KR20190083801A - 데스모글레인 3의 유전적 변이 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

데스모글레인 3단백질의 발현 수준이 야생형 세포에 비하여 저하된 표피 세포, 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 및 이를 이용한 개체의 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

데스모글레인 3의 유전적 변이 및 이의 용도 {Genetic mutation of desmoglein 3 and use thereof}

데스모글레인 3 단백질의 변이체를 발현하는 세포, 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 및 이를 이용한 개체의 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

천포창이란 피부와 점막에 수포를 형성하는 만성물집 질환으로, 표피 세포에 대한 자가항체를 가지는 자가 면역 질환으로 여겨진다. 임상 및 조직 소견에 따라 심상성 천포창, 증식성 천포창, 낙엽상 천포창, 홍반성 천포창 등으로 나눌 수 있습니다.

천포창을 진단하는 방법은 1) 피부나 점막의 파괴되지 않은 물집에서 얻은 샘플을 현미경으로 검사하거나, 2) 피부 조직에 천포창을 유발할 수 있는 항체가 있는지 직접적인 면역형광법을 이용하여 검사하거나, 3) 환자의 혈청에 자가항체가 있는지 검사하는 간접면역형광법을 이용하여 검사하거나, 4) 환자의 혈청에 자가항체 유무 및 질병의 활성도를 효소결합면역흡수법을 이용하여 검사하는 등의 방법이 있다.

현재 천포창의 가장 주된 치료는 면역억제제를 사용하는 것이다. 예를 들면, 코르티코스테로이드의 투여는 새로운 수포의 발생을 효과적으로 억제할 수 있으며 질병의 활성도가 심한 경우 고용량으로 사용하다 증상의 호전도에 따라 서서히 감량된다. 증상이 매우 심한 환자에서 면역글로불린 정맥주사 요법을 사용하면 임상적인 호전을 기대할 수 있으며, 최근 시도되는 표적치료(리툭시맙: Rituximab)는 B 세포를 선택적으로 제거함으로써 천포창 증상을 유발하는 자가항체의 생성을 억제한다. 리툭시맙은 스테로이드의 장기간 사용시 발생 가능한 부작용을 줄일 수 있다는 장점이 있다고 알려져 있다.

그러나, 아직까지 효율적인 천포창 질환의 진단 방법의 개발은 미흡한 실정이다. 천포창의 맞춤 진단 및 치료를 위하여 먼저 정확한 유전적 진단법의 확립이 요구되고 있다. 이에 본 발명자들은 기존에 보고되지 않은 신규한 돌연변이 유전자를 규명하였으며, 상기 돌연변이 유전자가 천포창 유사 질환의 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 단백질의 발현 수준이 야생형 세포에 비하여 저하된 표피 세포를 제공한다.

다른 양상은 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 키트를 제공한다.

다른 양상은 개체의 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

일 양상은 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 단백질의 발현 수준이 야생형 세포에 비하여 저하된 표피 세포를 제공한다.

야생형 세포는 유전적 변형을 갖지 않는 세포를 의미하며, 정상인 세포 또는 참조 유전체 서열을 갖고 있는 세포인 것일 수 있다.

상기 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 단백질의 발현 수준이 야생형 세포에 비하여 저하된 것은, 표피 세포 내 DSG3 단백질이 발현되지 않아 존재하지 않거나, 또는 야생형 세포에 비하여 낮은 수준으로 발현되어 그 양이 적은 것일 수 있다. 즉, 상기 데스모글레인 3 단백질의 발현 수준이 야생형 세포에 비하여 저하된 것은, 데스모글레인 3 단백질이 손실되거나 결핍된 것일 수 있다.

DSG3 단백질은 NCBI Accession No. CCDS 11898.1, NP_001935.2 또는 서열번호 1에 표시된 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 것일 수 있다. DSG3 유전자는 상기 DSB3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, NCBI Accession No. CCDS 11898.1, NM_001944.2 또는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.

표피(epidermis)에서 각질형성세포(Keratinocyte)는 데스모좀(desmosome)으로 불리우는 세포-세포 부착 결합부(cell-cell adhesion junction)에 의해 인접한 각질형성세포와 결합한다. 데스모좀은 세포질 플라크(cytoplasmic plaques)와 막관통 캐드히린(transmembrane cadherins)으로 구성된다. 데스모좀의 캐드히린은 4 종의 데스모글레인(desmogleins: DSGs, DSG1-4) 및 3 종의 데스모콜린(desmocollins: DSCs: DSC1-3)을 포함하며, 이들은 세포내 공간에서 이종이량체로 상호작용(heterodimeric interaction)하면서 존재한다. 즉, DSG는 데스모좀의 구조물이다. 캐드히린 중에서, DSG1 및 DSG3은 표피에서 서로 다른 위치에 존재한다. DSG1 및 DSG3는 각각 표피의 상부층 및 하부층에서 주로 발현된다. 이들 2종의 DSG 이소폼(isoform)은 어느 하나가 결핍되는 경우에 다른 하나가 보상적으로 기능한다. 그러나, 두 이소폼의 발현 수준(밀도)이 조직에 따라 다르기 때문에, 어느 하나의 결핍 시에 특정 조직에서 수포가 발생할 수 있다. 피부에는 DSG1의 발현 수준이 높지만, 점막에서는 상대적으로 DSG1의 발현 수준이 높지 않다. 따라서, 피부에서 DSG3의 불활성화는 피부에 영향을 적게 미치는 반면, 점막에서 DSG3의 불활성화는 점막에서 DSG3의 결핍을 완전하게 보상하지 못한다. 이는 점막에서 DSG1의 발현 수준이 높지 않기 때문이다. DSG3의 불활성화는 이론적으로 두가지 요인, DSG3의 기능장애 및 DSG의 손실에서 기인한다. DSG3의 기능장애에 의해 천포창이 유발된 환자에 대하여는 보고된 바 있으나, DSG3의 손실에 의해 유발된 천포창 환자는 보고된 바 없다.

상기 표피 세포는 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 단백질 변이체를 발현하는 것일 수 있다.

