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KR20190020660A - 인간화 항-basigin 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인간화 항-basigin 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20190020660A
KR20190020660A KR1020187034365A KR20187034365A KR20190020660A KR 20190020660 A KR20190020660 A KR 20190020660A KR 1020187034365 A KR1020187034365 A KR 1020187034365A KR 20187034365 A KR20187034365 A KR 20187034365A KR 20190020660 A KR20190020660 A KR 20190020660A
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핑 주
완 후앙
젱 장
양 장
멩야오 장
후이지에 비앙
지안리 지앙
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Abstract

본 개시 내용은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 경우에 따라 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함하는 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.

Description

인간화 항-BASIGIN 항체 및 이의 용도
본 개시 내용은 일반적으로 인간화 항-BASIGIN 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
BASIGIN(EMMPRIN, 뉴로텔린 및 M6 항원으로도 알려짐)은 50 내지 60 kD의 분자량을 갖는 고도로 당화된 막관통 당단백질이며 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF)의 멤버이다. 인간에 있어서, BASIGIN은 세포외, 막관통 및 세포내 영역으로 나눠질 수 있는 269개의 아미노산을 가지며, 여기서 N-말단 번역 시작점으로부터 최초 21개의 잔기가 신호 펩티드를 구성하고, 잔기 22-205는 세포외 도메인을 구성하며, 잔기 206-229는 전형적인 류신 지퍼 구조를 갖는 막관통 영역을 구성하며, C-말단의 잔기 230-269는 세포내 도메인을 구성한다.
BASIGIN은 폐암, 간암, 자궁경부암, 대장암, 유방암, 난소암, 식도암 또는 위암과 같은 다수 타입의 인간의 고형 종양에서 과발현되는 것으로 나타나 있다. 이전 연구에 따르면 BASIGIN 분자는 종양 진행에서 중요한 기능성 막 단백질이며 다음과 같은 다양한 암 관련 현상에 관여한다:
i. BASIGIN은 종양 세포의 부착 및 전이를 매개한다. 종양 세포의 표면상에서 발현된 BASIGIN은 빈클린(vinclin)과 상호작용하여 위족(pseudopodia) 형성, 종양 세포의 확산 및 부착을 촉진하고; 아넥신 II와 상호작용하여 종양 세포에서 MMP-2의 분비를 촉진하고; 주변 매트릭스의 분해를 가속시키고 종양 세포와 종양 세포 주변의 섬유아세포를 자극하여 각종 세포외 매트릭스 금속단백분해효소(MMP), 예를 들면 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-11, MT1-MMP 및 MT2-MMP를 분비함으로써 종양 전이를 촉진시키는 등의 작용을 한다.
ii. BASIGIN은 종양 세포의 혐기성 대사에 관여한다. BASIGIN은 모노카르복실레이트 수송체 MCT-1 및 MCT-4의 중요한 분자 샤페론이다. BASIGIN은 MCT-1 및 MCT-4와 상호작용하여 세포막상에서 이들의 정확한 포지셔닝을 보조하고 락테이트 대사물질의 수송을 지속적으로 조절할 수 있다. 종양 세포는 주로 혐기성 대사에 의존하여 에너지를 생산하기 때문에, BASIGIN은 MCT의 발현을 통해 간접적으로 종양 세포의 기능 및 에너지 대사를 조절한다.
iii. BASIGIN은 종양 세포의 약물-내성을 촉진한다. BASIGIN은 다중약물 내성(MDR) 유전자의 전사에 영향을 미치고 P-g의 공발현 조절 메카니즘에 의한 발현을 촉진하며, 결과적으로 종양의 MDR을 유도한다. Kanekura 등은 BASIGIN이 P-g를 통해 MDR을 야기하는 것을 입증했으며, 이는 BASIGIN이 MDR을 저해하기 위한 잠재적인 효과적인 타겟일 수 있음을 나타낸다. 추가로, BASIGIN은 p-TFII-I의 핵 국재화를 촉진하고 전개된 단백질 반응(UPR)에서의 주요 인자인 Bip의 발현을 상향 조절하여, 종양 세포에서 소포체 스트레스 및 UPR을 야기하고, 이에 의해 아폽토시스를 저해하고 약물 불감수성을 초래한다. BASIGIN의 저해는 간세포 암종 세포의 아폽토시스를 촉진하고 기존 항종양 약물에 대한 종양 세포의 감수성을 향상시킬 수 있다.
iv. BASIGIN은 VEGF 발현을 상향조절하여 종양 혈관신생을 촉진한다. 따라서, BASIGIN 발현의 저해는 VEGF의 분비를 상당히 저해하고 이에 따라 종양 혈관신생을 저해할 수 있다.
v. BASIGIN은 복수의 분자와 상호작용한다. BASIGIN 단백질의 막관통 영역은 각종 세포막 단백질과의 상호작용을 위한 구조적 기초인 고도로 보존된 음으로 하전된 글루타메이트를 가지며, 이는 또한 BASIGIN이 각종 단백질과의 상호작용을 통해 세포의 각종 생리학적 활성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. BASIGIN은 CD98, 인테그린, 카베올린-1, 시클로필린(CyP) 및 다른 단백질과 상호작용하여 에너지 대사, 세포-매트릭스 상호작용, 신호 전달 등과 같은 세포 기능을 조절함으로써 종양 세포의 성장 및 전이에 영향을 미친다.
추가로, 많은 후향적 연구가 종양 조직에서 BASIGIN의 발현 수준과 암 환자의 예후 간에 밀접한 상관관계를 보여주었다. 비소세포 폐암 환자에서, BASIGIN 발현 수준과 환자의 예후가 밀접히 관련된다.
따라서, BASIGIN은 종양 치료의 새로운 타겟이 되었으며, 항체 약물 "리카르틴(Licartin)"의 성공적인 개발이 BASIGIN을 타겟으로 하는 약물의 안전성과 효과성을 입증했다.
추가로, 적혈구상에서 발현된 BASIGIN과 리간드-수용체 방식으로 열대열 말라리아(plasmodium falciparum)의 롭트리(rhoptry) 단백질 PfRh5 사이의 상호작용이, 열대열 말라리아의 침입에 중요한 요소인 열대열 말라리아에 의한 적혈구의 말초 인식을 매개한다. 적혈구상에서의 PfRh5와 BASIGIN의 상호작용은 다양한 말라리아 균주들에서 존재하며, 이는 적혈구상의 BASIGIN이 항말라리아 약물에 대한 중요한 타겟인 것으로 예측됨을 시사한다. 적혈구상의 인간 BASIGIN에 대한 신규의 항말라리아 약물은 화학치료 약물에 대한 내성을 극복하기 위해 전통적인 항말라리아 약물과 함께 사용된다.
단일클론 항체(McAb)가 질병의 진단 및 치료에 널리 사용되고 있다. 그러나, 인간의 체내에 뮤린 McAb의 수회 주입은 환자에서 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 초래할 수 있고, 전신 알레르기 반응이 항체의 효과성을 차단할 수 있다. 따라서, 인간 항체 및 인간화 항체가 항체 약물 연구 및 개발에서 연구되어 잠재적인 이점이 조사되고 있다.
본 개시 내용은 높은 결합 친화성을 갖는 인간화 항-BASIGIN 항체를 제공하며, 그 생물학적 활성은 실험을 통해 입증된다.
본 개시 내용은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, VH는 서열번호 1 (EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 1의 위치 i(i = 5, 23, 49, 79, 80, 89, 94)에서의 X는 XHi라고 하며, XH5, XH23, XH49, XH79, XH80, XH89, XH94의 각각은 임의의 아미노산일 수 있다.
일부 실시양태에서, XH5는 V 또는 L이다. 일부 실시양태에서, XH23은 A 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XH49는 S, A 또는 G이다. 일부 실시양태에서, XH79는 N 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XH80은 T 또는 I이다. 일부 실시양태에서, XH89는 K 또는 R이다. 일부 실시양태에서, XH94는 A 또는 T이다.
일부 실시양태에서, (a) XH5는 V이고, XH23은 A이며; 그리고/또는 (b) XH49는 S 또는 A이고; 그리고/또는 (c) XH79는 N이고, XH80은 T이고, XH89는 K 또는 R이고, XH94는 A이다.
일부 실시양태에서, VH는 서열번호 9-11에 제시된 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15에 제시된 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH는 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열번호 2 (DIQMTQSPXXLSXSVGDRVTXXCKASENVGTYVSWYQQKPGXXPKLLIYGASNRYTGVPXRFTGXGSGTDFTLTISSLQXXDXATYYCGQSYSYPFTFGSGTKLEIK)의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2의 위치 j(j = 9, 10, 13, 21, 22, 42, 43, 60, 65, 80, 81, 83)에서의 X는 XLj라고 하며, XL9, XL10, XL13, XL21, XL22, XL42, XL43, XL60, XL65, XL80, XL81, XL83의 각각은 임의의 아미노산일 수 있다.
일부 실시양태에서, XL9는 S, P 또는 A이다. 일부 실시양태에서, XL10은 T 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XL13은 A, L 또는 V이다. 일부 실시양태에서, XL21은 L 또는 I이다. 일부 실시양태에서, XL22는 S 또는 T이다. 일부 실시양태에서, XL42는 K 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, XL43은 A, T 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XL60은 S 또는 A이다. 일부 실시양태에서, XL65는 S 또는 T이다. 일부 실시양태에서, XL80은 P 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XL81은 E 또는 D이다. 일부 실시양태에서, XL83은 F 또는 I이다.
일부 실시양태에서, (a) XL9는 S 또는 A이고, XL10은 T 또는 S이고, XL13은 A이고, XL21은 L 또는 I이고, XL22는 S 또는 T이며; 그리고/또는 (b) XL42는 K 또는 Q이고, XL43은 A 또는 T이며; 그리고/또는 (c) XL60은 S이고, XL65는 S 또는 T이고, XL80은 P이고, XL81은 E 또는 D이고, XL83은 F이다.
일부 실시양태에서, VL은 서열번호 22-24에 제시된 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28에 제시된 FR을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, dsFv, dAb, 및 단일쇄 결합 폴리펩티드로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG 중쇄의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG는 인간 IgG2이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 κ 쇄의 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1x10-11M 내지 약 5x10-10M 또는 약 5x10-11M 내지 약 1.1x10-10M의 KD로 BASIGIN에 결합한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 또한 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 서열은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 19, 또는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 또한 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 BASIGIN 관련 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, BASIGIN 관련 병태는 암 또는 말라리아이다. 일부 실시양태에서, 암은 폐암, 간암, 자궁경부암, 대장암, 유방암, 난소암, 식도암 또는 위암이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 대상체에서 BASIGIN 관련 병태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
도 1은 인간화 항-BASIGIN 항체의 중쇄 FR 중의 특정 아미노산 부위에서의 특정의 예시적인 변형을 도시한 그래픽도이다.
도 2는 인간화 항-BASIGIN 항체의 경쇄 FR 중의 특정 아미노산 부위에서의 특정의 예시적인 변형을 도시한 그래픽도이다.
도 3은 ELISA 분석에 의해 측정된, 인간 BASIGIN에 대한 마우스 6H8(실선의 다이아몬드형), 키메라 6H8(실선의 역삼각형), 인간화 HP6H8-1(실선의 원형), 인간화 HP6H8-2(실선의 삼각형), 인간화 HP6H8-3(실선의 사각형)을 포함한 항-BASIGIN 항체의 용량 의존적 결합을 도시한다.
도 4는 항-BASIGIN 항체 경쇄 유전자 발현 벡터 pcDNA3.3-LC-N-229-205의 개략적인 구조이며, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열이 pcDNA3.3 플라스미드의 Xba I 및 Bsi WI 부위 사이에 삽입되고, 이후에 인간 카파 쇄의 불변 영역을 코딩하는 서열이 삽입된다.
도 5는 항-BASIGIN 항체 중쇄 유전자 발현 벡터 pOptivec-HC-D-229-205의 개략적인 구조이며, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열이 pOptivec 플라스미드의 Xba I 및 Nhe I 부위 사이에 삽입되고, 이후에 인간 IgG2 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 서열이 삽입된다.
도 6은 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주에서의 HP6H8-1 항체의 발현의 결과를 도시한다.
도 7은 대장암, 간암 및 폐암의 악성 조직에서 HP6H8-1의 면역조직화학적 염색 결과를 도시한다.
도 8은 인간화 항체 HP6H8-1에 의한 적혈구의 열대열 말라리아 침입의 시험관내 저해 결과를 제시하며, 결과 데이터는 평균 ± S.E.M으로서 제시된다.
