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KR20220050087A - 대사성 질환의 치료 및 예방 - Google Patents

대사성 질환의 치료 및 예방 Download PDF

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KR20220050087A
KR20220050087A KR1020217039250A KR20217039250A KR20220050087A KR 20220050087 A KR20220050087 A KR 20220050087A KR 1020217039250 A KR1020217039250 A KR 1020217039250A KR 20217039250 A KR20217039250 A KR 20217039250A KR 20220050087 A KR20220050087 A KR 20220050087A
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KR
South Korea
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liver
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binding
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KR1020217039250A
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스튜어트 알렉산더 쿡
세바스찬 새퍼
브리제쉬 쿠마르스 싱
아니사 아닌디야 위드자자
Original Assignee
싱가포르 헬스 서비시즈 피티이 엘티디
내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화의 저해를 통해 대사 질환을 치료하고 방지하는 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법에 사용하기 위한 제제가 개시된다.

Description

대사성 질환의 치료 및 예방
본 출원은 2019년 5월 3일에 출원된 GB 1906291.8, 2019년 5월 10일에 출원된 GB 1906597.8, 2020년 1월 24일에 출원된 GB 2001013.8, 2020년 2월 12일에 출원된 GB 2001896.6 및 2020년 2월 14일에 출원된 GB 2002030.1로부터 우선권을 주장하며, 이의 내용 및 요소는 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 대사 질환의 진단, 치료 및 예방에 관한 것이다.
비만, 당뇨병 및 관련 병태
비만은 WHO에 의해 건강을 해칠 만한 과도한 지방 축적으로서 정의되고, BMI ≥30 kg/m2에서 진단된다. 비만은 실질적으로 대사 질환(2형 진성 당뇨병(T2D: type 2 diabetes mellitus) 및 지방 간 질환(fatty liver disease) 포함), 심혈관 질환(고혈압(hypertension), 심근 경색(myocardial infarction) 및 뇌졸중(stroke) 포함), 근골격계 질환(예를 들어, 골관절염(osteoarthritis)), 알츠하이머 질환(Alzheimer disease), 우울증(depression) 및 일부 유형의 암(유방, 난소, 전립선, 간, 신장 및 결장)의 위험을 증가시키며 - 예를 들어, 문헌[Bluher, 등, Nat Rev Endocrinol. (2019) 15:288-298] 및 문헌[Prospective Studies Collaboration, Lancet. (2009) 373(9669):1083-96]을 참조한다. 게다가, 비만은 삶의 감소된 질, 실업, 더 낮은 생산성 및 사회적 약점을 유발한다(문헌[Berrington de Gonzalez 등, N Engl J Med (2010) 363:2211-2219]). 비만은 또한, 저하된 기대 수명(life expectancy)과 관련이 있으며, 병태 및 동시이환(comorbid) 장애의 중증도에 따라 추정상 5년 내지 20년이 상실된다(문헌[Fontaine 등, JAMA (2003) 289: 187-193]).
지난 50년에 걸쳐, 비만 유병률(prevalence)은 팬데믹(pandemic) 수준까지 증가하였다. 비만의 세계적인 유병률은 또한, 1975년과 2016년 사이에 어린이 및 청소년에서 남자아이의 경우 0.7%로부터 5.6%까지 그리고 여자아이의 경우 0.9%로부터 7.8%까지 급속도로 증가하였다(문헌[NCD-RisC, Lancet (2017) 390(10113):26227-2642]). 생활양식의 '서구화' 및 고칼로리 식품은 비만의 주된 원인인 것으로 보였다.
세계적인 인간 건강에 대한 하나의 다른 가장 중요한 위협은 비만과 더불어 2형 당뇨병의 증가하는 발생률(incidence)이다. 문헌[Menke 등, JAMA (2015) 314: 1021-1029]는 BMI 범주에 의해 경향을 검사하였으며, 당뇨병은 단지 비만인 대상체 중에서 증가하였고(18.0% 내지 20.1%), 이는 당뇨병의 유병률에서의 대부분의 증가는 비만의 증가하는 유병률로 인한 것임을 시사한다. 특히, 아시아인은 백인보다 더 낮은 BMI를 갖고 있음에도 불구하고 당뇨병을 발증시킬 가능성이 30% 내지 50% 더 높으며 당뇨병의 높은 유병률이 염려된다(문헌[Lee 등, Diabetes Care (2011) 34, 353-357]).
메트포르민(metformin)은 치료적 잠재성을 실증하였으며, 또한 규칙적인 운동을 포함하여 이의 항-비만 이익을 얻는 건강한 생활양식을 채택하는 것과 더불어 당뇨병에 대한 제1선 치료로서 사용되어 왔다(문헌[Yerevanian 등, Curr Obes Rep (2019)]). 최근, 인터루킨-1이 또한, T2D에서 저등급 염증을 조절하기 위한 당뇨병의 치료적 표적인 것으로 나타났다(문헌[Kataria 등, Semin Immunopathol. (2010)]).
비-알코올성 지방간염(NASH: Non-alcoholic steatohepatitis)
비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD)의 세계적인 유병률은 25%로 추정되고(문헌[Friedman 등, Nat Med. (2018) 24(7): 908-922]), NAFLD는 가역적인 한편, 이는 비-알코올성 지방간염(NASH)으로 진행될 수 있다. NASH는 결국 간부전(liver failure)을 유발하는 지방증-주도(driven) 염증, 간세포 사멸 및 간 섬유증을 특징으로 한다. 간 성상 세포(HSC: hepatic stellate cell)는 NASH의 발병(pathogenesis)에서 중추적이고, 95%까지의 간 근섬유아세포(liver myofibroblast)를 발생시키며(문헌[Mederacke 등 Nat Commun (2013) 4:2823]), 이는 NASH의 많은 주요 발병, 즉, 간 섬유증, 염증 및 조직실질 기능이상(parenchymal dysfunction)을 주도한다(문헌[Friedman, Physiol Rev (2008) 88:125-172]; 문헌[Friedman, J Biol Chem (2000) 275:2247-2250]; 문헌[Higashi 등, Adv Drug Deliv Rev (2017) 121:27-42]).
캐노니컬(canonical) 섬유증-촉진(pro-fibrotic) 인자, 형질전환 성장 인자-β1(TGFβ1: transforming growth factor-β1) 및 혈소판-유래 성장 인자(PDGF(platelet-derived growth factor); 문헌[Hellerbrand J Hepatol (1999) 30:77-87]; 문헌[Tsuchida 및 Friedman Nat Rev Gastroenterol Hepatol (2017) 14:397-411]) 및 또한 전염증성 인자(pro-inflammatory factor), 예컨대 CCL2, TNFα 및 CCL5(문헌[Friedman, J Biol Chem (2000) 275:2247-2250]; 문헌[Tsuchida 및 Friedman Nat Rev Gastroenterol Hepatol (2017) 14:397-411]; 문헌[Kim 등, Sci Rep (2018) 8:7499])를 포함하여 많은 인자가 HSC 활성화 및 형질전환에 관여한다. 아마도 이러한 복잡성을 반영하고 중복성(redundancy)을 내포하여, 어떠한 단일 업스트림 개시 인자도 NASH에서 성공적으로 표적화되어 왔으며, 승인된 NASH 약물은 존재하지 않는다. 현재, NASH에 대해 임상 시험중인 많은 약물이 존재하지만, 이들 중 많은 것은 대사를 표적화하고 이것이, 임상적 성과를 예측하는 간 섬유증을 향상시킬 것인지는 분명하지 않다(문헌[Friedman 등, Nat Med. (2018) 24(7): 908-922]; 문헌[Banini 등, Curr Opin Gastroenterol (2017) 33:134-141]).
휴지기(quiescent) HSC는 비타민 A 저장 세포이며 섬유아세포와 매우 별개이다. 그러나, 공통(common) 인자는 세포 유형 둘 다를 활성화시키고, 공유된 특질을 갖는 근섬유아세포로의 이행(transition)을 자극한다(문헌[Mederacke 등 Nat Commun (2013) 4:2823]; 문헌[Iwaisako 등, Proc Natl Acad Sci U S A 2014;111:E3297-305]). IL-11은 최근, 심혈관 및 폐 섬유아세포-로부터-근섬유아세포로의 형질전환을 위한 중대한 인자로서 식별되어 왔다(문헌[Schafer 등, Nature 2017;552:110-115]; Cook 등, (2018) https://doi.org/10.1101/336537). 간에서 IL-11에 대한 매우 한정된 식견이 존재하지만, 재조합 인간 IL-11은 설치류에 매우 높은 용량으로 주사되었을 때 보호 효과를 갖는 것으로 보고되었고(문헌[Zhu 등, PLoS One (2015) 10:e0126296]; 문헌[Yu 등, Clin Res Hepatol Gastroenterol (2016) 40:562-570]), 인간에서 진행성 간염(advanced hepatitis)에서 염증을 감소시키기 위한 시도로 시험되었다(문헌[Lawitz 등, Am J Gastroenterol 2004;99:2359-2364]).
소모성 질환(wasting disease)
소모성은 체중 손실로서 나타날 수 있는 지방 질량(fat mass)의 손실과 함께 또는 지방 질량의 손실 없이 근육의 손실로서 정의될 수 있다. 여러 가지 급성 질환 및 만성 질환, 뿐만 아니라 노화는 종종 소모성과 관련이 있다. 소모성은 영양 상태의 악화, 근육 질량 및 기능의 손실, 삶의 손상된 품질, 및 질병률(morbidity)과 사망률(mortality)에 대한 증가된 위험을 유발할 수 있다. 근육 소모성은 소모성의 가장 공통적인 분모(denominator)이지만, 지방 조직 소모성 또한 단리되어 또는 근육 소모성과 조합되어 발생할 수 있다. 소모성 장애의 예는 악액질(cachexia), 근육감소증(sarcopenia)(예를 들어, 골격근 질량 및 강도의 노화-관련 손실 또는 사용-결여 손실), 거식증(anorexia)(음식에 대한 식욕의 결여 또는 손실), 근감소증(myopenia)(일반적으로 근육 소모성을 설명하기 위해 제안된 용어), 지방이영양증(lipodystrophy)(지방 축적물의 특이적인 소모성) 및 지방위축증(lipoatrophy)을 포함한다. 악액질의 현재-허용된 정의는: "종래의 영양 뒷받침에 의해 완전히 역전될 수 없고 진행성 기능적 손상을 유발하는 골격근 질량의 계속진행성(ongoing) 손실(지방 질량의 손실과 함께 또는 없이)을 특징으로 하는 다인성(multifactorial) 증후군"이다(문헌[Evans 등 Clin Nutr. 2008 (6):793-9]).
소모성은 말기(late-stage) 만성 병을 갖는 환자에서 고도로 우세하다. 근육감소증, 악액질 및 소모성 장애 협회(SCWS)에 따르면, 만성 심부전(chronic heart failure) 또는 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)을 갖는 환자 중 대략 5% 내지 15%는 소모성 장애를 나타내는 한편, 소모성 장애는 진행암(advanced cancer)을 갖는 환자 중 60% 내지 80%에 의해 경험된다. 악액질은 20%의 암 사망에 직접적으로 기인한다(문헌[Skipworth 등, Clin Nutr. 2007; 26:667-76]). 소모성은 감염 질환, 예컨대 HIV/AIDS, 말라리아(malaria) 및 결핵(tuberculosis)을 갖는 환자에서, 뿐만 아니라 만성 병태, 예컨대 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 간 경화증(liver cirrhosis), 신부전(renal failure), 크론 질환(Crohn's disease), 류마티스 관절염, 뇌졸중, 및 신경학적 퇴행성 질환(neurological degenerative disease)에서 주지되어 왔다. 외상성 손상(traumatic injury), 수술-후(post-surgery), 무중력 상태(weightlessness), 만성 알코올 중독(chronic alcoholism) 및 패혈증(sepsis) 또한, 소모성의 발생(onset)과 관련이 있다(문헌[Farkas 등 J Cachexia Sarcopenia Muscle (2013) 4:173-178]).
소모성 및 소모성 장애는 종종 기저 질환의 치료에 악영향을 미치며: 이는 기저 질환의 치료에 대한 환자 반응을 손상시키며, 면역계를 해치고, 기저 병태의 악화된 증상을 유발한다. 따라서, 소모성을 향상시키는 치료는 기저 질환/병태에 대한 치료의 효능을 증가시키고 환자에 대한 예후를 향상시킬 수 있다.
예를 들어, 진행형 암-관련 악액질은 종종 항암 치료에 대해 불량한 예후를 유발한다. 화학치료법까지 그리고 화학치료법 동안 체중 손실을 경험하는 암환자는, 체중-안정형 환자와 비교하여 더 낮은 초기 용량을 받으며 더 빈번하고 중증인 용량-제한 독성을 경험하므로, 유의하게 더 적은 치료를 받거나 실제로 착수 시 치료 요법으로부터 배제될 수 있다(문헌[Vaughan 등 J Cachexia Sarcopenia Muscle (2013) 4:95-109]). 소모성에 대한 효과적인 치료는 이러한 환자에 대해 더욱 긍정적인 성과를 초래할 것이다.
현재, 소모성에 대한 치료는 근육 질량을 빌드업(build up)하기 위해 식욕 자극제 및 운동을 포함한다. 그러나, 식욕 단독의 영양학적 보조 또는 약물학적 조작은 종종, 특히 중증 또는 말기에 있을 때 소모성 과정을 역전시킬 수 없다. 에이코사펜타엔산(EPA(eicosapentaenoic acid); 어유로부터의 오메가-3 지방산)은 암 맥락에서 악액질을 향상시키는 데 있어서 그 효과에 대해 시험되어 왔으나, 시험 결과는 모순되었다(문헌[Jatoi 등, J Clin Oncol. 2004; 22:2469-76]). 항산화제 및 비-스테로이드성 항염증제가 시험되었고, 이들 치료와 예를 들어, EPA, 산화 스트레스 저해제 및/또는 식욕 자극제와의 조합은 소모성을 치료하는 데 있어서 잠재성을 갖는 것으로 생각된다. 유비퀴틴 단백분해성 경로(UPP: ubiquitin proteolytic pathway)의 저해가 특히 흥미롭다. 근육 저해 성분, 마이오스타틴(myostatin)의 저해는 임상 시험에서 성공적인 적이 없었다.
기저 질환과 조합된 소모성의 다인자 성질은, 소모성에 대해 세계적으로 효과적이거나 허용된 치료가 존재하지 않거나, 심지어 임의의 승인된 약물 치료법이 존재하지 않음을 의미한다. 실제로, 질환-관련 소모성을 치료하는 유일한 방식은 기저 질환을 치유하는 것임이 일반적으로 허용된다(문헌[Vaughan 등 J Cachexia Sarcopenia Muscle (2013) 4:95-109]). 그러므로, 소모성에 대한 새로운 치료법이 필요하다.
본 발명은 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 제공한다.
또한, 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에서, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도가 제공된다.
또한, 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 치료적 또는 예방적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 비만(obesity), 2형 당뇨병(T2D: type 2 diabetes), 1형 당뇨병(T1D: type 1 diabetes), 전당뇨병(pre-diabetes), 과체중(being overweight), 대사 증후군(metabolic syndrome), 임신-관련 고혈당증(pregnancy-associated hyperglycemia), 담즙울체성 간 질환(cholestatic cholestatic liver disease), 고혈당증(hyperglycaemia), 고지질혈증(hyperlipidaemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 소모성(wasting), 악액질(cachexia), 화학치료법-관련 체중 손실(chemotherapy-associated weight loss), 췌장 부전(pancreatic insufficiency), 췌장염(pancreatitis), 급성 췌장염(acute pancreatitis), 만성 췌장염(chronic pancreatitis), 지방증(steatosis), 지방독성(lipotoxicity), 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease), 비-알코올성 지방 간(NAFL: non-alcoholic fatty liver), 비-알코올성 지방간염(NASH: non-alcoholic steatohepatitis), 지방이영양증, 지방비대증(lipohypertrophy), 지방위축증, 인슐린 내성(insulin resistacne) 또는 고글루카곤혈증(hyperglucagonemia)이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는, 인터루킨 11(IL-11)이 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)에 결합하는 것을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제이다.
일부 구현예에서, 제제는 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 또는 저분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 제제는 유인(decoy) 수용체이다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11 항체 길항제, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11Rα 항체 길항제, 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11에 대한 유인 수용체이다. 일부 구현예에서, IL-11에 대한 유인 수용체는: (i) gp130의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열 및 (ii) IL-11Rα의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 뮤테인(mutein)이다. 일부 구현예에서, IL-11 뮤테인은 W147A이다.
일부 구현예에서, 제제는 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 올리고뉴클레오타이드 또는 저분자이다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, IL-11의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:12, 13, 14 또는 15의 서열을 포함하는 IL11로 표적화된 siRNA이다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-11Rα의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, IL-11Rα의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:16, 17, 18 또는 19의 서열을 포함하는 IL11RA로 표적화된 siRNA이다.
일부 구현예에서, 인터루킨 11 수용체는 IL-11Rα이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 것으로 결정되었던 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 대상체에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계, 및 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
설명
인터루킨 11 및 IL-11에 대한 수용체
지방세포생성(adipogenesis) 저해 인자로도 알려져 있는 인터루킨 11(IL-11)은 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인이며, IL-6, IL-11, IL-27, IL-31, 온코스타틴(oncostatin), 백혈병 저해 인자(LIF), 카디오트로핀-1(CT-1: cardiotrophin-1), 카디오트로핀-유사 사이토카인(CLC: cardiotrophin-like cytokine), 섬모 신경친화성 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor) 및 뉴로포에틴(NP-1: neuropoetin-1)을 포함하는 사이토카인의 IL-6 계열(family)의 구성원이다.
인터루킨 11(IL-11)은 여러 가지 중간엽 세포 유형에서 발현된다. IL-11 게놈 서열은 염색체 19, 및 염색체 7의 동원체(centromeric) 영역 상으로 맵핑되었고(mapped), 세포로부터의 효율적인 분비를 보장하는 캐노니컬 신호 펩타이드와 함께 전사된다. IL-11의 활성자(activator) 단백질 복합체, cJun/AP-1은 이의 프로모터 서열 내에 위치해 있으며, IL-11의 기본적인(basal) 전사 조절에 중요하다(문헌[Du 및 Williams., Blood 1997, Vol 89: 3897-3908]). 미성숙 형태의 인간 IL-11은 199개 아미노산 폴리펩타이드인 반면, 성숙 형태의 IL-11은 178개 아미노산 잔기의 단백질을 인코딩한다(문헌[Garbers 및 Scheller., Biol. Chem. 2013; 394(9):1145-1161]). 인간 IL-11 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P20809(P20809.1 GI:124294; SEQ ID NO:1) 하에 입수 가능하다. 재조합 인간 IL-11 (오프렐베킨(oprelvekin)) 또한 상업적으로 입수 가능하다. 마우스, 래트, 돼지, 소, 몇몇 종의 경골 어류(bony fish) 및 영장류를 포함하여 다른 종으로부터의 IL-11 또한 클론되고 시퀀싱되었다.
이 명세서에서, "IL-11"은 임의의 종으로부터의 IL-11을 지칭하며, 임의의 종으로부터의 IL-11의 이소형(isoform), 단편, 변이체 또는 상동체(homologue)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 종은 인간(호모 사피엔스(Homo sapiens))이다. IL-11의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 주어진 종, 예를 들어, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 IL-11의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성 중 하나를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. IL-11의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, IL-11Rα(바람직하게는 동일한 종으로부터)에 결합하고 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 신호 전달을 자극하는 능력을 특징으로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Curtis 등. Blood, 1997, 90(11)]; 또는 문헌[Karpovich 등. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재된 바와 같음). IL-11의 단편은 임의의 길이(아미노산 수에 의해)일 수 있지만, 선택적으로 성숙 IL-11의 길이의 적어도 25%일 수 있고 성숙 IL-11의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. IL-11의 단편은 10개 아미노산의 최소 길이, 및 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 195개 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
IL-11은 유비쿼터스적으로(ubiquitously) 발현되는 당단백질 130(gp130; 당단백질 130, IL-6ST, IL-6-베타 또는 CD130으로도 알려져 있음)의 호모이량체(homodimer)를 통해 신호화한다. Gp130은 IL-6 수용체 계열와 함께 유형 I 사이토카인 수용체의 하나의 하위단위를 형성하는 막관통 단백질이다. 특이성은, 신호 전달에 직접적으로 참여하지 않지만 α-수용체에의 초기 사이토카인 결합 사건이 gp130과 최종적인 복합체 형성을 유발하는 개별적인 인터루킨 11 수용체 하위단위 알파(IL-11Rα)를 통해 얻어진다.
인간 gp130(22개 아미노산 신호 펩타이드 포함)은 918개 아미노산 단백질이고, 성숙 형태는 597개 아미노산 세포외 도메인, 22개 아미노산 막관통 도메인, 및 277개 아미노산 세포내 도메인을 포함하는 866개 아미노산이다. 단백질의 세포외 도메인은 gp130의 사이토카인-결합 모듈(CBM)을 포함한다. gp130의 CBM은 Ig-유사 도메인 D1, gp130의 피브로넥틴-유형 III 도메인 D2 및 D3을 포함한다. 인간 gp130의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P40189-1(SEQ ID NO:2) 하에 입수 가능하다.
인간 IL-11Rα는 422개 아미노산 폴리펩타이드(UniProt Q14626; SEQ ID NO:3)이고, 뮤린 IL-11Rα와 약 85% 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 동일성을 공유한다. IL-11Rα의 2개의 이소형이 보고되었으며, 이는 세포질 도메인에서 상이하다(상기 Du 및 Williams). IL-11 수용체 α-사슬(IL-11Rα)은 IL-6 수용체 α-사슬(IL-6Rα)과 많은 구조적 및 기능적 유사성을 공유한다. 세포외 도메인은 특징적인 보존된 Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS) 모티프를 포함하여 24% 아미노산 동일성을 나타낸다. 짧은 세포질 도메인(34개 아미노산)은, JAK/STAT 신호화 경로의 활성화에 필요한 박스 1 및 2 영역이 결여되어 있다.
뮤린 IL-11 상의 수용체 결합 부위가 맵핑되었고, 3개 부위 - 부위 I, II 및 III - 가 식별되었다. gp130에의 결합은 부위 II 영역에서의 치환에 의해, 그리고 부위 III 영역에서의 치환에 의해 감소된다. 부위 III 돌연변이체는 검출 가능한 작용제(agonist) 활성을 나타내지 않고, IL-11Rα 길항제 활성을 갖는다(문헌[Cytokine Inhibitors Chapter 8; edited by Gennaro Ciliberto and Rocco Savino, Marcel Dekker, Inc. 2001]).
본 명세서에서, IL-11에 대한 수용체(IL-11R)는 IL-11에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, IL-11 수용체는 IL-11에 결합하고 수용체를 발현하는 세포에서 신호 전달을 유도할 수 있다.
IL-11 수용체는 임의의 종으로부터의 것일 수 있고, 임의의 종으로부터의 IL-11 수용체의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 종은 인간(호모 사피엔스)이다.
일부 구현예에서, IL-11 수용체는 IL-11Rα일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11에 대한 수용체는 IL-11Rα를 포함하는 폴리펩타이드 복합체일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11 수용체는 IL-11Rα 및 gp130을 포함하는 폴리펩타이드 복합체일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11 수용체는 gp130, 또는 IL-11이 결합하는 gp130을 포함하는 복합체일 수 있다.
IL-11Rα의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 주어진 종, 예를 들어, 인간으로부터의 IL-11Rα의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성 중 하나를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. IL-11Rα의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, IL-11(바람직하게는 동일한 종으로부터)에 결합하고 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 신호 전달을 자극하는 능력을 특징으로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Curtis 등. Blood, 1997, 90(11)] 또는 문헌[Karpovich 등. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재된 바와 같음). IL-11 수용체의 단편은 임의의 길이(아미노산 수에 의해)일 수 있지만, 선택적으로 성숙 IL-11Rα의 길이의 적어도 25%일 수 있고 성숙 IL-11Rα의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. IL-11 수용체 단편의 단편은 10개 아미노산의 최소 길이, 및 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 또는 415개 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
IL-11 신호화
IL-11은 IL-11Rα에 낮은 친화도(Kd ~10 nmol/L)로 결합하고, 이들 결합 파트너 사이의 상호작용 단독으로는 생물학적 신호를 전달하기에 불충분하다. 신호 전달을 할 수 있는 고 친화도 수용체(Kd ~400 내지 800 pmol/L)의 발생은 IL-11Rα 및 gp130의 공동-발현을 필요로 한다(문헌[Curtis 등 Blood 1997; 90 (11):4403-12]; 문헌[Hilton 등, EMBO J 13:4765, 1994]; 문헌[Nandurkar 등, Oncogene 12:585, 1996]). 세포-표면 IL-11Rα에의 IL-11의 결합은 주로 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK)-캐스케이드 및 Janus 키나제/전사의 신호 전달자 및 활성자(Jak/STAT) 경로를 통해 헤테로이량체화, 티로신 인산화, gp130의 활성화 및 다운스트림 신호화를 유도한다(상기 Garbers 및 Scheller).
원칙적으로, 가용성 IL-11Rα는 또한, IL-11과 함께 생물학적으로 활성인 가용성 복합체를 형성하여(문헌[Pflanz 등, 1999 FEBS Lett, 450, 117-122]), IL-6과 유사하게, IL-11이 일부 경우에 세포-표면 gp130에 결합하기 전에 가용성 IL-11Rα에 결합할 수 있는 가능성을 상승시킬 수 있다(상기 Garbers 및 Scheller). Curtis 등(문헌[Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12])은 가용성 뮤린 IL-11 수용체 알파 사슬(sIL-11R)의 발현을 기재하며, gp130을 발현하는 세포에서 신호화를 조사하였다. gp130의 존재 하에, 막관통 IL-11R이 아니라 sIL-11R은 막관통 IL-11R을 통한 신호화와 유사하게 M1 백혈병 세포의 IL-11 의존적 분화 및 Ba/F3 세포에서의 증식 및 gp130, STAT3 및 SHP2의 인산화를 포함하여 초기(early) 세포내 사건을 매개하였다. 가용성 IL-11Rα에 결합된 IL-11에 의한 세포-막 결합된 gp130을 통한 신호화의 활성화가 최근 실증되었다(문헌[Lokau 등, 2016 Cell Reports 14, 1761-1773]). 이러한 소위 IL-11 trans 신호화가 질환 발병에 중요할 수 있지만, 인간 질환에서 이의 역할은 아직 연구된 적이 없었다.
본원에 사용된 바와 같이, 'IL-11 trans 신호화'는, IL-11Rα에 결합된 IL-11이 gp130에 결합함으로써 촉발되는 신호화를 지칭하는 데 사용된다. IL-11은 IL-11Rα에 비-공유 복합체로서 결합될 수 있다. gp130은 막-결합되고 세포에 의해 발현되어, 신호화는 IL-11:IL-11Rα 복합체가 gp130에 결합한 후 발생한다. 일부 구현예에서, IL-11Rα는 가용성 IL-11Rα일 수 있다. 일부 구현예에서, 가용성 IL-11Rα는 IL-11Rα의 가용성(분비된) 이소형(예를 들어, 막관통 도메인이 결여됨)이다. 일부 구현예에서, 가용성 IL-11Rα는 세포막 결합된 IL-11Rα의 세포외 도메인의 단백질분해성 절단의 유리된(liberated) 생성물이다. 일부 구현예에서, IL-11Rα는 세포막-결합된 것일 수 있고, gp130을 통한 신호화는 "IL-11 cis 신호화"라고 하는 세포-막-결합된 IL-11Rα에 결합된 IL-11의 결합에 의해 촉발될 수 있다. 바람직한 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 IL-11-매개 cis 신호화를 방해(disrupt)함으로써 달성된다.
IL-11-매개 신호화는 조혈작용(hematopoiesis) 및 혈소판발생(thrombopoiesis)을 자극하며, 용골세포(osteoclast)를 자극하고, 신경발생(neurogenesis)을 자극하며, 지방세포생성을 저해하고, 전염증성(pro inflammatory) 사이토카인 발현을 감소시키며, 세포외 매트릭스(ECM) 대사를 조절하고, 위장관 상피 세포의 정상적인 성장 제어를 매개하는 것으로 나타났다(상기 Du 및 Williams).
인터루킨 11(IL-11)의 생리학적 역할은 불분명하게 남아 있다. IL-11은 조혈 세포의 활성화 및 혈소판 생성과 가장 강하게 연관되어 왔다. IL-11은 또한, 이식편대숙주-질환, 염증성 관절염 및 염증성 장 질환에 반하여 보호를 부여하여, 항-염증성 사이토카인인 것으로 여겨지는 IL-11을 유발하는 것으로 나타났다(문헌[Putoczki 및 Ernst, J Leukoc Biol 2010, 88(6):1109-1117]). 그러나, IL-11은 전염증성일 뿐만 아니라 항염증성, 전혈관신생(pro-angiogenic)이고 신조직 형성(neoplasia)에 중요한 것으로 시사된다. 최근의 연구는, IL-11이 마우스 관절염 모델 및 암에서 바이러스-유도 염증 동안 쉽게 검출 가능함을 나타내었고, 이는 IL-11의 발현이 병리학적 자극에 의해 유도될 수 있음을 시사한다. IL-11은 또한, 신생물성(neoplastic) 위장관 상피에서 종양-촉진 표적 유전자의 Stat3-의존적 활성화와 연관이 있다(상기 Putoczki 및 Ernst).
본원에 사용된 바와 같이, "IL-11 신호화" 및 "IL-11-매개 신호화"는 IL-11, 또는 성숙 IL-11 분자의 기능을 갖는 이의 단편이 IL-11에 대한 수용체에 결합함으로써 매개되는 신호화를 지칭한다. "IL-11 신호화" 및 "IL-11 매개 신호화"는 예를 들어, IL-11에 대한 수용체에의 결합을 통해 IL-11/이의 기능적 단편에 의해 개시되는 신호화를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 다시 말해, "신호화"는 세포적 활성을 지배하는 신호 전달 및 다른 세포적 과정을 지칭한다.
대사 질환
본 발명은 대사 질환의 치료 및/또는 방지에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "대사 질환"은 비정상적인 대사에 의해 유발되거나 이를 특징으로 하는 임의의 질환 또는 병태를 지칭한다. 이러한 맥락에서 "대사"는 에너지로의 그리고/또는 저장을 위한 에너지 공급원, 예를 들어, 영양을 제공하기 위해 소모되는 성분의 체내 전환/가공을 지칭한다.
"정상적인 대사"는 질환을 갖지 않는, 예를 들어, 대사 질환을 갖지 않거나 대사 질환의 증상/상관관계를 소유하지 않는 건강한 대상체의 대사일 수 있다.
대사 질환을 갖는 대상체는 비정상적인 대사를 나타낼 수 있다. 대사 질환을 갖는 대상체는 비정상적인 대사의 증상/상관관계를 가질 수 있다. 대사 질환을 갖는 대상체는 대사 질환을 갖는 것으로 진단되었을 수 있다. 대상체는 대사 질환의 진단을 위한 진단 기준을 충족시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 비만, 2형 당뇨병(T2D), 1형 당뇨병(T1D), 전당뇨병, 과체중, 대사 증후군, 임신-관련 고혈당증(즉, 임신성 당뇨병(gestational diabetes)), 담즙울체성 간 질환, 고혈당증, 고지질혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 소모성, 악액질, 화학치료법-관련 체중 손실, 췌장 부전, 췌장염, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 지방증, 지방독성, 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방 간 (NAFL), 비-알코올성 지방간염(NASH), 지방이영양증, 지방비대증, 지방위축증, 인슐린 내성 및 고글루카곤혈증이거나 이를 포함한다(예를 들어, 이를 특징으로 함).
본 발명의 양태는 대사에 역할을 갖는 세포/조직(들)/기관(들)/기관계의 일탈적인(aberrant) 및/또는 불충분한 기능의 치료 및/또는 방지에 관한 것이다. 특히, 췌장의 세포/췌장 조직/췌장의 일탈적인 기능 및/또는 불충분한 기능의 치료 및/또는 방지가 본원에서 고려되며, 간의 세포/간 조직/간의 일탈적인 기능 및/또는 불충분한 기능의 치료 및/또는 방지 또한 그러하다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 비만이거나 이를 포함한다. 비만은 과도한 체지방을 특징으로 한다. 비만의 진단은 예를 들어, 문헌[Orzano 및 Scott, J Am Board Fam Pract (2004) 17(5): 359-369]에서 검토되며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 비만인 대상체는 30 kg/m2 초과의 체질량 지수(BMI; 사람의 체중을 그의 키의 제곱으로 나누어서 계산됨)를 갖는다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 과체중이거나 이를 포함한다. 과체중은 25 kg/m2 초과 내지 30 kg/m2(자료표 N°311", WHO (2015)) 미만의 BMI를 갖는 것을 특징으로 한다. 비만 및 과체중은 보편적으로, 과도한 음식 섭취, 신체적 활동의 결여, 및 유전적 감수성(genetic susceptibility)의 조합에 의해 야기된다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 진성 당뇨병(diabetes mellitus)(종종 단순히 '당뇨병'으로 지칭됨)이거나 이를 포함한다. 당뇨병은 연장된 기간에 걸쳐 높은 혈당(blood sugar) 수준을 특징으로 하는 대사 질환의 그룹을 지칭한다(당뇨병 자료표 N°312". WHO, (2013)). 미국 당뇨병 협회(ADA)에 따른 당뇨병의 진단은 ≥6.5%의 헤모글로빈 A1c 수준, ≥126 mg/dl(7.0 mmol/l)의 공복 혈장 글루코스(FPG: fasting plasma glucose) 수준(적어도 8시간 동안 칼로리 섭취를 하지 않는 것으로 정의됨), ≥200 mg/dl(11.1 mmol/l)의 75 g의 경구 글루코스 로드(load)의 섭취 후 2-시간 혈장 글루코스의 검출, 또는 고혈당증 또는 고혈당 위기(hyperglycemic crisis)의 전형적인 증상을 갖는 환자에서 ≥200 mg/dl(11.1 mmol/l)의 무작위 혈장 글루코스의 검출을 필요로 한다(미국 당뇨병 협회, 문헌[Diabetes Care (2010) 33(Suppl 1): S62-S69]). 당뇨병의 증상은 빈뇨, 증가된 갈증, 및 증가된 허기를 포함한다. 당뇨병의 기저 원인은 통상, 췌장에 의한 불충분한 인슐린 생성, 또는 생성되는 인슐린에 대해 적절하게 반응하지 않는 신체의 세포이다.
3개 주요 유형의 당뇨병이 존재하며, 이는 예를 들어, 당뇨병 자료표 N°312". WHO, (2013)에 기재되어 있다. 1형 당뇨병(T1D)은 췌장도(pancreatic islets)로부터 불충분한 수의 인슐린-생성 β 세포로 인해, 충분한 인슐린을 생성하는 데 있어서의 췌장의 실패로부터 비롯된다. T1D 및 이의 진단은 예를 들어, 문헌[Kahanovitz 등, Point Care. (2017) 16(1): 37-40]에 의해 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다. 2형 당뇨병(T2D)은 인슐린에 적절하게 반응하는 데 있어서의 대상체의 세포의 실패로부터 비롯되며, 또한 불충분한 인슐린 생성을 포함하도록 진행될 수 있다. T2D는 가장 보편적으로는 과도한 체중 및 불충분한 운동에 의해 야기된다. T2D는 문헌[DeFronzo, Nature Reviews Disease Primers (2015) 1:15019]에 의해 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다. 임신성 당뇨병(임신-관련 고혈당증으로도 지칭됨)은 임신부가 높은 혈당 수준을 발증할 때 발생한다. 임신성 당뇨병은 임신과 관련된 인슐린 내성의 맥락에서 임신 동안 필요한 잉여의 인슐린의 불충분한 생성에 의해 야기된다. 임신성 당뇨병은 예를 들어, 문헌[Kampmann 등, World J Diabetes. (2015) 6(8):1065-1072]에 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 인슐린 결핍이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 인슐린 내성이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 고혈당증이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 2형 당뇨병(T2D)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 1형 당뇨병(T1D)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 임신-관련 고혈당증이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 전당뇨병이거나 이를 포함한다. 전당뇨병은, 혈당 수준이 연장된 기간 동안 그러나 당뇨병의 진단에 필요한 것 미만의 수준까지 상승되는 고혈당증의 상태를 지칭한다. 전당뇨병 및 이의 진단은 예를 들어, 문헌[Bansal World J Diabetes. (2015) 6(2):296-303]에 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다. WHO는 전당뇨병을 6.1 내지 6.9 mmol/L(110 내지 125 mg/dL)의 FPG 수준, 및 75 g의 경구 글루코스 로드의 섭취 후 7.8 내지 11.0 mmol/L(140 내지 200 mg/dL)의 2 h 혈장 글루코스 수준의 결정에 의해 진단되는 즉각적인(intermediate) 고혈당증 상태로서 정의한다. ADA에 따른 전당뇨병의 진단은 75 g의 경구 글루코스 로드의 섭취 후 7.8 내지 11.0 mmol/L(140 내지 200 mg/dL)의 2 h 혈장 글루코스 수준, 100 내지 125 mg/dL의 FPG 수준, 및 5.7% 내지 6.4%의 헤모글로빈 A1c 수준을 필요로 한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 증후군이거나 이를 포함한다. 대사 증후군은 예를 들어, 문헌[Rochlani 등, Cardiovascular Disease (2017) 215-225]에 의해 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다. WHO는 대사 증후군을 비만, 고지질혈증(고중성지방혈증 또는 낮은 고밀도 지질단백질(HDL) 콜레스테롤), 고혈압, 또는 미세알부민뇨증(microalbuminuria) 중 2개에 더하여 인슐린 내성(공복 글루코스 장애(impaired fasting glucose), 글루코스 내약성 장애(impaired glucose tolerance), 또는 T2D)의 존재로서 정의한다. 대사 증후군에 대한 몇몇 다른 정의가 존재하며, 상기 Rochlani 등의 표 1에 요약되어 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 담즙정체증(cholestasis)이거나 이를 포함한다. 담즙정체증은 간으로부터 십이지장으로의 담즙(bile)의 감소된 유동을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 담즙울체성 간 질환이거나 이를 포함한다. 담즙울체성 간 질환은 담도를 통한 불충분한 담즙 합성, 분비 및/또는 유동으로부터 비롯되고, 예를 들어, 문헌[Jansen 등, Hepatology (2017) 65(2):722-738] 및 문헌[Pollock 및 Minuk, J Gastroenterol Hepatol (2017) 32(7):1303-1309]에 의해 검토되어 있으며, 이들 둘 다의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 담즙울체성 간 질환은 원발성 담즙성 담관염(PBC: primary biliary cholangitis) 및 원발성 경화성 담관염(PSC: primary sclerosing cholangitis)을 포함한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 고지질혈증이거나 이를 포함한다. 고지질혈증은 혈액 내 지질 또는 지질단백질의 상승된 수준을 지칭한다. 고지질혈증은 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증 및 조합된 고지질혈증(고중성지방혈증과 고콜레스테롤혈증의 조합)을 포함한다. 고지질혈증은 예를 들어, 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis) 및 심혈관 질환과 관련이 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 고중성지방혈증이거나 이를 포함한다. 고중성지방혈증은 예를 들어, 문헌[Berglund 등, J. Clin. Endocrinol. Metab. (2012) 97(9):2969-89]에 기재되어 있으며, ≥150 mg/dL(≥1.7 mmol/L)의 혈액 트리글리세라이드 수준에 의해 정의된다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 고콜레스테롤혈증이거나 이를 포함한다. 고콜레스테롤혈증은 예를 들어, 문헌[Bhatnagar 등, BMJ (2008) 337:a993]에 기재되어 있다. UK NHS는 ≥5 mmol/L의 혈액 총 콜레스테롤 수준 또는 ≥3 mmol/L의 혈액 저밀도 지질단백질(LDL) 수준으로서 정의한다. US NIH는 고콜레스테롤혈증을 ≥240 mg/dL의 혈액 총 콜레스테롤 수준으로서 정의한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 췌장 부전이거나 이를 포함한다. 췌장 부전은 내분비 또는 외분비일 수 있다. 내분비 췌장 부전은 인슐린, 아밀린(amylin), 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린(ghrelin) 및 췌장 폴리펩타이드(PP) 중 하나 이상의 불충분한 생성을 특징으로 할 수 있다. 외분비 췌장 부전은 이자액(pancreatic juice), 소화 효소, 트립시노겐(trypsinogen), 키모트립시노겐(chymotrypsinogen), 알레스타제(elastase), 카르복시펩티다제, 췌장 리파제, 뉴클레아제 및 아밀라제 중 하나 이상의 불충분한 생성, 및 결과적으로 음식을 적절하게 소화하는 데 있어서의 무능력을 특징으로 할 수 있다. 췌장 부전은 일반적으로, 관련 인자를 생성하는 췌장 세포, 예를 들어, 내분비 기능의 경우 췌도(islet) 세포, 및 외분비 기능의 경우 선방(acinar) 세포의 소실에 의해 야기된다. 외분비 췌장 부전은 예를 들어, 문헌[Struyvenberg 등, BMC Med (2017) 15:29]에 기재되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다. 췌장 부전의 가장 보편적인 원인은 췌장염이지만, 이는 또한 낭포성 섬유증, 수술, 셀리악 질환(celiac disease) 및 당뇨병에 의해 야기될 수 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 췌장 손상이거나 이를 포함한다. 본원에서, '손상'은 관련 기관 및/또는 기관의 조직 또는 세포에의 상해를 지칭한다. 세포/조직/기관에의 상해는 세포/조직/기관에의 공격(insult), 예를 들어, 화학적 또는 물리적 치료/경험으로 인한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 손상은 예를 들어, 약물-유도 손상의 경우에서 화학적 공격의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 손상은 물리적 공격, 예를 들어, 질환을 치료하기 위한 및/또는 이식을 위한 수술 동안 발생할 수 있는 예를 들어, 수술적 상해의 결과로서의 손상으로 인한 것일 수 있다(예를 들어, 손상은 의료원성(iatrogenic) 원인을 가질 수 있음). 일부 구현예에서, 손상은 예를 들어, 허혈증의 결과로서 저산소증의 결과일 수 있거나, 재관류로 인한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 손상은 감염, 감염에 대한 면역 반응, 암 및/또는 자가면역력으로 인해 발생할 수 있다. 상해는 가역적이거나 비가역적일 수 있다. 세포/조직/기관에의 상해는 세포/조직/기관의 구조 및/또는 기능에의 변화를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 세포/조직/기관에의 상해는 세포/조직/기관의 정상적인 기능의 상관관계 수준의 감소, 및/또는 세포/조직/기관의 약화된 기능의 상관관계의 증가를 특징으로 할 수 있다. 세포/조직/기관에의 상해는 세포 사멸, 예를 들어, 상해를 입은 기관/조직의 세포 사멸을 특징으로 할 수 있다. 세포 사멸은 세포자멸사(즉, 프로그래밍된 세포 사멸) 또는 괴사(상해의 결과로서 조기(premature) 세포 사멸)로 인한 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 췌장염이거나 이를 포함한다. 췌장염은 췌장의 염증을 특징으로 한다. 췌장염은 급성 또는 만성일 수 있다. 급성 췌장염은 예를 들어, 문헌[Shah 등, J Inflamm Res (2018) 11:77-85]에 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다. 급성 췌장염은 가장 보편적으로 담석에 의해 야기되며, 다른 것 중에서도 알코올 및 대사 질환에 의해 야기될 수도 있다. 만성 췌장염은 예를 들어, 문헌[Pham 등 Version 1. F1000Res (2018) 7: F1000 Faculty Rev-607]에 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다. 만성 췌장염은 만성 염증, 섬유증, 및 외분비 및 내분비 부족에서 나타날 수 있는 선방 세포 및 췌도 세포의 소실을 수반하는 증후군이다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 지방증이거나 이를 포함한다. 지방증은 세포/조직/기관 내에서 지질의 비정상적인 체류를 지칭한다. 지방증은 거대수포성(macrovesicular) 또는 미세수포성(microvesicular)일 수 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 비-지방 조직에서 지질 모이어티를 함유하는 분자(또는 이의 유도체)의 축적을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 지방독성이거나, 이를 포함하거나, 이를 특징으로 하거나 이와 관련이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, '지방독성'은 비-지방 조직에서 지질 모이어티를 함유하는 분자(또는 이의 유도체)의 축적으로부터 비롯되는 세포/조직의 상해, 기능이상 및/또는 사멸을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따르면, 지방독성은 간의 세포, 신장, 심장 및/또는 골격근의 지방독성이다. 일부 구현예에서, 지방독성은 간의 세포(예를 들어, 간세포)의 지방독성이다.
지방독성을 특징으로 하며/이와 관련된 대사 질환은 예를 들어, 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD) 및 NASH를 포함한다. 간세포에서의 지질의 축적 및 NAFLD, 특히 NASH와의 이의 관련성은 문헌[Friedman 등, Nat. Med. (2018) 24(7):908-922] 및 문헌[Farrell 등, Adv. Exp. Med. Biol. (2018) 1061: 19-44]에 기재되어 있다(이들 둘 다의 전체내용은 참조로서 본원에 포함됨).
NAFLD, 예컨대 NASH는 간세포에의 지방독성의 결과로서 발생하는 것으로 생각된다. 지질독성 인자는 유리(free)(비에스테르화된) 콜레스테롤, 포화된 유리 지방산(예를 들어, 팔미트산), 디아실글리세롤, 리소포스파티딜-콜린, 스핑고지질 및 세라마이드를 포함하는 것으로 생각된다. 간세포는 이러한 화학적-반응성 지질 분자를 격리시킬 수 없어서, 미토콘드리아 손상, 소포체(ER) 스트레스 및 자가포식(autophagy)을 초래한다. 지방독성은 간세포 세포자멸사, 및 또한 괴사(necrosis), 네크롭토시스(necroptosis) 및 파이롭토시스(pyroptosis)를 초래하며, 이는 내재성 면역계를 활성화시키고 전염증성 인자의 발현을 촉발한다. 전염증성 사이토카인 및 케모카인은 염증 세포, 예컨대 대식세포 및 호중구를 동원한다(recruit).
본 실시예(특히 실시예 5)에서, 본 발명자들은, 자가분비 IL-11-매개 신호화가 지질독성 신호전달의 중요한 구성요소(예를 들어, 간세포에서)이고 지질독성(및 이의 다운스트림 결과)이 IL-11-매개 신호화를 길항작용(antagonising)함으로써 저해될 수 있음을 실증한다. 이에, 본 개시내용의 양태는 IL-11 매개 신호화의 길항작용을 통해 지방독성 또는 지방독성을 특징으로 하거나 이와 관련된 질환의 치료/방지를 제공한다.