용어, “DSG3 단백질 변이체”란 서열번호 1로 표시되는 DSG3 단백질의 아미노산 서열에 넌센스 변이가 일어난 것을 의미한다. 구체적으로, DSG3 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 DSG3 단백질 변이체인 것일 수 있다. 상기 DSG3 단백질 변이체는 세포외 (Extracellular: EC) 도메인 1-5에서 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 DSG3 단백질 변이체인 것일 수 있고, 세포외 도메인 3에서 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 DSG3 단백질 변이체인 것일 수 있다. 즉, DSG3 단백질 변이체를 발현하는 것은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 생성되도록 전사 및 번역되는 것을 의미한다.

상기 표피 세포는 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 유전자 변이체를 발현하는 것일 수 있다. 상기 표피 세포는 상기 DSG3 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

용어, “DSG3 유전자 변이체”란 서열번호 2로 표시되는 DSG3 유전자의 뉴클레오티드 서열 일부에 변이가 일어난 것을 의미한다. 구체적으로, DSG3 유전자 변이체는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또는 DSG3 유전자 변이체는 인간의 18번 염색체의 29041235 번째 염기 C가 T로 치환된 것일 수 있다.

상기 DSG3 유전자 변이체는 DSG3 유전자의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism: SNP) 또는 점 돌연변이(point mutation)에 의해, 미스센스 돌연변이(missense mutation)를 유발하는 것일 수 있다.

용어 "유전자"는 유전 정보를 결정하는 구조 단위를 의미하며, 단백질의 아미노산 서열 또는 기능 RNA(tRNA, rRNA 등)의 염기 배열을 결정하는 정보를 가지는 구조 유전자, 및/또는 구조 유전자의 발현을 제어하는 조절 유전자, 예를 들면, 프로모터, 억제자(repressor), 작동유전자(operator) 등을 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유전자"는 유전자의 산물을 생성하기 위해 전사되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 가닥 쪽을 의미하는 것으로 이해된다.

통상의 기술자라면 상기 등록번호를 이용하여 단일염기다형성 마커 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. UCSC genome browser 또는 GenBank에 등록되어 있는 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

용어 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"은 당해 기술분야에 통상적으로 알려진 의미로 사용된다. 단일염기다형성은 유전체 상에서 단일 염기 또는 뉴클레오티드(A, T, C 또는 G, 뉴클레오티드 A는 아데닌, 뉴클레오티드 T는 티민, 뉴클레오티드 C는 시토신, 뉴클레오티드 G는 구아닌을 의미함)가 종의 멤버들 간 또는 집단 내 게놈에 존재하는 염기 또는 뉴클레오티드 서열의 다양성 또는 다형을 의미한다. 단일염기다형성는 인간 유전체 상에 가장 많이 존재하는 유전적 다형성으로, 유전학적으로 단일염기다형성에 따라 각 개체에 큰 차이를 야기할 수 있다. 상기 단일염기다형성은 단일뉴클레오티드변이(single nucleotide variant: SNV)와 혼용될 수 있다. 상기 단일뉴클레오티드변이는 유전체 상에서 하나의 염기 또는 뉴클레오티드의 차이를 보이는 서열의 변경을 의미한다.

상기 단일염기다형성은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 염기가 시토신(C) 또는 티민(T)인 것일 수 있다. 또는 상기 단일염기다형성은 인간의 18번 염색체의 29041235 번째 염기가 C 또는 T인 것일 수 있다.

상기 표피 세포는 점막 조직 또는 피부 조직 유래인 것일 수 있다. 상기 표피 세포는 각질형성세포(Keratinocyte)인 것일 수 있다.

상기 표피 세포는 구강 조직 또는 후두 조직 유래인 것일 수 있다.

상기 표피 세포는 척추동물, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 또는 조류 유래의 것일 수 있고, 보다 구체적으로 포유동물 유래의 것일 수 있으며, 예를 들면 인간(Homo sapiens) 유래의 것일 수 있다.

상기 표피 세포는 기탁번호 KCTC 13702BP로 기탁된 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 DSG3 단백질 변이체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 DSG3 유전자 변이체는 천포창 유사 질환의 진단 마커일 수 있다. 따라서, 상기 DSG3 단백질 변이체의 p.R287X 변이 부위 또는 상기 DSG3 유전자 변이체의 c.859C>T 변이 부위는 천포창 유사 질환의 진단을 위한 돌연변이 마커일 수 있다.

용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "천포창 유사 질환의 진단"이란 천포창 유사 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병의 위험을 예측하는 것을 의미하는 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

용어, "단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 단백질을 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 p. R287X 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제일 수 있다.

용어, "단백질의 p. R287X 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 단백질의 p. R287X 변이 부위를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.

상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 DSG3 단백질 변이체, 예를 들면 DSG3 변이체의 p. R287X 변이 부위를 타겟(target)으로 하는 특정 화합물 또는 합성 물질일 수 있고, 보다 구체적으로 DSG3 단백질 변이체에 특이적인 항체일 수 있고, 보다 더 구체적으로 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 단백질 변이체에 특이적인 항체일 수 있으나, 그 종류가 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 상기 DSG3 단백질 변이체에 특이적인 항체는, DSG3 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 DSG3 단백질 변이체를 얻고, 얻어진 DSG3 단백질 변이체로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 DSG3 단백질 변이체에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함될 수 있고, 부분 펩티드로는, 7개 아미노산, 9개 아미노산, 또는 12개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 나아가, 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다.

다중클론 항체는 상기한 DSG3 단백질 변이체 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다중클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단일클론 항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6: 511-519, 1976), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature 352: 624-628, 1991; Marks et al, J Mol Biol 222(58): 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

상기 DSG3 단백질 변이체를 검출할 수 있는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

용어, "폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 c. 859 C>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제일 수 있다.

용어, "폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.

상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 DSG3 유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있고, 구체적으로 DSG3 유전자 변이체의 c. 859 C>T 변이 부위에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있고, 보다 구체적으로 DSG3 유전자 변이체의 c. 859 C>T 변이 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있으나, 그 종류가 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 859번 위치인 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것일 수 있다.

