른 적당한 밀도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본체 (110)는 (예를 들어, 본체 (110)가 공정 액체의 흐름과 함께 운반되기를 원하는 단계를 용이하게 하기 위하여) 일 실시예에서 의도된 공정 액체와 동일한 밀도를 갖도록 구성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본체 (110)는 본체 (110)가 부력이 있고 시료의 표적 또는 비-표적 물질의 분리에 사용될 수 있도록, 공정 액체에 대해 부력이 되도록 구성될 수 있다.
밀도 및 형태와 관련하여, 본체 (110)는 (예를 들어, 미크론 규모, 나노미터 규모, 하위-나노미터 규모에서) 연속 본체일 수 있다. 대안적으로, 그 변화는 도 2에 나타내었으며, 본체 (110)는 (예를 들어, 본체 (110)의 거시적 형태로부터 축소된 형태를 갖는, 다른 형태를 갖는) 더 작은 본체 (115)의 클러스터로 구성될 수 있다. 이러한 구성은 더 작은 본체 (115)의 표면의 응집으로 인해 더 큰 전체 표면적을 제공할 수 있으며, 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 단일 본체의 거시적 거동 (예를 들어, 대략적인 강성/기타 기계적 특성 면에서)을 생성할 수 있고, 및/또는 원하는 표면 화학 거동을 제공하기 위해 분석에 사용한 후 (예를 들어, 포집 후) 용해될 수 있다. 더 작은 본체 (115)의 클러스터는 클러스터의 클러스터 형태를 일시적으로 또는 "영구적으로" 유지할 수 있는 클러스터링 물질 (116)에 의해 둘러싸일 수 있다 (예를 들어, 감쌀 수 있다). 예에서, 클러스터링 물질 (116)은 하이드로겔을 포함할 수 있으며, 여기서 하이드로겔은 (예를 들어, 가교결합 면에서, 용해가능성 면에서, 다공성 면에서, 밀도 면에서, 열 특성 면에서, 광학적 특성 면에서, 전하 면에서, 조성 면에서, 기계적 특성 면에서, 기타 물리적 특성 면에서 등) 조성물의 의도된 사용에 적합한 특성을 가진다. 관련된 사용의 적용에서, 클러스터링 물질 (116)은 분석에서 사용 단계 동안 더 작은 본체 (115)의 클러스터링된 형태를 유지할 수 있으며, 그 다음 더 작은 본체 (115)를 비-클러스터링된 상태로 전환하기 위하여 (예를 들어, 더 작은 본체 각각의 표면 화학에 대한 개선된 접근을 제공하기 위하여) 용해되거나 또는 제거될 수 있다.
예에서, 복합 미소구체가 20 미크론의 총 직경을 가졌으나 복합 입자의 표면의 표면적은 더 작은 미소구체의 존재 또는 특정 미리-설계된 어레이로 정렬된 특정 반응기의 존재에 의해 상당히 향상되도록, (예를 들어, 0.5 마이크로미터 직경을 갖는) 다수의 작은 미소구체로 구성된 복합 미소구체는 (예를 들어, 19 미크론 직경을 갖는) 더 큰 미소구체의 표면과 반응하였다.
실시예에서, 기저 물질 및 표면 특성은 성능의 상당한 유연성을 제공하기 위해 상이할 수 있다. 예를 들어, 더 큰 미소구체는 경질 물질(hard material)일 수 있으며, 작은 미소구체는 하이드로겔일 수 있다. 다른 예에서, 더 큰 미소구체는 비-자성일 수 있으나, 더 작은 미소구체는 자성일 수 있다. 또 다른 예에서, 더 큰 미소구체는 자성이며, 더 작은 미소구체는 자성 또는 상자성이다. 또 다른 예에서, 더 큰 미소구체는 투명 물질로 구성될 수 있는 반면, 더 작은 미소구체는 광학적으로 (예를 들어, 명시야 또는 형광성) 코딩될 수 있다. 또 다른 예에서, 더 큰 미소구체는 용해가능하게 구성될 수 있는 반면, 더 작은 미소구체는 용해불가능이다. 복합 미소구체의 또 다른 실시예는 증가된 반응의 표면적을 제공하는 하이드로겔 또는 기타 물질(들)의 얇게 코팅된 (예를 들어, 1-3 미크론 층) 기저 경질 미소구체 세트를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 혁신적인 미소구체는 특정 크기의 바이오마커가 미소구체로 침투하여 특정 반응에 참여하도록 하는 추가 이점을 제공할 것이다. 복합 미소구체의 또 다른 예는 복합 미소구체의 표면으로부터 미소구체의 중심까지 이어지는 미세-터널(micro-tunnels) (예를 들어, 0.1-2 미크론 직경)을 갖는 고체 입자 (예를 들어, 20 미크론 직경)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 미세-터널은 전체 입자의 직경을 가로질러 갈 수 있다. 또 다른 실시예에서, 미세-터널은 복합 물질의 총 표면적을 증가시키는 기공이다. 또 다른 실시예에서, 큰 미소구체는 내부의 조성물과 비교하여 상이한 기능성 조성물을 갖는 표면 상에 얇은 코팅을 가질 수 있다. 상단 표면은 가교-결합될 수 있으나, 내부 물질은 부드럽거나 또는 용해가능할 수 있다.
변화에서, 각각의 더 작은 본체 (115)는 특성 및 조성물에서 동일할 수 있다; 그러나, 다른 변화에서, 더 작은 본체 (115) 중 하나 이상은 분석 또는 반응의 상이한 부분에 대해 상이한 기능성을 제공하기 위하여, (예를 들어, 코어에서 표면까지) 클러스터 내의 상이한 특성, 조성물 및 분포를 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 클러스터의 제 1 영역 (예를 들어, 표면)은 분석 또는 반응의 제 1 부분을 수행하기 위해 제 1 특성 세트, 조성물 및/또는 표면 화학을 가질 수 있으며, 용해되거나 또는 제거된 다음, 클러스터의 제 2 영역 (예를 들어, 코어)은 분석 또는 반응의 제 2 부분을 수행하기 위해 제 2 특성 세트, 조성물 및/또는 표면 화학을 가질 수 있다.
특정 예에서, 1 미크론 (적당한 허용오차 포함)의 직경을 갖는 디비닐벤젠 가교결합 (PS-DVB)을 갖는 폴리스티렌으로 각각 구성된 대략 750의 더 작은 본체 (115) 세트는 단일 연속 20 미크론 입자의 전체 표면적의 ~7.5배인 전체 표면적을 갖는 20 미크론의 총 직경을 제공하기 위해 용해가능한 하이드로겔에 클러스터링된다. 다른 예에서, 본체 (110)는 더 작은 본체가 폴리-아크릴아미드 매트릭스로 구성되고 클러스터링 물질이 이황화 가교결합제 (예를 들어, BAC)를 포함하는 하이드로겔로 구성될 수 있다. 그러나, 예의 변화는 다른 적당한 방식으로 구성될 수 있다.
열 특성과 관련하여, 본체 (110)는 하한 온도 (예를 들어, 저온 반응 및 공정과 관련된, 저장과 관련된 등)와 상한 온도 (예를 들어, 고온 반응 및 공정과 관련된) 사이에서 작동하도록 구성된다. 특정 예에서, 하한 온도는 -20C 내지 4C (예를 들어, 냉장 저장)이며, 상한 온도는 90C 내지 120C (예를 들어, 변성 반응)이다. 그러나, 본체 (110)는 다른 작동 온도에 대해 구성될 수 있다.
물리적 특성과 관련하여, 본체 (110)는 용액 (예를 들어, 저장 동안 완충액, 분석 수행 동안 용액)에서 구조를 유지하도록 구성된다. 이와 같이, 본체 (110)는 비-팽윤 및 비-침출이 되도록 구성된다. 그러나, 대안적인 실시예에서, 본체 (110)는 (예를 들어, 처리 또는 적용에서의 사용을 위해 원하는 크기 또는 형태를 달성하는 것과 관련하여) 원하는 양만큼 팽윤하도록 구성될 수 있으며, 분석 수행을 위해 특정 화합물 (예를 들어, 공정 시약)을 침출하도록 및/또는 분석 또는 기타 공정의 수행 동안 원하는 방식으로 용해하도록 구성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 입자는 특정 완충액 및/또는 물리적 조건에서의 사용이 입자가 마이크로웰에 쉽게 들어갈 수 있지만 특정 완충액 조건 하에서는 마이크로웰에 포획될 수 있도록 잘-정의된 맞춤형 팽윤성을 가질 수 있다. 또한, 물리적 특성과 관련하여, 본체 (110)는 분석 또는 기타 공정의 수행과 관련하여 (예를 들어, 친수성에서 소수성까지의 스펙트럼에서) 원하는 정도의 친수성을 갖도록 구성될 수 있다. 유체 접촉과 관련된 표면 특성과 관련하여, 본체 (110)는 (예를 들어, 접촉각 등의 면에서) 원하는 습윤성을 갖도록 구성될 수 있다. 따라서, 본체 (110)의 변화는 사용 조건에서 원하는 수준의 안정성을 제공하기 위해, 적당한 유형의 가교결합 (예를 들어, 화학적 가교결합, 물리적 가교결합 등) 및 가교결합의 백분율 (예를 들어, 아크릴아미드의 경우 1-10% 가교결합, 기타 물질의 경우 30-99% 가교결합, 또 다른 적당한 가교결합 범위)을 가질 수 있다.
다른 표면 특성과 관련하여, 본체 (110)는 원하는 다공성 (예를 들어, 200-2000A 등)으로 구성될 수 있다. 본체 (110)는 (예를 들어, 사용 동안 더 강력한 감지가능한 신호를 제공하기 위해 본체 (110)에 부착점을 제공함으로써) 적당한 링커 밀도의 달성을 가능하게 하기 위하여, 추가적으로 또는 대안적으로 원하는 로딩 밀도 (loading density, LD)로 구성될 수 있으며, 여기서 본체 (110)에 대한 첨가는 하기 부문 2.2에서 더 상세히 기재된다. 또한, 본체 (110)는 하기 부문 2.2에 기재된 링커 분자의 결합을 위한 표면 기 (예를 들어, 히드록실 기, 아민 기, 카복실 기, 설파이드 기, 실라놀(silanol) 기 등)를 포함할 수 있다. 예에서, 원하는 로딩 밀도 (LD)는 작용기 밀도의 1 umol/g 만큼 낮거나 또는 수백 umol/g 만큼 높을 수 있다.
자성 특성과 관련하여, 본체 (110)는 자기장에 반응하도록 구성될 수 있다 (예를 들어, 표적 또는 비-표적 물질의 분리 및/또는 회수를 포함하는 분석과 관련하여). 본체 (110)의 특정 영역 (예를 들어, 코어 영역)은 자성 (예를 들어, 자성, 상자성 등)일 수 있으며, 본체 (110)의 특정 영역 (예를 들어, 쉘 영역)은 본체 (110)의 변화에서 비-자성일 수 있다. 표면 특성과 관련하여, 본체 (110)는 표적 물질에 대한 결합을 용이하게 하거나 또는 기능성을 갖는 분자를 포함하는 제조를 용이하게 하기 위하여, 전하가 있거나 또는 없이 구성될 수 있다.
광학 특성과 관련하여, 본체 (110)는 비-형광성으로 구성될 수 있다 (예를 들어, 광학-기반 감지 분석을 방해하지 않도록). 그러나, 변화에서, 본체 (110)는 예를 들어 추적 목적을 위해, (예를 들어, 비-형광 방식을 통해, 형광 방식을 통해, 적외선 감지 방식을 통해, 열 감지 방식을 통해, 등) 광학적으로 감지가능하도록 구성될 수 있다.
기계적 특성과 관련하여, 본체 (110)는 사용 적용 동안 원하는 수준의 경도를 유지하기 위하여, 원하는 경도 (예를 들어, 모스 척도로 측정됨, 다른 경도 척도로 측정됨)를 갖도록 구성될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본체 (110)는 강성, 탄성 거동 (예를 들어, 계수(moduli) 면에서, 소성 및 탄성 변형 면에서 등), 점탄성 거동, 피로 내성(fatigue resistance), 파괴 내성(fracture resistance), 전단 강도(shear strength), 압축 강도, 인장 강도, 유동학적 거동 (rheological behavior) (예를 들어, 마모의 조건 하에서), 및 기타 기계적 특성 중 하나 이상과 관련된 원하는 기계적 특성으로 구성될 수 있다.
조성물과 관련하여, 본체 (110)는 폴리스티렌, 폴리스티렌-디비닐벤젠, 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 실리카, 실리카-겔, 비-다공성 유리, 다공성 유리, 코팅된 유리, 아가로오스, 아크릴아미드, 폴리아크릴아미드, 철, 강철(steel), 또는 세라믹 물질 중 하나 이상 및/또는 하나 이상의 적당한 물질의 조합으로 구성될 수 있다. 상기 및 하기에 언급된 바와 같이, 본체 (110)의 상이한 영역은 상이한 물질로 구성될 수 있다 (예를 들어, 코어 영역은 제 1 물질로 구성될 수 있으며, 쉘 영역은 제 2 물질로 구성될 수 있다). 일 실시예에서, 다중 쉘 영역으로서 또는 무정형 또는 정렬된 공간 배열과 같은 다른 구성으로 다중 영역이 있을 수 있다.
본체 (110)의 특정 예는 15-25 미크론의 직경 (예를 들어, 더 작은 직경이 미세유체 구조 내에서 사용하기에 여전히 적절한 방식으로 약간의 팽윤을 허용하는 경우), 80-1500A의 표면 다공성, 고분자 비드의 경우 20% 내지 80% 가교결합 (예를 들어, 디비닐벤젠에 의한 60% 가교결합을 갖는 폴리스티렌 또는 디비닐벤젠에 의한 80% 가교결합을 갖는 폴리스티렌), 링커 화학 (예를 들어, C18 태그 링커)의 결합을 위한 표면 기 (예를 들어, 아민 기, 히드록실 기, 실라놀 기), 및 반응 효율을 위한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기능화를 갖는, 폴리아크릴아미드 (예를 들어, 하기에 더 상세히 기재됨), 실리카 (예를 들어, 실리카 겔), 폴리스티렌, 또는 PMMA로 구성된다. 특정 예의 변화는 자성 기능성 (예를 들어, 분리 및 회수용)을 허용하기 위해 자성 (예를 들어, 자성, 상자성) 코어 또는 쉘을 가질 수 있다.
2.2 기능성 분자(들)
도 1에 나타낸 바와 같이, 조성물 (100)은 또한 본체 (110)에 결합되고 조성물 (100)의 기능화를 위해 구조화된 하나 이상의 분자 (120)를 포함한다. 실시예에서, 하나 이상의 분자 (120) 각각은 링커 영역 (130); 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 절편 (140); 바코드 영역 (150); 고유 분자 식별자 (160); 제조-촉진 절편 (170); 활성 절편 (180); 및 분자 가위 영역 (190); 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 여기서 다양한 영역은 조성물에 기능성을 제공하기 위하여 함께 (예를 들어, 순서대로) 결합될 수 있다. 하나 이상의 분자 (120)는 상이한 반응 또는 공정에 대해 원하는 화학 (예를 들어, 결합 화학)을 제공하도록 기능할 수 있으며, 변화에서, 하나 이상의 분자에 특정 올리고뉴클레오티드의 포함은 mRNA 결합, CITE-시퀀싱 프로브의 결합, 올리고뉴클레오티드 표지된 항체, 올리고뉴클레오티드 표지된 펩티드, 올리고뉴클레오티드 표지된 지질, 올리고뉴클레오티드 표지된 대사산물, 변형된 게놈 DNA, 비변형 게놈 DNA, DNA ATAC 시퀀싱, Hi-C 시퀀싱, 컷-n-태그 시퀀싱, 다리 증폭, 근접 결찰, 기타 분자 반응, 기타 단백질-태깅 작업, 및/또는 기타 반응에 대해 하나 이상의 분자를 조정할 수 있다. 또한, 하나 이상의 분자는 다양한 시퀀싱 플랫폼 (예를 들어, 차세대 시퀀싱 플랫폼, IlluminaTM 시퀀싱 플랫폼 등)에 대한 영역 (예를 들어, 특정 어댑터, 프라이머)을 포함함으로써 라이브러리 제조 작업을 용이하게 하도록 조정될 수 있다. 이와 같이, 하나 이상의 분자 (120)는 특정 올리고뉴클레오티드 절편의 포함에 의해 시퀀싱 또는 기타 반응과 관련된 수동 또는 자동 단계를 단순화할 수 있다.