중요하게는, 본 발명자들은 본원의 실시예 5.3.5에서, IL-11 매개-신호전달이 NAFL과 관련되고 근섬유아세포로의 HSC의 NASH 업스트림에서 그리고 별도로 IL-11-매개 활성화를 유발하는 간세포에서의 지방독성의 중요한 구성요소임을 실증한다. 이에, 본 개시내용의 양태는 IL-11 매개 신호화의 길항작용을 통해 간세포에서의 지방독성의 저해를 포함하는 NAFLD(예를 들어, NASH)의 치료/방지를 제공한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD)이거나 이를 포함한다. NAFLD는 예를 들어, 문헌[Benedict 및 Zhang, World J Hepatol. (2017) 9(16): 715-732] 및 문헌[Albhaisi 등, Version 1. F1000Res. (2018) 7: F1000 Faculty Rev-720]에 검토되어 있으며, 이들 둘 다의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다. NAFLD는 간, 특히 간세포의 지방증을 특징으로 한다. NAFLD는 비-알코올성 지방 간(NAFL) 및 비-알코올성 지방간염(NASH)을 포함한다. NAFL은 간세포 손상의 증거 없이, 5% 초과의 조직실질을 수반하는 간의 지방증을 특징으로 한다. NAFL은 NASH로 진전될 수 있으며, 이는 염증 및/또는 섬유증(지방간염)과 조합된 지방증이다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 지방이영양증이거나 이를 포함한다. 지방이영양증은 예를 들어, 문헌[Fiorenza 등, Nature Reviews Endocrinology (2011) 7: 137-150]에 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 지방이영양증은 건강한 지방 조직을 생성하고/거나 유지시키는 데 있어서의 무능력을 지칭하고 지방 조직의 완전 또는 부분 소실(지방위축증)을 포괄하며, 이는 지방 조직의 병리학적 축적(지방비대증)과 함께 발생할 수 있다. 지방이영양증은 유전성 또는 후천성일 수 있지만, 유전성 지방이영양증 증후군은 드물다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 지방위축증이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 지방비대증이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 고글루카곤혈증이거나 이를 포함한다. 고글루카곤혈증은 예를 들어, 문헌[Wewer Albrechtsen 등, Biomark Med. (2016) (11):1141-1151]에 기재되어 있으며, 이의 전체내용은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 소모성이거나 이를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소모성"은 불수의적(involuntary) 체중 손실을 지칭하며, 이는 진전성(progressive) 및/또는 발생성(generative)일 수 있다. 소모성은 지방 질량의 소실과 함께 또는 없이 근육의 소실로서 정의될 수 있으며, 전형적으로 체질량(골격근 포함)의 유의하며 통상 불수의적 소실을 수반하고, 지방 조직의 소실을 포함할 수 있거나 포함할 수 없다. 일부 경우, 지방 조직 소모성은 지방이영양증 질환에서 나타난 바와 같이 단리되어 발생할 수 있다. 소모성은 감소된 음식 섭취와 비정상적인 대사의 가변적인 조합에 의해 구동되는 음성적인 단백질 및 에너지 균형을 특징으로 할 수 있다(문헌[Fearon 등 Lancet Oncol. (2011) 12(5):489-95]). 소모성은 진전성의 기능적 장애, 삶의 질 저하, 질병률 및 사망률에 대한 증가된 위험을 유발할 수 있다. 일부 경우, 소모성은 무기력(asthenia)(비정상적인 신체적 허약 또는 에너지 결여) 및/또는 빈혈(혈액 내 적혈구 또는 헤모글로빈의 결핍)을 유발한다. 일부 경우, 소모성은 종래의 영양학적 뒷받침에 의해 또는 현재까지 시험되어 온 치료적 개입에 의해 완전히 역전될 수 없다. 사망은 통상, 일단 체중 손실이 환자의 이력적 안정 체중(historic stable body weight)의 30%에 도달하였을 때 발생한다(문헌[Tisdale, Nature Reviews Cancer, 2, 862-871 (2002)]).
소모성을 특징으로 하는 질환/병태는 악액질(근육 질량의 비-연령-관련 소실), 근육감소증(근육 질량의 소실: 예를 들어, 연령-관련, 폐용(disuse), 공간 이동 또는 신경제거(denervation)), 거식증 장애(anorexic disorder)(단백질-에너지 영양실조), 근육 위축증, 지방이영양증(예를 들어, 지방 조직의 비정상적인 또는 퇴행성 병태), 지방위축증(얼굴 및 다른 조직에서 피하 지방의 연령-관련 소실) 및 근감소증(임의의 만성 병에서 근육 소모성; 문헌[Fearon 등 J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2011; 2:1-3]에 의해 제안됨)을 포함한다. 본원에서, 소모성을 특징으로 하는 질환/병태는 또한 "소모성 장애"로 지칭된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 소모성 장애는 악액질, 전악액질(pre-cachexia), 불응성(refractory cachexia) 악액질, 근육감소증, 거식증, 지방이영양증, 지방위축증 및/또는 근감소증이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다양한 양태에 따르면, 소모성 장애는 악액질, 전악액질 및/또는 불응성 악액질이다.
만성 병으로 인해 생기는 소모성 장애는 "경증 근육 소모성 질환"(허약함(frailty)과 함께 또는 없이), "중등도(moderate) 근육 소모성 질환"(허약함과 함께 또는 없이; 이따금 "전악액질"로도 알려져 있음), 또는 "중증 근육 소모성 질환"(이따금 "악액질"이라고 하며, 종종 허약함이 존재함)을 포함할 수 있다.
악액질은 기저 병(급성 또는 만성 병일 수 있음)과 관련이 있고 소모성을 특징으로 하는 복잡한 염증성/대사 증후군이다. 악액질의 주된 임상적 특질은 성인에서 체중 손실(유체 체류(retention)에 대해 교정됨(corrected)) 또는 어린이에서 성장 부전(내분비 장애 배제)이다. 거식증(anorexia), 염증, 인슐린 내성, 증가된 근육 단백질 분해 및 증가된 기초 대사량은 빈번하게는 악액질과 관련이 있다. 악액질 환자에서 낮은 지질 수준 및 지방 간은 악액질의 발병에서 간 대사에 대한 역할을 시사한다. 그러므로, 간을 표적화하고 지방 간, 간 상해 또는 간 대사를 방지하는 치료법은 악액질에 대해 직접적인 연관성을 가질 수 있다. 악액질은 기아, 근육 질량의 연령-관련 소실, 원발 우울증(primary depression), 흡수 불량(malabsorption) 및 갑상선 기능 항진증(hyperthyroidism)과는 별개이고, 증가된 질병률과 관련이 있다(문헌[Evans 등 Clin Nutr. 2008 (6):793-9]).
악액질은 이력적 안정 체중으로부터 >5%의 불수의적 체중 손실, >2%의 임의의 정도의 체중 손실과 함께 <20 kg/m2(65세 미만인 사람) 또는 <22 kg/m2(65세 이상인 사람)의 체질량 지수(BMI), 또는 >2%의 임의의 정도의 체중 손실과 함께 근육감소증과 일관되는 골격근 지수로서 정의될 수 있다. 대상체는 또한, <10% 체지방 및/또는 <35 g/l의 낮은 혈액 알부민 수준을 나타낼 수 있다. 이러한 기준은 또한, 소모성 장애를 발증시킬 '위험에 있는' 집단을 식별하는 것을 도울 수 있다(문헌[Fearon 등 Lancet Oncol. 2011; 12(5):489-95]).
악액질의 3-단계 분류가 제안되었으며, 중증도는 계속진행 체중 손실의 정도와 조합된 에너지 저장 및 신체 단백질(BMI)의 고갈 정도(degree of depletion)에 따라 분류된다.
1. 전악액질 - 환자가 <5%의 체중 손실을 갖지만, 아직까지 중증 합병증을 발증시키지 않았을 때.
2. 악액질 - 증후군이 진전되고 있으며, 체중 손실이 상기 언급된 매개변수를 초과하지만 여전히 잠재적으로는 치료될 수 있는 경우.
3. 불응성 악액질 - 질환이 치료에 더 이상 반응성이지 않을 때 또는 치료 이익이 부담(burden) 및 위험보다 크지 않을 때이다(상기 Fearon 등). 종종, 불응성 병기(stage)는 하기 기재된 기저 병의 전체 병기, 및 환자의 조건에 의해 판단된다.
대사 질환은 급성 또는 만성 질환 설정에 존재할 수 있다. 본 발명의 양태는 대사 질환과 관련된 질환/병태의 치료/방지를 제공한다. 대사 질환과 관련된 질환/병태는 대사 질환의 발생과 양의(positively) 관계에 있는 질환/병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환과 관련된 질환/병태는 대사 질환을 야기할 수 있으며/야기하며/야기하였던(즉, 유발할 수 있거나, 유발하거나 유발하였던) 것이다.
대사 질환과 관련된 질환/병태는 또한, 대사 질환에 의해 야기되고/거나 악화되는(더 불량해지고/거나, 진전되고/거나 합병증이 생기는) 질환/병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환과 관련된 질환/병태는 대사 질환의 발생과 양의 관계에 있을 수 있고, 또한 대사 질환에 의해 악화될 수 있다. "관련된" 질환/병태는 대사 질환-관련 병상(pathology)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 대사 질환, 또는 대사 질환과 관련된 질환/병태는 임의의 기관/조직, 예컨대 심장, 간, 신장, 뇌, 피부, 근육계, 위, 소장, 대장, 췌장, 입, 침샘, 인두, 식도, 담낭, 기관(trachea), 후두, 방광, 난소, 자궁, 고환, 내분비계의 샘, 예를 들어, 뇌하수체 또는 갑상선, 림프계, 예를 들어, 비장에 존재할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 대사 질환과 관련된 질환/병태는 암, 심장 질환, 신장 질환, 폐 질환, 간 질환, 만성 감염, 신경학적 퇴행성 질환, 급성 손상, 외상성 손상/외상, 수술-후 병태(post-operative condition), 또는 노화/노쇠(senescence) 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 하나 이상의 바이오마커 또는 상관관계를 사용하여 인식/식별/진단될 수 있다.
IL-11의 작용을 저해할 수 있는 제제
본 발명은 IL-11-매개 신호화의 저해를 수반한다.
본원에서, '저해'는 대조군 조건에 비교한 감소, 저하 또는 약화를 지칭한다. 예를 들어, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 IL-11의 작용의 저해는 제제의 부재 하에서의, 및/또는 적절한 제어 제제의 존재 하에서의 IL-11-매개 신호화의 규모/정도의 감소, 저하 또는 약화를 지칭한다.
본원에서 저해는 또한, 중화 또는 길항작용(antagonism)으로서 지칭될 수 있다. 다시 말해, IL-11-매개 신호화(예를 들어, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체에 의해 매개되는 상호작용, 신호화 또는 다른 활성)를 저해할 수 있는 제제는 관련 기능 또는 과정에 관하여 '중화' 또는 '길항' 제제라고 할 수 있다. 예를 들어, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 IL-11-매개 신호화를 중화시킬 수 있는 제제로서 지칭될 수 있거나, IL-11-매개 신호화의 길항제로서 지칭될 수 있다.
IL-11 신호화 경로는 IL-11 신호화의 저해를 위해 다수의 경로를 제공한다. IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 예를 들어, IL-11에 대한 수용체를 통한 신호화에 관여하거나 이에 필요한 하나 이상의 인자의 작용을 저해하는 것을 통해 그렇게 할 수 있다.
예를 들어, IL-11 신호화의 저해는 IL-11(또는 IL-11 함유 복합체, 예를 들어, IL-11과 IL-11Rα의 복합체)과 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, IL-11Rα를 포함하는 수용체 복합체, gp130 또는 IL-11Rα 및 gp130을 포함하는 수용체 복합체) 사이의 상호작용을 방해함으로써 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 예를 들어, IL-11, IL-11Rα 및 gp130 중 하나 이상의 유전자 또는 단백질 발현을 저해함으로써 달성된다.
구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 IL-11-매개 trans 신호화를 방해하는 것이 아니라 IL-11-매개 cis 신호화를 방해함으로써 달성되며, 즉, IL-11-매개 신호화의 저해는 막 결합된 IL-11Rα를 수반하는 gp130-매개 cis 복합체를 저해함으로써 달성된다. 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 IL-11-매개 cis 신호화를 방해하는 것이 아니라 IL-11-매개 trans 신호화를 방해함으로써 달성되며, 즉, IL-11-매개 신호화의 저해는 gp130-매개 trans 신호화 복합체, 예컨대 가용성 IL-11Rα에 결합된 IL-11 또는 가용성 IL-6R에 결합된 IL-6을 저해함으로써 달성된다. 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 IL-11-매개 cis 신호화 및 IL-11-매개 trans 신호화를 방해함으로써 달성된다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 제제는 IL-11-매개 cis 및/또는 trans 신호화를 저해하는 데 사용될 수 있다.
다른 예에서, IL-11 신호화의 저해는 IL-11/IL-11Rα/gp130의 다운스트림 신호화 경로를 방해함으로써 달성될 수 있다. 다시 말해, 일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해/길항작용은 IL-11/IL-11 수용체 복합체를 통한 신호화의 다운스트림 신호화 경로/과정/인자의 저해를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해/길항작용은, IL-11/IL-11 수용체 복합체에 의해 활성화되는 세포내 신호화 경로를 통한 신호화의 저해를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해/길항작용은, 인자의 발현/활성이 IL-11/IL-11 수용체 복합체를 통한 신호화의 결과로서 상향조절되는 하나 이상의 인자의 저해를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 JAK/STAT 신호화를 저해할 수 있는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, JAK/STAT 신호화를 저해할 수 있는 제제는 JAK1, JAK2, JAK3, TYK2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B 및/또는 STAT6의 작용을 저해할 수 있다. 예를 들어, 제제는 JAK/STAT 단백질의 활성화를 저해하고/거나, JAK 또는 STAT 단백질과 세포 표면 수용체, 예를 들어, IL-11Rα 또는 gp130의 상호작용을 저해하고/거나, JAK 단백질의 인산화를 저해하고/거나, JAK 단백질과 STAT 단백질 사이의 상호작용을 저해하고/거나, STAT 단백질의 인산화를 저해하고/거나, STAT 단백질의 이량체화를 저해하고/거나, 세포핵으로의 STAT 단백질의 전좌(translocation)를 저해하고/거나, DNA에의 STAT 단백질의 결합을 저해하고/거나 JAK 및/또는 STAT 단백질의 분해를 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, JAK/STAT 저해제는 룩솔리티닙(Ruxolitinib)(Jakafi/Jakavi; Incyte), 토파시티닙(Tofacitinib)(Xeljanz/Jakvinus; NIH/Pfizer), 오클라시티닙(Oclacitinib)(Apoquel), 바리시티닙(Baricitinib)(Olumiant; Incyte/Eli Lilly), 필고티닙(Filgotinib)(G-146034/GLPG-0634; Galapagos NV), 간도티닙(Gandotinib)(LY-2784544; Eli Lilly), 레스타우르티닙(Lestaurtinib)(CEP-701; Teva), 모멜로티닙(Momelotinib)(GS-0387/CYT-387; Gilead Sciences), 파크리티닙(Pacritinib)(SB1518; CTI), PF-04965842(Pfizer), 우파다시티닙(Upadacitinib)(ABT-494; AbbVie), 페피시티닙(Peficitinib)(ASP015K/JNJ-54781532; Astellas), 페드라티닙(Fedratinib)(SAR302503; Celgene), 쿠쿠르비타신 I(Cucurbitacin I)(JSI-124) 및 CHZ868로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 MAPK/ERK 신호화를 저해할 수 있는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, MAPK/ERK 신호화를 저해할 수 있는 제제는 GRB2의 작용을 저해하고/거나, RAF 키나제의 작용을 저해하고/거나, MEK 단백질의 작용을 저해하고/거나, MAP3K/MAP2K/MAPK 및/또는 Myc의 활성화를 저해하고/거나, STAT 단백질의 인산화를 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, ERK 신호화를 저해할 수 있는 제제는 ERK p42/44를 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, ERK 저해제는 SCH772984, SC1, VX-11e, DEL-22379, 소라페닙(Sorafenib)(Nexavar; Bayer/Onyx), SB590885, PLX4720, XL281, RAF265(Novartis), 엔코라페닙(encorafenib)(LGX818/Braftovi; Array BioPharma), 다브라페닙(dabrafenib)(Tafinlar; GSK), 베무라페닙(vemurafenib)(Zelboraf; Roche), 코비메티닙(cobimetinib)(Cotellic; Roche), CI-1040, PD0325901, 비니메티닙(Binimetinib)(MEK162/MEKTOVI; Array BioPharma), 셀루메티닙(selumetinib)(AZD6244; Array/AstraZeneca) 및 트라메티닙(Trametinib)(GSK1120212/Mekinist; Novartis)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 c-Jun N-말단 키나제(JNK) 신호화/활성을 저해할 수 있는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, JNK 신호화/활성을 저해할 수 있는 제제는 JNK(예를 들어, JNK1, JNK2)의 작용 및/또는 인산화를 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, JNK 저해제는 SP600125, CEP 1347, TCS JNK 6o, c-JUN 펩타이드, SU3327, AEG 3482, TCS JNK 5a, BI78D3, IQ3, SR3576, IQ1S, JIP-1(153-163) 및 CC401 디하이드로클로라이드로부터 선택된다.
본 실시예에서, 본 발명자들은 NOX4 발현 및 활성이 IL-11/IL-11Rα/gp130을 통한 신호화에 의해 상향조절됨을 실증한다. NOX4는 NADPH 옥시다제, 및 반응성 산소종(ROS)의 공급원이다. Nox4의 발현은 간세포-특이적 Il11 발현을 갖는 유전자이식 마우스에서 상향조절되고, IL11로 자극된 1차 인간 간세포는 NOX4 발현을 상향조절한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 NOX4 발현(유전자 또는 단백질 발현) 또는 기능을 저해할 수 있는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 NOX4 발현/기능의 IL-11-매개 상향조절을 저해할 수 있는 제제를 이용한다. NOX4 발현 또는 기능을 저해할 수 있는 제제는 본원에서 NOX4 저해제로 지칭될 수 있다. 예를 들어, NOX4 저해제는 NOX4의 발현(예를 들어, 유전자 및/또는 단백질 발현)을 감소시키고/거나, NOX4를 인코딩하는 RNA의 수준을 감소시키고/거나, NOX4 단백질의 수준을 감소시키고/거나, NOX4 활성의 수준을 감소(예를 들어, NOX4-매개 NADPH 옥시다제 활성 및/또는 NOX4-매개 ROS 생성을 감소)시킬 수 있다.
NOX4 저해제는 NOX4-결합 분자 및 NOX4 발현을 감소시킬 수 있는 분자를 포함한다. NOX4-결합 저해제는 NOX4에 대한 상호작용 파트너의 펩타이드/핵산 앱타머, 항체(및 항체 단편) 및 단편을 포함하며, 이는 NOX4 기능의 길항제, 및 NOX4의 저분자 저해제로서 거동한다. NOX4 발현을 감소시킬 수 있는 분자는 NOX4에 대한 안티센스 RNA(예를 들어, siRNA, shRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, NOX4 저해제는 문헌[Altenhofer 등, Antioxid Redox Signal. (2015) 23(5): 406-427] 또는 문헌[Augsburder 등, Redox Biol. (2019) 26: 101272]에 기재된 NOX4 저해제, 예컨대 GKT137831로부터 선택된다.
결합제
일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 IL-11에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 결합할 수 있다. 이러한 제제의 결합은, IL-11에 대한 수용체에 결합하는 IL-11의 능력을 감소/방지하여 다운스트림 신호화를 저해함으로써 IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있다. 이러한 제제의 결합은, IL-11에 대한 수용체, 예를 들어, IL-11Rα 및/또는 gp130에 결합하는 IL-11의 능력을 감소/방지하여 다운스트림 신호화를 저해함으로써 IL-11 매개 cis 및/또는 trans-신호화를 저해할 수 있다. 제제는 trans-신호화 복합체, 예컨대 IL-11 및 가용성 IL-11Rα에 결합하고 gp130-매개 신호화를 저해할 수 있다.
IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 임의의 종류일 수 있으나, 일부 구현예에서, 제제는 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 또는 저분자일 수 있다. 제제는 단리된 또는 정제된 형태로 제공될 수 있거나, 약학적 조성물 또는 약제로서 제형화될 수 있다.
항체 및 항원-결합 단편
일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 폴리펩타이드, 예를 들어, 유인 수용체 분자이다. 일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 앱타머일 수 있다.
일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편이 관련된 표적 분자에의 결합을 나타내는 한 이들을 포괄한다.
단일클론 항체 기술과 관련된 오늘날의 기법의 측면에서, 항체는 대부분의 항원에 대해 제조될 수 있다. 항원-결합 부분은 항체의 파트(part)(예를 들어, Fab 단편) 또는 합성 항체 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv 단편[ScFv])일 수 있다. 선택된 항원에 대한 단일클론 항체는 기지의 기법, 예를 들어, 문헌["Monoclonal Antibodies: A manual of techniques ", H Zola (CRC Press, 1988)] 및 문헌["Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications ", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)]에 개시된 것에 의해 제조될 수 있다. 키메라 항체는 문헌[Neuberger 등 (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)]에 의해 논의되어 있다. 단일클론 항체(mAb)는 특히 본 발명의 방법에 유용하고, 항원 상의 단일 에피토프를 특이적으로 표적화하는 항체의 균질한 집단이다.
다중클론 항체 또한 본 발명의 방법에 유용하다. 단일특이적 다중클론 항체가 바람직하다. 적합한 다중클론 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
항체의 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 및 Fab2 단편이 또한, 사용/제공될 수 있으며, 유전적으로 조작된 항체 및 항체 단편도 그럴 수 있다. 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인은, 초기(early) 프로테아제 분해 실험에 의해 최초로 인식된 사실인 항원 인식에 관여한다. 추가의 확인은 설치류 항체의 "인간화"에 의해 밝혀졌다. 설치류 기원의 가변 도메인은, 생성된 항체가 설치류 모(parented) 항체의 항원 특이성을 보유하도록 인간 기원의 불변 도메인에 융합될 수 있다(문헌[Morrison 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855]).
본 개시내용에 따른 항체 및 항원-결합 단편은, 관련 표적 분자(즉, IL-11/IL-11 함유 복합체/IL-11에 대한 수용체)에 결합할 수 있는 항체의 상보성-결정 영역(CDR; complementarity-determining region)을 포함한다.
IL-11에 결합할 수 있는 항체는 예를 들어, 문헌[Bockhorn 등. Nat. Commun. (2013) 4(0):1393]에서 사용된 것과 같은 단일클론 마우스 항-인간 IL-11 항체 클론 #22626; 카탈로그 번호 MAB218(R&D Systems, MN, USA), 클론 6D9A(Abbiotec), 클론 KT8(Abbiotec), 클론 M3103F11(BioLegend), 클론 1F1(Abnova Corporation), 클론 3C6(Abnova Corporation), 클론 GF1(LifeSpan Biosciences), 클론 13455(Source BioScience), 11h3/19.6.1(문헌[Hermann 등, Arthritis Rheum. (1998) 41(8):1388-97]), AB-218-NA(R&D Systems), X203(문헌[Ng 등, Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237]로서도 공개되어 있음; doi: https://doi.org/10.1101/336537) 및 US 2009/0202533 A1, WO 99/59608 A2, WO 2018/109174 A2 및 WO 2019/238882 A1에서 공개된 항-IL-11 항체를 포함한다.
특히, 항-IL-11 항체 클론 22626(MAB218로도 알려져 있음)은 예를 들어, 문헌[Schaefer 등, Nature (2017) 552(7683):110-115]에서 IL-11 매개 신호화의 길항제인 것으로 나타났다. 단일클론 항체 11h3/19.6.1은 문헌[Hermann 등, Arthritis Rheum. (1998) 41(8):1388-97]에서 중화성(neutralising) 항-IL-11 IgG1인 것으로 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[McCoy 등, BMC Cancer (2013) 13:16]에서 사용된 R&D Systems으로부터의 AB-218-NA는 중화성 항-IL-11 항체의 또 다른 예이다. WO 2018/109174 A2 및 WO 2019/238882 A1은 IL-11 매개 신호화의 더욱 추가의 예시적인 항-IL-11 항체 길항제를 개시한다. 문헌[Ng, 등, "IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis." bioRxiv 336537]; doi: https://doi.org/10.1101/336537 및 WO 2019/238882 A1에서 개시된 X203(Enx203으로도 지칭됨)은 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11 항체 길항제이고, WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:92(본 개시내용의 SEQ ID NO:22)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:94(본 개시내용의 SEQ ID NO:23)에 따른 VL 영역을 포함한다. WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:117(본 개시내용의 SEQ ID NO:30)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:122(본 개시내용의 SEQ ID NO:31)에 따른 VL 영역을 포함하는 hEnx203을 포함하여 X203의 인간화 버전은 WO 2019/238882 A1에 기재되어 있다. Enx108A는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11 항체 길항제의 추가 예이고, WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:8(본 개시내용의 SEQ ID NO:26)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:20(본 개시내용의 SEQ ID NO:27)에 따른 VL 영역을 포함한다.
IL-11Rα에 결합할 수 있는 항체는 예를 들어, 단일클론 항체 클론 025(Sino Biological), 클론 EPR5446(Abcam), 클론 473143(R & D Systems), US 2014/0219919 A1에 기재된 클론 8E2, 8D10 및 8E4 및 8E2의 친화도-성숙 변이체, Blanc 등(문헌[J. Immunol Methods. 2000 Jul 31;241(1-2);43-59])에 기재된 단일클론 항체, X209(문헌[Widjaja 등, Gastroenterology (2019) 157(3):777-792], 문헌[Widjaja, 등, "IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH." bioRxiv 470062]; doi: https://doi.org/10.1101/470062로서 공개되기도 함), WO 2014121325 A1 및 US 2013/0302277 A1에 개시된 항체, 및 US 2009/0202533 A1, WO 99/59608 A2, WO 2018/109170 A2 및 WO 2019/238884 A1에 개시된 항-IL-11Rα 항체를 포함한다.
특히, 항-IL-11Rα 항체 클론 473143(MAB1977로도 알려져 있음)은 예를 들어, 문헌[Schaefer 등, Nature (2017) 552(7683):110-115]에서 IL-11 매개 신호화의 길항제인 것으로 나타났다. US 2014/0219919 A1은 항-인간 IL-11Rα 항체 클론 8E2, 8D10 및 8E4에 대한 서열을 제공하며, IL-11 매개 신호화를 길항시키는 이의 능력을 개시한다 - 예를 들어, US 2014/0219919 A1의 [0489] 내지 [0490]을 참조한다. 더욱이, US 2014/0219919 A1은 클론 8E2의 추가 62개 친화도-성숙 변이체에 대한 서열 정보를 제공하며, 이 중에서 61개는 IL-11 매개 신호화를 길항시키는 것으로 개시된다 - US 2014/0219919 A1의 표 3을 참조한다. WO 2018/109170 A2 및 WO 2019/238884 A1은 IL-11 매개 신호화의 더욱 추가의 예시적인 항-IL-11Rα 항체 길항제를 개시한다. 문헌[Widjaja, 등, "IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH." bioRxiv 470062]; doi: https://doi.org/10.1101/470062 및 WO 2019/238884 A1에 개시된 X209(Enx209로도 지칭됨)는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11Rα 항체 길항제이며, WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:7(본 개시내용의 SEQ ID NO:24)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:14(본 개시내용의 SEQ ID NO:25)에 따른 VL 영역을 포함한다. WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:11(본 개시내용의 SEQ ID NO:32)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:17(본 개시내용의 SEQ ID NO:33)에 따른 VL 영역을 포함하는 hEnx209를 포함하여 X209의 인간화 버전은 WO 2019/238884 A1에 기재되어 있다.
당업자는 주어진 종/대상체에서의 치료적 용도에 적합한 항체를 생성하기 위한 기법을 잘 알고 있다. 예를 들어, 인간에서의 치료적 용도에 적합한 항체를 생성하는 절차는 문헌[Park and Smolen Advances in Protein Chemistry (2001) 56: 369-421(그 전체가 참조로서 본원에 포함됨)에 기재되어 있다.
주어진 표적 단백질(예를 들어, IL-11 또는 IL-11Rα)에 대한 항체는 모델 종(예를 들어, 설치류, 토끼목(lagomorph))에서 생성되고, 후속적으로 주어진 종/대상체에서의 치료적 용도를 위한 이의 적합성을 향상시키기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 모델 종의 면역화에 의해 생성된 단일클론 항체의 하나 이상의 아미노산은 인간 생식계열 면역글로불린 서열과 더욱 유사한 항체 서열에 도달하기 위해 치환될 수 있다(따라서 항체로 치료되는 인간 대상체에서 항-이종발생성(xenogenic) 항체 면역 반응에 대한 잠재력을 감소시킴). 항체 가변 도메인에서의 변형은 항체 파라토프(paratope)를 보존하기 위해 프레임워크(framework) 영역에 초점을 맞출 수 있다. 항체 인간화는 항체 기술 분야에서 일상적인 관례의 문제이고, 예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Frontiers in Bioscience (2008) 13:1619-1633], 문헌[Safdari 등, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (2013) 29(2): 175-186] 및 문헌[Lo 등, Microbiology Spectrum (2014) 2(1)]에 검토되어 있으며, 이는 모두 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 인간화에 대한 요건은, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 유전자이식 모델 종에서 주어진 표적 단백질(예를 들어, IL-11 또는 IL-11Rα)에 대한 항체를 생성함으로써 피해질 수 있으며, 따라서, 이러한 동물에서 생성된 항체는 완전(fully)-인간이다(예를 들어, 문헌[Bruggemann 등, Arch Immunol Ther Exp (Warsz) (2015) 63(2):101-108]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함됨).
파지 디스플레이 기법이 또한, 주어진 표적 단백질(예를 들어, IL-11 또는 IL-11Rα)에 대한 항체의 식별에 이용될 수 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 인간 표적 단백질에 대한 완전 인간 항체의 식별을 위한 파지 디스플레이의 사용은 예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1105-1116] 및 문헌[Chan 등, International Immunology (2014) 26(12): 649-657]에 검토되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
항체/단편은 IL-11의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 길항제 항체/단편일 수 있다. 항체/단편은 IL-11의 생물학적 효과, 예를 들어, IL-11 수용체를 통해 생산성 신호화를 자극시키는 이의 능력을 중화시키는 중화 항체일 수 있다. 중화성 활성은 T11 마우스 형질세포종(plasmacytoma) 세포주에서 IL-11 유도 증식을 중화시키는 능력에 의해 측정될 수 있다(문헌[Nordan, R. P. 등. (1987) J. Immunol. 139:813]).
IL-11-결합 또는 IL-11Rα-결합 항체는 IL-11-매개 신호화를 길항시키는 능력에 대해 예를 들어, US 2014/0219919 A1 또는 Blanc 등(문헌[J. Immunol Methods. 2000 Jul 31;241(1-2);43-59])에 기재된 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 간략하게는, IL-11-결합 및 IL-11Rα-결합 항체는, 적절한 종으로부터의 IL-11에 의한 자극에 반응하여, 적절한 종으로부터의 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 Ba/F3 세포의 증식을 저해하는 능력에 대해 시험관내에서 평가될 수 있다. 대안적으로, IL-11-결합 및 IL-11Rα-결합 항체는 TGFβ1에 의한 섬유아세포의 자극 후 섬유아세포로부터-근섬유아세포로의 이행을 저해하는 능력에 대해 αSMA 발현의 평가에 의해 시험관내에서 분석될 수 있다(예를 들어, WO 2018/109174 A2(실시예 6) 및 WO 2018/109170 A2(실시예 6), 문헌[Ng 등, Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237] 및 문헌[Widjaja 등, Gastroenterology (2019) 157(3):777-792]에 기재된 바와 같음).
항체는 일반적으로 6개의 CDR; 경쇄 가변 영역(VL) 내의 3개: LC-CDR1, LC-CDR2, LC-CDR3, 및 중쇄 가변 영역(VH) 내의 3개: HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함한다. 6개의 CDR은 함께, 항체의 파라토프를 정의하며, 이러한 파라토프는 표적 분자에 결합하는 항체의 파트이다. VH 영역 및 VL 영역은 각각의 CDR의 면(side)에 프레임워크 영역(FR)을 포함하며, 이는 CDR에 대한 스캐폴드(scaffold)를 제공한다. N-말단으로부터 C-말단까지, VH 영역은 하기 구조를 포함하고: N 말단-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C 말단; VL 영역은 하기 구조를 포함한다: N 말단-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C 말단.
항체 CDR 및 FR을 정의하기 위한 몇몇 상이한 관례, 예컨대 문헌[Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)], 문헌[Chothia 등, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 기재된 것, 및 문헌[Retter 등, Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suppl 1): D671-D674]에 기재된 바와 같은 VBASE2가 존재한다. 본원에 기재된 항체의 VH 영역 및 VL 영역의 CDR 및 FR은 카바트(Kabat) 시스템에 따라 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-11에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, Enx108A, Enx203 또는 hEnx203)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-11Rα에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, Enx209 또는 hEnx209)로부터 유래된다.
본 개시내용에 따른 항체 및 항원-결합 단편은 바람직하게는 IL-11-매개 신호화를 저해한다. 이러한 항체/항원-결합 단편은 IL-11-매개 신호화의 길항제인 것으로 기재될 수 있고/거나 IL-11-매개 신호화를 중화시키는 능력을 갖고 있는 것으로 기재될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 IL-11에 결합하는 항체의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 본원에 기재된 IL-11-결합 항체(예를 들어, Enx108A, Enx203 또는 hEnx203)의 CDR의 CDR, 또는 이로부터 유래된 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VH 영역:
(1)
SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2, 또는 HC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VL 영역:
(2)
SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 LC-CDR1, LC-CDR2, 또는 LC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VH 영역:
(3)
SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2, 또는 HC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VL 영역:
(4)
SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 LC-CDR1, LC-CDR2, 또는 LC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (1)에 따른 CDR을 혼입하는 VH 영역, 및 (2)에 따른 CDR을 혼입하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (3)에 따른 CDR을 혼입하는 VH 영역, 및 (4)에 따른 CDR을 혼입하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 IL-11에 결합하는 항체의 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 본원에 기재된 IL-11-결합 항체(예를 들어, Enx108A, Enx203 또는 hEnx203)의 VH 영역 및 VL 영역의 VH 영역 및 VL 영역, 또는 이로부터 유래된 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 IL-11Rα에 결합하는 항체의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 본원에 기재된 IL-11Rα-결합 항체(예를 들어, Enx209 또는 hEnx209)의 CDR의 CDR, 또는 이로부터 유래된 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VH 영역:
(5)
SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2, 또는 HC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VL 영역:
(6)
SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 LC-CDR1, LC-CDR2, 또는 LC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (5)에 따른 CDR을 혼입하는 VH 영역, 및 (6)에 따른 CDR을 혼입하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 IL-11Rα에 결합하는 항체의 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 본원에 기재된 IL-11Rα-결합 항체(예를 들어, Enx209 또는 hEnx209)의 VH 영역 및 VL 영역의 VH 영역 및 VL 영역, 또는 이로부터 유래된 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.
기준 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 CDR 서열, VH 영역 서열 또는 VL 영역 서열)의 하나 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되는 본 발명에 따른 구현예에서, 치환은 예를 들어, 하기 표에 따른 보존적 치환일 수 있다. 일부 구현예에서, 중간 열(column)의 동일한 블록(block) 내의 아미노산이 치환된다. 일부 구현예에서, 최우측 열의 동일한 선(line)의 아미노산이 치환된다:
Figure pct00001
일부 구현예에서, 치환(들)은 기능적으로 보존적일 수 있다. 다시 말해, 일부 구현예에서, 치환은 동등한 비치환된 분자에 비해 치환을 포함하는 항체/단편의 하나 이상의 기능적 특성(예를 들어, 표적 결합)에 영향을 미치지 않을 수 있다(또는 실질적으로 영향을 미치지 않을 수 있음).
일부 구현예에서, 기준 VH 영역 또는 VL 영역 서열에 비해 치환(들)은 VH 영역 또는 VL 영역 서열의 특정 영역 또는 영역들에 집중(focus)될 수 있다. 예를 들어, 기준 VH 영역 또는 VL 영역 서열로부터의 변동은 하나 이상의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)에 집중될 수 있다.
본 개시내용에 따른 항체 및 항원-결합 단편은 관련 표적 분자에 결합할 수 있는 단일클론 항체(mAb)의 서열을 사용하여 설계되고 제조될 수 있다. 항체의 항원-결합 영역, 예컨대 단일 사슬 가변 단편(scFv), Fab 및 Fab2 단편이 또한 사용/제공될 수 있다. '항원-결합 영역' 또는 '항원 결합 단편'은, 주어진 항체가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항체의 임의의 단편이다.
일부 구현예에서, 항체/단편은 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항체의 VL 및 VH 영역을 포함한다. 항체의 항원-결합 영역의 VL 및 VH 영역은 함께 Fv 영역을 이룬다. 일부 구현예에서, 항체/단편은, IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항체의 Fv 영역을 포함하거나 이로 구성된다. Fv 영역은 단일 사슬로서 표현될 수 있으며, 여기서, VH 및 VL 영역은 예를 들어, 가요성(flexible) 올리고펩타이드에 의해 공유 연결된다. 이에, 항체/단편은, IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항체의 VL 및 VH 영역을 포함하는 scFv를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체의 항원-결합 영역의 VL과 경쇄 불변(CL) 영역, 및 VH 영역과 중쇄 불변 1(CH1) 영역은 함께 Fab 영역을 이룬다. 일부 구현예에서, 항체/단편은 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항체의 Fab 영역을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 항체/단편은 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 전항체(whole antibody)를 포함하거나 이로 구성된다. "전항체"는 면역글로불린(Ig)의 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭한다. 상이한 종류의 면역글로불린 및 이의 구조는 예를 들어, 문헌[Schroeder 및 Cavacini J Allergy Clin Immunol. (2010) 125(202): S41-S52]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 유형 G의 면역글로불린(즉, IgG)은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 약 150 kDa 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 중쇄는 VH, 뒤이어 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 유사하게 경쇄는 VL, 뒤이어 CL을 포함한다. 중쇄에 따라, 면역글로불린은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예를 들어, IgA1, IgA2), IgD, IgE, 또는 IgM으로서 분류될 수 있다. 경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체/항원-결합 단편은 면역글로불린 중쇄 불변 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예를 들어, IgA1, IgA2), IgD, IgE 또는 IgM, 예를 들어, 인간 IgG(예를 들어, hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4), hIgA(예를 들어, hIgA1, hIgA2), hIgD, hIgE 또는 hIgM의 중쇄 불변 서열이거나 이로부터 유래된다. 일부 면역글로불린에서, 중쇄 불변 서열은 인간 IgG1 알로타입(allotype)(예를 들어, G1m1, G1m2, G1m3 또는 G1m17)의 중쇄 불변 서열이거나 이로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 G 1 불변(IGHG1; UniProt: P01857-1, v1)의 불변 영역 서열이거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 치환 K214R, D356E 및 L358M(즉, G1m3 알로타입)을 포함하는 인간 면역글로불린 G 1 불변(IGHG1; UniProt: P01857-1, v1)의 불변 영역 서열이거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:52의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 G 4 불변(IGHG4; UniProt: P01861, v1)의 불변 영역 서열이거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 치환 S241P 및/또는 L248E를 포함하는 인간 면역글로불린 G 4 불변(IGHG4; UniProt: P01861, v1)의 불변 영역 서열이거나 이로부터 유래된다. S241P 돌연변이는 힌지 안정화(hinge stabilising)인 한편, L248E 돌연변이는 IgG4의 이미 낮은 ADCC 이펙터(effector) 기능을 추가로 감소시킨다(문헌[Davies 및 Sutton, Immunol Rev. 2015 Nov; 268(1):139-159]; 문헌[Angal 등 Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8]). 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:53의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체/항원-결합 단편은 면역글로불린 경쇄 불변 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 경쇄 불변 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 카파(κ) 또는 람다(λ) 경쇄, 예를 들어, 인간 면역글로불린 카파 불변(IGKC; Cκ; UniProt: P01834-1, v2), 또는 인간 면역글로불린 람다 불변(IGLC; Cλ), 예를 들어, IGLC1(UniProt: P0CG04-1, v1), IGLC2(UniProt: P0DOY2-1, v1), IGLC3(UniProt: P0DOY3-1, v1), IGLC6(UniProt: P0CF74-1, v1) 또는 IGLC7(UniProt: A0M8Q6-1, v3)이거나 이로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 면역글로불린 경쇄 불변 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 카파 불변(IGKC; Cκ; UniProt: P01834-1, v2; SEQ ID NO:90)이거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 람다 불변(IGLC; Cλ), 예를 들어, IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 또는 IGLC7이다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:55의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은, (i) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드, 및 (ii) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (i) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드, 및 (ii) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (i) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드, 및 (ii) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드를 포함한다.
Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있어서, 다량의 상기 단편의 손쉬운 생성을 가능하게 한다.
전항체, 및 F(ab')2 단편은 "2가(bivalent)"이다. "2가"란, 본 발명자들은, 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2개의 항원 조합 부위를 가짐을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 단지 1개의 항원 조합 부위를 갖는 1가(monovalent)이다. IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 합성 항체 또한, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 파지 디스플레이 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
항체는 친화도 성숙 과정에 의해 생성될 수 있으며, 이 과정에서, 비변형된 모(parent) 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도의 향상을 갖는 변형된 항체가 발생된다. 친화도-성숙 항체는 당업계에 알려진 절차, 예를 들어, 문헌[Marks 등, Rio/Technology 10:779-783 (1992)]; 문헌[Barbas 등, Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; 문헌[Schier 등, Gene 169:147-155 (1995)]; 문헌[Yelton 등, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; 문헌[Jackson 등, J. Immunol. 154(7):331 0-15 9 (1995)]; 및 문헌[Hawkins 등, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 의해 생성될 수 있다.
항체/단편은 예를 들어, 2개의 상이한 항체의 2개의 상이한 단편으로 이루어진 이중-특이적 항체를 포함하여, 이중-특이적 항체는 2개 유형의 항원에 결합한다. 이중특이적 항체는 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 항체/단편을 포함한다. 항체는 임의의 요망되는 항원일 수 있는 제2 항원에 대해 친화도를 갖는 상이한 단편을 함유할 수 있다. 이중-특이적 항체의 제조 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Mueller, D 등, (2010 Biodrugs 24 (2): 89-98)], 문헌[Wozniak-Knopp G 등, (2010 Protein Eng Des 23 (4): 289-297)], 및 문헌[Baeuerle, PA 등, (2009 Cancer Res 69 (12): 4941-4944)]를 참조한다. 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원-결합 단편은 임의의 적합한 포맷, 예컨대 문헌[Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-197]에 기재된 포맷으로 제공될 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원-결합 단편은 이중특이적 항체 접합체(conjugate)(예를 들어, IgG2, F(ab')2 또는 CovX-Body), 이중특이적 IgG 또는 IgG-유사 분자(예를 들어, IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 2 인(in) 1-IgG, mAb2, 또는 탠덤ab 공통 LC), 비대칭 이중특이적 IgG 또는 IgG-유사 분자(예를 들어, kih IgG, kih IgG 공통 LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, 전하쌍(charge pair) 또는 SEED-바디), 작은 이중특이적 항체 분자(예를 들어, 디아바디(Db: Diabody), dsDb, DART, scDb, tandAbs, 탠덤 scFv(taFv), 탠덤 dAb/VHH, 트리플 바디(triple body), 트리플 헤드(triple head), Fab-scFv, 또는 F(ab')2-scFv2), 이중특이적 Fc 및 CH3 융합 단백질(예를 들어, taFv-Fc, Di-디아바디, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, 또는 scFv-kih-CH3), 또는 이중특이적 융합 단백질(예를 들어, scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-독소, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-사이토카인2)일 수 있다. 특히, 문헌[Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19]의 도 2를 참조한다.
이중특이적 항체를 생성하는 방법은 항체 또는 항체 단편을 예를 들어, 문헌[Segal 및 Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기재된 바와 같이 화학적으로, 예를 들어, 환원적 디설파이드 또는 비-환원적 티오에테르 결합으로 가교시키는 단계를 포함하며, 이 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)는 예를 들어, 힌지 영역 SH- 기를 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교시켜, 디설파이드-연결 이중특이적 F(ab)2 헤테로이량체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
이중특이적 항체를 생성하는 다른 방법은 항체-생성 하이브리도마를 예를 들어, 문헌[D. M. 및 Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기재된 바와 같이 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시켜, 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 쿼드로마(quadroma) 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
이중특이적 항체 및 이중특이적 항원-결합 단편은 또한, 예를 들어, 문헌[Antibody Engineering: Methhods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz)], 또는 문헌[French, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339]에 기재된 바와 같이 예를 들어, 항원 결합 분자에 대한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물로부터의 발현에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다.
예를 들어, 2개의 항원 결합 도메인에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(즉, IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 또 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 인코딩하고, 항원 결합 도메인 사이의 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기법에 의해 제조될 수 있다. 이후, 재조합 이중특이적 항체는 적합한 숙주 세포(예를 들어, 포유류 숙주 세포)에서 작제물의 발현(예를 들어, 시험관내에서)에 의해 생성될 수 있으며, 그 후에 발현된 재조합 이중특이적 항체는 선택적으로 정제될 수 있다.
유인 수용체
IL-11 또는 IL-11 함유 복합체에 결합할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 기초 제제는 IL-11 수용체, 예를 들어, IL-11 수용체의 IL-11 결합 단편에 기초할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11Rα 사슬의 IL-11-결합 단편을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 가용성이고/거나 막관통 도메인(들) 중 하나 이상, 또는 모두를 배제할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 gp130의 IL-11-결합 단편을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 가용성이고/거나 막관통 도메인(들) 중 하나 이상, 또는 모두를 배제할 수 있다. 이러한 분자는 유인 수용체로서 기재될 수 있다. 이러한 제제의 결합은, IL-11에 대한 수용체, 예를 들어, IL-11Rα 또는 gp130에 결합하는 IL-11의 능력을 감소/방지하여 다운스트림 신호화를 저해함으로써 IL-11 매개 cis 및/또는 trans-신호화를 저해할 수 있다.
Curtis 등(문헌[Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12])은, 가용성 뮤린 IL-11 수용체 알파 사슬(sIL-11R)이 막관통 IL-11R 및 gp130을 발현하는 세포 상에서 시험되었을 때 IL-11의 활성을 길항시킬 수 있었음을 보고한다. 이들은, sIL-11R에 의한 관찰된 IL-11 길항작용이 막관통 IL-11R을 이미 발현하고 있는 세포 상에서 제한된 수의 gp130 분자에 의존함을 제안하였다.
신호 전달 및 치료적 개입의 저해에 대한 기초(basis)로서 가용성 유인 수용체의 용도 또한, 다른 신호화 분자:수용체 쌍, 예를 들어, VEGF 및 VEGF 수용체에 대해 보고되었다(문헌[De-Chao Yu 등, Molecular Therapy (2012); 20 5, 938-947]; 문헌[Konner and Dupont Clin Colorectal Cancer 2004 Oct;4 Suppl 2:S81-5]).
이와 같이, 일부 구현예에서, 결합제는 유인 수용체, 예를 들어, 가용성 IL-11에 대한 수용체 및/또는 IL-11 함유 복합체일 수 있다. 유인 수용체에 의해 제공되는 IL-11 및/또는 IL-11 함유 복합체에 대한 경쟁은 IL-11 길항제 작용을 유발하는 것으로 보고되었다(상기 Curtis 등). 유인 IL-11 수용체는 또한, WO 2017/103108 A1 및 WO 2018/109168 A1에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
유인 IL-11 수용체는 바람직하게는 IL-11 및/또는 IL-11 함유 복합체에 결합하여, 이러한 종(species)이 gp130, IL-11Rα 및/또는 gp130:IL-11Rα 수용체에의 결합에 이용 불가능하게 만든다. 이와 같이, 이는, 많은 것이 에타네르셉트(etanercept)가 TNFα에 대한 유인 수용체로서 작용하는 것과 동일한 방식으로, IL-11 및 IL-11 함유 복합체에 대한 '유인' 수용체로서 작용한다. IL-11-매개 신호화는 유인 수용체의 부재 하에서의 신호화 수준과 비교하여 감소된다.
유인 IL-11 수용체는 바람직하게는 하나 이상의 사이토카인 결합 모듈(CBM)을 통해 IL-11에 결합한다. CBM은 IL-11에 대한 천연 발생 수용체 분자의 CBM이거나, 이로부터 유래되거나 이와 상동성이다. 예를 들어, 유인 IL-11 수용체는, gp130 및/또는 IL-11Rα의 CBM으로부터의 것이거나, 이로부터 유래되거나 이와 상동성인 하나 이상의 CBM을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 유인 IL-11 수용체는 gp130의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 유인 IL-11 수용체는 IL-11Rα의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본원에서, 주어진 펩타이드/폴리펩타이드의 기준 영역 또는 서열에 '상응하는' 아미노산 서열은 기준 영역/서열의 아미노산 서열의 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 하나의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 유인 수용체는 IL-11에 예를 들어, 적어도 100 μM 이하, 선택적으로 10 μM 이하, 1 μM 이하, 100 nM 이하, 또는 약 1 내지 100 nM 중 하나의 결합 친화도로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 유인 수용체는 IL-11 결합 도메인의 모두 또는 파트를 포함할 수 있으며, 선택적으로 막관통 도메인의 모두 또는 파트가 결여될 수 있다. 유인 수용체는 선택적으로, 면역글로불린 불변 영역, 예를 들어, IgG Fc 영역에 융합될 수 있다.