본 개시 내용의 하기의 설명은 단지 본 개시 내용의 각종 실시양태를 예시하기 위한 의도이다. 이처럼, 논의된 구체적인 변형은 본 개시 내용의 범위에 대한 제한으로 해석될 수 없다. 다양한 동등물, 변화 및 변형이 본 개시 내용의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당업자에게 자명하며, 이러한 등가의 실시양태는 본원에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 간행물, 특허 및 특허 출원을 포함한 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다.
인간화 항- BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편
일 양태에서, 본 개시 내용은 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본원에서 사용시, 용어 "항체"는 임의의 면역글로불린, 단일클론 항체, 다가 항체, 다중특이성 항체, 또는 이중특이성(2가) 항체를 포함한다. 천연의 온전한 항체는 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 항체의 각 중쇄는 가변 영역(VH) 및 제1, 제2, 및 제3 불변 영역(각각 CH1, CH2, CH3)으로 이루어지는 반면에, 항체의 각 경쇄는 가변 영역(VL) 및 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 두 쇄의 가변 영역은 일반적으로 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개의 초가변성 영역으로 세분화된다 (여기서, 경쇄(L) CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 중쇄(H) CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다). 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편에 대한 CDR 경계는 카밧(Kabat), 코티아(Chothia), 또는 Al-라지카니(Lazikani)의 규칙에 의해 정의되거나 확인될 수 있다 (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;31(6252):877-83 (1989) ; Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 일부 실시양태에서, 항체의 CDR 경계는 카밧 데이터베이스에 따라 결정된다. 3개의 CDR은, CDR보다 더 잘 보존되고 초가변성 루프를 지지하기 위해 스캐폴드를 형성하는 프레임워크 영역(FR, 여기서 중쇄(H) FR은 HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4를 포함하고, 경쇄(L) FR은 LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함한다)으로서 알려진 플랭킹 스트레치들 사이에 개재된다. 따라서, 각각의 VH 및 VL은 하기의 순서로 (아미노산 잔기 N 말단에서 C 말단으로) 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합에 관여하지 않지만, 각종 이펙터 기능을 나타낸다.
포유류의 중쇄는 α, δ, ε, γ, 및 μ로서 분류되고, 포유류의 경쇄는 λ 또는 κ로서 분류된다. 항체는 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로 배정되며, 이들은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 중쇄의 존재에 의해 특징지어진다. 몇몇 주요 항체 부류의 하부 부류는 예컨대 IgG1 (γ1 중쇄), IgG2 (γ2 중쇄), IgG3 (γ3 중쇄), IgG4 (γ4 중쇄), IgA1 (α1 중쇄), 또는 IgA2 (α2 중쇄)이다.
한 종에서 유래한 중쇄 및/또는 경쇄의 일부, 및 다른 종에서 유래한 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지를 갖는 항체 또는 항원 결합 단편은 키메라로서 지칭된다. 구체적인 일례에서, 키메라 항체는 인간에서 유래한 불변 영역 및 마우스와 같은 비인간 종에서 유래한 가변 영역을 포함할 수 있다.
인간화 항체 또는 항원 결합 단편은, 비인간(예를 들면, 설치류, 토끼, 개, 염소, 말, 또는 닭) 항체에서 유래한 CDR, 및 인간 면역글로불린으로부터 완전히 또는 실질적으로 가변 영역 FR 및 불변 영역(존재한다면)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "실질적으로"는 2개의 비교 항목(예를 들어, 서열, 수치) 사이의 고도의 유사성을 지칭하며, 당업자는 2가지 항목 간에 유의한 차이가 있다고 고려하지 않고/거나, 2가지 비교 항목이 그들의 성질(예를 들면, 물리적 성질 또는 생물학적 활성)과 관련하여 거의 차이가 없다고 예상할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항원 결합 단편의 서열은 결합 친화성, 안정성, 면역원성, 약동학적 반감기, pH 민감성, 접합에 대한 적합성 등과 같은 항체의 하나 이상의 성질을 개선하도록 변경(예를 들면, 치환, 삽입 또는 결실)된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비인간 CDR 및/또는 인간 FR의 하나 이상의 아미노산 잔기는 항체의 결합 친화성을 유지하거나 개선하는 항체의 상술한 하나 이상의 성질을 개선하도록 변경되며, 변경된 아미노산 잔기는 특이적 결합에 중요하지 않거나 변경은 보존적 변화이며, 이에 인간화 항체의 BASIGIN으로의 결합에는 큰 영향을 미치지 않는다.
일부 실시양태에서, 비인간 항체에서 유래한 CDR은 이것이 유래한 비인간 CDR과 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 3개 이하, 2개 이하, 또는 단지 1개의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변경은 보존적 치환이다.
아미노산 서열과 관련한 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 성질을 갖는 측쇄를 가진 다른 아미노산 잔기로 교체하거나 또는 폴리펩티드의 활성에 중요하지 않은 아미노산의 치환을 지칭한다. 예를 들면, 보존적 치환은 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들 사이에(예를 들면, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe 및 Trp), 하전되지 않은 극성 측쇄를 가진 잔기들 사이에(예를 들면, Cys, Ser, Thr, Asn, Gly 및 Gln), 산성 측쇄를 가진 잔기들 사이에(예를 들면, Asp 및 Glu), 염기성 측쇄를 가진 아미노산들 사이에(예를 들면, His, Lys 및 Arg), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산들 사이에(예를 들면, Thr, Val 및 Ile), 황 함유 측쇄를 가진 아미노산들 사이에(예를 들면, Cys 및 Met), 또는 방향족 측쇄를 가진 잔기들 사이에(예를 들면, Trp, Tyr, His 및 Phe) 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환, 결실 또는 첨가는 또한 그러한 치환, 결실, 또는 첨가가 단백질 입체형태 구조에 있어 중대한 변화를 야기하지 않으며, 따라서 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있는 한 "보존적 치환"으로 간주될 수 있다. 보존적 치환으로서 삽입되거나 결실되는 아미노산의 수는 약 1 내지 3의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열번호 9-11에 제시된 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열번호 22-24에 제시된 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 BASIGIN에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 실제로 시뮬레이션하고, 이에 따라 결합에 중요하지 않은 항체/단편상의 아미노산 부위(예를 들면, FR)를 확인하는데 컴퓨터 소프트웨어가 사용될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편의 결합 부위의 구조/입체형태를 변화시키지 않거나, 또는 경우에 따라 항체 또는 항원 결합 단편의 하나 이상의 성질, 예컨대 결합 또는 결합 친화성, 안정성, 면역원성, 약동학적 반감기, pH 민감성, 접합에 대한 적합성 등을 개선하는 그러한 부위를 확인하기 위해 시뮬레이션에서 그러한 부위에 대해 다양한 아미노산을 시험할 수 있다. 이러한 컴퓨터 소프트웨어의 예는 SYBYL, Discovery Studio, MOE, AMBER, GROMACS, NAMD, CONCOORD, DynDom, Autodock, MODELER, MolMol 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 FR 영역은 예를 들면, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하, 또는 단지 1개의 아미노산 부위에서 일부 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 FR 영역은 비인간 FR에 상동이다.
본원에서 사용시, "동족(의)" 및 "상동(의)"은 상호 교환적으로 사용되고 임의적으로 정렬시 다른 서열에 대해 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 핵산 서열(또는 이의 상보적 가닥)을 지칭한다.
아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 퍼센트(%) "서열 동일성"은, 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 일치를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 기준 서열의 아미노산 (또는 핵산) 잔기와 일치하는 후보 서열의 아미노산 (또는 핵산) 잔기의 퍼센티지로서 정의된다. 아미노산 (또는 핵산) 서열 동일성%를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLASTN, BLASTp, ClustalW2, 및 ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수 가능한 툴을 사용함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, VH는 서열번호 1 (EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 1의 위치 i(i = 5, 23, 49, 79, 80, 89, 94)에서의 X는 XHi라고 하며, XH5, XH23, XH49, XH79, XH80, XH89, XH94의 각각은 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, VH는 서열번호 1 (EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)의 아미노산 서열로 이루어지며, 서열번호 1의 위치 i(i = 5, 23, 49, 79, 80, 89, 94)에서의 X는 XHi라고 하며, XH5, XH23, XH49, XH79, XH80, XH89, XH94의 각각은 임의의 아미노산일 수 있다.
일부 실시양태에서, XH5는 V 또는 L이다. 일부 실시양태에서, XH23은 A 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XH49는 S, A 또는 G이다. 일부 실시양태에서, XH79는 N 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XH80은 T 또는 I이다. 일부 실시양태에서, XH89는 K 또는 R이다. 일부 실시양태에서, XH94는 A 또는 T이다.
일부 실시양태에서, (a) XH5는 V이고, XvH23은 A이며; 그리고/또는 (b) XvH49는 S 또는 A이고; 그리고/또는 (c) XvH79는 N이고, XH80은 T이고, XvH89는 K 또는 R이고, XvH94는 A이다.
일부 실시양태에서, XH5는 V이고, XvH23은 A이다. 일부 실시양태에서, XH49는 S 또는 A이다. 일부 실시양태에서, XH49는 S이다. 일부 실시양태에서, XH49는 A이다. 일부 실시양태에서, XH79는 N이고, XH80은 T이고, XH89는 K이고, XH94는 A이다. 일부 실시양태에서, XH79는 N이고, XH80은 T이고, XH89는 R이고, XH94는 A이다.
일부 실시양태에서, VH는 서열번호 12-15로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 FR을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24에 제시된 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열번호 2 (DIQMTQSPXXLSXSVGDRVTXXCKASENVGTYVSWYQQKPGXXPKLLIYGASNRYTGVPXRFTGXGSGTDFTLTISSLQXXDXATYYCGQSYSYPFTFGSGTKLEIK)의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 43의 위치 j(j = 9, 10, 13, 21, 22, 42, 43, 60, 65, 80, 81, 83)에서의 X는 XLj라고 하며, XL9, XL10, XL13, XL21, XL22, XL42, XL43, XL60, XL65, XL80, XL81, XL83의 각각은 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, VL은 서열번호 2 (DIQMTQSPXXLSXSVGDRVTXXCKASENVGTYVSWYQQKPGXXPKLLIYGASNRYTGVPXRFTGXGSGTDFTLTISSLQXXDXATYYCGQSYSYPFTFGSGTKLEIK)의 아미노산 서열로 이루어지며, 서열번호 43의 위치 j(j = 9, 10, 13, 21, 22, 42, 43, 60, 65, 80, 81, 83)에서의 X는 XLj라고 하며, XL9, XL10, XL13, XL21, XL22, XL42, XL43, XL60, XL65, XL80, XL81, XL83의 각각은 임의의 아미노산일 수 있다.
일부 실시양태에서, XL9는 S, P 또는 A이다. 일부 실시양태에서, XL10은 T 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XL13은 A, L 또는 V이다. 일부 실시양태에서, XL21은 L 또는 I이다. 일부 실시양태에서, XL22는 S 또는 T이다. 일부 실시양태에서, XL42는 K 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, XL43은 A, T 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XL60은 S 또는 A이다. 일부 실시양태에서, XL65는 S 또는 T이다. 일부 실시양태에서, XL80은 P 또는 S이다. 일부 실시양태에서, XL81은 E 또는 D이다. 일부 실시양태에서, XL83은 F 또는 I이다.
일부 실시양태에서, (a) XL9는 S 또는 A이고, XL10은 T 또는 S이고, XL13은 A이고, XL21은 L 또는 I이고, XL22는 S 또는 T이며; (b) XL42는 K 또는 Q이고, XL43은 A 또는 T이며; 그리고/또는 (c) XL60은 S이고, XL65는 S 또는 T이고, XL80은 P이고, XL81은 E 또는 D이고, XL83은 F이다.
일부 실시양태에서, XL9는 S이고, XL10은 T이고, XL13은 A이고, XL21은 L이고, XL22는 S이다. 일부 실시양태에서, XL9는 A이고, XL10은 S이고, XvL13은 A이고, XL21은 I이고, XL22는 S이다. 일부 실시양태에서, XL9는 S이고, XL10은 S이고, XL13은 A이고, XL21은 L이고, XL22는 T이다.
일부 실시양태에서, XL42는 K이고, XL43은 A이다. 일부 실시양태에서, XL42는 Q이고, XL43은 T이다. 일부 실시양태에서, XL42는 Q이고, XL43은 A이다.
일부 실시양태에서, XL60은 S이고, XL65는 S이고, XL80은 P이고, XL81은 E이고, XL83은 F이다. 일부 실시양태에서, XL60은 S이고, XL65는 S이고, XL80은 P이고, XL81은 D이고, XL83은 F이다.