실시예에서, 하나 이상의 분자 (120)는 본체(110)에 걸쳐 분포된 단일 분자, 동일한 분자 세트, 또는 상이한 분자 세트 (예를 들어, 제 1 및 제 2 분자, 다수의 상이한 분자)를 포함할 수 있다. 예를 들어, mRNA 포집 및 cDNA 합성을 포함하는 반응에서, 하나 이상의 분자 (120)는 mRNA 결합을 위한 제 1 서열을 갖고 상보적 cDNA 가닥의 생성과 관련된 제 2 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있다. 유사하게, 단백질 태그의 결합을 포함하는 반응에서, 하나 이상의 분자는 올리고뉴클레오티드 태그로 항체의 태깅을 감지함으로써 항체 결합을 감지하기 위한 제 1 서열을 갖는 분자, 및 합성을 위한 제 2 서열을 갖는 분자를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 정방향 및 역방향 프라이머를 제공하기 위한 상이한 분자 세트는 하나 이상의 분자 (120)에 존재할 수 있어, 다리 증폭을 허용하여 초기에 미소구체에 결합된 단일 세포로부터의 특정 핵산 단편을 증폭할 수 있다. 다양한 정방향 또는 역방향 프라이머의 상대적 비율은 다리 증폭 동안 특정 크기의 cDNA만이 최대화되도록 조정될 수 있다 (예를 들어, 600 미만의 염기쌍 또는 300 이상의 염기쌍 생성물). 그러나, 하나 이상의 분자 (120)의 서열은 다른 반응 및 공정에 적합할 수 있으며, 그 변화는 하나 이상의 분자 (120)의 상이한 구조적 특징과 관련하여 하기에 기재된다. 또한, 결합 기는 효소가 특정 크기에 도달하도록 mRNA에 대한 반응 생성물을 처리하고 생성하거나 또는 생성물이 특정 염기 크기보다 커지는 것을 방지할 수 있도록 효소 반응 동안 효소가 미소구체에 고정되도록 특정 비율로 하나 이상의 분자 (120)에 존재할 수 있다. 대안적으로, 구조적 특징은 보유된 분자의 크기를 원하는 크기 (예를 들어, 300bp보다 긴 것은 더 작은 크기로 분해됨)로 조정하기 위하여, 본체 (110)에 매우 근접한 특정 효소 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 제한 효소) 또는 기타 기능성 부분을 제외할 수 있다.
2.2.1 분자 - 링커
도 1에 나타낸 바와 같이, 본체 (110)는 링커 (130)를 포함하는 링커 세트를 포함할 수 있으며, 여기서 링커 (130)는 반응이 발생하기에 충분한 수의 분자/부위를 제공하는 방식으로 본체 (110)에 결합된 하나 이상의 분자 (120)의 밀도 및 간격을 제어하는 기능을 한다. 또한, 링커 세트는 본체(들)의 표면에 있는 분자가 접히거나 또는 원치 않는 구조 (예를 들어, 2차 구조, 3차 구조 등)를 형성하는 것을 방지하는 방식으로 하나 이상의 분자 (120)의 밀도 및 간격을 제어하는 기능을 하거나, 또는 다른 실시예에서 이러한 구조를 촉진하는 방식으로 밀도를 제어한다.
실시예에서, 링커 세트 내의 링커의 수는 결합 반응을 위해 표적화되는 단일 세포당 표적 분자의 수보다 많도록 구성된다. 하나의 예에서, 세포당 표적 분자의 수는 대략 50만 내지 100만 분자 또는 분자 단편이다; 따라서, 예에서, 링커 세트는 본체 (110)당 107-1010의 전장 올리고뉴클레오티드를 위치시키기 위한 107-1010의 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 과량의 전장 올리고뉴클레오티드는 반응 동안 포집된 더 많은 mRNAs (또는 다른 분자)를 야기한다. 그러나, 링커 세트는 다른 실시예에서 다른 수의 링커를 포함할 수 있다.
실시예에서, 링커 (130)는 본체 (110)의 표면에서 올리고뉴클레오티드 분자의 적당한 밀도를 제공하고 인접한 올리고뉴클레오티드 분자 사이에 적당한 간격을 제공하도록 구성된 분지형 링커를 포함한다. 변화에서, 분지형 링커는 부착의 결절 (nodes)과 함께 분지를 제공하는 덴드리머 (예를 들어, 대칭 덴드리머, 비대칭 덴드리머, 더블러 (doubler), 트레블러(trebler), 표지된, 비-표지된 등)이다. 하나의 변화에서, 덴드리머는 근원 결절(source node) (예를 들어, 본체 (110) 또는 본체 (110)에 근접한 영역에서의 부착을 위한), 및 2개의 말단 결절 (예를 들어, 하나 이상의 분자 (120)의 기능성 올리고뉴클레오티드 분자에 대한 부착을 위한 또는 본체 (110)의 원위(distal)에 있는 후속 덴드리머에 대한 부착을 위한)를 포함하는 y-모양의 덴드리머일 수 있다. 특정 예에서, 분지형 링커는 대칭 배가(doubling) 포스포라미다이트 덴드리머이다; 그러나, 특정 예의 변화는 다른 코어 화학 (예를 들어, 카보실란(carbosilane), 티올화(thiolated) 등) 및 구조를 사용할 수 있다. 이와 같이, 다른 변화에서, 덴드리머는 본체 (110)에 대한 올리고뉴클레오티드 분자의 결합 부위 및 간격을 제공하기 위해, 임의의 다른 적당한 수의 부착점, 화학, 및/또는 구조를 가질 수 있다.
또한, 분지형 링커는 선택가능한 부착 (예를 들어, 특정 화학에 특이적인 작용기를 가짐) 및/또는 선택가능한 절단을 위해 (예를 들어, 처리 동안, 분자 가위와 같은 올리고뉴클레오티드 절편의 방출을 위해) 구성될 수 있다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 링커로 유용한 덴드리머는 원하는 덴드리머 크기 및 말단 분지의 수 (예를 들어, 세대 수의 지수)가 달성될 때까지, 초기 분지 중심에서 시작하여 염기 시약 세트를 초기 분지 중심에 결합하고 염기 시약 세대를 순차적으로 첨가하여 형성될 수 있다. 염기 시약 작용기의 유형, 세대 수, 및 분자량은 링커의 설계를 통해 본체 (110)에 결합된 올리고뉴클레오티드 분자의 원하는 밀도를 달성하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 나선형 폭 (예를 들어, ~2nm)에 상응하는 원하는 직경에 상응하는 유체역학적 직경을 생성할 수 있다. 그러나, 덴드리머 링커의 최종 직경 (또는 다른 특성 치수)은 다른 설계 제약과 일치하도록 구성되거나 또는 다른 적당한 방식으로 구성될 수 있다.
2.2.2 분자 - PCR 절편(들)
도 1에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자 각각은 PCR-관련된 반응 (예를 들어, 증폭)의 수행을 위해 구성된 하나 이상의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 절편 (140)을 더 포함할 수 있다. PCR 절편(들)은 PCR 반응의 수행을 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상이한 유형의 핵산-관련된 및 단백질-관련된 반응과 관련하여 상기 나타낸 바와 같이 (및 도 4a 내지 4c에 나타낸 바와 같이), 하나 이상의 분자 (120)의 상이한 서열에 사용된 PCR 프라이머(들)는 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 제 1 변화에서, 하나 이상의 분자 (120)의 제 1 부분은 반응의 제 1 단계 (예를 들어, mRNA 결합, 항체의 결합, 기타 단백질 태그의 결합, 등)와 관련된 제 1 PCR 프라이머 절편 (141)을 포함할 수 있으며, 하나 이상의 분자 (120)의 제 2 부분은 반응의 제 2 단계 (예를 들어, cDNA 합성, 기타 합성, 기타 태깅, 기타 결합 등)와 관련된 제 2 PCR 프라이머 절편 (142)을 포함할 수 있다.
다른 변화에서, PCR 절편(들) (140)은 추가적으로 또는 대안적으로 조성물의 품질 관리를 위해 구성되고 감지가능한 PCR 핸들 절편 (143)을 포함할 수 있다. 그러나, 하나 이상의 분자 (120)의 변화는 추가적으로 또는 대안적으로 PCR 핸들 절편 (143)을 생략할 수 있다.
실시예에서, PCR 절편(들) (140)은 링커 (130) 세트 중 하나의 말단 부분 (또는 다른 부분)에 직접 결합된다. 그러나, 다른 변화에서, PCR 절편(들)은 다른 방식으로 올리고뉴클레오티드 분자의 다른 부분에 대해 결합될 수 있다.
실시예에서, PCR 절편(들) (140)은 5-30의 염기를 가질 수 있으며, 맞춤 (custom) 또는 비-맞춤(non-custom) 프라이머를 포함할 수 있다; 그러나, 대안적인 변화에서, PCR 절편(들) (140)은 다른 적당한 수의 염기를 가질 수 있다.
2.2.3 분자 - 바코드 영역 및 고유 분자 식별자 (UMI)
도 1에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자 (120) 각각은 조성물 (100)의 하나 이상의 분자 (120)를 이용하여 처리되거나 또는 유래된 (예를 들어, 합성된) 생물학적 물질 (예를 들어, 세포 물질)의 고유 식별을 가능하게 하는 기능을 하는 바코드 영역 (150)을 포함할 수 있다. 바코드 영역 (150)은 감지된 신호 및 사용가능한 판독과 관련하여 (예를 들어, 정확한 바코드에 대한 시퀀싱 판독의 할당 및 낭비된 판독의 감소와 관련하여) 잡음을 감소시키도록 구성될 수 있다. 하기에 더 상세히 기재된 제조 방법 (400)과 관련하여, 특정 본체 (110)에 결합된 모든 분자에 걸친 바코드 영역 (150)의 정확도 (의도하지 않은(unintentional) 결실, 치환 또는 첨가를 최소화하는 것과 관련하여)는 위양성 (예를 들어, 부정확하게 바코딩된 분자에 대한 신호의 일치)에 대해 낮은 오차율을 야기할 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 바코드 영역 (150)은 PCR 절편 (140)에 결합될 수 있거나 (예를 들어, 본체 (110)에 대해 PCR 절편 (140)의 원위) 또는 대안적으로 하나 이상의 분자 (120) 중 분자의 다른 부분에 결합될 수 있다.
바코드 영역 (150)은 하나 이상의 바코드 절편을 포함할 수 있으며, 여기서 바코드 절편의 제조 및 조립은 하기 부문 4에서 더 상세히 기재된다. 일부 변화에서, 바코드 절편은 대안적으로 바코드의 일부로 또는 바코드 절편과 독립적으로 사용될 수 있는 조립에 사용되는 부분 (예를 들어, 결찰 핸들 또는 PCR 확장 핸들과 같은 핸들)을 포함할 수 있다. 변화에서, 각 바코드 절편은 2-20의 뉴클레오티드 길이일 수 있다; 그러나, 대안적인 변화에서, 각 바코드 절편은 다른 적당한 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 각 바코드 절편은 2보다 큰 해밍 거리(Hamming distance) (예를 들어, 두 줄의 핵산을 동일하게 만드는데 필요한 치환의 수)를 가진다; 그러나, 대안적인 변화에서, 바코드 절편은 또 다른 적당한 해밍 거리를 가질 수 있다. 또한 각 바코드 절편은 GG (또는 특정 시퀀싱 플랫폼에 덜 적합한 기타 서열)로 끝나지 않도록 구성될 수 있다; 그러나, 바코드 절편은 다른 적당한 방식으로 구성될 수 있다. 바코드 영역 (150)은 하나 이상의 절편으로부터 구성되어 적당한 길이의 100만-1억의 고유 바코드를 생성할 수 있다; 그러나, 변화는 다른 적당한 수의 고유 바코드를 생성할 수 있다. 특정 예에서, 바코드 절편은 GG 염기에서 종료 없이 2의 해밍 거리를 갖는 875 (또는 그 이상)의 7-mers 세트로부터 선택되며, 여기서 서열은 비-자연적으로 발생한다. 특정 예에서, 바코드 영역은 함께 조립될 때, 5천만 고유 바코드를 생성하는 다중 절편으로 구성된다. 그러나, 특정 예의 변화는 다른 적당한 방식으로 구성될 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자 (120) 각각은 시퀀싱 플랫폼 (예를 들어, 차세대 시퀀싱 플랫폼)이 처리되는 입력 분자를 식별할 수 있도록 하는 분자 태그로서 기능하는 고유 분자 식별자 (UMI) (160)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 분자 (120)의 각 분자는 단일 UMI 또는 다중 UMIs를 가질 수 있다. 또한, UMI (160)는 도 1에 나타낸 바와 같이 바코드 영역 (150) (예를 들어, 바코드 영역 (150)의 원위)에, 또는 하나 이상의 분자 (120)의 분자를 따라 다른 위치에 결합될 수 있다.
2.2.4 분자 - 제조-촉진 절편
도 1에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자 (120) 각각은 특정 작업과 관련된 처리 단계를 단순화하거나 또는 감소시키는 기능을 하는 하나 이상의 제조-촉진 절편(들) (170)을 임의로 포함할 수 있다.
하나의 변화에서, 도 5에 나타낸 바와 같이, 제조-촉진 절편(들) (170)은 일반적으로 별도의 단계 (예를 들어, 그렇지 않으면 수동 방식으로)에서 실행되어야 하는 분자 서열의 포함에 의해 라이브러리 제조 단계를 단순화하도록 구성될 수 있다. 더 상세하게는, 하나 이상의 분자 (120)의 분자는 P5 어댑터 (예를 들어, IlluminaTM 흐름 세포의 경우)와 관련된 제 1 제조-촉진 절편 (170a)을 포함할 수 있으며, 여기서, 일부 변화에서, 제 1 제조-촉진 절편 (170a)은 부분(partial) P5 어댑터 및 관련 인덱스에 대한 서열을 포함한다. 변화에서, 제 1 제조-촉진 절편 (170a)은 바코드 영역 (150) (예를 들어, 본체 (110)에 근접한, 또 다른 적당한 영역)에 결합될 수 있다. 또한, 하나 이상의 분자 (120)의 분자는 P7 어댑터 (예를 들어, IlluminaTM 플랫폼 및 cDNA 합성용으로 구성된 경우)와 관련된 제 2 제조-촉진 절편 (170b)을 포함할 수 있으며, 이는 동일한 단계 동안 또는 역전사 과정 또는 다른 별도의 단계에서 추가될 수 있고, 여기서, 일부 변화에서, 제 2 제조-촉진 절편 (170b)은 mRNA 분자의 3' 말단에 더 가까운 표적 mRNA 분자에 무작위로 결합하며 mRNA 분자의 5' 말단에서 확장을 방지하도록 구성된 랜덤 프라이머에 대한 서열을 포함한다. 따라서, 역전사 동안 cDNA 가닥은 랜덤 프라이머 절편에 인접하여 종료될 것이다. 그 다음, 리가제 효소는 cDNA 가닥에 촉진 절편 (170b)이 부착된 랜덤 프라이머를 결찰할 것이다. P7 및 P5 프라이머를 이용한 후속 증폭은 인덱싱 동안 단편화할 필요 없이 시퀀싱가능한 단편을 야기할 것이다. 또한, 이러한 구성은 신호의 지수 증폭(exponential amplification)을 생성하지만 잡음의 선형 증폭만 생성하므로, 신호-대-잡음 비 (SNR)를 크게 개선시킨다. 이와 같이, 제조-촉진 절편 (170a, 170b)의 포함은 여러 단계를 단일 단계로 축소할 수 있으며, 그렇지 않으면 수행되어야 하는 정리 공정을 간소화할 수 있다 (예를 들어, 원하는 생성물이 조성물의 사용 후에 조성물 (100)에 결합될 것이라는 점을 감안하면).
그러나, 다른 변화에서, 제조-촉진 절편(들) (170)은 추가적으로 또는 대안적으로 작업 (예를 들어, 특정 플랫폼, 특정 공정 등)과 관련된 단계 (예를 들어, 수동 단계)를 줄이도록 구성된 다른 서열을 포함할 수 있다.
2.2.5 분자 - 활성 절편
도 1에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자 (120) 각각은 원하는 공정 (예를 들어, 핵산 분자, 단백질 등과 관련된 태깅 또는 합성을 가능하게 하는 결합 상호작용)의 수행을 가능하게 하는 기능을 하는 활성 절편 (180)을 임의로 포함할 수 있다.
변화에서, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자 (120)의 분자의 활성 절편 (180)은 mRNA 결합에 적합할 수 있으며, cDNA 합성은 PolyA 상호작용을 통해 mRNA 종의 포집을 가능하게 하는 PolyT 서열 (예를 들어, dTVN 또는 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN 서열)과 같은 mRNA 결합을 위한 제 1 서열 (180a); 및 포집된 mRNA로부터 합성된 cDNA와의 상호작용을 위한 제 2 서열 (180b) (예를 들어, 역전사 효소를 이용하여 합성된 cDNA에 첨가된 CCC 영역과의 상호작용을 위한 rGrGrG 기, 역전사 효소를 이용하여 합성된 cDNA에 첨가된 다른 영역과의 상호작용을 위한 또 다른 기, 등) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 작업 동안, RT 효소는 cDNA 합성 동안 CCC 서열 (또는 다른 서열)의 첨가로 종료될 수 있으며, 그 다음 변성-후에 주형 mRNA를 제거할 수 있고, cDNA 서열은 제 2 서열 (180b)의 GGG 함유 기 (또는 다른 상보적 기)와 상호작용할 수 있으며, 여기서 제 2 서열은 포스페이트 또는 기타 적당한 차단 기 (예를 들어, C3 스페이서, 디데옥시 뉴클레오티드 등)에 의해 3' 말단에서 확장을 차단시킨다. CCC 또는 GGG 이외의 특정 서열은 비드에 부착된 올리고뉴클레오티드 태그에 포함되어 특정 분자 상호작용 기능을 제공할 수 있으며 DNA 염기, RNA 염기 또는 기타 기를 포함할 수 있다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 합성된 cDNA 생성물이 후속 정제 단계 없이 조성물 (100)에서 입자상 (on-particle)으로 포집 및 정제될 수 있도록, 하나 이상의 분자는 mRNA 결합을 위한 제 1 서열 (예를 들어, 서열 (180a)을 가짐)을 포함하는 제 1 하위세트 및 cDNA 상호작용을 위한 제 2 서열 (예를 들어, 서열 (180b)을 가짐)을 포함하는 제 2 하위세트를 포함할 수 있다; 그러나, 다른 변화에서, 제 1 서열 (180a) 및 제 2 서열 (180b)은 대안적으로 상이한 입자에 결합될 수 있다. 다른 변화에서, 제 2 서열은 3' 차단되지 않을 수 있으며, cDNA 서열 상에서 확장되어 제 1 가닥 서열에 대한 상보체(complement)를 형성할 수 있다.