저해제
본 발명은 IL-11, IL-11 함유 복합체, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체 중 하나 이상에 결합하고 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 저해제 분자의 용도를 고려한다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11에 기초한 펩타이드-기초 또는 폴리펩타이드-기초 결합제, 예를 들어, IL-11의 돌연변이체, 변이체 또는 결합 단편이다. 적합한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 기초 제제는, 신호 전달의 개시를 유발하지 않거나 차선의 신호화를 생성하는 방식으로 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 결합할 수 있다. 이러한 종류의 IL-11 돌연변이체는 내인성 IL-11의 경쟁적 저해제로서 작용할 수 있다.
예를 들어, W147A는, 아미노산 147이 트립토판으로부터 알라닌으로 돌연변이화된 IL-11 길항제이며, IL-11의 소위 '부위 III'을 파괴한다. 이러한 돌연변이체는 IL-11Rα에 결합할 수 있으나, gp130 호모이량체의 연계(engagement)는 실패하여, IL-11 신호화의 효율적인 차단을 초래한다(문헌[Underhill-Day 등, 2003; Endocrinology 2003 Aug;144(8):3406-14]). Lee 등(문헌[Am J respire Cell Mol Biol. 2008 Dec; 39(6):739-746])은 또한, IL-11Rα에의 IL-11의 결합을 특이적으로 저해할 수 있는 IL-11 길항제 돌연변이체("뮤테인")의 발생을 보고한다. IL-11 뮤테인은 또한 WO 2009/052588 A1에 기재되어 있다.
Menkhorst 등(문헌[Biology of Reproduction May 1, 2009 vol.80 no.5 920-927])은 PEG화된(PEGylated) IL-11 길항제, PEGIL11A(CSL Limited, Parkvill, Victoria, Australia)를 기재하며, 이는 암컷 마우스에서 IL-11 작용을 저해하는 데 효과적이다.
문헌[Pasqualini 등. Cancer (2015) 121(14):2411-2421]은 IL-11Rα에 결합할 수 있는 리간드-지향성(directed), 펩티도미메틱(peptidomimetic) 약물, 골 전이-표적화 펩티도미메틱-11(BMTP-11)을 기재한다.
일부 구현예에서, IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 결합제는 IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체 중 하나의 저분자 저해제의 형태로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체의 저분자 저해제, 예를 들어, 문헌[Lay 등, Int. J. Oncol. (2012); 41(2): 759-764]에 기재된 IL-11 저해제의 형태로 제공될 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
앱타머
일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 결합할 수 있는 제제는 앱타머이다. 핵산/펩타이드 리간드라고도 하는 앱타머는, 표적 분자에 높은 특이성 및 높은 친화도로 결합하는 능력을 특징으로 하는 핵산 또는 펩타이드 분자이다. 현재까지 식별된 대부분의 모든 앱타머는 비-천연 발생 분자이다.
주어진 표적(예를 들어, IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체)에 대한 앱타머는 지수 농화에 의한 리간드의 체계적 진화(SELEXTM)의 방법에 의해, 또는 SOMAmer(느린 오프-레이트 변형된 앱타머(slow off-rate modified aptamer))를 개발함으로써 식별 및/또는 생성될 수 있다(문헌[Gold L 등. (2010) PLoS ONE 5(12):e15004]). 앱타머 및 SELEX는 문헌[Tuerk and Gold, Science (1990) 249(4968):505-10] 및 WO 91/19813호에 기재되어 있다. SELEX 및 SOMAmer 기술을 적용하는 것은 예를 들어, 앱타머의 화학적 다양성을 확장(expand)시키기 위해 아미노산 측쇄를 모방하는 작용기를 첨가하는 단계를 포함한다. 그 결과, 표적에 대한 고 친화도 앱타머가 농화 및 식별될 수 있다.
앱타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 앱타머는, 예를 들어, 당(sugar) 및/또는 포스페이트 및/또는 염기가 화학적으로 변형된, 화학적으로 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 앱타머의 안정성을 향상시키거나 앱타머를 분해에 대해 더욱 내성이 되게 만들 수 있고, 리보스의 2' 위치에서 변형을 포함할 수 있다.
앱타머는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 앱타머는 예를 들어, 고체 지지체 상에서 화학적으로 합성될 수 있다. 고체상 합성은 포스포라미다이트(phosphoramidite) 화학을 사용할 수 있다. 간략하게는, 고체 지지된(supported) 뉴클레오타이드는 탈트리틸화(detritylated)된 다음, 적합하게 활성화된 뉴클레오사이드 포스포라미다이트와 커플링되어, 포스파이트 트리에스테르 연결을 형성한다. 그 후에, 캡핑(capping)이 발생하며, 뒤이어 산화제, 전형적으로 요오드에 의한 포스파이트 트리에스테르의 산화가 발생할 수 있다. 그 후에, 주기(cycle)가 반복되어, 앱타머를 조립할 수 있다(예를 들어, 문헌[Sinha, N. D.; Biernat, J.; McManus, J.; Koster, H. Nucleic Acids Res. 1984, 12, 4539]; 및 문헌[Beaucage, S. L.; Lyer, R. P. (1992). Tetrahedron 48 (12): 2223] 참조).
적합한 핵산 앱타머는 선택적으로, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 뉴클레오타이드 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다. 적합한 핵산 앱타머는 선택적으로, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 뉴클레오타이드 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 적합한 핵산 앱타머는 선택적으로, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 뉴클레오타이드 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
앱타머는 특이적인 표적 분자에 결합하도록 선택되거나 조작된 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 앱타머 및 이의 발생 방법과 식별 방법은 문헌[Reverdatto 등, Curr Top Med Chem. (2015) 15(12):1082-101]에 검토되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 펩타이드 앱타머는 선택적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다. 펩타이드 앱타머는 선택적으로, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 적합한 펩타이드 앱타머는 선택적으로, 2-30, 2-25, 2-20, 5-30, 5-25 또는 5-20개 아미노산 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
앱타머는 nM 또는 pM 범위, 예를 들어, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM 중 하나 미만의 KD를 가질 수 있다.
IL-11 결합제의 특성
본 발명에 따른 IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 하기 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
· IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에의 특이적인 결합;
· 10 μM 이하, 바람직하게는 ≤ 5 μM, ≤ 1 μM, ≤500 nM, ≤ 100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM 또는 ≤100 pM의 KD로, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에의 결합;
· IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용의 저해;
· IL-11과 gp130 사이의 상호작용의 저해;
· IL-11과 IL-11Rα:gp130 수용체 복합체 사이의 상호작용의 저해;
· IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용의 저해.
이들 특성은 적합한 검정에서 관련 제제의 분석에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 검정은 제제와 적합한 대조군 제제의 성능 비교를 수반할 수 있다. 당업자는 주어진 검정에 대한 적절한 제어 조건을 식별할 수 있다.
예를 들어, IL-11/IL-11 함유 복합체/IL-11에 대한 수용체에 결합하는 시험 항체/항원-결합 단편의 능력의 분석에 적합한 음성 대조군은 비-표적 단백질에 대한 항체/항원-결합 단편(즉, IL-11/IL-11 함유 복합체/IL-11에 대한 수용체에 특이적이지 않은 항체/항원-결합 단편)일 수 있다. 적합한 양성 대조군은 기지의 입증된(예를 들어, 상업적으로 입수 가능한) IL-11-결합 또는 IL-11 수용체-결합 항체일 수 있다. 대조군은 분석중인 추정상(putative) IL-11/IL-11 함유 복합체/IL-11 수용체-결합 항체/항원-결합 단편과 동일한 이소타입(isotype)일 수 있고, 예를 들어, 동일한 불변 영역을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 특이적으로 결합할 수 있다. 주어진 표적 분자에 특이적으로 결합하는 제제는 바람직하게는, 이것이 다른 비-표적 분자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 및/또는 더 큰 기간으로 표적에 결합한다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-6 사이토카인 패밀리의 하나 이상의 다른 구성원(예를 들어, IL-6, 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM), 카디오트로핀-1(CT-1), 섬모 신경친화성 인자(CNTF) 및 카디오트로핀-유사 사이토카인(CLC))에의 결합 친화도보다 더 큰 친화도로 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-6 수용체 패밀리의 하나 이상의 다른 구성원에의 결합 친화도보다 더 큰 친화도로 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-6Rα, 백혈병 저해 인자 수용체(LIFR), 온코스타틴 M 수용체(OSMR), 섬모 신경친화성 인자 수용체 알파(CNTFRα) 및 사이토카인 수용체-유사 인자 1(CRLF1) 중 하나 이상에의 결합 친화도보다 더 큰 친화도로 IL-11Rα에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 비-표적에의 결합제의 결합 규모는 예를 들어, ELISA, SPR, 생물층 간섭계(BLI: Bio-Layer Interferometry), 마이크로스케일 열영동(MST: MicroScale Thermophoresis)에 의해, 또는 방사성면역검정(RIA: radioimmunoassay)에 의해 측정된 바와 같이 표적에의 제제의 결합의 약 10% 미만이다. 대안적으로, 결합 특이성은 결합 친화도의 측면에서 반영될 수 있으며, 여기서, 결합제는 또 다른 비-표적 분자에 대한 KD보다 적어도 0.1 자릿수(order of magnitude)(즉, 0.1 x 10n, 여기서, n은 자릿수를 나타내는 정수임) 더 큰 KD로 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합한다. 이는 선택적으로 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 또는 2.0 중 하나일 수 있다.
주어진 결합제의 표적에 대한 이러한 결합제의 결합 친화도는 종종 이의 해리 상수(KD; dissociation constant)의 측면에서 기재된다. 결합 친화도는 당업계에 알려진 방법에 의해, 예컨대 ELISA, 표면 플라즈몬 공명(SPR; 예를 들어, 문헌[Hearty 등, Methods Mol Biol (2012) 907:411-442]; 또는 문헌[Rich 등, Anal Biochem. 2008 Feb 1; 373(1):112-20] 참조), 생물층 간섭계(예를 들어, 문헌[Lad 등, (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507]; 또는 문헌[Concepcion 등, Comb Chem High Throughput Screen. 2009 Sep; 12(8):791-800] 참조), 마이크로스케일 열영동(MST) 분석(예를 들어, 문헌[Jerabek-Willemsen 등, Assay Drug Dev Technol. 2011 Aug; 9(4): 342-353] 참조)에 의해, 또는 방사성표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 50 μM 이하, 바람직하게는 ≤ 10 μM, ≤5 μM, ≤4 μM, ≤3 μM, ≤2 μM, ≤1 μM, ≤500 nM, ≤100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM, ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM, ≤500 pM, ≤400 pM, ≤300 pM, ≤200 pM, 또는 ≤100 pM 중 하나의 KD로 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 EC50 = 10,000 ng/ml 이하, 바람직하게는 ≤5,000 ng/ml, ≤1000 ng/ml, ≤900 ng/ml, ≤800 ng/ml, ≤700 ng/ml, ≤600 ng/ml, ≤500 ng/ml, ≤400 ng/ml, ≤300 ng/ml, ≤200 ng/ml, ≤100 ng/ml, ≤90 ng/ml, ≤80 ng/ml, ≤70 ng/ml, ≤60 ng/ml, ≤50 ng/ml, ≤40 ng/ml, ≤30 ng/ml, ≤20 ng/ml, ≤15 ng/ml, ≤10 ng/ml, ≤7.5 ng/ml, ≤5 ng/ml, ≤2.5 ng/ml, 또는 ≤1 ng/ml 중 하나의 결합 친화도(예를 들어, ELISA에 의해 결정된 바와 같음)로 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합한다. 이러한 ELISA는 예를 들어, 문헌[Antibody Engineering, vol. 1 (2nd Edn), Springer Protocols, Springer (2010), Part V, pp657-665]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체에 대한 수용체, 예를 들어, gp130 또는 IL-11Rα에의 결합에 중요한 영역 내의 IL-11 또는 IL-11-함유 복합체에 결합하여, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체와 IL-11에 대한 수용체 사이의 상호작용, 및/또는 수용체를 통한 신호화를 저해한다. 일부 구현예에서, 제제는, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체에의 결합에 중요한 영역 내의 IL-11에 대한 수용체에 결합하여, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체와 IL-11에 대한 수용체 사이의 상호작용, 및/또는 수용체를 통한 신호화를 저해한다.
2개 단백질 사이의 상호작용을 저해하는, 주어진 결합제(예를 들어, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제)의 능력은 예를 들어, 결합제의 존재 하에, 또는 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다와 결합제의 인큐베이션 후에 상호작용의 분석에 의해 결정될 수 있다. 주어진 결합제가 2개 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 저해할 수 있는지의 여부를 결정하기에 적합한 검정의 일례는 경쟁 ELISA이다.
주어진 상호작용(예를 들어, IL-11과 IL-11Rα 사이, 또는 IL-11과 gp130 사이, 또는 IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이, 또는 IL-11:IL-11Rα와 gp130 사이)을 저해할 수 있는 결합제는, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) 상호작용의 수준과 비교하여, 결합제의 존재 하에 - 또는 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다와 결합제의 인큐베이션 후에 - 상호작용 파트너 사이의 상호작용의 수준의 감소/저하를 관찰함으로써 식별된다. 적합한 분석은 시험관내에서, 예를 들어, 재조합 상호작용 파트너를 사용하거나 상호작용 파트너를 발현하는 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 상호작용 파트너를 발현하는 세포는 내인성적으로 그렇게 수행할 수 있거나, 세포 내로 도입된 핵산으로부터 그렇게 수행할 수 있다. 이러한 검정의 목적을 위해, 상호작용 파트너 및/또는 결합제 중 하나 또는 둘 다는 상호작용의 수준을 검출하고/거나 측정하는 목적을 위해 검출 가능한 엔터티(entity)로 표지되거나 이와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 제제는 방사성 원자 또는 착색된 분자 또는 형광 분자 또는 임의의 다른 방식으로 쉽게 검출될 수 있는 분자로 표지될 수 있다. 적합한 검출 가능한 분자는 형광 단백질, 루시퍼라제, 효소 기질, 및 방사성표지를 포함한다. 결합제는 검출 가능한 표지로 직접 표지될 수 있거나 결합제는 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 결합제는 비표지되고, 그 자체가 표지되는 또 다른 결합제에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 제2 결합제는 여기에 비오틴이 결합되어 있을 수 있고, 표지된 스트렙타비딘이 비오틴에 결합하는 것은 제2 결합제를 간접적으로 표지하는 데 사용될 수 있다.
2개 결합 파트너 사이의 상호작용을 저해하는 결합제의 능력은 또한, 이러한 상호작용의 다운스트림 기능적 결과, 예를 들어, IL-11-매개 신호화의 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이 또는 IL-11:IL-11Rα와 gp130 사이의 상호작용의 다운스트림 기능적 결과는 예를 들어, IL-11에 의해 매개되는 과정, 또는 예를 들어, 콜라겐 또는 IL-11의 유전자/단백질 발현을 포함할 수 있다.
IL-11 또는 IL-11 함유 복합체와 IL-11에 대한 수용체 사이의 상호작용의 저해는 3H-티미딘 혼입 및/또는 Ba/F3 세포 증식 검정, 예컨대 예를 들어, 문헌[Curtis 등. Blood, 1997, 90(11)] 및 문헌[Karpovich 등. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재된 것을 사용하여 분석될 수 있다. Ba/F3 세포는 IL-11Rα 및 gp130을 공동-발현한다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 gp130 사이의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 gp130 사이의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
IL-11 또는 IL-11 수용체의 발현을 감소시킬 수 있는 제제
본 발명의 양태에서, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 중 하나 이상의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
발현은 유전자 또는 단백질 발현일 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 잘 알려질 당업계의 방법에 의해 결정될 수 있다. 발현은 대상체의 세포/조직/기관/기관계에 의한 것일 수 있다.
적합한 제제는 임의의 종류일 수 있으나, 일부 구현예에서, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 중 하나 이상의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제는 저분자 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 중 하나 이상의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제는 예를 들어, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 인코딩하는 유전자의 전사를 저해하는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 인코딩하는 RNA의 전사-후 가공을 저해하는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 인코딩하는 RNA의 안정성을 감소시키는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 인코딩하는 RNA의 분해를 촉진하는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 폴리펩타이드의 번역-후 가공을 저해하는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 폴리펩타이드의 안정성을 감소시키는 것 또는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 폴리펩타이드의 분해를 촉진하는 것을 통해 그렇게 수행할 수 있다.
문헌[Taki 등. Clin Exp Immunol (1998) Apr; 112(1): 133-138]은 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone) 또는 인터페론-감마(IFNγ; interferon-gamma)에 의한 치료 시 류마티스성 활막(rheumatoid synovial) 세포 내 IL의 발현의 감소를 보고하였다.
본 발명은 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현을 방지/감소시키기 위한 안티센스 핵산의 용도를 고려한다. 일부 구현예에서, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제는 RNA 간섭(RNAi)에 의해 감소된 발현을 야기할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 저해성(inhibitory) 핵산, 예컨대 shRNA 또는 siRNA를 포함하지만 이로 제한되지 않는 안티센스 또는 작은 간섭 RNA일 수 있다.
일부 구현예에서, 저해성 핵산은 벡터에서 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제제는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 중 하나 이상에 대한 shRNA를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 분자, 특히 RNA는 유전자 발현을 조절하기 위해 이용될 수 있다. 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의한 mRNA의 표적화된 분해, 전사 후 유전자 침묵(PTG), 마이크로-RNA(miRNA)에 의한 mRNA의 발달적으로 조절된 서열-특이적 번역 억제, 및 표적화된 전사적 유전자 침묵을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 상보적 서열 결합에 의해 표적 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, mRNA를 표적화하고 이에 결합하는, 바람직하게는 단일-가닥의, 올리고뉴클레오타이드이다. 표적 올리고뉴클레오타이드가 mRNA인 경우, mRNA에의 안티센스의 결합은 mRNA의 번역 및 유전자 생성물의 발현을 차단한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 센스 게놈 핵산에 결합하고 표적 뉴클레오타이드 서열의 전사를 저해하도록 설계될 수 있다.
IL-11, IL-11Rα 및 gp130에 대한 기지의 핵산 서열(예를 들어, 수탁 번호: BC012506.1 GI:15341754(인간 IL-11), BC134354.1 GI:126632002(마우스 IL-11), AF347935.1 GI:13549072(래트 IL-11), NM_001142784.2 GI:391353394(인간 IL-11Rα), NM_001163401.1 GI:254281268(마우스 IL-11Rα), NM_139116.1 GI:20806172(래트 IL-11Rα), NM_001190981.1 GI:300244534(인간 gp130), NM_010560.3 GI:225007624(마우스 gp130), NM_001008725.3 GI:300244570(래트 gp130) 하에 GenBank로부터 입수 가능한 기지의 mRNA 서열)의 측면에서, 올리고뉴클레오타이드는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현을 억제시키거나 침묵화시키도록 설계될 수 있다.
이러한 올리고뉴클레오타이드는 임의의 길이일 수 있으나, 바람직하게는 짧으며, 예를 들어, 100개 미만의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 10-40개 뉴클레오타이드, 또는 20-50개 뉴클레오타이드일 수 있고, 표적 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 mRNA 내 상응하는 길이의 뉴클레오타이드 서열과 완전-상보성 또는 근(near)-상보성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 상보적 영역은 임의의 길이일 수 있으나, 바람직하게는 적어도 5개, 선택적으로 50개 이하 뉴클레오타이드, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오타이드 중 하나의 길이이다.
IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현의 억제는 바람직하게는, 세포/조직/기관/기관계/대상체에 의해 발현되는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 양의 저하를 초래할 것이다. 예를 들어, 주어진 세포에서, 적합한 핵산의 투여에 의한 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 억제는, 비처리된 세포에 비해 해당 세포에 의해 발현되는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 양의 저하를 초래할 것이다. 바람직한 억제 정도(degree)는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90% 중 하나이다. 90% 내지 100%의 억제 수준이 발현 또는 기능의 '침묵화'인 것으로 여겨진다.
특정 염색체 좌위에서 이질염색질 복합체의 표적화 및 후성 유전자(epigenetic gene) 침묵화에 있어서 RNAi 머시너리 및 작은 RNA의 역할이 실증되었다. RNA 간섭(RNAi)으로도 알려져 있는 이중-가닥 RNA(dsRNA)-의존적 전사 후 침묵은, dsRNA 복합체가 단기간 내에 침묵화를 위한 상동성의 특정 유전자를 표적화할 수 있는 현상이다. 이는 서열 동일성을 갖는 mRNA의 분해를 촉진하기 위한 신호로서 작용한다. 20-nt siRNA는 일반적으로, 유전자-특이적 침묵화를 유도하기에 충분히 길지만, 숙주 반응을 피하기에는 충분히 짧다. 표적화된 유전자 생성물의 발현의 저하는 siRNA의 몇몇 분자에 의해 유도되는 90% 침묵화로 광범위할 수 있다. RNAi 기초 치료제는 많은 적응증(indication)을 위한 I, II 및 III상 임상 시험으로 진행되었다(문헌[Nature 2009 Jan 22; 457(7228):426-433]).
당업계에서, 이러한 RNA 서열은 이의 기원에 따라 "짧은 또는 작은 간섭 RNA"(siRNA) 또는 "microRNA"(miRNA)라고 한다. 두 유형의 서열 모두, 상보적 RNA에 결합하고 mRNA 제거(RNAi)를 촉발하거나 단백질로의 mRNA 번역을 저지함으로써 유전자 발현을 하향조절하는 데 사용될 수 있다. siRNA는 길이가 긴 이중 가닥 RNA의 가공에 의해 유래되고, 자연 상에서 발견될 때 전형적으로 외인성 기원이다. 마이크로-간섭 RNA(miRNA)는 짧은 헤어핀의 가공에 의해 유래되는 내인성적으로 인코딩된 작은 비-코딩 RNA이다. siRNA와 miRNA 둘 다, RNA 절단 없이 부분적으로 상보적인(complimentary) 표적 서열을 보유하는 mRNA의 번역을 저해하고, 완전히 상보적인 서열을 보유하는 mRNA를 분해할 수 있다.
siRNA 리간드는 전형적으로 이중 가닥이고, 표적 유전자의 기능의 RNA 매개 하향조절의 효과성을 최적화하기 위해, siRNA의 길이는, siRNA에 의한 mRNA 표적의 인식을 매개하는 RISC 복합체에 의한 siRNA의 올바른 인식을 보장하도록 선택되고, 따라서 siRNA는 숙주 반응을 감소시키기에 충분히 짧은 것이 바람직하다.
miRNA 리간드는 전형적으로 단일 가닥이고, 부분적으로 상보적이어서 리간드가 헤어핀을 형성하는 것을 가능하게 하는 영역을 갖는다. miRNA는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 RNA 유전자이다. miRNA 유전자를 코딩하는 DNA 서열은 miRNA보다 더 길다. 이러한 DNA 서열은 miRNA 서열 및 근사 역보체(approximate reverse complement)를 포함한다. 이러한 DNA 서열이 단일 가닥 DNA 분자로 전사될 때, miRNA 서열 및 이의 역보체는 염기쌍을 이루어, 부분적으로 이중 가닥인 RNA 분절(segment)을 형성한다. 마이크로RNA 서열의 설계는 문헌[John 등, PLoS Biology, 11(2), 1862-1879, 2004]에 논의되어 있다.
전형적으로, siRNA 또는 miRNA의 효과를 모방하고자 하는 RNA 리간드는 10 내지 40개 리보뉴클레오타이드(또는 이의 합성 유사체), 더욱 바람직하게는 17 내지 30개 리보뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 19 내지 25개 리보뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21 내지 23개 리보뉴클레오타이드를 갖는다. 이중 가닥 siRNA를 이용하는 본 발명의 일부 구현예에서, 분자는 예를 들어, 1 또는 2개의 (리보)뉴클레오타이드의 대칭적인 3' 오버행, 전형적으로 dTdT 3' 오버행의 UU를 가질 수 있다. 본원에 제공된 개시내용에 기초하여, 당업자는 예를 들어, Ambion siRNA 파인더(finder)와 같은 자원(resource)을 사용하여 적합한 siRNA 및 miRNA 서열을 쉽게 설계할 수 있다. siRNA 및 miRNA 서열은 합성적으로 생성되고 외인성적으로 첨가되어 유전자 하향조절을 야기하거나, 발현 시스템(예를 들어, 벡터)을 사용하여 생성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 합성적으로 합성된다.
더 긴 이중 가닥 RNA는 세포에서 가공되어 siRNA를 생성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Myers (2003) Nature Biotechnology 21:324-328] 참조). 더 긴 dsRNA 분자는 예를 들어, 1 또는 2개의 (리보)뉴클레오타이드의 대칭적인 3' 또는 5' 오버행을 가질 수 있거나, 평활 단부(blunt end)를 가질 수 있다. 더 긴 dsRNA 분자는 25개 뉴클레오타이드 이상일 수 있다. 바람직하게는, 더 긴 dsRNA 분자는 25 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 더욱 바람직하게는, 더 긴 dsRNA 분자는 25 내지 27개 뉴클레오타이드 길이이다. 가장 바람직하게는, 더 긴 dsRNA 분자는 27개 뉴클레오타이드 길이이다. 30개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 dsRNA는 벡터 pDECAP를 사용하여 발현될 수 있다(문헌[Shinagawa 등, Genes and Dev., 17, 1340-5, 2003]).
또 다른 대안은 세포에서 짧은 헤어핀 RNA 분자(shRNA)의 발현이다. shRNA는 합성 siRNA보다 더 안정하다. shRNA는 작은 루프 서열에 의해 분리된 짧은 인버트 반복부(inverted repeat)로 구성된다. 하나의 인버트 반복부는 유전자 표적에 상보적이다. 세포에서, shRNA는 다이서(DICER)에 의해 siRNA로 가공되며, 이는 표적 유전자 mRNA를 분해하고 발현을 억제시킨다. 바람직한 구현예에서, shRNA는 벡터로부터 전사에 의해 내인성적으로(세포 내에서) 생성된다. shRNA는 세포 내에서, RNA 폴리머라제 III 프로모터, 예컨대 인간 H1 또는 7SK 프로모터 또는 RNA 폴리머라제 II 프로모터의 제어 하에 shRNA 서열을 인코딩하는 벡터로 세포를 형질주입함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, shRNA는 벡터로부터 전사에 의해 외인성적으로(시험관내에서) 합성될 수 있다. 그 후에, shRNA는 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 바람직하게는, shRNA 분자는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 부분 서열을 포함한다. 바람직하게는, shRNA 서열은 40 내지 100개 염기 길이, 더욱 바람직하게는 40 내지 70개 염기 길이이다. 헤어핀의 스템(stem)은 바람직하게는 19 내지 30개 염기쌍 길이이다. 스템은 G-U 쌍형성(pairing)을 함유하여, 헤어핀 구조를 안정화시킬 수 있다.
siRNA 분자, 더 긴 dsRNA 분자 또는 miRNA 분자는 바람직하게는 벡터 내에 함유된 핵산 서열의 전사에 의해 재조합적으로 만들어질 수 있다. 바람직하게는, siRNA 분자, 더 긴 dsRNA 분자 또는 miRNA 분자는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 부분 서열을 포함한다.
일 구현예에서, siRNA, 더 긴 dsRNA 또는 miRNA는 벡터로부터 전사에 의해 내인성적으로(세포 내에서) 생성된다. 벡터는 당업계에 알려진 임의의 방식으로 세포 내로 도입될 수 있다. 선택적으로, RNA 서열의 발현은 조직 특이적(예를 들어, 심장, 간, 또는 신장 특이적) 프로모터를 사용하여 조절될 수 있다. 추가 구현예에서, siRNA, 더 긴 dsRNA 또는 miRNA는 벡터로부터 전사에 의해 외인성적으로(시험관내에서) 생성된다.
적합한 벡터는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 억제를 할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 제제를 발현하도록 배치된 올리고뉴클레오타이드 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있다. 치료적 올리고뉴클레오타이드는 바이러스 벡터의 게놈에 혼입되고, 이의 발현을 구동하는 조절 서열, 예를 들어, 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된"은, 선택된 뉴클레오타이드 서열 및 조절 뉴클레오타이드 서열이 공유적으로 연결되어 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 뉴클레오타이드 서열의 발현을 일어나게 하는 상황을 포함할 수 있다. 그러므로, 조절 서열은, 선택된 뉴클레오타이드 서열 중 파트 또는 모두를 형성하는 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절 서열이 수행할 수 있다면, 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다.
프로모터-발현된 siRNA 서열을 인코딩하는 바이러스 벡터는 당업계에 알려져 있고, 치료적 올리고뉴클레오타이드의 장기간 발현의 이익을 갖는다. 예는 렌티바이러스(문헌[Nature 2009 Jan 22; 457(7228):426-433]), 아데노바이러스(문헌[Shen 등, FEBS Lett 2003 Mar 27;539(1-3)111-4]) 및 레트로바이러스(문헌[Barton and Medzhitov PNAS November 12, 2002 vol.99, no.23 14943-14945])를 포함한다.
다른 구현예에서, 벡터는, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 발현의 억제가 필요한 부위로의 치료적 올리고뉴클레오타이드의 전달을 돕도록 배치될 수 있다. 이러한 벡터는 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드를 양으로 하전된 벡터(예를 들어, 양이온성 세포 투과성(penetrating) 펩타이드, 양이온성 중합체 및 덴드리머, 및 양이온성 지질)와 복합체화시키는 것; 올리고뉴클레오타이드를 저분자(예를 들어, 콜레스테롤, 담즙산, 및 지질), 중합체, 항체, 및 RNA와 접합시키는 것; 또는 올리고뉴클레오타이드를 나노미립자 제형에서 캡슐화하는 것(문헌[Wang 등, AAPS J. 2010 Dec; 12(4): 492-503)을 수반한다.
일 구현예에서, 벡터는 핵산 서열을 센스 배향과 안티센스 배향 둘 다에서 포함할 수 있어서, RNA로서 발현될 때, 센스 구획 및 안티센스 구획은 회합되어 이중 가닥 RNA를 형성할 것이다.
대안적으로, siRNA 분자는 당업계에 알려진 표준 고체상 또는 용액상 합성 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 뉴클레오타이드 사이의 연결은 포스포디에스테르 결합일 수 있거나, 대안적으로, 예를 들어, 화학식 P(O)S, (티오에이트); P(S)S, (디티오에이트); P(O)NR'2; P(O)R'; P(O)OR6; CO; 또는 CONR'2의 연결기는 -O- 또는 -S-를 통해 인접 뉴클레오타이드에 접합되며, 여기서, R은 H(또는 염) 또는 알킬(1-12C)이고 R6은 알킬(1-9C)이다.
천연 발생 염기 이외의 변형된 뉴클레오타이드 염기가 사용될 수 있으며, 이를 함유하는 siRNA 분자에 유리한 특성을 부여할 수 있다.
예를 들어, 변형된 염기는 siRNA 분자의 안정성을 증가시켜, 침묵화에 필요한 양을 감소시킬 수 있다. 변형된 염기의 제공 또한, 비변형된 siRNA보다 더욱 안정하거나 덜 안정한 siRNA 분자를 제공할 수 있다.
용어 '변형된 뉴클레오타이드 염기'는 공유적으로 변형된 염기 및/또는 당을 갖는 뉴클레오타이드를 포괄한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드는, 3' 위치에서 하이드록실기 이외의 그리고 5' 위치에서 포스페이트기 이외의 저분자량 유기 기에 공유적으로 부착된 당을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 그러므로, 변형된 뉴클레오타이드는 또한, 2' 치환된 당, 예컨대 2'-O-메틸-; 2'-O-알킬; 2'-O-알릴; 2'-S-알킬; 2'-S-알릴; 2'-플루오로-; 2'-할로 또는 아지도-리보스, 카르복실릭 당 유사체, a-아노머(anomeric) 당; 에피머(epimeric) 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스(lyxose), 피라노스 당, 푸라노스 당, 및 세도헵툴로스를 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드는 당업계에 알려져 있으며, 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 및 피리미딘, 및 다른 헤테로사이클을 포함한다. 이들 부류의 피리미딘 및 퓨린은 당업계에 알려져 있으며, 슈도이소시토신, N4,N4-에타노시토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데닌, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5 플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸 우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소펜틸-아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸 우라실, 5-메톡시 아미노 메틸-2-티오우라실, -D-만노실쿼오신(queosine), 5-메톡시카르보닐메틸우라실, 5메톡시우라실, 2 메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 슈도우라실, 2-티오시토신, 5-메틸-2 티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실 5-옥시아세트산, 쿼오신, 2-티오시토신, 5-프로필우라실, 5-프로필시토신, 5-에틸우라실, 5-에틸시토신, 5-부틸우라실, 5-펜틸우라실, 5-펜틸시토신, 및 2,6,디아미노퓨린, 메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸시토신을 포함한다.
씨. 엘레간스(C. elegans), 초파리, 식물 및 포유류에서의 유전자를 침묵화시키기 위한 RNAi의 용도에 관한 방법은 당업계에 알려져 있다(문헌[Fire A, 등, 1998 Nature 391:806-811]; 문헌[Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)]; 문헌[Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)]; 문헌[Hammond, S. M., 등, Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)]; 문헌[Tuschl, T. Chem. Biochem. 2, 239-245 (2001)]; 문헌[Hamilton, A. 등, Science 286, 950-952 (1999)]; 문헌[Hammond, S. M., 등, Nature 404, 293-296 (2000)]; 문헌[Zamore, P. D., 등, Cell 101, 25-33 (2000)]; 문헌[Bernstein, E., 등, Nature 409, 363-366 (2001)]; 문헌[Elbashir, S. M., 등, Genes Dev. 15, 188-200 (2001)]; WO0129058; WO9932619, 및 문헌[Elbashir S M, 등, 2001 Nature 411:494-498]).
이에, 본 발명은, 적합하게는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 발현하는 포유류, 예를 들어, 인간 세포 내로 도입되거나 그 내에서 발현될 때, RNAi에 의해 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 발현을 억제시킬 수 있는 핵산을 제공한다.
IL-11, IL-11Rα 및 gp130에 대한 핵산 서열(예를 들어, 수탁 번호: BC012506.1 GI:15341754(인간 IL-11), BC134354.1 GI:126632002(마우스 IL-11), AF347935.1 GI:13549072(래트 IL-11), NM_001142784.2 GI:391353394(인간 IL-11Rα), NM_001163401.1 GI:254281268(마우스 IL-11Rα), NM_139116.1 GI:20806172(래트 IL-11Rα), NM_001190981.1 GI:300244534(인간 gp130), NM_010560.3 GI:225007624(마우스 gp130), NM_001008725.3 GI:300244570(래트 gp130) 하에 GenBank로부터 입수 가능한 기지의 mRNA 서열) 올리고뉴클레오타이드는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현을 억제시키거나 침묵화시키도록 설계될 수 있다.
핵산은 예를 들어, GenBank 수탁 번호 NM_000641.3 GI:391353405(IL-11), NM_001142784.2 GI:391353394(IL-11Rα), NM_001190981.1 GI:300244534(gp130) 하에 정의된 바와 같은 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 mRNA, 또는 상기 mRNA에 대한 상보적 서열의 일부와 실질적인 서열 동일성을 가질 수 있다.
핵산은 이중 가닥 siRNA일 수 있다(당업자가 이해할 바와 같이 그리고 하기에서 추가로 설명되는 바와 같이, siRNA 분자는 짧은 3' DNA 서열을 또한 포함할 수 있음).
대안적으로, 핵산은 DNA(통상 이중 가닥 DNA)일 수 있으며, 이는 포유류 세포에서 전사될 때, 스페이서(spacer)를 통해 결합된 2개의 상보적 부분을 갖는 RNA를 산출하여, RNA는 상보적 부분이 서로 혼성화될 때 헤어핀의 형태를 취한다. 포유류 세포에서, 헤어핀 구조는 효소 다이서에 의해 분자로부터 절단되어, 2개의 별개의 그러나 혼성화된 RNA 분자를 산출할 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 핵산은 일반적으로, SEQ ID NO 4 내지 7(IL-11) 중 하나의 서열 또는 SEQ ID NO 8 내지 11(IL-11Rα) 중 하나로 표적화된다.
mRNA 전사체(transcript)의 단지 단일 가닥(즉, 비(non) 자가-혼성화된) 영역은 RNAi에 적합한 표적인 것으로 예상된다. 따라서, SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나로 표시된 서열에 대해 IL-11 또는 IL-11Rα mRNA 전사체에서 매우 근접한 다른 서열 또한, RNAi에 대한 적합한 표적일 수 있는 것으로 제안된다. 이러한 표적 서열은 바람직하게는 17-23개 뉴클레오타이드 길이이고, 바람직하게는 SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나와 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 모든 19개 뉴클레오타이드만큼(SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나의 어느 단부에서) 중첩된다.
이에, 본 발명은, 적합하게는 IL-11 또는 IL-11Rα를 발현하는 포유류 세포 내로 도입되거나 그 내에서 발현될 때, RNAi에 의해 IL-11 또는 IL-11Rα 발현을 억제시킬 수 있는 핵산을 제공하며, 여기서 핵산은 일반적으로 SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나의 서열로 표적화된다.
"일반적으로 표적화된"이란, 핵산이 SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11과 중첩되는 서열을 표적화할 수 있다. 특히, 핵산은, SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나보다 약간 더 길거나 더 짧지만(바람직하게는 17 내지 23개 뉴클레오타이드 길이), SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나와 동일한 인간 IL-11 또는 IL-11Rα의 mRNA 내의 서열을 표적화할 수 있다.
본 발명의 핵산과 표적 서열 사이의 완벽한 동일성/상보성은 바람직하긴 하지만, 필수적이지는 않은 것으로 예상된다. 이에, 본 발명의 핵산은 IL-11 또는 IL-11Rα의 mRNA와 비교하여 단일 미스매치를 포함할 수 있다. 그러나, 심지어 단일 미스매치의 존재는 감소된 효율을 유발하는 경향이 있어서, 미스매치의 부재가 바람직한 것으로 예상된다. 존재할 때, 3' 오버행은 미스매치의 수를 고려하여 배제될 수 있다.
용어 "상보성"은 천연 발생 리보- 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 핵산 사이의 종래의 염기쌍 형성으로 제한되지 않을 뿐만 아니라 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 mRNA와 핵산 사이의 염기쌍 형성을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산(본원에서 이중 가닥 siRNA로 지칭됨)은 SEQ ID NO 12 내지 15로 표시된 이중 가닥 RNA 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 핵산(본원에서 이중 가닥 siRNA로 지칭됨)은 SEQ ID NO 16 내지 19로 표시된 이중 가닥 RNA 서열을 포함한다.
그러나, 또한, IL-11 또는 IL-11Rα mRNA의 동일한 영역에 관하여 약간 더 짧거나 더 긴 서열이 또한 효과적일 것으로 예상된다. 특히, 17 내지 23 bp 길이의 이중 가닥 서열이 또한 효과적일 것으로 예상된다.
이중 가닥 RNA를 형성하는 가닥은 짧은 3' 디뉴클레오타이드 오버행을 가질 수 있으며, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 3' DNA 오버행의 사용은 3' RNA 오버행과 비교하여 siRNA 활성에 어떠한 효과도 갖지 않지만, 핵산 가닥의 화학적 합성의 비용을 감소시킨다(Elbashir 등, 2001c). 이러한 이유에서, DNA 디뉴클레오타이드가 바람직할 수 있다.
존재할 때, 디뉴클레오타이드 오버행은 서로 대칭적일 수 있지만, 필수적이지는 않다. 사실상, 센스(상단) 가닥의 3' 오버행은 이것이 mRNA 인식 및 분해에 참여하지 않기 때문에 RNAi 활성과 무관하다(문헌[Elbashir 등, 2001a, 2001b, 2001c]).
초파리에서의 RNAi 실험이, 안티센스 3' 오버행이 mRNA 인식 및 표적화에 참여할 수 있음을 나타내긴 하지만(Elbashir 등. 2001c), 3' 오버행은 포유류 세포에서 siRNA의 RNAi 활성에 필요한 것으로 보이지 않는다. 따라서, 3' 오버행의 올바르지 않은 어닐링(annealing)은 포유류 세포에서 거의 효과를 갖지 않는 것으로 생각된다(문헌[Elbashir 등. 2001c; Czauderna 등. 2003]).
따라서, 임의의 디뉴클레오타이드 오버행은 siRNA의 안티센스 가닥에 사용될 수 있다. 그렇지만, 디뉴클레오타이드는 바람직하게는 -UU 또는 -UG(또는 오버행이 DNA라면 -TT 또는 -TG), 더욱 바람직하게는 -UU(또는 -TT)이다. -UU(또는 -TT) 디뉴클레오타이드 오버행이 가장 효과적이고, 전사 신호(종결자 신호는 TTTTT임)의 RNA 폴리머라제 III 단부와 일관된다(즉, 이의 파트를 형성할 수 있음). 이에, 이러한 디뉴클레오타이드가 가장 바람직하다. 디뉴클레오타이드 AA, CC 및 GG가 또한 사용될 수 있지만, 덜 효과적이고 결과적으로 덜 바람직하다.
더욱이, 3' 오버행은 siRNA로부터 전적으로 생략될 수 있다.
본 발명은 또한, 바람직하게는 3'-오버행을 갖지만 선택적으로 갖지 않는, 각각 상기 언급된 이중 가닥 핵산 중 하나의 성분 가닥으로 구성된 단일 가닥 핵산(본원에서 단일 가닥 siRNA로 지칭됨)을 제공한다. 본 발명은 또한, 시험관내에서 서로 혼성화하여 상기 언급된 이중 가닥 siRNA를 형성할 수 있는 이러한 단일 가닥 핵산의 쌍을 함유하는 키트를 제공하며, 이는 그 후에 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어, SEQ ID NO: 12 내지 15 또는 16 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 또는 상기 언급된 서열 중 임의의 하나로부터 단일 염기쌍 치환에 의해 상이한 서열을 포함하여 포유류 세포에서 전사될 때, 자가-혼성화하여 이중 가닥 모티프를 생성할 수 있는 2개의 상보적 부분을 갖는 RNA(본원에서 또한 shRNA로 지칭됨)를 산출하는 DNA를 제공한다.
상보적 부분은 일반적으로 스페이서에 의해 결합될 것이며, 이러한 스페이서는 2개의 상보적 부분이 서로 혼성화하도록 적합한 길이 및 서열을 갖는다. 2개의 상보적(즉, 센스 및 안티센스) 부분은 어느 순서로 5'-3' 결합될 수 있다. 스페이서는 전형적으로, 대략 4-12개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 4-9개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 6-9개 뉴클레오타이드의 짧은 서열일 것이다.
바람직하게는 스페이서의 5' 단부(업스트림 상보적 부분의 바로 3')는 뉴클레오타이드 -UU- 또는 -UG-, 또한 바람직하게는 -UU-로 구성된다(또한 이들 특정 디뉴클레오타이드의 사용이 필수적이지는 않긴 함). OligoEngine(Seattle, Washington, USA)의 pSuper 시스템에 사용하도록 권고된 적합한 스페이서는 UUCAAGAGA이다. 이러한 경우 및 다른 경우에, 스페이서의 단부는 서로 혼성화되어, 예를 들어, SEQ ID NO 12 내지 15 또는 16 내지 19의 정확한 서열을 적은 수(예를 들어, 1 또는 2개)의 염기쌍만큼 지나 이중 가닥 모티프를 신장시킬 수 있다.
유사하게는, 전사된 RNA는 바람직하게는 다운스트림 상보적 부분으로부터의 3' 오버행을 포함한다. 다시, 이는 바람직하게는 -UU 또는 -UG, 더욱 바람직하게는 -UU이다.
그 후에, 이러한 shRNA 분자는 포유류 세포에서 효소 다이서에 의해 절단되어, 상기 기재된 바와 같이 이중 가닥 siRNA를 산출할 수 있으며, 여기서 혼성화된 dsRNA 중 하나 또는 각각의 가닥은 3' 오버행을 포함한다.
본 발명의 핵산의 합성을 위한 기법은 당연하게도, 당업계에 잘 알려져 있다.
당업자는, 잘 알려진 기법 및 상업적으로 입수 가능한 물질을 사용하여 본 발명의 DNA에 적합한 전사 벡터를 잘 작제할 수 있다. 특히, DNA는 프로모터 및 전사 종결 신호를 포함한 제어 서열과 회합될 것이다.
특히 적합성은 OligoEngine(Seattle, Washington, USA)의 상업적으로 입수 가능한 pSuper 및 pSuperior 시스템이다. 이들은 폴리머라제-III 프로모터(H1), 및 전사체의 3' 단부에서 2개의 U 잔기를 이루는 T5 전사 종결자 서열을 사용한다(이는 다이서 가공 후, siRNA의 하나의 가닥의 3' UU 오버행을 제공함).
또 다른 적합한 시스템은 문헌[Shin 등. (RNA, 2009 May; 15(5): 898-910)]에 기재되어 있으며, 또 다른 폴리머라제-III 프로모터(U6)를 사용한다.
본 발명의 이중 가닥 siRNA는 하기 기재된 바와 같이 기지의 기법을 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 포유류 세포 내로 도입되어, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 억제시킬 수 있다.
유사하게는, 본 발명의 DNA를 함유하는 전사 벡터는 RNA의 일시적인 또는 안정한 발현을 위해 하기 기재된 바와 같이 기지의 기법을 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 종양 세포 내로 도입되어, 또한 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 억제시킬 수 있다.
이에, 본 발명은 또한, 포유류, 예를 들어, 인간, 세포에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 억제시키는 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터를 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
유사하게는, 나아가 본 발명은 대사 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
나아가, 본 발명은 치료 방법, 바람직하게는 대사 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터를 제공한다.
나아가, 본 발명은 대사 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터의 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 적합한 담체는 친유성 담체 또는 비히클을 포함하며, 이는 세포막의 투과를 도울 수 있다.
본 발명의 siRNA 듀플렉스 및 DNA 벡터의 투여에 적합한 물질 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 향상된 방법은 RNAi 기술의 잠재력을 고려하여 개발 하에 있다.
일반적으로, 핵산을 포유류 세포 내로 도입하기 위해 많은 기법이 이용 가능하다. 기법의 선택은, 핵산이 시험관내에서 배양된 세포 내로 또는 생체내에서 환자의 세포에 이전되는지의 여부에 의존할 것이다. 시험관내에서 핵산을 포유류 세포 내로 이전시키기에 적합한 기법은 리포솜, 전기천공, 현미주사(microinjection), 세포 융합, DEAE, 덱스트란 및 칼슘 포스페이트 침전의 사용을 포함한다. 생체내 유전자 이전 기법은 바이러스(전형적으로 레트로바이러스) 벡터에 의한 형질주입 및 바이러스 외피 단백질-리포솜 매개 형질주입(문헌[Dzau 등. (2003) Trends in Biotechnology 11, 205-210])을 포함한다.
특히, 본 발명의 핵산을 시험관내와 생체내 둘 다에서 세포내 투여하기에 적합한 기법은 하기 논문에 개시되어 있다:
일반적인 검토: 문헌[Borkhardt, A. 2002. Blocking oncogenes in malignant cells by RNA interference--new hope for a highly specific cancer treatment? Cancer Cell. 2:167-8]. 문헌[Hannon, G.J. 2002. RNA interference. Nature. 418:244-51]. 문헌[McManus, M.T., 및 P.A. Sharp. 2002. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3:737-47]. 문헌[Scherr, M., M.A. Morgan, 및 M. Eder. 2003b. Gene silencing mediated by small interfering RNAs in mammalian cells. Curr Med Chem. 10:245-56]. 문헌[Shuey, D.J., D.E. McCallus, 및 T. Giordano. 2002. RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention. Drug Discov Today. 7:1040-6].
