KR20190003694A

KR20190003694A - 재조합 단백질을 생성시키는 방법

Info

Publication number: KR20190003694A
Application number: KR1020187034736A
Authority: KR
Inventors: 로빈 알렉산드라 엠민스; 개리 브라이언 핀카; 미셸 호어; 앨런 피터 루이스; 윌리엄 존 케네스 루이스; 아담 다니엘 매키날리; 마크 우덴; 이오아니스 불가리스
Original assignee: 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2019-01-09
Anticipated expiration: 2037-05-04
Also published as: AU2017260277A1; JP2019516371A; RU2018137305A3; RU2018137305A; JP2022070902A; MX2018013562A; US11098312B2; IL262544A; WO2017191255A1; CA3023025A1; US20190177734A1; CN109071611B; SG11201808976WA; RU2742006C2; KR102504317B1; CN109071611A; EP3452496A1; TW201805298A; TWI794170B; BR112018072043A2

Abstract

본 발명은 E. 콜리로부터 유래된 재조합 신호 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신호 서열을 포함하는 융합 단백질, 재조합 단백질 및 재조합 단백질을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 재조합 신호 서열은 발효의 점도를 조절하고/하거나, 재조합 단백질의 기저(유도-전) 발현을 조절하기 위한 방법을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

Description

재조합 단백질을 생성시키는 방법

본 발명은 재조합 신호 서열, 및 신호 서열 및 재조합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 재조합 신호 서열을 이용하여 재조합 단백질을 생성하는 방법이 기재된다. 특히, 재조합 신호 서열은 발효의 점도를 조절하고/하거나, 재조합 단백질의 기저(유도-전) 발현을 조절하기 위한 방법을 제공한다.

재조합 단백질의 대규모 및 비용-효과적인 제조, 회수 및 정제는 생명공학 산업에서 중요한 과제이다.

미생물 숙주 세포는 재조합 단백질의 생산에 널리 사용되는 유기체이다. 생산 동안의 고려사항은 숙주 세포 성장 및 재조합 단백질의 발현, 단백질 역가, 단백질 위치(예를 들어, 세포내, 세포외, 원형질막공간 등), 및 재조합 단백질의 최종 위치로부터의 선택적 회수 및 정제를 포함한다. 이들 다양한 요인의 균형을 맞추고 최적화시키는 것은 간단하지 않다.

그람-음성 유박테리움 에스케리키아 콜리(Escherichia coli; E. 콜리)는 이의 잘 특성규명된 유전학; 저렴한 기질을 이용하여 신속히 바이오매스(biomass)를 축적하는 이의 능력; 공정 규모 확대의 용이성 및 많은 수의 이용 가능한 숙주 균주 및 발현 벡터로 인해 산업용 생물공정에서 사용하기 위한 확실한 발현 시스템이다. E. 콜리는 치료 단백질의 생성을 위해 당화와 같은 복잡한 번역 후 변형을 필요로 하지 않는 일반적인 숙주이다. 디설파이드 결합 형성을 위해, 발현은 정확한 폴딩을 촉진하기 위해 원형질막공간의 산화 환경으로 유도될 수 있다. 이는 세포의 분비 시스템의 성분에 의해 인지되어 전용 수송 시스템을 통한 이의 표적화 및 통과를 개시시키는 N-말단 신호 서열의 사용에 의해 달성될 수 있다.

따라서, 재조합 단백질을 생성하고, 회수하고, 정제하는 개선된 방법이 필요하다.

본 발명은 (a) 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1) 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체, 및 (b) (a)에 대한 이종성 신호 서열 C-말단을 포함하는 재조합 신호 서열을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 정의된 바와 같은 신호 서열; 및 (b) (a)에 대한 이종성 재조합 단백질 C-말단을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한 정의된 바와 같은 신호 서열 또는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 제공한다.

본 발명은 또한 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 제공하며, 핵산은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다.

본 발명은 또한 정의된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 숙주 세포에 존재하는 정의된 바와 같은 재조합 발현 벡터로부터 재조합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합 단백질을 생성시키기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 재조합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포 브로쓰(broth)의 점도를 조절하기 위한 방법을 제공하며, 상기 숙주 세포는 (i) 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1) 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체를 포함하는 재조합 신호 서열, 및 (ii) 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 유도-전 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 숙주 세포 브로쓰에 의해 발현된 재조합 단백질의 기저 발현을 조절하기 위한 방법을 제공하며, 상기 숙주 세포는 (i) 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1) 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체를 포함하는 재조합 신호 서열, 및 (ii) 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함한다.