상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 통상의 기술자가 DSG3 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인할 수 있다.

용어, "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, DSG3 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열 부위의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 천포창 유사 질환을 진단할 수 있다.

용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, DSG3 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 천포창 유사 질환을 진단할 수 있다.

상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phospharamidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한하지 않는다.

용어, "안티센스 핵산"은 타겟으로 하는 DSG3 유전자 변이체에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 DSG3 유전자 변이체와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, DSG3 유전자 변이체를 검출하는 데 사용될 수 있다.

상기 안티센스 핵산은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 이들에 상보적인 것일 수 있다. 상기 단편은 5개 이상, 구체적으로 10개 이상, 보다 구체적으로 10개 내지 1000개, 보다 더 구체적으로 10개 내지 500개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 500개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 300개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 200개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 150개의 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나의 단일가닥 폴리뉴클레오티드가 천포창 유사 질환의 발병 위험과 연관되어 있는 경우, 상기 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 당연히 천포창 유사 질환 발병 위험과 연관되어 있는 것을 판단될 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은, 하나의 특정한 서열을 가진 천포창 유사 질환의 발병 위험과 연관되어 있는 단일가닥 폴리뉴클레오티드 및 그에 상보적인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

예를 들면, 인간의 18번 염색체의 29041235 번째 염기(단일염기다형성 마커)는 "C" 또는 "T"이다. 이 경우, 상기 조성물은 인간의 18번 염색체의 29041235 번째 염기(단일염기다형성 마커)의 "C" 또는 "T" 뉴클레오티드를 포함할 뿐만 아니라, 인간의 18번 염색체의 29041235 번째 염기에 대응되는 위치에 "G" 또는 "A" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 염기 C 또는 T, 또는 인간의 18번 염색체의 29041235번째 염기를 검출할 수 있다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 천포창 유사 질환의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

상기 키트는 검사 대상에게서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출함으로써 천포창 유사 질환의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단할 수 있다.

구체적으로, 상기 키트는 검사 대상에게서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 p. R287X 변이 부위, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위를 특이적으로 검출함으로써 천포창 유사 질환의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단할 수 있다.

상기 키트에는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 특이적으로 인지하는 항체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산이 포함될 수 있고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적으로, 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

상기 RT-PCR 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위를 특이적으로 검출하기 위하여 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함할 수 있다. RT-PCR 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

상기 마이크로어레이 칩은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위의 존재 여부를 검출하여 천포창 유사 질환의 발병 가능성을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.

서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위에 대한 프로브를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, DNA 마이크로어레이는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법에 의해 상기 c. 859 C>T 변이 부위에 대한 프로브를 기판 상에 고정화시킬 수 있다. 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

상기 단백질 칩 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 발현수준을 측정할 수 있다. 단백질 칩 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

다른 양상은 천포창 유사 질환을 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다.

용어, "개체"는 천포창 유사 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병 위험도를 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 보다 구체적으로 포유동물일 수 있으며, 예를 들면 인간(Homo sapiens)일 수 있다. 상기 개체는 아시아계 인, 또는 한국인일 수 있다. "개체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

용어, "생물학적 시료"는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 생물학적 시료는 점막 또는 피부의 조직 또는 세포인 것일 수 있다.

상기 단백질은 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 p. R287X 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것일 수 있다. 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질을 검출하는 분석법은 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 효소면역흡착법(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역분석법(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation Assay), 보체고정분석(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter: FACS), 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 분석법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에서, 개체로부터 분리한 생물학적 시료에 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 p. R287X 변이 부위, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c. 859 C>T 변이 부위가 존재할 경우, 천포창 유사 질환이 발병되었거나 또는 발병 위험이 있는 것으로 진단할 수 있다.

상기 개체의 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 것은 천포창 유사 질환의 발병의 상대적인 위험을 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 정상인 군 또는 참조 유전체 서열을 갖고 있는 군에 비하여 천포창 유사 질환 발병 가능성이 증가되어 있는지를 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다.

용어 "참조 유전체 서열(reference genome sequence)"은 다형성 또는 변이 확인을 위해 참조가 되는, 인간 유전체 서열인 것일 수 있다. 참조 유전체 서열은, 참조 유전체의 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소의 데이터베이스에 게시된 인간 유전자의 뉴클레오티드 서열, 구체적으로, NCBI37.1 또는 UCSC hg19(GRCh37)인 것일 수 있다. 상기 개체의 뉴클레오티드 서열과 참조 유전체 서열 간의 비교는 공지된 다양한 서열 비교 분석프로그램, 예를 들면 Maq, Bowtie, SOAP, GSNAP 등을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 천포창 유사 질환은 동형집합형인 단일염기다형성에 의해 유발되는 것일 수 있다. 상기 천포창 유사 질환은 점막에 수포가 형성되는 것일 수 있고, 구체적으로, 후두 점막, 구강 점막 또는 이들의 조합에 수포가 형성되는 것, 또는 점막의 기저상부에 수포(suprabasal blister)가 형성되는 것일 수 있다. 상기 천포창 유사 질환은 피부 병변을 갖지 않는 것일 수 있고, 구체적으로 두피, 모발 또는 이들의 조합은 정상의 표현형을 갖는 것일 수 있다.

도 4는 DSG3^-/- 마우스에서의 표현형을 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, DSG3^-/- 마우스의 경우, 구강, 질, 콧구멍 및 결막을 포함하는 점막의 기저 상부에서 수포를 보였으며, 외상으로 나타나는 피부의 짓무름 및 소모증(hypotrichosis)을 보였다. 그러나, DSG3^-/- 마우스와는 달리, 인간에서 DSG3의 기능이 상실된 경우, 결막 및 생식기의 점막이 비교적 보존되고, 모발의 상태도 정상적이었다. 인간에서 DSG3의 변이는 외상으로 나타나는 피부에 미치는 영향이 비교적으로 낮은 것으로 판단된다. 또한, DSG3가 결핍된 인간 환자에서 마우스에 비하여 경증 정도의 표현형을 나타내는 것은, DSG3 결핍시에, 인간의 DSG1이 보상할 수 있는 능력(compensation capability)이 마우스의 DSG1이 보상할 수 있는 능력보다 우수하다는 것을 암시한다.