리포솜을 사용한 전신 전달: 문헌[Lewis, D.L., J.E. Hagstrom, A.G. Loomis, J.A. Wolff, 및 H. Herweijer. 2002. Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice. Nat Genet. 32:107-8]. 문헌[Paul, C.P., P.D. Good, I. Winer, 및 D.R. Engelke. 2002. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat Biotechnol. 20:505-8]. 문헌[Song, E., S.K. Lee, J. Wang, N. Ince, N. Ouyang, J. Min, J. Chen, P. Shankar, 및 J. Lieberman. 2003. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med. 9:347-51]. 문헌[Sorensen, D.R., M. Leirdal, 및 M. Sioud. 2003. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice. J Mol Biol. 327:761-6].
바이러스 매개 이전(virus mediated transfer): 문헌[Abbas-Terki, T., W. Blanco-Bose, N. Deglon, W. Pralong, 및 P. Aebischer. 2002. Lentiviral-mediated RNA interference. Hum Gene Ther. 13:2197-201]. 문헌[Barton, G.M., 및 R. Medzhitov. 2002. Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:14943-5]. 문헌[Devroe, E., 및 P.A. Silver. 2002. Retrovirus-delivered siRNA. BMC Biotechnol. 2:15]. 문헌[Lori, F., P. Guallini, L. Galluzzi, 및 J. Lisziewicz. 2002. Gene therapy approaches to HIV infection. Am J Pharmacogenomics. 2:245-52]. 문헌[Matta, H., B. Hozayev, R. Tomar, P. Chugh, 및 P.M. Chaudhary. 2003. Use of lentiviral vectors for delivery of small interfering RNA. Cancer Biol Ther. 2:206-10]. 문헌[Qin, X.F., D.S. An, I.S. Chen, 및 D. Baltimore. 2003. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100:183-8]. 문헌[Scherr, M., K. Battmer, A. Ganser, 및 M. Eder. 2003a. Modulation of gene expression by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA. Cell Cycle. 2:251-7]. 문헌[Shen, C., A.K. Buck, X. Liu, M. Winkler, 및 S.N. Reske. 2003. Gene silencing by adenovirus-delivered siRNA. FEBS Lett. 539:111-4].
펩타이드 전달: 문헌[Morris, M.C., L. Chaloin, F. Heitz, 및 G. Divita. 2000. Translocating peptides and proteins and their use for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 11:461-6]. 문헌[Simeoni, F., M.C. Morris, F. Heitz, 및 G. Divita. 2003. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 31:2717-24]. siRNA를 표적 세포에 전달하기에 적합할 수 있는 다른 기술은 나노입자 또는 나노캡슐, 예컨대 미국 특허 번호 6,649,192B호 및 5,843,509B호에 기재된 것에 기초한다.
IL-11-매개 신호화의 저해
본 발명의 구현예에서, IL-11의 작용을 저해할 수 있는 제제는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 소유할 수 있다:
· IL-11에 의해 매개되는 신호화의 저해;
· IL-11Rα:gp130 수용체 복합체에의 IL-11의 결합에 의해 매개되는 신호화의 저해;
· gp130에의 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호화(즉, IL-11 trans 신호화)의 저해;
· IL-11에 의해 매개되는 과정의 저해;
· IL-11 및/또는 IL-11Rα의 유전자/단백질 발현의 저해.
이들 특성은 적합한 검정에서 관련 제제의 분석에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 검정은 제제와 적합한 대조군 제제의 성능 비교를 수반할 수 있다. 당업자는 주어진 검정에 대한 적절한 제어 조건을 식별할 수 있다.
IL-11-매개 신호화 및/또는 IL-11에 의해 매개되는 과정은 IL-11의 단편 및 IL-11 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 복합체에 의해 매개되는 신호화를 포함한다. IL-11-매개 신호화는 인간 IL-11 및/또는 마우스 IL-11에 의해 매개되는 신호화일 수 있다. IL-11에 의해 매개되는 신호화는, IL-11 또는 IL-11 함유 복합체가 결합하는 수용체에 IL-11 또는 상기 복합체가 결합한 후 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 또는 IL-11-함유 복합체의 생물학적 활성을 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는, IL-11Rα 및/또는 gp130, 예를 들어, IL-11Rα:gp130을 포함하는 수용체를 통한 신호 전달에 의해 활성화되는 하나 이상의 신호화 경로의 길항제이다. 일부 구현예에서, 제제는, IL-11Rα 및/또는 gp130, 예를 들어, IL-11Rα:gp130을 포함하는 하나 이상의 면역 수용체 복합체를 통한 신호화를 저해할 수 있다. 본 발명의 다양한 양태에서, 본원에 제공된 제제는 IL-11-매개 cis 및/또는 trans 신호화를 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 다양한 양태에 따르면, 본원에 제공된 제제는 IL-11-매개 cis 신호화를 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11-매개 신호화를, 제제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 제제의 존재 하에서의) 신호화의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-11-매개 신호화를, 제제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 제제의 존재 하에서의) 신호화의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화는 IL-11Rα:gp130 수용체에의 IL-11의 결합에 의해 매개되는 신호화일 수 있다. 이러한 신호화는 예를 들어, IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포를 IL-11로 처리함으로써, 또는 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 IL-11 생성을 자극함으로써 분석될 수 있다.
IL-11-매개 신호화의 저해에 대한 제제의 IC50은, IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 Ba/F3 세포를 인간 IL-11 및 제제의 존재 하에 배양하고, DNA 내로의 3H-티미딘 혼입을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 이러한 검정에서 10 μg/ml 이하, 바람직하게는 ≤ 5 μg/ml, ≤ 4 μg/ml, ≤ 3.5 μg/ml, ≤ 3 μg/ml, ≤ 2 μg/ml, ≤ 1 μg/ml, ≤ 0.9 μg/ml, ≤ 0.8 μg/ml, ≤ 0.7 μg/ml, ≤ 0.6 μg/ml, 또는 ≤ 0.5 μg/ml 중 하나의 IC50을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화는 gp130에의 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호화일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11:IL-11Rα 복합체, 예를 들어, IL-11Rα의 세포외 도메인과 IL-11의 복합체, 또는 가용성 IL-11Rα 이소형/단편과 IL-11의 복합체는 가용성일 수 있다. 일부 구현예에서, 가용성 IL-11Rα는 IL-11Rα의 가용성(분비된) 이소형이거나, 세포막 결합된 IL-11Rα의 세포외 도메인의 단백질분해성 절단의 유리된 생성물이다.
일부 구현예에서, IL-11:IL-11Rα 복합체는 세포-결합된 것, 예를 들어, 세포-막 결합된 IL-11Rα와 IL-11의 복합체일 수 있다. gp130에의 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호화는, gp130을 발현하는 세포를 IL-11:IL-11Rα 복합체, 예를 들어, 펩타이드 링커에 의해 IL-11Rα의 세포외 도메인, 예를 들어, 하이퍼(hyper) IL-11에 결합된 IL-11을 포함하는 재조합 융합 단백질로 처리함으로써 분석될 수 있다. 하이퍼 IL-11은 IL-11Rα의 단편(도메인 1 내지 3으로 구성된 아미노산 잔기 1 내지 317; UniProtKB: Q14626) 및 IL-11(UniProtKB: P20809의 아미노산 잔기 22 내지 199)을 20개 아미노산 길이 링커(SEQ ID NO:20)와 함께 사용하여 작제되었다. 하이퍼 IL-11에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:21로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 제제는 gp130에의 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호화를 저해할 수 있고, 또한 IL-11Rα:gp130 수용체에의 IL-11의 결합에 의해 매개되는 신호화를 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11에 의해 매개되는 과정을 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 및/또는 IL-11Rα의 유전자/단백질 발현을 저해할 수 있다. 유전자 및/또는 단백질 발현은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 잘 알려질 당업계의 방법에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 및/또는 IL-11Rα의 유전자/단백질 발현을, 제제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 제제의 존재 하에서의) 발현 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-11 및/또는 IL-11Rα의 유전자/단백질 발현을, 제제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 제제의 존재 하에서의) 발현 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
대사 질환의 치료/방지
본 발명은 대사 질환, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 대사 질환의 치료 및/또는 방지를 위한 방법 및 물품(제제 및 조성물)을 제공한다.
치료는 IL-11-매개 신호화의 저해(즉, IL-11-매개 신호화의 길항작용)에 의해 달성된다. 다시 말해, 본 발명은 예를 들어, 세포, 조직/기관/기관계/대상체에서 IL-11 매개 신호화의 저해를 통한, 대사 질환의 치료/방지를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 IL-11-매개 신호화의 저해는 간의 세포(예를 들어, 간세포)에서 IL-11-매개 신호화의 저해를 포함한다.
이에, 본 발명은 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 제공한다.
또한, 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도가 제공된다.
나아가, 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법이 제공되며, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이용성은 임의의 대사 질환의 치료/방지까지 확장된다. 본 발명은 또한, 대사 질환에 의해 야기되거나 악화되는 질환/병태의 치료/방지를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대사 질환이 불량한 예후를 제공하는 대상체에서 질환/병태의 치료/방지를 제공한다.
일부 구현예에서, 치료/방지될 대사 질환은 예를 들어, 정상적인 기관/조직/대상체(즉, 대사 질환의 부재)와 비교하여, 대사 질환에 의해 영향을 받는 기관/조직/대상체에서 IL-11 및/또는 IL-11Rα의 발현(즉, 유전자 및/또는 단백질 발현)의 증가를 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 대사 질환의 치료/방지는, IL-11의 상향조절, 예를 들어, 질환의 증상이 명시되거나 발생할 수 있는 세포 또는 조직에서 IL-11의 상향조절, 또는 세포외 IL-11 또는 IL-11Rα의 상향조절과 관련된 대사 질환일 수 있다.
대사 질환은 임의의 조직 또는 기관 또는 기관계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 몇몇 조직/기관/기관계에 영향을 미칠 수 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환은, 간, 췌장, 심혈관계, 소화계, 배설계, 호흡계, 신장계(renal system), 생식계, 순환계, 근육계, 내분비계, 외분비계, 림프계, 면역계, 신경계, 및/또는 골격계 중 하나 이상에 영향을 미친다.
본원에 개시된 다양한 양태에 따르면, 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 기능에 비해, 간의 감소된 기능, 또는 간의 세포(예를 들어, 간세포)의 감소된 기능을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, ALT 및/또는 AST의 증가된 수준 및/또는 GSH(예를 들어, 혈청에서)의 감소된 수준을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 간의 염증 및/또는 섬유증을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, 간의 세포(예를 들어, 간세포)에 의한 전염증성 및/또는 섬유증-촉진 인자(예를 들어, IL-11, IL-6, CCL2 및/또는 CCL5)의 증가된 유전자/단백질 발현을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, 간의 세포에 의한 콜라겐의 증가된 유전자/단백질 발현 및/또는 간의 증가된 콜라겐 함량을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 간 내 근섬유아세포의 수/비율에 비해, 간 내 근섬유아세포의 증가된 수/비율을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, 간의 세포(예를 들어, 간세포)의 증가된 세포자멸사 및/또는 괴사를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수/비율에 비해, 세포자멸사성 및/또는 괴사성 간 세포의 수/비율의 증가를 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, 간의 세포(예를 들어, 간세포)에 의한 지방산 합성효소(FASN: fatty acid synthase)의 증가된 유전자/단백질 발현을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, 간의 세포(예를 들어, 간세포) 내 반응성 산소종(ROS)의 증가된 수준을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, 간의 세포(예를 들어, 간세포)에 의한 NOX4의 증가된 유전자/단백질 발현을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, 간의 세포(예를 들어, 간세포)에서 ERK 및/또는 JNK 활성화의 증가된 수준을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 수준에 비해, 간 내 또는 간의 세포(예를 들어, 간세포) 내 증가된 트리글리세라이드 수준을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 고혈당증을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 고중성지방혈증을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 고콜레스테롤혈증을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 체중에 비해, 증가된 체중을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 대사 질환은 대사 질환의 부재 시의 간 중량에 비해, 증가된 간 중량을 특징으로 한다.
치료는 대사 질환의 발증 또는 진전을 감소/지연/방지하는 데 효과적일 수 있다. 치료는 대사 질환의 하나 이상의 증상의 악화를 감소/지연/방지하는 데 효과적일 수 있다. 치료는 대사 질환의 하나 이상의 증상을 향상시키는 데 효과적일 수 있다. 치료는 대사 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키고/거나 이를 역전시키는 데 효과적일 수 있다. 치료는 대사 질환의 효과를 역전시키는 데 효과적일 수 있다.
방지는 대사 질환의 발증의 방지, 및/또는 대사 질환의 악화의 방지, 예를 들어, 대사 질환의 예를 들어, 말기/만성 병기로의 진전의 방지를 지칭할 수 있다.
본 발명의 다양한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 대사 질환을 치료하고/거나 방지하는 방법은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
혈액 지질 수준의 감소;
혈액 글루코스 수준의 감소;
글루코스 내약성(예를 들어, 글루코스 불내성 대상체의)의 증가;
인슐린 내약성(예를 들어, 인슐린 내성 대상체의)의 증가;
췌장 기능의 증가;
체중(예를 들어, 과체중/비만 대상체의)의 감소;
체지방 질량의 감소;
제지방 질량(lean mass)의 증가;
공복 혈액 글루코스 수준의 감소;
혈청 트리글리세라이드 수준의 감소;
혈청 콜레스테롤 수준의 감소;
글루코스 내약성의 증가;
췌장 기능(예를 들어, 외분비 및/또는 내분비 기능)의 증가;
췌장 조직의 성장의 증가;
췌장 조직의 재생;
췌장 중량의 증가;
PSC에 의한 PSC-로부터-근섬유아세포로의 이행 저해;
췌장 내 근섬유아세포의 수/비율의 감소;
췌장 하이드록시프롤린 수준의 감소;
췌장 콜라겐 수준의 감소;
췌장 상해의 감소;
췌장 췌도 세포 과형성증(hyperplasia)의 감소;
글루카곤 발현의 감소;
인슐린 발현의 증가;
체중(예를 들어, 소모성 질환, 예를 들어, 악액질을 갖는 대상체의)의 증가;
간 내 IL-11 단백질의 발현의 감소;
간 내 Erk 활성화의 감소;
간 내 JNK 활성화의 감소;
간 내 카스파제-3 절단의 감소;
간 내 ROS의 수준의 감소;
간 내 NOX4 발현의 감소;
예를 들어, 간의 지방증의 감소;
간 트리글리세라이드 수준의 감소;
지방산 합성효소 발현의 감소;
혈청 ALT 및/또는 AST 수준의 감소;
전염증성 인자(예를 들어, TNFa, CCL2, CCL5, IL-6, CXCL5, 및/또는 CXCL1)의 발현의 감소;
섬유증-촉진 인자(예를 들어, IL-11, TIMP1, ACTA2, TGFβ1, MMP2, TIMP2, MMP9, COL1A2, COL1A1 및/또는 COL3A1)의 발현의 감소;
혈청 TGFβ1 수준의 감소;
HSC에 의한 IL-11, ACTA2, MMP2, TGFβ1, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 및/또는 H2O2의 발현/생성의 감소;
HSC에 의한 HSC-로부터-근섬유아세포로의 이행의 저해;
간 내 근섬유아세포의 수/비율의 감소;
간 하이드록시프롤린 수준의 감소;
간 콜라겐 수준의 감소;
간 기능의 증가;
혈청 GSH 수준의 증가;
대사 질환에 의해 영향받는 기관/조직의 기능의 증가;
간 상해의 감소;
간세포 사멸의 감소;
지방독성의 결과로서 세포 사멸의 감소;
간세포 내 IL-11-매개 신호화의 감소; 및
간 내 CD45+ 세포의 수/비율의 감소.
본원에 기재된 다양한 양태 및 구현예에 따르면, 대사 질환의 치료/방지는 구체적으로 예를 들어, 주어진 기관계/기관/조직/세포 유형에서 지방독성의 저해, 감소 또는 방지를 포함한다. 일부 구현예에서, 대사 질환의 치료/방지는 간에서의, 예를 들어, 간세포에서의 지방독성의 저해/감소/방지를 포함한다.
투여
IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 투여는 바람직하게는 "치료적 유효" 또는 "예방적 유효" 양(amount)으로 존재하며, 이는 대상체에게 이익을 나타내기에 충분하다.
투여되는 실제량, 및 투여의 속도와 시간-경과는 질환의 성질과 중증도 및 제제의 성질에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투약에 대한 결정 등은 일반 의사 및 다른 의학 박사의 책임 내에 있고, 전형적으로 치료될 질환/병태, 개별 대상체의 조건, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 인자를 고려한다. 상기 언급된 기법 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]에서 찾을 수 있다.
다수의 용량의 제제가 제공될 수 있다. 용량 중 하나 이상 또는 각각은 또 다른 치료제의 동시적인 또는 순차적인 투여에 의해 동반될 수 있다.
다수의 용량은 예정된 시간 간격에 의해 분리될 수 있으며, 이러한 시간 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 중 하나인 것으로 선택될 수 있다. 예로서, 용량은 7, 14, 21 또는 28일(+(플러스) 또는 -(마이너스) 3, 2 또는 1일)마다 1회 주어질 수 있다.
치료적 적용에서, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 바람직하게는, 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 부형제, 희석제, 충전제, 완충제, 보존제, 항산화제, 윤활제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제(예를 들어, 습윤제), 마스킹제(masking agent), 착색제, 풍미제, 및 감미제(sweetening agent)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업자에게 잘 알려진 하나 이상의 다른 약학적으로 허용 가능한 성분과 함께 약제 또는 약학적 제제로서 제형화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약학적으로 허용 가능한"은, 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서, 타당한 이익/위험 비(benefit/risk ratio)에 비례하여(commensurate), 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제점이나 합병증 없이 해당 대상체(예를 들어, 인간)에서 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 성분, 물질, 조성물, 투약 형태 등에 관한 것이다. 각각의 담체, 아쥬반트, 부형제 등은 또한, 제형의 다른 성분과 융화성(compatible)인 의미에서 "허용 가능"해야 한다.
적합한 담체, 아쥬반트, 부형제 등은 표준 약학적 문헌, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994]에서 찾을 수 있다.
제형은 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 화합물을, 하나 이상의 부속(accessory) 성분을 이루는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 담체(예를 들어, 액체 담체, 미분된 고체 담체 등)와 균일하게 그리고 긴밀하게 회합시킨 다음, 필요하다면 생성물을 형상화(shaping)시킴으로써 제조된다.
제형은 주사를 포함할 수 있는 투여의 국소, 비경구, 전신, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내(intrathecal), 안내(intraocular), 결막내(intraconjunctival), 피하, 경구 또는 경피 경로용으로 제조될 수 있다. 주사 제형은 선택된 제제를 멸균 또는 등장성 배지에 포함할 수 있다. 제형 및 투여 방식은 제제 및 치료될 질환에 따라 선택될 수 있다.
IL-11 및 IL-11에 대한 수용체의 검출
본 발명의 일부 양태 및 구현예는 대상체로부터 수득된 시료에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)의 발현의 검출에 관한 것이다.
일부 양태 및 구현예에서, 본 발명은 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(각각의 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체를 인코딩하는 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드로서)의 발현의 상향조절(과발현), 및 IL-11의 작용을 저해할 수 있는 제제에 의한 또는 IL-1 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 적합성의 지표(indicator)로서 이러한 상향조절의 검출에 관한 것이다.
상향조절된 발현은, 주어진 유형의 세포 또는 조직에 대해 통상 예상될 것보다 더 큰 수준에서의 발현을 포함한다. 상향조절은 세포 또는 조직에서 관련 인자의 발현 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 비교는, 관련 인자에 대한 대상체로부터의 세포 또는 조직 시료에서의 발현 수준과 기준 발현 수준, 예를 들어, 동일한 또는 상응하는 세포 또는 조직 유형에 대한 관련 인자의 정상적인 발현 수준을 나타내는 값 또는 값의 범위 사이에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 대조군 시료에서, 예를 들어, 건강한 대상체로부터의 또는 동일한 대상체의 건강한 조직으로부터의 상응하는 세포 또는 조직에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 검출함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 표준 곡선 또는 데이터 세트로부터 수득될 수 있다.
발현 수준은 절대 비교를 위해 정량화될 수 있거나, 상대 비교가 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)의 상향조절은, 시험 시료에서의 발현 수준이 기준 수준의 적어도 1.1배일 때 존재하는 것으로 여겨질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 발현 수준은 기준 수준의 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.1, 적어도 2.2, 적어도 2.3, 적어도 2.4 적어도 2.5, 적어도 2.6, 적어도 2.7, 적어도 2.8, 적어도 2.9, 적어도 3.0, 적어도 3.5, 적어도 4.0, 적어도 5.0, 적어도 6.0, 적어도 7.0, 적어도 8.0, 적어도 9.0, 또는 적어도 10.0배 중 하나로부터 선택될 수 있다.
발현 수준은 많은 기지의 시험관내 검정 기법, 예컨대 PCR 기초 검정, 인 시추 혼성화 검정(in situ hybridisation assay), 유세포분석 검정, 면역학적 또는 면역조직화학적 검정 중 하나에 의해 결정될 수 있다.
예로서, 적합한 기법은, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제를 시료와 접촉시키고 제제와 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 복합체의 형성을 검출함으로써 시료 내 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 수준을 검출하는 방법을 수반한다. 제제는 임의의 적합한 결합 분자, 예를 들어, 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 또는 저분자일 수 있으며, 선택적으로 표지되어, 형성된 복합체의 검출, 예를 들어, 시각화를 허용할 수 있다. 적합한 표지 및 이의 검출 수단은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인(fluorescein), 로다민, 에오신 및 NDB, 녹색 형광 단백질(GFP), 희토류의 킬레이트(chelate), 예컨대 유로퓸(Eu; europium), 테르븀(Tb; terbium) 및 사마륨(Sm; samarium), 테트라메틸 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 4-메틸 엄벨리페론(umbelliferone), 7-아미노-4-메틸 쿠마린, Cy3, Cy5), 동위원소 마커, 방사성 동위원소(예를 들어, 32P, 33P, 35S), 화학발광 표지(예를 들어, 아크리디늄 에스테르, 루미놀, 이소루미놀), 효소(예를 들어, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제), 항체, 리간드 및 수용체를 포함한다. 검출 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 표지제(labelling agent)에 상응하도록 선택될 수 있다. 적합한 기법은 올리고뉴클레오타이드 태그의 PCR 증폭, 질량 분광법, 예를 들어, 리포터 단백질에 의한 기질의 효소적 전환 시 형광 또는 색상의 검출, 또는 방사성의 검출을 포함한다.
검정은 시료에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 양을 정량화하도록 배치될 수 있다. 시험 시료로부터 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 정량화된 양은 기준값과 비교될 수 있으며, 이러한 비교는, 시험 시료가 기준값보다 더 높거나 더 낮은 양의 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체를 함유하는지의 여부를 통계학적 유의성의 선택된 정도까지 결정하는 데 사용될 수 있다.
검출된 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 정량화는 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체를 인코딩하는 유전자의 상향조절이나 하향조절 또는 증폭을 결정하는 데 사용될 수 있다. 시험 시료가 섬유증성(fibrotic) 세포를 함유하는 경우, 이러한 상향조절, 하향조절 또는 증폭은 기준값과 비교되어, 임의의 통계학적으로 유의한 차이가 존재하는지의 여부를 결정할 수 있다.
대상체로부터 수득된 시료는 임의의 종류일 수 있다. 생물학적 시료는 임의의 조직 또는 체액, 예를 들어, 혈액 시료, 혈액-유래 시료, 혈청 시료, 림프 시료, 정액 시료, 침 시료, 활액 시료로부터 얻어질 수 있다. 혈액-유래 시료는 환자의 혈액 중 선택된 분획, 예를 들어, 선택된 세포-함유 분획 또는 혈장이나 혈청 분획일 수 있다. 시료는 조직 시료 또는 생검; 또는 대상체로부터 단리된 세포를 포함할 수 있다. 시료는 기지의 기법, 예컨대 생검 또는 바늘 흡인술에 의해 수집될 수 있다. 시료는 IL-11 발현 수준의 후속적인 결정을 위해 저장되고/거나 가공될 수 있다.
시료는, 시료가 얻어진 대상체에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 상향조절을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 시료는 대사 질환에 의해 영향을 받는 조직/기관으로부터 얻어진 조직 시료, 예를 들어, 생검일 수 있다. 시료는 세포를 함유할 수 있다.
대상체는, 이러한 대상체가 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)의 발현의 상향조절된 수준을 갖는다는 결정에 기초하여 본 발명에 따라 치료법/예방을 위해 선택될 수 있다. IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 상향조절된 발현은, IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 적합한 대사 질환의 마커로서 역할을 할 수 있다.
상향조절은 주어진 조직에 또는 주어진 조직으로부터의 선택된 시료에 있을 수 있다. 바람직한 조직은 간 조직 또는 췌장 조직일 수 있다. IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현의 상향조절은 또한, 순환중인 유체, 예를 들어, 혈액에서, 또는 혈액 유래 시료에서 결정될 수 있다. 상향조절은 세포외 IL-11 또는 IL-11Rα의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 발현은 국소적으로 또는 전신적으로 상향조절될 수 있다.
선택 후, 대상체는 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여받을 수 있다.
진단 및 예후
IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)의 발현의 상향조절의 검출은 또한, 대사 질환을 진단하며, 대사 질환을 발증시킬 위험에 있는 대상체를 식별하는 방법에서, 그리고 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 예후화하거나 예측하는 방법에 사용될 수 있다.
"발증시키는", "발증", 및 "발증하다"의 다른 형태는 장애/질환의 발병, 또는 장애/질환의 계속 또는 진행을 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어, 대상체의 신체에서 또는 대상체의 신체의 선택된 세포/조직에서 대사 질환을 나타내는 다른 증상의 존재에 기초하여 대사 질환을 갖고 있거나 이를 앓고 있는 것으로 의심될 수 있거나, 예를 들어, 대사 질환에 대한 위험 인자인 것으로 알려진 유전적 소인 또는 환경적 조건에의 노출때문에 대사 질환을 발증시킬 위험에 있는 것으로 여겨질 수 있다. IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현의 상향조절의 결정은 진단 또는 의심된 진단을 확인할 수 있거나, 대상체가 대사 질환을 발증시킬 위험에 있음을 확인할 수 있다. 결정은 또한, 대사 질환 또는 소인을, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 적합한 것으로 진단할 수 있다.
이와 같이, 대사 질환을 갖고 있거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에 대해 예후를 제공하는 방법이 제공될 수 있으며, 방법은 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현이 대상체로부터 수득된 시료에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계, 및 결정에 기초하여, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 대상체의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 진단 방법 또는 IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 예후화하거나 예측하는 방법은 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현의 결정을 필요로 하지 않을 수 있으나, 발현 또는 활성의 상향조절을 예측하는 유전적 인자를 대상체에서 결정하는 것에 기초할 수 있다. 이러한 유전적 인자는 IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130에서 유전적 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 유전자 증폭의 결정을 포함할 수 있으며, 이는 발현 또는 활성 및/또는 IL-11 매개 신호화의 상향조절과 상관관계가 있고/거나 이를 예측한다. 질환 상태에의 소인 또는 치료 반응을 예측하기 위한 유전적 인자의 사용은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Peter Starkel Gut 2008;57:440-442]; 문헌[Wright 등, Mol. Cell. Biol. March 2010 vol. 30 no. 6 1411-1420]을 참조한다.
유전적 인자는 PCR 기초 검정, 예를 들어, 정량적 PCR, 경쟁적 PCR을 포함하여 당업자에게 알려진 방법에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터 수득된 시료에서 유전적 인자의 존재를 결정함으로써, 진단이 확인될 수 있고/거나 대상체는 대사 질환을 발증시킬 위험에 있는 것으로 분류될 수 있고/거나 대상체는 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 적합한 것으로 식별될 수 있다.
일부 방법은 IL-11의 분비와 연관된 하나 이상의 SNP의 존재 또는 대사 질환의 발증에 대한 감수성(susceptibility)의 결정을 포함할 수 있다. SNP는 통상 이중-대립유전자(bi-allelic)이며, 따라서, 당업자에게 알려진 많은 종래의 검정 중 하나를 사용하여 쉽게 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Anthony J. Brookes. The essence of SNPs. Gene Volume 234, Issue 2, 8 July 1999, 177-186]; 문헌[Fan 등, Highly Parallel SNP Genotyping. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2003. 68: 69-78]; 문헌[Matsuzaki 등, Parallel Genotyping of Over 10,000 SNPs using a one-primer assay on a high-density oligonucleotide array. Genome Res. 2004. 14: 414-425] 참조).
방법은, 대상체로부터 수득된 시료에 SNP 대립유전자가 존재하는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소수 대립유전자(minor allele)의 존재를 결정하는 것은 증가된 IL-11 분비 또는 대사 질환의 발증에 대한 감수성과 관련이 있을 수 있다.
이에, 본 발명의 일 양태에서, 대상체를 스크리닝하는 방법이 제공되며, 방법은
대상체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계;
어떤 대립유전자가 시료에서 WO 2017/103108 A1의 도 33, 도 34 또는 도 35에 나열된 하나 이상의 SNP(본원에 참조로서 포함됨), 또는 나열된 SNP 중 하나와 연관 불균형(linkage disequilibrium)에 있는 SNP의 다형성 뉴클레오타이드 위치에 존재하는지 r2 ≥ 0.8로 결정하는 단계
를 포함한다.
결정 단계는, 소수 대립유전자가 시료 내 선택된 다형성 뉴클레오타이드 위치에 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 0, 1 또는 2개의 소수 대립유전자가 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
스크리닝 방법은, 대사 질환의 발증에 대한 대상체의 감수성을 결정하는 방법, 또는 본원에 기재된 바와 같은 진단 또는 예후 방법이거나 이의 파트를 형성할 수 있다.
방법은 추가로, 예를 들어, 대상체가 다형성 뉴클레오타이드 위치에 소수 대립유전자를 갖는 것으로 결정된다면, 대사 질환에 대한 감수성 또는 이의 증가된 위험을 갖고 있는 것으로 대상체를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 추가로, 대상체에서 대사 질환에 대한 치료를 제공하기 위해 또는 대상체에서 대사 질환의 발증 또는 진행을 방지하기 위해, IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료를 위한 대상체를 선택하고/거나 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 대사 질환을 진단하고, 대사 질환을 발증시킬 위험에 있는 대상체를 식별하는 방법, 및 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 예후화하거나 예측하는 방법은, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체, 또는 유전적 인자의 발현의 상향조절의 검출이 아닌 지표를 이용한다.
일부 구현예에서, 대사 질환을 진단하고, 대사 질환을 발증시킬 위험에 있는 대상체를 식별하는 방법, 및 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 예후화하거나 예측하는 방법은, 대사 기능의 하나 이상의 지표를 검출하고/거나, 측정하고/거나 식별하는 것에 기초한다.
진단 또는 예후 방법은 대상체로부터 수득된 시료 상에서, 또는 대상체로부터 수득된 시료의 가공 후 시험관내에서 수행될 수 있다. 일단 시료가 수집되면, 환자는 수행될 시험관내 진단 또는 예후 방법을 위해 존재할 필요는 없으며, 따라서, 방법은 인간 또는 동물 신체 상에서 수행되지 않는 것일 수 있다. 대상체로부터 수득된 시료는 본원 상기에 기재된 바와 같이 임의의 종류일 수 있다.
다른 진단 또는 예후 시험은 본원에 기재된 것과 함께 사용되어, 진단 또는 예후의 정확성을 증강시키거나 본원에 기재된 시험을 사용함으로써 수득된 결과를 확인시켜 줄 수 있다.
대상체
대상체는 동물 또는 인간일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다. 대상체는 비-인간 포유류일 수 있으나, 더욱 바람직하게는 인간이다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다.
환자는 본원에 기재된 바와 같이 대사 질환을 가질 수 있다. 대상체는 치료를 필요로 하는 대사 질환으로 진단된 적이 있을 수 있거나, 이러한 대사 질환을 갖고 있는 것으로 의심될 수 있거나, 대사 질환을 발증시킬 위험에 있을 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따르면, 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 구현예에서, 본 발명에 따르면, 대상체는 대사 질환의 소정의 마커에 대한 특징화에 기초한 방법에 따라 치료를 위해 선택될 수 있다.
제공되는 추가의 방법 및 용도
본 발명은 또한, 하기의 방법에서 사용하기 위한 IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제, 또는 IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도를 제공한다: 혈액 지질 수준의 감소, 혈액 글루코스 수준의 감소, 글루코스 내약성(예를 들어, 글루코스 불내성 대상체의)의 증가, 인슐린 내약성(예를 들어, 인슐린 내성 대상체의)의 증가, 췌장 기능의 증가, 체중(예를 들어, 과체중/비만 대상체의)의 감소, 체지방 질량의 감소, 제지방 질량의 증가, 공복 혈액 글루코스 수준의 감소, 혈청 트리글리세라이드 수준의 감소, 혈청 콜레스테롤 수준의 감소, 글루코스 내약성의 증가, 췌장 기능(예를 들어, 외분비 및/또는 내분비 기능)의 증가, 췌장 조직의 성장의 증가, 췌장 조직의 재생, 췌장 중량의 증가, PSC에 의한 PSC-로부터-근섬유아세포로의 이행 저해, 췌장 내 근섬유아세포의 수/비율의 감소, 췌장 하이드록시프롤린 수준의 감소, 췌장 콜라겐 수준의 감소, 췌장 상해의 감소, 췌장 췌도 세포 과형성증의 감소, 글루카곤 발현의 감소, 인슐린 발현의 증가, 체중(예를 들어, 소모성 질환, 예를 들어, 악액질을 갖는 대상체의)의 증가, 간 내 IL-11 단백질의 발현의 감소, 간 내 Erk 활성화의 감소, 간 내 JNK 활성화의 감소; 간 내 카스파제-3 절단의 감소; 간 내 ROS의 수준의 감소; 간 내 NOX4 발현의 감소, 예를 들어, 간의 지방증의 감소, 간 트리글리세라이드 수준의 감소, 지방산 합성효소 발현의 감소, 혈청 ALT 및/또는 AST 수준의 감소, 전염증성 인자(예를 들어, TNFa, CCL2, CCL5, IL-6, CXCL5, 및/또는 CXCL1)의 발현의 감소, 섬유증-촉진 인자(예를 들어, IL-11, TIMP1, ACTA2, TGFβ1, MMP2, TIMP2, MMP9, COL1A2, COL1A1 및/또는 COL3A1)의 발현의 감소, 혈청 TGFβ1 수준의 감소, HSC에 의한 IL-11, ACTA2, MMP2, TGFβ1, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 및/또는 H2O2의 발현/생성의 감소, HSC에 의한 HSC-로부터-근섬유아세포로의 이행의 저해, 간 내 근섬유아세포의 수/비율의 감소, 간 하이드록시프롤린 수준의 감소, 간 콜라겐 수준의 감소, 간 기능의 증가, 혈청 GSH 수준의 증가, 대사 질환에 의해 영향받는 기관/조직의 기능의 증가, 간 상해의 감소, 간세포 사멸의 감소; 지방독성의 결과로서 세포(예를 들어, 간세포의) 사멸의 감소; 간세포 내 IL-11-매개 신호화의 감소 또는 간 내 CD45+ 세포의 수/비율의 감소.
본 발명은 또한, 하기의 방법에 사용하기 위한 조성물의 제조에 사용하기 위한 IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도를 제공한다: 혈액 지질 수준의 감소, 혈액 글루코스 수준의 감소, 글루코스 내약성(예를 들어, 글루코스 불내성 대상체의)의 증가, 인슐린 내약성(예를 들어, 인슐린 내성 대상체의)의 증가, 췌장 기능의 증가, 체중(예를 들어, 과체중/비만 대상체의)의 감소, 체지방 질량의 감소, 제지방 질량의 증가, 공복 혈액 글루코스 수준의 감소, 혈청 트리글리세라이드 수준의 감소, 혈청 콜레스테롤 수준의 감소, 글루코스 내약성의 증가, 췌장 기능(예를 들어, 외분비 및/또는 내분비 기능)의 증가, 췌장 조직의 성장의 증가, 췌장 조직의 재생, 췌장 중량의 증가, 췌장 췌도 세포 과형성증의 감소, 글루카곤 발현의 감소, 인슐린 발현의 증가, 체중(예를 들어, 소모성 질환, 예를 들어, 악액질을 갖는 대상체의)의 증가, 간 내 IL-11 단백질의 발현의 감소, 간 내 Erk 활성화의 감소, 간 내 JNK 활성화의 감소; 간 내 카스파제-3 절단의 감소; 간 내 ROS의 수준의 감소; 간 내 NOX4 발현의 감소, 예를 들어, 간의 지방증의 감소, 간 트리글리세라이드 수준의 감소, 지방산 합성효소 발현의 감소, 혈청 ALT 및/또는 AST 수준의 감소, 전염증성 인자(예를 들어, TNFa, CCL2, CCL5, IL-6, CXCL5, 및/또는 CXCL1)의 발현의 감소, 섬유증-촉진 인자(예를 들어, IL-11, TIMP1, ACTA2, TGFβ1, MMP2, TIMP2, MMP9, COL1A2, COL1A1 및/또는 COL3A1)의 발현의 감소, 혈청 TGFβ1 수준의 감소, HSC에 의한 IL-11, ACTA2, MMP2, TGFβ1, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 및/또는 H2O2의 발현/생성의 감소, HSC에 의한 HSC-로부터-근섬유아세포로의 이행의 저해, 간 내 근섬유아세포의 수/비율의 감소, 간 하이드록시프롤린 수준의 감소, 간 콜라겐 수준의 감소, 간 기능의 증가, 혈청 GSH 수준의 증가, 대사 질환에 의해 영향받는 기관/조직의 기능의 증가, 간 상해의 감소, 간세포 사멸의 감소; 지방독성의 결과로서 세포(예를 들어, 간세포의) 사멸의 감소; 간세포 내 IL-11-매개 신호화의 감소 또는 간 내 CD45+ 세포의 수/비율의 감소.
본 발명은 또한, 하기 방법을 제공한다: 혈액 지질 수준의 감소, 혈액 글루코스 수준의 감소, 글루코스 내약성(예를 들어, 글루코스 불내성 대상체의)의 증가, 인슐린 내약성(예를 들어, 인슐린 내성 대상체의)의 증가, 췌장 기능의 증가, 체중(예를 들어, 과체중/비만 대상체의)의 감소, 체지방 질량의 감소, 제지방 질량의 증가, 공복 혈액 글루코스 수준의 감소, 혈청 트리글리세라이드 수준의 감소, 혈청 콜레스테롤 수준의 감소, 글루코스 내약성의 증가, 췌장 기능(예를 들어, 외분비 및/또는 내분비 기능)의 증가, 췌장 조직의 성장의 증가, 췌장 조직의 재생, 췌장 중량의 증가, 췌장 췌도 세포 과형성증의 감소, 글루카곤 발현의 감소, 인슐린 발현의 증가, 체중(예를 들어, 소모성 질환, 예를 들어, 악액질을 갖는 대상체의)의 증가, 간 내 IL-11 단백질의 발현의 감소, 간 내 Erk 활성화의 감소, 간 내 JNK 활성화의 감소; 간 내 카스파제-3 절단의 감소; 간 내 ROS의 수준의 감소; 간 내 NOX4 발현의 감소, 예를 들어, 간의 지방증의 감소, 간 트리글리세라이드 수준의 감소, 지방산 합성효소 발현의 감소, 혈청 ALT 및/또는 AST 수준의 감소, 전염증성 인자(예를 들어, TNFa, CCL2, CCL5, IL-6, CXCL5, 및/또는 CXCL1)의 발현의 감소, 섬유증-촉진 인자(예를 들어, IL-11, TIMP1, ACTA2, TGFβ1, MMP2, TIMP2, MMP9, COL1A2, COL1A1 및/또는 COL3A1)의 발현의 감소, 혈청 TGFβ1 수준의 감소, HSC에 의한 IL-11, ACTA2, MMP2, TGFβ1, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 및/또는 H2O2의 발현/생성의 감소, HSC에 의한 HSC-로부터-근섬유아세포로의 이행의 저해, 간 내 근섬유아세포의 수/비율의 감소, 간 하이드록시프롤린 수준의 감소, 간 콜라겐 수준의 감소, 간 기능의 증가, 혈청 GSH 수준의 증가, 대사 질환에 의해 영향받는 기관/조직의 기능의 증가, 간 상해의 감소, 간세포 사멸의 감소; 지방독성의 결과로서 세포(예를 들어, 간세포의) 사멸의 감소; 간세포 내 IL-11-매개 신호화의 감소 또는 간 내 CD45+ 세포의 수/비율의 감소.
서열 동일성
2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 사이에서 동일성 백분율을 결정하기 위한 쌍(pairwise) 및 다중 서열 정렬은 당업자에게 알려진 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 ClustalOmega(문헌[Soding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960]), T-커피(T-coffee)(문헌[Notredame 등. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217]), Kalign(문헌[Lassmann 및 Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)]) 및 MAFFT(문헌[Katoh 및 Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780]) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용할 때, 예를 들어, 갭 페널티(gap penalty) 및 익스텐선 페널티(extension penalty)에 대한 디폴터 매개변수(default parameter)가 바람직하게는 사용된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명은 기재된 양태 및 바람직한 특질의 조합을, 단, 이러한 조합이 명백하게 허용 불가능하거나 분명하게 피해지는 경우를 제외하고는, 포함한다.
상기 설명에서 또는 하기 청구항에서, 또는 첨부된 도면에서 이의 구체적인 형태로 또는 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 또는 개시된 결과를 수득하기 위한 방법 또는 과정의 측면에서 개시된 특질은 적절하다면, 별개로 또는 이러한 특질의 조합으로, 본 발명을 이의 다양한 형태로 실현하는 데 이용될 수 있다.
임의의 의심을 피하기 위해, 본원에 제공된 임의의 이론적 설명은 독자의 이해를 향상시키기 위해 제공된다. 발명자들은 임의의 이들 이론적 설명에 결부시키고자 하지 않는다.
본원에 사용된 임의의 섹션 머릿말은 단지 구조적인 목적을 위한 것이고, 기재된 주제를 제한하려는 것으로 간주되지 않는다.
후속하는 청구항을 포함하여 본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 다르게 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(include)" 및 변화형, 예컨대 "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", 및 "포함하는(including)"은, 임의의 다른 정수나 단계 또는 정수나 단계의 군(group)의 배제가 아니라 언급된 정수나 단계 또는 정수나 단계의 군의 포함을 내포하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형("a," "an," 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수형을 포함함을 주지해야 한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 또 다른 특정값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 구현예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게는, 값이 근사치로서 표현될 때, 선행사 "약"의 사용에 의해, 특정 값은 또 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 수치값과 관련하여 용어 "약"은 선택적이고, 예를 들어, +/- 10%를 의미한다.
시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서, 본원에 개시된 방법이 수행될 수 있거나 생성물이 존재할 수 있다. 용어 "시험관내에서"는 실험실 조건에서 또는 배양물에서의 물질, 생물학적 성분, 세포 및/또는 조직을 이용한 실험을 포괄하고자 하는 반면, 용어 "생체내에서"는 다세포성 유기체를 이용한 실험 및 절차를 포괄하고자 한다. 일부 구현예에서, 생체내에서 수행되는 방법은 비-인간 동물 상에서 수행될 수 있다. "생체외에서"는 유기체 외부에서, 예를 들어, 인간 또는 동물 신체의 외부에서 존재하거나 발생하는 어떤 것을 지칭하며, 이는 유기체로부터 얻은 조직(예를 들어, 전체(whole) 기관) 또는 세포 상에 있을 수 있다.
핵산 서열이 본원에 개시되는 경우, 이의 역보체가 또한 명백하게 고려된다.
표준 분자생물학 기법에 대해, 문헌[Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press]를 참조한다.
본 발명의 양태 및 구현예는 이제 첨부된 도면을 참조로 논의될 것이다. 추가 양태 및 구현예는 당업자에게 분명할 것이다. 본 문헌에서 언급된 모든 문헌은 이의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명이 하기 기재된 예시적인 구현예와 함께 기재되긴 하였지만, 이러한 개시내용이 주어질 때 많은 동등한 변형 및 변화가 당업자에게 분명할 것이다. 이에, 상기 제시된 본 발명의 예시적인 구현예는 예시적인 것으로 여겨지고 제한하려는 것이 아니다. 기재된 구현예에 대한 다양한 변화는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.
본 발명의 원리를 예시하는 구현예 및 실험은 이제, 첨부된 도면을 참조로 하여 논의될 것이다.
도 1a 및 도 1b. (1a) 정상 사료 식단(NCD), 또는 (1b) 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육된 IL-11RA 넉아웃(Il11ra1-/-) 또는 야생형, IL-11RA 발현(Il11ra1+/+) 마우스에 대해 시간 경과에 따른 체중 변화의 백분율을 도시하는 그래프이다.
도 2a 및 도 2b. (2a) 정상 사료 식단(NCD), 또는 (2b) 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육된 IL-11RA 넉아웃(Il11ra1KO) 또는 야생형, IL-11RA 발현(Il11raWT) 마우스에 대한 총 체지방 질량 변화의 백분율을 도시하는 막대 챠트이다.
도 3. 정상 사료 식단(NC), 또는 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육된 IL-11RA 넉아웃(KO) 또는 야생형, IL-11RA 발현(WT) 마우스에 대한 공복 혈액 글루코스 수준(mM)을 도시하는 그래프이다.
도 4. 정상 사료 식단(NC), 또는 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육된 IL-11RA 넉아웃(KO) 또는 야생형, IL-11RA 발현(WT) 마우스에 대한 혈청 트리글리세라이드 수준(mg/g)을 도시하는 그래프이다.
도 5a 및 도 5b. (5a) 정상 사료 식단(NC), 또는 (5b) 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육된 IL-11RA 넉아웃(KO) 또는 야생형, IL-11RA 발현(WT) 마우스에 대한 혈청 콜레스테롤 수준(mg/dl)을 도시하는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b. 정상 사료(NC) 또는 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육되고 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 대조군으로 치료된 마우스에 대한 체중 변화를 도시하는 그래프 및 박스 플롯이다. (6a) 시간(주(week))에 따른 체중 변화 백분율을 도시한다. (6b) 총 체지방 질량과 제지방 질량 사이의 차이 백분율을 도시한다. *P<0.05.
도 7a 및 도 7b. 복강내 글루코스 내약성 시험(ipGTT)에 의해 결정된 바와 같이, 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육되고 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 대조군으로 치료된 마우스에 대한 글루코스 내약성을 도시하는 그래프, 개략도 및 막대 챠트이다. (7a) 1분 시점으로부터 글루코스 수준(mM) 변화를 도시한다. (7b) 곡선아래 면적(면적 under the curve)을 도시한다. *P<0.05, ** P<0.01.
도 8. 정상 사료(NCD) 또는 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육되고 상이한 시점으로부터 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 대조군으로 치료된 마우스에 대한 췌장 중량을 도시하는 박스 플롯이다. ****P<0.0001.
도 9a 내지 도 9c. 정상 사료(NCD) 또는 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 사육되고 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 대조군으로 치료된 마우스에 대한 (9a) 혈청 콜레스테롤 수준(mg/dl), (9b) 혈청 트리글리세라이드 수준(mg/g) 및 (9c) 공복 혈액 글루코스 수준(mM)을 도시하는 박스 플롯이다.
도 10a 및 도 10b. 정상 사료(NCD)로 공급된 마우스, 또는 프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)으로 공급되고 제16주로부터 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 대조군으로 치료된 마우스로부터 제24주에 수득된 췌장 조직의 절편의 (10a) 글루카곤 함량 및 (10b) 인슐린 함량의 면역조직화학적 분석 결과를 도시하는 이미지이다.