도 1. 24 dwp 배양에서 E. 콜리 W3110으로부터의 dAb의 발현에 대한 다양한 N-말단 신호 서열의 효과. 기호표: B - 세포외(상층액) 위치된 dAb; C - 세포내(전체 세포 용해질: 원형질막공간 + 세포질) 위치된 dAb. B + C - 전체 dAb, B/(B + C) - 방출된 비율. B와 C의 합계는 형성된 전체 dAb의 시각적 평가를 가능하게 한다. 샘플은 유도 24시간 후에 채취되었고, 환원되었고, 밴드가 쿠마시 염색된 SDS-PAGE에 의해 시각화되었다. 'Std'는 0.5 mg.mL^-1 농도에서의 dAb 표준을 나타낸다.
도 2. 높은 세포 밀도의 E. 콜리 W3110 유가식(fed-batch) 배양에 대한 유도후 발효 프로파일. N-말단 신호 서열 및 기저(유도-전) 발현 수준: (Δ), OmpASS, 0.30 g.L^-1, (□), YceISS, 0.64 g.L^-1 또는 (◇), IvySS, 0.061 g.L^-1. 모든 결과는 IPTG를 이용한 dAb 형성의 유도-후에 취해진다. (A) 바이오매스는 OD_600nm에 의해 측정되었고; (B) 세포외 가용성 dsDNA 농도; dAb 수율은 (C) 세포내(전체 세포 용해질), (D) 세포외(상층액), (E) 형성된 전체 dAb(세포내 + 세포외) 및 (F) 세포외 공간에서의 전체 dAb의 백분율로 결정되었다. 브로쓰 점도 μ는 멱급수 법칙의 관계(power law relationship) μ = K γ ^n-1에 의해 기재되며, 여기서 γ는 전단 속도이고, (G) K는 흐름 조밀도 지수(flow consistency index)이고, (H) n은 유동 지수(flow behaviour index)이다. 결과는 평균을 낸 복제된 발효조(n = 2 내지 4)로부터 채취되었고, 오차 막대는 하나의 표준 편차에 대응하여 추가되었다.
도 3. 신호 서열 아미노산 서열 정렬 및 이의 코돈 적응 지수의 평가. (A) YceISS(SEQ ID NO:35) 및 IvySS(SEQ ID NO:34)에 대한 아미노산 서열 정렬은 OmpASS(SEQ ID NO:33)를 참조로 한다. (B) 각각의 코돈 위치의 적응성은 카즈사(Kazusa) E. 콜리 코돈 사용 데이터베이스로부터 유래된 E. 콜리 코돈 사용 표를 참조로 하여 가장 풍부한 동의어 코돈에 대한 코돈 빈도의 비율로 계산되었다. 'B'의 아미노산 서열은 Ivy'SS 카세트 이후 첫번째 메티오닌으로부터 정렬된다.
도 4. 높은 세포 밀도의 E. 콜리 W3110 유가식 배양에 대한 유도-후 발효 프로파일. N-말단 신호 서열 및 기저(유도-전) 발현 수준: (Δ), IvyTruncSS, 0.90 g.L^-1, (□), Ivy'OmpASS, 0.086 g.L^-1, (◇), IvyOpt1SS, 0.16 g.L^-1 및 (◆), IvyOpt2SS, 0.089 g.L^-1. 세부사항은 도 2를 참조한다. 결과는 단일 발효 샘플(m = 3)에서 취하였다.
도 5. (A) 전체 유도-후 시간 당 브로쓰 리터 당 세포외 dAb의 질량으로 계산된 전체 생산성, (B) 상이한 N-말단 신호 서열을 갖는 dAb를 발현하는 E. 콜리 수확 배양물의 원심분리 성능; OmpASS(유도 48시간 후), YceISS(48시간), IvyTruncSS(55시간), Ivy'OmpA(153시간) 및 Ivy 코돈 최적화된 신호 서열 IvyOpt1(48시간) 및 IvyOpt2(55시간). 세포 브로쓰는 (■), 전단 없음; (□), 고 전단 스트레스(20초 동안 0.53 x10⁶ W.kg^-1의 최대 에너지 소산율(ε))의 조건에 노출되었고, 이후 USD 원심분리(V = 2.0 mL, t = 420 s, Σ = 0.164 m², (본문 참조), V/tΣ = 2.9 x 10^-8 m.s^-1)에 의해 처리되었다. 결과는 OmpASS 및 YceISS에 대한 복제된 발효조(n = 3) 또는 나머지 신호 서열에 대한 단일 발효조 샘플로부터 취하였다. (B)에 대한 샘플 특성규명은 삼중(m = 3)이었다. 결과는 평균 +/- SD로 제시된다.