일 양상에 따른 데스모글레인 3 단백질의 변이체 및 이를 발현하는 세포는 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 마커로서 이용할 수 있다. 천포창 유사 질환에 대하여 유전자 검사를 통한 정확한 조기진단을 가능하게 하며, 그에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료효과를 극대화할 수 있다.

도 1a는 환자의 구강 점막의 임상학적 분석 결과를 나타낸다. 도 1b 및 도 1c는 환자의 구강 점막 및 두피의 조직학적 분석 결과를 나타낸다.
도 2a는 DSG3의 넌센스 변이를 확인한 결과를 나타낸다. 도 2b는 DSG3의 세포외 도메인 1-5의 구조를 나타낸다.
도 3a는 환자 및 정상인의 구강 점막 절편의 면역형광 염색 분석을 나타낸다. 녹색은 타겟 단백질을 염색한 것이고, 파란색은 DAPI를 염색한 것이다. 스케일 바는 100 ㎛ 기준으로 나타내었다. 도 3b는 환자 및 정상인의 피부 각질형성세포 및 점막 각질형성세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 3c는 환자의 데스모좀 구조를 나타낸다. 스케일 바는 100nm를 기준으로 나타내었다.
도 4는 DSG3 결핍 (DSG3^-/- ) 마우스에서의 표현형을 나타낸다.
도 5는 환자의 진피 및 표피의 면역형광 염색 분석을 나타낸다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 데스모글레인 3( desmoglein 3: DSG3 ) 결핍 환자에서의 천포창 유사 증상 분석 및 이를 유발하는 유전적 변이 SNP 859C> T 확인

1. 연구대상 선정 및 점막 조직에서 수포 형성의 임상학적 및 조직학적 분석

1.1. 연구대상 선정 및 점막 조직에서의 수포 형성의 임상학적 분석

본 연구는 연세대학교 의과대학 임상 시험 심의위원회의 승인하에 수행되었으며, 연구에 참가한 환자는 서면으로 동의하였다.

환자는 1세 여아로, 출생 일주일 후부터 구강(oral)에서 출혈이 있었으며, 구강 및 후두(laryngeal)의 점막(mucosa)에서 반복되는 짓무름(erosion)을 보였다. 결막(conjunctival) 및 생식기(genital)의 점막과 피부는 손상되지 않았고(spared), 모발은 정상적으로 자랐다. 환자의 부모는 피부와 점막에서 수포(blister)를 보이지 않았다.

도 1a는 환자의 구강 점막의 임상학적 분석 결과를 나타낸다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 환자의 혀에서 다수의 짓무름과 입술이 갈라진 증상을 보였으며, 후두에서 짓무름을 나타내었다. 도 1c는 환자의 두피의 임상학적 분석 결과를 나타낸다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 환자의 두피와 모발은 정상적인 소견을 보였다.

1.2 점막 조직에서 수포 형성의 조직학적 분석 - 헤마톡실린 및 에오신 염색, 면역형광 염색 및 전자 현미경 관찰

환자 및 환자의 부모로부터 두피(scalp)와 구강 점막(oral mucosa) 조직을 수득하고, 이를 포르말린에 고정(fixation)하고, 파라핀에 포매(embedding)하고, 6㎛로 절편화하였다. 절편화된 조직 샘플을 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 후, 현미경을 이용하여 피부 및 구강 점막 조직 절편에서 이미지를 수득하였다.

도 1b는 환자의 구강 점막의 조직학적 분석 결과를 나타낸다. 도 1c는 환자의 두피의 조직학적 분석 결과를 나타낸다. 도 1b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이, 구강 점막에서 기저상부의 극세포해리성 수포(suprabasal acantholytic blisters)가 관찰되었으나, 두피에서 표피 및 모발 구조는 정상으로 보였다.

절편화된 조직 샘플을 마우스 항-인간 DSG3 항체 (클론 5H10; Novus Biologicals 및 클론 5G11; Invitrogen), 마우스-항-인간 DSC3 항체 (클론 DSC3-U114; Progen), 마우스 항-인간 프라코글로빈(plakoglobin) 항체 (클론 PG-11E4; Invitrogen) 및 마우스 항-인간 데스모플라킨(desmoplakin) 항체 (Progen)를 포함하는 1차 항체 및 낙엽상 천포창 환자의 혈청에서 수득한 IgG (PF IgG, 데스모글레인 1 IgG)로 염색하였다. 이어서, Alexa Fluor 488가 결합된 래빗 항-마우스 IgG 및 고트 항-인간 IgG (Invitrogen)를 포함하는 2차 항체와 결합시켰다. 그 후, 절편을 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole: DAPI) (Invitrogen)로 5분 동안 염색하였다. LSM 780 공초점 현미경 (confocal microscope) (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 염색된 조직 샘플로부터 이미지를 수득하고, 투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy (H-7600, Hitachi, Japan)을 이용하여 Karnovsky 정착액 (Karnovsky's fixative)에 고정된 피부 조직 절편에서 이미지를 수득하였다.

도 3은 환자 및 정상인에서 데스모좀 단백질 성분의 발현 수준 및 구조를 나타낸다. 도 3a는 환자 및 정상인의 구강 점막 절편의 면역형광 염색 분석을 나타낸다. 녹색은 타겟 단백질을 염색한 것이고, 파란색은 DAPI를 염색한 것이다. 스케일 바는 100 ㎛ 기준으로 나타내었다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 환자의 점막 내 DSG3는 발현되지 않았다. 반면, 다른 데스모좀의 캐드히린(cadherins)인 데스모글레인1 (desmoglein 1: DSG1) 및 데스모콜린(desmocollin), 프라코글로빈(plakoglobin), 및 데스모플라킨(descmoplakin)의 경우, 정상인과 발현 수준이 유사하였다.

도 3c는 환자의 데스모좀 구조를 나타낸다. 스케일 바는 100nm를 기준으로 나타내었다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 표피의 하부층(기저층, stratum basalis: SB) 및 상부층(과립층, stratum granulosum: SG)에서 데스모좀이 관찰되었다. 관찰된 데스모좀은 기저층 및 과립층에서 정상이었다.