도 11a 및 도 11b. 악액질-관련 체중 손실에 미치는 항-IL-11/항-IL-11Rα 항체 치료의 효과를 도시하는 그래프 및 이미지이다. (11a) 악액질-유도 고 지방 메티오닌-콜린 결핍(HFMCD) 식단으로 사육된 마우스는 항-IL-11 또는 항-IL-11Rα 항체로 2x/주로 치료될 때 정상적인 또는 정상-근처(near-normal) 체중으로 복귀하였다. 대조군 마우스는 정상 사료(NC)로 사육되거나, HFMCD 식단으로 사육되고 IgG 이소타입 대조군으로 치료되었다. (11b) HFMCD 식단으로 사육되고 IgG 또는 항-IL-11 항체 또는 항-IL-11Rα 항체로 치료된 마우스의 신체 크기의 실시예 비교이다.
도 12a 내지 도 12c. 악액질-관련 체중 손실의 모델에서 체중에 미치는 항-IL-11/항-IL-11Rα 항체 치료의 효과를 도시하는 그래프이다. HFMCD 식단으로 사육된 마우스는 0.5, 1, 5 또는 10 mg/kg 항-IL-11Rα 항체(12a) 또는 2개의 항-IL-11 항체 중 하나(12b 및 12c)로 2x/주 치료되었다. 대조군 마우스는 정상 사료(NC)로 사육되거나, HFMCD 식단으로 사육되고 IgG 이소타입 대조군으로 치료되었다.
도 13a 내지 도 13c. 악액질-관련 체중 손실의 모델에서 음식 소모에 미치는 항-IL-11/항-IL-11Rα 항체 치료의 효과를 도시하는 그래프이다. HFMCD 식단으로 사육된 마우스는 0.5, 1, 5 또는 10 mg/kg 항-IL-11Rα 항체(13a) 또는 2개의 항-IL-11 항체 중 하나(13b 및 13c)로 2x/주 치료되었다. 대조군 마우스는 정상 사료(NC)로 사육되거나, HFMCD 식단으로 사육되고 IgG 이소타입 대조군으로 치료되었다.
도 14a 및 도 14b. 폴레이트-유도 급성 신장 손상 후 악액질-관련 체중 손실에서 체중에 미치는 항-IL-11/항-IL-11Rα 항체 치료의 효과를 도시하는 그래프이다. (14a) 폴레이트-유도 신장 손상을 갖는 마우스는 손상 전 1시간째로부터 손상 후 28일까지 항-IL-11Rα 항체, 항-IL-11 항체, 또는 IgG 대조군으로 치료되었다. '대조군' 마우스는 비히클 단독으로 투여되었다. (14b) 폴레이트-유도 신장 손상을 갖는 마우스는 손상 후 21일째부터 항-IL-11 항체 또는 IgG 대조군으로 치료되었다. FA = 엽산.
도 15. 일측 요로 폐쇄(UUO: unilateral ureter obstruction)-유도 급성 신장 손상 후 악액질-관련 체중 손실에서 체중에 미치는 항-IL-11 항체 치료의 효과를 도시하는 그래프이다. UUO-유도 신장 손상을 갖는 마우스는 손상 후 10일 동안 항-IL-11 항체 또는 IgG 대조군으로 치료되었다.
도 16a 및 도 16b. 체중 획득(gain)에 미치는 IL-11 과발현의 효과를 도시하는 그래프이다. (16a) 재조합 마우스 IL-11(rmIL11)의 투여는 정상적인 마우스 체중 획득 진전을 보여주었다. (16b) 마우스에서 IL-11 이식유전자(IL-11 Tg)의 유도는 시간 경과에 따른 체중 손실을 초래하였다.
도 17a 내지 도 17n. IL-11은 HSC 활성화 및 간 섬유증을 유도한다. (a) IL-11 RNA는 TGFβ1로 자극된 HSC에서 상향조절된다. (b) IL-11 단백질은 TGFβ1로 자극된 HSC로부터 분비된다. (c) 인간 정밀 절단된 간 슬라이스는 TGFβ1로 자극되었고, IL-11 단백질은 상층액에서 측정되었다. (d) HSC 및 활성화된 THP-1 세포에서의 면역형광 이미지 IL6R 및 IL11RA 발현이다(척도 막대(scale bar), 100 μm). (e) 면역형광 이미지(척도 막대, 100 μm) 및 (f) 자극 없이(-), TGFβ1, PDGF, 또는 IL-11과 함께 인큐베이션 후 HSC에서 ACTA2의 웨스턴 블롯이다. (g) 콜라겐 I 염색에 대한 HSC 및 (h) TGFβ1, PDGF, 또는 IL-11로 자극된 HSC 상층액에서 콜라겐 분비의 면역형광 이미지(척도 막대, 100 μm)이다. (i) IL-11에 의해 유도되는 HSC의 용량-의존적 마트리겔 침범이다. (j) 하이퍼 IL-11은 HSC로부터의 IL-11 단백질 분비를 유도한다(ELISA). (a-c, e-h, j) TGFβ1(5 ng/ml), 하이퍼 IL-11(0.2 ng/ml), PDGF(20 ng/ml), IL-11(5 ng/ml); 24 h; (k) 48 h. (k) 식염수(대조군) 또는 rmIl-11(100 μg/kg)의 일일 주사를 받는 마우스의 개략도이다. (l-n) 1K에서 도시된 바와 같은 rmIl-11 주사 실험에 대한 데이터(n≥7/그룹)이다. (l) 상대 간 하이드록시프롤린 함량, (m) 섬유증-촉진 및 전염증성 마커의 간 mRNA 발현, 및 (n) 혈청 ALT 수준이다. (a-b, h-j, l, n) 데이터는 평균 ± s.d로서 표시되며; (c, m) 박스-및-휘스커 플롯은 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(percentile)(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)를 도시한다. (a-c, j, l-n) 양측 스튜던츠 t-검정(two-tailed Student's t-test); (h-i) 양측 던넷 검정(two-tailed Dunnett's test). FC: 배수 변화; I/A: 강도/면적.
도 18a 내지 도 18n. Il11ra1에 대해 결실된 마우스는 NASH 간 병상(pathology), 고지질혈증 및 고혈당증으로부터 보호된다. (a) 1, 4, 6, 및 10주 동안 HFMCD 식단에 있는 마우스에서의 간 Il-11, Gapdh, p-Erk 및 Erk의 웨스턴 블롯이다. 10주의 HFMCD 식단 후 Il11ra +/+ (WT) 및 Il11ra -/- (KO) 마우스의 간에서 (b) 간의 대표적인 마손 삼색(Masson's Trichrome) 이미지(척도 막대, 100 μm), (c) 간 트리글리세라이드, (d) 혈청 ALT, 및 (e) 전염증성 mRNA 발현의 수준이다(n≥5/그룹). (f-n) 16주 동안 WDF에 대한 WT 및 KO 마우스에 대한 데이터이다. (f) 간 Il-11 및 Gapdh의 웨스턴 블롯이다. (g) 간 전염증성 마커의 상대 mRNA 발현 수준, (h) 혈청 ALT 수준, (i) 상대 간 하이드록시프롤린 함량(n≥4/그룹)이다. (j) 간의 대표적인 마손 삼색 이미지(척도 막대, 100 μm)이다. (k) 간 Erk 활성화 상태의 의 웨스턴 블롯, (l) 공복 혈액 글루코스, (m) 혈청 트리글리세라이드 및 (n) 혈청 콜레스테롤 수준(n≥3/그룹)이다. (c-e, g-i) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시되며; (L-N) 데이터는 평균 ± s.d로서 표시되고, 점선은 NC에 대한 WT의 평균 값을 나타내며; 시닥-교정 스튜던츠 t-검정(Sidak-corrected Student's t-test)이다. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍; WDF: 서구 식단+15%(w/v) 프룩토스.
도 19a 내지 도 19j. 항-IL-11 치료법은 HSC-로부터-근섬유아세포로의 형질전환을 ERK 의존적 방식으로 저해하고 선호할 만한 대사 안전성 프로파일을 갖는다. (a) TGFβ1-자극 HSC에 의한 MMP2 분비를 저해하는 데 있어서 X203과 X209 및 (61 pg/ml 내지 4 μg/ml; 4-배 희석)의 용량-반응 곡선 및 IC50 값이다. (b) 다양한 NASH 인자로 자극된 HSC로부터 IL-11 분비의 ELISA(n≥5/그룹). (c) IgG, X203, 또는 X209의 존재 하에 TGFβ1 및 다른 NASH 인자로 처리된 HSC로부터 ACTA2+ve 세포의 대표적인 형광 이미지 및 정량화이다(척도 막대, 100 μm이고 점선은 기준선의 중앙값을 나타냄). (d) PDGF-유도 또는 CCL2-유도 HSC 침범에 미치는 X203 및 X209의 효과이다. (e) HSC 용해물 자극된 IL-11(상단 패널)에서 또는 IgG 또는 X209의 존재 하에 다양한 NASH 인자와 함께(하단 패널) p-ERK 및 ERK의 웨스턴 블롯이다. (f) ERK/MEK 저해제 U0126 또는 PD98059의 존재 하에 IL-11 및 중요한 NASH 인자로 처리된 HSC에서 ACTA2+ve 세포의 대표적인 형광 이미지 및 정량화이다(척도 막대, 100 μm이고 점선은 기준선의 중앙값을 나타냄). (a-f) TGFβ1(5 ng/ml), IL-11(5 ng/ml), PDGF(20 ng/ml), AngII(100 nM), bFGF(10 ng/ml), CCL2(5 ng/ml), H202(0.2 mM), IgG, X203 및 X209(2 μg/ml), U0126 또는 PD98059(10 μM); (a,c,e-f) 24 h; (b,d) 48 h. 5개월 동안 10 mg/kg의 X203 및 X209로 격주로 주사된 마우스로부터의 (g) 말초 혈소판 카운트, (h) 혈청 ALT 수준, (i), 혈청 트리글리세라이드 수준, 및 (j) 혈청 콜레스테롤 수준이다(n≥5/그룹). (b, d) 데이터는 평균± s.d로서 도시된다; (c, f, g-j) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다. (b, d, g-j) 양측 던넷 검정; (c, f) 양측, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정. FC: 배수 변화.
도 20a 내지 도 20n. Il-11의 치료적 표적화는 전임상 모델에서 NASH 병상을 저해하고 역전시킨다. (a) (b-e)에서 도시된 실험에 대해 HFMCD-사육 마우스에서 X203 및 X209(10 mg/kg, 격주)의 치료적 용도를 도시하는 개략도이다. X203, X209 또는 IgG 이소타입 대조군은 HFMCD 식단의 제6주로부터 제10주까지 투여되었다. (b) 대표적인 간 조직학적 이미지(마손 삼색 염색; 척도 막대, 100 μm), (c) 상대 간 하이드록시프롤린 함량, (d) 상대 간 전염증성 mRNA 발현 수준(n≥6/그룹) 및 (e) 혈청 ALT 수준. (f) 간 Erk 활성화 상태의 웨스턴 블롯. (g) h-n에서 도시된 실험에 대해 MCD-사육 db/db 마우스에게 X203 또는 IgG 투여의 개략도이다. 간 (h) Il-11 및 Gapdh, (i) p-Erk 및 Erk의 웨스턴 블롯이다. (j) X203 또는 IgG-치료 MCD-사육 db/db 마우스로부터 간의 대표적인 마손 삼색 이미지이다(척도 막대, 100 μm). (k) 간 트리글리세라이드, (l) 상대 간 하이드록시프롤린, (m) 혈청 ALT, 및 (n) 간 전염증성 마커의 mRNA 발현의 수준이다(n≥5/그룹). (c-e, k-n) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다; 양측, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍; MCD: 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 21a 내지 도 21l. Il-11 신호전달의 저해는 전임상 모델 및 HSC-로부터-근섬유아세포로의 형질전환에서 NASH 병상을 역전시킨다. (a) (b-g)에서 도시된 데이터에 대한 NASH 역전 실험에서 치료적 투약 요법을 도시하는 개략도이다. 마우스는 16주 동안 WDF로 사육되어 NASH를 유도한 다음, (10 mg/kg) X209 또는 IgG로 8주 동안 치료되었으며, 한편 이러한 마우스는 계속적인 WDF 사육에 있었다. NC 및 IgG-치료 및 X209-치료 WDF에 있는 마우스에서 (b) 총 간 하이드록시프롤린 함량, (c) 간 트리글리세라이드, (d) 혈청 ALT, (e), 공복 혈액 글루코스, (f) 혈청 트리글리세라이드, 및 (g) 혈청 콜레스테롤의 수준이다(n≥5/그룹). (H) 마우스를 HFMCD로 10주 동안 사육한 다음 이를 NC로 대체하고 항체(X203 및 X209) 치료법을 개시함으로써 섬유증이 확립된 역전 실험을 도시하는 개략도이다. 마우스는 지시된 시점에서 안락사되었다. (i) 총 간 하이드록시프롤린 함량(점선은 NC=0.93의 평균 값을 나타냄) 및 (j) 동시병행(concurrent) 대사적 개입(metabolic intervention)(식단 스위치) 및 X203, X209, 또는 IgG 치료 후 1주, 3주, 6주째에 Mmp2 /Timp1의 상대 mRNA 발현이다(n≥3/그룹). X203, X209, 또는 IgG의 첨가 전에 또는 후에 (k) TGFβ1과 함께 또는 (l) PDGF와 함께 인큐베이션 후 ACTA2+ve 면역염색(척도 막대, 200 μm)의 정량화이다(n=5/그룹). (k-l) TGFβ1(5 ng/ml), PDGF(20 ng/ml), IgG, X203 및 X209(2 μg/ml). (b-g, k-l) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다; (i) 데이터는 평균 ± s.d로서 도시되며; (j) 데이터는 선(line) 챠트(평균)로서 나타나고 투명(transparency)은 s.d.를 나타낸다. (b) 양측 스튜던츠 t-검정 (c-g, k-l) 양측, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정; (i-j) 양측 ANOVA. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; WDF: 서구 식단+15%(w/v) 프룩토스; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 22a 내지 도 22k. Il-11 신호전달의 중화는 초기 NASH에서 간 상해를 역전시킨다. (a) 지시된 시점에 대해 NC 또는 HFMCD 식단으로 사육된 마우스로부터 섬유증 및 염증 마커의 상대 간 mRNA 발현이다. (b) HFMCD 식단 NASH 모델에서 초기에 항-IL-11 치료법 실험의 개략도이다. 항체 치료는 X209, X203, 또는 IgG(10 mg/kg, 격주)가 5주 동안 복강내로 투여되었을 때 NASH 식단의 시작 후 1주일째에 시작되었다. (c-g) 도 21b에 도시된 바와 같은 실험에 대한 데이터이다. 5주의 IgG 또는 X209 치료 후 (c) 대표적인 전체 간 이미지 및 (d) 간의 마손 삼색 염색된 이미지이다(척도 막대, 100 μm). (e) 간 트리글리세라이드 수준(n≥5/그룹), (f) X209-치료 및 IgG-치료 마우스의 간 하이드록시프롤린 함량(n≥5/그룹), (g) 혈청 ALT 수준(n≥5/그룹)이다. (h) 간세포에서 IL6R 및 IL11RA 발현의 면역형광 이미지이다(척도 막대, 100 μm). (i) 간세포 상층액에서 ALT에 미치는 IL-11 및 (j) 간세포에서 스트레스 섬유 형성(로다민-팔로이딘 염색)에 대한 용량-의존적 효과이다(척도 막대, 200 μm). (k) IL-11 단백질은 TGFβ1(5 ng/ml)로 자극된 1차 인간 간세포로부터 분비된다; 24 h. (b) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다; (f-g, i, k) 데이터는 평균 ± s.d로서 도시된다. (e) 터키-교정된 스튜던츠 t-검정; (f, g) 양측 ANOVA; (i, k) 양측 던넷 검정. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 23a 내지 도 23g. 항-IL11RA 치료법은 면역 세포 활성화를 저해하는 한편 정상적인 간 프로파일을 향해 NASH의 분자 시그너처(signature)를 역전시킨다. (a-g) 도 22b에 대해 도시된 바와 같은 실험에 대한 데이터이다. (a) 6B에 도시된 시간에 대한 IgG, X203 또는 X209 항체의 존재 하에 NC 또는 HFMCD에서 마우스에서 간 유전자 발현의 주성분 분석(PCA: principal component analysis)이다. 화살표는 정상적인 유전자 발현(NC)으로부터 NASH(HFMCD+IgG)에서 가장 동요된(perturbed) 유전자 발현으로의, 중간으로 회복된 유전자 발현(HFMCD+Abs (3w))으로의, 정규화된 유전자 발현(HFMCD+Abs(6w))으로의 이행을 도시한다. (b) 섬유증-촉진 및 전염증성 유전자 발현 히트맵(heatmap)(척도화된(scaled) 백만개당 전사체, TPM(Transcripts Per Million)). (c) qPCR에 의한 Tnf , Ccl2, 및 Ccl5 mRNA 발현(n≥5/그룹). (d) 간 CD45+ve 면역 세포 수, (e) 총 CD45+ve 집단 내 Ly6C+ve TGFβ1+ve 세포, (f) Ly6C+ve TGFβ1+ve 세포를 검출하는 데 사용되는 게이팅(gating) 전략을 예시하는 대표적인 거짓컬러(pseudocolor) 플롯(n≥4/그룹). (g) 혈청 TGFβ 수준(n≥5/그룹). (c-e, g) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다. (c, g) 양측, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정; (d-e) 양측 스튜던츠 t-검정. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 24a 내지 도 24k. HSC는 IL-11을 분비하고 이에 반응하며, 마우스에게의 IL-11 주사는 간 섬유증을 야기한다. (a) TGFβ1 자극 후 HSC에서의 RNA 발현에서 게놈-와이드 변화이다(n=3, RNAseq). (b) 인간 HSC(RNA-seq14)에서의 강성(stiffness)-유도 RNA 상향조절이며, 유전자는 킬로염기 백만개당 단편(FPKM: fragments per kilobase million)에 따라 순위가 매겨지며, IL-11 상향조절은 가장 고도로 상향조절된 유전자 게놈 와이드이다. (c) 인간 심장 섬유아세포(HCF), 인간 폐 섬유아세포(HLF), 및 인간 HSC에서의 IL11RA 전사체이다. 알코올성 간 질환(ALD), 원발성 경화성 담관염(PSC), 원발성 담즙성 간경변증(PBC: primary biliary cirrhosis), 및 비-알코올성 지방간염(NASH)을 앓고 있는 환자의 인간 간 시료에서 IL-11 및 GAPDH의 (d) 웨스턴 블롯 및 (e) 밀도측정(densitometry)이다. 자극 없이(-), TGFβ1, PDGF, 또는 IL-11과 함께 인큐베이션 후 (f) ACTA2+ve 세포 및 (g) 콜라겐 I 면역염색에 대한 자동화된 형광 정량화이다. (h) ELISA에 의한, 자극 없이(-), TGFβ1 또는 IL-11과 함께 HSC 상층액에서 MMP-2 농도이다. (a, f-h) TGFβ1 및 IL-11(5 ng/ml), PDGF(20 ng/ml); 24 h 자극. (i) 대표적인(척도 막대, 100 μm) 및 (j) 식염수 또는 rmIl-11로 주사된 마우스로부터의 간 절편의 마손 삼색 염색 이미지의 정량화이다. (k) rmIl-11 또는 식염수로 매일 주사된 Col1a1-GFP 마우스의 개략도 및 대표적인 형광 이미지 GFP+ve 세포이다. 절편은 Acta2에 대해 면역염색되고 DAPI로 대조염색되었다(척도 막대, 200 μm). (c, f-g) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다; (e, h, j) 데이터는 평균 ± s.d로서 표시된다. (f-h) 양측 던넷 검정; (j) 양측 스튜던츠 t-검정. FC: 배수 변화; TPM: 백만개당 전사체.
도 25a 내지 도 25i. Il-11 신호전달의 유전적 저해는 HFMCD-유도 NASH 병상으로부터 마우스를 보호한다. 간 (a) Il-11 mRNA 및 (b) Il-11 단백질 수준에 미치는 NC 식단과 비교하여 16주의 HFMCD 식단의 효과이다. (a-b) RNA 및 단백질은 동일한 마우스로부터 추출되었다(n=5/그룹). (c) 상대 간 하이드록시프롤린 함량 및 (d) 1, 4, 6, 또는 10주 동안 NC 또는 HFMCD 식단으로 사육된 마우스로부터의 혈청 ALT 수준이다(n≥5/그룹). (e-i) 10주의 HFMCD 식단 후 Il11ra +/+ (WT) 및 Il11ra -/- (KO) 마우스에 대한 데이터이다. 간의 (e) 상대 간 하이드록시프롤린 함량, (f) 대표(척도 막대, 100 μm) 및 (g) 마손 삼색 염색 이미지의 정량화이다. (h) Acta2, Col1a1, Col1a2, 및 Col3a1의 상대 간 mRNA 발현 수준이다(n≥5/그룹). (i) 10주의 NC 및 HFMCD 식단 후 인산화된 Erk 및 총 Erk의 웨스턴 블롯이다. (a, e, h) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다; (c-d, g) 데이터는 평균 ± s.d로서 표시된다. (a, g) 양측 스튜던츠 t-검정; (c-d) 양측 ANOVA; (e, h), 시닥-교정 스튜던츠 t-검정. (c) NC 및 HFMCD 6주의 값은 도 20c에서 사용된 것과 동일하며; NC 및 HFMCD 1주의 값은 도 22f에서 사용된 것과 동일하다. (d) HFMCD 6주의 값은 도 20d에서 사용된 것과 동일하며; NC 및 HFMCD 1주의 값은 도 22g에서 사용된 것과 동일하다. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 26a 내지 도 26e. Il-11 신호전달의 유전적 저해는 WDF-유도 NASH 병상으로부터 마우스를 보호한다. (a) Il11ra +/+ (WT) 및 Il11ra -/- (KO) 마우스의 체중(n≥6/그룹)에 미치는 16주의 WDF의 효과이다. (b) 간 트리글리세라이드 수준, (c) 대표(척도 막대, 100 μm) 및 (d) 간의 마손 삼색 염색 이미지의 정량화, (e) 16주의 NC 및 WDF 후 WT 및 KO 마우스의 전-섬유증(pro-fibrosis) 유전자에 대한 상대 간 mRNA 발현 수준(n≥5/그룹)이다. (a, d) 데이터는 평균 ± s.d로서 도시된다, 양측 스튜던츠 t-검정; (b, e) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다, 시닥-교정 스튜던츠 t-검정. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; WDF: 서구 식단+15%(w/v) 프룩토스.
도 27a 내지 도 27f. 중화성 항-IL-11RA 단일클론 항체의 발달이다. (a) 정제된 마우스 단일클론 항-IL11RA 후보(6 μg ml-1)와 함께 TGFβ1-(상단), 하이퍼IL-11-(중간) 자극된 인간 심방 섬유아세포 및 TGFβ1-(하단) 자극된 마우스 심방 섬유아세포의 ACTA2+ve 세포 형질전환의 저해이다. (b) SPR(1:1 Langmuir)에 의해 결정된 바와 같이 IL11RA와의 X209 상호작용이다. (c) 마우스(n=5)에서 125I-X209의 혈액 약물동력학이다. 결과는 2-상 지수 붕괴(two-phase exponential decay) 모델로 적합화되었다(fit)(R2=0.92). (d) 안와(retro-orbital) 주사 후 지시된 시점에서 간(n=5)에 의한 125I-X209 흡수의 백분율이다. (e-f) (e) IgG 대조군, X203, 또는 X209의 존재 하에 또는 (f) MEK/ERK 저해제(U0126 또는 PD98059)의 존재 하에 다양한 NASH 인자로 치료된 HSC의 콜라겐 1 면역염색의 대표적인 형광 이미지(척도 막대, 100 μm) 및 정량화이다. (a, e-f) TGFβ1(5 ng/ml), IL-11(5 ng/ml), PDGF(20 ng/ml), AngII(100 nM), bFGF(10 ng/ml), CCL2(5 ng/ml), H202(0.2 mM), IgG, X203 및 X209(2 μg/ml), U0126 또는 PD98059(10 μM); 24 h 자극. (c-d) 데이터는 평균 + s.d로서 표시되며; (e-f) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시되고, 점선은 기준선 값의 평균을 나타내며, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정이다. FC: 배수 변화; I/A: 강도/면적.
도 28a 내지 도 28f. 중화성 항-IL-11 및 항-IL11RA 항체는 HFMCD-유도 및 WDF-유도 NASH 병상을 저해한다. (a-d) 도 20a에 도시된 바와 같이 HFMCD-사육 마우스에서 X203 및 X209의 치료적 용도에 대한 데이터이다. (a) 간 절편의 마손 삼색 염색의 정량화이다(점선은 평균 NC 값을 나타냄). (b) 섬유증 유전자의 상대 간 mRNA 발현 수준 및 (c) 간 트리글리세라이드 함량(n≥5/그룹)이다. (d) HFMCD 식단에서 NC, IgG-치료 및 X203-치료 마우스(10 mg/kg, 격주)로부터의 간 ERK 활성화의 웨스턴 블롯이다. (e) 간 절편의 마손 삼색 염색의 정량화이며, 점선은 12 주령 db/db(도 20g 참조)로부터의 지방증 간의 평균 값을 나타내고, (f) 개략도에 도시된 바와 같이 IgG 또는 X203으로 주사된 지방증 및 MCD-사육 db/db 마우스의 간에서 상대 섬유증-촉진 mRNA 발현 수준이다(도 20g, n≥5/그룹). (a, e) 데이터는 평균 ± s.d.로서 표시된다; (b-c, f) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다. (a-c, e-f) 양측, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍; MCD: 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 29a 내지 도 29e. 중화성 항-IL11RA 치료법은 WDF-유도 NASH 병상을 역전시킨다. (a-b) 개략도에 도시된 바와 같이 WDF 식단에 있는 마우스에서 항-IL-11RA 치료적 개입에 대한 데이터이다(도 21a). WDF에서의 마우스는, 제16주로부터 시작하여 희생 시(제24주)까지 8주 동안 격주 IgG 또는 X209(10 mg/kg) 치료를 받았다. (a) 24주 동안 NC 또는 WDF에서 마우스로부터의 간에서 p-Erk 및 Erk의 웨스턴 블롯이다. (b) 격월 체중 측정이다(n≥4/그룹). 16주 동안 WDF(좌측), 24주 동안 제16-24주 IgG 주사(중간), 및 24주 동안 제16-24주 X209 치료(우측)에서 마우스로부터 (c) 대표(척도 막대, 100 μm) 및 (d) 간의 마손 삼색 염색 이미지의 정량화이며, 점선은 NC의 평균 값을 나타낸다. (e) 전염증 유전자의 상대 간 mRNA 발현 수준이다(n≥5/그룹). (b, d) 데이터는 평균 ± s.d로서 도시된다; (e) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다. (d, e) 양측, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정.
도 30a 내지 도 30g. 중화성 항 IL-11 또는 항-IL11RA 항체는 HFMCD-유도 간 섬유증 및 HSC-로부터-근섬유아세포로의 형질전환을 역전시킨다. (a-d) 5G(HFMCD 역전 실험)에 도시된 바와 같이 1, 3, 또는 6주 동안 IgG, X203, 또는 X209로 치료된 마우스로부터의 데이터이다. (a) 간 ERK 활성화 상태의 웨스턴 블롯이다. 6주 동안 IgG, X203, 또는 X209로 치료된 마우스로부터의 (b) 대표(척도 막대, 100 μm) 및 (c) 간의 정량화 마손 삼색 염색이다. (d-g) 도 21k 내지 도 21l에 도시된 바와 같이 HSC 형질전환 실험으로부터의 데이터이다; TGFβ1(5 ng/ml), PDGF(20 ng/ml), IgG, X203, 및 X209(2 μg/ml). (d) X203, X209, 또는 IgG의 첨가 전에 또는 후에 TGFβ1과 함께 또는 PDGF와 함께 인큐베이션 후 ACTA2+ve 면역염색의 대표적인 형광 이미지(척도 막대, 200 μm)이다. IgG, X203, 또는 X209의 첨가 전에 또는 후에 (e) TGFβ1 또는 (f) PDGF로 자극된 HSC에 의해 분비되는 콜라겐의 양이다(n=5/그룹). (g) TGFβ1-치료 HSC에서 X203 및 X209 치료 후 ERK 활성화 상태의 웨스턴 블롯이다. (c) 데이터는 평균 ± s.d로서 도시되며; (e-f) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다. (c, e-f) 양측, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 31a 내지 도 31h. 중화성 항-IL-11 및 항-IL11RA 항체는 HFMCD-사육 마우스를 간 섬유증 및 염증으로부터 보호한다. (a) ELISA에 의한, IgG, X203, 또는 X209의 존재 하에 자극 없이(-), IL-11과 함께, 또는 TGFβ1과 함께 HSC(n=4/그룹)의 상층액에서 CCL2이다; IL-11(5 ng ml-1), TGFβ1(5 ng ml-1), IgG, X203, 및 X209(2 μg ml-1). (b-i) 도 22b에 도시된 바와 같이 치료적 투약 실험에 대한 데이터이다. 5주의 초기 X203 및 X209 치료 후 (b) 대표적인 전체 간 이미지, (c) 간 ERK 활성화 상태의 웨스턴 블롯, (d) 대표(척도 막대, 100 μm) 및 (e) 간의 마손 삼색 염색된 이미지의 정량화이다. (f) 간 하이드록시프롤린 함량(NC 및 HFMCD 1주 식단의 값은 도 25c에 사용된 것과 동일하며, IgG 3주 및 6주는 도 22f에서 사용된 것과 동일함, n≥5/그룹), (g) qPCR에 의한, 5주의 X203 및 X209의 치료 후 간에서 섬유증 마커의 상대 RNA 발현 수준이며, 이는 RNA-seq로부터의 데이터를 확인시켜 주고(Col1a1, Col1a2, Col3a1, 및 Acta2에 대한 NC 6주의 값은 도 28d에서 도시된 것과 동일함, n≥5/그룹), 및 (h) 혈청 ALT 수준(NC 및 HFMCD 1주의 값은 도 25d에 사용된 것과 동일하며, IgG 3주 및 6주(각각 2주 및 5주 치료)의 값은 도 22g에 사용된 것과 동일함, n≥5/그룹)이다. (a, e-f, h) 데이터는 평균 ± s.d로서 표시되며; (g) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(휘스커)와 함께 박스-및-휘스커로서 도시된다. (a, e, g) 양측, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정; (f, h) 양측 ANOVA. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 32a 내지 32d. 중화성 항-IL-11 또는 항-IL11RA 항체는 정상적인 간 프로파일을 향해 NASH의 분자 시그너처를 역전시킨다. (a-d) 도 22a에 도시된 바와 같이 초기 치료적 투약 실험에 대한 RNA-seq 및 유전자 설정 농화 분석에 대한 데이터이다(n=3/그룹). (a-b) IgG와 (a) X209 또는 (b) X203 치료 사이에서 통계학적으로 차별적으로 발현된 모든 유전자에 대한 시료에 걸쳐 유전자 발현 수준(척도화된 백만개당 전사체 맵핑된 판독물, TPM)을 도시하는 히트맵이다. NC에서 프로파일과 함께 항-IL-11 치료 클러스터에 대한 발현 프로파일로서, 이는 HFMCD 식단의 전사적 효과의 거의 완전한 역전을 시사한다. (c) 지방형성 및 β-산화 유전자 발현 히트맵으로서, X203보다 X209가 더 많이 IgG와 비교하여 간 지질 대사를 향상시켰음을 보여준다. (d) 6주의 NC 또는 HFMCD 식단 및 항체 치료법 후 차별적으로 발현된 유전자에 대한 유전자 세트 농화 분석(GSEA)의 결과를 도시하는 버블맵(bubblemap)이다. 각각의 도트(dot)는, 각각 색상 및 크기에 의해 요약된 유전자 세트에 대한 정규화된 농화 점수(NES) 및 이의 FDR-교정 유의성 수준를 나타낸다. 농화 시험에 대한 유전자 세트는 MSigDB에서 "H - 홀마크(Hallmark)" 컬렉션으로부터 선택되었다. FC: 배수 변화; NC: 정상 사료; HFMCD: 고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍.
도 33a 내지 도 33k. 1차 인간 간세포에서 IL-11 및 IL-6에 대한 수용체의 발현 및 IL-11 및 IL-6 신호화의 효과에 관한 산점도, 박스 플롯 히스토그램 및 이미지이다. (a) 간세포 상에서 IL11RA, IL6R 및 gp130 염색의 대표적인 유세포분석 포워드 스캐터(FSC) 및 형광 강도 플롯이다. (b) RNA-seq(좌측) 및 리보-seq(우측)에 기초한 기부(basal)에서 간세포에서 IL11RA1 및 IL6R 판독의 존재비(abundance)이다(백만개당 전사체, TPM: 백만개당 전사체). (c 및 d) 인간 간세포(n=3)의 RNA-seq 및 리보-seq에 기초한 (c) IL11RA1 및 (d) IL6R 전사체의 판독 커버리지이다. (e 및 f)(e) ERK, JNK 및 STAT3 활성화 상태를 도시하는 웨스턴 블롯 및 (f) 용량 범위에 걸친 하이퍼IL11 또는 하이퍼IL6의 자극 후 간세포에 의한 ALT 분비이다. (g) 하이퍼IL11 단독으로 또는 증가하는 양의 가용성 gp130(sgp130)의 존재 하에 자극된 간세포의 상층액 내 ALT 수준이다. (h 및 i)(h) 단독으로 또는 sgp130과 함께 하이퍼IL11 자극에 반응하여 인산화된 ERK 및 JNK 및 이의 각각의 총 발현, 및 (i) sgp130과 함께 그리고 sgp130 없이 하이퍼IL6 자극에 반응하여 인산화된 STAT3 및 총 STAT3를 도시하는 간세포의 웨스턴 블롯이다. (j) sgp130 또는 가용성 IL11RA(sIL11RA)의 존재 하에 IL11-자극된 간세포의 프로피디움 요오다이드(PI) 염색의 대표적인 FSC 플롯이다. (k) 단독으로 또는 sgp130 또는 sIL11RA의 존재 하에 IL11 자극에 반응하여 간세포에서 p-ERK, p-JNK 및 이의 각각의 총 발현을 도시하는 웨스턴 블롯이다. (a 내지 k) 1차 인간 간세포; (e 내지 k) 24시간 자극; (e 내지 k) 하이퍼IL11, 하이퍼IL6, IL11(20 ng/ml), sgp130, sIL11RA(1 μg/ml)이다. (b, f 내지 g) 데이터는 중앙값을 갖는 박스-및-휘스커(중앙선), 25-75분위(박스), 및 최소-최대 값(휘스커)으로서 도시된다.
도 34a 내지 도 34k. 지질 적재(laden) 간세포가 IL11을 분비함을 보여주는 그래프, 산점도, 및 이미지이며, 이는 자가분비 IL11 cis-신호화를 통해 다수의 지질독성 표현형을 유도한다. (a-k) IgG(2 μg/ml), 항-IL11RA(X209, 2 μg/ml), 또는 sgp130(1 μg/ml)의 존재 하에 1차 인간 간세포에서 팔미테이트 로딩 실험에 대한 데이터이다. 상층액의 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 (a) IL11, (b) IL6, (c) CCL2, 및 (d) CCL5 단백질 분비 수준이다. (e 및 f) 팔미테이트로 자극된 PI+ve 간세포의 (e) 대표적인 FSC 플롯 및 (f) 정량화이다. (g) 상층액 내 ALT 수준이다. (h) 간세포 글루타티온(GSH) 수준이다. (i) DCFDA 염색의 대표적인 형광 이미지(ROS 검출; 척도 막대, 100 μm). (j) pERK, ERk, pJNK, JNK, 절단된 카스파제3, 카스파제3, NOX4, FASN 및 GAPDH의 웨스턴 블롯이며, (k) 오일 레드 O 염색의 대표적인 이미지이다(척도 막대, 100 μm). (a-d, f-h) 평균±SD; 터키-교정된 스튜던츠 t-검정.
도 35a 내지 도 35p. IL6 계열 사이토카인 trans-신호화의 저해가 프룩토스가 보충된 서구 식단에 있는 마우스에서 NASH 또는 대사 표현형에 아무런 효과를 갖지 않음을 보여주는 개략도, 이미지, 및 박스 플롯이다. (a) (b-p)에 도시된 데이터에 대한 sgp130의 간세포-특이적 발현을 갖는 마우스에서 WDF 사육의 개략도이다. AAV8-Alb-무효(Null) 또는 AAV8-Alb-sgp130 바이러스 주사 후 3주째에, 마우스는 16주 동안 WDF로 사육되었다. (b) sgp130, IL11, IL6, 및 GAPDH의 간 수준을 내부 대조군으로서 보여주는 웨스턴 블롯이다. (c) 혈청 IL11 수준. (d) 혈청 IL6 수준. (e) 간의 대표적인 전체 해부학 및 H&E 염색된 이미지이다. (f) 간 중량이다. (g) 간 트리글리세라이드 함량이다. (h) 혈청 ALT 수준이다. (i) 혈청 AST 수준이다. (j) 간 콜라겐 수준이다. (k) 공복 혈액 글루코스 수준이다. (l) 혈청 트리글리세라이드 수준이다. (m) 혈청 콜레스테롤 수준이다. (n) 간 GSH 함량이다. (o) 간 전염증성 및 섬유증 유전자 발현 히트맵이다(값은 도 41d 및 41e에 도시되어 있음). (p) 간 p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-STAT3, 및 STAT3의 웨스턴 블롯이다 (c-n) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커로서 도시되어 있으며, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정이고; 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC 무효, WDF 무효, WDF sgp130.
도 36a 내지 도 36k. IL11 cis-신호화의 간세포-특이적 저해가 HFMCD 식단에 있는 마우스에서 악액질 및 NASH에 대해 보호함을 도시하는 개략도, 이미지, 그래프 및 박스 플롯이다. (a) (b-k)에서 도시된 실험에 대해 AAV8-Alb-Cre 주사된 Il11ra1 loxP/loxP (조건적 넉아웃; CKO) 마우스에 대한 HFMCD 사육 요법의 개략도이다. Il11ra1 loxP/loxP 마우스는 AAV8-Alb-무효 또는 AAV8-Alb-Cre로 정맥내 주사되어, HFMCD 식단의 시작 전 3주째에 간세포에서 Il11ra1을 특이적으로 결실시켰다. (b) 간 IL11RA 및 GAPDH의 웨스턴 블롯이다. (c) 체중(초기 체중의 백분율(%)로서 도시됨)이다. (d) 간의 대표적인 전체 해부학 및 H&E 염색된 이미지이다. (e) 간 트리글리세라이드 함량이다. (f) 혈청 ALT 수준이다. (g) 혈청 AST 수준이다. (h) 간 GSH 함량이다. (i) 간 콜라겐 수준이다. (j) 전염증성 마커(Tnf, Ccl2, Ccl5) 및 섬유증 마커(Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2)의 간 mRNA 발현을 도시하는 히트맵이다. 값은 도 43a 및 도 43b에 도시되어 있다. (k) 간 ERK 및 JNK 활성화 상태를 보여주는 웨스턴 블롯이다. (c) 데이터는 평균 ± SEM, 터키 다중 비교 검정과 함께 양측 ANOVA로서 도시되어 있으며, 통계학적 유의성은 HFMCD WT와 CKO 사이에서 P 값으로 나타나 있고; (e-i) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 시닥-교정 스튜던츠 t-검정으로 나타나 있으며; 좌측으로부터 우측까지 조건은 하기이다: NC WT, NC CKO, HFMCD WT, HFMCD CKO.
도 37a 내지 도 37m. IL11 cis-신호화의 간세포-특이적 저해를 갖는 마우스가 WDF-유도 비만 및 NASH에 대해 보호됨을 도시하는 개략도, 이미지, 그래프 및 박스 플롯이다. (a) (b-m)에서 도시된 데이터에 대한 WDF-사육 대조군 및 CKO 마우스의 개략도이다. AAV8-Alb-무효 또는 AAV8-Alb-Cre 바이러스 주사 후 3주째에, CKO 마우스는 16주 동안 WDF로 사육되었다. (b) IL11RA 및 GAPDH의 간 수준을 보여주는 웨스턴 블롯이다. (c) 체중(초기 체중의 백분율(%)로서 도시됨)이다. (d) 지방 질량이다. (e) 간의 대표적인 전체 해부학 및 H&E 염색된 이미지이다. (f) 간 트리글리세라이드 함량이다. (g) 간 중량이다. (h) 혈청 ALT 수준이다. (i) 혈청 AST 수준이다. (j) 간 GSH 함량이다. (k) 간 콜라겐 수준이다. (l) 히트맵에서 간 전염증성 및 섬유증 유전자 발현이다(값은 도 44a 및 도 44b에서 도시되어 있음). (m) 간 ERK 및 JNK의 활성화 상태를 보여주는 웨스턴 블롯이다. (c 및 d) 데이터는 평균 ± SEM, 터키 다중 비교 검정과 함께 양측 ANOVA로서 도시되어 있으며, 통계학적 유의성은 WDF WT와 CKO 사이에서 P 값으로 나타나 있고; (f-k) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 시닥-교정 스튜던츠 t-검정으로 나타나 있으며; 좌측으로부터 우측까지 조건은 하기이다: NC WT, NC CKO, WDF WT, WDF CKO.
도 38a 내지 도 38n. IL11 trans-신호화가 아니라 간세포-특이적 IL11 cis-신호화가 WDF에 있는 마우스에서 지방간염을 유도함을 도시하는 개략도, 이미지 및 박스 플롯이다. (a) (b-n)에서 도시된 실험에 대해 Il11ra1+/+(WT) 및 Il11ra1-/-(KO) 마우스의 WDF 사육 요법을 도시하는 개략도이다. AAV8-Alb-무효, AAV8-Alb-mbIl11ra1(전장 막-결합된 Il11ra1), 및 AAV8-Alb-sIl11ra1(가용성 형태의 Il11ra1)-주사된 KO 마우스는 바이러스 투여 후 3주째에 16주의 WDF 사육을 받았다. (b) IL11RA 및 GAPDH의 간 수준을 보여주는 웨스턴 블롯이다. (c) 간의 대표적인 전체 해부학 및 H&E 염색된 이미지이다. (d) 간 중량이다. (e) 간 트리글리세라이드 함량이다. (f) 혈청 ALT 수준이다. (g) 혈청 AST 수준이다. (h) 간 GSH 함량이다. (i) 간 콜라겐 함량이다. (j) 간 전염증성 및 섬유증 유전자 발현 히트맵이다(값은 도 45c 및 도 45d에 도시되어 있음). (k) 간 ERK 및 JNK의 활성화 상태를 보여주는 웨스턴 블롯이다. (l) 공복 혈액 글루코스 수준이다. (m) 혈청 트리글리세라이드 수준이다. (n) 혈청 콜레스테롤 수준이다. (d-i, l-n) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정으로 나타나 있으며; 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC 무효 WT, WDF 무효 WT, WDF 무효 KO, WDF mbIl11ra1 KO, WDF sIl11ra1 KO.
도 39. NASH에서 IL11 신호전달의 제안된 기전의 개략도이다. 간세포에서 과도한 지질 축적은, IL11 단백질 번역 및 분비를 촉발하는 반응성 산소종 생성을 유발하는 지방독성을 초래한다. IL11은 간세포 상의 IL11RA 및 gp130에 결합하여, 자가분비 ERK, JNK, 및 카스파제3 활성화를 개시하여 지방세포자멸사를 유발한다. IL11은 또한, 측분비 방식으로 작동하여, 휴지기 간 성상 세포(HSC)의 형질전환을 유도하여, 활성화된 근섬유아세포가 된다. 지질독성 간세포 및 HSC로부터 방출된 사이토카인 및 케모카인은 면역 세포를 활성화시키고 동원하여, 염증을 유발한다. 그러므로, 간세포에서 자가분비 IL11 cis-신호화는 모든 NASH 병상에 대해 중요한 개시 사건이다.
도 40a 내지 도 40i. 1차 인간 간세포에서 IL-11 및 IL-6에 대한 수용체의 발현 및 IL-11 및 IL-6 신호화의 효과에 관한 산점도, 박스 플롯 히스토그램, 이미지 및 그래프이다. (a) 활성화된 THP-1 세포 상에서 IL11RA, IL6R, 및 gp130 염색의 대표적인 FSC 플롯이다. (b) RNA-seq 및 리보-seq(백만개당 전사체, TPM)에 기초한 1차 인간 간세포에서의 gp130 전사체이다. (c) 1차 인간 간세포(n=3)의 RNA-seq 및 리보-seq에 기초하여 gp130 전사체의 판독 커버리지이다. (d) 1차 인간 간세포 및 활성화된 THP-1 세포에서 IL11RA, IL6R, gp130, 및 알부민 발현의 면역형광 이미지(스케일 바, 100 μm)이다. (e) 간세포 배지에서 가용성 IL6R의 기저 수준이다. (f) sgp130 또는 sIL11RA의 존재 하에 IL11-자극된 1차 인간 간세포(PI+ve 세포) 상에서의 PI 염색의 정량화이다. (g) 1차 인간 간세포에 의해 분비되는 ALT 수준에 미치는 1 μg/ml의 sgp130 또는 sIL11RA의 존재 하에 증가하는 농도의 IL11의 용량-의존적 효과이다. (h) IL11-유도 ALT 분비에 미치는 증가하는 농도의 sgp130 또는 sIL11RA의 용량-의존적 효과이다. (i) IgG(2 μg/ml), 항-IL11RA(X209, 2 μg/ml), 또는 sgp130(1 μg/ml)의 존재 하에 팔미테이트 자극 후 간세포 트리글리세라이드 수준이다. (b, g 내지 h) 데이터는 중앙값을 갖는 박스-및-휘스커(중앙선), 25-75분위(박스), 및 최소-최대 값(휘스커)으로서 도시되며; (e 내지 f, i) 데이터는 평균 ± SEM으로서 도시되고; (f 내지 i) 터키-교정된 스튜던츠 t-검정이다. (g) 각각의 농도의 IL-11에 대해 좌측으로부터 우측까지, 나타낸 조건은 하기이다: BL, sgp130, sIL11RA. (h) 각각의 농도의 IL11 + sgp130/IL11RA에 대해, 좌측으로부터 우측까지, 나타낸 조건은 하기이다: sgp130, sIL11RA.
도 41a 내지 도 41e. sgp130 발현이 마우스를 WDF-유도 간 및 비만 표현형으로부터 보호하지 않음을 도시하는 개략도, 박스 플롯 및 그래프이다. (a) gp130 단백질 도메인 구조 및 이의 아미노산 위치(좌측) 및 이 연구에서 sgp130을 작제하는 데 사용되었던 도메인(우측)의 개략도이다. (b-e) 도 35a에 도시된 바와 같은 WDF-sgp130 생체내 실험에 대한 데이터이다. (b) NC-사육 대조군 마우스 및 WDF-사육 AAV8-Alb-무효-주사된 마우스 및 AAV8-Alb-sgp130-주사된 마우스에서의 혈청 gp130 수준이다. (c) AAV8-Alb-무효-주사된 마우스 및 AAV8-Alb-sgp130-주사된 마우스의 체중에 미치는 16주의 WDF의 효과이다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 표시된다. (d 및 e) 도 35o에 도시된 바와 같이 (d) 전염증성 마커(Tnf, Ccl2, Ccl5) 및 (e) 섬유증 마커(Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2)의 간 mRNA 발현이다. (b, d-e) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정으로서 도시되어 있으며; 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC 무효, WDF 무효, WDF sgp130.