본 발명의 개시는 특정 신호 서열의 사용이 발효, 재조합 단백질 발현, 및 단백질 회수가능성(recoverability)의 측면에서 장점을 제공한다는 인식을 포함한다.

신호 서열은 재조합 단백질의 원형질막공간 분비에 대해 조사되었다. 신호 서열은 낮은 기저 발현으로부터 발생하는 저 점도 브로쓰의 장점을 제공한다. 신호 서열에 포함된 8개의 아미노산 서열은 이러한 낮은 기저 발현을 유도하는 열쇠로 확인된다. 신호 서열의 코돈 최적화는 재조합 단백질의 발효 생산성을 증가시키면서 낮은 기저 발현 및 이에 따른 저 점도 브로쓰를 유지하는데 성공적이었다. 따라서, 높은 생산성 및 전체-규모 원심분리에 의한 실용적인 정화의 조합이 달성된다.

서열 "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)는 임의의 신호 서열에 대해 N-말단(5')으로 사용될 수 있다. 예를 들어, "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)는 이종성 신호 서열에 대해 N-말단으로 사용될 수 있다. 이종성 신호 서열은 내인성 IVY 신호 서열이 아닌 것일 수 있다. 예를 들어, 이종성 신호 서열은 E. 콜리로부터의 원형질막공간 신호 서열이다. 예를 들어, E. 콜리 원형질막공간 신호 서열은 OmpA, MalE, PelB, OmpT, 또는 LamB이다. 예를 들어, "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)는 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID NO:33), 또는 표 3의 임의의 신호 서열, 또는 임의의 E. 콜리 원형질막공간 신호 서열에 대해 N-말단일 수 있다.

재조합 신호 서열은 (a) 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1) 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체, 및 (b) (a)에 대한 이종성 신호 서열 C-말단을 포함한다. 이종성 신호 서열은 MGRISSGG(SEQ ID NO:1)에 대해 바로 C-말단일 수 있다. 예를 들어, 재조합 신호 서열은 이종성 E. 콜리 원형질막공간 신호 서열에 대해 바로 N-말단에 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 신호 서열은 이종성 신호 서열 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID NO:33)에 대해 바로 N-말단에 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1)를 포함하여 재조합 신호 서열 MGRISSGGMKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID NO:55)를 형성할 수 있다.

서열 "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 가변적일 수 있다. 서열 "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1) 및 이종성 신호 서열은 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 가변적일 수 있다. 변이체는 "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)의 활성을 보유할 수 있다.

아미노산 치환은 하기 표 1에 정의되는 바와 같이 적어도 하나의 아미노산의 동일 부류의 아미노산에 의한 대체를 포함할 수 있다.

표 1

적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 표 1에 정의된 바와 같이 (i) 하나 이상의 소수성 아미노산(들), (ii) 하나 이상의 염기성 극성 아미노산(들), (iii) 하나 이상의 소수성 아미노산(들), 및 (iv) 하나 이상의 비하전 극성 아미노산(들)을 갖는 컨센서스 서열을 유지시킴으로써 서열 "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)의 일차 구조를 보존할 수 있다.

신호 서열에 대해 N-말단(5')인 경우 "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)의 활성은 재조합 단백질의 기저 발현(유도-전 발현)의 조절로 정의될 수 있다. 기저 발현은 숙주 세포의 유도-전 지수 성장 단계 동안 발생한다. 이러한 성장 단계 동안, 재조합 단백질은 발현되거나 최소화되지 않아야 하며, 대신 세포의 대사 부담이 성장에 집중된다. 그러나, 많은 신호 서열은 재조합 단백질의 일부 기저 발현을 허용한다. "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1) 또는 이의 변이체의 활성은 유도시에 재조합 단백질 기저 발현을 0.5g/L 이하의 수준, 즉, 0.5g/L 이하의 재조합 단백질의 유도-전 발현 수준으로 조절하는 것일 수 있다. "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열의 사용은 재조합 단백질의 낮은 유도-전 발현 수준을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질의 유도-전 발현 수준은 0.5g/L 이하, 0.4g/L 이하, 0.3g/L 이하, 0.2g/L 이하, 0.1g/L 이하, 또는 0.05g/L 이하일 수 있다.