일부 실시양태에서, VL은 서열번호 25-28로부터 선택된 하나 이상의 FR을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 중쇄의 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 인간 IgG 중쇄의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG는 인간 IgG2이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 이의 단편은 인간 λ 또는 κ 쇄의 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 인간 κ 쇄의 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체는 서열번호 9-11에 제시된 3개의 중쇄 CDR, 서열번호 12-15에 제시된 HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4의 중쇄 프레임워크 서열, 서열번호 22-24에 제시된 경쇄 CDR 및 서열번호 25-28에 제시된 LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4의 경쇄 프레임워크 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 서열은 포뮬러: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4에 따르고, 경쇄 가변 영역의 서열은 포뮬러 LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4에 따른다.
인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 인간의 치료제로서 유용하다. 일부 실시양태에서 이것은 비인간 종의 항체와 비교하여 감소된 면역원성을 갖거나 또는 인간에서 면역 반응을 유도할 가능성이 낮기 때문이다. 일부 실시양태에서, 비인간 동물은 포유류, 예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 기니피그, 햄스터, 또는 비인간 영장류(예를 들면, 원숭이(예를 들면, 시노몰구스 또는 레서스 원숭이) 또는 유인원(예를 들면, 침팬지, 고릴라, 시미안 또는 아펜))이다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다"는 두 분자 간의, 예를 들면 항체와 항원 간의 비-랜덤 결합 반응을 지칭한다. 결합 친화성은 KD 값으로서 표시될 수 있으며, 이는, 항원과 항체 간의 결합이 평형에 도달할 때의 해리 속도(koff) 대 회합 속도(kon)의 비, 즉, koff/kon으로 계산된다. KD 값은 예를 들면, Biacore와 같은 기기를 사용하는 플라즈몬 공명 결합(SPR) 어세이를 포함한 당업계에 공지된 적당한 방법을 사용하여 적절히 결정될 수 있다 (예를 들면, 문헌[Murphy, M. et al, Current protocols in protein science, Chapter 19, unit 19.14, 2006] 참조).
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-BASIGIN 항체 및 이의 항원 결합 단편은 플라즈몬 공명 결합 어세이에 의해 측정시 약 10-7 M 이하(예를 들면, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M)의 결합 친화성(KD)으로 인간 BASIGIN에 특이적 결합이 가능하다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1x10-11 M 내지 약 1x10-7 M, 약 1x10-11 M 내지 약 1x10-8 M, 1x10-11 M 내지 약 5x10-9 M, 약 1x10-11 M 내지 약 1x10-9 M, 1x10-11 M 내지 약 1x10-9 M, 약 5x10-11 M 내지 약 5x10-10 M 또는 약 5x10-11 M 내지 약 1.1x10-11 M의 결합 친화성(KD)으로 인간 및/또는 비인간 BASIGIN과 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 1x10-11M 내지 약 5x10-10M, 또는 약 5x10-11M 내지 약 1.1x10-10M의 KD로 BASIGIN에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-BASIGIN 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간 BASIGIN에 특이적으로 결합하지만 마우스 BASIGIN에는 그렇지 않으며, 예를 들면, 마우스 BASIGIN과의 결합 친화성은 인간 BASIGIN과의 결합 친화성의 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만이다.
본원에서 사용시, 용어 "항원 결합 단편"은 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 단편, 또는 항원에 결합하지만 온전한 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 부분으로부터 형성된 항체 단편을 지칭한다. 항원 결합 단편의 예는, 비제한적으로, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디술피드 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 디아바디(dAb), 이중특이성 ds-디아바디(이중특이성 ds-dAb), 단일쇄 Fv (scFv), scFv 다이머, 단일쇄 결합 폴리펩티드, 단리된 CDR 및 다중특이성 항체를 포함한다. 항원 결합 단편은 모(parent) 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다.
"Fab"는 디술피드 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역에 결합된 단일 경쇄(가변 및 불변 영역 모두)로 이루어진 항체의 1가 항원 결합 단편을 지칭한다.
"Fab'"는 힌지 영역의 일부를 추가로 포함하는 Fab 단편에 상응하는 1가 항원 결합 단편을 지칭한다.
"F(ab')2"는 디술피드 결합에 의해 함께 결합되는 2개의 Fab' 단편의 다이머를 지칭한다.
"Fv"는 단일 중쇄의 가변 영역에 결합된 단일 경쇄의 가변 영역으로 이루어진다.
"dsFv"는 단일 경쇄의 가변 영역과 단일 중쇄의 가변 영역 간의 연결이 디술피드 결합인 디술피드-안정화된 Fv 단편을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "(dsFv)2"는 3개의 펩티드 쇄: 펩티드 링커에 의해 연결되고 2개의 VL 모이어티에 디술피드 브릿지에 의해 결합된 2개의 VH 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, dsFv는 이중특이성이며 각 디술피드 쌍의 중쇄 및 경쇄는 상이한 항원 특이성을 갖는다.
"디아바디" 또는 "dAb"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 단편을 지칭하며, 여기서 단편은, 단일 쇄상의 2개 도메인 간의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 단일 폴리펩티드 쇄에서 VL 도메인에 연결된 VH 도메인(VH-VL 또는 VL-VH)을 포함하고(예를 들면, Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A.;90(14):6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161 참조), 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 강제적으로 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 생성한다.
일부 실시양태에서, "이중특이성 ds 디아바디"는 VH1과 VL1 간의 디술피드 브릿지를 통해 VL1-VH2(펩티드 링커에 의해 연결됨)에 결합된 VH1-VL2(펩티드 링커에 의해 연결됨)를 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 또는 "단일 쇄 항체"는 항체의 단일 VH 도메인 및 단일 VL 도메인을 포함하는 조작된 항체 단편을 지칭하며, 여기서 이들 도메인은 서로 직접적으로 또는 펩티드 링커 서열을 통해 연결되어 단일 폴리펩티드 쇄를 형성한다(Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)).
"scFv 다이머"는 2개의 scFv의 다이머를 지칭한다.
"단일쇄 결합 폴리펩티드"는 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 임의의 단일 쇄 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용시, 용어 "항원"은 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 결합될 수 있고, 부가적으로 그러한 항원에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 보유할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 또는 항원 결합 단편과 상호작용할 수 있는 항원상의 원자의 특정 기(예를 들면, 당 측쇄, 포스포릴 기, 술포닐 기) 또는 아미노산을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, dAb, scFv, 및 단일쇄 결합 폴리펩티드로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 실시양태에서, 본 개시 내용은 예시적인 마우스 단일클론 항체 HAb18GC2(6H8로서도 지칭됨), 이의 키메라 항체(즉, c6H8), 및 인간화 항체 HP6H8-1, HP6H8-2, HP6H8-3을 제공한다.
마우스 단일클론 항체 HAb18GC2는 서열번호 31의 중쇄 가변 영역, 서열번호 29의 경쇄 가변 영역을 갖는다. 키메라 항체 c6H8은 앞서 언급한 마우스 가변 영역에 융합된 IgG1 이소타입의 인간 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체는 (각각 서열번호 4, 6 및 8의 코딩 DNA 서열에 상응하는) 각각 서열번호 3, 5 및 7의 중쇄 가변 영역 및 (각각 서열번호 17, 19 및 21의 코딩 DNA 서열에 상응하는) 각각 서열번호 16, 18 및 20의 경쇄 가변 영역을 갖는 HP6H8-1, HP6H8-2 및 HP6H8-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
인간화 항체 또는 항원 결합 단편의 제조 방법
일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합 방법을 사용하여 제조된다. 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 재조합 공정은 하기를 포함한다:　
1) 적합한 비인간 동물을 인간 BASIGIN 단백질 또는 hBASIGIN 생산 세포로 면역화하는 공정. 동물은 마우스, 래트, 양, 염소, 토끼, 또는 기니피그일 수 있다. 비인간 동물의 비장 또는 림프절을 이용하여 항체 생산 하이브리도마를 생성하거나, 면역화된 비인간 동물의 B 세포를 모으고 비인간 단일클론 항-BASIGIN 항체 역가를 측정하는 공정. 통상적인 과정을 사용함으로써 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 단일클론 항체를 코딩하는 DNA를 단리하고 시퀀싱하는 공정.
2) 생성된 하이브리도마 또는 모아진 B 세포 클론으로부터 적합한 역가를 갖는 비인간 단일클론 항-BASIGIN 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는 공정. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 서열을 분석하여 비인간 단일클론 항체에 대한 CDR 경계를 확인하는 공정.
3) 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역이, 존재한다면, 완전히 또는 실질적으로 인간 면역글로불린 서열로부터 유래하도록, 비인간 유래의 항체 CDR 유전자를 인간 면역글로불린 유전자 내에 그라프팅함으로써 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 재조합 유전자를 얻는 공정.
4) 경우에 따라 재조합 유전자를 적합한 벡터 내에 혼입하고, 벡터 또는 재조합 유전자를 숙주 세포 내에 도입하여 본원에서 제공된 인간화 항체 또는 이의 항원 단편을 생성하는 공정.
본원에서 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 숙주 세포를 배양한 다음, 숙주 세포 또는 배양액(예를 들면, 상청액)을 분리 및 정제함으로써 실질적으로 순수한 그리고 균질한 형태로 얻어질 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 분리 및 정제를 위해, 임의의 통상적인 폴리펩티드 정제 방법이 이용될 수 있다.
단리된 핵산 서열
일 양태에서, 본 개시 내용은 본원에서 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열을 제공한다.
"단리된" 물질은 인간의 손에 의해 자연 상태에서 변형된 물질이며, 예를 들면 본래 환경으로부터 제거된 자연 발생 물질이 단리된 물질로서 지칭될 수 있다. "단리된" 핵산은, 실질적으로 다른 핵산 분자가 없고, 천연 상태의 핵산을 수반하는 자연 발생 성분과 관련이 없는 핵산 분자이다. "단리된 핵산 서열"은 단리된 핵산 분자의 서열을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 서열은 본 개시 내용에 제공된 CDR 서열을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 서열은 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 동족 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 서열은 서열번호 17, 서열번호 19 또는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 동족 서열을 포함한다.
본원에서 사용시, "동족(의)" 및 "상동(의)"은 상호 교환적으로 사용되고 임의적으로 정렬시 다른 서열에 대해 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열(또는 이의 상보적 가닥) 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
핵산 서열(또는 아미노산 서열)에 대한 퍼센트(%) "서열 동일성"은, 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 일치를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 기준 서열의 핵산 (또는 아미노산) 잔기와 일치하는 후보 서열의 핵산 (또는 아미노산) 잔기의 퍼센티지로서 정의된다. 핵산 (또는 아미노산) 서열 동일성%를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, 공개적으로 입수 가능한 툴, 예컨대 BLASTN, BLASTp(미국국립생물공학정보센터(NCBI)의 웹사이트에서 입수 가능, 또한 [Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)]; [Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)] 참조), ClustalW2(유럽생물정보학연구소의 웹사이트에서 입수 가능, 또한, [Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996)]; [Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)] 참조), 및 ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 툴에 의해 제공된 디폴트 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 예를 들어 적절한 알고리즘을 선택하는 것과 같은 정렬을 위해 적절한 파라미터를 커스터마이징할 수 있다.
벡터
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 또한 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본원에서 사용시 용어 "벡터"는 세포를 형질전환 또는 형질감염시켜 세포에서 유전자 발현을 허용할 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 벡터는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터일 수 있다. 본 개시 내용은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 본원에 제공된 핵산 서열, 상기 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터(예를 들면, SV40, CMV, EF-1α), 및 적어도 하나의 선택 마커를 함유하는 벡터(예를 들면, 발현 벡터)를 제공한다. 본 개시 내용의 발현 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지 및 코스미드일 수 있다. 예로는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 허프스바이러스(예를 들면, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 파필로마바이러스, 파포바바이러스(예를 들면, SV40), 람다 파지, 및 M13 파지, 플라스미드 pcDNA3.3, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
숙주 세포
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본원에서 사용된 "숙주 세포"는 하나 이상의 외인성 단백질을 발현하도록 외인성 핵산 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 용어 "숙주 세포"는 특정 대상 세포 및 그의 자손 모두를 지칭하는 것으로 의도된다. 숙주 세포는 원핵세포, 진핵세포, 식물 세포, 동물 세포 또는 하이브리도마일 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역후 프로세싱 및 변형에 대한 상이한 특성 및 메카니즘을 가질 수 있으며, 이에 따라 적합한 세포주가 발현되는 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 항원 결합 단편의 정확한 변형 및 프로세싱(예컨대 일차 전사물, 당화, 및 인산화)을 보장하기 위한 숙주 세포로서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유류의 세포이다.