도 42a 내지 도 42n. IL6 계열 구성원의 추정상 trans-신호화의 저해가 HFMCD 식단에 있는 마우스에서 NASH 표현형에 어떠한 효과도 갖지 않음을 도시하는 개략도, 이미지 및 박스 플롯이다. (a) (b-n)에 도시된 데이터에 대해 HFMCD 식단에 있는 마우스에서 간세포-특이적 발현을 갖는 마우스의 개략도이다. 마우스는 4주 동안 AAV8-Alb-무효 또는 AAV8-Alb-sgp130으로 정맥내 주사되고 HFMCD로 사육되었다. (b) 내부 대조군으로서 도시된 GAPDH와 함께 sgp130, IL11 및 IL6의 간 수준을 보여주는 웨스턴 블롯이다. (c) 혈청 gp130 수준이다. (d) 혈청 IL11 수준이다. (e) 혈청 IL6 수준이다. (f) 간의 대표적인 전체 해부학 및 H&E 염색된 이미지이다. (g) 간 트리글리세라이드 함량이다. (h) 혈청 ALT 수준이다. (i) 혈청 AST 수준이다. (j) 간 GSH 함량이다. (k) 간 콜라겐 수준이다. (l 및 m) (l) 전염증성 마커(Tnf, Ccl2, Ccl5) 및 (m) 섬유증 마커(Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2)의 간 mRNA 발현이다. (n) 간 p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-STAT3, STAT3의 웨스턴 블롯이다. (c-e, g-m) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정으로 나타나 있으며; 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC 무효, HFMCD 무효, HFMCD sgp130.
도 43a 및 도 43b. Il11ra1의 간세포-특이적 결실을 갖는 마우스가 HFMCD-유도 유전자 조절이상(dysregulation)으로부터 보호됨을 도시하는 박스 플롯이다. (a 및 b) 도 36j에 도시된 바와 같이 NC 및 HFMCD 식단에 있는 대조군 및 CKO 마우스로부터의 (a) 전염증성 마커(Tnf, Ccl2, Ccl5) 및 (b) 섬유증 마커(Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2)의 간 mRNA 발현이다. (a-b) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 시닥-교정 스튜던츠 t-검정으로 나타나 있으며; 각각의 유전자에 대해, 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC WT, NC CKO, HFMCD WT, HFMCD CKO.
도 44a 내지 도 44e. 간세포-특이적 Il11ra1 결실된 마우스가 WDF-유도 NASH 표현형으로부터 보호됨을 도시하는 박스 플롯이다. (a-e) 도 37a에 도시된 바와 같이 NC 및 WDF 식단에 있는 대조군 및 CKO 마우스에 대한 데이터이다. (a 및 b) 도 37l에 도시된 바와 같이 (a) 전염증성 마커(Tnf, Ccl2, Ccl5) 및 (b) 섬유증 마커(Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2)의 간 mRNA 발현이다. (c) 공복 혈액 글루코스 수준이다. (d) 혈청 트리글리세라이드 수준이다. (e) 혈청 콜레스테롤 수준이다. (a-e) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 시닥-교정 스튜던츠 t-검정으로 나타나 있다. (a 및 b) 각각의 유전자에 대해, 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC WT, NC CKO, WDF WT, WDF CKO. (C-E) 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC WT, NC CKO, WDF WT, WDF CKO.
도 45a 내지 도 45d. IL11 trans-신호화가 아니라 간세포-특이적 IL11 cis-신호화가 WDF에 있는 마우스에서 WDF-유도 지방간염을 유도함을 도시하는 개략도 및 박스 플롯이다. (a) 전장 막-결합된 IL11RA 단백질 도메인 및 이의 구조 아미노산 위치(좌측) 및 가용성 IL11RA를 작제하는 데 사용되었던 도메인(우측)의 개략도이다. (b-d) 도 38a에 예시된 바와 같이 AAV8-Alb-무효, AAV8-Alb-mbIl11ra1(전장 막-결합된 Il11ra1) 또는 AAV8-Alb-sIl11ra1(가용성 형태의 Il11ra1)이 주사되었던 Il11ra1+/+ (WT) 마우스 및 Il11ra에 대해 전체적으로 결실된 마우스(Il11ra1-/- ;KO 마우스)에서 WDF 사육 요법의 데이터이다. (b) WDF에 있는 AAV8-Alb-무효 및 AAV8-Alb-sIl11ra1-주사된 KO 마우스에서의 혈청 IL11RA 수준이다. (c 및 d) (c) 전염증성 마커(Tnf, Ccl2, Ccl5) 및 (d) 섬유증 마커(Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2)의 간 mRNA 발현이다. (b-d) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정으로서 나타나 있다. (c 및 d) 각각의 유전자에 대해, 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC 무효 WT, WDF 무효 WT, WDF 무효 KO, WDF mbIl11ra1 KO, WDF sIl11ra1 KO.
도 46a 내지 도 46l. IL11 trans-신호화가 아니라 간세포-특이적 IL11 cis-신호화가 HFMCD에 있는 마우스에서 지방간염을 유도함을 도시하는 개략도, 이미지 및 박스 플롯이다. (a) (b-l)에서 도시된 실험에 대해 HFMCD-사육 WT 및 KO 마우스의 개략도이다. KO 마우스는 AAV8-Alb-무효, AAV8-Alb-mbIl11ra1 또는 AAV8-ALB-sIl11ra1로 정맥내 주사되었으며; WT 마우스는 대조군으로서 AAV8-Alb-무효를 받았다. 바이러스 투여 후 3주째에, 마우스는 4주 동안 HFMCD를 시작하였다. (b) IL11RA 및 GAPDH의 간 수준을 보여주는 웨스턴 블롯이다. (c) 혈청 IL11RA 수준이다. (d) 간의 대표적인 전체 해부학 및 H&E 염색된 이미지이다. (e) 간 트리글리세라이드 함량이다. (f) 혈청 ALT 수준이다. (g) 혈청 AST 수준이다. (h) 간 GSH 수준이다. (i) 간 콜라겐 함량이다. (j 및 k) (j) 전염증성 마커(Tnf, Ccl2, Ccl5) 및 (k) 섬유증 마커(Col1a1, Col1a2, Col3a1, Acta2)의 간 mRNA 발현이다. (l) 간 ERK 및 JNK의 활성화 상태를 보여주는 웨스턴 블롯이다. (c, e-k) 데이터는 중앙값(중간선), 25th-75th 백분위수(박스) 및 최소-최대 값(휘스커)과 함께 박스-및-휘스커, 터키-교정된 스튜던츠 t-검정으로 나타나 있다. (e-i) 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC 무효 WT, HFMCD 무효 WT, HFMCD 무효 KO, HFMCD mbIl11ra1 KO, HFMCD sIl11ra1 KO. (j 및 k) 각각의 유전자에 대해, 좌측으로부터 우측까지 나타낸 조건은 하기이다: NC 무효 WT, HFMCD 무효 WT, HFMCD 무효 KO, HFMCD mbIl11ra1 KO, HFMCD sIl11ra1 KO.
도 47a 및 도 47b. 췌장 성상 세포(PSC)가 IL-6Rα가 아니라 IL-11Rα 및 gp130을 발현함을 보여주는 그래프 및 이미지이다. (a) 마우스 PSC 및 담관(ductal) 세포에서 Il6st(gp130을 인코딩함), Il11ra1 및 Il6ra의 발현의 단일-세포 RNA 시퀀싱 분석이다. (b) 인간 PSC에 의한 gp130, IL11RA 및 IL6RA 단백질의 발현의 면역형광 분석이다.
도 48a 및 도 48b. αSMA-양성, 콜라겐-발현 섬유형성 표현형으로의 췌장 성상 세포(PSC)의 활성화를 보여주는 박스 플롯 및 이미지이다. (a) 중화성 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 이소타입 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에, 지시된 인자와 함께 24시간 동안 PSC의 시험관내 자극 후 ACTA2-양성 세포의 백분율 및 콜라겐 I 강도/면적에 대한 고-함량 이미지화 검정의 정량화이다. (b) 중화성 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 이소타입 대조군 항체의 존재 하에, 지시된 인자와 함께 24시간 동안 PSC의 시험관내 자극 후 콜라겐 I 강도/면적의 고-함량 이미지화 분석에 대한 대표적인 이미지이다.
도 49a 내지 도 49c. IL-11의 유도적, 섬유아세포-특이적 발현을 갖는 유전자이식 마우스에서 생체내에서 췌장 섬유증의 유도에 관한 개략도, 박스 플롯 및 이미지이다. (a) 유전자이식 Col1a2-CreER Rosa26Il11/+(IL11 Tg) 마우스가 섬유아세포에서 IL-11을 발현하도록 타목시펜(tamoxifen)으로 치료에 의해 유도되는 실험의 개략적인 표현이다. (b) 24일 후 대조군 마우스 및 IL11 Tg 마우스의 췌장 조직의 하이드록시프롤린 함량이다. (c) 24일 후 대조군 마우스 및 IL11 Tg 마우스로부터의 췌장 조직의 마손 삼색 염색의 대표적인 이미지이다.
도 50a 내지 도 50c. 췌장 손상의 췌관 결찰(PDL) 모델에서 IL-11 매개 신호화의 길항작용의 효과에 관한 개략도, 박스 플롯 및 이미지이다. (a) 췌장 손상이 PDL에 의해 유도되고, 마우스가 후속적으로 중화성 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 이소타입 대조군 항체로 치료되는 실험의 개략적인 표현이다. (b) 14일에서 중화성 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 이소타입 대조군 항체로 치료된 마우스에 대한 결찰된 엽 중량이다. (c) 14일에서 중화성 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 이소타입 대조군 항체로 치료된 마우스로부터의 췌장 조직의 마손 삼색 염색의 대표적인 이미지이다.
실시예
하기 실시예에서, 본 발명자들은, IL-11-매개 신호화의 저해가 광범위한 대사 질환의 증상의 중증도를 감소시키고 이를 역전시킴을 실증한다.
실시예 1: 실시예 1 내지 4에 대한 일반적인 방법
IL-11-RA-넉아웃 마우스
Il11rα에 대한 기능적 대립유전자가 결여된 마우스(Il11rα-/-)는 C57Bl/6J 유전적 배경(B6.129S1-Il11rαtm1Wehi/J, Jackson's Laboratory)에 있었다.
항-IL-11 또는 항-IL-11Rα 항체를 이용한 치료
마우스에게 10 mg/kg의 길항제 항-IL-11 항체, 길항제 항-IL-11Rα 항체, 또는 동일한 양의 이소타입-매칭된 IgG 대조군 항체를 복강내 주사하였다. 항-IL-11 및 항-IL-11Rα 항체는 마우스 IL-11 및 마우스 IL-11Rα에 각각 결합하고, IL-11 매개 신호화를 저해한다.
구체적으로, 본 실시예에 사용되는 항-IL-11 항체는 마우스 항-마우스 IL-11 IgG X203이며, 이는 예를 들어, 문헌[Ng 등, Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237]에 기재되어 있다(또한 문헌[Ng, 등, "IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis." bioRxiv 336537]; doi: https://doi.org/10.1101/336537에 개시되어 있음). X203은 "Enx203"으로도 지칭되고, WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:92(본 개시내용의 SEQ ID NO:22)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:94(본 개시내용의 SEQ ID NO:23)에 따른 VL 영역을 포함한다.
본 실시예에 사용되는 항-IL-11Rα 항체는 마우스 항-마우스 IL-11Rα IgG X209이고, 이는 예를 들어, 문헌[Widjaja 등, Gastroenterology (2019) 157(3):777-792]에 기재되어 있다(또한 문헌[Widjaja, 등, "IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH." bioRxiv 470062]; doi: https://doi.org/10.1101/470062에 개시되어 있음). X209는 또한, "Enx209"로 지칭되고, WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:7(본 개시내용의 SEQ ID NO:24)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:14(본 개시내용의 SEQ ID NO:25)에 따른 VL 영역을 포함한다.
식단
프룩토스와 함께 서구 식단(WDF)을 사용하여, 비만, T2D 및 NAFLD 동안 인간에서의 것과 근접하게 닮은 대사 장애를 확립하였다(문헌[Baena 등, Sci Rep (2016) 6: 26149], 문헌[Machado 등, PLoS One (2015) 10:e0127991]).
대사 질환, 예컨대 비만 및 T2D를 확립하기 위해, 마우스를 12주령으로부터 16주 동안 식수 중 15% 중량/부피 프룩토스가 보충된 서구 식단(D12079B, Research Diets)(WDF)으로 사육하였다.
고 지방 메티오닌 콜린 결핍 식단(HFMCD)을 사용하여, 악액질-유사 대사 장애를 확립하였다. 악액질 체중 손실 및 제지방 질량 소실을 확립하기 위해, C57BL/6N 마우스를 60 kcal% 지방(A06071301B, Research Diets)으로 보충된 메티오닌 및 콜린 결핍(HFMCD) 식단으로 사육하였다.
대조군 대상체를 정상 사료(NC, Specialty Feeds) 및 식수로 사육하였다.
신체 조성물에 대한 에코 MRI 분석
총 체지방 및 제지방 질량 측정을, 살아 있는 소동물에 대한 4인1(4in1) 신체 조성물 분석기를 사용하여 2주마다 EchoMRI 분석에 의해 수행하였다.
공복 혈액 글루코스 측정
공복 혈액 글루코스 측정을 위해, 마우스를 채혈(꼬리 스닙(tail snip)을 통해) 전 6시간 동안 단식시키고, Accu-Chek 혈액 글루코스 미터(meter)를 사용하여 공복 글루코스 측정을 수득하였다.
복강내 글루코스 내약성 시험(ipGTT)
복강내 글루코스 내약성 시험을 위해, ipGTT를 받기 전 6시간 동안 마우스를 단식시켰다. 기초 공복 글루코스를 꼬리 스닙에 의해 Accu-Chek 혈액 글루코스 미터를 사용하여 측정하였다. 2 g/kg 제지방 질량 글루코스를 복강내로 주사하고, 글루코스 측정을 2시간 동안 15분마다 수행하였다. 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하고, 막대 그래프로서 플롯화하였다.
랑게르한스섬, 글루카곤 및 인슐린에 대한 췌장의 조직학
조직학적 분석을 위해, 췌장 시료를 절제하고, 4% 중성-완충 포르말린(NBF)에서 RT에서 24시간 동안 고정하고, 30% 수크로스에 저장하였다. 5 μm 동결절편을 글루카곤 또는 인슐린 항체로 밤새 염색하고, ImmPACT DAB 퍼옥시다제 기질(Vector Laboratories)과 함께 ImmPRESS HRP IgG 중합체 검출 키트(Vector Laboratories)로 표준 프로토콜에 따라 시각화하고, 광(light) 현미경에 의해 검사하였다.
실시예 2: 비만-관련 장애에서 IL-11-매개 신호화의 길항작용
비만 및 관련 장애, 예컨대 T2D에 미치는 IL-11-매개 신호화의 길항작용의 효과를 조사하기 위해, IL-11 수용체 알파 넉아웃(IL11-RA-/-) 마우스를 사용하여 또는 길항제 항-마우스 IL-11 항체 또는 길항제 항-마우스 IL11-RA 항체를 이용한 마우스의 치료에 의해 이러한 대사 질환의 식단-유도 마우스 모델을 사용하여 생체내 실험을 수행하였다.
정상 사료 식단(NCD) 또는 WDF로 사육된 IL11RA 넉아웃 마우스는 야생형 IL11RA-발현 한배새끼(littermate)와 비교하여 향상된 대사적 표현형을 나타내었다.
도 1a 및 도 1b는, 체중이 IL11RA 넉아웃 마우스에 대해서보다 야생형 마우스에 대해 더 증가하였음을 도시한다. 도 2a 및 도 2b는, IL11RA 넉아웃 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 유의하게 더 낮은 총 체지방 질량을 가졌음을 도시한다. 도 3은, IL11RA 넉아웃 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 유의하게 더 낮은 공복 혈액 글루코스 수준을 가졌음을 도시한다. 도 4는, IL11RA 넉아웃 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 유의하게 더 낮은 혈청 트리글리세라이드 수준을 가졌음을 도시한다. 도 5a 및 도 5b는, IL11RA 넉아웃 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 유의하게 더 낮은 혈청 콜레스테롤 수준을 가졌음을 도시한다.
결과는, IL-11 매개 신호화의 감소가 대사에서 유익한 효과를 가짐을 시사하였다.
본 발명자들은 다음으로, WDF로 사육된 마우스에 미치는 길항제 항-IL-11RA 항체 또는 대조군 IgG 항체의 효과를 조사하였다.
놀랍게도, WDF로 사육된 항-IL-11RA 항체-치료 마우스는, WDF로 사육된 대조군 IgG 항체-치료 마우스와 비교하여 체중에서 유의한 감소를 나타내었다(도 6a). IL11RA KO 마우스와 유사하게(도 3), 이러한 항-IL-11RA 항체-치료 마우스는 또한 유의하게 감소된 지방 질량을 보여주었다(도 6b).
흥미롭게도, 제지방 질량의 증가 또한, IgG 대조군-치료 마우스와 비교하여 항-IL-11RA 항체로 치료된 마우스에서 관찰되었으며, 이는 WDF-유도 대사적 발병 동안 IL-11 신호전달의 저해가 근육 질량을 회복시켰음을 시사한다. 더욱이, 복강내 글루코스 내약성 시험(ipGTT) 결과는, 공복 글루코스와 더불어, 항-IL-11RA 항체로 치료된 마우스에서 글루코스 내약성에서 유의한 향상을 보여주었다(도 7a 및 도 7b).
분석을 췌장에 미치는 효과까지 확장시켰다. WDF로 사육된 항-IL-11RA 항체-치료 마우스는 예상치 못하게도, 8주 내지 16주로 치료되었든 간에(대사 질환과 관련된 효과로부터 보호하기 위해) 또는 16주 내지 24주로 치료되었든 간에(대사 질환과 관련에 효과를 역전시키기 위해) IgG 대조군-치료 마우스와 비교하여 췌장의 WDF-유도 소실에 대하여 두드러질 만한 보호를 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 8).
도 9a는, WDF로 사육된 항-IL-11RA 항체-치료 마우스가 WDF로 사육된 대조군 IgG 항체-치료 마우스와 비교하여 유의하게 더 낮은 혈청 콜레스테롤 수준을 가졌음을 도시하며, 도 9b는, WDF로 사육된 항-IL-11RA 항체-치료 마우스가 WDF로 사육된 대조군 IgG 항체-치료 마우스와 비교하여 유의하게 더 낮은 혈청 트리글리세라이드 수준을 가졌음을 도시한다. 도 9c는, WDF로 사육된 항-IL-11RA 항체-치료 마우스가 WDF로 사육된 대조군 IgG 항체-치료 마우스와 비교하여 유의하게 더 낮은 공복 혈액 글루코스 수준을 가졌음을 도시한다.
더욱이, 췌장의 면역-조직학은 또한, IgG 치료된 WDF 사육 마우스에서 췌도 과형성증과 더불어 췌장도에서 글루카곤 및 인슐린 염색의 증가를 드러내었으며(도 10a 및 도 10b), 이는 T2D의 전형적인 특질이다(문헌[Bonner-Weir 및 O'Brien Diabetes (2008) 57:2899-2904]). 16주 내지 24주에서 WDF 사육된 마우스에서 항-IL-11RA 항체 치료는 WDF 사육된 마우스의 췌도 과형성증 및 글루카곤 염색을 두드러지게 감소시켰을 뿐만 아니라 췌도에서 인슐린 발현을 향상시켰으며(도 10a 및 도 10b), 이는 IL-11 매개 신호화의 길항작용이 서구-유형 식단에 의해 야기되는 대사 질환을 향상시키고 역전시키는 데 유용함을 시사한다.
실시예 3: IL-11-매개 신호화 및 악액질의 길항작용
항-IL-11 치료법을 악액질의 마우스 모델에서 이의 효과에 대해 평가하였다.
메티오닌-콜린 결핍(MCD) 식단으로 마우스를 사육하는 것은 중증 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 염증 및 섬유증을 야기하고, 중증 및 지속된 체중 손실(3주의 MCD 식단 후 체중의 30%까지)을 초래한다. MCD 식단에 있는 마우스가 정상 사료 식단(NCD)에 있는 마우스보다 36% 더 높은 대사율을 갖고 강한 식욕-자극 환경(낮은 렙틴, 낮은 글루코스, 낮은 TGs/콜레스테롤, 낮은 인슐린)을 갖는 한편, 이는 이의 음식 소모를 증가시키지 않는다(문헌[Rizki 등 J. Lipid Res. (2006) 47:2280-2290]). 이와 같이, MCD 식단은 악액질의 잘-인식된 모델이고 암-관련 악액질과 공통인 많은 특질을 갖는다. 지방간염은 빈번하게는 실험 및 인간 암 악액질에서 문헌화되고, 소모성 증후군에서 중요하지만 불량하게 이해되는 역할을 나타낸다.
5주령 수컷 마우스를, 고 지방 MCD(HFMCD) 식단으로 지정된 60 kcal% 지방(A06071301B, Research Diets)과 함께 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍(MCD) 식단으로 사육하였으며, 이는 MCD 식단 단독보다 더 중증인 NASH를 야기한다. 대조군 마우스를 정상 사료(NC; Specialty Feeds)로 사육하였다. 이러한 마우스가 동일한 치료 연속기간 동안 HFMCD를 받은 후 1주일째에 마우스에게 10 mg/kg의 항-IL-11 항체 또는 항-IL-11RA 항체, 또는 동일한 농도의 IgG 이소타입 대조군을 주(week)당 2회 복강내 주사하였다. 체중을 매주 측정하였다.
결과를 도 11a 및 도 11b에 도시한다. 항-IL-11 치료법은 체중에 뚜렷한 양성(positive) 효과를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 IL-11-매개 신호화의 저해가 악액질-관련 체중 손실을 개선할 수 있음을 나타낸다. 모든 HFMCD 치료 그룹(n≥5 마우스/그룹)이 지방간염-유도 HFMCD 식단에서 제1주 후 체중의 약 15%를 소실한 한편, 항-IL-11 또는 항-IL-11RA 치료법을 받는 그룹은 체중을 신속하게 재획득하였고, 이후에 5주까지 정상적인 또는 정상-근처 체중으로 복귀하였다(도 11a). NC 식단으로 사육된 마우스는 체중을 꾸준히 얻은 한편, HFMCD 식단으로 사육되고 IgG 대조군으로 치료된 마우스는 치료의 과정에 걸쳐 체중의 >30%를 소실하였다. 마우스 크기의 실시예 비교는 도 11b에 도시되어 있다. 그러므로, IL-11-매개 신호화의 저해는 거식증/악액질의 마우스 모델에서 생체내에서 악액질을 역전시키는 것으로 밝혀졌다.
악액질에 관하여 IL-11-매개 신호화의 저해의 효과를 추가로 조사하기 위해, 항-IL-11 치료법의 용량의 범위를 MCD 모델에서 연구하였다. 5주령 수컷 마우스를 이전과 같이 1주일 동안 HFMCD 또는 NC 식단으로 사육한 후, 악액질을 유도하여, MCD 마우스에서 체중의 약 15% 소실을 초래하였다. 초기 주(week) 후, 마우스에게 0.5, 1, 5 또는 10 mg/kg의 항-IL-11 또는 항-IL-11RA 항체를 주당 2회 복강내 주사하였다. 3개의 항체를 연구하였다: 2개의 항-IL-11((1) 및 (2)), 및 1개의 항-IL-11RA. 10 mg/kg의 IgG 이소타입 항체를 대조군으로서 사용하였다.
체중 및 음식 소모를 매주 측정하였다. 음식 소모에 대해, 평균 음식 섭취를 케이지(케이지당 n=3 마우스)로부터 음식 호퍼(food hopper)에서 측정하였다(g/마우스/주).
체중 결과를 도 12a 내지 도 12c에 도시한다. 모든 3개의 항-IL-11 치료법은 체중에서 용량-의존적 획득을 제공하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 악액질의 역전을 나타낸다. 최고 용량은 가장 큰 악액질-역전 효과를 보여준다. NC 식단으로 사육된 마우스는 체중을 꾸준히 얻은 한편, HFMCD 식단으로 사육되고 IgG 대조군으로 치료된 마우스는 치료의 과정에 걸쳐 체중의 약 30%를 소실하였다.
음식 소모 결과를 도 13a 내지 도 13c에 도시한다. 모든 3개의 항-IL-11 치료법은 음식 소모에서 용량-의존적 증가를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 최고 용량은 음식 소모에서 가장 큰 효과를 가진 반면, IgG 대조군으로 치료된 마우스는 음식 소모에서 약간의 감소를 보여주었다.
항-IL-11RA 항체 치료는 체중 손실을 역전시키는 데 있어서 가장 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 음식 섭취에서 가장 큰 증가와 관련이 있었다.
급성 질환, 예를 들어, 외상 또는 패혈증은 또한, 거식증 및 악액질과 관련이 있을 수 있으며, 따라서 본 발명자들은 다음으로, 급성 신장 손상의 마우스 모델에서 거식증 및 악액질에 미치는 IL-11-매개 신호화의 길항작용의 효과를 조사하였다.
신장 손상을 10-주령 수컷 마우스에게 비히클(0.3 M NaHCO3) 중 엽산(180 mg/kg)의 IP 주사에 의해 유도하였으며; 대조군 마우스에게 비히클 단독을 투여하였다. 주사-후 28일째에 동물을 희생시켰다. 마우스가 희생될 때까지 엽산 투여 전 1시간으로부터 시작하여 마우스에게 20 mg/kg의 항-IL-11 항체, 항-IL-11RA 항체 또는 동일한 농도의 IgG 이소타입 대조군을 3일마다 복강내로 주사하였다.
결과를 도 14a에 도시한다. 폴레이트-유도 신장 손상은 중증의 양측(bilateral) 신장 손상의 급성기와 관련된 신속한 거식증/악액질-관련 체중 손실을 초래하였다. 손상 시 그리고 손상의 연속기간 동안 항-IL-11Rα 또는 항-IL-11 치료법을 받는 마우스(n=7/그룹)는 IgG 대조군과 비교하여 더욱 신속하게 체중을 재획득하였고, 이후에 3주까지 정상적인 또는 정상-근처 체중으로 복귀하였다.
제2 실험에서, 이전에서와 같이 엽산의 IP 주사에 의해 신장 손상을 유도하였다. 신장 손상 후 21일로부터 마우스를 항-IL-11 항체 또는 IgG 대조군으로만 치료하였다. 항체 치료 전에 그리고 후에 동물 체중을 평가하였다. 엽산을 받지 않은 건강한 마우스를 대조군으로서 사용하였다.
결과를 도 14b에 도시한다. 항-IL-11 항체로 치료된 동물은 치료 개시 시 체중을 재획득하기 시작하였으며, 이는 소모성-관련 체중 손실이 말기 질환에서 향상될 수 있음을 보여준다.
추가 실험에서, 마우스를 일측 요로 폐쇄(UUO)-유도 급성 신장 손상을 받게 하였다. UUO 수술을 12주령 마우스 상에서 수행하였다. 간략하게는, 마우스를 케타민(100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg)의 IP 주사에 의해 마취시키고, 마취의 전체 깊이를 발 반사(pedal reflex)로 평가하였다. 그 후에, 마우스의 복부 좌측면을 면도하였다. 메스를 이용하여 피부를 통해 수직 절개를 만들고, 복막을 통해 제2 절개를 만들어서, 신장을 드러내었다. 겸자를 사용하여, 신장을 표면으로 가져오고, 수뇨관을 수술용 실크로 신장 아래에서 2회 묶었다. 결찰된 신장을 이의 올바른 해부학적 위치로 부드럽게 되돌려 놓고, 멸균 식염수를 첨가하여 유체 손실을 보충하였다. 그 후에, 절개를 봉합하였다. 동물을 항생제 엔로플록사신(enrofloxacin)(15 mg/kg, SC) 및 진통제(analgesic) 부프레노핀(buprenorphine)(0.1 mg/kg, SC)으로 3일 연속일 동안 수술-후 치료하였다. 결찰-후 10일째에 마우스를 희생시켰다. 수술-후 제4일부터 마우스를 희생시킬 때까지 마우스에게 20 mg/kg(2x/주)의 항-IL-11 항체 또는 동일한 농도의 IgG 이소타입 대조군을 복강내로 주사하였다.
결과를 도 15에 도시한다. 그룹 둘 다로부터의 동물은 수술 외상-관련 거식증으로 인해 초기에 유사한 양의 체중(약 6%)을 소실하였다. 항-IL-11 치료법(UUO-후 제4일로부터 마우스를 희생시킬 때까지 20 mg/kg 2x/주)을 받는 동물은 IgG 대조군을 받는 마우스보다 이의 체중을 더 신속하게 재획득하였으며, 4일 이내에 정상적인 체중으로 복귀하였다.
그러므로, IL-11 매개 신호화의 길항작용은 급성 질환의 모델에서 체중의 치료적 회복과 관련이 있다.
본 발명자들은 다음으로, 재조합 마우스 IL-11의 주사 또는 IL-11 이식유전자 발현의 유도를 통해 마우스 체중에 미치는 IL-11 과발현의 효과를 조사하였다.
재조합 마우스 IL-11(rmIL11)을 식염수 중 50 μg ml-1의 농도까지 재구성하였다. 10주령 수컷 야생형 C57BL/6J 마우스는 21일 동안 식염수 중 100 μg kg-1의 rmIL11(n=19) 또는 동일한 부피의 식염수(n=15)의 매일 피하 주사를 받았다.
결과를 도 16a에 도시한다. rmIL11의 투여는 정상적인 체중 획득 진전을 느리게 하는 것으로 밝혀졌다. 21일 동안 rmIL11의 매일 주사를 받은 마우스는 치료의 과정 동안 식염수 단독을 받는 마우스와 비교하여 더 적은 체중을 획득하였다.
IL-11 유전자이식(IL-11-Tg) 마우스를 생성하였다. 이형접합성 Rosa26-IL11 마우스를 Col1a2-CreER 마우스와 교배시켜, 섬유아세포에서 IL-11 이식유전자 발현과 함께 이중 이형접합성 Col1a2-CreER:Rosa26-IL11 자손(IL-11-Tg 마우스)을 생성하였다. Cre-매개 IL-11 이식유전자 유도를 위해, IL-11-Tg 마우스에게 10일의 연속일 동안 6주령에서 50 mg kg-1 타목시펜(Sigma-Aldrich)을 복강내로 주사하고, 동물을 제21일에 희생시켰다(n=14). Rosa26:Il11 마우스(Col1a2-CreER 대립유전자가 없음)에게 대조군(n=10)과 비교하여 동일한 용량의 타목시펜을 10일 연속일 동안 주사하였다.
결과를 도 16b에 도시한다. IL-11-Tg 마우스는 악액질의 초기 징후를 보여주었으며, 체중을 얻는 것을 중단하였고, 시간 경과에 따른 체중 손실을 경험하였다. 그러므로, IL-11-매개 신호화는 소모성-관련 체중 손실에 기여하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4: 비-알코올성 지방간염(NASH)의 마우스 모델에서 IL-11-매개 신호화의 길항작용
본 발명자들은 비-알코올성 지방간염(NASH)의 발병에서 IL-11 신호전달의 역할을 조사하였다.
4.1 방법
간 성상 세포(HSC) 또는 간세포를 IL-11로 자극시키고, 세포성 및 고 함량 이미지화, 면역블로팅, ELISA 및 침범 검정을 사용하여 효과를 평가하였다. 유전학적 및 약물학적 IL-11 기능-획득 또는 기능-소실 실험을 시험관내에서 그리고 생체내에서 수행하였다. ERK 저해제를 사용하여 IL-11 신호전달을 연구하였다. 3개의 전임상 NASH 모델에서 메티오닌/콜린 결핍 식단 또는 액체 프룩토스와 함께 서구 식단을 사용하여 항-IL-11 또는 항-IL11RA 치료법의 효과를 평가하였다. 하이드록시프롤린 검정, qPCR, RNA-seq, 웨스턴 블로팅, 조직학, CyTOF, 지질 및 대사 바이오마커를 사용하여 표현형분석(phenotyping)을 수행하였다.
동물 실험
모든 동물 시술은 싱헬스 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 따라 승인받고 수행되었다. 모든 마우스는 사료 및 물을 마음대로 제공받았다.
NASH의 마우스 모델
고 지방 메티오닌 및 콜린-결핍(HFMCD) 식단으로 사육된 야생형 마우스
5주령 수컷 C57BL/6N 마우스를 60 kcal% 지방(A06071301B16, Research Diets)으로 보충된 메티오닌 및 콜린 결핍 식단으로 사육하고; 대조군 마우스를 정상 사료(NC, Specialty Feeds)로 사육하였다. 식단 및 항체 치료법의 연속기간은 기재되어 있다.
메티오닌 및 콜린-결핍(MCD) 식단으로 사육된 db/db 마우스
C57BL/6J 유전적 배경에서 수컷 BKS.Cg-Dock7m+/+LeprdbJ(db/db) 마우스는 이러한 마우스를 8주 동안 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍 식단(MCD, A02082002BRi, Research Diets)으로 사육하였을 때 12주령이고 간 지방증 병기에 있었으며; 대조군 마우스는 동일한 유전자형의 것이었다. 식단 및 항체 치료법의 연속기간은 기재되어 있다.
프룩토스가 보충된 서구 식단(WDF)으로 사육된 야생형 마우스
10주령의 수컷 C57Bl/6J 마우스를 NAFLD/NASH 유사 인간17,18을 모방하기 위해 식수 중 15% 중량/부피 프룩토스가 보충된 서구 식단(D12079B, Research Diets)으로 사육한 반면, 대조군 마우스는 정상 사료 및 수돗물을 받았다. 식단 및 항체 치료법의 연속기간은 기재되어 있다.
Il11ra-결실 마우스
Il11rα에 대한 기능적 대립유전자가 결여된 마우스(Il11rα-/-)는 C57Bl/6J 유전적 배경(B6.129S1-Il11rαtm1Wehi/J, Jackson's Laboratory)에 있었다. Il11ra-/- 마우스와 이의 야생형 한배새끼(Il11ra+/+) 둘 다를 (1) 5주령으로부터 10주 동안 HFMCD 및 (2) 12주령으로부터 16주 동안 WDF로 사육하여, NASH를 발증시켰으며; 대조군 마우스를 동일한 연속기간 동안 NC로 사육하였다.
Il-11의 생체내 투여
10주령의 수컷 Col1a1-GFP 리포터 마우스19 및 야생형 C57BL/6J 마우스는 21일 동안 100 μg/kg의 재조합 마우스 IL-11(rmIL-11) 또는 동일한 부피의 식염수의 매일 피하 주사를 받았다.
항-IL-11 또는 항-IL11RA 단일클론 항체의 생체내 투여
마우스에게 도 5에 기재된 치료 연속기간 동안 길항제 항-IL-11 항체, 길항제 항-IL11RA 항체 또는 동일한 양의 IgG 이소타입 대조군을 복강내로 주사하였다.
공복 혈액 글루코스 측정
마우스를 채혈(꼬리 스닙을 통해) 전 6시간 동안 단식시키고, Accu-Chek 혈액 글루코스 미터를 사용하여 공복 글루코스 측정을 수득하였다.
세포 배양
세포(심방 섬유아세포, HSC 및 간세포)를 성장시키고, 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 성장 배지를 2일 내지 3일마다 새롭게 하고, 표준 트립신처리 기법을 사용하여 80% 내지 90% 합류도(confluence)에서 세포를 계대배양하였다. 모든 실험을 낮은 세포 계대배양(P1 내지 P2)에서 수행하였다. 자극 전 16시간 동안 세포를 혈청-고갈시켰다(starve). 자극된 세포를, 동일한 조건(무혈청 배지) 하에 동일한 연속기간 동안 그러나 자극 없이 성장되어 온 비자극 세포와 비교하였다.
1차 인간 심방 섬유아세포
인간 심방 섬유아세포를 제조하고, 이전에 기재된 바와 같이11 배양하였다.
1차 인간 간 성상 세포(HSC)
HSC(5300, ScienCell)를 폴리-L-리신-코팅된 플레이트(2 μg/cm2, 0403, ScienCell) 상에서 성상 세포 완전 배지(5301, ScienCell)에서 배양하였다.
1차 인간 간세포
인간 간세포(5200, ScienCell)를 2% 우태 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 간세포 배지(5201, ScienCell) 에서 성장시키고 유지시켰다.
THP-1
THP-1(ATCC)을 10% FBS 및 0.05 mM β-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640(A1049101, Thermo Fisher)에서 배양하였다. THP-1 세포를 RPMI 1640 중 10 ng/ml의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, P1585, Sigma)로 48시간 동안 분화시켰다.
오페레타 고 처리량 표현형분석 검정(Operetta high throughput phenotyping assay)
오페레타 검정을 본원에 기재된 최소의 변형과 함께 대체로 이전에 기재된 바와 같이11 수행하였다: HSC 또는 간세포를 96-웰 블랙 세포담체 플레이트( PerkinElmer)에 웰당 5x103개 세포의 밀도로 시딩(seed)하였다. 실험 조건에 따라, 세포를 4% 파라포름알데하이드(PFA, 28908, Thermo Fisher Scientific)에서 고정하고, PBS 중 0.1% Triton X-100(Sigma)으로 투과시키고, 비-특이적 부위를 PBS 중 0.5% BSA 및 0.1% Tween-20으로 차단하였다. 세포를 1차 항체(1:500)와 함께 밤새(4℃) 인큐베이션하고, 뒤이어 적절한 AlexaFluor488 2차 항체(1:1000)와 함께 인큐베이션하였다. 로다민 팔로이딘 염색(1:1000, R415, Thermo Fisher)을 밤새 인큐베이션(4℃)에 의해 수행하였다. 세포를 차단 용액 중 1 μg/ml DAPI(D1306, Thermo Fisher)로 대조염색하였다. 각각의 조건을, 오페레타 고-함량 이미지화 시스템 1483(PerkinElmer)을 사용하여 2개 웰 및 웰당 최소 7개 필드(field)로부터 이미지화하였다. Harmony v3.5.2(PerkinElmer)를 사용하여 ACTA2를 정량화하고, 활성화된 섬유아세포/총 세포 수(ACTA2+ve)의 백분율을 각각의 필드에 대해 결정하였다. 콜라겐 I의 면적당 형광 강도(세포의 수로 정규화됨)의 측정을 Columbus 2.7.1(PerkinElmer)로 수행하였다.
면역형광
염색 전 24시간째에 인간 HSC 및 간세포를 8-웰 챔버 슬라이드(웰당 1.5X104 세포) 상에 시딩하였다. 세포를 4% PFA에서 20분 동안 고정하고, PBS로 세척하고, 비-특이적 부위를 PBS 중 5% BSA로 2시간 동안 차단시켰다. 세포를 항-IL11RA 또는 항-IL6R 항체와 함께 밤새(4℃) 인큐베이션하고, 뒤이어 적절한 Alexa Fluor 488 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 챔버 슬라이드를 암실에서 건조하고, DAPI와 함께 5 방울의 마운팅 배지를 슬라이드에 15분 동안 첨가한 후, 형광 현미경(Leica)에 의해 이미지화하였다.
비행 시간에 의한 질량 유세포분석((CyTOF: Mass cytometry by Time of Flight)
면역 세포를 이전에 기재된 바와 같이20 간으로부터 단리하였다. 간 조직을 잘게 갈고, 100 μg/ml 콜라게나제 IV 및 20 U/ml DNase I로 37℃에서 1시간 동안 분해하였다. 분해 후, 세포를 스트레이너(strainer)를 통해 통과시켜, 단일 세포 현탁액을 수득하였으며, 면역 세포의 단리를 위해 퍼콜(percoll) 구배 원심분리를 받게 하였다. CyTOF 염색을 이전에 기재된 바와 같이21 수행하였다. 세포를 해동시키고, 시스플라틴(Fluidigm)으로 염색하여, 살아 있는 세포를 식별하고, 뒤이어 바코딩(barcoding) 목적을 위해 금속-접합 CD45 항체로 염색하였다. 바코딩 후, 세포를 금속-접합 세포 표면 항체(Ly6C)로 염색하였다. 그 후에, 세포를 1.6% PFA로 고정하고, 100% 메탄올로 투과시키고, 세포내 항체 염색(TGFβ1)을 받게 하였다. 세포를 DNA 인터칼레이터(intercalator)로 표지한 후, Helios 질량 유세포분석기(Fluidigm) 상에서 획득하였다. 분석을 위해, 처음의 살아 있는 단일 세포를 식별하고, 뒤이어 디바코딩(debarcoding)을 하여 개별 시료를 식별하였다. Flowjo 소프트웨어(Flowjo)를 사용하여 수동 게이팅(manual gating)을 수행하였다.
통계학적 분석
GraphPad Prism 소프트웨어(버전 6.07)를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 더넷(몇몇 실험 그룹이 하나의 조건과 비교되었을 때), 터키(몇몇 조건이 하나의 실험 내에서 서로 비교되었을 때), 시닥(2개의 상이한 유전자형으로부터의 몇몇 조건이 서로 비교되었을 때)에 따른 다중 시험에 대해 P 값을 교정하였다. 2개의 상이한 그룹의 비교를 위해 2개 매개변수(시간에 걸친 항체 효능)에 대한 분석을 이원 ANOVA에 의해 수행하였다. 통계학적 유의성에 대한 기준은 P <0.05이었다.
데이터 이용 가능성
이 연구에 대해 생성된 고-처리량 시퀀싱 데이터를 GSE128940으로부터 다운로드할 수 있다. 모든 다른 데이터는 사본에 또는 보충 방법에 나타나 있다.
4.2 결과
개요
NASH로 자극되었을 때, 인자 HSC는 IL-11을 분비하며, 이는 HSC-로부터-근섬유아세포로의 형질전환에 필요한 자가분비, ERK-의존적 신호전달 루프를 유도한다. IL-11은 인간 및 뮤린 NASH에서 상향조절되고, Il-11 주사는 마우스에서 간 상해, 염증 및 섬유증을 야기하고, Il11ra1 결실된 마우스는 2개의 전임상 모델에서 NASH로부터 보호된다. IL11RA 또는 IL-11에 대한 치료 항체는 3개의 뮤린 NASH 모델에서 섬유증 및 지방증을 일관적으로 저해하고 역전시킨다. 예상치 못하게도, IL-11은 간세포 상해를 야기하고 간질(stromal)-매개 염증을 촉진하고, 항-IL-11 치료법은 NASH-관련 간독성 및 간염을 역전시킨다. NASH에서 IL-11 신호전달의 유전적 또는 약물학적 저해는 더 낮은 혈청 트리글리세라이드, 콜레스테롤 및 글루코스와 관련이 있다.
IL-11은 HSC를 활성화시키고 간 섬유증을 유도한다
게놈 와이드 RNA-seq 분석은, TGFβ1이 HSC에서 IL-11을 강하게 상향조절(14.9-배, P = 3.40x10-145)함을 드러내었고, 이는 qPCR에 의해 확증되었으며, 단백질 수준에서 확인되었고, 정밀 절단된 인간 간 슬라이스를 사용하는 실험에서 복제되었다(도 17a 내지 도 17c, 도 24a). 독립적으로 생성된 RNA-seq 데이터22는, IL-11이 경화증 간을 모델링하기 위해 강성(stiff) 기질 상에서 성장되었을 때 HSC에서 가장 상향조절되는 유전자임을 보여준다(도 24b). HSC는 심장 또는 폐 섬유아세포보다 더 높은 수준의 IL-11 수용체 하위단위 알파(IL11RA)를 발현하며, 이는 IL-11에 반응성이다(도 24b). 면역조직화학적 분석은 HSC에서 높은 IL11RA 발현 및 검출 불가능한 IL6R 발현을 확인시켜 주었다(도 17d). 인간 간 시료의 웨스턴 블롯은 NASH를 포함한 섬유증성 간 질환을 갖는 환자에서 증가된 IL-11을 보여주었다(도 24d 내지 도 24e). 이러한 데이터는, HSC가 인간 간에서 IL-11의 공급원이자 표적이고, IL-11이 인간 간 질환에서 상승됨을 보여준다.
HSC에 미치는 IL-11의 효과를 조사하기 위해, 세포를 IL-11, TGFβ1 또는 PDGF로 자극시켰다. IL-11은 HSC를 TGFβ1 또는 PDGF와 유사한 정도(extent)까지 활성화시켜, 휴지기 HSC를 ACTA2+ve 근섬유아세포로 형질전환시켰으며, 이는 콜라겐 및 기질 변형 효소를 분비한다(도 17e 내지 도 17h, 도 24f 내지 도 24h). IL-11은 또한, HSC에 의한 용량-의존적 매트릭스 침범을 촉진하였으며, 이는 NASH23에서 HSC 병상의 중요한 양태이다(도 17i). 하이퍼IL-1111로 자극된 HSC는 또한, IL-11을 분비하였으며, 이는 IL-11 신호전달의 자가분비 공급-포워드 루프를 확인시켜 주었다(도 17j).
재조합 마우스 IL-11(rmIL-11)로 치료된 Col1a1-GFP 리포터 마우스19는 간에서 GFP-발현 Col1a1 +ve 근섬유아세포를 축적시켰으며, 이는 생체내에서 HSC-로부터-근섬유아세포로의 형질전환에 미치는 Il-11의 효과를 추가로 확인시켜 주었다. 21일 동안 마우스에게의 rmIl-11의 피하 투여는 또한, 간 콜라겐 함량, 주된 섬유증-촉진 및 전염증성 유전자의 발현 및 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 증가시켰다(도 17k 내지 도 17n, 도 24i 내지 도 24k). 이는, rmIl-11이 섬유증에 더하여 간세포 상해 및 염증을 야기함을 내포하였다.
Il11ra1의 결실은 마우스를 NASH-관련 염증, 간독성 및 섬유증으로부터 보호하고, 혈청 지질 및 글루코스를 낮춘다
고 지방 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍(HFMCD) 식단16을 사용하여 중증 NASH의 전임상 모델에서 연구를 수행하였다. 이 모델에서, Il-11 mRNA는 약간 상승되었으며, 반면 단백질 수준은 고도로 상향조절되었고, 이는 간에서 Il-11 발현의 전사-후 조절을 시사한다(도 25a 내지 도 25b). NASH 동안 Il-11 단백질의 점진적인 유도는 Erk 활성화에 의해 반영되었으며, 이는 NASH 발병24, 증가된 콜라겐 및 상승된 혈청 ALT 수준에서 중요할 수 있다(도 18a, 도 25c 내지 도 25d).
NASH에서 증가된 Il-수준의 병태생리학적 관련성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 유전적 기능-소실 모델을 사용하였다: Il-11 수용체 하위단위 알파 결실된 마우스(Il11ra1 -/- )25. HFMCD 식단에 있는 Il11ra1 -/- 마우스는 섬유증으로부터 강하게 보호되었고, 대조군과 비교하여 더 적은 지방증 및 간 상해를 가졌다(도 18b 내지 도 18d, 도 25e 내지 도 25h). 더욱이, 두드러지게 더 적은 간 염증은 Il11ra1 -/- 마우스에서 관찰되었으며(도 18e), 이는 Il-11이 다수의 NASH 병상에 걸쳐 중요한 역할을 함을 시사한다.
HFMCD 모델은 조기 발병 지방증 간염, 뒤이어 섬유증을 갖는다. 그러나, 이러한 모델은 비만 또는 인슐린 내성이 아니다. 액체 프룩토스가 보충된 서구 식단(WDF)26을 사용하여 비만이며, 인슐린 내성이고 고혈당증인 또 다른 NASH 모델을 확립하였으며, 이는 인간 NASH18을 반영하였다. 16주의 WDF 사육 후, NASH가 확립되었고, Il-11 단백질은 간에서 상향조절되었다(도 18f). WDF에 있는 Il11ra1 -/- 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 유사한 체중을 가졌으나, 간 지방증, 염증, 간세포 상해, 및 섬유증으로부터 보호되었다(도 18g 내지 도 18j, 도 26). Il11ra1 -/- 마우스에서 Erk 활성화는 HFMCD 모델과 WDF 모델 둘 다에서 약화되었으며, 이는 Il-11-주도 Erk 활성화가 NASH에 중요함을 내포한다(도 18k, 도 25i).
NASH에서 사망률의 1차 원인은 심혈관: 심근 경색, 신부전(renal failure) 및 뇌졸중이다27,28. 심혈관 위험의 바이오마커를 WDF 식단에서 16주 후 Il11ra1 -/- 마우스에서 측정하였다. 한배새끼 대조군과 비교하여, WDF에 있는 Il11ra1 -/- 마우스는 더 낮은 수준의 공복 혈액 글루코스, 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 가졌다(도 18l 내지 도 18n).