추가 변화에서, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자 (120)의 분자의 활성 절편 (180)은 mRNA, DNA, 또는 기타 핵산 표적 상의 특정 표적 서열에 결합하도록 조정될 수 있으며, 합성은 항체에 부착된 올리고 태그의 포집을 가능하게 하는 TotalSeqC 포집 서열 (예를 들어, TTTCTTATATGGG)와 같은 또는 하나 또는 몇 개의 mRNA 종의 특정 부분을 표적하는 또 다른 표적 결합 올리고 (예를 들어, 표적화된 프라이머), gDNA 서열 또는 기타 서열과 같은, 표적 결합을 위한 제 1 서열 (180c); 및 포집된 핵산으로부터 합성된 DNA (또는 cDNA)와의 상호작용을 위한 제 2 서열 (180b) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 작업 동안, RT 효소는 주형화된 cDNA 합성 후 CCC 서열 (또는 다른 서열)의 첨가로 종료될 수 있으며, 그 다음 변성-후에 주형 mRNA를 제거할 수 있고, cDNA 서열은 제 2 서열 (180b)의 GGG 함유 기 (또는 다른 상보적 기)와 상호작용할 수 있으며, 여기서 제 2 서열은 포스페이트 또는 기타 적당한 차단 기 (예를 들어, C3 스페이서, 디데옥시 뉴클레오티드 등)에 의해 3' 말단에서 확장을 차단시킨다. CCC 또는 GGG 이외의 특정 서열은 비드에 부착된 올리고뉴클레오티드 태그에 포함되어 특정 분자 상호작용 기능성을 제공할 수 있으며 DNA 염기, RNA 염기 또는 기타 기로 구성될 수 있다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 결과로 합성된 생성물이 후속 정제 단계 없이 조성물 (100)에서 입자상으로 포집 (예를 들어 180c와 180b의 알려진 서열 요소 사이) 및 정제될 수 있도록 일반적인 (예를 들어, rGrGrG) 결합 모티프 또는 다른 특정 표적화된 올리고 서열을 이용하여, 하나 이상의 분자는 표적화된 핵산 결합을 위한 제 1 서열 (예를 들어, 서열 (180c)을 가짐)을 포함하는 제 1 하위세트 및 핵산 혼성화를 위한 제 2 서열 (예를 들어, 서열 (180b)을 가짐)을 포함하는 제 2 하위세트를 포함할 수 있다; 그러나, 다른 변화에서, 제 1 서열 (180c) 및 제 2 서열 (180b)은 대안적으로 상이한 입자에 결합될 수 있다. 다른 변화에서, 제 2 서열은 3' 차단되지 않으며, 새로 합성된 서열 상에서 직접 확장되어 제 1 가닥 서열에 대한 상보체를 형성할 수 있다.
실시예에서, 도 6a에서와 같이 동일한 입자에 존재하는 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 태그는 추가 이점을 제공하도록 구성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 cDNA를 포함하는 도 6a에서 생성된 가닥은 계속해서 제 2 가닥의 상보체로 남아 결국 CBC를 2번 포집하게 되며, 여기서 제 2 가닥은 역 상보체(inverted complement)이다. 이러한 경우, 동일한 비드에서 비롯된 다중 바코드 영역은 물리적으로 연결되어 자료 분석을 개선하는 수단을 제공한다 (즉, 바코드 영역은 "일치"해야 한다). 그러나, 불일치한(non-matching) 바코드 영역은 오차를 나타낸다 (예를 들어, 바코드가 매우 상이한 경우 in vitro 재조합, 차이가 1-2 염기에 불과한 경우 기타 오차). 따라서, 이를 통해 작은 오차를 식별하고 잠재적으로 수정할 수 있으므로, cDNA 서열을 올바른 비드 및 올바른 세포에 매핑하는 능력이 개선된다. 더 상세하게는, 이러한 구성은 오차 수정 정도를 제공하기 위한 제 2 지점을 제공한다. 또한, 바코드가 충분히 일치하지 않으면, 해당 서열을 분석에서 제외할 수 있다 (또는 잠정적으로 하나 또는 다른 바코드 영역에 할당한다). 또 다른 이점은 자료에서 이러한 유형의 키메리즘(chimerism)의 비율을 측정한 다음, 해당 자료를 사용하여 직접 측정할 수 없는 자료를 수정할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 다중 바코드 영역이 있는 비드와 동일한 작업흐름에서 하나의 바코드 영역만 있는 비드를 사용하는 경우, 서열당 2개의 바코드 영역을 부여하는 비드로 생성된 자료에서 하나의 바코드 영역 시나리오에 대한 키메리즘 비율을 추론할 수 있다. 두 바코드가 일치하도록 동일할 필요는 없다. 바코드가 상이하게 구성되어 있지만 관련이 알려진 경우, "일치"의 이점은 여전히 가능하다.
다른 변화에서, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자 (120)의 분자의 활성 절편 (180)은 단백질 태깅에 적합할 수 있으며, 기타 공정은 용해된 세포로부터 항체 (예를 들어, 표면 항체)의 결합을 가능하게 하는 올리고뉴클레오티드-항체 결합 영역 (예를 들어, TotalSeqTM 영역)과 같은 표적 단백질의 항체 (또는 다른 단백질 성분)의 결합을 위한 제 3 서열 (180c); 및 포집된 단백질로부터 유래된 생성된 생성물과의 상호작용을 위한 제 4 서열 (180d) (예를 들어, 합성 동안 첨가된 CCC 영역과의 상호작용을 위한 rGrGrG 기, 합성 동안 첨가된 다른 영역과의 상호작용을 위한 또 다른 기 등) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 작업 동안, RT 효소는 합성 동안 CCC 서열 (또는 다른 서열)의 첨가로 종료될 수 있으며, 그 다음 합성된 단백질 생성물은 제 4 서열 (180d)의 GGG 기 (또는 다른 상보적 기)와 상호작용할 수 있다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 합성된 생성물이 후속 정제 단계 없이 조성물 (100)에서 입자상으로 포집 및 증폭될 수 있도록, 하나 이상의 분자는 항체 결합을 위한 제 1 서열 (예를 들어, 서열 (180c)을 가짐)을 포함하는 제 1 하위세트 및 합성된 생성물 상호작용을 위한 제 2 서열 (예를 들어, 서열 (180d)을 가짐)을 포함하는 제 2 하위세트를 포함할 수 있다; 그러나, 다른 변화에서, 제 3 서열 (180c) 및 제 4 서열 (180d)은 대안적으로 상이한 입자에 결합될 수 있다. 특정 생성물의 일부 정제 또는 향상은 다른 서열보다 특정 올리고뉴클레오티드 서열의 증폭에 의해 가능하다는 점에 유의하라.
조성물은 결합/기타 상호작용을 포함하는 다른 공정을 수행하기 위해, 하나 이상의 분자 (120)에 다른 활성 절편을 추가적으로 또는 대안적으로 포함할 수 있다.
2.2.5.1 절단가능한 링커
예를 들어, 도 6c-6e에 나타낸 바와 같이, 활성 절편 (180')은 방출된 형광 신호에 기초하여 본체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단의 확인을 가능하게 하는 기능을 할 수 있는, 하나 이상의 절단가능한 형광단 소광제 영역을 포함할 수 있다. 도 6c (우측 상단)에 나타낸 바와 같이, 조성물의 하나 이상의 분자는 분자를 본체 (110')에 결합하는 링커 (130') (상기 기재된 바와 같음); 형광단 (180a') 및 소광제 (180b')를 갖는 절단가능한 요소 (예를 들어, 절단가능한 염기 또는 링커)를 포함하는 활성 영역 (180'); PCR 핸들 (140'); 바코드 영역 (150'); 및 포집 서열이 있는 고유 분자 식별자 (UMI) (160')를 포함할 수 있다.
사용 동안, 도 6c-6d에 나타낸 바와 같이, 비오티닐화된 뉴클레오티드는 일부 분자에 상보적 RNA/DNA 하이브리드 가닥의 생성과 함께 역전사 동안 포함될 수 있으며, 일부 분자는 임의의 표적 올리고뉴클레오티드를 포집하지 못할 수 있다. 그 다음, 절단 신호 (예를 들어, 94C로 반응 환경 온도 변화, 열불안정성 링커에 대한 다른 적당한 온도로의 반응 환경 온도 변화)는 활성 영역 (180')의 열불안정성 링커의 절단, 및 RNA/DNA 하이브리드 가닥을 갖는 분자의 상보적 RNA/DNA 하이브리드 가닥의 방출을 생성한다. 도 6d에 나타낸 바와 같이, 열불안정성 염기/링커가 분리된 후, 소광제 (180b)가 방출되어 여기(excitation) 시 형광단 (180a)이 형광을 발하도록 한다. 이와 같이, 형광단 (180a)에 의해 방출된 형광 신호는 본체 (110)로부터 올리고뉴클레오티드 분자의 절단의 확인을 가능하게 할 수 있다.
더 상세하게는, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 가열은 반응 환경에 존재하는 다중 분자를 야기한다: 1) 바코드 영역 (150') 및 비오티닐화된 뉴클레오티드를 갖는 고유 분자 식별자 (160')를 포함하는 역전사된 올리고뉴클레오티드; 2) 없는 (naked)/빈(empty)/포집되지 않은(uncaptured) 올리고뉴클레오티드 서열; 및 3) RNA-DNA 하이브리드 상보적 가닥. 그 다음, 2020년 5월 5일에 출원된 미국 출원 제 16/867,235호 및 2020년 6월 19일에 출원된 미국 출원 제 16/906,337호에 기재된 바와 같이 (이들은 각각 전체 참조로 본 명세서에 포함됨), 반응 환경으로부터 액상의 제거와 함께, 액상과 분리 입자 (예를 들어, 참조로 포함된 출원에 기재된, 스트렙타비딘 자성 비드)의 조합 후, (예를 들어, 자기력(magnetic force)에 의한) 분리는 라이브러리 제조와 함께 후속 처리 및 제 2 가닥 합성을 위해 역전사된 올리고뉴클레오티드를 분리할 수 있다.
열불안정성 메커니즘이 기재되어 있지만, 활성 영역 (180')은 생성물을 감지하여 절단을 확인할 수 있는 다른 절단가능한 메커니즘을 추가적으로 또는 대안적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성 영역 (180')은 추가적으로 또는 대안적으로 광절단가능한 영역, 화학적으로 절단가능한 영역, 효소적으로 절단가능한 영역, 또는 다른 적당한 메커니즘에 의해 절단가능한 영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 기재된 바와 같이, 방출된 형광 신호로 절단 및/또는 포집을 모니터링하기 위하여, 형광단 (180a') 및 소광제 (180b')의 역 방향(reverse orientation)이 실행될 수 있다.
관련된 변화에서, 활성 영역 (180')은 대안적으로 형광단을 포함할 수 있으며, 여기서 형광단은 형광단 및 소광제 둘 다로서 작용한다. 특히, 비드 상의 형광단의 밀도가 자기 소광(self quenching)에 충분히 높을 때, 비드로부터 일부 형광단의 제거는 특정 소광제 분자가 포함되지 않은 경우에도 총 형광의 증가를 야기할 것이다. 따라서, 절단은 모니터링되는 비드의 수 및 형광단의 수가 변하지 않더라도, 형광 (예를 들어, 비드로부터의 형광 또는 비드 및/또는 상청액에서 방출된 형광단을 함유하는 웰로부터의 형광)의 증가에 의해 모니터링될 수 있다.
여전히 대안적으로, 활성 영역 (180')의 다른 변화에서, 소광제 (180b)는 어두운 소광제가 아니라 오히려 작업 동안 반응으로부터 감지된 신호에 영향을 미치는 다른 형광단 (예를 들어, FRET 파트너)일 수 있다. 예를 들어, 활성 영역 (180)은 절단 후 본체 (110) 상에 남아 있도록 구성된 부분 상의 제 1 형광단 (예를 들어, 플루오레세인), 및 절단에 의해 방출되도록 구성된 제 2 형광단 (예를 들어, TAMRA)을 포함할 수 있으며, 이는 매우 근접할 때 제 1 형광단으로부터의 플루오레세인 신호의 소광을 야기하나, 제 2 형광단이 있는 올리고뉴클레오티드가 방출될 때 신호의 증가를 야기할 것이다. 또한, 제 2 형광단으로부터의 신호는 절단된 및 비절단된 구성 둘 다에서 모니터링될 수 있다.
도 6e에 나타낸 하나의 대안적인 구성에서, 조성물은 비드의 직접 정량화를 위해 구성될 수 있다 (예를 들어, 전장 및 절단된 분자 정량화 둘 다 이용). 더 상세하게는, 조성물의 하나 이상의 분자는 분자를 본체 (110'')에 결합하는 링커 (130'') (상기 기재된 바와 같음); 제 1 형광단 (180a'') (예를 들어, 플루오레세인, Cy3 등) 및 제 2 형광단 (180b'') (예를 들어, TAMRA, Cy5, Cy7)을 갖는 절단가능한 요소를 포함하는 활성 영역 (180''), 및 특정 용도에 필요한 대로 구성된 추가 요소, 예를 들어, PCR 핸들 (140''); 바코드 영역 (150''); 및 포집 서열이 있는 고유 분자 식별자 (UMI) (160'')를 포함할 수 있다. 이러한 구성은 절단 후 조성물의 절단된 부분의 직접 정량화에 사용될 수 있으며, 여기서 조성물 성분은 비절단된 요소 (FRET 파트너가 매우 근접해 있는 경우) 및 절단된 요소 (FRET 파트너가 분리되어 더 이상 상호작용하지 않는 경우) 둘 다를 교대로 감지하거나 또는 두 종 중 하나만 우선적으로 감지하기 위해 상이한 파장 영역을 이용하여 (예를 들어, 형광 현미경에 의해, 형광 판독 장치에 의해) 시각화될 수 있다. 동일하거나 또는 유사한 조성물은 (예를 들어, 저장수명(shelf-life) 시험을 위해) 시각화 없이 정량화에 사용될 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 하이드로겔로 구성된 본체 (110)와 함께 사용될 수 있으며, 여기서 본체 (110)에 사용된 하이드로겔 물질은 반투명(translucent)하고 자가형광하지 않는다.
그러나, 기재된 다른 구성 또는 구성의 조합을 구상할 수 있다.
2.2.6 분자 - 분자 가위
도 1 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 분자의 분자의 변화는 추가적으로 또는 대안적으로 하나 이상의 분자 (120)로부터 생성물 또는 다른 표적 분자의 제어된 절단을 가능하게 하는 기능을 하는, 하나 이상의 임의의 분자 가위 영역(들) (190)을 포함할 수 있다 (예를 들어, 합성 후, 반응 후, 생성물의 생성 후, 생물학적 물질의 처리 동안 특정 지점에서 등). 기재된 실시예, 변화, 및 예와 관련하여, 분자 가위는 NEB로부터의 특정 USER 효소 혼합물뿐만 아니라 제한 효소, 징크 핑거 뉴클레아제, 탈론(talons), 앱타머, 트랜스포사제(transposases), RnaseH, CRISPR 효소 및 특정 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 천연 또는 비천연) 서열을 인식하고 서열의 특정 위치에서 절단하는 능력을 갖는 다른 분자도 광범위하게 포함한다. 변화에서, 분자 가위는 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 변화에서, 분자 가위 영역 (190)은 바람직하게는 절단이 원하는 생성물을 손상시키거나 또는 사용할 수 없게 만들지 않을 영역 (예를 들어, 링커의 바로 원위)에서 올리고뉴클레오티드 분자를 따라 위치된다. 그러나, 분자 가위 영역(들) (190)은 대안적으로 다른 적당한 방식으로 위치될 수 있다. 도 7 (상단)은 조성물의 단위가 mRNA 포집을 위한 제 1 올리고뉴클레오티드 분자를 따라 제 1 링커 (130a)의 바로 원위에 위치한 제 1 분자 가위 영역 (190a), 및 합성된 cDNA 생성물의 포집을 위한 제 2 올리고뉴클레오티드 분자를 따라 제 2 링커 (130b)의 바로 원위에 위치한 제 2 분자 가위 영역 (190b)을 포함하는 예를 나타낸다. 이 예는 cDNA 표적화 올리고뉴클레오티드와 별도로 mRNA 포집 올리고뉴클레오티드의 제어된 절단을 허용한다. 도 7 (중앙)은 조성물의 단위가 mRNA 포집을 위한 제 1 올리고뉴클레오티드 분자를 따라 제 1 링커 (130a)의 바로 원위에 위치한 제 1 분자 가위 영역 (190a), 및 합성된 cDNA 생성물의 포집을 위한 제 2 올리고뉴클레오티드 분자를 포함하는 예를 나타낸다. 이 예는 mRNA 포집 올리고뉴클레오티드의 제어된 절단을 허용한다. 도 7 (하단)은 조성물의 단위가 mRNA 포집을 위한 제 1 올리고뉴클레오티드 분자를 따라 제 1 링커 (130a)의 바로 원위에 위치한 제 1 분자 가위 영역 (190a), 및 합성된 cDNA 생성물의 포집을 위한 제 2 올리고뉴클레오티드 분자를 따라 제 2 링커 (130b)의 바로 원위에 위치한 제 1 분자 가위 영역 (190a)의 다른 예를 포함하는 예를 나타낸다. 이 예는 mRNA 포집 올리고뉴클레오티드 및 cDNA 표적화 올리고뉴클레오티드의 동시 절단을 허용한다.
mRNA 결합-cDNA 합성 반응과 관련하여, 분자 가위(들)는 mRNA를 제거하기 위해 변성 전 또는 변성 후 생성물의 절단에 사용되도록 구성될 수 있다. 이와 같이, 분자 가위 영역(들) (190)은 mRNA-cDNA 생성물, 표적 mRNA 및/또는 (mRNA 없이) 합성된 cDNA 생성물을 모두 제거하는데 사용될 수 있다.