유용한 포유류의 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주(예를 들면, COS-7); 인간 배아 신장 주(예를 들면, 현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293T 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포(예를 들면, CHO/-DHFR, CHO/-GS, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:116 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 141); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포 암종 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; PC12; 마우스 배아 섬유아세포주(3T3); NSO 골수종 세포(내인성으로 어떤 기능적인 면역글로불린 쇄도 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
상술한 벡터 또는 재조합 유전자로 형질전환된 숙주 세포는 통상적인 영양 배지, 또는 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 항체의 다른 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드로 공형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 외인성 핵산을 함유할 수 있지만, 핵산과 작동 가능하게 연결되도록 조절제가 세포 내로 도입되거나 조절 서열이 세포 내로 도입되지 않으면 외인성 핵산에 의해 코딩된 단백질을 원하는 수준으로 발현시킬 수 없다. 일부 실시양태에서, 형질전환된 벡터를 함유하는 숙주 세포는 항-BASIGIN 항체를 일시적으로 발현할 수 있다.
약학 조성물
일 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 하나 이상의 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원에 제공된 약학 조성물은 액체 용액, 현탁제, 에멀젼, 알약, 캡슐, 정제, 서방성 제제 또는 파우더(이에 한정되지 않음)를 포함한 당업계에 공지된 임의의 통상적인 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 주사 가능한 조성물로 제제화된다. 주사 가능한 조성물의 예는 주사 가능한 멸균 용액; 주사 가능한 멸균 현탁제; 주사 가능한 멸균 에멀젼; 사용 직전에 용매 중에서 재구성될 수 있는 멸균 건조한 가용성 제품, 예컨대 동결건조 파우더, 등을 포함한다. 동결건조 파우더는 약 4℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건하에 보관될 수 있다. 재구성에 유용한 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다. 일부 실시양태에서는, 단위-용량의 주사 가능한 조성물이 앰풀, 바이알 또는 니들을 갖는 시린지에 미리 패키지된다. 일부 실시양태에서는, 복수-용량의 주사 가능한 조성물이 앰풀 또는 바이알에 미리 패키지된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"은 지정된 담체가 일반적으로 약학 조성물에 포함된 다른 성분과 화학적으로 및/또는 물리적으로 상용성이 있고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증을 유발함이 없이 수혜 대상(예를 들면, 인간 및 동물)에서 생체 내에서 사용하기에 적합한 건전한 의학적 판단 범위 내에서 합당한 이익/위험 비에 상응함을 의미한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는, 예를 들면, 활성 성분의 저장 및 대상체로의 이의 투여를 촉진할 수 있는 약학적으로 허용가능한 수성, 비수성 또는 고체 비히클, 항균제, 등장화제, 완충제, pH 조절제, 현탁/분산제, 격리 또는 킬레이팅제, 희석제, 아쥬번트, 부형제, 또는 무독성 보조 물질, 당업계에 알려진 다른 성분, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시 내용에 이용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 일반적으로 알려진 것들, 예컨대 문헌["Remington Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)](인용에 의해 본원에 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다.
추가적으로 예시하면, 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들면, 멸균수, 염화나트륨, 덱스트로스, 락토스, 프룩토스, 글루코스, 트레할로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 페놀, 크레졸, 벤질 알콜, 클로로-부탄올, 글리세롤, 프롤린, 히스티딘, 아르기닌, 염산, 아세트산, 시트르산, 락트산, 숙신산, 아스코르브산, 아세테이트, 시트레이트, 숙신산 시트레이트, 포스페이트, 소르비테이트, 수크로스 포스페이트, 숙신산나트륨, 시트르산나트륨, 에탄올 나트륨 아세테이트, 수산화나트륨, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 시클로덱스트린, TWEEN-20, Tween-80, 옥수수 시럽, 글리세린, 나트륨 비설페이트, 프로카인 히드로클로라이드, Poloxam, 나트륨 카복시메틸세룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, EDTA, EGTA 또는 다른 적합한 작용제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 다른 치료제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 치료제는 방사선 요법, 화학요법, 타겟 요법, 유전자 요법, 면역요법, 호르몬 요법, 혈관신생 저해, 완화 케어, 수술, 항말라리아 약물 또는 이들의 조합에 사용되는 작용제이다.
키트
본 개시 내용은 본원에 제공된 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 생물학적 샘플에서 BASIGIN의 존재 또는 수준을 검출하는데 유용하다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직일 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트에 함유되는 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지(예를 들면, 형광성, 방사성 또는 효소적 표지)와 접합된다. 일부 다른 실시양태들에서, 키트는 비표지된 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고 비표지된 항-BASIGIN 항체에 결합할 수 있는 제2의 표지 항체를 추가로 포함한다. 키트는 표지를 검출하는 수단을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 특정 방법의 실행에 사용되는 추가 시약 및 완충제를 포함할 수 있다. 키트는 사용 설명서, 및 키트 내의 성분들 각각을 분리하는 패키지를 추가로 포함할 수 이다. 일부 실시양태에서, 키트는 BASIGIN 항체를 검출하기 위한 면역어세이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 BASIGIN 단백질 수준을 검출하기 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 BASIGIN 관련 병태를 예측, 진단, 예방 또는 치료를 위해 사용된다.
치료 방법
일 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 약학 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 BASIGIN 관련 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 대상체에서 BASIGIN 관련 병태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 대상체에서 BASIGIN 관련 병태의 치료에 유용한 본 개시 내용의 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 동물을 지칭한다. 전형적으로, 동물은 포유류이고, 특정 예는 영장류(예를 들면, 인간), 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 및 양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 "BASIGIN 관련 병태"는 BASIGIN(예를 들면, 인간 BASIGIN)의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소에 의해 기인하거나, 악화되거나, 또는 이와 다르게 관련되는 임의의 상태를 지칭한다. 일부 실시양태에서, BASIGIN 관련 병태는 암, 염증성 질환 또는 감염증이다.
본원에서 사용되는 "암"은 악성 세포 성장 또는 신생물, 비정상적인 증식, 침윤 또는 전이를 특징으로 하는 임의의 의료적 상태를 지칭하며, 고형 종양 및 비고형 암(혈액 악성 종양) 예컨대 백혈병 모두를 포함한다. 본원에서 사용되는 "고형 종양"은 신생물성 및/또는 악성 세포의 고체 덩어리를 지칭한다. 암의 예는 비소세포 폐암(편평/비편평), 소세포 폐암, 신세포암, 결장직장암, 대장암, 난소암, 유방암(기저 유방암, 유관암 및 소엽 유방암을 포함함), 췌장암, 위암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 흑색종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암, 간세포 암종(HCC), 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 악성 림프종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선암종, 갑상선 수질암, 갑상선 유두암, 갈색세포종피지선암, 유두암, 유두 선암종, 수질암종, 기관지암, 간세포암, 담도암, 융모암, 빌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 대형 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 B-세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 적혈구증가증, 비만 세포 유래 종양, EBV-양성 및 -음성 PTLD, 및 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 형질아구성 림프종, 절외 NK/T-세포 림프종, 비인두암, HHV8-관련 일차 삼출성 림프종, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 골수이형성 증후군, 털세포 백혈병 및 골수형성이상증후군, 원발성 CNS 림프종, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 별아교세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경 종양, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막모세포종을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 전이성, 특히 BASIGIN 발현 전이성 암이다.
일부 실시양태에서, BASIGIN 관련 병태는 염증성 질환 예컨대 전신홍반루푸스(SLE), 장 점막 염증, 대장염과 관련된 소모병, 다발성 경화증, 바이러스 감염, 류마티스 관절염, 골관절염, 크론병, 및 염증성 장질환, 건선, 전신 피부경화증, 자가면역성 당뇨 등이다.
일부 실시양태에서, BASIGIN 관련 병태는 감염(증) 예컨대 진균 감염, 기생충/원생동물 감염 또는 만성 바이러스 감염, 예를 들면, 말라리아, 콕시디오이데스진균증 이미티스(coccidioiodmycosis immitis), 히스토플라스마증, 손발톱진균증, 아스페르길루스증, 블라스토마이코시스, 칸디다증 알비칸스(candidiasis albicans), 파라콕시디오이데스진균증(paracoccidioiomycosis), 미포자충병, 가시아메바 각막염, 아메바증, 회충증, 바베시아증, 바란티디움증, 아메리카너구리회충증, 샤가스병, 간흡충증, 코클리오미아, 크립토스포리디움증, 열두조충증, 메디나충증, 포충증, 상피병, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 필라리아증, 지아디아증, 악구충증, 왜소조충증, 이소스포라증, 카타야마열, 리슈마니아증, 라임병, 요코가와흡충증, 승저증, 회선사상충증, 슬증, 옴, 주혈흡충증, 수면병, 분선충증, 조충증, 개회충증, 톡소플라즈마증, 선모충증, 편충증, 트리파노소마증, 연충 감염, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 허프스 바이러스, 엡스타인바 바이러스, HIV, 사이토메갈로바이러스, 단순 포진 바이러스 타입 I, 단순 포진 바이러스 타입 II, 인간 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 I, 인간 면역결핍 바이러스 II, 카포시 웨스트 육종 관련 허프스 바이러스 전염병, 얇은 링 바이러스(토크테노바이러스), 인간 T 림프구친화성 바이러스 I, 인간 T 림프구친화성 바이러스 II, 대상 포진, JC 바이러스 또는 BK 바이러스의 감염이다. 일부 실시양태에서, 병태는 말라리아이다.
본원에서 사용시 병태의 "치료", "치료법" 또는 "요법"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 치료적 처치, 예방적 또는 차단적 조치, 예컨대 병태를 예방 또는 완화시키거나, 병태의 발병 또는 발병 속도를 늦추거나, 병태의 발병 위험을 줄이거나, 병태와 관련된 증상의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 병태와 관련된 증상을 감소 또는 종결시키거나, 병태의 완전한 또는 부분적인 퇴행을 일으키거나, 병태를 치유하거나, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
본원에서 사용시 용어 "치료적 유효량"은 인간 BASIGIN과 관련된 질병 또는 병태를 치료하는데 효과적인 약물의 용량 또는 농도를 지칭한다. 예를 들면, 암을 치료하기 위해 본원에 개시된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 항원 결합 단편의 사용과 관련하여, 치료적 유효량은 종양 부피를 감소시키거나, 암 세포의 성장 또는 증식을 저해하거나, 종양 성장 또는 다른 장기로의 암 세포 침윤을 저해 또는 늦추거나, 암 세포 전이를 저해 또는 늦추거나, 암과 관련된 임의의 증상을 완화시키거나, 암의 발생을 방지 또는 지연시키거나, 또는 이들의 일부 조합이 가능한 항체 또는 항원 결합 단편의 용량 또는 농도이다. 혹은, 말라리아를 치료하기 위해 본원에 개시된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 항원 결합 단편의 사용과 관련하여, 치료적 유효량은 말라리아원충의 감염 또는 증식을 저해하거나, 말라리아 병태와 관련된 임의의 증상을 완화시키거나, 말라리아 병태의 발생을 예방 또는 지연시키거나, 또는 이들의 일부 조합이 가능한 항체 또는 항원 결합 단편의 용량 또는 농도이다.
본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 항원 결합 단편의 치료적 유효량(단독으로 사용시 또는 다른 작용제 예컨대 화학치료제와 함께 사용시)은 당업계에 공지된 각종 인자, 예를 들면, 치료할 질병의 종류, 항체의 종류, 체중, 연령, 과거 의료 이력, 현재의 약물 치료, 대상체의 건강 상태, 면역 상태 및 교차 반응의 가능성, 알레르기, 감수성 및 부작용, 및 투여 경로 및 질병의 타입, 중증도 및 진행 및 주치의 또는 수의사의 재량에 좌우될 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 항원 결합 단편은 하루에 1회 이상 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 치료적 유효 용량(예를 들면, 하루에 1회 이상 약 0.01 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg)으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 항원 결합 단편은 약 50 mg/kg 이하의 용량으로 투여되고, 일부 실시양태에서 투여량은 20 mg/kg 이하, 10 mg/kg 이하, 3 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.3 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 일부 실시양태에서, 투여 용량은 치료 과정 동안 변할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서 초기 투여 용량은 후속의 투여 용량보다 더 높을 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 용량은 대상체의 반응에 따라 치료 과정 동안 변할 수 있다.
투여 계획은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 항원 결합 단편은 한번에 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 항원 결합 단편은 질병의 타입 및 중증도에 따라 1 이상의 분리 투여에 의해, 또는 연속 주입에 의해 대상체에 투여된다. 지침은 예를 들면, 미국 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 5,225,212에서 확인할 수 있다.