선택적으로 또는 추가로, 신호 서열에 대해 N-말단(5')인 경우 "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)의 활성은 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포 브로쓰의 점도의 조절로서 정의될 수 있다. 숙주 세포 브로쓰는 숙주 세포 및 배양 배지를 포함하는 상층액으로 구성된다. 브로쓰 점도는 발효 동안 유도-전, 유도 시점, 및 유도-후의 시점에서 변할 수 있다. "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열의 사용은 발효 동안 저 점도 숙주 세포 브로쓰를 발생시킬 수 있다. 점도는 현장에서 일반적인 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 점도는 흐름 조밀도 지수(K) 또는 겉보기 점도(μ)를 이용하여 측정될 수 있다.

예를 들어, 숙주 세포 브로쓰는 K 0.1 Nsⁿm^-2 이하의 흐름 조밀도 지수에 해당하는 점도를 갖는다. 예를 들어, 숙주 세포 브로쓰는 K 0.05 Nsⁿm^-2 이하, K 0.04 Nsⁿm^-2 이하, K 0.03 Nsⁿm^-2 이하, K 0.02 Nsⁿm^-2 이하, 또는 K 0.01 Nsⁿm^-2 이하의 점도를 갖는다.

예를 들어, "저" 점도는 약 0.001 Nsⁿm^-2 내지 0.01 Nsⁿm^-2의 K의 값에 해당할 수 있고, "중간" 점도는 약 0.01 Nsⁿm^-2 내지 0.1 Nsⁿm^-2의 K의 값에 해당할 수 있고, "고" 점도는 약 0.1 Nsⁿm^-2 초과의 K의 값에 해당할 수 있다.

대안적으로, 예를 들어, 숙주 세포 브로쓰는 0.1 Nsm^-2 이하의 겉보기 점도 μ(1 s^-1의 전단 속도에서 정의되는 바와 같음)를 갖는다. 예를 들어, 숙주 세포 브로쓰는 μ 0.05 Nsm^-2 이하, μ 0.04 Nsm^-2 이하, μ 0.03 Nsm^-2 이하, μ 0.02 Nsm^-2 이하, 또는 μ 0.01 Nsm^-2 이하의 겉보기 점도를 갖는다. 겉보기 점도는 적용된 전단 속도에 따라 가변적일 것이며, 값은 유동 지수 n 및 선택된 전단 속도의 제공된 값으로부터 계산될 수 있다.

일 구현예에서, 이는 유도 시점에서의 브로쓰 점도이다.

"MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)를 포함하는 재조합 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화(코돈 적응으로도 공지됨)를 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 코돈 적응 지수(CAI)는 특정 세포주에 대해 고유한 모든 유전자, 또는 높은 발현 유전자 단독에 대한 코돈 사용에 대해 참조될 수 있다. 모든 E. 콜리 유전자가 참조될 수 있거나, 모든 E. 콜리 K12 유전자, 또는 E. 콜리 K12 클래스 II(높은 발현) 유전자가 참조될 수 있다.

"MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 0.40 이상, 0.45 이상, 0.50 이상, 0.55 이상, 0.60 이상, 0.65 이상, 0.70 이상, 0.75 이상, 0.80 이상, 0.85 이상, 또는 0.90 이상의 CAI 스코어를 가질 수 있다.

예를 들어, "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 코돈 최적화된 서열을 포함할 수 있다:

"atgggacgtatttcttcgggcggaatgatgttcaaagcaatcaccacagtggcagctctggttattgctactagcgctatggct"(SEQ ID NO:49); 또는

"atgggtcgtatctcttccggcggtatgatgttcaaagcaatcactaccgttgcagctctggttattgcgacctctgctatggca"(SEQ ID NO:50).