하나의 예시적인 실시예에서, 이중 가닥 특이적 분자 가위는 폴리머라제 확장 또는 역전사 또는 유사한 공정이 제 2 가닥을 완료한 후에만 가닥이 방출되도록 실행될 수 있다. 이러한 방식으로, 미반응 생성물은 세척될 수 있으며, 그 다음 완료된 생성물은 하나 이상의 분자 (120) 또는 조성물 (100)의 다른 부분으로부터 배경 오염 없이 선택적으로 방출 및 회수될 수 있다. 도 7에 나타낸 조성물에 대한 대안적인 변화에서, 상기 기재된 기능성을 제공하는 하단 분자를 생략할 수 있다. 다른 변화에서, 활성 부분으로 프라이머를 갖는 분자는 원하는 기능성을 제공할 수 있다.
또한, 대안적인 실시예에서, 하나 이상의 분자 (120) 및/또는 조성물 (100)의 다른 부분은 다른 메커니즘 (예를 들어, 광절단, 열 절단, 화학적 절단 등)을 이용하여 올리고뉴클레오티드 서열 및/또는 다른 생성물의 제어된 절단을 위해 설계된 영역을 포함할 수 있다.
2.2.7 조성물 변화 - 기질에 결합된 기능성 분자
도 8a-8c에 나타낸 바와 같이, 조성물의 변화는 (예를 들어, 단일 세포로부터) 표적 물질을 포집 및/또는 처리하는데 사용된 기질 (110b) (예를 들어, 챔버의 벽, 챔버를 덮는 뚜껑, 챔버 안으로 돌출된 돌출부(protusion) 등)에 대한 하나 이상의 분자 (120)의 부착을 위해 구성될 수 있다. 조성물 및 공정의 변화는 2019년 8월 27일자로 발행된 미국 특허 번호 제 10,3891,492호 (이는 전체 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 방법 및 조성물로부터 더 조정될 수 있다.
더 상세하게는, 도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 입자-조성물은 기능화된 올리고뉴클레오티드 분자를 기질 (110b) (예를 들어, 반응 챔버의 벽)에 전달하도록 구성될 수 있으며, 여기서 입자체에 결합된 분자는 올리고뉴클레오티드를 기질의 표면 코팅 (191)에 부착하도록 구성된 반응기 (6) (예를 들어, 말단 끝에서)를 포함한다. 비-제한적인 예에서, 표면 코팅은 아크릴아미드 또는 유사한 화합물(들)을 포함할 수 있으며, 올리고뉴클레오티드에 부착된 기능성 링커는 아크리다이트 (acrydite) 변형을 포함할 수 있다. 이와 같이, 올리고뉴클레오티드를 웰 표면에 부착하는 것은 다수의 아크릴아미드 및 아크리다이트 분자를 중합하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 아크릴아미드 고분자는 가교결합제 (예를 들어, 비스-아크릴아미드), 또는 가역적 가교결합제 (예를 들어, [비스(아크릴로일)시스타민], BAC)를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 고분자 매트릭스는 올리고뉴클레오티드가 공유 결합을 통해 웰의 벽에 직접 부착되는 방식으로 중합될 수 있다. 다른 실시예에서, 부착은 간접적일 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 벽면에 직접 부착되지 않고 매트릭스에 포함되어 부착될 수 있다. 이 구성에서, BAC와의 중합으로 인한 가교결합은 온전하고 올리고뉴클레오티드는 기능적으로 벽에 부착된 채로 남아 있지만, BAC의 감소 시, 가교결합은 불안정해지고 다수의 올리고는 표면으로부터 용액으로 방출된다. 다른 예시적인 표면 코팅 화학 및/또는 기능성 링커 화학은 도 8a에 나타낸 구성 및 도 8b-8m에 나타낸 후속 구성에 대하여 실행될 수 있다.
도 8b에 나타낸 바와 같이, 가닥의 반응기 (6)는 본체 (110)에 공유 결합된 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 통해 상보적 가닥 (7)과 쌍을 이룰 수 있으며, 본체 (110)로부터 반응기 (6)를 갖는 가닥의 방출은 기질 (110b)에 부착을 위해 제조할 수 있다. 입자에 부착된 올리고뉴클레오티드의 상보체를 이용하여 도 8a 및 8b에 나타낸 본체 (110) (예를 들어, 입자 (110))로부터 웰 표면으로 전장 올리고뉴클레오티드의 전달에 관하여, 상보체는 웰에 비드의 첨가 후 변성하여 상보적 올리고뉴클레오티드를 방출하고 이러한 올리고뉴클레오티드를 웰에 결합함과 함께, (예를 들어, 다중 본체/비드에서 대량으로 수행될 수 있는) 5' 말단에 반응성 부분이 있는 프라이머를 이용하여 구성될 수 있다 (예를 들어, 웰의 외부, 웰의 내부). 제 1 라운드에서 재어닐링된 올리고뉴클레오티드가 후속 라운드에서 떨어져 나와 기질 (110b)의 표면에서 이용가능한 스트렙타비딘에 결합할 수 있도록, 비오틴/스트렙타비딘의 실행은 여러 라운드의 변성 (예를 들어, 1 내지 5)으로 원하는 결합 결과를 제공할 수 있다.
도 8c에 나타낸 바와 같이, 부착을 위한 전장 올리고뉴클레오티드는 기질 (110b) (즉, 웰 표면)에 대한 부착을 위해 액적으로부터 올리고뉴클레오티드의 방출과 함께, 액적 (8)에서 웰(9) 내로 전달될 수 있다. 액적은 (예를 들어, 액체 처리 하위시스템에 의해 전달된) 공기 중 액체이거나, 또는 (예를 들어, 계면활성제 또는 기타 물질이 있거나 또는 없는 오일에 의해 결합된 수용액과 같은 에멀젼에서와 같은) 다양한 물질에 의해 결합될 수 있다. 액적은 완전히 액체일 수 있거나, 또는 대안적으로 하이드로겔로 구성될 수 있다. 오일 액적 내 물의 경우, 올리고뉴클레오티드는 에멀젼을 분해하는 세제 또는 화학물질의 첨가에 의해 방출될 수 있다. 하나의 비-제한적인 예는 저온에서 고체 (예를 들어, 왁스) 구조를 형성하나, 정상적인 생물학적 온도에서 유체로 되돌아가는 오일에 의해 결합된 수성 액적이다.
대안적으로, 도 8d-8m은 기질 (110b)의 표면(들)에서 전장 올리고뉴클레오티드를 결합 및/또는 구축하기 위한 부착 과정의 변화를 나타낸다.
제 1 변화에서, 도 8d에 나타낸 바와 같이, 공통 스터브(stub) 올리고뉴클레오티드는 용액에 제공될 수 있으며, 기질 (110b) (예를 들어, 벽면)에 부착될 수 있고, 그 다음 기질 (110b)로부터 적당한 공정을 이용하여 (예를 들어, 입자, 비드, 액적 등을 이용하여) 구축하여 전장 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
도 8e는 기질 (110b)의 표면으로부터 순차적인 구축의 하나의 이러한 변화를 나타내며, 여기서 초기 스터브 올리고뉴클레오티드는 부착된 올리고뉴클레오티드를 전장 기능성 올리고뉴클레오티드로 확장하기 위해 웰 내의 추가 올리고뉴클레오티드 절편 또는 주형 (예를 들어, 입자 상)의 전달과 함께, 이전에 기재된 바와 같이 웰 내의 표면에 부착된다.
도 8f는 부착된 올리고뉴클레오티드가 확장될 수 있는 메커니즘을 나타낸다. 더 상세하게는, 웰 내의 표면에 부착된 초기 스터브 올리고뉴클레오티드는 입자로부터 이러한 추가 올리고뉴클레오티드 절편의 (예를 들어, 화학적 수단, 열 수단, 광절단 수단 등에 의한) 절단 및 웰 표면에서 스터브 올리고뉴클레오티드의 기능성 링커에 절단된 올리고뉴클레오티드 절편의 후속 결합과 함께, 입자 상의 추가 올리고뉴클레오티드 절편의 전달에 의해 확장될 수 있다.
도 8g는 도 8f에 나타낸 메커니즘의 제 1 변화를 나타내며, 여기서 입자에 초기에 결합된 추가 올리고뉴클레오티드 절편은 변성에 의해 입자로부터 절단 시 상응하는 기능성 링커에 부착되도록 구성된 반응기를 포함한다. 예에서, 반응기는 결찰을 위한 5' 포스페이트를 포함할 수 있으나, 대안적으로 클릭 화학을 위한 알킨 또는 아지드를 포함할 수 있거나, 또는 여전히 대안적으로 또 다른 반응기 (예를 들어, 카바메이트 등)를 포함할 수 있다. 도 8g에 따르면, 반응기/기능성 링커는 반응기/기능성 링커 화학의 유형에 따라 5' 또는 3' 방향에 위치할 수 있다 (예를 들어, 기능성 링커 상의 5' 포스페이트와 반응하도록 구성된 3' OH). 또한, 올리고뉴클레오티드는 단일 또는 이중 가닥일 수 있으며, 여기서 반응기를 갖는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 예는 도 8h에 나타낸다.
도 8i는 도 8g 및 8h에 나타낸 메커니즘의 대안적인 변화를 나타내며, 이에 의해 입자에 올리고뉴클레오티드를 결합하는 절단가능한 부분의 절단은 후속적으로 웰 표면에서 기능성 링커에 부착되는 반응기를 생성한다. 다시, 도 8i에 나타낸 바와 같이, 5' 및 3' 방향은 구체적으로 언급되지 않는다. 하나의 비-제한적인 예에서, 반응기는 절단 후에 생성된 5' 포스페이트일 수 있으며, 여기서 5' 포스페이트는 웰 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 기능성 링커와 반응한다. 하나의 이러한 예에서, 입자 상 올리고뉴클레오티드는 입자에 부착된 5' 말단으로 구성될 수 있으며, 우라실 DNA 글리코실라제로 처리한 후 백본을 절단하여 5' 포스페이트를 야기하는 리아제(lyase) 효소 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 III, 엔도뉴클레아제 VIII)로 처리하여 절단되는 dU 잔기 또는 비염기성 부위를 함유한다. 그 다음, 절단된 생성물은 이용가능한 3' OH (예를 들어, 벽면에 부착된 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 3' OH)에 결찰될 준비가 된다. 작업 중, 기능성 링커에 대한 부착은 결찰을 용이하게 하기 위해 부목(splint)을 실행할 수 있다. 변화에서, 기능성 링커는 부목으로 작용하도록 부분적으로 이중 가닥 구조로 구성될 수 있으며, 입자 상의 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌출부를 생성하기 위해 (예를 들어, 2개의 dU 염기 오프셋에 의해) 두 가닥에서 절단된 이중 가닥 생성물일 수 있거나, 또는 추가 올리고뉴클레오티드가 부목으로 작용하도록 별도로 첨가될 수 있다.
도 8j는 도 8g-8i에 나타낸 메커니즘의 대안적인 변화를 나타내며, 여기서 입자에 올리고뉴클레오티드를 결합하는 절단가능한 부분의 절단은 기능성 링커의 3' 말단으로의 어닐링을 위해 입자로부터 올리고뉴클레오티드를 방출하고, 이어서 폴리머라제를 이용하여 확장된다. 변화에서, 도 8j (우측 하단)에 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 웰 기하학, 입자의 변형성, 또는 기능성 링커의 밀도가 입자로부터 올리고뉴클레오티드를 방출할 필요가 없도록 하는 경우, 입자에 부착된 채로 남아 있을 수 있다.
도 8k는 도 8g-8j에 나타낸 메커니즘의 대안적인 변화를 나타내며, 여기서 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 폴리머라제를 이용한 확장을 위해 웰 표면에서 기능성 링커의 3' 말단에 대한 후속 어닐링과 함께 입자로부터 방출된다. 변화에서, 도 8k (우측 하단)에 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 웰 기하학, 입자의 변형성, 또는 기능성 링커의 밀도가 입자로부터 올리고뉴클레오티드를 방출할 필요가 없도록 하는 경우, 입자에 부착된 채로 남아 있을 수 있다.
도 8l은 도 8g-8k에 나타낸 메커니즘의 대안적인 변화를 나타내며, 여기서 입자 상에 올리고뉴클레오티드의 상보체를 구축하고 상보체는 웰 표면에서 기능성 링커를 확장하는 주형의 역할을 한다. 더 상세하게는, 상보체는 확장된 상태로 입자 올리고뉴클레오티드에서 프라이머를 어닐링하여 상보체를 형성한 후 변성하여 입자로부터 상보체를 방출함으로써 구축될 수 있다. 그 다음, 기능성 링커는 확장되어 웰 표면에서 전장 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
도 8m은 추가 올리고뉴클레오티드 절편이 웰 표면에 결합된 기능성 링커에 첨가될 수 있는 예시적인 메커니즘을 나타낸다. 더 상세하게는, 1 내지 n의 추가 절편은 입자로부터 올리고뉴클레오티드 절편을 순차적으로 절단하고 이를 실행 빌드(running build)에 부착함으로써, 웰 표면에서 올리고뉴클레오티드의 실행 빌드에 부착될 수 있다. 도 8m의 방법과 관련하여, 부착을 위한 임의의 선행 방법은 연속적으로, 단독으로, 또는 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 각 올리고뉴클레오티드 절편은 클릭 화학에 의해 결찰되거나 또는 부착될 수 있으며, 각각은 주형을 혼성화한 후 확장에 의해 첨가될 수 있거나, 또는 일부 올리고뉴클레오티드 절편은 확장에 의해 첨가되고 나머지는 결찰에 의해 첨가될 수 있다.
그러나, 도 8a-8m에 나타낸 방법 및 구성은 다른 단계 또는 요소를 포함할 수 있으며, 이 중 일부는 하기 부문에서 더 상세히 기재된다.
도 1은 표적 물질 반응용 조성물의 실시예의 개략도를 나타낸다.
도 2는 표적 물질 반응용 조성물의 대안적인 실시예의 개략도를 나타낸다.
도 3은 표적 물질 반응용 조성물에 포함된 링커 분자의 실시예의 개략도를 나타낸다.
도 4a-4c는 cDNA 합성 반응 또는 단백질 태깅 상호작용에 대한 mRNA 포집에 사용가능한 조성물의 변화를 나타낸다.
도 5는 라이브러리 제조 작업의 단순화를 위한 부분을 포함하는 조성물의 변화를 나타낸다.
도 6a는 cDNA 합성 반응에 대한 mRNA 포집에 사용가능한 조성물의 변화를 나타낸다.
도 6b는 단백질 태깅 반응에 사용가능한 조성물의 변화를 나타낸다.
도 6c-6e는 열불안정성 링커 요소를 포함하는 조성물의 변화를 나타낸다.
도 7은 분자 가위 영역을 포함하는 조성물의 변화를 나타낸다.
도 8a-8m은 기질에 기능화된 분자의 결합의 변화를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 ATAC-seq 작업에 사용가능한 조성물의 변화를 나타낸다.
도 9c-9e는 제한 부위를 갖는 조성물의 변화를 나타낸다.
도 10은 ATAC-seq에 대한 방법의 실시예의 흐름도를 나타낸다.
도 11은 조성물의 제조 방법의 흐름도를 나타낸다.
도 12a는 조성물의 입자의 제조 방법의 변화의 흐름도를 나타낸다.
도 12b 및 12c는 조성물의 제조 단계의 변화를 나타낸다.
도 13은 올리고뉴클레오티드 분자의 합성의 변화를 나타낸다.
도 14는 올리고뉴클레오티드 분자의 일부의 합성의 변화를 나타낸다.
도 15는 올리고뉴클레오티드 분자의 일부의 합성의 변화의 상세한 단계를 나타낸다.
도 16a-16e는 입자에 결합된 고유 바코드를 갖는 올리고뉴클레오티드 분자 세트의 합성의 변화를 나타낸다.
도 17a-17b는 입자에 결합된 고유 바코드를 갖는 올리고뉴클레오티드 분자 세트의 합성의 대안적인 변화를 나타낸다.
3. 조성물의 특정 예 - ATAC 시퀀싱, 분자 가위, 제한 부위
도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이, (예를 들어, 후성유전체학(epigenomic analysis) 분석을 위해) 게놈과 관련된 염색질(chromatin) 접근성을 평가하기 위하여, 하나 이상의 분자 (120)의 분자의 변화는 시퀀싱 (ATAC-seq)을 이용한 트랜스포사제-접근성 염색질에 대한 분석을 위해 구성될 수 있다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, 조성물 (200)의 예는 본체 (210), 본체에 결합된 링커 (230), 링커에 결합된 제 1 분자 가위 영역 (290), 제 1 분자 가위 영역 (290)에 결합된 PCR 프라이머 (240), PCR 프라이머 (240)에 결합된 바코드 영역 (250), PCR 프라이머 (240)에 결합된 UMI (260), 및 UMI (260)에 결합된 ATAC-seq용 트랜스포사제 어댑터 (예를 들어, Tn5 트랜스포사제 1, Tn5 트랜스포사제 2)에 상보적인 서열을 포함하는 활성 절편 (280)을 포함할 수 있다. 이 구성은 초기 확장 반응을 달성하도록 구성되며, 여기서 다른 트랜스포사제 어댑터는 제 1 트랜스포사제 어댑터와 관련된 삽입 결과의 후속 PCR 농축에 사용된다.