1.3 데스모글레인 3 결핍 환자의 혈청에서의 데스모글레인 1 및 3 수준 분석 - 효소 연관 면역 측정법 (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)

ELISA를 이용하여, 환자의 혈청에서 데스모글레인 1 및 3에 대한 항체를 검출하였다 (MBL diagnostics). 그 결과, 데스모글레인 1의 농도는 약 25.0 U/ml, 데스모글레인 3의 농도는 약 30.4 U/ml이었다.

2. 점막 조직에서의 수포 형성의 유전적 변이 분석 및 동형접합형 SNP 859C> T 확인

2.1 점막 조직에서 수포 형성의 유전적 변이 분석, 동형접합형 SNP c.859C> T 및 p. R287X 확인 - 전체-게놈 시퀀싱(whole-genome sequencing: WGS )

환자 및 환자의 부모로부터 혈액 샘플을 채취하고, 혈액 샘플을 대상으로 전체 게놈 시퀀싱을 다음과 같이 수행하였다.

혈액 샘플을 대상으로 일루미나 라이브러리 제작 프로토콜(TruSeq DNA PCR-free library, Illumina)을 이용하여 시퀀싱 라이브러리를 준비하였다. 준비된 라이브러리를 HiSeq X Ten 장비 (Illumina)를 이용하여 시퀀싱하였다. 이어서, Isaac Aligner (Illumina)를 사용하여, BCL 파일 포맷의 WGS 원 데이터를 인간 참조 게놈에 정렬시켜(aligned) BAM 파일을 생성하였다. Issac 변이 추출기 (Variant Caller)(https://www.illumina.com/documents/products/whitepapers/whitepaper_isaac_workflow.pdf), SnpEff (http://snpeff.sourceforge.net/SnpEff.html), Manta (https://www.synapse.org/#!Synapse:syn312572) 및 Control-FREEC를 이용하여, 변이 추출의 정확도를 향상시켰다.

변이 추출 결과, 환자에서 3,474,087 종의 SNP를 확인하였다. 상기 데이터에서, 비 코딩 유전자의 SNP를 제외하고, 정지(stop-gained) (stop-loss) 및 격자이동 SNP를 선별하였다. 필터링을 수행한 후, 정지(stop-gained) 및 격자이동 SNP를 선별하여 표 1에 나타내었다. 그 중에서, 동형접합형 변이인 chr18:29041235의 c. 859C>T를 최종적으로 선별하였다.

유전자	유전형 (Homo/Hetero)	참조게놈 대립인자 (Reference allele)	환자 대립인자 (Patient allele)	염색체 번호 (Chr)	위치 (Position)
정지코돈(STOP CODON GAINED)
DSG3	T/T (Homo)	C	T	18	29041235
HELZ2	G/A (Hetero)	G	A	20	62203525
격자이동(FRAMESHIFT)
HSPB11	AG/A (Hetero)	AG	A	1	54387416
ZNF717	A/AATGACTT (Hetero)	A	AATGACTT	3	75787044
MAML3	TTGCTGCTGC/T (Hetero)	TTGCTGCTGCTGC	TTGCTGCTGC,T	4	140811063
TRIM4	A/AT (Hetero)	A	AT	7	99516871
ARHGEF5	A/ATGGAGGCTGAGGAGGCCCAGCG (Hetero)	A	ATGGAGGCTGAGGAGGCCCAGCG	7	144059763
CYSLTR2	AT/A (Hetero)	AT	A	13	49281070
CCDC175	CACTAGAG/C (Hetero)	CACTAGAG	C	14	60005557
RNFT1	GAT/G (Hetero)	GAT	G	17	58040263
GAMT	C/CTCCA (Hetero)	C	CTCCA	19	1399155
ZNF799	TA/T (Hetero)	TA	T	19	12501866

2.2. 점막 조직에서 수포 형성의 유전적 변이 분석, 동형접합형 SNP c.859C> T 및 p. R287X 확인 - DSG3의 부위 특이적인 앰플리콘 시퀀싱(site-specific amplicon sequencing) 및 제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism: RFLP)

환자 및 환자의 부모로부터 혈액 샘플을 채취하고, DNA 추출 키트를 이용하여 혈액 샘플에서 게놈 DNA를 수득하였다. 표적 프라이머를 사용하여 DSG3 유전자를 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 증폭하였다.

PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)은 제한효소 TaqI를 이용하여 수행하였다.

도 2a는 DSG3의 넌센스 변이를 확인한 결과를 나타낸다. 하부 도면은 환자의 가계를 나타내고, 여기서 사각형은 남성, 원형은 여성, 채워진 도형은 질환의 영향을 받은 개체를 나타낸다. 중간 도면은 환자의 가계 및 건강한 정상인의 PCR-RFLP 분석 결과를 나타내고, N은 정상인을 나타낸다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 야생형 대립인자에서, 596 bp의 단편은 247 bp 및 249 bp의 두 단편으로 나누어졌다. 반면, DSG3의 c.859C>T 변이를 갖는 환자에서는 596 bp의 단편이 검출되었다. 상부 도면은 DSG3 유전자를 직접적으로 시퀀싱한 결과를 나타낸다. 생거 시퀀싱(sanger sequencing)을 수행하여, 환자의 부모 각각에서 이형접합형 c.859C>T 변이를 확인하였다. 이로부터, 환자의 DSG3의 동형접합형 c.859C>T 변이는 유전에 의한 것임을 알 수 있었다.

DSG3은 5개의 세포외 (extracellular 1-5: EC 1-5) 도메인 1-5, 및 작은 막관통성 및 세포내(intracellular) 도메인으로 구성된 약 130kDa의 막 단백질이다. 도 2b는 DSG3의 세포외 도메인 1-5의 구조를 나타낸다. DSG3의 c.859C>T 변이는 DSG3의 EC3 도메인에서 단백질 번역의 조기 종결(p.R287X)을 초래할 것으로 예상된다.