선택적으로 또는 추가로, "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1) 또는 이의 변이체 또는 코돈 최적화된 서열의 활성은 유도시 재조합 단백질 발현을 5g/L 이상의 수준으로 조절하는 것일 수 있다. "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열의 사용은 재조합 단백질의 높은 유도-후 발현 수준을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질의 유도-후 발현 수준은 5g/L 이상, 6g/L 이상, 7g/L 이상, 8g/L 이상, 9g/L 이상, 또는 10g/L 이상일 수 있다. 재조합 단백질의 발현 수준은 전체 생성된 단백질, 또는 세포외 단백질일 수 있다.

선택적으로 또는 추가로, "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1) 또는 이의 변이체 또는 코돈 최적화된 서열의 활성은 유도시 재조합 단백질 생산성을 0.1g/L/h 이상의 수준으로 조절하는 것일 수 있다. "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열의 사용은 유도시 높은 재조합 단백질 생산성을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질의 유도-후 생산성은 0.10g/L/h 이상, 0.11g/L/h 이상, 0.12g/L/h 이상, 0.13g/L/h 이상, 0.14g/L/h 이상, 또는 0.15g/L/h 이상일 수 있다. 재조합 단백질의 생산성은 전체 생성된 단백질, 또는 세포외 단백질일 수 있다. 시간(시)은 유도 시점으로부터 계산될 수 있다.

선택적으로 또는 추가로, "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1) 또는 이의 변이체 또는 코돈 최적화된 서열의 활성은 수확물의 원심분리(즉, 정화) 후 남아 있는 고체 %(600 nm에서의 광학 밀도의 측정에 의해 정의되는 바와 같음)를 20% 이하의 수준으로 조절하는 것일 수 있다. "MGRISSGG"(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열의 사용은 수확물의 원심분리 후 낮은 %의 남아 있는 고체를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 수확물의 원심분리 후 남아 있는 고체 %는 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 또는 5% 이하일 수 있다.

본 발명의 개시에서 사용되는 세포 배양은 가장 넓은 의미, 즉, 성장 배지에서의 세포의 벌크 성장으로 제공된다. 본원에서 사용되는 "발효" 및 "배양"은 성장 배지에서 세포를 벌크 성장시키는 것을 의미한다. 용어 "발효" 및 "배양"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 지수 단계는 세포 배가, 따라서 벌크 성장을 특징으로 하는 기간이다. 단위 시간 당 나타나는 새로운 세포의 수는 유의하게 증가하고, 기존 집단에 비례한다. 세포는 지수적 성장 단계에서 유도-전일 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질의 기저 발현은 유도-전 지수 단계 동안이다.

정지 단계는 세포의 성장 속도 및 사멸 속도가 동일하여 선형의 성장 단계를 발생시키는 단계이다. 예를 들어, 재조합 단백질의 발현은 정지 단계 동안 유도된다. 세포는 종종 필수 영양소의 고갈 및/또는 유기산과 같은 억제 생성물의 형성과 같은 성장-제한 인자로 인해 정지 단계에 도달한다. 정지 단계 및 이에 따른 벌크 성장에서 일정한 바이오매스를 유지하기 위해, 세포는 지속적으로 성장한다.

바이오매스는 OD⁶⁰⁰nm에 의해 측정될 수 있다. "높은 세포 밀도"의 바이오매스는 적어도 30의 OD⁶⁰⁰nm일 수 있다. 예를 들어, 높은 세포 밀도는 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 또는 적어도 60의 OD⁶⁰⁰nm를 나타낼 수 있다. 대안적으로, 바이오매스는 건조 세포 중량에 의해 측정될 수 있다. "높은 세포 밀도"의 바이오매스는 적어도 10gL^-1의 건조 세포 중량일 수 있다. 예를 들어, 높은 세포 밀도는 적어도 10gL^-1, 적어도 15gL^-1, 적어도 20gL^-1, 또는 적어도 25gL^-1의 건조 세포 중량을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 바이오매스는 습윤 세포 중량에 의해 측정될 수 있다. "높은 세포 밀도"의 바이오매스는 적어도 50gL^-1의 습윤 세포 중량일 수 있다. 예를 들어, 높은 세포 밀도는 적어도 50gL^-1, 적어도 70gL^-1, 적어도 85gL^-1, 또는 적어도 100gL^-1의 습윤 세포 중량을 나타낼 수 있다.