본원에 개시된 인간화 항-BASIGIN 항체 및 항원 결합 단편은 예를 들면, 비경구 루트(예를 들면, 피하, 복강내, 정맥내, 정맥내 주입, 근육내, 또는 피부내 주사를 포함함) 또는 비경구 아닌 루트(예를 들면, 경구, 코내, 눈내, 혀밑, 직장, 또는 국소)와 같은 당업게에 공지된 임의 루트에 의해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인간화 항-BASIGIN 항체 및 항원 결합 단편은 제어 방출 방식으로 투여될 수 있다. 제어 방출형 비경구 제제는 임플란트, 유성 주사액 또는 미립자 시스템(예를 들면, 마이크로스피어, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 나노스피어, 및 나노입자)으로 제조될 수 있다 (문헌[Banga, A. J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995); Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., pp. 219-31 (1994); Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., pp. 315-339, (1992)] 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 인간화 항-BASIGIN 항체 및 항원 결합 단편은 분해성 또는 비분해성 폴리머 매트릭스에 투여될 수 있다 (문헌[Langer, Accounts Chem . Res. 26:537-51, 1993] 참조).
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수 형태를 포함하고자 한다. 본원에서 사용되는 경우, "포함하다", "포함하는", "함유하다", "함유하는", "가지다" 및/또는 "가지는"이라는 용어는 명시된 특징, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분의 존재를 명시하지만 하나 이상의 다른 특징, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 특정의 언급된 수치와 관련하여 사용될 때, 용어 "약"은 그 값이 언급된 값으로부터 10% 이하로 변할 수 있음을 의미한다.
임의의 교차 참조되거나 관련된 특허 또는 출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 문헌은 명백히 배제되거나 달리 제한되지 않는 한 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함된다. 어떤 문헌의 인용은 본원에 개시 또는 청구된 발명에 관한 선행 기술이거나 또는 그 자체만으로 또는 임의의 다른 참고 문헌과 임의의 조합으로 그러한 발명을 교시하거나 시사하거나 개시하고 있음을 인정하는 것이 아니다. 또한, 본 문서에서 용어의 의미 또는 정의가 참조로 포함된 문헌에서 동일한 용어의 의미 또는 정의와 상충되는 한, 본 문서의 해당 용어에 지정된 의미 또는 정의가 적용된다.
실시예
하기의 실시예는 청구된 발명을 보다 잘 예시하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이하에서 설명되는 모든 특정 조성물, 재료 및 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 범위 내에 있다. 이들 특정 조성물, 재료 및 방법은 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라 단지 본 발명의 범위에 속하는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이다. 당업자는 창의력의 행사없이 그리고 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 동등한 조성물, 재료 및 방법을 개발할 수 있다. 본 발명의 범위 내에 여전히 존재하면서 본원에 기재된 절차에서 많은 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 그러한 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것은 본 발명자의 의도이다.
실시예 1: 파지 디스플레이 벡터의 구축
하이브리도마 세포주 HAb18GC2를 생성하고, 2006년에 차이니즈 센터 포 타입 컬쳐 컬렉션(China Center for Type Culture Collection)에 기탁 번호 CCTCC-C200636으로 기탁했다. 이 세포주, 이 세포주에 의해 생산된 항체 및 제조 방법에 관한 상세한 정보는 중국 특허 ZL200710007452.2(그 전문이 인용에 의해 본원에 포함됨)에 기재되어 있다.
총 RNA를, 키트의 매뉴얼에 따라 토탈 RNA 추출 키트(Omega bio-tek)를 사용함으로써 하이브리도마 세포 HAb18GC2로부터 추출했다. 추출된 총 RNA의 무결성을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석했다.
cDNA를, 1㎍의 총 RNA를 취하고, 역전사 키트 PrimeScript RT 시약 키트(TaKaRa)의 매뉴얼에 따라 cDNA 제1 가닥을 합성하여 제조하고 추가 실험을 위해 -20℃에 보관했다.
VH 유전자 단편 및 VL 유전자 단편은, PCR 반응에서 각각 VH 및 VL 유전자 특이적 프라이머 세트를 사용하여 cDNA 주형으로부터 증폭되었다. Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase(NEB)를 PCR에 사용하여, NEB의 매뉴얼에 따라 반응 믹스를 준비했다. PCR 반응 조건은 하기와 같다: 94℃, 5분; (94℃, 15초, 54℃, 30초, 72℃, 1분) x 35 사이클; 72℃, 10분. 증폭된 단편의 크기는 1% 아가로스 겔 전기영동에서 결정되었다.
링커 서열 및 이의 역 상보적 서열을, 추가 PCR 반응에서 프라이머(VH 역 링커-R1: 서열번호 34, CAAAGTTGGAAATAAAAGCGGCCGCAGAACAAAA; VL 링커-F1: 서열번호 35, TTTTGTTCTGCGGCCGCTTTTATTTCCAACTTTG)를 통해 VH 유전자 단편의 3' 단부 및 VL 유전자 단편의 5' 단부에 각각 도입했다.
링커 서열 또는 링커 서열의 역 상보적 서열을 갖는 VH 유전자 단편 및 VL 유전자 단편을 1:1(mol/mol)로 혼합하고 scFv 유전자를 오버랩-PCR 방법에 의해 증폭시켰다. 반응 시스템을 하기와 같이 준비했다: 1 pmol VH 유전자 단편, 1 pmol VL 유전자 단편, 100 pmol pFL-6H8-F1 프라이머(서열번호 33 CCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCT), 100 pmol pFL-6H8-R2 프라이머(서열번호 36 TTTTGTTCTGCGGCCGCTTTTATTTCCAACTTTG), 10 ㎕ 10x PCR 완충제. PCR 반응 조건을 하기와 같이 설정했다: 95℃, 5분; (95℃, 15초, 56℃, 30초, 72℃, 1분) x 35 사이클; 72℃, 10분. 증폭된 단편의 크기는 1% 아가로스 겔 전기영동에서 결정되었다.
예상 크기의 밴드를 절취하고, DNA 단편 정제 키트(Omega bio-tek)를 사용하여 회수하여 Nco I 및 Not I의 제한 부위를 함유하는 scFv 유전자 단편을 얻었다.
절단 부위 Nco I 및 Not I를 함유하는 scFv 유전자 단편 및 벡터 플라스미드 pGEM-T 벡터(Promega)를 자외선 분광광도계로 측정한 다음, 제한 효소 소화 처리했다.
반응은 하기와 같이 설정되었다: 3㎍의 회수된 scFv 유전자 단편 또는 3㎍의 pGEM-T 벡터, 1㎕ Nco I-HF, 1㎕ Not I-HF 제한 엔도뉴클레아제(NEB), 5㎕ 10x CutSmart 완충제를 혼합하고, 물을 50 ㎕까지 첨가함. 소화 반응 믹스를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트했다. 얻어진 산물의 크기를 1% 아가로스 겔 전기영동에서 결정하고, 예상 크기의 밴드를 절취하고, DNA 단편 정제 키트(Omega bio-tek)를 사용하여 회수하여 소화된 scFv 유전자 단편 및 소화된 pGEM-T 벡터를 얻었다.
소화 후, 회수된 scFv 유전자 단편 및 pGEM-T 벡터를 라이게이션했다. 라이게이션 반응 믹스는 하기와 같이 설정되었다: 0.7 ㎍ 소화된 scFv 유전자 단편, 1.4 ㎍ 소화된 pGEM-T 벡터, 40 U T4 리가제, 40 ㎕ 5x 라이게이션 완충제. 라이게이션 반응 믹스를 16℃에서 밤새 인큐베이트했다. TG1 적격 세포를 라이게이션 산물로 형질전환한 다음, LB 아가 플레이트상에 스프레드하고 37℃에서 밤새 인큐베이트했다. 개별 콜로니를 채취하고 벡터에 대한 유니버셜 프라이머로 양성 클론을 스크리닝했다. 이후, 양성 클론을 정확한 인서트를 위해 시퀀싱하고, (재조합 플라스미드 pFL-6H8로 명명된) 정확한 인서트를 함유하는 것으로 입증된 것들을 추가 사용을 위해 -40℃에서 보관했다. 재조합 플라스미드 pFL-6H8은 완전한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 scFv 유전자를 함유한다.
실시예 2: 마우스 단일클론 항체 6H8의 CDR 및 FR에 대한 결정
마우스 단일클론 항-hBASIGIN 항체 6H8(HAb18GC2로도 알려져 있음, 중국 특허: ZL200710007452.2 참조)의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR을 카밧 데이터베이스에 따라 결정했다. 3개의 경쇄 CDR의 아미노산 서열이 서열목록에서 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 제시되어 있다. 3개의 중쇄 CDR의 아미노산 서열은 서열목록에서 각각 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 제시되어 있다.
실시예 3: 적절한 인간 면역글로불린 프레임워크 서열의 선택
카밧 데이터베이스에서 얻어진 인간 FR 서열을 항체의 인간화를 위해 앞서 언급한 CDR로 그라프팅하고 그라프팅된 항체 가변 영역을 상동성 및 구조를 위해 스크리닝했다. Discovery Vision(VIOVIA, 버젼 3.5)으로 명명되는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 분자 모델링, 호몰로지 모델링 및 메카닉스의 최적화를 통해 인간화 이전 및 이후의 항체의 분자 구조를 분석하고, 인간 FR에서 가능한 변경을 확인하여 교체된 FR이 VH 및 VL의 전체 골격 구조를 변화시키지 않도록, 특히, 마우스 단일클론 항체의 β-가닥 제2 구조를 파괴하지 않도록 하여 오리지널 마우스 항체의 친화성을 유지하거나 개선하도록 했다. 특정 부위에서의 가능한 변형을 갖는 선택된 인간 중쇄/경쇄 가변 FR 서열은 본 개시 내용의 도 1 및 도 2에서 마우스 FR 서열과 나란히 수록되어졌다.
실시예 4: 파지 디스플레이 인간화 항- hBASIGIN 항체 라이브러리의 구축 및 스크리닝
실시예 2에서 결정된 CDR의 서열과 실시예 3에서 확인된 FR 서열에 기초하여, 인간화 항체의 ScFv 단편을 코딩하는 상응하는 뉴클레오티드 서열이 포유류의 세포에서 공통으로 사용되는 코돈을 사용함으로써 얻어졌다. 코딩 유전자를 오버랩-PCR 방법에 의해 얻은 다음, 클로닝 벡터 내에 클로닝하고 증폭시키며, 양성 클론에 대해 시퀀싱 분석을 실시했다. FR의 인간화를, 프라이머에 의해 중쇄/경쇄 FR의 코딩 서열 중의 특정 아미노산 부위에서의 변경 및 변형을 도입함으로써 실시했다. 상세한 프로토콜은 이하에 기술했다.