4. 1차 인간 각질형성세포로의 유도를 위한 피부 외식 배양 및 각질형성세포에서의 데스모글레인 3의 발현 수준 확인

정상인과 환자의 피부 및 구강 점막을 3 mm의 펀치로 생검하고, 날카로운 모서리를 가진 10 조각으로 해부하였다. 상기 조각들을 100 파이(pi) 웰의 배양용 접시(dish)에 두고, 10%의 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS) 및 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 둘베코스 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM)에서, 37℃의 5%의 CO₂ 조건에서 유지하였다. 1주일 후, 배지를 Keratinocyte-SFM (Invitrogen)로 교체하였다. 이후 세포를 충분히 증식시키고, 트립신을 가하여 배양용 접시에서 세포를 분리시킨 후, 원심분리하여 세포를 수득하고 질소 탱크에 보관하였다. 수득된 세포를 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, KCTC13402BP 수탁번호를 부여받았다.

수득된 세포를 이용하여, 다음과 같이 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 1mM의 PMSF를 함유하는 RIPA 용해 버퍼 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)를 이용하여, 1차(primary) 인간 각질형성세포(keratinocyte)에서, 단백질을 수득하였다. 단백질을 수득한 후, 각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 Nupage Novex Bis-Tris 젤 (Invitrogen)에 로딩하고, X-cell SureLock Mini-Cell (Invitrogen) 상에서 전기영동(electrophoresis)을 수행하였다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막으로 이동시키고, 상기 PVDF 막을 1차 항체와 반응시켰다. 이어서, 2차 항체와 반응시키고, ECL PLUS 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 이 때, 1차 항체는 래빗 항-인간 E-cadherin 항체 (24E10; Cell Signaling Technology), 마우스 항-인간 GAPDH 항체 (6C5; Calbiochem) 및 면역형광을 위한 항체 등을 사용하였다. 2차 항체는 HRP 결합된 항-마우스 및 항-래빗 2차 항체 (Invitrogen)를 사용하였다.

도 3b는 환자 및 정상인의 피부 각질형성세포 및 점막 각질형성세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 환자의 점막 내 DSG3는 정상인과 달리 발현되지 않았다. 이는 도 3a에서 수행한 면역형광 염색 분석 결과와 동일한 결과이다.

5. 데스모글레인 3 결핍 환자의 천포창 발병 여부 확인

5.1 데스모글레인 3 결핍 환자의 천포창 발병 여부 확인 - 면역형광 염색 관찰

환자의 진피(dermis) 및 표피(epidermis)의 면역형광 염색 분석을 나타낸다. 녹색은 IgG를 염색한 것이고, 파란색은 DAPI를 염색한 것이다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 환자의 피부에서 침착된 IgG가 나타나지 않았으며, 이로부터 데스모글레인 3 결핍 환자는 천포창과 완전하게 동일한 증상을 보이지 않는 것을 알 수 있다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13402BP