중화성 항-IL-11 항체 또는 항-IL11RA 항체는 HSC 활성화를 차단한다
마우스를 IL11RA로 유전적으로 면역화시켜, 중화성 항-IL11RA 항체를 생성하였다. 섬유아세포 형질전환을 차단한 클론11이 식별되었고, 클론 X209(IgG1κ, K D = 6 nM)를 우선순위화하였다(prioritise). X209는 HSC로부터의 MMP2 분비를 5.8 pM의 IC50으로 차단하였고, 양호한 간 흡수와 함께 대략 18일의 생체내 반감기를 갖는다(도 19a, 도 27a 내지 도 27d). IL-11 신호전달에 대한 치료적 특이성을 보장하기 위해, 중화성 항-IL-11 항체 X20312(IgG1κ, HSC 활성화에 대해 IC50= 40.1 pM)를 개발하고 실험에 사용하였다.
본 발명자들은, TGFβ1(도 17a 내지 도 17c)에 더하여, 다른 주된 NASH 자극, 예컨대 PDGF, CCL2, 안지오텐신 II, bFGF 또는 산화적 스트레스가 HSC로부터의 IL-11 분비를 유도함을 밝혀내었다(도 19b). 이는, IL-11이 다수의 인자의 HSC 활성화 다운스트림에서 역할을 가짐을 시사하였다. 이를 시험하기 위해, HSC는 다양한 NASH 인자로 자극되었고, ACTA2 또는 콜라겐 발현을 유도하기 위해 모든 자극이 무손상(intact) IL-11 신호전달에 의존하는 것으로 밝혀졌다(도 19c, 도 27e). 별도의 검정에서, HSC에 미치는 PDGF 또는 CCL2의 전침범성(pro-invasive) 효과 또한, IL-11 의존적인 것으로 나타났다(도 19d).
Il11ra1 -/- 마우스에서, HFMCD 또는 WDF 식단에서 간 보호는 감소된 Erk 활성화와 관련이 있었다. 본 발명자들은, IL-11이 HSC에서 ERK를 직접적으로 활성화시키고 HSC로부터 IL-11 분비를 유도하는 모든 자극이 또한 ERK 활성화를 유도함을 밝혀내었다. X209는 IL-11 자체를 포함하여 모든 인자의 ERK 인산화 및 HSC 형질전환 다운스트림을 무효화시켰다. ERK 저해제는 모든 NASH 촉발제(trigger)의 IL-11 효과 및 HSC 활성화 다운스트림을 차단하였으며, 이는 IL-11 유도 ERK 인산화가 HSC 형질전환을 위한 중심적인 중요성을 가짐을 시사한다(도 19e 내지 도 19f, 도 27f).
간에서 IL-11에 대한 공개된 문헌은 제한되지만, 설치류 내로의 고용량의 재조합 인간 IL-11의 주사는 보호 효과13,14와 관련이 있어 왔으며, 혈소판 생물학25에서 IL-11에 대한 역할에 관하여 혼동이 존재한다. 안전성 문제를 배제하기 위해, 본 발명자들은 X209 및 X209의 장기간(5개월) 고용량(10 mg/kg x 2/주) 전임상 독성학 연구를 수행하였고, 혈청 ALT 수준 또는 혈소판에 미치는 어떠한 효과도 관찰하지 않았다(도 19g 내지 도 19h). Il11ra -/- 마우스에서의 데이터와 일관되게, 항-IL-11 치료법은 이러한 치료 기간 동안 혈청 지질 수준을 낮추거나, 낮추는 방향으로 경향을 이루었다(도 19i 내지 도 19j).
IL-11 또는 IL11RA의 치료적 표적화는 3개의 전임상 NASH 모델에서 효과적이다
그 후에, 본 발명자들은 생체내에서 X209 및 X203 치료법을 시험하였고, IL-11이 강하게 상향조절되고, 콜라겐이 축적되었고 지방간염이 확립될 때 6주의 HFMCD 식단 후 항체 투여를 시작하였다(도 18a, 도 20a, 및 도 25c 내지 도 25d). 4주의 치료법 후, 항체 둘 다는 간 섬유증, 염증 및 상해를 저해하거나 역전시켰으며, 한편 지방증은 변하지 않았다(도 20b 내지 도 20e, 도 28a 내지 도 28c). 더욱이, 항체 둘 다는 Erk 활성화를 무효화시켰으며, 이는 표적 연계(engagement) 및 커버리지를 나타낸다(도 20f, 도 28d).
본 발명자들은 또한, 8주 동안 NASH-유도 메티오닌-콜린-결핍(MCD) 식단에 있었을 때 비만이고, 당뇨병이 있으며 지방증 간을 갖는 20주령의 db/db 마우스에서 항-IL-11 치료법을 시험하였다(도 20g)29-31. 본 발명자들의 다른 모델과 일관되게, IL-11 발현 및 Erk 활성화는 MCD-사육 db/db 마우스의 간에서 증가되었고, Erk 활성화는 치료법에 의해 저해되었다(도 20h 내지 도 20i). 이 모델에서, 항-IL-11 치료법은 ALT 수준을 낮추는 한편 간 지방증, 섬유증, 및 염증을 감소시켰다(도 20j 내지 도 20n, 도 28e 내지 도 28f).
WDF-유도 NASH의 제3 모델을 사용하여, 비만, 인슐린 내성 및 당뇨병의 맥락에서 항-IL-11 치료법의 효과를 시험하였다18. 마우스를 16주 동안 WDF로 사육하였으며, 이때까지 이러한 마우스는 비만이고 간 지방증, 염증 및 섬유증과 함께 인슐린 내성이었다. 그 후에, 항-IL11RA(X209) 치료법을 이용한 치료를 개시하였다(도 21a). IL-11 신호전달이 표적화되었을 때 간 Erk 활성화는 NASH 간에서 저해되었다(도 29a). 유사한 체중 증가에도 불구하고, 항-IL11RA 치료법에 있는 마우스에서 간 섬유증, 지방증, 염증의 역전 및 혈청 ALT 수준의 감소가 관찰되었다. 이는 혈청 글루코스, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준의 감소에 의해 동반되었다(도 21b 내지 도 21g 및 도 29b 내지 도 29e).
간 섬유증에 미치는 조합된 대사 개입과 항-IL-11 개입의 효과
본 발명자들의 데이터는, 항-IL-11 치료법이 섬유증을 역전시켰으나, 이러한 효과가 지속되거나 점진적인지의 여부를 평가하지 않았음을 보여주었다. 더욱이, 조합 치료법은 NASH에서 섬유증을 역전시키는 데 있어서 유익할 수 있다1. 이러한 점을 해결하기 위해, 10주 동안 HFMCD를 사용하여 중증 간 섬유증을 확립한 다음, 마우스를 정상 사료로 전환시켜, 강력한 대사적 개입을 모방하고, 항-IL-11 치료를 병행하여 개시하였다(도 21h).
대사적 자극의 제거 시, Erk 활성화는 서서히 회귀하였으며, 이는 X203 또는 X209-치료에 의해 가속화되었다(도 30a). 섬유증은 실험의 연속기간 동안 IgG 치료된 동물에서 변하지 않았으며, 이는 완전한 대사적 교정만으로는 섬유증을 역전시키지 않거나 섬유증을 매우 서서히 역전시킴을 시사한다. 대조적으로, 간 콜라겐 함량은 3주의 항체 치료 후 유의하게 역전되었으며(역전: 18%, X203; 24%, X209), 6주에서 추가로 역전되었고(역전 37%, X203; 46%, X209), 이는 점진적이고 지속된 효과를 보여준다(도 21i, 도 30b 내지 도 30c).
섬유증의 회귀는 더 낮은 TIMP 및 더 높은 MMP 수준과 관련이 있으며, 이는 선호할 만한 매트릭스 재건3,32을 촉진한다. 이와 일관되게, 중증 섬유증을 갖는 X203 또는 X209 치료된 마우스는 급속하게 Mmp2를 상향조절하고 Timp1를 하향조절하였다(도 21j). 형질전환된 HSC가 세포자멸사33, 노쇠34,35 및/또는 비활성 ACTA2-ve 상태36로의 회귀를 겪을 때 간 섬유증의 역전은 선호된다. IL-11이 형질전환된 상태에서 HSC를 유지시키는 데 필요한지 체크하기 위해, HSC를 TGFβ1 또는 PDGF로 자극시키고, 뒤이어 IL-11 신호전달을 저해하였다. IL-11 저해의 24시간 내에, ACTA2+ve 세포의 백분율 및 분비된 콜라겐의 양은 기준선-근처 수준으로 역전되었고, ERK 활성은 진행중인 TGFβ1/PDGF 자극에도 불구하고 대체로 약화되었다(도 21k 내지 도 21l, 도 30d 내지 도 30g).
초기 NASH에서 급성 괴사염증 동안 간 건강에 미치는 항-IL-11 치료법의 효과
NAFLD로부터 NASH로의 이행은 지방증 간염, 염증 및 세포 사멸(괴사염증)의 발증을 특징으로 한다. HSC는 전염증성 인자3,8,37,38의 분비를 통해 이 과정에서 중심적인 역할을 갖는다. 본 발명자들은, IL-11이 HSC-주도 염증 경로에 영향을 미치는지 조사하였고, IL-11이 CCL2의 HSC 집단을 자극시켰으며, 반면에 IL-11 저해는 CCL2 분비를 차단하였음을 밝혀내었다(도 31a). 이는, NASH 식단에 걸쳐 Il11ra1 -/- , X203-치료 또는 X209-치료 마우스로부터의 간에서 관찰된 염증의 일관되게 낮은 수준과 함께 유지시키는 데 있어서 간질 면역력에서 IL-11에 대해 인정받지 못하는 전염증성 역할을 보여준다.
NASH의 HFMCD 모델에서, 조기 염증에 뒤이어 섬유증 기가 존재한다(도 22a). 초기 지방간염 동안 IL-11의 치료적 표적화는 간 지방증을 놀랄만큼 감소시켰으며, 이는 더 적은 Erk 활성화에 의해 동반되었다(도 22b 내지 도 22e, 도 31b 내지 도 31c). 지질 액적은 X203- 및 X209를 받는 마우스의 간에서 보이지 않았으며, 이러한 마우스는 섬유증을 발증시키지 않았다(도 22d, 도 22f 및 도 31d 내지 도 31g). HFMCD 식단은 또한, 급성 및 중증 괴사염증을 유도하며(1주일까지 ALT에서 >20-배 증가), 항-IL-11 치료법을 이용한 간 상해의 실질적인 역전은 예상치 못하게도 3주 기간에 걸쳐 관찰되었다(도 22g, 도 31h). 이러한 급속한 치료적 이익은 질환의 섬유증 병기를 앞서고, 이전의 전임상 모델에서 Il11ra1 -/- , X203 또는 X209-치료 마우스에서 일관되게 더 낮은 ALT 수준과 더불어 간세포에서 직접적으로 IL-11의 손상 효과를 시사한다.
1차 인간 간세포는 IL6R이 아니라 IL11RA를 발현하는 것으로 밝혀졌다(도 22h). 간세포가 생리학적 수준의 IL-11로 자극되었을 때, ALT의 용량-의존적 방출이 존재한다. 이는 간세포에서 스트레스 섬유의 발현에서 점진적인 증가와 일치한다(도 22i 내지 도 22j). 흥미롭게도, 간세포는 또한, TGFβ1로 자극되었을 때 IL-11을 강력하게 분비하였으며, 이는 간세포에서 IL-11의 부적응적(maladaptive) 자가분비 활성을 시사한다(도 22k). 그러므로, IL-11 신호전달은 간세포 기능을 직접적으로 해친다.
RNA-seq 분석을 수행하여, HFMCD-유도 NASH의 급성 염증기 동안 IL-11 치료법의 효과를 프로파일링하였다. 무감독 분석은, 항체 치료가 HFMCD 식단에 의해 유도되는 병리학적 RNA 발현 시그너처를 거의 완전히 역전시킴을 보여주었다(도 23a, 도 32a 내지 도 32b). 섬유증-촉진 유전자 및 전염증성 유전자의 상향조절은 무효화되었고, 지질 대사 유전자 발현은 재확립되었다(도 23b 내지 도 23c, 도 32c). 불편 유전자 세트 농화 연구(Unbiased Gene Set Enrichment study)는 정상-근처 지방산, 담즙산, 산화적 스트레스, 섬유증 및 염증성 전사 시그너처의 회복을 확인시켜 주었다(도 32d).
체류 대식세포 및 침윤성 단핵구는 NASH 발병에 중요하고, TGFβ139의 주요 공급원이다. 염증 세포 집단은 지방간염 동안 간에서 검사되었고, X209-치료 간에서 일반적인 더 적은 면역 세포 및 Ly6C+veTGFβ1+ve 세포에서 특이적인 감소를 관찰하였다(도 23d 내지 도 23f). 순환중인 TGFβ1 수준은 HFMCD 식단에 의해 상승되었으나 X209 치료법에 의해서는 감소되었으며, 이는 항-IL11RA 치료법이 질환-변형적임을 보여준다(도 23g).
4.3 논의
HSC는 간2 내 전염증성 근섬유아세포의 주요 공급원이고, 이의 형질전환을 저해하고 역전시키는 것은 NASH 치료법에 대한 표적이다. 비-중복적인(non-redundant), ERK-의존적 IL-11 신호전달은 심장, 신장 및 폐11,12에서 섬유아세포 활성화에 대한 이의 역할과 유사하게 HSC 형질전환에 필요한 것으로 보인다. 이와 같이, IL-11을 표적화하여 간 섬유증을 역전시키는 것은, 종종 어느 정도 수준의 중복성을 나타내는 다른 면역, 대사적 또는 섬유증 인자에 대한 치료법과 비교할 때 이익을 가질 수 있다. 흥미롭게는, 강력한 대사적 개입 단독으로는 본 발명자들의 실험에서 섬유증에 어떠한 효과도 갖지 않았고, 대사적 치료법은 NASH에서 섬유증을 역전시키는 데 있어서 제한된 효과를 가질 수 있다.
본 발명자들은, 간에서 IL-11에 대한 예상치 못한 전염증성 역할을 발견하였고, HSC가 높은 수준의 IL11RA를 발현하는 반면 면역 세포는 대신에 IL6R을 발현함을 보여준다. 데이터는, 간질(stroma)를 통해 매개되는 면역 세포에 미치는 IL-11의 간접적인 효과를 시사한다. 유전학적 또는 약물학적 기능-소실 접근법을 사용하는 것과 무관하게, IL-11 매개 신호화의 저해는 다수의 NASH 모델에 걸쳐 염증을 방지/역전시키는 것으로 일관되게 그리고 강력하게 실증되었다. 보다 초기의 공개문헌은 IL-11이 간에서 보호 역할을 가질 수 있음을 시사하는 한편, 이러한 연구는 뮤린 Il11ra111을 자극하지 않는 설치류에서 극도로 고용량의 외래 재조합 인간 IL-11을 사용하였다. 생리학적 수준에서 IL-11의 진(true) 생물학적 효과는 전염증성이고 간질 유도인 것으로 보인다.
간세포는 또한, 간세포 유도 스트레스 섬유 형성 및 세포독성에서 TGFβ1 및 IL-11 신호전달을 이용한 자극 시 IL11RA를 발현하고 IL-11을 강하게 분비한다. NASH에서 급성 괴사염증 동안 간세포에 미치는 IL-11의 효과는 명확하고, IL-11 신호전달의 치료적 표적화는 3주 내에 ALT 수준을 대략 700 U/L로부터 정상까지 역전시켰다. NASH에서 이후의 시점에서, IL-11의 유전적 또는 치료적 저해는 또한, 간세포 상해를 방지하거나 역전시키며, 이는 추가 연구를 필요로 한다.
IL11RA에 대한 인간40 및 마우스25 넉아웃은 경증 두개골 기형(mild skull deformity)을 갖고 관절 이완(joint laxity)을 나타낼 수 있으나, 그렇지 않다면 건강하며, IL-11은 성인 포유류에서 중복적인(redundant) 것으로 보인다. 이는 약물 표적으로서 IL-11에 대한 주목할 만한 유전적 안전성 데이터를 제공한다. 이러한 표적 안전성 데이터 이외에, 본 연구는, IL-11 신호전달이 고용량의 치료적 항체를 사용하여 연장된 기간 동안 중화될 때 어떠한 부작용도 존재하지 않음을 보여준다. 더욱이, 유전적 또는 약물학적 저해는 더 낮은 혈청 트리글리세라이드, 콜레스테롤 및 공복 글루코스와 관련이 있다. NASH를 갖는 환자가 종종 심혈관 질환을 앓으므로, IL-11 저해의 이러한 양태는 잠재적인 NASH 치료법에 대한 바람직한 특질이다.
본 발명자들은 간 병상에서 IL-11에 대해 인정받지 못하고 중심적인 역할을 식별하였다. 중화 항체를 이용한 IL-11 신호전달의 표적화는 NASH의 스펙트럼에 걸쳐 섬유증, 지방증, 간세포 사멸 및 염증을 역전시킨다. 이러한 신규 치료적 접근법은 선호할 만한 심장대사적(cardiometabolic) 프로파일과 관련이 있다.
4.4 실시예 4에 대한 참조문헌
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
4.5 보충 물질
항체
ACTA2(ab7817, Abcam; IF), ACTA2(19245, CST; WB), CD45(103102, Biolegend), 콜라겐 I(ab34710, Abcam), p-ERK1/2(4370, CST), ERK1/2(4695, CST), GAPDH(2118, CST), IgG(Aldevron), 중화성 항-IL-11(X203, Aldevron), 중화성 항-IL11RA(X209, Aldevron; 생체내 연구), IL11RA(ab1250515, Abcam; IF), Ly6C(128039, Biolegend), TGFβ1(141402, Biolegend), 항-토끼 HRP(7074, CST), 항-마우스 HRP(7076, CST), 항-토끼 Alexa Fluor 488(ab150077, Abcam), 항-마우스 Alexa Fluor 488(ab150113, Abcam).
재조합 단백질
상업적인 재조합 단백질: 인간 안지오텐신 II(A9525, Sigma-Aldrich), 인간 CCL2(279-MC-050/CF, R&D Systems), 인간 bFGF(233-FB-025, R&D Systems), 인간 IL-11(PHC0115, Life Technologies), 인간 PDGF(220-BB-010, R&D Systems), 인간 TGFβ1(PHP143B, Bio-Rad), 및 마우스 TGFβ1(7666-MB-005, R&D Systems).
커스텀 재조합 단백질: 마우스 Il-11(UniProtKB: P47873)을 신호 펩타이드 없이 합성하였다. 20개 아미노산 링커(GPAGQSGGGGGSGGGSGGGSV)1와 함께 IL11RA(아미노산 잔기 1-317; UniProtKB: Q14626) 및 IL-11(아미노산 잔기 22-199, UniProtKB: P20809)의 단편을 사용하여, trans-신호전달 복합체를 모방하는 하이퍼IL-11(IL11RA:IL-11 융합 단백질)을 작제하였다. 포유류 발현 시스템을 사용한 GenScript에 의해 모든 커스텀 재조합 단백질을 합성하였다.
화학물질
하이드로겐 퍼옥사이드(H2O2, 31642, Sigma), PD98059(9900, CST), U0126(9930, CST).
IL11RA에 대한 마우스 단일클론 항체의 생산
일반적인 면역화 및 특이적인 결합에 대한 스크리닝
인간 IL11RA의 아미노산 23-422를 인코딩하는 cDNA를 발현 플라스미드(Aldevron) 내로 클로닝하였다. 입자-충격(particle-bombardment)을 위한 핸드-헬드(hand-held) 장치를 사용하여 DNA-코팅된 금-입자의 피부내 적용에 의해 마우스를 면역화하였다. 일시적으로 형질주입된 HEK 세포 상에서 세포 표면 발현을, IL11RA 단백질의 N-말단에 첨가된 태그를 인식하는 항-태그 항체로 확인하였다. 혈청을 24일 및 일련의 면역화 후에 수집하고, 상기 언급된 발현 플라스미드로 일시적으로 형질주입된 HEK293 세포 상에서의 유세포분석에서 시험하였다. 2차 항체는 10 μg ml-1의 최종 농도에서 염소 항-마우스 IgG R-피코에리트린-접합 항체(Southern Biotech, #1030-09)였다. 3% FBS를 함유하는 PBS에서 혈청을 희석시켰다. 혈청의 상호작용을 무관한 cDNA로 형질주입된 HEK293 세포와 비교하였다. 특이적인 반응성을 2 마리의 동물에서 확인하였고, 항체-생성 세포를 이러한 동물로부터 단리하고 표준 절차에 따라 마우스 골수종 세포(Ag8)와 융합하였다. 하이브리도마 배양물의 상층액을, IL11RA-플래그(flag)를 발현하는 HEK 세포와 함께 인큐베이션하고, IL11RA에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마를 유세포분석에 의해 식별하였다.
중화성 항-IL11RA 항체의 식별
음성 대조군이 아니라 IL11RA-플래그 세포에 결합된 항체는 특이적인 결합제인 것으로 여겨졌으며, 후속적으로 Schafer 등2에 의해 기재된 바와 같이 인간 및 마우스 심방 섬유아세포 상에서 항-섬유증 활성에 대해 시험되었다. 간략하게는, 1차 인간 또는 마우스 섬유아세포를 항체 후보(6 μg ml-1)의 존재 하에 인간 또는 마우스 TGFβ1(5 ng ml-1; 24 h)로 각각 자극시켰다. TGFβ1 자극은 내인성 IL-11의 상향조절을 초래하며, 이는 중화된다면 TGFβ1의 섬유증-촉진 효과를 차단한다. 활성화된 근섬유아세포(ACTA2+ve 세포)의 분획을 상기 기재된 바와 같이 오페레타 플랫폼 상에서 측정하여, 항체 후보의 중화 잠재력을 추정하였다. 잠재적인 trans-신호전달 효과를 차단하기 위해, 항체를 또한 인간 섬유아세포(200 pg ml-1)의 하이퍼IL-11 자극의 맥락에서 스크리닝하였다. 3개의 특이적인 그리고 중화성 항-IL11RA 항체를 검출하였으며, 이 중 X209는 생체내 연구를 위해 얻었다. 동일한 절차를 수행하여, 리간드 IL-113에 결합하는 중화 항체를 수득하였다.
IL11RA에의 X209의 결합 동역학
인간 IL11RA에의 X209의 결합을 Biacore T200(GE Healthcare) 상에서 측정하였다. X209를 항-마우스 캡처 칩 상으로 고정하였다. 0.005% P20 및 0.5% BSA를 함유하는 HEPES-완충 식염수 pH 7.4로 상호작용 검정을 수행하였다. 분석물(인간 IL11RA)의 농도 범위(1.56 nM 내지 100 nM)를 40 μl min-1의 유동 속도에서 X209 및 기준 표면에 걸쳐 주사하였다. 유사한 전략을 사용하여 옥텟 시스템(ForteBio) 상에서 마우스 Il11ra1에의 결합을 확인하였다. 모든 센서그램을 정렬시키고 이중-참조하였다4. 1:1 랭뮤어 모델로 교정된 센서그램을 맞춤으로써 친화도 및 동역학 상수를 결정하였다. k d/k a의 비에 의해 평형 결합 상수 K D를 결정하였다.
X209 IC 50 측정.
HSC를 IgG(4 μg ml-1) 및 다양한 농도의 X209(4 μg ml-1 내지 61 pg ml-1; 4-배 희석)의 존재 하에 TGFβ1(5 ng ml-1, 24 h)로 자극시켰다. 상층액을 수집하고, 분비된 MMP2의 양에 대해 검정하였다. 최소 제곱법(least squares)(오디너리(ordinary)) 적합(fit)을 사용하여 시험된 X209 농도(pM) 대 상응하는 백분율 저해 값의 로그를 플롯화함으로써 용량-반응 곡선을 생산하였다. 로그(저해제) 대 정규화된 반응-가변 기울기 방정식을 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
혈액 약물동력학 및 생물분포
C57BL/6J 마우스(10-12-주령)에게 PBS 중 100 μl의 신선하게 방사성표지된 125I-X209(5 μCi, 2.5 μg)로 안와(retro-orbitally) 주사하였다(왼쪽 눈). 마우스를 2% 이소플루란으로 마취시키고, 주사 후 몇몇 시점(2, 5, 10, 15, 30분, 1, 2, 4, 6, 8시간, 1, 2, 3, 7, 14 및 21일)에서 악하(submandibular) 채혈을 통해 혈액을 수집하였다. 생물분포 연구를 위해, 심장 천자를 통해 혈액을 수집하고, 조직을 하기 시점에서 수합하였다: 주사 후 1, 4시간, 1, 3, 7, 14, 21일. 붕괴-교정(decay-correction)(100 μl 용량의 100x 희석)과 함께 감마 카운터(2480 Wizard2, Perkin Elmer)를 사용하여 방사능 함량을 측정하였다. 측정된 방사능을 % 주사된 용량/g 조직으로 정규화하였다.
RNA-seq
RNA-seq 라이브러리의 생산
Qubit RNA 고-민감성 검정 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 총 RNA를 정량화하고, LabChip GX RNA 검정 시약 키트(Perkin Elmer)를 사용하여 RNA 온전성 수(RIN: RNA integrity number)를 평가하였다. TruSeq Stranded mRNA 라이브러리 제조 키트(Illumina)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 전사체 라이브러리를 제조하였다. KAPA 라이브러리 정량화 키트(KAPA Biosystems)를 사용하여 모든 최종 라이브러리를 정량화하였다. LabChip GX DNA 고-민감성 시약 키트(Perkin Elmer)를 사용하여 최종 라이브러리의 품질 및 평균 단편 크기를 평가하였다. NextSeq 500 High Output v2 키트 및 쌍형성-단부(paired-end) 75-bp 시퀀싱 화학을 사용하여 NextSeq 500 벤치탑 시퀀서(Illumina) 상에서 라이브러리를 풀링하고 시퀀싱하였다.
RNA-seq 분석
간 성상 세포에서 강성-유도 RNA 조절: 정규화된 유전자 발현 값을 Dou 등5으로부터 다운로드하였다. 낮게 발현된 유전자(기준선에서의 FPKM ≥ 2)를 분석으로부터 제거하고, 연질(soft) 표면 상에서 HSC에서의 평균 FPKM으로 나눈 강성 표면 상에서 HSC에서의 평균 FPKM으로서 배수 변화를 계산하였다. 상향조절된 유전자(f.c. >1)에 대한 RNA 발현의 배수 변화를 플롯팅하고, 유전자를 이의 평균 FPKM 값에 따라 순위를 매겼다.
인간 간 성상 세포의 TGFB1 자극 및 HFMCD에서의 항체 치료: 시퀀싱된 라이브러리를, --노-레인-분할(--no-lane-splitting) 옵션과 함께 bcl2fastq v2.19.0.316을 사용하여 탈멀티플렉스(demultiplex)하였다. 그 후에, 쌍형성된 단부 모드에서 옵션 MAXINFO:35:0.5 MINLEN:35와 함께 trimmomatic6 v0.36을 사용하여 어댑터 서열을 트리밍(trim)하였다. 트리밍된 판독물을, 쌍형성된 단부, 단일 통과 모드에서 --outFilterType BySJout --outFilterMultimapNmax 20 --alignSJoverhangMin 8 --alignSJDBoverhangMin 1 --outFilterMismatchNmax 999 --alignIntronMin 20 --alignIntronMax 1000000 --alignMatesGapMax 1000000과 함께 STAR7 v. 2.2.1을 사용하여 호모 사피엔스(Homo sapiens) GRCh38에 정렬시켰다. 단지 독특한 정렬을 카운팅을 위해 보유시켰다. 옵션 -O -s 2 -J -T 8 -p -R -G와 함께 하위판독물(subread) 8 v. 1.5.1로부터 피처카운트(FeatureCounts) 모듈을 사용하여 카운트를 유전자 수준에서 계산하였다. Ensembl 릴리스(release) 86 hg38 GTF를 아노테이션(annotation)으로 사용하여, STAR 지수 및 피처카운트에 대해 제조하였다.
마우스에서의 항체 치료 실험을 위해, 인간 시료에 대해 mm10 Ensembl 릴리스 86 게놈 및 아노테이션만 사용하여 라이브러리를 인간 시료에서와 같이 처리하였다.
Bioconductor 패키지 DESeq29 1.18.1을 사용하고, 비교를 위해 왈드 검정(Wald test)을 사용하고 0.05의 유의성 역치를 설정하는 분산 수축(variance shrinkage) 단계를 포함하여 R 3.4.1에서 차별적인 발현 분석을 수행하였다.
fgsea 패키지 및 MSigDB 홀마크 유전자세트10,11를 사용하고, 100000 이터레이션(iteration)을 수행하여 R 3.4.1에서 유전자 세트 농화 분석(GSEA)을 수행하였다. DESeq2 결과 출력(output)의 "stat" 컬럼을 각각의 농화에 대한 순위매겨진(ranked) 입력으로서 사용하였으며, 1-대-1 인간 이종상동체(ortholog)를 갖는 마우스 유전자만 얻었다.
효소-연결 면역흡착 검정(ELISA) 및 비색 검정
인간 IL-11 Quantikine ELISA 키트(D1100, R&D Systems) 및 총 MMP-2 Quantikine ELISA 키트(MMP200, R&D Systems)를 각각 사용하여 동일한 부피의 세포 배양물 배지 내 IL-11 및 MMP-2의 수준을 정량화하였다. 시리우스 레드 콜라겐 검출 키트(9062, Chondrex)를 사용하여 세포 배양물 상층액 내 총 분비된 콜라겐을 정량화하였다. Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(Quickzyme Biosciences)를 사용하여 간 내 총 하이드록시프롤린 함량을 측정하였다. 알라닌 트랜스아미나제 활성 검정 키트(ab105134, abcam), 콜레스테롤 검정 키트(ab65390, abcam), 및 트리글리세라이드 검정 키트(ab65336, abcam)를 각각 사용하여 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 콜레스테롤, 및 트리글리세라이드의 마우스 혈청 수준을 측정하였다. 트리글리세라이드 비색 검정 키트(10010303, Cayman)를 사용하여 간 트리글리세라이드(TG) 측정을 수행하였다. 모든 ELISA 및 비색 검정을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
마트리겔 침범 검정
24-웰 Boyden 챔버 침범 검정(Cell Biolabs Inc.)을 사용하여 인간 HSC의 침범 거동을 검정하였다. 무혈청 HSC 배지 중 동일한 수의 HSC를 ECM-코팅된 마트리겔 상으로 3벌 시딩하고, 0.2% FBS를 함유하는 HSC 배지를 향해 침범하게 하였다. 자극과 함께 48시간의 인큐베이션 후, 배지를 흡인하고, 면봉을 사용하여 비-침범 세포를 제거하였다. 하단 챔버를 향하여 침범한 세포를 세포 염색 용액(Cell Biolabs Inc.)으로 염색하고, 5개의 비-중복 필드/막으로부터의 침범 세포를 이미지화하고 40x 배율 하에 카운팅하였다. 항체 저해 실험을 위해, HSC를 X203, X209, 또는 IgG 대조군 항체로 15분 동안 전처리한 다음, 자극을 첨가하였다.
정밀 절단된 간 슬라이스(PCLS) 및 NASH 환자 간의 웨스턴 블로팅
간략하게는, 인간 PCLS를 자르고, TGFβ1과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인간 IL-11 DuoSet(DY218, R&D Systems)를 사용하여 상층액으로부터의 ELISA를 수행하였다. 이러한 CRO는 또한, 분자 연구를 위해 인접한 비-암성 조직을 수집하는 암에 대한 간 절제를 받는 환자로부터 간 생검을 수집하였다. 환자는 문헌화된(documented) 내재성 간 질환(대조군) 또는 이전에 문헌화된 알코올성 간 질환, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염 또는 NASH 중 어느 것도 갖지 않았다. 신뢰성 이유로, 어떠한 추가 정보도 이러한 시료에 제공되지 않았다.
정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)
급속-냉동된 간 조직 또는 HSC 용해물로부터 총 RNA를 트리졸(Trizol)(Invitrogen), 뒤이어 RNeasy 컬럼(Qiagen) 정제를 사용하여 추출하였다. iScriptTM cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 제조업체의 설명에 따라 이용하여 cDNA를 합성하였다. 40 주기에 걸쳐 TaqMan(Applied Biosystems)에 의해 또는 StepOnePlusTM(Applied Biosystem)를 사용하는 신속(fast) SYBR 녹색(Qiagen) 기술에 의해 유전자 발현 분석을 2벌로 수행하였다. 발현 데이터를 GAPDH mRNA 발현으로 정규화하였으며, 2-△△Ct 방법을 사용하여 배수 변화를 계산하였다. 특이적인 TaqMan 프로브 및 SYBR 녹색 프라이머의 서열은 요청 시 입수 가능하다.
면역블로팅
웨스턴 블롯을 HSC 및 간 조직으로부터의 총 단백질 추출물 상에서 수행하였다. 세포와 냉동된 조직 둘 다를, 프로테아제 및 포스파타제 저해제(Thermo Scientifics)를 함유하는 방사성면역침전 검정(RIPA) 완충제에서 균질화시키고, 뒤이어 원심분리시켜 용해물을 정제(clear)하였다. 단백질 농도를 브래드포드 검정(Bio-Rad)에 의해 결정하였다. 동일한 양의 단백질 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 막으로 이전시키고, 지시된 1차 항체에 대한 면역블롯 분석을 받게 하였다. 적절한 2차 항체와 함께 ECL 검출 시스템(Pierce)을 사용하여 단백질을 시각화하였다.
조직학
간 조직을, 10% 중성-완충된 포르말린(NBF) 중 RT에서 48시간 동안 고정시키고, 탈수하며, 파라핀 블록에 포매시키고, 7 μm에서 박절하였다. 마손 삼색으로 염색된 절편을 광현미경에 의해 검사하였다. n=3/그룹으로부터의 유사한 결과와 독립적으로 각각의 조직학 실험을 반복하였다. 절편의 이미지를 캡처하고, 4개 절편/간으로부터 Image-J 소프트웨어(색상 디컨볼루션-마손 삼색(color deconvolution-masson Trichrome))를 이용하여 청색-염색된 섬유증 면적을 반정량적으로 결정하였다. 치료 및 유전자형은, 조직학을 수행하고 반정량적 판독물을 생산하는 조사자에게 공개되지 않았다.
보충 물질에 대한 참조문헌
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실시예 5: 간세포에서 자가분비 IL11 cis-신호화는 지방독성과 비-알코올성 지방간염(NASH) 사이의 개시 연쇄(nexus)이다
5.1 개요
IL11 신호화는 비-알코올성 지방간염(NASH)에 중요하다. 본 실시예에서, 본 발명자들은, 지질-적재 간세포가, 자가분비 cis-신호화 루프를 통해 작동하여 지방세포자멸사(lipoapoptosis)를 야기하는 IL11을 분비함을 보여준다. IL6이 간세포를 보호하는 한편, IL11은 비-캐노니컬 신호화 경로의 활성화 및 NOX4와 반응성 산소종의 상향조절을 통해 간세포 사멸을 야기한다. 2개의 전임상 모델에서, Il11ra1의 간세포-특이적 결실은 NASH의 모든 양태로부터 마우스를 보호하였다. 게다가, 전체적인 Il11ra1 넉아웃 마우스에서 단지 간세포에서 IL11 cis-신호화의 복구는 지방증 및 염증을 재구성하였다. 어떠한 증거도 IL6 또는 IL11 trans-신호화의 존재를 뒷받침하는 것으로 밝혀지지 않았다. 본 발명자들은, 간세포 지방독성이, 간세포 사멸을 유발하고 섬유증 및 염증으로 이어지는 IL11 분비를 자극한다고 결론내린다. 이러한 데이터는 비-알코올성 지방 간 질환으로부터 NASH로의 이행에 대한 새로운 간세포-특이적 기전을 설명한다.
5.2 도입
인터루킨 11(IL11)은, 종(species)에 걸쳐 섬유증 정밀-절단 간 슬라이스에서 상승되는 주된 섬유형성 인자(Ng 등, 2019; Schafer 등, 2017)이다(Bigaeva 등, 2019). IL11은 독성 간 공격(insult) 후 간세포 기능에 미치는 음성 효과를 갖는 것으로 나타났고(Widjaja 등), 직접적으로 또는 간접적으로, 비-알코올성 지방간염(NASH) 병상에 기여한다(Widjaja 등, 2019). 스펙트럼의 다른 단부에서, 많은 보다 초기의 공개문헌은, IL11이 허혈성-유도, 감염-유도 또는 독소-유도 간 상해의 마우스 모델에서 보호적임을 시사하였다(Bozza 등, 1999; Maeshima 등, 2004; Nishina 등, 2012; Trepicchio 등, 2001; Yu 등, 2016; Zhu 등, 2015). 그러나, 현재, 보다 초기의 연구에서 사용되는 재조합 인간 IL11(rhIL11) 시약은 마우스에서 효과가 없는 것이 분명하다(Widjaja 등).
IL11은 인터루킨 6(IL6) 사이토카인 계통의 구성원이고, cis에서 신호화하기 위해 IL6과 마찬가지로 이의 막-결합된 알파 수용체(IL11RA) 및 당단백질 130(gp130)에 결합한다. IL6 자체는 간 기능과 연관이 있어 왔으며, 공개문헌은 전반적인 유익한 효과를 시사한다(Klein 등, 2005; Kroy 등, 2010; Matthews 등, 2010; Schmidt-Arras 및 Rose-John, 2016; Wuestefeld 등, 2003). 그러나, IL6은 가용성 IL6 수용체(sIL6R)에 결합하고 trans에서 신호화할 수 있는 것으로 생각되며, 이는 적응성이 없는(maladaptive) 것으로 간주된다(Schmidt-Arras 및 Rose-John, 2016). IL11은 IL6과 마찬가지로, 병원성 모드에서 trans에서 신호화하는 것이 가능하지만, 현재까지의 실험은 종양 또는 생식 조직에서 이에 대한 어떠한 증거를 밝혀내지 못하였다(Agthe 등, 2017; Balic 등, 2017).
비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD)으로부터 NASH로의 이행을 겪는 인자는 다인자적이지만, 간세포의 지질 로딩은 중심적으로 중요하다(Friedman 등, 2018). 소정의 지질 화학종은 간세포에 대해 독성이고, 이러한 지방독성은 사이토카인 방출을 자극시켜 간세포 사멸 및 간 성상 세포(HSC)와 면역 세포의 측분비 활성화를 야기한다(Farrell 등, 2018; Friedman 등, 2018). 지방독성, 예컨대 팔미테이트로 인한 지방독성(Kakisaka 등, 2012)은 NASH에서 초기의 사건이고, 식단, NAFLD 및 NASH 사이에서의 연결성(linkage)을 나타낸다. IL6 cis-신호화의 유전학적 또는 약물학적 저해가 지방증 표현형을 악화시키는 한편(Kroy 등, 2010; Matthews 등, 2010; Yamaguchi 등, 2010), 간 지방독성에서 IL11에 대한 역할은 기재되어 있지 않았다.
본 실시예에서, 광범위한 시험관내 및 생체내 접근법을 사용하여, 간세포 생물학, NAFLD 및 NASH에서 IL11에 관한 주요 문제를 해결하였다: (1) 인간 간세포에서 IL11 cis-신호화 및 trans-신호화의 진 역할을 정의하는 것, (2) 지방독성이 간세포에서 IL11 활성과 관련이 있는지의 여부를 검사하는 것, (3) IL11 또는 IL6 trans-신호화가 NASH에 기여하는지의 여부를 확립하는 것, (4) 간세포에서의 IL11 cis-신호화와 지방증, 간세포 사멸, 염증, 및 섬유증의 발증 사이의 연관성(inter-relationship)을 해체하는(dissect) 것. 이러한 연구는 IL6 및 IL11 생물학의 예상치 못한 양태를 드러내고, NAFLD로부터 NASH로의 이행을 개시하는 간세포에서 지방독성-활성화된, 자가분비 IL11 cis-신호화의 확실한 발병 효과를 실증한다.
5.3 결과
5.3.1 합성 IL11 trans-신호화 작제물은 간세포 사멸을 야기한다
본 발명자들은 우선, 1차 인간 간세포에서 IL6R, IL11RA 및 gp130의 발현 수준을 유세포분석에 의해 평가하였다. IL11RA 및 gp130의 강력한 발현은 대부분의 세포(각각 92.6% 및 91.9%)에서 관찰되었으나 단지 몇몇 간세포(3.0%)만 IL6R을 낮은 수준에서 발현하였다(도 33a 및 도 40a). 이 결과에 따르면, RNA-seq 및 리보-seq 연구는 간세포에서 고도로 발현되고 활성적으로 번역되는 IL11RA 및 gp130 전사체를 확인시켜 주었다. 대조적으로, 몇몇 IL6R 전사체가 관찰되었고, 검출 가능한 IL6R 번역은 거의 존재하지 않았다(도 33b 내지 도 33d, 도 40b 및 도 40c). 간세포의 면역형광 염색은 리보-seq 데이터의 결과를 확증시켜 주었다: 높은 IL11RA 발현이지만, 검출 불가능한 IL6R 발현(도 40d). 본 발명자들은 또한, 배양물 배지 내로의 IL6R의 유의한 수준을 검출하지 않았으며(수준은 검출 하한 바로 위였음), 따라서 IL6R이 쉐딩되는 확률을 배제하였다(도 40e). 이들 데이터를 종합하자면, IL6R은 1차 인간 간세포에서 매우 낮은 수준으로 발현되어, 이러한 세포에서 IL6 cis-신호화에 대한 제한된 역할을 내포한다. 그러나, 이러한 세포는 IL11RA와 gp130 둘 다의 강한 공동-발현을 나타낸다.
인간 간세포에 의한 IL6R 발현의 결여를 고려하여, 본 발명자들은 합성 IL6 trans-신호화 작제물(하이퍼IL6)을 이용하여 이러한 세포에서 IL6 신호화를 활성화시켰고, 이를 합성 IL11 trans-신호화 복합체(하이퍼IL11)와 비교하였다. 하이퍼IL11은 IL11 자체(Widiaia 등)와 마찬가지로, ERK 및 JNK를 용량-의존적 방식(2.5 ng/ml 내지 20 ng/ml)으로 활성화시켰다. 대조적으로, IL6 trans-신호화는 비-정준 신호화 경로를 활성화시키지 않았으나, 대신에 STAT3 활성화를 용량-의존적으로 유도하였다(도 33e). 그러므로, IL11 또는 IL6은 이의 코그네이트(cognate) 수용체와 함께 예비-형성된 합성 복합체에서, 간세포 상의 gp130에 결합되었을 때 상이한 세포내 경로를 활성화시키며, 이는 신규하고 흥미로운 발견이다.
하이퍼IL11은 1차 인간 간세포 세포 배양물의 배지에서 알라닌 트랜스아미나제(ALT)의 용량-의존적 증가를 야기한 반면, 하이퍼IL6(20 ng/ml)은 유의하지만 제한된 세포보호 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(배수 변화 (FC)=0.9; P=0.0468)(도 33f). 가용성 gp130(sgp130)은 gp130을 통해 작용하는 trans-신호화 복합체의 저해제이다(Schmidt-Arras 및 Rose-John, 2016). sgp130은 이의 보고된 유인 효과와 일관되게, 하이퍼IL11(p-ERK/p-JNK)과 하이퍼IL6(p-STAT3) 둘 다의 다운스트림 신호화 경로의 활성화를 차단하였고, 또한 하이퍼IL11의 간독성 효과를 저해하였다(도 33g 내지 도 33i).
그 후에, 본 발명자들은 인공 단백질 복합체 하이퍼IL6 또는 하이퍼IL11의 부재 하에 IL11 trans-신호화를 검출하기 위해 실험을 수행하였다. 세포를 가용성 gp130(sgp130, 추정상 trans-신호화를 저해하기 위해) 또는 가용성 IL11RA(sIL11RA, 추정상 trans-신호화를 강화시키기 위해)의 존재 하에 IL11로 자극하였다. IL11-유도 간세포 사멸 및 신호화는 sgp130 또는 sIL11RA에 의해 영향을 받지 않았다(도 33j 내지 도 33k 및 도 40f). 더욱이, IL11은 간세포 세포 사멸을 용량-의존적으로(0.625 ng/ml 내지 20 ng/ml) 야기하였으며, 이는 sgp130(1 μg/ml) 또는 sIL11RA(1 μg/ml)의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다(도 40g). 상호간에, sgp130 또는 sIL11RA의 용량을 증가시키는 것은 IL11-자극된 간세포로부터의 ALT 방출에 어떠한 효과도 갖지 않았다(도 40h). 이러한 데이터는, IL11 trans-신호화가 합성 작제물의 부재 하에 존재할 수 있음을 시사한다.
5.3.2 IL11 cis-신호화는 간세포에서 지방독성의 기초를 이룬다
지방 간 질환에서 IL11의 역할을 해결하기 위해, 본 발명자들은 간세포 지방독성을 모델링하고, NASH에 대한 개시 병상으로서 관찰하고, 상해를 입은 간세포로부터의 사이토카인 방출과 관련을 지었다(Friedman 등, 2018). NAFLD 환자의 혈청에서 나타나는 포화된 지방산(sFSs)의 농도를 사용하여 6:1의 비에서 팔미테이트:BSA 혼합물을 간세포에 로딩하였다(Kleinfeld 등, 1996). 대조군과 비교하여, sFA 로딩된 세포는 더 많은 양의 IL11(FC=28, P<0.0001) 및 또한 IL6, CCL2 및 CCL5(도 34a 내지 도 34d)를 분비하였다. 지질 로딩된 간세포는 FACS에 의해 세포자멸적 세포 사멸을 받았으며 또한 ALT의 괴사적 방출을 받았다(도 34e 내지 도 34g).
지질 로딩된 간세포로부터의 IL11 분비가 cis-신호화 또는 trans-신호화 방식에서 지방독성과 기능적으로 관련이 있는지를 시험하기 위해, 세포를 항-IL11RA 항체(X209) 또는 sgp130과 함께 인큐베이션하였다. X209는 IL11 자체를 포함하여 모든 사이토카인의 분비를 감소시킨 반면, sgp130은 어떠한 효과도 갖지 않았다(도 34a 내지 도 34g). 이는 간세포 지방독성에서 IL11 cis-신호화의 자가분비 루프를 시사한다. 상해를 입은 미토콘드리아로부터의 반응성 산소종(ROS)의 생성은 지방독성에 중요하고(Farrell 등, 2018), NOX4로부터의 ROS는 또한 NASH에서 적절하다(Bettaieb 등, 2015). X209는 sFA-로딩된 간세포에서 ROS 생성을 방지하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 글루타티온(GSH) 수준의 부분 회복에 의해 동반되었다(도 34h 및 도 34i).
다음으로, 본 발명자들은 신호화 사건을 검사하였다. 지방독성은 JNK의 활성화와 강하게 관련이 있으며, 이는 카스파제-3 활성화 및 지방세포자멸사를 유도한다. 이에, 팔미테이트 로딩된 간세포는 JNK 활성화 및 카스파제-3 절단, 뿐만 아니라 ERK 인산화를 나타내었다(도 34j). 이러한 패턴은 주목할 만하게는, IL11 자극으로 나타나는 효과와 유사하였다(도 33e). X209는, 간세포에 의한 유사한 sFA 흡수에도 불구하고, 팔미테이트-유도 신호화 사건, 뿐만 아니라 지방산 합성효소(FASN) 상향조절, 카스파제3 활성화 및 트리글리세라이드 축적을 대체로 저해하였다(도 34j, 도 34k, 및 도 40i). NOX4는 팔미테이트에 의해 상향조절되고 또한 X209에 의해 저해되었다(도 34j). STAT3이 sFA 로딩에 의해 활성화된 한편, 이러한 효과는 IL11RA-매개 신호화와 독립적이고 지방세포자멸사와 무관한 것으로 밝혀졌다(도 34j). 이러한 실험 전반에 걸쳐, sgp130은 어떠한 효과도 갖지 않았다. 종합하자면, 이러한 데이터는, 팔미테이트-유도 IL11 분비 및 자가분비, 공급물-포워드 IL11 cis-신호화가 간세포 지방독성에 중요함을 보여준다.