재료
실시예 1의 마우스 유래 scFv 단편을 주형으로서 사용했다. 하기의 프라이머를 인간화 중쇄 가변 영역(hVH) 및 인간화 경쇄 가변 영역(hVL)의 증폭을 위해 사용했다:
hVH 정방향 프라이머는 하기를 포함한다:
1) 6H8-L1-F1: 서열번호 37
CAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTTGTGGAGTCTG
2) 6H8-L1-F2: 서열번호 38 (6H8-L1-F2는 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 R = G 또는 A, S = G 또는 C)
CGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTTGAGTGGGTTRSCGAAATTAGATTGAAATC
3) 6H8-L1-F3: 서열번호 39 (6H8-L1-F3은 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 R = G 또는 A)
CAGATGAACTCCTTAARGACTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTACCAG
hVH 역방향 프라이머는 하기를 포함한다:
1) 6H8-L1-R1: 서열번호 40 (6H8-L1-R1은 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 M = A 또는 C, Y = T 또는 C)
GAAAGTGAATCCAGAGGCGGMACAGGAGAGCYTCAGGGATCCTCCAGG
2) 6H8-L1_R2: 서열번호 41
CCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTTCATCCAGAAGTTACTGAAAGTGAATCCAG
3) 6H8-L1-R3: 서열번호 42 (6H8-L1-R3은 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 R = G 또는 A, K = G 또는 T)
TAAGGAGTTCATCTGCAGGTACAGGRTGKTTTTGGAATCATCTCTTG
4) 6H8-L1-R4: 서열번호 43
GGGAGATTGGGTCATCTGAATGTCGCTAGCACCGCCAC
5) 6H8-L1_R5: 서열번호 44 (6H8-L1_R5는 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 R = G 또는 A, S = G 또는 C, W = A 또는 T, V = G 또는 C 또는 A)
GGTGACCCTGTCGCCCACTGAGRSGGACAGGGWGGVGGGAGATTGGGTC
hVL 정방향 프라이머는 하기를 포함한다:
1) 6H8-L1_F4: 서열번호 45 (6H8-L1_F4는 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 M = A 또는 C, W = A 또는 T)
GTGGGCGACAGGGTCACCMTCWCCTGCAAGGCCAGTGAG
2) 6H8-L1_F6: 서열번호 46 (6H8-L1_F6은 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 Y = T 또는 C, S = G 또는 C, W = A 또는 T)
TCAGCAGTCTGCAGYCCGASGACWTCGCAACCTATTACTGTGGACAGAGTTAC
3) 6H8-L1_F5: 서열번호 47
CCGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAG
hVL 역방향 프라이머는 하기를 포함한다:
1) 6H8-L1_R6: 서열번호 48 (6H8-L1_R6은 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 H = A 또는 C 또는 T, K = G 또는 T)
GTTGGATGCCCCGTATATCAGCAGTTTAGGGGHCTKGCCTGGTTTCTGTTG
2) 6H8-L1_R8: 서열번호 49
TTTGTTCTGCGGCCGCTTTTATTTCCAACTTTGTCCC
3) 6H8-L1_R7: 서열번호 50 (프라이머 6H8-L1_R7은 프라이머들의 혼합물을 나타냄, 여기서 W = A 또는 T, M = A 또는 C)
AGATCCACTGCCGGWGAAGCGGGMGGGGACCCCAGTGTACCGGTTGGATGCCCC
방법 및 결과
타겟 단편을 이하에 제시된 바와 같은 증폭 스킴에 따라 증폭시켰다:
제1 단계 증폭: 5개의 프라이머 쌍(6H8-L1-F1+6H8-L1-R1, 6H8-L1-F2+6H8-L1-R3, 6H8-L1-F3+6H8-L1-R4, 6H8-L1_F4+6H8-L1_R6, 6H8-L1_F6+6H8-L1_R8)을 사용하여 실시예 1에서 얻어진 pFL-6H8 벡터의 5개의 제1 단계 단편을 증폭시켰다. PCR 반응 조건은 하기와 같이 설정했다: 95℃, 3분; (95℃, 30초, 55℃, 30초, 72℃, 40초) x 40 사이클; 72℃, 10분. PCR 후에, 증폭된 단편의 크기를 1% 아가로스 겔 전기영동에서 결정한 다음 pMD18-T 벡터(TaKaRa) 내에 라이게이션시켰다. 라이게이션 산물을 적격 세포 내로 형질전환시키고, 클론을 선별하여 정확한 삽입에 대해 스크리닝했다. 시퀀싱 결과를 기초로 하여, 정확한 서열을 갖는 단편을 각각 6H8-L1-1, 6H8-L1-2, 6H8-L1-3, 6H8-L1-4 및 6H8-L1-5로 명명했다.
제2 단계 증폭: 앞서 얻어진 5개의 제1 단계 단편(6H8-L1-1, 6H8-L1-2, 6H8-L1-3, 6H8-L1-4 및 6H8-L1-5)을 주형으로서 사용하고, 4개의 프라이머 쌍(6H8-L1-F1 + 6H8 -L1_R2, 6H8-L1-F2 + 6H8-L1_R5, 6H8-L1_F4 + 6H8-L1_R7, 6H8-L1_F5 + 6H8-L1_R8)을 사용하여 제2 단계 단편을 증폭시켰다. PCR 반응 조건은 제1 단계 증폭과 동일했다. PCR 후에, PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 정제하고, pMD18-T 벡터(TaKaRa) 내에 라이게이션하고 적격 세포 내로 형질전환시켰다. 양성 클론을 선별하고 정확한 삽입에 대해 스크리닝했다. 시퀀싱 결과를 기초로 하여, 정확한 서열을 갖는 단편을 각각 6H8-L1-6, 6H8-L1-9, 6H8-L1-7 및 6H8-L1-8로 명명했다.
제3 단계 증폭: 제1 단계 증폭과 동일한 절차에 따라, 앞서 얻어진 2개의 제2 단계 단편(6H8-L1-6 및 6H8-L1-9)을 주형으로서 사용하고, 프라이머 쌍(6H8-L1-F1+6H8-L1_R5)을 사용하여 제3 단계 단편(6H8-L1-10)을 얻고; 앞서 얻어진 2개의 제2 단계 단편(6H8-L1-7 및 6H8-L1-8)을 주형으로서 사용하고, 프라이머 쌍(6H8-L1_F4+6H8-L1_R8)을 사용하여 제3 단계 단편(6H8-L1-11)을 얻었다.
제4 단계 증폭: 제1 단계 증폭과 동일한 절차에 따라, 앞서 얻어진 제3 단계 단편(6H8-L1-10 및 6H8-L1-11)을 주형으로서 사용하고, 프라이머 쌍(6H8-L1-F1+6H8-L1_R8)을 사용하여 제4 단계 단편(6H8-L1-12)을 얻었다.
6H8-L1-12 단편을 제한 효소 NcoI-HF 및 NotI-HF(NEB)로 소화한 다음, 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 분리하고, 이후 소화된 단편을 겔 추출 키트(Omega bio-tek)로 정제했다. 정제되어진 소화된 단편을, T4 DNA 리가제(TaKaRa)를 통해 동일한 세트의 제한 효소(즉, NcoI-HF 및 NotI-HF)로 소화되는 파지 벡터 pComb3Xss(파지 벡터의 백본 내로 미리조작된 c-myc 융합 단백질을 포함함)로 라이게이션시켰다. 라이게이션 산물을 탈이온화한 다음 전기천공을 통해 TG1 적격 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 TG1 세포를 클론 스크리닝을 위해 LB 플레이트상에 접종했다. 6H8-L1 항체 파지 라이브러리의 용량을 기록하고, 라이브러리를 추가 사용을 위해 -80℃에서 보관했다.
6H8-L1 항체 파지 라이브러리의 항원 특이성 패닝을 하기 단계에 따라 고체-상 패닝에 의해 실시했다:
6H8-L1 항체 파지 라이브러리를 60 ml의 2YT 배지에서 부활시키고, 배양물의 OD600이 0.3-0.4에 도달할 때까지 쉐이커 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이트했다. M13KO7 헬퍼 파지(Invitrogen)를 첨가하고, 배양물을 정치 인큐베이터에서 30분간 인큐베이트하고 쉐이커 인큐베이터에서 37℃에서 60분간 인큐베이트했다. 배양물을 1500 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포를 50 ㎍/ml 카나마이신 함유 2YT 배지(글루코스없이) 60 ml에 재현탁시켰다. 재현탁된 배양물을 쉐이커 인큐베이터에서 30℃에서 밤새 인큐베이트하고, 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 박테리아 함유 파지 디스플레이 라이브러리를 침전시켰다. 상청액을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 30 ml/튜브 롯으로 분취하고, 7.5 ml의 PEG/NaCl을 각 원심분리 튜브에 첨가하고, 충분히 혼합하여, 얼음상에 1시간 동안 두고, 12000 rpm으로 5분간 원심분리하고, 상청액을 버리고, 파지를 PBS-5% BSA를 함유한 용액 2.2 ml에 재현탁시켰다. 재현탁된 파지를 12000 rpm으로 5분간 다시 원심분리하여 세포 파편을 제거했다.
인간 BASIGIN 코팅된 플레이트를 사용하여 5 라운드 패닝(결합-세척-증폭)을 위한 친화성 패닝을 수행하고, 각 라운드의 패닝을 위해 항원의 코팅 농도를 점차적으로 감소시켰다(1 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml, 0.001 ㎍/ml, 0.0001 ㎍/ml). 패닝 실험은 신호 대 노이즈 비(S/N)가 10 아래일 때 종료했다. 768개 클론을 선별하고 선별된 클론을 배양하여 scFv 항체를 발현하도록 유도하고 ELISA 분석에 사용했다.
실시예 5: ELISA 및 시퀀싱 분석
인간 BASIGIN을 코팅 완충제(200 mM Na2CO3/NaHCO3, pH 9.2)를 사용하여 1 ㎍/ml로 희석하고, 이 중 50 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이트했다. 각 웰의 코팅 용액을 버리고 플레이트를 1xPBS 완충제로 3회 세척했으며, 웰당 200 ㎕의 블로킹 완충제(2% BSA/1xPBS 완충제)로 실온에서 1시간 동안 블로킹한 다음, 웰당 200 ㎕의 1xPBS 완충제로 세척했다. ScFv 항체를 함유하는 세포 배양 상청액 및 음성 대조군을 플레이트의 개개 웰 내에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이트했다. 이후, 플레이트를 200 ㎕의 1x PBS 완충제로 3회 세척했다. 블로킹 완충제로 희석된(1: 2500) 이차 항체(Abcam Cat # ab19312, 50 ㎕/웰)로서의 항-c-Myc Ab(HRP)를 플레이트의 개개 웰 내에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이트했다. 이후, 플레이트를 200 ㎕의 1x PBS 완충제로 6회 세척했다. TMB 기질 용액(50 ㎕/웰)을 각 웰에 첨가하여 10분간 반응시키고, 정지 용액(2 M HCl, 50 ㎕/웰)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 리더에서 판독했다. ELISA의 결과에 따라, A450> 2.0의 123개 클론을 시퀀싱 분석을 위해 선별했다.
시퀀싱의 DNA 서열 결과를 인간 면역글로불린 생식세포계 데이터베이스 및 웹사이트 http://www.bioinf.org.uk/abs/shab/를 참조하여 인간화 정도에 대해 평가했다. 인간화의 최고 정도를 갖는 26개의 scFV 분자를 친화성 분류를 위해 선별했다.
실시예 6: SPR에 의한 scFv 결합 친화성의 결정
항체의 친화성은 ProteOn XPR36(Bio-Rad)으로 측정되었다. GLC 칩(Bio-Rad, 1765011)을 0.04 M EDC + 0.01 M 술포-NHS(Bio-Rad)로 활성화시켰다. 인간 BASIGIN을 10 mM NaAc(pH 4.5)로 10 mM로 희석한 다음 30 ㎕/min의 비율로 칩상에 주입하여 항원을 아미노 기를 통해 활성화된 칩과 커플링시켰다. 마지막으로, 칩을 1 M 에탄올아민-HCl(Bio-Rad)로 불활성화시키고, 칩을 90도 회전시켰을 때, 기준선이 안정될 때까지 완충제(PBS/0.005% Tween 20)로 세척했다. scFv 항체를 함유한 5개의 세포 배양 상청액과 하나의 음성 대조군을 30 ㎕/min의 공급 속도로 각각 6개의 수평 채널 상에 주입했다. 결합을 위한 시간을 60초로 설정하고 해리를 위한 시간을 900초로 설정했다. 데이터를 Kinetic-Langmuir 모델을 사용하여 분석했다.
scFv 항체를 함유한 TG1 상청액과 인간 BASIGIN의 결합의 실시간 모니터링을 위해 SPR을 사용했다. 스크리닝된 모든 항체의 회합 속도 상수(Kon)는 비슷했으며, 따라서 해리 속도 상수(Koff)가 KD 대신에 항체의 결합 친화성을 결정하는데 사용되었다. 인간화 scFv 항체와 인간 BASIGIN의 결합 친화성은 Koff에 따라 미리 평가되었고 결과가 표 1에 제시된다.
Figure pct00001
다른 특징을 고려하여, 각각 온전한 항체를 구축하기 위해 비교적 낮은 Koff 값을 갖는 것들로부터 5개의 인간화 scFv(즉, 11188, 11214, 11242, 11245 및 11305)를 선별했다.
실시예 7: 온전한 인간화 항체의 구축
이전의 친화성 분류의 결과에 따라, 선별된 scFv를 갖는 5개의 클론을 밤새 접종했다. 플라스미드를 각각의 밤새 배양물로부터 추출하고, 이의 서열은 시퀀싱에 의해 확인하였다.
온전한 인간화 항체의 생성을 위한 인간화 중쇄 가변 영역(VH) 및 인간화 경쇄 가변 영역(VL)의 증폭을 위해 하기의 프라이머가 사용되었다:
VL 정방향 프라이머: PCI-wbp229_F1, 서열번호 51
GCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATTCAGATGACCCAATC
VL 역방향 프라이머: pCI-6H8_R8, 서열번호 52
GGTGCAGCCACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG
VH 정방향 프라이머는 하기를 포함한다:
1) PCI-wbp229_F2: 서열번호 53
CTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAGTGCAGCTTCTGGAGTC
2) PCI-wbp229_F3: 서열번호 54
CTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAGTGCAGCTTGTGGAGTC
3) 6H8-L1_R2: 서열번호 55
CCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTTCATCCAGAAGTTACTGAAAGTGAATCCAG
4) 6H8-L1_R5: 서열번호 56
GGTGACCCTGTCGCCCACTGAGRSGGACAGGGWGGVGGGAGATTGGGTC
VH 역방향 프라이머: PCI-wbp229_R1, 서열번호 57 참조
GGGCCCTTGGTCGACGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC
타겟 단편을 이하에 제시된 증폭 스킴에 따라 증폭시켰다:
11188 유래의 플라스미드가 주형으로 사용되었고, 프라이머 쌍(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 및 PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1)이 온전한 인간화 항체 WBP229-201의 VL 및 VH 영역을 증폭시키는데 사용되었다.