수탁일자 : 20171122

<110> Industry Academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> Genetic mutation of desmoglein 3 and use thereof <130> PN120091 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 999 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Gly Leu Phe Pro Arg Thr Thr Gly Ala Leu Ala Ile Phe Val 1 5 10 15 Val Val Ile Leu Val His Gly Glu Leu Arg Ile Glu Thr Lys Gly Gln 20 25 30 Tyr Asp Glu Glu Glu Met Thr Met Gln Gln Ala Lys Arg Arg Gln Lys 35 40 45 Arg Glu Trp Val Lys Phe Ala Lys Pro Cys Arg Glu Gly Glu Asp Asn 50 55 60 Ser Lys Arg Asn Pro Ile Ala Lys Ile Thr Ser Asp Tyr Gln Ala Thr 65 70 75 80 Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Ser Gly Val Gly Ile Asp Gln Pro Pro 85 90 95 Phe Gly Ile Phe Val Val Asp Lys Asn Thr Gly Asp Ile Asn Ile Thr 100 105 110 Ala Ile Val Asp Arg Glu Glu Thr Pro Ser Phe Leu Ile Thr Cys Arg 115 120 125 Ala Leu Asn Ala Gln Gly Leu Asp Val Glu Lys Pro Leu Ile Leu Thr 130 135 140 Val Lys Ile Leu Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Val Phe Ser Gln Gln 145 150 155 160 Ile Phe Met Gly Glu Ile Glu Glu Asn Ser Ala Ser Asn Ser Leu Val 165 170 175 Met Ile Leu Asn Ala Thr Asp Ala Asp Glu Pro Asn His Leu Asn Ser 180 185 190 Lys Ile Ala Phe Lys Ile Val Ser Gln Glu Pro Ala Gly Thr Pro Met 195 200 205 Phe Leu Leu Ser Arg Asn Thr Gly Glu Val Arg Thr Leu Thr Asn Ser 210 215 220 Leu Asp Arg Glu Gln Ala Ser Ser Tyr Arg Leu Val Val Ser Gly Ala 225 230 235 240 Asp Lys Asp Gly Glu Gly Leu Ser Thr Gln Cys Glu Cys Asn Ile Lys 245 250 255 Val Lys Asp Val Asn Asp Asn Phe Pro Met Phe Arg Asp Ser Gln Tyr 260 265 270 Ser Ala Arg Ile Glu Glu Asn Ile Leu Ser Ser Glu Leu Leu Arg Phe 275 280 285 Gln Val Thr Asp Leu Asp Glu Glu Tyr Thr Asp Asn Trp Leu Ala Val 290 295 300 Tyr Phe Phe Thr Ser Gly Asn Glu Gly Asn Trp Phe Glu Ile Gln Thr 305 310 315 320 Asp Pro Arg Thr Asn Glu Gly Ile Leu Lys Val Val Lys Ala Leu Asp 325 330 335 Tyr Glu Gln Leu Gln Ser Val Lys Leu Ser Ile Ala Val Lys Asn Lys 340 345 350 Ala Glu Phe His Gln Ser Val Ile Ser Arg Tyr Arg Val Gln Ser Thr 355 360 365 Pro Val Thr Ile Gln Val Ile Asn Val Arg Glu Gly Ile Ala Phe Arg 370 375 380 Pro Ala Ser Lys Thr Phe Thr Val Gln Lys Gly Ile Ser Ser Lys Lys 385 390 395 400 Leu Val Asp Tyr Ile Leu Gly Thr Tyr Gln Ala Ile Asp Glu Asp Thr 405 410 415 Asn Lys Ala Ala Ser Asn Val Lys Tyr Val Met Gly Arg Asn Asp Gly 420 425 430 Gly Tyr Leu Met Ile Asp Ser Lys Thr Ala Glu Ile Lys Phe Val Lys 435 440 445 Asn Met Asn Arg Asp Ser Thr Phe Ile Val Asn Lys Thr Ile Thr Ala 450 455 460 Glu Val Leu Ala Ile Asp Glu Tyr Thr Gly Lys Thr Ser Thr Gly Thr 465 470 475 480 Val Tyr Val Arg Val Pro Asp Phe Asn Asp Asn Cys Pro Thr Ala Val 485 490 495 Leu Glu Lys Asp Ala Val Cys Ser Ser Ser Pro Ser Val Val Val Ser 500 505 510 Ala Arg Thr Leu Asn Asn Arg Tyr Thr Gly Pro Tyr Thr Phe Ala Leu 515 520 525 Glu Asp Gln Pro Val Lys Leu Pro Ala Val Trp Ser Ile Thr Thr Leu 530 535 540 Asn Ala Thr Ser Ala Leu Leu Arg Ala Gln Glu Gln Ile Pro Pro Gly 545 550 555 560 Val Tyr His Ile Ser Leu Val Leu Thr Asp Ser Gln Asn Asn Arg Cys 565 570 575 Glu Met Pro Arg Ser Leu Thr Leu Glu Val Cys Gln Cys Asp Asn Arg 580 585 590 Gly Ile Cys Gly Thr Ser Tyr Pro Thr Thr Ser Pro Gly Thr Arg Tyr 595 600 605 Gly Arg Pro His Ser Gly Arg Leu Gly Pro Ala Ala Ile Gly Leu Leu 610 615 620 Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Thr 625 630 635 640 Cys Asp Cys Gly Ala Gly Ser Thr Gly Gly Val Thr Gly Gly Phe Ile 645 650 655 Pro Val Pro Asp Gly Ser Glu Gly Thr Ile His Gln Trp Gly Ile Glu 660 665 670 Gly Ala His Pro Glu Asp Lys Glu Ile Thr Asn Ile Cys Val Pro Pro 675 680 685 Val Thr Ala Asn Gly Ala Asp Phe Met Glu Ser Ser Glu Val Cys Thr 690 695 700 Asn Thr Tyr Ala Arg Gly Thr Ala Val Glu Gly Thr Ser Gly Met Glu 705 710 715 720 Met Thr Thr Lys Leu Gly Ala Ala Thr Glu Ser Gly Gly Ala Ala Gly 725 730 735 Phe Ala Thr Gly Thr Val Ser Gly Ala Ala Ser Gly Phe Gly Ala Ala 740 745 750 Thr Gly Val Gly Ile Cys Ser Ser Gly Gln Ser Gly Thr Met Arg Thr 755 760 765 Arg His Ser Thr Gly Gly Thr Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Gly Ala Ile 770 775 780 Ser Met Asn Phe Leu Asp Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Ala Phe Ala Cys 785 790 795 800 Ala Glu Glu Asp Asp Gly Gln Glu Ala Asn Asp Cys Leu Leu Ile Tyr 805 810 815 Asp Asn Glu Gly Ala Asp Ala Thr Gly Ser Pro Val Gly Ser Val Gly 820 825 830 Cys Cys Ser Phe Ile Ala Asp Asp Leu Asp Asp Ser Phe Leu Asp Ser 835 840 845 Leu Gly Pro Lys Phe Lys Lys Leu Ala Glu Ile Ser Leu Gly Val Asp 850 855 860 Gly Glu Gly Lys Glu Val Gln Pro Pro Ser Lys Asp Ser Gly Tyr Gly 865 870 875 880 Ile Glu Ser Cys Gly His Pro Ile Glu Val Gln Gln Thr Gly Phe Val 885 890 895 Lys Cys Gln Thr Leu Ser Gly Ser Gln Gly Ala Ser Ala Leu Ser Thr 900 905 910 Ser Gly Ser Val Gln Pro Ala Val Ser Ile Pro Asp Pro Leu Gln His 915 920 925 Gly Asn Tyr Leu Val Thr Glu Thr Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Leu Val 930 935 940 Gln Pro Ser Thr Ala Gly Phe Asp Pro Leu Leu Thr Gln Asn Val Ile 945 950 955 960 Val Thr Glu Arg Val Ile Cys Pro Ile Ser Ser Val Pro Gly Asn Leu 965 970 975 Ala Gly Pro Thr Gln Leu Arg Gly Ser His Thr Met Leu Cys Thr Glu 980 985 990 Asp Pro Cys Ser Arg Leu Ile 995 <210> 2 <211> 3000 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgatggggc tcttccccag aactacaggg gctctggcca tcttcgtggt ggtcatattg 60 gttcatggag aattgcgaat agagactaaa ggtcaatatg atgaagaaga gatgactatg 120 caacaagcta aaagaaggca aaaacgtgaa tgggtgaaat ttgccaaacc ctgcagagaa 180 ggagaagata actcaaaaag aaacccaatt gccaagatta cttcagatta ccaagcaacc 240 cagaaaatca cctaccgaat ctctggagtg ggaatcgatc agccgccttt tggaatcttt 300 gttgttgaca aaaacactgg agatattaac ataacagcta tagtcgaccg ggaggaaact 360 ccaagcttcc tgatcacatg tcgggctcta aatgcccaag gactagatgt agagaaacca 420 cttatactaa cggttaaaat tttggatatt aatgataatc ctccagtatt ttcacaacaa 480 attttcatgg gtgaaattga agaaaatagt gcctcaaact cactggtgat gatactaaat 540 gccacagatg cagatgaacc aaaccacttg aattctaaaa ttgccttcaa aattgtctct 600 caggaaccag caggcacacc catgttcctc ctaagcagaa acactgggga agtccgtact 660 ttgaccaatt ctcttgaccg agagcaagct agcagctatc gtctggttgt gagtggtgca 720 gacaaagatg gagaaggact atcaactcaa tgtgaatgta atattaaagt gaaagatgtc 780 aacgataact tcccaatgtt tagagactct cagtattcag cacgtattga agaaaatatt 840 ttaagttctg aattacttcg atttcaagta acagatttgg atgaagagta cacagataat 900 tggcttgcag tatatttctt tacctctggg aatgaaggaa attggtttga aatacaaact 960 gatcctagaa ctaatgaagg catcctgaaa gtggtgaagg ctctagatta tgaacaacta 1020 caaagcgtga aacttagtat tgctgtcaaa aacaaagctg aatttcacca atcagttatc 1080 tctcgatacc gagttcagtc aaccccagtc acaattcagg taataaatgt aagagaagga 1140 attgcattcc gtcctgcttc caagacattt actgtgcaaa aaggcataag tagcaaaaaa 1200 ttggtggatt atatcctggg aacatatcaa gccatcgatg aggacactaa caaagctgcc 1260 tcaaatgtca aatatgtcat gggacgtaac gatggtggat acctaatgat tgattcaaaa 1320 actgctgaaa tcaaatttgt caaaaatatg aaccgagatt ctactttcat agttaacaaa 1380 acaatcacag ctgaggttct ggccatagat gaatacacgg gtaaaacttc tacaggcacg 1440 gtatatgtta gagtacccga tttcaatgac aattgtccaa cagctgtcct cgaaaaagat 1500 gcagtttgca gttcttcacc ttccgtggtt gtctccgcta gaacactgaa taatagatac 1560 actggcccct atacatttgc actggaagat caacctgtaa agttgcctgc cgtatggagt 1620 atcacaaccc tcaatgctac ctcggccctc ctcagagccc aggaacagat acctcctgga 1680 gtataccaca tctccctggt acttacagac agtcagaaca atcggtgtga gatgccacgc 1740 agcttgacac tggaagtctg tcagtgtgac aacaggggca tctgtggaac ttcttaccca 1800 accacaagcc ctgggaccag gtatggcagg ccgcactcag ggaggctggg gcctgccgcc 1860 atcggcctgc tgctccttgg tctcctgctg ctgctgttgg ccccccttct gctgttgacc 1920 tgtgactgtg gggcaggttc tactggggga gtgacaggtg gttttatccc agttcctgat 1980 ggctcagaag gaacaattca tcagtgggga attgaaggag cccatcctga agacaaggaa 2040 atcacaaata tttgtgtgcc tcctgtaaca gccaatggag ccgatttcat ggaaagttct 2100 gaagtttgta caaatacgta tgccagaggc acagcggtgg aaggcacttc aggaatggaa 2160 atgaccacta agcttggagc agccactgaa tctggaggtg ctgcaggctt tgcaacaggg 2220 acagtgtcag gagctgcttc aggattcgga gcagccactg gagttggcat ctgttcctca 2280 gggcagtctg gaaccatgag aacaaggcat tccactggag gaaccaataa ggactacgct 2340 gatggggcga taagcatgaa ttttctggac tcctactttt ctcagaaagc atttgcctgt 2400 gcggaggaag acgatggcca ggaagcaaat gactgcttgt tgatctatga taatgaaggc 2460 gcagatgcca ctggttctcc tgtgggctcc gtgggttgtt gcagttttat tgctgatgac 2520 ctggatgaca gcttcttgga ctcacttgga cccaaattta aaaaacttgc agagataagc 2580 cttggtgttg atggtgaagg caaagaagtt cagccaccct ctaaagacag cggttatggg 2640 attgaatcct gtggccatcc catagaagtc cagcagacag gatttgttaa gtgccagact 2700 ttgtcaggaa gtcaaggagc ttctgctttg tccacctctg ggtctgtcca gccagctgtt 2760 tccatccctg accctctgca gcatggtaac tatttagtaa cggagactta ctcggcttct 2820 ggttccctcg tgcaaccttc cactgcaggc tttgatccac ttctcacaca aaatgtgata 2880 gtgacagaaa gggtgatctg tcccatttcc agtgttcctg gcaacctagc tggcccaacg 2940 cagctacgag ggtcacatac tatgctctgt acagaggatc cttgctcccg tctaatatga 3000 3000