5.3.3 2개의 NASH 모델에서 IL11 또는 IL6 trans-신호화에 대한 어떠한 증거도 없다
그 후에, 본 발명자들은, trans-신호화가 생체내에서 NASH의 기초를 이루는지의 여부를 2개의 전임상 마우스 NASH 모델을 사용하여 조사하였다: 프룩토스가 보충된 서구 식단(WDF) 모델 및 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍 고 지방 식단(HFMCD) 모델. WDF 모델은 비만, 고지질혈증 및 인슐린 내성과 관련이 있으며, 당뇨병 환자에서와 같이 보편적인 형태의 인간 NASH로 번역 가능한 것으로 보인다. HFMCD 모델은, 간세포 지방독성에 의해 특이적으로 유도되는 신속한 개시 NASH를 자극시키며, 이는 인슐린 내성의 부재 하에 체중 손실과 관련이 있다. 지방독성은 모델 둘 다에서 보편적인 반면, 비만 및 인슐린 내성은 그렇지 않다.
WDF 및 HFMCD 식단을 시작하기 전 3주째에, 마우스에게, 마우스 gp130 단백질(아미노산 1 내지 617)의 전체 세포외 도메인을 함유하는 알부민 프로모터-주도 sgp130을 인코딩하는 AAV8 바이러스(AAV8-Alb-sgp130), 또는 알부민 프로모터 단독(AAV8-Alb-무효)을 주사하였다(도 35a, 도 41a, 및 도 42a). AAV8-Alb-sgp130 투여는 간에서 높은 수준의 sgp130을 유도하였으며, 이는 또한 추정상 IL6 또는 IL11 trans-신호화의 국소 저해와 전신 저해 둘 다에 적합한 말초 순환에서 검출 가능하였다(도 35b, 도 41b, 도 42b 내지 도 42c).
16주의 WDF 후, IL11 수준은 간 및 말초에서 강하게 상향조절되었으나, IL6 발현은 영향을 받지 않았다(도 35b 및 도 35c). WDF에 있는 마우스는 비만으로 되었으며(도 41c), 간 질량에서 대략 2-배 증가를 가졌고, 전체 형태, 조직학 및 간 트리글리세라이드의 정량적 분석에 의해 중증 지방증을 발증시켰다(도 35e 내지 도 35g). 이러한 표현형은 높은 수준의 sgp130 발현에 의해 영향을 받지 않았다(도 35b 내지 도 35g). 유사하게는, WDF에 있는 마우스는 결핍된 수준의 GSH와 더불어 상승된 수준의 ALT, AST, 콜라겐 및 말초 심혈관 위험 인자(공복 혈액 글루코스, 혈청 트리글리세라이드 및 혈청 콜레스테롤)를 가졌으나, 이러한 매개변수 중 어느 것도 sgp130에 의해 영향을 받지 않았다(도 35h 내지 도 35n). 16주 동안 WDF 식단에 있는 마우스로부터의 간은 전염증성 유전자 및 섬유증 유전자의 증가된 발현을 보여주었으며, 이러한 시그너처는 추정상 trans-신호화의 sgp130-매개 저해에 의해 영향을 받지 않았다(도 35o 및 도 41d 내지 도 41e).
제2 세트의 실험에서, HFMCD 식단을 사용하여 NASH를 유도하였다(도 42a). HFMCD 식단은 간 및 혈청에서 IL11 수준을 증가시킨 반면, IL6 수준은 간에서 약간 더 낮았고 말초에서 약하게 증가되었다(도 42b 및 도 42d 내지 도 42e). HFMCD 식단에 있는 마우스는 전체 형태, 조직학, 및 분자 검정에 의해 신속하고 확실한 지방증을 발증시켰으며, 이는 sgp130 발현에 의해 변경되지 않았다(도 42f 및 도 42g). 간세포 상해 마커(ALT 및 AST)는 sgp130 발현과 무관하게 HFMCD 식단에 의해 상승되었고 GSH는 결핍되었다(도 42h 내지 도 42j). 유사하게는, HFMCD-유도 간 섬유증은 sgp130 발현에 의해 변하지 않았다(도 42k). RNA 수준에서, HFMCD 식단은 염증 유전자 및 섬유증 유전자의 이상조절된(dysregulated) 발현과 관련이 있었고, 이러한 분자적 표현형은 sgp130 발현에 의해 영향을 받지 않았다(도 42l 및 도 42m).
신호화 수준에서, WDF 식단과 HFMCD 식단 둘 다는, 상승된 IL11 cis-신호화와 일관되게 ERK 및 JNK 활성화를 자극시켰다(도 35p 및 도 42n). 대조적으로, 간에서의 pSTAT3 수준은 WDF에 의해 상승되지 않았고(도 35p), HFMCD 식단에 있는 마우스에서 약하게 상승된 것으로 나타났다(도 42n). 모든 경우에, 식단-유도 신호화 사건에 미치는 sgp130의 어떠한 효과도 존재하지 않았다. 전반적으로, 이러한 데이터는, IL6 또는 IL11 trans-신호화 중 어느 것도 NASH에서 역할을 하지 않음을 시사하고, 이는 IL6 계열 trans-신호화가 검출되지 않았던 다른 연구와 일관된다(Agthe 등, 2017; Balic 등, 2017; Kammoun 등, 2017; Kraakman 등, 2015).
5.3.4 간세포-특이적 IL11 cis-신호화는 NASH를 개시하는 데 필요하다
어떠한 증거도 NASH 모델에서 IL11 trans-신호화를 뒷받침하는 것으로 밝혀지지 않은 한편, 전반적으로 데이터는 간세포에서 증가된 IL11 효과를 시사하였고, 이는 cis에서 추정되었다(presumed). 이러한 전제를 시험하기 위해, 본 발명자들은 AAV8-Alb-Cre를 Il11ra1 loxP/loxP 마우스에게 투여하여, 단지 간세포에서 Il11ra1을 결실시켰다(CKO 마우스). 그 후에, CKO 마우스를 정상 사료(NC), HFMCD 식단 또는 WDF로 사육하였다(도 36a 및 도 37a). 간 IL11RA 단백질은 AAV8-Alb-Cre 후 CKO에서 크게 감소되었으며, 이는 효과적인 모델을 보여주고 간세포가 Il11ra1의 가장 큰 간 저장소(reservoir)임을 시사하였다(도 36b 및 도 37b).
지방독성-주도 NASH를 신속하게 자극시키는 것에 더하여(Stephenson 등, 2018), HFMCD 식단은 체중 손실을 야기한다(Stephenson 등, 2018). 놀랍게도, HFMCD 식단에 있는 마우스에서 체중 손실은 초기에 제한되고 이후에 CKO 마우스에서 역전되었다(도 36c). WDF에 있는 마우스는 예상된 바와 같이 실험 기간 전반에 걸쳐 체중 및 지방 질량을 획득하였다. 그러나, 그리고 동일하게 놀랍게도, 이러한 비만 표현형은 CKO 마우스에서 경감되었다(도 37c 및 도 37d). 이러한 데이터는, IL11 신호화의 저해가 맥락(context)-특이적 항악액질 또는 항비만 효과와 함께 체중 향상성에 관대함을 시사한다.
전체 형태, 조직학 및 정량적 트리글리세라이드 분석에 의해, HFMCD 또는 WDF 식단에 있는 CKO 마우스는 지방증으로부터 강력하게 보호되었고(도 36d 및 도 36e, 도 37e 및 도 37f), WDF에 있는 마우스는 더 적은 간 비대(hepatomegaly)를 가졌다(도 37g). 간 상해 마커는 HFMCD 식단(감소: ALT, 99%; AST, 97%; 둘 다에 대해 P<0.0001) 또는 WDF(감소: ALT, 98%; AST, 98%; 둘 다에 대해 P<0.0001)으로 사육된 CKO 마우스에서 뚜렷하게 감소되었고, NC 대조군 수준과 비슷한 것으로 밝혀졌다(도 36f 및 도 36g, 도 37h 및 도 37i). 모델 둘 다에서, GSH 수준은 NASH 식단에 있는 대조군 마우스에서 약화되었으나 CKO에서 정규화되었다(도 36h 및 도 37j).
간 섬유증은 대조군과 비교하여 NASH 식단에 있는 CKO 마우스에서 크게 감소되었다(감소: HFMCD, 87%; WDF, 64%; 둘 다에 대해 P<0.001)(도 36i 및 도 36k). HFMCD 또는 WDF 식단에 있는 마우스에서 전염증성 유전자 및 섬유증 유전자의 상향조절은 또한 CKO에서 약화되었다(도 36j, 도 37l, 도 43a 및 도 43b, 도 44a 및 도 44b). 이는, HSC로부터 근섬유아세포로의 형질전환 및 면역 세포의 활성화가 부분적으로는, 간세포에서의 업스트림, IL11-주도 사건에 부차적임을 시사한다.
WDF에 있는 마우스는 또한, 고혈당증, 고중성지방혈증, 및 고콜레스테롤혈증을 발증시키고, 이는 모두 CKO에서 향상되었으며, 이는 보다 일반적으로 NASH 표현형에 대한 간세포-특이적 IL11 신호전달에 중요한 역할을 시사한다(도 44c 내지 도 44e). 신호화 수준에서, HFMCD 식단과 WDF 둘 다는 상승된 ERK 및 JNK 신호화를 초래하였다. 이는, 간세포에서의 IL11 신호화의 저해와 일관되게 CKO 마우스에서 대체로 방지되었다(도 36k 및 도 37m).
5.3.5 IL11ra1 무효 마우스에서 간세포-특이적 IL11 cis-신호화의 재구성은 간 섬유증이 아니라 지방간염을 복구시킨다
생체내 기능-획득 실험을 이용하여, CKO 마우스를 사용한 기능-소실 실험을 보완하였다. 본 발명자들은, 전반적인 Il11ra1 결실을 갖는 마우스(Il11ra1-/- 넉아웃(KO))의 간세포에서 IL11 cis-신호화 또는 trans-신호화를 특이적으로 복구시키는 것이 질환을 초래하는지의 여부를 조사하였다. KO 마우스에게, 전장, 막 결합된 Il11ra1(mbIl11ra1; cis-신호화를 재구성하기 위해) 또는 분비된/가용성 형태의 Il11ra1(sIl11ra1로서, Il11ra1의 세포외 부분을 구성함; trans-신호화를 가능하게 하기 위해)을 인코딩하는 AAV8 또는 대조군 작제물을 주사한 다음, 동물을 NC, HFMCD 식단 또는 WDF로 사육하였다(도 38a, 도 45a 및 도 46a).
AAV8-Alb-mbIl11ra1가 주사된 KO 마우스는 간세포 상에서 IL11RA1을 재발현하였고, AAV8-Alb-sIl11ra1이 주사된 KO 마우스는 간과 순환계 둘 다에서 sIL11RA1의 증가된 발현을 나타내었다(도 38b, 도 45b, 도 46b, 및 도 46c). 예상된 바와 같이, NC 상에서 대조군 AAV8 작제물(AAV8-Alb-무효)을 받는 야생형 마우스는 정상적인 간을 가졌고, HFMCD 식단 또는 WDF에 있을 때, 지방증, 염증 및 간 상해를 발증시켰다(도 38c 내지 도 38j, 도 45c 및 도 45d, 도 46d 내지 도 46k). 대조군 바이러스가 주사되고 HFMCD 또는 WDF 식단으로 사육된 KO 마우스는 NASH 표현형으로부터 보호되었지만, Il11ra1의 생식세포계(germline) 결실을 이용한 보호는 CKO에서 나타난 바와 같이 강하지 않았다.
KO 마우스에서 mbIl11ra1을 사용한 IL11 cis-신호화의 복구는, 전체 형태로부터 유전자 발현 및 신호화의 분자 패턴까지 명백한 간 지방증 및 염증을 설명하였다(도 38c 내지 도 38j, 도 45c 내지 도 45d, 및 도 46d 내지 도 46l). 주목할 만하게는, 간 콜라겐 함량 및 섬유증 유전자 발현은 복구되지 않았으며(도 38i 및 도 38j, 도 45d, 도 46i 및 도 46k), HSC-로부터-근섬유아세포로의 형질전환에 중요한(Widjaja 등, 2019) HSC에서의 IL11 신호화는 알부민-주도 Il11ra1 발현에 의해 영향을 받지 않는다(즉, HSC는 이러한 모델에서 Il11ra1에 대해 결실된 채로 남아 있음). 아주 대조적으로, 이론적으로 trans-신호화를 활성화시킬 KO의 간세포에서의 sIL11RA의 발현은 높은 IL11 수준에도 불구하고 어떠한 효과도 갖지 않았고(도 35b), 마우스는 모든 NASH 간 병상으로부터 보호되어 남아 있었다(도 38c 내지 도 38j, 도 45c 내지 도 45d, 및 도 46d 내지 도 46l). 신호화 변화는, mIL11RA 발현이 어떤 식단에서든 KO에서 ERK 및 JNK 활성화를 복구시킨 반면, sIL11RA1은 그렇지 않았다는 것과 일관되었다(도 38k 및 도 46l). WDF 모델에서, KO 마우스에서 간세포-특이적 IL11 cis-신호화의 복구는 고혈당증, 고중성지방혈증, 및 고콜레스테롤혈증을 야기하였으나, sIl11ra1의 발현은 그렇지 않았다(도 38l 내지 도 38n).
5.4 논의
대사적 간 질환은 비만 및 2형 당뇨병의 맥락에서 보편적으로 발생하고, 초기에는, NASH로 진전될 수 있는 NAFLD로서 나타난다(Friedman 등, 2018; Sanyal, 2019). NASH로의 진전에서 주된 기저 병상은 "기질 오버로드"이며, 대사물의 풍부함(abundance)은 지방을 처리하는 간세포의 능력을 초과하여 지방독성을 야기한다. 사이토카인은 지질독성 간세포로부터 분비되는 주된 NASH 인자이며(Friedman 등, 2018), 본원에서 본 발명자들은 IL11을 지질독성 환경의 중요한 구성요소 및 NAFLD-로부터-NASH로의 이행의 유도제(driver)로서 확립한다.
증거 중 상당 부분은, 간에서 IL6 신호화가 유익하다는 생각을 뒷받침한다(Kroy 등, 2010; Schmidt-Arras 및 Rose-John, 2016; Yamaguchi 등, 2010). 그러나, 간 지방증에서 IL6 trans-신호화에 대한 발병 역할이 제안되었다(Kammoun 등, 2017; Wieckowska 등, 2008). 본 발명자들은, 합성 작제물을 사용하여, IL11 trans-신호화를 개시하는 하이퍼IL11이 세포독성인 반면, 하이퍼IL6은 간세포에서 보호적임을 밝혀내었다. 그러나, 시험관내에서 또는 생체내에서 생물학적으로 관련된 맥락에서, 기능-획득과 기능-소실 둘 다를 사용하여 trans-신호화에 대한 어떠한 증거도 존재하지 않았다. 이는, IL6 계열 구성원 trans-신호화가 NASH에서 어떠한 역할도 하지 않으며, 이는 간 외부에서의 이전의 연구와 일치함을 시사한다(Agthe 등, 2017; Balic 등, 2017). 다른 질환에 대한 이러한 발견의 관련성은 명확하지 않고, 임상 시험은 궤양성 대장염에서 trans-신호화를 표적화하고 있다(Kang 등, 2019). 이전의 연구는, IL6R이 간세포에서 발현됨을 시사하였고(Schmidt-Arras 및 Rose-John, 2016), 따라서, 1차 인간 간세포는 매우 적은 IL6R을 발현하며/IL6R을 발현하지 않는 것으로 밝혀진 것은 놀라웠다. 이는 더 초기의 연구에서 형질전환된 간세포-유사 세포(예를 들어, HepG2)에서 강한 신뢰성을 반영할 수 있다.
본원에서, 본 발명자들은, NASH에 대한 간세포에서 IL11 cis-신호화의 결정적인 중요성을 보여준다. 이러한 효과는 야생형 유전적 배경 상에서 간세포-특이적 기능-소실과 또한 Il11ra1 무효 배경 상에서 간세포-특이적 기능-획득 둘 다를 사용하여 확립되었다. 이는, IL11이 간 질환의 뮤린 모델에서 마우스에서 효과가 없는, rhIL11의 사용에 기초하여 간세포에 대해 보호적이라는 문헌의 시사를 뒤집는다(Maeshima 등, 2004; Nishina 등, 2012; Trepicchio 등, 2001; Zhu 등, 2015). 중요하게는, 간세포-특이적 IL11 cis-신호화의 복구가 KO 마우스에서 지방간염을 야기하는 한편, 섬유증은 복구되지 않는 반면, 이는 CKO에서 방지되었다. 이는, HSC에서의 IL11 cis-신호화가 간 섬유증에 필요하고, 간세포 기능이상을 HSC 활성화의 업스트림을 배치함을 실증한다.
본 발명자들은, 지질 로딩된 간세포가, 자가분비 세포 사멸, HSC의 측분비 활성화 및 2차적인 염증성 세포 활성화와 침윤을 유발하는 IL11을 분비하는 NASH에 대한 기전적 모델을 제안한다(도 39). IL11 신호화의 저해는, 후속적인 간 섬유증 및 염증에 영향을 미치는 식단-유도 지방간염에 대한 개시 연쇄를 표적화하며, 이는 NASH에 대한 새로운 치료적 접근법을 시사한다.
5.5 실시예 5에 대한 재료 및 방법
5.5.1 AAV8 벡터
모든 아데노-관련 바이러스 혈청형 8(AAV8) 벡터를 벡터 Biolabs에 의해 합성하였다. 알부민(Alb) 프로모터에 의해 유도되는 마우스 막-결합된 Il11ra1 cDNA(NCBI 기탁 번호: BC069984), 마우스 가용성 Il11ra1 cDNA, 및 마우스 가용성 gp130 cDNA를 소유하는 AAV8 벡터는 각각 AAV8-Alb-mbIl11ra1, AAV8-Alb-sIl11ra1, 및 AAV8-Alb-sgp130으로 지칭된다. 마우스 gp130 서열(NCBI 기탁 번호: BC058679) 및 마우스 Il11ra1 서열 막관통 영역 및 세포질 영역을 각각 제거함으로써 AAV8-Alb-sgp130 및 AAV8-Alb-sIl11ra1을 작제하였다. AAV8-무효 벡터를 벡터 대조군으로서 사용하였다. 알부민-발현 세포에서 Il11ra1을 특이적으로 결실시키기 위해, AAV8-Alb-iCre 벡터를, LoxP-flanked Il11ra1 대립유전자에 대해 동형접합성인 마우스(Il11ra1 loxP/loxP 마우스)에게 주사하였다.
5.5.2 항체
알부민(ab207327, Abcam), Alexa Fluor 488 2차 항체(ab150077, Abcam), 절단된 카스파제-3(9664, CST), 카스파제3(9662, CST) p-ERK1/2(4370, CST), ERK1/2(4695, CST), GAPDH(2118, CST), gp130(PA5-28932, Thermo Fisher), IL6(AF506, R&D systems), IL6R(유세포분석, ab222101, Abcam), IL6R(면역형광 염색을 위해, MA1-80456, Thermo Fisher), IL11(Aldevron), IL11RA(유세포분석 및 면역형광 염색, ab125015, Abcam), IL11RA(웨스턴 블롯, 130920, Santa Cruz), p-JNK(4668, CST), JNK(9258, CST), p-STAT3(4113, CST), STAT3(4904, CST), 마우스 HRP(7076, CST), 토끼 HRP(7074, CST), 래트 HRP(31470, Santa Cruz).
5.5.3 재조합 단백질
상업적인 재조합 단백질: 인간 하이퍼IL6(IL6R:IL6 융합 단백질, 8954-SR, R&D systems), 인간 가용성 gp130 Fc(671-GP-100, R&D systems), 인간 IL11RA(8895-MR-050, R&D systems).
주문 재조합 단백질: 인간 IL11(UniProtKB:P20809, Genscript). trans-신호화 복합체를 모방하는 인간 하이퍼IL11(IL11RA:IL11 융합 단백질)을, 20개 아미노산 링커와 함께 IL11RA(아미노산 잔기 1-317; UniProtKB: Q14626) 및 IL11(아미노산 잔기 22-199, UniProtKB: P20809)의 단편을 사용하여 작제하였다(SEQ ID NO:20)(Schafer 등, 2017).
5.5.4 화학물질
팔미테이트(P5585, Sigma), 파라포름알데하이드(PFA, 28908; Thermo Fisher), 포볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, P1585, Sigma), Triton X-100(T8787, Sigma), 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(D1306; Thermo Fisher).
5.5.5 1차 인간 간세포 배양물
1차 인간 간세포(5200, Sciencell)를, 2% 우태 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 간세포 배지(520, Sciencell)에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 간세포(P2-P3)를, 기재된 바와 같이 상이한 용량의 다양한 재조합 단백질로 자극하기 전 24시간째에 방법에서 다르게 명시되지 않는 한 밤새 혈청-고갈시켰다.
5.5.6 THP-1 배양물
THP-1(ATCC)을 10% FBS 및 0.05 mM β-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640(A1049101, Thermo Fisher)에서 배양하였다. THP-1 세포를 RPMI 1640 중 10 ng/ml의 PMA로 48시간 동안 분화시켰다.
5.5.7 시험관내 팔미테이트(포화된 지방산) 치료
팔미테이트: 6:1의 비에서 BSA 접합 용액을 더 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다(Alsabeeh 등, 2018). 지방산 무함유 BSA에서 접합된 팔미테이트(0.5 mM)를 사용하여, 도면 범례에 기재된 바와 같이 세포를 처리하였고; 0.5% BSA 용액을 대조군으로서 사용하였다.
5.5.8 유세포분석
표면 IL11RA, IL6R, 및 gp130 분석을 위해, 1차 인간 간세포 및 THP-1 세포를 IL11RA, IL6R, 또는 gp130 항체 및 상응하는 Alexa Fluor 488 2차 항체로 염색하였다. 1차 인간 간세포를, 아넥신 V FITC 및 PI를 이용하는 사멸 세포 세포자멸사 키트(V13242, Thermo Fisher)로 염색함으로써 세포 사멸 분석을 수행하였다. 그 후에, PI+ve 세포를 유세포분석기(Fortessa, BD Biosciences)로 정량화하고, 유동Jo 버전 X 소프트웨어(TreeStar)로 분석하였다.
5.5.9 면역형광
1차 인간 간세포를 염색 전 24시간째에 8-웰 챔버 슬라이드(1.5X104 세포/웰)에 접종하였다. 세포를 4% PFA에서 20분 동안 고정하고, PBS로 세척하며, 비-특이적 부위를 PBS 중 5% BSA로 2시간 동안 차단하였다. 세포를 IL11RA, IL6R, gp130, 또는 알부민 항체와 함께 밤새(4℃) 인큐베이션하고, 뒤이어 적절한 Alexa Fluor 488 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 챔버 슬라이드를 암실에서 건조하고, DAPI와 함께 5 방울의 마운팅 배지를 슬라이드에 15분 동안 첨가한 후, 형광 현미경(Leica)에 의해 이미지화하였다.
5.5.10 오일 레드 O 염색
1차 인간 간세포를 8-웰 챔버 슬라이드 상에 시딩하였다(1X104 세포/웰). 24시간의 팔미테이트 처리 후, 세포를 10% PFA에서 30분 동안 고정하고, 증류수로 세척하고, 60% (v/v) 이소프로필 알코올과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 오일 레드 O 용액으로 30분 동안 염색하고, 증류수로 세척한 다음, 명시야 현미경(bright field microscope)(BX53, Olympus)을 이용하여 이미지화하였다. 지질 액적을 이의 레드 염색에 의해 식별하였다.
5.5.11 반응성 산소종(ROS) 검출
1차 인간 간세포를 8-웰 챔버 슬라이드 상에 시딩하였다(1X104 세포/웰). 이 실험을 위해, 팔미테이트 처리 전에 세포를 혈청-고갈시키지 않았다. 팔미테이트 자극 후 24시간째에, 세포를 세척하고, 37℃, 암실에서 25 μM의 DCFDA 용액(ab113851, Abcam)과 함께 인큐베이션하고, 희석 완충제로 제조업체의 프로토콜에 따라 헹구었다. 양성 DCF 염색을 갖는 살아 있는 세포를 형광 현미경(Leica)을 사용하여 플루오레신(FITC)에 적절한 필터 세트로 이미지화하였다.
5.5.12 동물 모델
동물 실험을 SingHealth 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 가이드라인 하에 수행하였다. 마우스를 SPF 환경에서 유지시키고, 사료 및 물을 마음대로 제공하였다.
대사적 간 질환의 마우스 모델
HFMCD
6-8주령 C57BL/6N, Il11ra1-/- 마우스, 및 Il11ra1 loxP/loxP 및 이의 각각의 대조군을 60 kcal% 지방이 보충된 메티오닌-결핍 및 콜린-결핍 식단으로 4주 동안 사육하였다. 대조군 마우스는 정상 사료(NC, Specialty Feeds)를 받았다.
WDF
6-8주령 C57BL/6N, Il11ra1-/- 마우스, 및 Il11ra1 loxP/loxP 이의 각각의 대조군을 식수 중 15% 중량/부피 프룩토스가 보충된 서구 식단(D12079B, Research Diets)으로 16주 동안 사육하였다. 대조군 마우스는 정상 사료 및 수돗물을 받았다.
Il11ra1-결실 마우스(KO)
6-8-주령 수컷 Il11ra1-/- 마우스(B6.129S1-Il11ratm1Wehi/J, Jackson's Laboratory)에게 4 x 1011 게놈 복사체(gc: genome copy)의 AAV8-Alb-mbIl11ra1 또는 AAV8-Alb-sIl11ra1 바이러스를 정맥내로 주사하여, 마우스 Il11ra1 또는 가용성 Il11ra1의 간세포 특이적 발현을 각각 유도하였다. 대조군으로서, Il11ra1-/- 마우스 및 이의 야생형 한배새끼(Il11ra1+/+) 둘 다에게 4 x 1011 gc AAV8-Alb-무효 바이러스를 정맥내로 주사하였다. 바이러스 주사 후 3주째에, 마우스를 HFMCD, WDF, 또는 NC로 사육하였다. 식단의 연속기간은 기재되어 있다.
가용성 gp130의 생체내 투여
6-8-주령 수컷 C57BL/6N 마우스(InVivos)에게 4 x 1011 gc AAV8-Alb-sgp130 바이러스를 주사하여, 가용성 gp130의 간세포 특이적 발현을 유도하였으며; 대조군 마우스에게 4 x 1011 gc AAV8-Alb-무효 바이러스를 주사하였다. 바이러스 투여 후 3주째에, 마우스를 기재된 연속기간 동안 HFMCD, WDF, 또는 NC로 사육하였다.
Il11ra-플록스드(floxed) 마우스(CKO)
이전에 기재된 바와 같이(Ng 등) CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여, Il11ra1 유전자의 엑손 4 내지 7이 loxP 부위의 측면에 있는 Il11ra-플록스드 마우스를 생성하였다. 간세포에서 Il11ra1의 특이적 결실을 유도하기 위해, 6-8-주령 수컷 동형접합성 Il11ra1-플록스드 마우스에게 AAV8-Alb-Cre 바이러스(4 x 1011gc)를 정맥내로 주사하였으며; 유사한 양의 AAV8-Alb-무효 바이러스를 대조군으로서 동형접합성 Il11ra1-플록스드 마우스 내로 주사하였다. AAV8-주사된 마우스는 HFMCD, WDF, 또는 NC 사육 전 3주 동안 회복되도록 하였다. 넉다운 효율을 간 IL11RA의 웨스턴 블로팅에 의해 결정하였다.
5.5.13 RNA-시퀀싱(RNA-seq) 및 리보솜 프로파일링(리보-seq)
RNA-seq 및 리보-Seq 라이브러리 제조를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Chothani 등, 2019).
RNA-seq 라이브러리의 생산
RNeasy 컬럼(Qiagen)을 사용하여 총 RNA를 인간 간세포로부터 추출하였다. Qubit RNA 고-민감성 검정 키트(Life Technologies)를 사용하여 RNA를 정량화하고, LabChip GX RNA 검정 시약 키트(Perkin Elmer)를 사용하여 이의 품질을 이의 RNA 온전성 수에 기초하여 평가하였다. TruSeq Stranded mRNA 라이브러리 제조 키트(Illumina)를 제조업체로부터의 표준 설명에 따라 사용하여, 전사체 존재비를 측정하였다.
리보-seq 라이브러리의 생산
간세포를 10 cm 배양 접시에서 90% 컨플루언스까지 성장시키고, 0.1 mg/mL 사이클로헥시미드가 보충된 1 mL 냉각 용해 완충액(TruSeq® 리보 프로파일 포유류 키트에서와 같은 제형, RPHMR12126, Illumina)에서 용해시켰다. 그 후에, 균질화되고 정제된 용해물을 Truseq 뉴클레아제(Illumina)로 제조업체의 설명에 따라 풋프린팅하였다. Illustra Sephacryl S400 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 리보솜을 정제하고, 보호된 RNA 단편을 표준 페놀:클로로포름:이소아밀알코올 기법으로 추출하였다. 리보솜 RNA 제거(Mammalian RiboZero Magnetic Gold, Illumina) 후, TruSeq® 리보 프로파일 포유류 키트를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 풋프린팅된 RNA로부터 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다.
StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems) 상에서 제조업체의 프로토콜에 따라 KAPA 라이브러리 정량화 키트(KAPA Biosystems)를 사용하여 최종 RNA-seq 및 리보솜 프로파일링 라이브러리를 정량화하였다. LabChip GX DNA 고 민감도 시약 키트(Perkin Elmer)를 사용하여 최종 라이브러리의 품질 및 평균 단편 크기를 결정하였다. 독특한 지수(index)를 갖는 라이브러리를 풀링하고, NextSeq 500 High Output v2 키트 및 쌍형성된-단부 75-bp 시퀀싱 화학을 사용하여 NextSeq 500 벤치탑 시퀀서(Illumina) 상에서 시퀀싱하였다.
RNA-시퀀싱 및 리보솜 프로파일링을 위한 데이터 가공 및 분석
원(raw) 시퀀싱 데이터를 bcl2fastq V2.19.0.316과 탈멀티플렉스하고, Trimmomatic(Bolger 등, 2014) V0.36을 사용하여 어댑터를 트리밍하여, 20 nt 클립핑-후(post-clipping)보다 길이가 더 긴 판독물을 보유하였다. 리보-seq 판독물을 보우타이(bowtie)(Langmead 등, 2009)를 사용하여 기지의 mtRNA, rRNA 및 tRNA 서열(RNACentral(The RNAcentral Consortium, 2017), 릴리스 5.0)에 정렬하고, 비정렬된 판독물만 리보솜 보호된 단편(RPF)으로서 보유하였다. STAR(Dobin 등, 2012)를 사용하여 인간 게놈(hg38)에의 정렬을 수행하였다. 특질 카운트와 함께(Liao 등, 2014) 독특하게 맵핑된 판독물(Ensembl 데이터베이스 릴리스 GRCh38 v86)을 사용하여 리보-seq에 대해 CDS(코딩 서열) 및 RNA-seq에 대해 엑손 영역 상에서 유전자 발현을 정량화하였다. TPM을 계산하고 박스플롯을 사용하여 시각화하여, IL11RA(ENSG00000137070), IL6R(ENSG00000160712), 및 gp130(ENSG00000134352)의 기준선 발현을 비교하였다. 가닥 특이적 정렬 파일과 함께 Gviz R 패키지(Hahne 및 Ivanek, 2016)를 사용하여, IL11RA, IL6R 및 gp130에 대한 리보-seq 및 RNA-seq 판독물을 사용하는 판독 커버리지를 시각화하였다.
5.5.14 비색 검정
ALT 활성 검정 키트(ab105134, Abcam)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 세포 배양 상층액에서의 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 활성을 측정하였다. 글루타티온 비색 검출 키트(EIAGSHC, Thermo Fisher)를 사용하여 간 글루타티온(GSH) 수준을 측정하였다. Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(QZBtotco15, Quickzyme Biosciences)를 사용하여, 마우스 간에서의 총 하이드록시프롤린 함량을 측정하였다. 트리글리세라이드 검정 키트(ab65336, Abcam)를 사용하여 혈청 및 간 트리글리세라이드의 수준을 측정하였다. AST 검정 키트(ab105135, Abcam) 및 콜레스테롤 검정 키트(ab65390; Abcam)를 각각 사용하여 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 콜레스테롤의 마우스 혈청 수준을 측정하였다. 모든 비색 검정을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다
5.5.15 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)
마우스 gp130 DuoSet ELISA(DY468, R&D systems)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 마우스 혈청 내 gp130의 수준을 정량화하였다.
5.5.16 RT-qPCR
급속-냉동된 간 조직으로부터 총 RNA를 트리졸(Trizol)(Invitrogen) 및 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였다. iScript cDNA 합성 키트(Biorad)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 40 주기에 걸쳐 TaqMan(Applied Biosystems)에 의해 또는 StepOnePlus(Applied Biosystem)를 사용하는 SYBR 녹색(Qiagen) 기술에 의해 유전자 발현을 2벌로 분석하였다. 발현 데이터를 GAPDH mRNA 발현으로 정규화하였으며, 배수 변화를 2-△△Ct 방법을 사용하여 계산하였다. 특이적인 TaqMan 프로브 및 SYBR 녹색 프라이머의 서열은 요청 시 입수 가능하다.
5.5.17 면역블로팅
간세포로 및 간 조직으로부터의 총 단백질 추출물 상에서 웨스턴 블롯을 수행하였다. 간세포 및 간 조직 용해물을, 프로테아제 및 포스파타제 저해제(Roche)를 함유하는 RIPA 용해 및 추출 완충액(89901, Thermo Scientific)에서 균질화하였다. 단백질 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 막으로 이전시켰다. 적절한 2차 항체: 항-토끼 HRP 또는 항-마우스 HRP와 함께 ECL 검출 시스템(Pierce)을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하였다.
5.5.18 간 조직 가공 및 조직학적 분석
간 시료를 10% 중성 포르말린에서 고정하고, 파라핀화시키고, 5 μm로 절편으로 자르고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 표준 프토토콜에 따라 염색하고, 광현미경에 의해 검사하였다.
5.5.19 통계학적 분석
GraphPad Prism 소프트웨어(버전 6.07)를 사용하여 모든 통계학적 분석을 수행하였다. 던넷(Dunnett)(몇몇 실험 그룹이 하나의 조건과 비교되었을 때), 터키(Tukey)(몇몇 조건이 하나의 실험 내에서 서로 비교되었을 때), 시닥(Sidak)(2개의 상이한 유전자형으로부터의 몇몇 조건이 서로 비교되었을 때)에 따른 다중 시험을 위해 P 값을 교정하였다. 2개의 상이한 그룹의 비교를 위해 2개의 매개변수에 대한 분석을 양측 ANOVA에 의해 수행하였다. 통계학적 유의성에 대한 기준을 P <0.05로 설정하였다.
5.6 실시예 5에 대한 참조문헌
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 6: 췌장염에서 섬유-염증성 기전의 해체
만성 췌장염은 병인학적으로(aetiological) 이종성인 섬유-염증성 증후군이며, 외분비 및 내분비 췌장 부전을 유발한다.
췌장 성상 세포(PSC)는 2개 상태로 존재하고, 췌장 손상에 관여하는 주된 섬유형성 세포 유형이다. PSC는 간 조직실질(HSC)에서의 세포를 포함하여 신체에서 더 넓은 레티노이드-저장 세포 네트워크의 파트이다. IL-11은 최근, NASH에서 정의적 병상(defining pathology)인 HSC 형질전환에서 주요 역할을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Widjaja 등, Gastroenterology (2019) 157(3): 777-792]).
무스 무스쿨루스(Mus musculus)로부터의 췌장 조직의 단일-세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 분석(타불라 무리스 컨소시엄(Tabula muris Consortium) 데이터 - Schaum 등, Nature (2018) 562: 367-372)은, PSC(및 췌관 세포)가 Il6ra가 아니라 ll11ra1의 높은 발현을 나타냄을 드러낸다 - 도 47a 참조. 이러한 결과는 인간 PSC의 면역형광 분석에 의해 단백질 수준에서 확인되었다(도 47b).
PSC 활성화는 시험관내에서 IL-11을 이용한 치료에 의해 촉발되는 것으로 나타났으며, PSC 활성화에 대한 자극(즉, TGFβ1, IL-11, bFGF, CTGF, PDGF 또는 ET-1)과는 상관 없이, IL-11 매개 신호화의 항-IL-11RA 항체 길항제를 이용한 치료에 의해 저해되었다 - 도 48a 및 도 48b 참조.
IL-11의 유도적, 섬유아세포-특이적 발현을 갖는 유전자이식 마우스는 췌장 섬유증을 발증시킨다 - 도 49a 내지 도 49c.
췌장 손상의 췌관 결찰(PDL) 모델에서, IL-11 매개 신호화의 항-IL-11RA 항체 길항제를 이용한 치료는 췌장 섬유증을 감소시키고, PDL과 관련된 췌장 조직에서 감소를 저해하였다 - 도 50a 내지 도 50c 참조.
SEQUENCE LISTING <110> Singapore Health Services Pte. Ltd. (All states) National University of Singapore (All states) Clegg, Richard Ian (Lesotho only) <120> Treatment and Prevention of Metabolic Diseases <130> 007641822 <150> GB 1906291.8 <151> 2019-05-03 <150> GB 1906597.8 <151> 2019-05-10 <150> GB 2001013.8 <151> 2020-01-24 <150> GB 2001896.6 <151> 2020-02-12 <150> GB 2002030.1 <151> 2020-02-14 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens IL-11 (UniProt P20809) <400> 1 Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro 1 5 10 15 Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser 20 25 30 Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe 50 55 60 Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg 85 90 95 Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg 100 105 110 Arg Ala Gly Gly Ser Ser 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Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile 325 330 335 Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val 355 360 365 Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala 370 375 380 Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu 385 390 395 400 Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile 405 410 415 Pro Ala Cys Asp Phe Gln Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala 420 425 430 Phe Pro Lys Asp Asn Met Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu 435 440 445 Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala 450 455 460 Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr 465 470 475 480 Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val 485 490 495 Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala 500 505 510 Tyr Leu Lys Gln Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys 515 520 525 Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val 530 535 540 Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr 545 550 555 560 Ile Ile Gly Asn Glu Thr Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu 565 570 575 Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met 580 585 590 Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe 595 600 605 Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Val Pro 610 615 620 Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu Phe Cys 625 630 635 640 Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro 645 650 655 Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro 660 665 670 Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe 675 680 685 Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe 690 695 700 Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn 705 710 715 720 Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser 725 730 735 Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn 740 745 750 Thr Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg 755 760 765 His Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser Thr Gln 770 775 780 Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu Val Asp 785 790 795 800 His Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr Phe Lys 805 810 815 Gln Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His Phe Glu 820 825 830 Arg Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val Arg Leu 835 840 845 Lys Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser Gly Gln 850 855 860 Met Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly Pro Gly 865 870 875 880 Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu Ala Ala 885 890 895 Thr Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val Arg Gln 900 905 910 Gly Gly Tyr Met Pro Gln 915 <210> 3 <211> 422 <212> PRT <213> Homo sapiens IL11RA (UniProt Q14626) <400> 3 Met Ser Ser Ser Cys Ser Gly Leu Ser Arg Val Leu Val Ala Val 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Val Glu Ser Val Pro Gly Tyr Pro Arg Arg Leu Arg Ala Ser Trp 225 230 235 240 Thr Tyr Pro Ala Ser Trp Pro Cys Gln Pro His Phe Leu Leu Lys Phe 245 250 255 Arg Leu Gln Tyr Arg Pro Ala Gln His Pro Ala Trp Ser Thr Val Glu 260 265 270 Pro Ala Gly Leu Glu Glu Val Ile Thr Asp Ala Val Ala Gly Leu Pro 275 280 285 His Ala Val Arg Val Ser Ala Arg Asp Phe Leu Asp Ala Gly Thr Trp 290 295 300 Ser Thr Trp Ser Pro Glu Ala Trp Gly Thr Pro Ser Thr Gly Thr Ile 305 310 315 320 Pro Lys Glu Ile Pro Ala Trp Gly Gln Leu His Thr Gln Pro Glu Val 325 330 335 Glu Pro Gln Val Asp Ser Pro Ala Pro Pro Arg Pro Ser Leu Gln Pro 340 345 350 His Pro Arg Leu Leu Asp His Arg Asp Ser Val Glu Gln Val Ala Val 355 360 365 Leu Ala Ser Leu Gly Ile Leu Ser Phe Leu Gly Leu Val Ala Gly Ala 370 375 380 Leu Ala Leu Gly Leu Trp Leu Arg Leu Arg Arg Gly Gly Lys Asp Gly 385 390 395 400 Ser Pro Lys Pro Gly Phe Leu Ala Ser Val Ile Pro Val Asp Arg Arg 405 410 415 Pro Gly Ala Pro Asn Leu 420 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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siRNA to IL-11Ralpha (U32324.1) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n = deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (41)..(42) <223> n = deoxythymidine <400> 19 gcucaaggaa cguguguaan nuuacacacg uuccuugagc nn 42 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20 amino acid linker <400> 20 Gly Pro Ala Gly Gln Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Val 20 <210> 21 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hyper IL-11 (IL-11RA:IL-11 fusion) <400> 21 Met Ser Ser Ser Cys Ser Gly Leu Ser Arg Val Leu Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Thr Ala Leu Val Ser Ala Ser Ser Pro Cys Pro Gln Ala Trp Gly Pro 20 25 30 Pro Gly Val Gln Tyr Gly Gln Pro Gly Arg Ser Val Lys Leu Cys Cys 35 40 45 Pro Gly Val Thr Ala Gly Asp Pro Val Ser Trp Phe Arg Asp Gly Glu 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Gln Gly Pro Asp Ser Gly Leu Gly His Glu Leu Val 65 70 75 80 Leu Ala Gln Ala Asp Ser Thr Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Cys Gln Thr 85 90 95 Leu Asp Gly Ala Leu Gly Gly Thr Val Thr Leu Gln Leu Gly Tyr Pro 100 105 110 Pro Ala Arg Pro Val Val Ser Cys Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Asn Phe 115 120 125 Ser Cys Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ile Ser Gly Leu Pro Thr Arg Tyr 130 135 140 Leu Thr Ser Tyr Arg Lys Lys Thr Val Leu Gly Ala Asp Ser Gln Arg 145 150 155 160 Arg Ser Pro Ser Thr Gly Pro Trp Pro Cys Pro Gln Asp Pro Leu Gly 165 170 175 Ala Ala Arg Cys Val Val His Gly Ala Glu Phe Trp Ser Gln Tyr Arg 180 185 190 Ile Asn Val Thr Glu Val Asn Pro Leu Gly Ala Ser Thr Arg Leu Leu 195 200 205 Asp Val Ser Leu Gln Ser Ile Leu Arg Pro Asp Pro Pro Gln Gly Leu 210 215 220 Arg Val Glu Ser Val Pro Gly Tyr Pro Arg Arg Leu Arg Ala Ser Trp 225 230 235 240 Thr Tyr Pro Ala Ser Trp Pro Cys Gln Pro His Phe Leu Leu Lys Phe 245 250 255 Arg Leu Gln Tyr Arg Pro Ala Gln His Pro Ala Trp Ser Thr Val Glu 260 265 270 Pro Ala Gly Leu Glu Glu Val Ile Thr Asp Ala Val Ala Gly Leu Pro 275 280 285 His Ala Val Arg Val Ser Ala Arg Asp Phe Leu Asp Ala Gly Thr Trp 290 295 300 Ser Thr Trp Ser Pro Glu Ala Trp Gly Thr Pro Ser Thr Gly Pro Ala 305 310 315 320 Gly Gln Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 325 330 335 Ser Val Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro 340 345 350 Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala 355 360 365 Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp 370 375 380 Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly 385 390 395 400 Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala 405 410 415 Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly 420 425 430 Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala 435 440 445 Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu 450 455 460 Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro 465 470 475 480 Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly 485 490 495 Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu 500 505 510 Lys Thr Arg Leu 515 <210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enx203 VH <400> 22 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Pro Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Glu Leu Gly His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enx203 VL <400> 23 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala 50 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Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Gly Ala Thr Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 29 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enx108A lambda LC <400> 29 Gln Ser 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Ser 210 215 <210> 30 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hEnx203 VH <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Pro Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Glu Leu Gly His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hEnx203 VL <400> 31 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Asp 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Leu Gly His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr 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185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (25)

  1. 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제.
  2. 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도.
  3. 대사 질환을 치료하거나 방지하는 방법으로서, 방법은 치료적 또는 예방적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제2항에 있어서, 또는 제3항에 있어서, 상기 대사 질환은 비만(obesity), 2형 당뇨병(T2D: type 2 diabetes), 1형 당뇨병(T1D: type 1 diabetes), 전당뇨병(pre-diabetes), 과체중(being overweight), 대사 증후군(metabolic syndrome), 임신-관련 고혈당증(pregnancy-associated hyperglycemia), 담즙울체성 간 질환(cholestatic liver disease), 고혈당증(hyperglycaemia), 고지질혈증(hyperlipidaemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 소모성(wasting), 악액질(cachexia), 화학치료법-관련 체중 손실(chemotherapy-associated weight loss), 췌장 부전(pancreatic insufficiency), 췌장염(pancreatitis), 급성 췌장염(acute pancreatitis), 만성 췌장염(chronic pancreatitis), 지방증(steatosis), 지방독성(lipotoxicity), 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease), 비-알코올성 지방 간(NAFL: non-alcoholic fatty liver), 비-알코올성 지방간염(NASH: non-alcoholic steatohepatitis), 지방이영양증(lipodystrophy), 지방비대증(lipohypertrophy), 지방위축증(lipoatrophy), 인슐린 내성(insulin resistance) 또는 고글루카곤혈증(hyperglucagonemia)이거나 이를 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  5. 제1항 또는 제4항, 제2항 또는 제4항, 또는 제3항 또는 제4항에 있어서, 제제는 인터루킨 11(IL-11)이 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)에 결합하는 것을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  6. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)에 결합할 수 있는 것인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  7. 제1항, 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2항, 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머(aptamer) 또는 저분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제제는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11 항체 길항제, 또는 이의 항원-결합 단편인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 제제는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11Rα 항체 길항제, 또는 이의 항원-결합 단편인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서, 제제는 유인 수용체(decoy receptor)인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제제는 IL-11에 대한 유인 수용체인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  13. 제12항에 있어서, IL-11에 대한 유인 수용체는 (i) gp130의 사이토카인 결합 모듈(module)에 상응하는 아미노산 서열 및 (ii) IL-11Rα의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  14. 제6항 또는 제7항에 있어서, 제제는 IL-11 뮤테인(mutein)인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  15. 제14항에 있어서, IL-11 뮤테인은 W147A인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  16. 제1항 또는 제4항에 있어서, 제2항 또는 제4항에 있어서, 또는 제3항 또는 제4항에 있어서, 제제는 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 것인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 제제는 올리고뉴클레오타이드 또는 저분자인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제제는 IL-11의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  19. 제18항에 있어서, IL-11의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:12, 13, 14 또는 15의 서열을 포함하는 IL11로 표적화된 siRNA인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 제제는 IL-11Rα의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  21. 제20항에 있어서, IL-11Rα의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:16, 17, 18 또는 19의 서열을 포함하는 IL11RA로 표적화된 siRNA인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  22. 제5항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인터루킨 11 수용체는 IL-11Rα이거나 이를 포함하는 것인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  23. 제1항, 또는 제4항 내지 제22항 중 어느 한 항, 제2항, 또는 제4항 내지 제22항 중 어느 한 항, 또는 제3항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  24. 제1항, 또는 제4항 내지 제23항 중 어느 한 항, 제2항, 또는 제4항 내지 제23항 중 어느 한 항, 또는 제3항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 것으로 결정되었던 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  25. 제1항, 또는 제4항 내지 제24항 중 어느 한 항, 제2항, 또는 제4항 내지 제24항 중 어느 한 항, 또는 제3항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 대상체에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계, 및 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
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