11214 유래의 플라스미드가 주형으로 사용되었고, 프라이머 쌍(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 및 PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1)이 온전한 인간화 항체 WBP229-202를 위한 VL 및 VH 영역을 증폭시키는데 사용되었다.
11242 유래의 플라스미드가 주형으로 사용되었고, 프라이머 쌍(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 및 PCI-wbp229_F3+PCI-wbp229_R1)이 온전한 인간화 항체 WBP229-203을 위한 VL 및 VH 영역을 증폭시키는데 사용되었다.
11245 유래의 플라스미드가 주형으로 사용되었고, 프라이머 쌍(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 및 PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1)이 온전한 인간화 항체 WBP229-204를 위한 VL 및 VH 영역을 증폭시키는데 사용되었다.
11305 유래의 플라스미드가 주형으로 사용되었고, 프라이머 쌍(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 및 PCI-wbp229_F3+PCI-wbp229_R1)이 온전한 인간화 항체 WBP229-205를 위한 VL 및 VH 영역을 증폭시키는데 사용되었다.
PCR 후에, 증폭된 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동에서 분리하고, 예상 크기의 밴드를 회수 및 정제했다.
정제된 VL/VH 단편을 NgoMIV 및 SnaBI로 소화시키고, 소화된 단편을 DNA 정제 키트로 정제한 다음, (hIgG2 중쇄 불변 영역 또는 인간 κ 쇄 불변 영역) 유전자를 포함하고 동일한 효소로 소화된 포유류의 발현 벡터 pCI-벡터로 라이게이션했다. 라이게이션 산물을 TOP10 이. 콜라이(E. coli) 세포(Invitrogen) 내로 형질전환하고, 형질전환된 세포를 100 ㎍/ml의 암피실린을 갖는 LB 아가 플레이트상에 스프레딩했다. 이후, 양성 클론을 100 ㎍/ml의 암피실린을 갖는 LB 액체 배지에 접종하고, 시퀀싱에 의해 클론을 확인한 후, Midi-Prep 플라스미드 추출 키트(QIAGEN)를 사용하여 클론 플라스미드를 추출했다. 제조된 플라스미드를 각각 pCI-WBP229-201L 및 pCI-WBP229-201H, pCI-WBP229-202L 및 pCI-WBP229-202H, pCI-WBP229-203L 및 pCI-WBP229-203H, pCI-WBP229-204L 및 pCI-WBP229-204H, pCI-WBP229-205L 및 pCI-WBP229-205H로 명명했으며, 이들 각각은 온전한 인간화 항체의 제조를 위한 완전한 경쇄 유전자 또는 완전한 중쇄 유전자를 함유한다.
실시예 8: 세포의 일시적 형질감염 및 항체 정제
HEK293 세포(1.0x106 세포/ml)를, Invitrogen의 Freestyle Max Reagent 형질감염 시약을 사용함으로써 하나의 경쇄 유전자 및 하나의 상응하는 중쇄 유전자를 함유하는 한쌍의 플라스미드(예를 들면, pCI-WBP229-201L/H~205L/H)로 공형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 37℃, 5% CO2, 및 회전 속도 120 rpm에서 쉐이커 인큐베이터에 접종하였다. 배양 상청액을 형질감염후 7일째 원심분리에 의해 모아, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 상청액으로부터 타겟 항체를 단리 및 정제했다. 이하의 가장 높은 인간화 항체 생산을 갖는 3개의 배양물을 선별했다:
1) 서열번호 3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 서열번호 16의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 HP6H8-1 (pCI-WBP229-205L/H에 상응함).
2) 서열번호 5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 서열번호 18의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 HP6H8-2 (pCI-WBP229-204L/H에 상응함).
3) 서열번호 7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 서열번호 20의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 HP6H8-3 (pCI-WBP229-203L/H에 상응함).
실시예 9: 인간화 항- hBASIGIN 항체의 결합 친화성의 결정
200 ng의 인간 BASIGIN 재조합 단백질을 ELISA 플레이트 내에 코팅하고 4℃에서 밤새 정치시켰다. 코팅된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 0.1% BSA로 블로킹시켰다. 모 마우스 단일클론 6H8 및 키메라 항체 c6H8와 함께 실시예 8에서 얻어진 3개의 항체를 각각 10, 100, 1,000, 10,000 및 100,000 ng/ml의 농도 구배로 5개 용액으로 준비했다. 100 ㎕의 각 용액을 개개 웰 내에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 정치시켰다. 이차 항체로서 100 ㎕의 1:4,000 희석된 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 염소 항-인간 경쇄 불변 영역(Millipore)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 정치시켰다. 이후, 플레이트를 200 ㎕의 1x PBS 완충제로 3회 세척하고, TMB 기질 용액(50 ㎕/웰)을 각 웰에 첨가하여 10분간 반응시키고, 정지 용액(2 M HCl, 50 ㎕/웰)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 리더에서 판독했다.
결과에 따라, 3개의 인간화 항체 및 키메라 항체 c6H8는 모 마우스 항체 6H8과 비교했을 때 인간 BASIGIN에 대해 상당히 더 높은 친화성을 나타내었다 (도 3).
3개의 인간화 항체, 마우스 항체 6H8 및 키메라 항체 c6H8의 결합 친화성이 또한 SPR에 의해 결정되었고 (상세한 단계에 대해서는, 실시예 6의 설명을 참조하기 바란다), 데이터가 표 2에 제시되었다.
Figure pct00002
도 3 및 표 2에 제시된 바와 같이, 인간화 항체의 결합 친화성은 모 마우스 항체 6H8의 것보다 더 높았다. 인간에서 인간화 항체의 면역원성은 모 마우스 항체 6H8의 것보다 더 낮고 인간화 항체의 안정성은 모 마우스 항체 6H8의 것보다 더 우수하다.
실시예 10: 매우 효율적인 인간화 항- hBASIGIN 항체 발현 벡터의 구축 및 안정된 발현 세포주의 스크리닝
실시예 9의 결과에 따라, HP6H8-1의 유전자 서열이 매우 효율적인 인간화 항체 발현 벡터의 구축을 위해 사용되었다.
1. 경쇄 유전자 발현 벡터의 구축
HP6H8-1의 VL 영역을 코딩하는 유전자 서열을 합성하고 서열의 5' 및 3' 단부 각각에 XbaI 및 BsiWI의 제한 효소 인식 부위를 추가했다. 합성된 분자 및 경쇄 불변 유전자를 갖는 pcDNA3.3-LC-104new-M 플라스미드를 제한 효소 XbaI 및 BsiWI로 소화시켰다. 소화된 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동에서 분리하고, 예상 크기의 밴드를 회수 및 정제했다. 정제된 단편(합성 분자에서 유래한 416bp의 단편 및 pcDNA3.3-LC-104new-M 플라스미드에서 유래한 5,712bp의 단편)을 T4 리가제를 사용하여 라이게이션하고 반응 믹스를 16℃에서 20분간 유지했다. 20 ㎕ 라이게이션 용액 중 10 ㎕를 사용하여 이. 콜라이 TOP10 적격 세포(Invitrogen)를 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 PCR 분석, 효소 소화 분석 및 시퀀싱으로 확인한 후, 하나의 정확한 모노-클론을 쉐이커 인큐베이터 중의 200ml LB 배지에서 37℃에서 220 rpm으로 접종시켰다. 플라스미드를 추출하고 pcDNA3.3-LC-N-229-205로 명명했다 (도 4에 도시됨).
2. 중쇄 유전자 발현 벡터의 구축
마찬가지로, HP6H8-1의 VH 영역을 코딩하는 유전자 서열을 합성하고 서열의 5' 및 3' 단부 각각의 XbaI 및 NheI의 제한 효소 인식 부위를 추가했다. 합성된 분자 및 중쇄 불변 유전자를 갖는 pOptivec-HC-208-M 플라스미드를 제한 효소 XbaI 및 NheI로 소화시켰다. 소화된 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동에서 분리하고 예상 크기의 밴드를 회수 및 정제했다. 정제된 단편(합성 분자 유래의 434bp의 단편 및 pOptivec-HC-208-M 플라스미드 유래의 5,364bp의 단편)을 T4 리가제를 사용하여 라이게이션하고 반응 믹스를 16℃에서 20분간 유지했다. 20 ㎕ 라이게이션 용액 중 10 ㎕를 사용하여 이. 콜라이 TOP10 적격 세포(Invitrogen)를 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 PCR 분석, 효소 소화 분석 및 시퀀싱으로 확인한 후, 하나의 정확한 모노-클론을 쉐이커 인큐베이터 중의 200ml LB 배지에서 37℃에서 220 rpm으로 접종시켰다. 플라스미드를 추출하고 pOptivec-HC-D-229-205로 명명했다 (도 5에 도시됨).
3. CHO 안정된 발현 세포주의 구축 및 스크리닝
인간화 항체 경쇄 발현 벡터 pcDNA3.3-LC-N-229-205 및 인간화 항체 중쇄 발현 벡터 pOptivec-HC-D-229-205를 Freestyle Max Reagent(Invitrogen)를 사용하여 CHO/DHFR 세포 내에 형질감염시켰다. 형질감염후 48시간째, 세포를 초기에 계대시키고 세포 생존력이 85% 이상으로 회복될 때까지 500 ㎍/ml G418을 보충한 Opti CHO 배지로 스크리닝하였다. 500 nM MTX를 함유한 스크리닝 배지에서 제2 라운드 스크리닝을 실시했다. ClonePix FL로 단일 클론을 선별했다. 단일클론 배양의 7-10일 후, 배양 상청액 중의 HP6H8-1의 발현 수준은 HTRF 방법으로 측정시 2.23 ± 0.18 g/L였다 (도 6에 도시됨).
실시예 11: 인간화 항- hBASIGIN 항체의 특이성의 결정
면역조직화학법을 사용하여 종양 조직에 대한 항체 HP6H8-1의 특이적 결합을 검출하고, 항체의 면역조직화학적 교차 반응성을 조사했다. 3% H2O2를 사용하여 내인성 퍼옥시다제를 블로킹 및 불활성화시키고, 정상 양 혈청 작용 용액을 블로킹에 사용하고, HP6H8-1을 일차 항체로서 사용하고, 비오틴-표지된 토끼 항-인간 Fc 항체를 이차 항체로서 사용하고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 스트렙토마이신 알부민 용액을 표지 시약으로서 사용하고, DAB를 착색을 위해 사용하고, 헤마톡실린을 재-염색에 사용했다. 샘플을 탈수시킨 후, 이를 운반하는 슬라이드를 현미경 검사를 위해 실장시켰다.
결과가 도 7에 도시되며, 항체 HP6H8-1의 특이적 착색이 폐암, 간암, 대장암 및 다른 악성 종양 조직에서 관찰되었지만, 정상 조직에서는 거의 관찰되지 않았고, 착색의 상이한 정도를 "++" 또는 "+++"로서 마킹했다.
상기 결과는 CDR 그라프팅에 기초한 본 개시 내용에서 제조된 인간화 항체가 인간 BASIGIN을 특이적으로 인식할 수 있음을 보여준다.
실시예 12: HP6H8 -1 항체를 이용한 시험관내 항말라리아 검사
인간 적혈구(O-형)를 열대열 말라리아 균주 Dd2, 3D7, FCC1 및 Nf54로 각각 감염시켰다. 감염률이 1% 이상이고 말라리아 로젯이 80% 이상인 경우에, 항말라리아 검사를 시행했다. 배양물을 단일클론 항체로 희석하여 기생충병의 초기 수준을 0.5%로 설정하고, 신선한 적혈구를 첨가하여 초기 헤마토크리트를 2%로 설정하며, 단일클론 항체 HP6H8-1을 각각 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ㎍/ml의 농도로 첨가하고, 각 농도 구배를 3회씩 시험했다. 37℃에서 72시간 동안 배양한 후, 얇은 혈액 도말을 준비하고 100x 오일 현미경으로 관찰하여 기생충 비율을 계수하였다. 실험을 독립적으로 3회 반복하고, 결과를 평균했으며, 통계를 위해 SPSS로 분석했다.