Claims (17)

1. 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 단백질의 발현 수준이 야생형 세포에 비하여 저하된 표피 세포.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 표피 세포는 점막 조직 또는 피부 조직 유래인 것인 세포.
3. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 단백질 변이체를 발현하는 것인 표피 세포.
4. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 데스모글레인 3(desmoglein 3: DSG3) 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 세포.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 표피 세포는 기탁번호 KCTC13402BP로 기탁된 것인 세포.
7. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
   서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 천포창 유사 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체인 것인 조성물.
9. 청구항 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산인 것인 조성물.
10. 천포창 유사 질환을 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 아르기닌(R)이 종결코돈에 의하여 종결된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 287번 위치의 종결코돈에 의하여 종결된 경우, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 859번 위치의 염기가 티민(T)인 경우,
    천포창 유사 질환의 발병 위험이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
12. 청구항 10에 있어서, 상기 천포창 유사 질환은 동형집합형인 단일염기다형성에 의한 것인 방법.
13. 청구항 10에 있어서, 상기 천포창 유사 질환은 점막에 수포가 형성되는 것인 방법.
14. 청구항 10에 있어서, 상기 천포창 유사 질환은 후두 점막, 구강 점막 또는 이들의 조합에 수포가 형성되는 것인 방법.
15. 청구항 10에 있어서, 상기 천포창 유사 질환은 두피, 모발 또는 이들의 조합은 정상인 것인 조성물.
16. 청구항 10에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 분석법은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩인 것인 방법.
17. 청구항 10에 있어서, 상기 단백질을 검출하는 분석법은 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선 면역분석법, 방사선 면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 또는 단백질 칩인 것인 방법.
    
    
    

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