도 9b에 나타낸 바와 같이, 이러한 조성물 (200)은 각 단편의 각 말단에서 어댑터 (및 트랜스포사제 어댑터에 연결된 바코드)의 추가 후, 증폭 및 시퀀싱함으로써 확장된 염색질 절편에 대한 DNA 서열의 절단을 위해 구성될 수 있다.
도 9a에 나타낸 예의 변화는 다른 적당한 방식으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 제 2 구성에서, 하나 이상의 분자는 본체에 결합된 링커 (230), 링커에 결합된 제 1 분자 가위 영역 (290), 제 1 분자 가위 영역 (290)에 결합된 PCR 프라이머 (240), PCR 프라이머 (240)에 결합된 바코드 영역 (250), PCR 프라이머 (240)에 결합된 UMI (260), 및 UMI (260)에 결합된 제 1 트랜스포사제 어댑터 (예를 들어, Tn5 트랜스포사제-1)를 포함하는 활성 절편 (280)을 포함하는 하나 이상의 분자; 및 본체에 결합된 링커 (230), 링커에 결합된 제 1 분자 가위 영역 (290), 제 1 분자 가위 영역 (290)에 결합된 PCR 프라이머 (240), PCR 프라이머 (240)에 결합된 바코드 영역 (250), PCR 프라이머 (240)에 결합된 UMI (260), 및 UMI (260)에 결합된 제 2 트랜스포사제 어댑터 (예를 들어, Tn5 트랜스포사제-2)를 포함하는 활성 절편 (280)을 포함하는 제 2 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 이 구성은 조성물 (200)의 동일한 입자에 대해 확장 및 PCR 농축을 수행하도록 구성된다.
도 9c에 나타낸 대안적인 변화에서, 조성물 (200')은 본체로부터 올리고뉴클레오티드를 제어가능하게 방출하는데 사용될 수 있는 절단가능한 요소 (235' 및 290')를 포함하도록 구성될 수 있다. 더 상세하게는, 제한 효소를 사용하여 DNA를 특이적으로 절단할 수 있으나, 절단하려면 이중 가닥 절편을 필요로 한다; 그러나, 본 명세서에 기재된 방법은 종종 단일 가닥 핵산을 이용한다. 이와 같이, 제한 효소를 사용하기 위해, 표적화된 절단을 위한 이중 가닥 요소를 형성하기 위해 종종 제 2 핵산을 단일 가닥 분자에 첨가해야 한다. 이 공정은 문제를 유발할 수 있으며 불완전한 절단을 야기할 수 있다. 조성물 (200')은 적어도 하나의 절단 부위를 인코딩하도록 구성될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 분자는 본체에 결합된 링커 (230') (예를 들어, 길이 및 굴곡(bend)에 대한 유연성을 제공하는 스페이서 (18) (HEG) 서열과 같은 긴 유연성 링커), 제한 부위 (290') (예를 들어, 유형 II 제한 엔도뉴클레아제, 유형 I 제한 엔도뉴클레아제, 유형 IIG 제한 엔도뉴클레아제, 유형 IIP 제한 엔도뉴클레아제, 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제, 유형 III 제한 엔도뉴클레아제; 유형 IV 제한 엔도뉴클레아제)를 인코딩하는 단일 가닥 서열, 및 임의로 변형 코드 영역 (235') (예를 들어, 내부 데옥시우리딘 변형 코드), 정방향 프라이머 (240a'), 역방향 프라이머 결합 부위 (240b'), 및 임의의 형광 프로브 표적 (295') (예를 들어, (FAM)-표지된 5' 뉴클레아제 프로브, 다른 프로브)를 포함할 수 있다. 도 9c에 나타낸 변화에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 본체의 표면으로부터 멀어진 방향을 가리키는 선형 가닥으로 나타내며, 여기서 제한 엔도뉴클레아제는 역평행(antiparallel) 방향의 dsDNA를 필요로 한다. 또한, 올리고뉴클레오티드 분자는 서로 근접한 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 조성물 (200')의 제 1 분자 및 조성물 (200')의 제 2 분자)가 제한 효소 인식 서열의 영역에서 적어도 일시적으로 역평행 이중 가닥 구조를 형성하도록 하는 다양한 확인을 취할 수 있으며, 이에 의해 회문(palindromic) 제한 부위 서열 이외의 명백한 상동성의 결여에도 불구하고 완전한 제한 부위를 형성할 수 있다. 이와 같이, 제한 부위 (290')를 이용한 절단 후, 용액 내 올리고뉴클레오티드는 다양한 분석을 이용하여 (예를 들어, qPCR에 의해) 감지, 표본화 및 정량화될 수 있다. 특정 예에서, 제한 부위 (290')는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터 유래된 BamHI 유형 II 제한 엔도뉴클레아제를 포함하며, 여기서 엔도뉴클레아제는 핵산의 짧은 서열 (예를 들어, 6 bp)을 인식하고 표적 부위에서 이들을 절단하는 능력을 가진다. 그러나, 다른 제한 엔도뉴클레아제가 상기 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
실시예에 따른 실험 동안, 표면적으로(ostensibly) ss 올리고뉴클레오티드가 있는 미처리된 비드는 BamHI 절단에 의해 방출된 가장 많은 수의 분자를 나타내었으며 (예를 들어, 역방향 프라이머의 혼성화 및 폴리머라제에 의한 확장에 의해 이중 가닥 생성물이 생성된 처리와 비교하여 대략 2배의 수), ssDNA를 갖고 제한 분해 직전에 수산화나트륨으로 변성된 비드는 분해가 재어닐링을 위한 시간 요구 사항과 함께 이중 가닥 상태에 의존함을 나타내는 더 낮은 절단을 나타내었다.
이러한 변화에서, 분자(들)는 상이한 올리고 가닥 간의 일시적인 혼성화에 의해 올바른 이중 가닥 모티프를 형성한다 (즉, 이들은 단일 가닥 내에 헤어핀 또는 기타 2차 구조를 형성하지 않는다). 또한, 분자간 상호작용이 필요함을 나타내는 각 분자 가닥의 나머지 부분에는 제한 부위를 완성하는 서열이 없다. 또한, BamHI 제한 부위의 사용은 회문일 뿐만 아니라 절단을 용이하게 하는 GC가 풍부하다; 그러나, 절단 효율이 다를 수 있지만 다른 제한 부위를 사용할 수 있다. 더 상세하게는, ssDNA는 소수의 염기만으로 루프 구조를 형성할 수 있으며, 종종 "랜덤 코일(random coil)" 구성을 가정할 수 있으나, 링커 영역 (230')의 링커 길이 및 유연성은 표적화된 절단을 가능하게 하도록 올리고뉴클레오티드 쌍을 일치시키는 역할을 한다. 또한, 이러한 실시예에서, 두 가닥이 모든 절단 전에 부착될 필요는 없다. 예를 들어, Bam HI 두 가닥은 제한 엔도뉴클레아제가 절단되는 방식으로 인해 동일한 결과 생성물로 절단될 것이나, 염기가 없으면 절단이 완전히 저해되지 않을 것이다; 따라서, 하나의 절단된 올리고뉴클레오티드는 미절단된 올리고뉴클레오티드와 혼성화하고 이전에 미절단된 가닥에서 제 2 절단 (예를 들어, 닉(nick))을 유도할 수 있으나, 외인성 상보적 가닥의 첨가는 필요하지 없다. 이와 같이, 본체에 결합된 올리고뉴클레오티드의 밀도는 반응 속도에서 역할을 하나, 절단을 가능하게 하기 위해 엄격하게 요구되는 것은 아니다.
절단가능한 링커의 다른 특정 예는 도 9d에 나타내었으며, 여기서 절단가능한 링커 영역 (230'')은 본체로부터 올리고뉴클레오티드를 제어가능하게 방출하는데 사용될 수 있다. 도 9d에 나타낸 조성물은 올리고에 서열 특징 (231'')을 구축하며, 여기서 서열 특징은 적어도 일시적으로 제한 효소 인식/절단 부위를 함유하는 이중 가닥 요소 (예를 들어, Pac I 제한 부위)를 생성할 헤어핀 구조를 형성한다. 이와 같이, 분자내 방식으로 표적 절단을 위해 일시적인 이중 가닥 요소가 형성되어, 상응하는 올리고뉴클레오티드 가닥의 방출을 가능하게 한다.
그러나, 분자의 절편은 추가적으로 또는 대안적으로 기재된 바와 같은 다른 적당한 절편을 포함할 수 있으며, 및/또는 다른 적당한 방식으로 본체 (210)에 결합될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 도 9c 및 9e의 제한 부위 (290') 및 도 9d의 절단가능한 링커 요소를 사용하여 본 명세서에 기재된 다른 조성물에 대해 제어된 절단 요소를 제공할 수 있다 (예를 들어, 도 1에 나타낸 조성물 (100)의 분자 가위 부문 (190), 구조체 (200)의 분자 가위 부문 (290), 도 6c에 나타낸 절단가능한 링커 요소, 또는 절단가능한 요소가 표시되거나 또는 유익한 다른 조성물에서와 같이).
하나의 예에서, 조성물 (200)의 실시예는 단일-세포 ATAC 시퀀싱을 위한 방법 (300)에서 실행될 수 있으며, 여기서 도 10에 나타낸 바와 같이, 방법 (300)은 미세유체 기질의 포집 영역에서 단일 세포 형태의 표적 세포 세트를 포집하는 단계 (S310); 포집 영역에서 표적 세포 세트의 핵을 유지하면서 표적 세포 세트를 용해시켜 세포질을 제거하는 단계 (S320); 단일-세포 핵을 갖는 조성물 (200)의 단위를 공동-포집하는 단계 (S330); 단일-세포 핵 및 조성물과 전위 반응을 가능하게 하여, 단편화된 DNA를 생성하는 단계 (S340); 제 1 트랜스포사제 어댑터를 이용하여 확장 작업을 수행하는 단계 (S350); 분자 가위 영역을 통해 조성물의 본체로부터 바코드 영역 및 UMI를 포함하는 조성물의 일부를 절단하는 단계 (S360); 확장 작업으로 단편화된 DNA에 제 2 트랜스포사제 어댑터를 적용하는 단계 (S370); 및 단편화된 및 처리된 DNA에 대해 증폭 반응을 수행하는 단계 (S380)를 포함한다.
방법 (300)의 변화는 라이브러리 정리 및 차세대 시퀀싱 로딩 단계를 더 포함할 수 있다.
그러나, 방법 (300)의 변화는 다른 적당한 방식으로 (예를 들어, 다른 포집 및 처리 플랫폼 등을 이용하여) 실행될 수 있다.
4. 제조
도 11에 나타낸 바와 같이, 조성물을 생성하는 방법 (400)은 기저 기질로서 본체를 제공하는 단계 (S410); 본체에 링커 세트를 결합하는 단계 (S420); 및 단계적/순차적 부착 작업으로 링커 세트에 하나 이상의 분자를 결합하는 단계 (S430)를 포함한다. 실시예에서, 다양한 분자 생물학적 반응 (예를 들어, 결찰 또는 폴리머라제 확장) 또는 화학적 합성 방법 (예를 들어, 클릭 화학)을 이용하여 긴 (>50 bp 길이) 올리고뉴클레오티드 분자를 제조하여 최소 오차율 (예를 들어, 5% 미만의 오차, 1% 미만의 오차, 0.5% 미만의 오차)로 매우 잘 정의된 서열을 가질 수 있다. 일부 예에서, 이들은 서열을 정의하는데 사용된 주형이 최종 생성물에 직접 포함되지 않은 주형화된 반응을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 반응은 주형화되지 않거나 또는 주형이 포함되는 방식으로 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 성분 단량체 단위로부터 또는 부분 서열 또는 완전한 서열의 첨가에 의해 구축될 수 있다. 일부 예에서, 첨가된 단위는 부분적으로 또는 완전히 단일 가닥일 수 있다. 다른 실시예에서, 첨가된 단위는 부분적으로 또는 완전히 이중 가닥이다. 일 실시예에서, 첨가된 단위는 대부분 이중 가닥이나, 가닥 중 하나만이 본체 및/또는 링커에 공유 결합된다. 일 실시예에서, 첨가되는 주형 가닥 및/또는 단위는 부착에 사용하기 전에 정제 또는 품질 관리 검사를 거쳐 최종 생성물이 개별 단위에 존재하는 오차를 감소시킴으로써 오차율을 감소시키도록 하였다. 일부 경우에, 개별 단위의 제조 방법은 본질적으로 (예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오티드 단위를 이용하여) 감소된 오차율을 확인할 수 있다. 도 10의 일 실시예 및 변화에서, 마지막에서 두 번째 단계 (예를 들어, 본체에 링커 세트를 결합하는 단계 (S420)는 임의적일 수 있다). 예를 들어, 잠재적으로 단계 (S430)에서 세트의 분자 각각에 부착된 링커를 가질 수 있다.
방법 (400)은 상기 부문 1에 기재된 하나 이상의 이점에 따라, 시료로부터 표적 물질의 처리, 분리, 및 회수를 허용하는 조성물을 효율적으로 생성하는 기능을 한다. 방법 (400)은 염기별 올리고뉴클레오티드 부착 방법 (예를 들어, 포스포라미다이트 기반 올리고뉴클레오티드 합성)과 관련된 합성 오차(compounding error)를 감소시키는 단계적-부착 방식으로 복잡한 올리고뉴클레오티드 구조를 갖는 조성물을 생성할 수 있다. 또한, 방법 (400)은 시퀀싱 플랫폼 (예를 들어, IlluminaTM 어댑터 등)에 특이적인 분자 어댑터의 포함에 의해, 라이브러리 제조 공정의 단순화를 제공하는 조성물을 생성할 수 있다. 따라서, 방법 (400)은 확장가능한(scalable) 방식으로, 및 품질 관리 및 회수가능한 생성물의 양의 개선을 제공하는 방식으로 기능화된 입자의 제조에 사용될 수 있다.
실시예에서, 방법 (400)은 상기 기재된 조성물 (100 및 200)의 실시예, 변화, 및 예를 생성할 수 있다. 그러나, 방법 (300)의 일부는 다른 관련 조성물을 생성하도록 조정될 수 있다.
블록 (S410)은 다양한 공정에 특이적인 기능성 분자의 부착을 위한 기저 기질을 제공하는 기능을 하는 기저 기질로서 본체를 제공하는 단계를 기재한다. 상기 언급된 바와 같이, 기저는 인접한 본체로 제공될 수 있거나 또는 대안적으로 더 작은 본체의 클러스터로 제공될 수 있다. 연속 또는 클러스터링된 형태에서, 블록 (S410)은 본체의 표면에 링커 분자의 후속 부착을 용이하게 하기 위하여 본체에 작용기 (예를 들어, 아민 기, 히드록실 기, 실라놀 기 등)를 결합하는 단계를 포함할 수 있다.
대안적인 변화에서, 상기 언급된 바와 같이, 블록 (S410)은 더 작은 본체 세트를 모아 본체를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 제 1 변화에서, 도 12b에 나타낸 바와 같이, 블록 (S410)은 미세유체 채널을 이용하여 비중합된 및/또는 비-가교결합된 물질의 액적을 생성하는 단계 (S414)를 포함할 수 있으며, 이에 의해 물질은 액적 상태에서 중합 및/또는 가교결합을 거쳐 더 작은 본체 세트를 형성한다. 블록 (S414)에 따르면, 물질은 원하는 크기의 액적을 생성하기 위하여, 원하는 속도로 미세유체 채널을 통해 및 원하는 형태를 갖는 개구부(opening)를 통해 매질 (예를 들어, 오일 등)로 흐를 수 있다. 그 다음, 중합은 화학적 또는 다른 수단을 통해 달성될 수 있다. 유사하게, 가교결합은 광활성화 방법, 화학적 방법, 열-유도 방법, 및/또는 임의의 다른 적당한 방법 중 하나 이상을 이용하여 달성될 수 있다.
다른 대안적인 변화에서, 도 12c에 나타낸 바와 같이, 블록 (S410)은 미리-중합된 수용액에서 기질의 웰 세트를 가로질러 더 작은 본체 세트를, 웰 세트 위에 유체의 수성 층과 함께 분포하는 단계 (S415)를 포함할 수 있다. 그 다음, 블록 (S410)은 유체의 수성 층을 분리 층 (예를 들어, 실리콘 오일과 같은 저밀도 오일의 층)으로 대체하여 웰 세트 내에서 더 작은 본체의 클러스터를 분리하는 단계 (S416)를 포함할 수 있다. 그 다음, 블록 (S410)은 (예를 들어, 원심력으로, 다른 적용된 힘으로) 기질을 반전시키거나 또는 웰 세트로부터 더 작은 본체의 클러스터를 변위시키는 단계 (S417)를 포함할 수 있으며, 여기서 유체의 분리 층 내의 표면 장력은 분리 유체 내의 클러스터 세트 각각의 구형 형태를 촉진한다. 블록 (S310)의 변화는 더 작은 본체의 클러스터의 중합 및/또는 가교결합 (S318)을 더 포함할 수 있다 (예를 들어, 유체의 분리 층 내의 다른 영역에서, 유체의 분리 층 외부에서). 변화에서, 블록 (S416)은 더 작은 본체의 클러스터 세트 각각의 광중합 (예를 들어, UV 광으로, 다른 파장의 광으로, 등) 또는 화학적 중합을 포함할 수 있다. 블록 (S316)은 추가적으로 또는 대안적으로 가교결합 (예를 들어, 조사에 의한 가교결합, 화학적 가교결합, 열-기반 가교결합, 산화적 가교결합 등)를 포함할 수 있다.