열대열 말라리아 균주 Dd2, 3D7, FCC1 및 Nf54에 대한 인간화 HP6H8-1 단일클론 항체의 시험관내 약력학적 결과가 도 8에 도시되었다. 항체 투여 후 72시간째에, 인간화 단일클론 항체 HP6H8-1은 모든 열대열 말라리아 균주에 대해 상당한 항말라리아 효과를 나타내었으며, IC50은 각각 0.04, 0.02, 0.04, 및 0.05 mg/ml였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
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Figure pct00006
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Figure pct00024
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Figure pct00030
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Figure pct00034
SEQUENCE LISTING <110> Fourth Military Medical University <120> HUMANIZED ANTI-BASIGIN ANTIBODIES AND THE USE THEREOF <130> 022079-8006WO01 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of humanized heavy chain variable region of humanized anti-BASIGIN antibody or antigen binding fragment with variations <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (79)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (94)..(94) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Xaa Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Xaa Xaa 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Thr Glu Asp Thr Xaa Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of humanized light chain variable region of humanized anti-BASIGIN antibody or antigen binding fragment with variations <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (42)..(43) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (80)..(81) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (83)..(83) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Xaa Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Xaa 65 70 75 80 Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region (VH) of humanized antibody HP6H8-1 <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 4 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of heavy chain variable region (VH) of humanized antibody HP6H8-1 <400> 4 gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgaggctc 60 tcctgtgccg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggcttgagtg ggtttccgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc 240 ctgtacctgc agatgaactc cttaaagact gaagacactg ccgtgtatta ctgtaccagc 300 tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region (VH) of humanized antibody HP6H8-2 <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 6 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of heavy chain variable region (VH) of humanized antibody HP6H8-1 <400> 6 gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgaagctc 60 tcctgtgccg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggcttgagtg ggttgccgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc 240 ctgtacctgc aaatgaactc cttaaggact gaagacactg ccgtgtatta ctgtaccagc 300 tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region (VH) of humanized antibody HP6H8-3 <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 8 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of heavy chain variable region (VH) of humanized antibody HP6H8-3 <400> 8 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Ala Ala Cys Thr Thr Cys 85 90 95 Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr 130 135 140 Gly Cys Cys Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ala 145 150 155 160 Ala Ala Thr Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Cys 165 170 175 Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ala Thr Gly Cys Gly Gly Ala Gly 180 185 190 Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr 195 200 205 Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala 210 215 220 Thr Gly Ala Thr Thr Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys 225 230 235 240 Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala 245 250 255 Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala 260 265 270 Ala Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr 275 280 285 Thr Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly 290 295 300 Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys 325 330 335 Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala 340 345 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> HCDR1 <222> (1)..(10) <400> 9 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> HCDR2 <222> (1)..(19) <400> 10 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> HCDR3 <222> (1)..(5) <400> 11 Tyr Asp Tyr Glu Tyr 1 5 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X= any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 12 Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser 20 25 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Human heavy chain FR2 <222> (1)..(14) <400> 13 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Xaa 1 5 10 <210> 14 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Human heavy chain FR3 <222> (1)..(32) <400> 14 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Xaa Xaa Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Xaa Thr Glu Asp Thr Xaa Val Tyr Tyr Cys Thr Ser 20 25 30 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Human heavy chain FR4 <222> (1)..(11) <400> 15 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region (VL) of humanized antibody HP6H8-1 <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of light chain variable region (VL) of humanized antibody HP6H8-1 <400> 17 gacattcaga tgacccaatc tccctccacc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc 60 ctctcctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120 ggcaaggccc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtcccctcc 180 cgcttcaccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc 240 gaggacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa a 321 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region (VL) of humanized antibody HP6H8-2 <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of light chain variable region (VL) of humanized antibody HP6H8-2 <400> 19 gacattcaga tgacccaatc tcccgcctcc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc 60 atctcctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120 ggccagaccc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtcccctcc 180 cgcttctccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc 240 gacgacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa a 321 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region (VL) of humanized antibody HP6H8-3 <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of light chain variable region (VL) of humanized antibody HP6H8-3 <400> 21 gacattcaga tgacccaatc tccctcctcc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc 60 ctcacctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120 ggccaggccc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtcccctcc 180 cgcttcaccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc 240 gacgacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa a 321 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> LCDR1 <222> (1)..(11) <400> 22 Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> LCDR2 <222> (1)..(7) <400> 23 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> LCDR3 <222> (1)..(9) <400> 24 Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Human light chain FR1 <222> (1)..(23) <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys 20 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Human light chain FR2 <222> (1)..(15) <400> 26 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 27 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Human light chain FR3 <222> (1)..(32) <400> 27 Gly Val Pro Xaa Arg Phe Thr Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Xaa Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Human light chain FR4 <222> (1)..(10) <400> 28 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> Amino acid sequence of the light chain variable region of 6H8 <222> (1)..(107) <400> 29 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> Nucleic acid sequence of the light chain variable region of 6H8 <222> (1)..(321) <400> 30 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtgggcga gagggtcacc 60 ttgagctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagaccttg cagattatca ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa a 321 <210> 31 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> Amino acid sequence of heavy chain variable region of 6H8 <222> (1)..(116) <400> 31 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 32 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> Nucleic acid sequence of the heavy chain variable region of 6H8 <222> (1)..(348) <400> 32 gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc agatgaacaa cttaagaact gaagacactg gcatttatta ctgtaccagc 300 tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcaccg tctctgca 348 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFL-6H8-F1 <400> 33 cccagccggc catggccgaa gtgaagcttg aggagtct 38 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker-R1 <400> 34 caaagttgga aataaaagcg gccgcagaac aaaa 34 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker-F1 <400> 35 ttttgttctg cggccgcttt tatttccaac tttg 34 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFL-6H8-R2 <400> 36 ttttgttctg cggccgcttt tatttccaac tttg 34 <210> 37 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1-F1 <400> 37 cagccggcca tggccgaagt gcagcttgtg gagtctg 37 <210> 38 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1-F2 <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> R = G or A, S = G or C <400> 38 cgccaggctc cagggaaggg gcttgagtgg gttrscgaaa ttagattgaa atc 53 <210> 39 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1-F3 <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> R = G or A <400> 39 cagatgaact ccttaargac tgaagacact gccgtgtatt actgtaccag 50 <210> 40 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1-R1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> M = A or C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Y = T or C <400> 40 gaaagtgaat ccagaggcgg macaggagag cytcagggat cctccagg 48 <210> 41 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_R2 <400> 41 ccctggagcc tggcggaccc agttcatcca gaagttactg aaagtgaatc cag 53 <210> 42 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1-R3 <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> R = G or A <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> K = G or T <400> 42 taaggagttc atctgcaggt acaggrtgkt tttggaatca tctcttg 47 <210> 43 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1-R <400> 43 gggagattgg gtcatctgaa tgtcgctagc accgccac 38 <210> 44 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_R5 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> R = G or A, S = G or C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> W = A or T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> V = G or C or A <400> 44 ggtgaccctg tcgcccactg agrsggacag ggwggvggga gattgggtc 49 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_F4 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> M = A or C <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> W = A or T <400> 45 gtgggcgaca gggtcaccmt cwcctgcaag gccagtgag 39 <210> 46 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_F6 <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Y = T or C <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> S = G or C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> W = A or T <400> 46 tcagcagtct gcagyccgas gacwtcgcaa cctattactg tggacagagt tac 53 <210> 47 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_F5 <400> 47 ccggcagtgg atctggcaca gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag 50 <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_R6 <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> H = A or C or T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> K = G or T <400> 48 gttggatgcc ccgtatatca gcagtttagg gghctkgcct ggtttctgtt g 51 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_R8 <400> 49 tttgttctgc ggccgctttt atttccaact ttgtccc 37 <210> 50 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_R7 <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> W = A or T <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> M = A or C <400> 50 agatccactg ccggwgaagc gggmggggac cccagtgtac cggttggatg cccc 54 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCI-wbp229_F1 <400> 51 gctccccggg gcgcgctgtg acattcagat gacccaatc 39 <210> 52 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCI-6H8_R8 <400> 52 ggtgcagcca ccgtacgttt tatttccaac tttgtccccg ag 42 <210> 53 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCI-wbp229_F2 <400> 53 ctctccacag gtgtacactc cgaagtgcag cttctggagt c 41 <210> 54 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCI-wbp229_F3 <400> 54 ctctccacag gtgtacactc cgaagtgcag cttgtggagt c 41 <210> 55 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_R2 <400> 55 ccctggagcc tggcggaccc agttcatcca gaagttactg aaagtgaatc cag 53 <210> 56 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6H8-L1_R5 <400> 56 ggtgaccctg tcgcccactg agrsggacag ggwggvggga gattgggtc 49 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCI-wbp229_R1 <400> 57 gggcccttgg tcgacgctgc agagacagtg accagagtc 39

Claims (30)

  1. 서열번호 1 (EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 서열번호 1의 위치 i(i = 5, 23, 49, 79, 80, 89, 94)에서의 X는 XHi라고 하며, XH5, XH23, XH49, XH79, XH80, XH89, XH94의 각각은 임의의 아미노산일 수 있는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, XH5는 V 또는 L이고, XH23은 A 또는 S이고, XH49는 S, A 또는 G이고, XH79는 N 또는 S이고, XH80은 T 또는 I이고, XH89는 K 또는 R이고, XH94는 A 또는 T인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, (a) XH5는 V이고, XH23은 A이며; 그리고/또는 (b) XH49는 S 또는 A이고; 그리고/또는 (c) XH79는 N이고, XH80은 T이고, XH89는 K 또는 R이고, XH94는 A인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, VH는 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, VH는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15에 제시된 프레임워크 영역(FR)을 포함하는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 22, 서열번호 23 또는 서열번호 24에 제시된 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함하는 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, VL은 서열번호 2 (DIQMTQSPXXLSXSVGDRVTXXCKASENVGTYVSWYQQKPGXXPKLLIYGASNRYTGVPXRFTGXGSGTDFTLTISSLQXXDXATYYCGQSYSYPFTFGSGTKLEIK)의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 2의 위치 j(j = 9, 10, 13, 21, 22, 42, 43, 60, 65, 80, 81, 83)에서의 X는 XLj라고 하며, XL9, XL10, XL13, XL21, XL22, XL42, XL43, XL60, XL65, XL80, XL81, XL83의 각각은 임의의 아미노산일 수 있는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, XL9는 S, P 또는 A이고, XL10은 T 또는 S이고, XL13은 A, L 또는 V이고, XL21은 L 또는 I이고, XL22는 S 또는 T이고, XL42는 K 또는 Q이고, XL43은 A, T 또는 S이고, XL60은 S 또는 A이고, XL65는 S 또는 T이고, XL80은 P 또는 S이고, XL81은 E 또는 D이고, XL83은 F 또는 I인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제7항에 있어서, (a) XL9는 S 또는 A이고, XL10은 T 또는 S이고, XL13은 A이고, XL21은 L 또는 I이고, XL22는 S 또는 T이며; 그리고/또는 (b) XL42는 K 또는 Q이고, XL43은 A 또는 T이며; 그리고/또는 (c) XL60은 S이고, XL65는 S 또는 T이고, XL80은 P이고, XL81은 E 또는 D이고, XL83은 F인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제7항에 있어서, VL은 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제6항에 있어서, VL은 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 FR을 포함하는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, dsFv, dAb, 및 단일쇄 결합 폴리펩티드로부터 선택된 항체 단편인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항에 있어서, 중쇄 폴리펩티드가 인간 IgG 중쇄의 불변 영역을 포함하는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제10항에 있어서, 인간 IgG가 인간 IgG2인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제6항에 있어서, 경쇄 폴리펩티드가 인간 κ 쇄의 불변 영역을 포함하는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항에 있어서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 1x10-11M 내지 약 5x10-10M의 KD로 BASIGIN에 결합하는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5x10-11M 내지 약 1.1x10-10M의 KD로 BASIGIN에 결합하는 것인 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. BASIGIN과의 결합에 대해 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁할 수 있는 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  20. 제19항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 19, 또는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열.
  21. 제19항에 있어서, 인간 IgG 중쇄 또는 인간 카파 쇄의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산 서열.
  22. 제20항 또는 제21항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  23. 제22항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. 제23항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
  25. (a) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  26. 제25항의 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 BASIGIN 관련 질환을 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, BASIGIN 관련 질환은 암 또는 말라리아인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 암은 폐암, 간암, 자궁경부암, 대장암, 유방암, 난소암, 식도암 또는 위암인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
  30. 대상체에서 BASIGIN 관련 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 인간화 항-BASIGIN 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
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