그러나, 블록 (S410)의 다른 변화는 올리고뉴클레오티드로 기능화하기 위한 기질을 제공하기 위하여, 적당한 표면 화학 (및/또는 자성과 같은 코어 물질 특징)을 갖는 클러스터링된 더 작은 본체 세트의 형성을 위한 추가 또는 대체 단계를 포함할 수 있다.
제 1 변화에서, 블록 (S410)은 비드의 형태로 기저 기질을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 비드는 제어된 환경에서 용해되는 고분자로 구성된다. 특정 예에서, 비드는 아크릴아미드 용액 (예를 들어, 40% v/v 아크릴아미드, 다른 백분율의 아크릴아미드), 비스(아크릴로일) 시스타민 (예를 들어 0.8% w/v BAC, 다른 백분율의 BAC), 탈이온수, 및 완충액 (예를 들어, Tris-HCL, NaCl, KCl, EDTA, Triton X-100 및 물로 구성된 완충액, 다른 적당한 완충액 등)으로부터 처리된 폴리아크릴아미드 물질로 구성될 수 있으며, 여기서 폴리아크릴아미드 비드는 저산소 조건 하에서 (예를 들어, 아르곤 기체 하에서) 암모늄 퍼설페이트 (예를 들어, 10% APS, 다른 백분율의 APS) 및 테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)과 중합하고 나중에 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 환원제의 존재 하에서 용해되도록 구성된다.
이 변화에서, 도 12a에 나타낸 바와 같이, 블록 (S410)에 따른 비드의 제조 방법은 개시제와 함께 물질 성분을 제 1 미세유체 경로로 전달하는 단계 (S411); 수집 동안 오일 상에 제공된 TEMED로 제 2 미세유체 경로 (예를 들어, 500um 수집 부피에서 종료되는 14um 포커싱 채널(focusing channel))를 통해 결과의 물질을 (예를 들어, 가압 기체 펌프를 이용하여) 펌핑할 때, (S411)의 결과의 물질로 액적 세트를 생성하는 단계 (S412); 및 미세유체 채널 특징, 미세유체 경로를 통해 물질 성분을 펌핑하는데 사용된 기체 조성물 (예를 들어, 아르곤, 기타 기체)에 기초하여 액적 세트의 액적 크기를 제어하는 단계 (S413)를 포함한다. (S410-S413)의 특정 예에서, 압력 및 유속(flow rate)을 제어하는 가압 펌프 (예를 들어, 하이드로겔을 중합하기 위하여 펌프 챔버에서 공기를 가압 및 제거하기 위해 가압된 아르곤 사용)는 제 1 유체 경로를 포함하는 제 1 미세유체 칩 및 제 2 유체 경로를 포함하는 제 2 미세유체 칩에 결합되었으며, 여기서 형성된 액적의 품질 및 크기는 흐름 제어 센터로 제어된 현미경에 장착된 고속 카메라 및 X-Y 단계를 이용하여 모니터링되었다. 예에서, 형성된 폴리아크릴아미드 액적을 Tris-HCL, NaCl, KCl, EDTA, Triton X-100, 및 물로 구성된 완충액으로 세척하고, Tris Tween-20의 저장 용액에 넣었으며, 여기서 형성된 액적은 1.62 um의 표준 편차와 함께, (예를 들어, 팽윤이 있는 수용액에서) 22.75 um의 평균 직경을 가졌다. 예에서, 액적은 30초 이내에 1:1 부피비로 0.1M DTT에 용해될 수 있었다.
도 12a와 관련된 예의 변화에서, 폴리아크릴아미드 비드의 제형은 아크릴아미드의 양을 감소시키고 아크릴아미드-태깅된 (예를 들어, 아크리다이트 변형된) 올리고뉴클레오티드를 첨가함으로써 조정되어, 비드당 대략 109 올리고뉴클레오티드를 제공하였다. 일부 변화에서, 올리고는 형광 태깅 및 감지 적용을 위해 (예를 들어, 형광단 또는 기타 변형으로) 더 변형되었다. 더 상세하게는, 비드는 아크릴아미드 용액 (예를 들어, 40% v/v 아크릴아미드, 다른 백분율의 아크릴아미드), 비스(아크릴로일) 시스타민 (예를 들어 0.8% w/v BAC, 다른 백분율의 BAC), 탈이온수, 아크리다이티드(acrydited) 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 제 1 말단에 근접한 아크리다이티드 부위 및 제 2 말단에 근접한 플루오레세인 아미다이트 (FAM) 부위를 갖는 250 uM 아크리다이티드 플루오레세인 아미다이트 (FAM) 올리고), 암모늄 퍼설페이트 용액 (예를 들어, 10% w/v APS, 다른 백분율의 APS), 및 완충액 (예를 들어, Tris-HCL, NaCl, KCl, EDTA, Triton X-100 및 물로 구성된 완충액, 다른 적당한 완충액 등)으로부터 처리된 폴리아크릴아미드 물질로 구성될 수 있으며, 여기서 FAM-태깅된 폴리아크릴아미드 비드는 테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)과 중합하고 디티오트레이톨 (DTT)의 용액에 용해되도록 구성된다. 형광-태깅된 비드의 예에서, 형성된 액적은 1.25 um의 표준 편차와 함께, (예를 들어, 팽윤이 있는 수용액에서) 20.39 um의 평균 직경을 가졌다. 예에서, 액적은 (예를 들어, 0초, 30초, 90초, 및 5분에서 영상과 함께) 1:1 부피비로 0.1M DTT에 용해가능하였으며, 여기서 형광 신호는 용해 과정을 나타낸다. 이 비-제한적인 예에서, DTT는 BAC 요소로 인해 존재하는 이황화 가교결합을 끊음으로써 구형 비드로부터 더 작은 본체 (예를 들어, 폴리아크릴아미드 연결된 올리고)를 방출한다. 더 작은 본체는 용액을 통해 쉽게 확산할 수 있는 크기이다. 그러나, 이 비-제한적인 예의 변화도 실행될 수 있다.
블록 (S420)은 본체에 링커 세트를 결합하는 단계를 기재하며, 이는 본체에 결합된 올리고뉴클레오티드 분자 세트의 간격 및 밀도를 제어하여 조성물의 기능화를 생성하는 기능을 한다. 실시예에서, 링커는 상기 기재된 링커 (130)의 실시예, 변화, 또는 예일 수 있다; 그러나, 링커는 또 다른 적당한 링커일 수 있다.
비대칭 링커 (예를 들어, 상이한 길이의 분지를 갖는 링커, 또는 유사한 길이의 링커이나 상이한 작용기 또는 보호기를 갖는 링커)를 포함하는 변화에서, 블록 (S420)은 제 2 분지를 제 2 보호기로 보호하면서 비대칭 링커의 제 1 분지로부터 제 1 올리고뉴클레오티드 절편을 구축하는 단계, 및 별도로 제 1 분지를 제 1 보호기로 보호하면서 (및 제 2 분지를 탈보호함) 비대칭 링커의 제 2 분지로부터 제 2 올리고뉴클레오티드 절편을 구축하는 단계 (S425)를 포함할 수 있다. 그러나, 블록 (S425)의 변화는 링커를 사용하지 않거나, 또는 이미 합성된 올리고뉴클레오티드를 조성물의 부착 부위에 결합하여 작동하도록 구성될 수 있다.
블록 (S430)은 단계적/순차적 부착 작업으로 링커 세트에 하나 이상의 분자를 결합하는 단계를 기재하며, 이는 올리고뉴클레오티드 사슬의 일반적인 화학적 합성과 관련된 합성 오차 및 로트 간 변동성(lot-to-lot variability)을 감소시키는 기능을 한다. 더 상세하게는, 블록 (S430)은 사용가능한 전장 생성물의 양 (예를 들어, 97% 이상의 사용가능한 생성물)과 관련하여, 더 높은 정확도의 올리고뉴클레오티드 분자, 분자 설계에 대한 더 많은 제어, 및 더 높은 합성 효율을 생성하기 위하여, 더 적은 수의 추가 결과를 포함하여 더 낮은 합성 오차를 생성하는 방법을 제공하는 기능을 한다. 일 실시예에서, 부분 생성물이 후속 작업흐름에 참여하지 못하도록 할 수 있는 이점을 제공하고 후속 자료 분석을 개선할 수 있는 후속 공정의 인공물(artefacts)과 제조 오차를 구별할 수 있는 자료 분석을 용이하게 하는 단일 염기보다 큰 개별 단위로, 불완전한 생성물을 제한하는 역할을 더 제공한다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 변화에서, 블록 (S430)은 상기 기재된 반응을 위해 구성된 원하는 올리고뉴클레오티드 분자의 하위-절편 세트 (예를 들어, 병렬로, 직렬로)를 생성하는 단계 (S431)를 포함할 수 있다. 그 다음, 블록 (S430)은 감소된 오차를 갖는 전장 생성물로서 하위-절편 세트를 원하는 올리고뉴클레오티드 분자로 조립하는 단계 (S432)를 포함할 수 있다. 일부 변화에서, 블록 (S430)은 조립의 오차를 더 감소시키기 위하여 하위-절편 세트의 단위를 정제하는 단계 (S433)를 포함할 수 있으며, 여기서 정제는 완전한 정제 공정 및/또는 탈염 단계를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 변화는 원하는 올리고뉴클레오티드 분자의 조립 후 정제-관련 단계를 포함할 수 있다; 그러나, 방법 (S430)의 일부 변화는 블록 (S433)과 관련된 정제 단계를 생략할 수 있다. 변화에서, 블록 (S430)의 단계적 부착 방법은 길이가 5-30 염기인 하위-절편의 생성 다음에 조립하는 단계를 포함한다; 그러나, 대안적인 변화에서, 블록 (S430)의 단계적 부착 방법은 다른 적당한 길이의 하위-절편의 생성을 포함할 수 있다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 기재된 바코드 절편 또는 기타 절편과 관련하여, 블록 (S430)의 특정 예는 바코드 절편 (예를 들어, 대략 20 염기 길이의 절편)의 생성을 포함할 수 있으며, 여기서 도 14에 나타낸 바와 같이, 바코드 절편은 96-384 버전의 바코드 서열군으로부터 선택된다. 그러나, 적당한 길이의 비-자연적으로 발생하는 서열을 이용하여 또 다른 적당한 수의 바코드 서열 버전을 생성할 수 있다.
특정 예에서, 바코드 서열의 3 절편은 (예를 들어, 관련된 식별자를 갖는) 고유한 돌출부로 생성될 수 있으며, 여기서 돌출부는 원하는 순서로 올리고뉴클레오티드 분자의 정확한 조립을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 15에 나타낸 바와 같이, 제 1 바코드 서열 (435)은 제 3 바코드 서열과의 결합을 위한 돌출부를 갖는 제 2 바코드 서열 (436)과의 결합을 위한 돌출부 및 활성군 (438) (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 TVN, TS GGG, TotalSeq C 등)에 대한 결합을 위한 돌출부를 갖는 고유 분자 식별자 (437)를 포함할 수 있다. 조립된 바코드 절편은 블록 (S410)에서 제공된 본체에 결합되거나 또는 다른 방식으로 전구체 분자에 결합된 전구체 분자 (예를 들어, 프라이머에 커플링된 링커)에 결합될 수 있다.
특정 예에 관하여 더욱 더 상세하게는, 조성물의 전구체는 프라이머 결합 부위 (예를 들어, TSO 프라이머) 다음에 염기 세트 (예를 들어, 8 티민 염기)를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 결합된 링커 (예를 들어, C18 링커)에 결합된 본체 (예를 들어, 비드)로 구성될 수 있다. 그 다음, 제 1 바코드 절편의 각 측면에 돌출부가 있는 제 1 바코드 절편을 미리-혼성화한 다음, 적당한 리가제 효소를 이용하여 조성물의 전구체에 결합할 수 있다. 돌출부가 있는 후속 바코드 절편은, 원하는 바코드 영역 길이가 달성될 때까지, 바코드 영역의 실행 빌드에 결합될 수 있다. 바코드 절편의 조립의 각 단계에 대해, 감지 부분을 포함하는 상보적 절편 (예를 들어, 형광단 절편)은 첨가되는 현재의 절편에 태깅될 수 있으며, 여기서 (예를 들어, 광학 감지 공정에 의한) 감지 부분의 감지는 단계적 부착의 각 단계에서 품질 관리를 위해 사용될 수 있다. 그러나, 단계적 부착 방법의 각 단계에서 품질 관리는 다른 적당한 방식으로 수행되거나, 또는 생략될 수 있다.
블록 (S430)의 또 다른 대안적인 변화는 뉴클레오티드의 단일-염기 첨가를 위해 구성된 합성 작업을 수행하여 올리고뉴클레오티드 생성물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적인 변화의 특정 예에서, 화학적 합성은 링커 (예를 들어, C18 링커)에 염기별로 뉴클레오티드 염기를 첨가하여 전장 생성물을 생성하는 단계를 포함한다. 또한, 방법 (400)의 변화는 하이브리드 방법을 포함할 수 있으며, 이에 의해 올리고뉴클레오티드 분자 (예를 들어, 링커 및 프라이머 절편)의 일부는 염기별 합성에 의해 형성되고, 올리고뉴클레오티드 분자의 나머지 부분은 올리고뉴클레오티드의 더 짧은 하위-절편의 조립을 포함하는 단계적 부착 방법에 의해 형성된다.
방법 (400)은 추가적으로 또는 대안적으로 다른 적당한 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법 (400)의 변화는 생성된 올리고뉴클레오티드 절편을 결합하기 위하여 (예를 들어, 생성되는 입자의 수당 원하는 농도와 함께) 제어된 환경에서 리가제 (예를 들어, NEB-M0202M)와의 반응을 수행하는 단계; 생성되는 입자의 수당 원하는 농도의 올리고뉴클레오티드 물질을 제공하는 단계; (예를 들어, 세척 단계를 위한 충분한 헤드룸(headroom)을 허용하는 용기 내에서) 원하는 반응 부피를 제공하는 단계; 반응 효율을 개선시키기 위하여 제조 동안 안정화 시약 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)을 제공하는 단계; 진탕 과정 (또는 원하는 반응 조건으로 균일한 생성물을 완전히 분산시키거나 또는 생성하기 위한 다른 과정)을 실행하는 단계; 조성물의 제조 동안 배양 과정 (예를 들어, 16±5 ℃ 또는 16±1 ℃)를 실행하는 단계; 및 적당한 수의 세척 단계를 수행하는 단계; 중 하나 이상을 포함하여, 사용가능한 생성물을 생성하는 단계의 효율을 개선하기 위하여 제조, 규모 확대 (scale-up), 및 품질 관리와 관련된 단계를 포함할 수 있다. 또한, 방법 (400)의 변화는 DTT 없는 리가제로 제조하고 공정에서 다른 시약으로부터 DTT를 제거하거나, 또는 제조 공정으로부터 더 작은 본체 (온도, 화학물질 등)에 대한 다른 잠재적 방출제를 제외하는 것과 같은 제조 공정으로부터 특정 요소를 제외할 수 있다. 그러나, 방법 (400)은 추가적으로 또는 대안적으로 조성물 (100, 200)의 단위의 대량 생산을 위한 공정의 다른 적당한 단계를 포함할 수 있다.
4.1.1 제 1 제조예 - 차세대 바코딩된 비드
하나의 예에서, 방법 (400')은 알려진 고유 조합으로 결합된 제한된 (예를 들어, 소수의) 바코드 세트를 이용하여, 단일 비드가 바코드 서열의 상이한 조합을 갖는 방식으로, 각 본체에 다중 바코드 세트를 생성하도록 조정될 수 있다. 단일 비드에 있는 모든 바코드 서열의 조합은 비드에 고유할 수 있거나, 또는 다르게 구성될 수 있다. 이와 같이, 방법 (400')은 모든 상이한 바코드가 동일한 비드에 다시 매핑할 수 있도록, 단일 제조 빌드가 제어되고 예측가능한 방식으로 비드당 다중 바코드 (CBC's)를 야기하도록 알려진 조합으로 함께 결합된 제한된 바코드 세트를 실행할 수 있다.
더 상세하게는, 각 바코드 단위는 염기 세트 (예를 들어, 10 미만의 염기, 10 이상의 염기)를 갖는 바코드 단위 하위서열 및 핸들 또는 핸들들 (예를 들어, 상이한 결찰 핸들 세트 중 하나 또는 한쪽 말단에 있는 결찰 핸들 세트 중 하나 또는 폴리머라제 확장 핸들(들)과 같은 기타 핸들(들))을 포함할 수 있으며, 여기서 바코드 단위 하위서열은 주로 핸들에 의해 정의된 세트로 구성될 수 있다. 변화에서, 핸들은 각각 3 내지 15의 염기, 또는 다른 적당한 수의 염기를 가질 수 있다. 따라서, 조립된 세트의 바코드 단위 하위서열 각각은 동일한 핸들(들) (예를 들어, 상이한 결찰 핸들 세트 중 하나)로 구성되며, 상이한 세트는 상이한 핸들 세트의 다른 핸들을 가진다. 따라서, 결찰 핸들의 수는 비드당 원하는 바코드 서열의 수 및 원하는 총 바코드 다양성을 기반으로 결정될 수 있다.
예에서, 방법 (400')은 결찰 핸들 세트 (예를 들어, 4 결찰 핸들, 4 미만의 결찰 핸들, 4 이상의 결찰 핸들)와 함께, 다수의 바코드 단위 하위서열 (예를 들어, 96 바코드 단위, 384 바코드 단위, 다른 수의 바코드 단위)을 실행하여 처리 되는 시료(들)에 대해 원하는 수준의 다양성 및 비드당 원하는 수의 상이한 바코드를 달성할 수 있다. 각 세트는 고유 바코드를 가질 수 있으나, 대안적으로, (예를 들어, 96 바코드 하위서열의, 384 바코드 하위서열의, 등) 동일한 세트는 모든 세트에 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 7-mer 바코드를 갖는 96의 바코드 단위 하위서열은 4 염기 결찰 핸들로 실행될 수 있으며, 여기서 바코드 단위 하위서열은 96의 바코드 단위 하위서열의 4개의 상이한 세트로부터 선택된다; 그러나, 핸들 서열에 의해서만 문맥상 구별된 단일 세트를 포함하는 다른 수의 바코드 단위 하위서열 세트를 사용할 수 있다.
예를 확장하여, 하나의 비드 상에 4개의 고유하게 상이한 바코드 서열을 제공하기 위해, 방법 (400')은 결찰 핸들 ATCG를 갖는 XXXXXXX의 바코드 하위서열을 갖는 제 1 세트 (여기서, XXXXXXX는 7-mer 바코드 서열 (예를 들어, 96 바코드 서열 세트 중 하나, 384 바코드 서열 중 하나, 다른 수의 바코드 서열 중 하나)임); 결찰 핸들 TCGA를 갖는 XXXXXXX의 바코드 하위서열을 갖는 제 2 세트 (여기서, XXXXXXX는 7-mer 바코드 서열임); 결찰 핸들 CGAT를 갖는 XXXXXXX의 바코드 하위서열을 갖는 제 3 세트 (여기서, XXXXXXX는 7-mer 바코드 서열임); 및 결찰 핸들 GATC를 갖는 XXXXXXX의 바코드 하위서열을 갖는 제 4 세트 (404') (여기서, XXXXXXX는 7-mer 바코드 서열임)를 실행할 수 있다. 이와 같이, 결찰 핸들 ATCG, TCGA, CGAT, 및 GATC는 세트에 특이적이나. 하위서열 XXXXXXX는 세트에 특이적이지 않을 수 있다. 이 예에서, 특정 4 염기 결찰 핸들은 개별 비드와 관련된 제 1 (예를 들어, ATCG, TCGA, CGAT, 및 GATC), 제 2 (예를 들어, TCAG, AATC, ATTA, TCCT), 제 3 및 제 4 결찰 반응에 대해 상이하며, 바코드 단위 하위서열의 각 세트에 대해서도 상이하다. 이와 같이, 이 구성은 4개의 결찰 결과가 있는 4개의 바코드 단위 하위서열 세트에 걸쳐 16개의 상이한 핸들을 제공한다 (예를 들어, 핸들의 수는 바코드 단위 하위서열 세트 수와 원하는 결찰 결과의 수의 결과물이다).
방법 (400')의 실행 동안, 각 비드에 결합된 상이한 바코드를 갖는 바코딩된 비드를 고유하게 생성하기 위하여, 모든 제 1 바코드 버전 세트는 제 1 웰에서 제공될 수 있으며, 모든 제 2 바코드 버전 세트는 제 2 웰에서 제공될 수 있다 (예를 들어, 웰 1은 바코드 1 ATCG, 바코드 1 TCGA. 바코드 1 CGAT, 및 바코드 1 GATC를 함유하며; 웰 2는 바코드 2 ATCG, 바코드 2 TCGA, 바코드 2 CGAT, 및 바코드 2 GATC 등을 가진다). 대안적인 변화에서, 각 웰이 각 바코드 세트로부터 하나의 고유하게 식별가능한 바코드를 갖고 있는 한, 각 세트의 상이한 바코드 버전은 각 웰에서 제공될 수 있다 (예를 들어, 웰 1은 바코드 1 ATCG, 바코드 25 TCGA, 바코드 49 CGAT 및 바코드 76 GATC를 가지며; 웰 2는 바코드 2 ATCG, 바코드 33 TCGA, 바코드 82 CGAT, 및 바코드 25 GATC를 갖거나, 또는 대안적으로, 각 바코드 세트가 96개의 상이한 세트에서 비롯된 경우, 예를 들어, 웰 1은 바코드 1 ATCG, 바코드 97 TCGA, 바코드 193 CGAT, 및 바코드 290 GATC 등을 가진다).
도 16a-16d는 4개의 상이한 바코드를 갖는 비드 (즉, 본체 (110'))의 생성 서열을 나타내며, 여기서 각각의 개별 비드는 결찰 결과 세트 후에 4개의 고유하게 식별가능한 바코드 (CBCs) 세트로 끝난다. 도 16a에 나타낸 바와 같이, 예시적인 방법 (400')은 3' 말단에서 상이한 결찰 핸들을 갖는 제 1 바코드 단위 하위서열 세트를 첨가하는 단계 (S410')를 포함할 수 있으며, 여기서 제 1 바코드 단위 하위서열 세트의 상이한 바코드 단위 하위서열 (411', 412', 413', 414')은 동일한 중첩 서열을 갖는 부목 올리고뉴클레오티드 (415')와 혼성화된다. 단계 (S410')와 관련하여, 제 1 바코드 단위 하위서열 세트 각각을 함께 첨가하여 상이한 단위 사이의 원하는 비 (예를 들어, 1:1:1:1, 1:1:1:1이 아닌 비 등)를 달성할 수 있다. 제 1 결찰 라운드 후 결과의 생성물은 각각 상이한 결찰 핸들을 갖는 각 비드에 4개의 상이한 올리고뉴클레오티드 가닥 (또는 다른 변화에서 또 다른 적당한 수)일 것이다. 하나의 변화에서, 바코드 단위 하위서열은 세트를 구별하는데 사용된 상이한 결찰 핸들을 이용하여 웰 내에서 동일할 수 있다. 또 다른 변화에서, 바코드 단위 하위서열은 상이할 수 있으나, 동일한 웰에 있기 때문에 알려진 관련이 있을 수 있다.
도 16b에 나타낸 바와 같이, 예시적인 방법 (400')은 제 1 바코드 단위 하위서열 세트의 상응하는 말단에 제 2 바코드 단위 하위서열 세트를 첨가하는 단계 (S420')를 포함할 수 있으며, 여기서 제 2 바코드 단위 하위서열은 421', 422', 423', 424'로 도 16b에 나타낸다. 단계 (S420')와 관련하여, 제 2 바코드 단위 하위서열 세트 각각을 함께 첨가하여 상이한 단위 사이의 원하는 비 (예를 들어, 1:1:1:1, 1:1:1:1이 아닌 비 등)를 달성할 수 있다.
도 16c에 나타낸 바와 같이, 예시적인 방법 (400')은 제 2 바코드 단위 하위서열 세트의 상응하는 말단에 제 3 바코드 단위 하위서열 세트를 첨가하는 단계 (S430')를 포함할 수 있으며, 여기서 제 3 바코드 단위 하위서열은 431', 432', 433', 434'로 도 16c에 나타낸다. 단계 (S430')와 관련하여, 제 2 바코드 단위 하위서열 세트 각각을 함께 첨가하여 상이한 단위 사이의 원하는 비 (예를 들어, 1:1:1:1, 1:1:1:1이 아닌 비 등)를 달성할 수 있다. 또한, 도 15c에 나타낸 바와 같이, 제 3 바코드 단위 하위서열 세트는 상기 기재된 바와 같이 고유 분자 식별자 서열을 임의로 포함할 수 있다.
도 16d에 나타낸 바와 같이, 예시적인 방법 (400')은 제 3 바코드 단위 하위서열 세트의 상응하는 말단에 포집 올리고뉴클레오티드 세트를 첨가하는 단계 (S440')를 포함할 수 있으며, 여기서 유사한 포집 올리고뉴클레오티드는 441'로 도 16d에 나타내고, 상이한 부목 올리고뉴클레오티드 (즉, 445', 446', 447', 448')가 실행된다. 제 3 바코드 단위 하위서열 세트가 기재되지만, 방법 (400')은 원하는 다양성을 달성하기 위하여 임의의 다른 적당한 수의 바코드 단위 하위서열의 첨가를 포함할 수 있다. 예시적인 방법 (400)과 관련하여, 라운드 사이에 풀링 및 분할을 이용한 3회 (또는 다수의) 라운드의 결찰 후 결과는, 단일 바코드 서열을 이용하는 것과 동일한 바코드 다양성을 가지나 각 비드에 대해 4개의 상이한 바코드 서열을 갖는 비드이다. 상이한 말단을 이용하여 이러한 비드에 4개의 상이한 포집 서열을 넣는 것이 가능할 것이며, 바코드 단위 하위서열 관련이 알려져 있기 때문에, 모든 바코드 세트는 단일 바코드 위치뿐만 아니라 응집체 바코드 서열을 구성하는 3개의 바코드 단위 하위서열 세트 전체에서 일치해야 한다.
더 상세하게는, 동일한 포집 서열이 특정 비드의 모든 올리고뉴클레오티드 가닥에 적용된다면, 이들이 상이한 복합 바코드를 포함하더라도, 모든 세포로부터의 서열의 풀은 시퀀싱 오차 또는 키메라 서열의 더 나은 식별을 허용하는 특정 비드와 관련된 제한된 화이트리스트(whitelist) 바코드 하위서열 세트 중 하나에 모두 매핑될 것이다. 사용된 결찰 핸들은 개별 바코드 단위 하위서열로부터 응집된 응집체 바코드 서열의 모든 위치에 대한 특정 세트에 더 해당한다. 이와 같이, 임의의 세트의 교차가 감지될 수 있으며 해당 서열은 플래그될 수 있다. 임상 적용에서, 동일한 비드 (및 따라서 동일한 세포)에 모두 매핑되는 다수의 상이한 바코드가 있기 때문에 동일한 세포로부터 유래한 것으로 확인된 비교적 드문 (예를 들어, 1보다 큰) 포집된 서열 (예를 들어, 전사체)을 가질 수 있는 능력은 바코드와 관련된 모든 호출의 확실성을 크게 개선시켜 잠재적인 진단을 개선시킨다. 응집체 바코드 서열과 관련되나 UMI가 상이한 특정 전사체 또는 전사체 세트는, 단일 표적 세포의 상이한 전사체일 가능성이 있으나 키메라 서열의 결과일 수 있다. 이와 같이, 모두 단일 비드와 관련된 4개의 상이한 응집체 바코드에 대한 매핑은 이들이 단일 세포로부터 유래하였다는 훨씬 더 큰 확신을 제공한다.
예시적인 방법 (400')에 따른 바코드 단위 하위서열의 개별 세트를 이용하는 추가 이점은, "불변(invariant)" 결찰 핸들이 이제 각 단일 비드와 함께 집합적으로 다양성을 가지므로 시퀀싱 플래그를 피하여 후속 공정의 보다 비용 효율적인 사용을 허용한다는 것이다.
3개의 바코드 단위 하위서열 세트가 기재되지만, 방법 (400')은 임의의 다른 적당한 수의 바코드 단위 하위서열의 첨가를 포함할 수 있다. 예시적인 방법 (400)과 관련하여, 라운드 사이에 풀링 및 분할을 이용한 3회 (또는 다수의) 라운드의 결찰 후 결과는, 단일 바코드 서열을 이용하는 것과 동일한 바코드 다양성을 가지나 각 비드에 대해 4개의 상이한 바코드 서열을 갖는 비드이다. 상이한 말단을 이용하여 이러한 비드에 4개의 상이한 포집 서열을 넣는 것이 가능할 것이며, 바코드 단위 하위서열 관련이 알려져 있기 때문에, 모든 바코드 세트는 단일 바코드 위치뿐만 아니라 응집체 바코드 서열을 구성하는 3개의 바코드 단위 하위서열 세트 전체에서 일치해야 한다.
방법 (400')의 변화에서, 도 16e에 나타낸 바와 같이, 방법은 제 3 바코드 단위 하위서열 세트의 상응하는 말단에 포집 올리고뉴클레오티드 세트를 첨가하는 단계 (S440'')를 포함할 수 있으며, 여기서 포집 올리고뉴클레오티드는 441', 442', 443', 444'로 도 16e에 나타낸 것에 해당한다. 단계 (S440'')은 최종 결찰 단계 후, 결과의 조성물이 동일한 PCR 핸들을 가지나 각 응집체 바코드 서열에 대해 상이한 포집 서열을 갖는 비드당 다수의 상이한 응집체 바코드 서열 (CBCs)을 포함한다는 점에서, 상기 기재된 단계 (S440')과 다르다. 이와 같이, 이 구성은 응집체 바코드 서열이 동일하지 않더라도 확실하게 각 세포에 다시 매핑하는 능력과 함께, 상이한 표적의 동시 포집을 허용한다.
방법 (400')의 또 다른 변화에서, 도 17a에 나타낸 바와 같이, 방법은 3' 말단에서 상이한 결찰 핸들을 갖는 제 1 바코드 단위 하위서열 세트를 상이한 PCR 핸들에 첨가하는 단계 (S410'')를 포함할 수 있으며, 여기서 제 1 바코드 단위 하위서열 세트의 상이한 바코드 단위 하위서열 (411'', 412'', 413'', 414'')은 상보적 중첩 서열을 갖는 부목 올리고뉴클레오티드 (415'')와 혼성화된다. 단계 (S410'')와 관련하여, 제 1 바코드 단위 하위서열 세트 각각을 함께 첨가하여 상이한 단위 사이의 원하는 비 (예를 들어, 1:1:1:1, 1:1:1:1이 아닌 비 등)를 달성할 수 있다. 그 다음, 상기 기재되고 도 17b에 나타낸 단계 (S420' 내지 S440')와 관련하여 기재된 것과 유사한 방식으로, 방법은 각 비드가 단계 (S410'')에서 적용된 상이한 PCR 핸들로 인해 독립적으로 처리될 수 있는 상이한 바코드 서열을 갖는 비드 조성물을 생성할 수 있다. 특히, 최종 포집 올리고뉴클레오티드(들)는 적용에 따라 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 또한, 각각은 상이한 PCR 핸들을 이용하여 별도로 처리될 수 있으나, 여전히 동일한 비드에 다시 매핑될 수 있다. 이와 같이, 시료가 상이한 후속 작업흐름을 이용하여 처리되더라도 (예를 들어, 역전사 또는 폴리머라제 확장에 의한 초기 포집 및 확장 후), 특정 세포/비드와의 연결 및 관련이 있을 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 방법 (400' 및 400'')은 비드에 올리고뉴클레오티드 서열을 첨가하는 것으로 나타난다; 그러나, 방법 (400' 및 400'')은 상기 다양한 변화에 기재된 바와 같이 절단 부위 (예를 들어, 분자 가위, 제한 부위 등)를 포함하도록 추가적으로 또는 대안적으로 조정될 수 있다. 또한, 일부 적용에서, 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 의해 비드에 부착될 수 있으며, 유리 3'-OH 기를 가질 수 있다. 다른 적용에서, 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 의해 비드에 부착될 수 있다. 다른 적용에서, 상이한 바코드 세트는 결찰 후 잠재적으로 동일한 서열을 갖도록 조립된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 하나의 바코드 세트가 올리고뉴클레오티드를 5'에서 3' 방향으로 확장하여 첨가되며 다른 올리고뉴클레오티드가 3'에서 5' 방향으로 확장되는 방식으로 구성된다.
상기 기재된 방법 (400' 및 400'')의 단계와 관련하여, 결찰 동안 현탁액에 비드를 유지하는 단계는 전체 결찰에 유익하며 비드 간에 결찰의 균일성에 영향을 미칠 가능성이 있다. 정확한 속도는 용기의 크기와 모양, 및 반응에서 비드의 수에 따라 달라질 것이다. 관련된 혼합물을 일 예에서 진탕 장치에서 1500 RPM으로 진탕 (shaking)하였다; 그러나, 다른 진탕 매개변수를 실행할 수 있다. 각 결찰 단계의 시기(timing)와 관련하여, 1시간 미만의 결찰 시간은 전체 결찰 효율을 감소시키거나, 또는 동일한 효율을 달성하기 위해 추가 효소가 필요할 수 있다. 예에서, 16C에서 배양과 함께, 결찰당 4시간 내지 24시간의 결찰 시간을 실행하였다; 그러나, 다른 결찰 시간 및 배양 온도를 실행할 수 있다.
비드 제조를 위한 분할 및 풀 합성 방법의 고유한 것은 불완전한 올리고뉴클레오티드가 있는 비드가 함께 결합된다는 것이다. 이와 같이, 하나의 웰의 비-결찰된 바코드가 원래 상이한 웰에 있던 비드의 올리고에 결찰될 가능성이 있다. 이것은 "스터브" (즉, 비드에 부착된 불완전한 올리고)의 수가 바코드로 완전히 포화되지 않은 경우에 특히 그렇다. 결과는 동일한 비드에 하나 이상의 바코드를 갖는 비드가 되며, 이는 분석 동안 서열 자료의 부정확한 할당을 야기할 것이다. 이러한 유형의 오염은 매우 바람직하지 않다. 다수의 웰의 비드 (및 결찰 반응 성분)를 더 큰 튜브에 수집하는 경우, 비드의 수집 후, 펠렛화하여 비드를 유지하고 상청액을 제거한 다음, 비드를 세척하여 교차-오염을 크게 감소시켜 상기 기재된 효과를 완화한다 (예를 들어, 빠르게 수행되는 경우). 대안적으로, 자동화 시스템의 경우 또는 중간 상태의 혼합 용액에 비드가 남아 있는 경우, (예를 들어, 정지 용액, 효소의 열 사멸, 바코드 올리고뉴클레오티드의 탈인산화, 차단 올리고의 첨가, 결찰 용액으로부터 ATP의 고갈, 또 다른 적당한 방식으로) 결찰을 저해해야 한다. 예시적인 정지 용액은 존재하는 Mg++의 대략 2X 몰 당량과 결합된 EDTA를 포함할 수 있다.
비드당 이상적인 수의 올리고뉴클레오티드는 비드 조성물 및 최종 사용 적용에 따라 더 다양하다. 예를 들어, 최대 이하의 양의 바코드 올리고뉴클레오티드와의 결찰에 대해 개선된 성능 및 감소된 비용을 달성할 수 있다. 예시적인 공정은 대략 350만 비드, 또는 비드당 약 0.25 피코몰과의 결찰 반응에서 부분적으로 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 850 나노몰을 실행하였다. 부분적으로 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 양을 350만 비드당 172 나노몰, 또는 비드당 약 50 펨토몰 (femtomoles)로 감소시킴으로써, 개선된 성능으로 제조 비용을 크게 감소시켰다. 이 예는 각 비드 주위에 올리고뉴클레오티드의 보다 최적의 분포를 달성하여, 입체 장애가 문제가 될 인접한 올리고뉴클레오티드가 더 낮은 속도로 결찰되어 더 분포된 전장 올리고뉴클레오티드 세트를 야기함에 따라 입체 장애를 덜 야기시켰다. 또한, 리가제의 양은 비드의 수 및 비드당 결찰 결과의 수에 따라 조정된다. 예에서, 350만 비드당 33,333 응집성(cohesive) 말단 단위, 또는 비드당 약 0.0095 응집성 말단 단위가 실행되었다.
결찰을 개선할 수 있는 다른 결찰 반응 성분은 10% w/v의 최종 농도까지의 PEG 6000, 10 mM의 농도까지의 Mg++을 포함한다 (또는 최대 ~ 50%의 마그네슘을 다른 2가 양이온으로 대체하거나 또는 1가 =120* [2가]의 제곱근인 훨씬 더 많은 양의 1가 양이온으로 대체함). 다른 결찰 반응 성분은 적당한 반응 환경을 생성하기 위해 추가적으로 또는 대안적으로 실행될 수 있다.
또한, 결찰이 예시적인 방법 (400', 400'')에 기재되어 있지만, 조립 또는 확장의 다른 방법 (예를 들어, 주형화된 폴리머라제 확장 또는 화학적 부착, 예를 들어 클릭 부착 등)이 실행될 수 있다.
상기 방법과 관련하여 기재된 바코드 단위 하위서열 목록과 관련하여, 다양한 예시적인 목록은 96 (또는 그 미만) 내지 932 (또는 그 이상)의 바코드 단위 하위서열을 포함할 수 있다. 특히, 시퀀싱-후 분석에 의해 용이한 수정가능성 (correctability)을 위한 특성을 제공하기 위하여, 더 큰 해밍 거리, 레벤슈타인 거리(Levenshtein distance) 또는 기타 거리로 세트를 구성할 수 있다. 더 낮은 총 바코드 다양성을 갖는 비드를 제조하기 위해, 세트를 추가적으로 또는 대안적으로 구성할 수 있다.
그러나, 다른 적당한 구성 및/또는 목록당 바코드 단위의 수를 실행할 수 있다.
4.1.2 제 2 제조예
예에서, 제조 방법은 다수의 웰 (예를 들어, 96 웰)로 시작할 수 있으며, 각 웰은 최적의 시간, 온도 및 진탕의 조건 및 조성물 (예를 들어, 효소 농도, 올리고뉴클레오티드 농도, 반응 증강제, 군집(crowding)을 제공하는 분자) 하에서 각 비드에 (예를 들어, 결찰에 의해) 부착된 100만 이상의 미소구체 및 하나의 고유 올리고뉴클레오티드 절편을 함유한다. 각 튜브 (예를 들어, 96 튜브)에 존재하는 모든 입자에 고유 올리고뉴클레오티드 태그의 결찰 후, 96 튜브의 모든 비드가 함께 풀링될 때 세척 후 생성물의 이월이 발생하지 않도록 비드를 세척할 수 있다 (예를 들어, 튜브당 100만 비드 x 96 튜브 = 9600만 풀링됨 비드).
추가 시간의 세척 후, 비드를 고유 바코딩된 올리고뉴클레오티드 절편을 함유하는 96개의 상이한 튜브에 재-분포한 다음, 추가 시약 (예를 들어, 리가제, ATP, PEG, 반응 증강제)을 첨가하여 제 2 부착 단계를 계속한다. 바코드 절편 반응, 세척, 풀링, 재분포의 이 공정은, 모든 상이한 올리고뉴클레오티드 절편 영역이 첨가되어 전체 공정을 완료할 때까지 계속된다. 분할-풀링-세척 및 비드의 반응을 위한 액체 처리 공정은 96 웰 플레이트에서 자동화될 수 있거나 또는 384 웰 플레이트 또는 1536 웰 플레이트와 같은 다른 플레이트 크기에서 자동화될 수 있다. 각 웰에서 시약의 분배는 액체 피펫터에 의해 수행될 수 있거나 또는 잉크젯 유형 노즐과 같은 다른 방법으로 수행될 수 있거나, 또는 역(inverted) 웰 플레이트에서 음향적으로 배출될 수 있다. 비드의 풀링은 피펫터로 수행되거나 또는 96 웰 플레이트에 놓을 수 있는 특별히 설계된 수신된 뚜껑 플레이트를 이용하여 수행될 수 있으며, 그 다음 플레이트-뚜껑 조립을 역으로 흔들어 수신기 뚜껑 플레이트의 모든 비드를 수집할 수 있다. 액체 처리 작업은 전체 작업 동안 단계의 오염을 최소화하여 임의의 오차가 전체 공정을 통해 전파되는 것을 방지하도록 설계되었다. 본 명세서에 기재된 본 발명은 이러한 바코딩된 비드를 제조하기 위한 작업흐름이 상당히 간소화되도록 할 것이다. 제조될 수 있는 총 비드의 수는 100,000 이상 (또는 100만 또는 >1000만)의 다양한 고유 조합의 비드 다양성과 함께, 적게는 1000만에서 많게는 100억일 수 있다.
일 실시예에서, 각 웰에 존재하는 고유 올리고뉴클레오티드는 상이한 웰에 상이한 크기 단편을 포함할 수 있다. 명확성을 위해, 특정 예는 32 웰이 각각 결찰을 용이하게 하기 위해 이전 절편과 중첩을 제공하는 6 염기, 바코드 절편을 정의하는 7 고유 염기, 및 다음 절편과 중첩을 제공하는 4 염기를 포함하는 부분적으로 이중 가닥 구조체를 함유할 수 있다는 것이다. 추가 32 웰은 이전 절편과 중첩을 제공하는 동일한 6 염기, 바코드 절편을 정의하는 8 고유 염기, 및 다음 절편과 중첩을 제공하는 4 염기를 포함하는 부분적으로 이중 가닥 구조체를 함유한다. 32 웰의 제 3 세트는 각각 이전 절편과 중첩을 제공하는 동일한 6 염기, 바코드 절편을 정의하는 9 고유 염기, 및 다음 절편과 중첩을 제공하는 4 염기를 포함하는 부분적으로 이중 가닥 구조체를 함유한다. 상기 기재된 제조 방법에 사용되는 경우, 이는 상이한 길이 단편의 포함으로 인해 길이가 상이한 전장 올리고뉴클레오티드를 야기할 것이다. 바코드 영역을 통해 판독하는 서열이 이후에 생성될 때, 이러한 방식으로 제조된 바코드는 일반적인 제조 공정에는 없는 서열 생성 및 분석에 대해 여러 가지 뚜렷한 이점이 있다. 특히, 다수의 비드로부터 다수의 서열을 생성하는 경우, 상기 공정에 의해 생성된 것들은 서열의 일부 또는 전체에 대한 중첩 부문이 동일해야 한다는 유리한 특성을 가질 수 있다. 따라서, 이들은 정렬 마커의 역할을 할 수 있으며, 키메라 분자 식별, 시퀀싱 또는 제조 오차, 및 기타 이점과 같은 분석에 다른 이점을 제공할 수 있다.
이러한 분석에 일반적으로 사용된 서열은 오차를 생성하고 실행을 종료하므로, 서열의 너무 많은 부분이 모두 특정 위치에서 동일한 염기를 함유하는 경우 원하는 실험 자료를 수집하지 못할 것이다. 이와 같이, 기재된 동일한 중첩 영역과 같은 동일한 서열의 포함은 모든 서열이 동일한 길이일 때 문제가 될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방식으로 불변 영역에 선행하는 바코드 단위의 길이를 변화시킴으로써, 결과의 서열은 오프셋(offset)이 된다. 중첩 영역 또는 영역들이 다수의 서열에 걸쳐 근본적으로 불변할 수 있지만, 이들은 시퀀싱 공정 자체에서 오차를 야기하지 않고 동일하거나 또는 거의 동일한 마커의 이점을 달성할 수 있도록 효과적으로 위상이 다르다. 이것은 시퀀싱 기기 제한의 제약으로 작업하며 시퀀싱 후 개선된 분석을 제공하는 이중 이점을 제공하기에 적합한 한, 실례를 위해 본 명세서에서 사용된 것과 상이한 수의 웰 또는 튜브 및 상이한 구성의 서열 길이 변화를 이용하여 기재된 제조 공정에서 실행할 수 있다.
5. 결론
도면은 바람직한 실시예, 예시적인 구성, 및 이들의 변화에 따른 시스템, 방법 및 컴퓨터 프로그램 제품의 가능한 실행의 아키텍처(architecture), 기능성 및 작업을 나타낸다. 이와 관련하여, 흐름도 또는 블록도의 각 블록은 모듈, 절편 또는 코드의 일부를 나타낼 수 있으며, 이는 지정된 논리적 기능(들)을 실행하기 위한 하나 이상의 실행가능한 명령어를 포함한다. 또한, 일부 대안적인 실행에서, 블록에 언급된 기능은 도면에 언급된 순서와 다르게 발생할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 연속적으로 나타낸 2개의 블록은 실제로 실질적으로 동시에 실행될 수 있거나, 또는 블록은 관련된 기능성에 따라 때때로 역순으로 실행될 수 있다. 또한, 블록도의 각 블록 및/또는 흐름도 예시, 및 블록도의 블록 및/또는 흐름도 예시의 조합은, 지정된 기능 또는 작동을 수행하는 특수 목적 하드웨어-기반 시스템, 또는 특수 목적 하드웨어 및 컴퓨터 명령어의 조합에 의해 실행될 수 있음을 유의할 것이다.
통상의 기술자는 이전의 상세한 설명과 도면 및 청구범위로부터 인식할 수 있는 바와 같이, 하기 청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 바람직한 실시예에 대한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다.

Claims (33)

  1. 본체; 및
    본체에 결합된 분자 세트를 포함하는, 조성물로서,
    분자 세트 중 하나 이상은
    본체에 결합된 링커 영역;
    결합 영역;
    바코드 영역;
    고유 분자 식별자;
    포집 서열; 및
    영역 세트 중 적어도 하나를 본체로부터 분리하도록 구성된 절단 영역
    을 포함하는 영역 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 본체는 절단가능한 요소를 함유하는 폴리아크릴아미드 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 본체는 환원제가 있는 환경에서 용해되도록 구성된 폴리아크릴아미드 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 2항에 있어서, 본체는 조성물의 사용 동안 형광 신호를 방출하도록 구성된 플루오레세인 아미다이트 (FAM) 화합물로 태깅되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 바코드 영역은 2 이상의 바코드 단위 하위서열 세트를 포함하며, 다수의 2 이상의 바코드 단위 하위서열 세트는 조립 동안 바코드 단위 하위서열 세트에 걸쳐 공유되는 공통 핸들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 바코드 영역은 단일 본체에 부착된 2 이상의 비-랜덤 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 분자 세트는 제 1 서열을 갖는 제 1 바코드 영역을 갖는 분자의 제 1 하위세트, 제 2 서열을 갖는 제 2 바코드 영역을 갖는 분자의 제 2 하위세트, 및 제 3 서열을 갖는 제 3 바코드 영역을 갖는 분자의 제 3 하위세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 2 이상의 바코드 영역은 서열 특이적 방식으로 2 이상의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 핸들 또는 올리고뉴클레오티드 결합 영역과 연결되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 결합 영역은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 핸들 및 올리고뉴클레오티드 결합 영역 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 절단 영역은 USER 서열에 대한 dU를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 절단 영역은 제한 효소 인식 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 제한 효소 절단 부위는 상응하는 제한 효소에 의해 인식된 일시적인 헤어핀 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1항에 있어서, 절단 영역은 절단가능한 요소의 제 1 말단에 위치한 제 1 형광단과 절단가능한 요소의 제 2 말단에 위치한 형광 소광제 사이에 위치한 절단가능한 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 소광 요소는 절단 전에 제 1 형광단으로부터 방출된 형광 신호를 소광하도록 구성된 제 2 형광단을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1항에 있어서, 절단 영역은 본체와 형광단 사이에 위치한 절단가능한 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1항에 있어서, 절단 영역은 열불안정성 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 1항에 있어서, 절단 영역은 일련의 RNA 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 1항에 있어서, 포집 서열은 PolyA 상호작용을 통한 mRNA 결합, 및 포집된 mRNA로부터 cDNA의 합성 중 하나에 대해 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 1항에 있어서, 링커 영역은 덴드리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 기저 기질로서 본체 세트를 생성하는 단계;
    각각의 본체 세트에 대해
    본체에 링커 세트를 결합하는 단계; 및
    순차적 부착 작업으로 링커 세트에 분자 세트를 결합하는 단계를 포함하는, 조성물을 생성하는 방법으로서,
    분자 세트 중 하나 이상은
    본체에 결합된 링커 영역;
    결합 영역;
    바코드 영역; 및
    포집 서열
    을 포함하는 영역 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 분자 세트는 고유 분자 식별자 및 영역 세트 중 적어도 하나를 본체로부터 분리하도록 구성된 절단 영역 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 본체를 생성하는 단계는 개시제와 함께 아실아미드 용액을 포함하는 물질 성분의 부피를 제 1 미세유체 경로로 전달하는 단계, 및 가압 기체 펌프를 이용하여 물질 성분의 부피를 포커싱 채널로 통과시켜 본체를 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 바코드 영역은 2 이상의 바코드 단위 하위서열 세트를 포함하며, 다수의 2 이상의 바코드 단위 하위서열 세트는 조립 동안 바코드 단위 하위서열 세트에 걸쳐 공유되는 공통 핸들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제 20항에 있어서, 바코드 영역은 단일 본체에 부착된 2 이상의 비-랜덤 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 분자 세트는 제 1 서열을 갖는 제 1 바코드 영역을 갖는 분자의 제 1 하위세트, 제 2 서열을 갖는 제 2 바코드 영역을 갖는 분자의 제 2 하위세트, 및 제 3 서열을 갖는 제 3 바코드 영역을 갖는 분자의 제 3 하위세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제 20항에 있어서, 순차적 부착 작업은 본체 세트에 제 1 바코드 단위 하위서열 세트를 첨가하는 단계를 포함하며, 제 1 바코드 단위 하위서열 세트는 제 1 바코드 단위 하위서열 세트 중에서 하나 이상의 핸들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 결찰 핸들 세트에 기초한 표적화된 결찰을 이용하여 제 1 바코드 단위 하위서열 세트에 제 2 바코드 단위 하위서열 세트를 결찰하는 단계,
    결찰 핸들 세트에 기초한 표적화된 결찰을 이용하여 제 2 바코드 단위 하위서열 세트에 제 3 바코드 단위 하위서열 세트를 결찰하는 단계, 및
    이에 의해 2 이상의 서열로 구성된 바코드 영역을 형성하는 단계
    를 더 포함하는, 방법.
  28. 제 20항에 있어서, 결합 영역은 2 이상의 별개의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 순차적 부착 작업은 본체 세트에 제 1 바코드 단위 하위서열 세트를 첨가하는 단계를 포함하며, 제 1 바코드 단위 하위서열 세트는 제 1 바코드 단위 하위서열 세트 중에서 하나 이상의 핸들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 2 이상의 결합 영역에 대한 제 1 바코드 단위 하위서열 세트의 표적화된 결찰을 더 포함하는, 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 결찰 핸들 세트에 기초한 표적화된 결찰을 이용하여 제 1 바코드 단위 하위서열 세트에 제 2 바코드 단위 하위서열 세트를 결찰하는 단계,
    결찰 핸들 세트에 기초한 표적화된 결찰을 이용하여 제 2 바코드 단위 하위서열 세트에 제 3 바코드 단위 하위서열 세트를 결찰하는 단계, 및
    이에 의해 2 이상의 서열로 구성된 바코드 영역을 형성하는 단계
    를 더 포함하는, 방법.
  32. 제 1항에 있어서, 본체는 마이크로웰의 표면인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  33. 제 20항에 있어서, 본체는 마이크로웰의 표면인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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