용어 세포외 배지, 상층액, 세포외 환경, 세포외 공간, 배양 배지, 및 발효 배지는 모두 세포 배양 동안, 유도 시점, 및 수확 시점에서 세포의 외부 환경을 기재하기 위해 본원에서 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "유도" 또는 "유도성 발현"은 재조합 단백질의 발현의 유도가 개시되는 시점을 나타낸다. 예를 들어, 재조합 단백질 발현은 유도제의 첨가, 또는 유도가 온도 의존성인 경우 온도의 변화에 의해 유도될 수 있다. 용어 "유도-후"는 유도가 개시된 시점 후의 경과 시간을 기재하기 위해 본원에서 사용된다.

용어 "수확"은 발효의 종료를 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 수확은 발효 과정을 종료시키고, 발현되는 재조합 단백질을 회수하기에 충분한 것으로 간주되는 발효 동안의 임의의 시점일 수 있다. 예를 들어, 단백질 회수는 수확 시점에서 시작한다. 수확 시간은 상층액 중의 재조합 단백질의 최적 농도에 의존할 수 있다. 재조합 단백질은 수확 시의 세포 배양물의 세포외 배지로부터 직접 회수되고 정제될 수 있다. 대안적으로, 재조합 단백질은 숙주 세포의 원형질막공간으로부터 회수되고 정제될 수 있다.

양, 분자량, 일시적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급하는 경우에 본원에서 사용되는 "약"은 특정 값으로부터의 ±1%, ±0.75%, ±0.5%, ±0.25%, ±0.2%, 및 ±0.1%의 변화를 포함하는 것을 의미하는데, 이는 상기 변화가 기재된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다.

재조합 단백질

재조합 단백질은 항원 결합 단백질, 예를 들어, 모노클로날 항체, 항체 단편, 또는 도메인 항체(dAb)를 포함할 수 있다.

재조합 단백질은 바이러스 단백질, 박테리아 독소, 박테리아 톡소이드, 또는 암 항원을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "재조합 단백질"은 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하기 위해 포유동물에 투여될 수 있는 임의의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 나타낸다. 재조합 단백질은 하나 초과의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 수 있다. 또한, 용어 "치료적 유효량"은 이러한 양을 투여받지 않은 상응하는 대상체에 비해 질병, 장애 또는 부작용의 치유, 예방 또는 개선, 또는 질병 또는 장애의 진행 속도에서의 감소를 발생시킬 수 있으나, 이에 제한되지는 않는 임의의 양을 의미한다. 상기 용어는 또한 이의 범위 내에 정상적인 생리학적 기능을 향상시키기에 효과적인 양뿐만 아니라 제2의 약학적 제제의 치료 효과를 향상시키거나 돕는 환자에서의 생리학적 기능을 야기시키기에 효과거인 양을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"은 항원에 결합할 수 있는 항체, 항체 단편 및 다른 단백질 작제물, 예를 들어, 도메인을 나타낸다.

용어 "항체"는 면역글로불린-유사 도메인을 갖는 분자를 나타내기 위해 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 본원에서 사용되는 "면역글로불린-유사 도메인"은 2개의 b-시트 및 일반적으로 보존된 디설파이드 결합을 함유하는 항체 분자의 면역글로불린 폴드 특징을 보유하는 폴리펩티드의 패밀리를 나타낸다. 이러한 패밀리는 모노클로날(예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD or IgE), 재조합, 폴리클로날, 키메라, 인간화, 이특이적 및 헤테로컨쥬게이트 항체; 단일 가변 도메인, 도메인 항체, 항원 결합 단편, 면역학적으로 효과적인 단편, Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, 단일 사슬 Fv, 디아바디(diabodies), TANDABS™ 등을 포함한다.

어구 "단일 가변 도메인"은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 가변 도메인(예를 들어, VH, VHH, VL)을 나타낸다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 "단일 가변 도메인"과 동일한 것으로 간주될 수 있다.

본원에서 사용되는 "도메인"은 단백질의 나머지와 독립적인 이의 3차 구조를 보유하는 폴딩된 단백질 구조를 나타낸다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능 손실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질에 전달될 수 있다. 단일 항체 가변 도메인 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 가변 도메인에 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인에 특징적이지 않은 서열에 의해 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나, N-말단 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 적어도 부분적으로 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.

도메인 항체는 다른 영역 또는 도메인이 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않은 경우(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가 가변 도메인과 독립적으로 항원에 결합하는 경우)에 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종다합체 또는 이종다합체)으로 존재할 수 있다.

도메인 항체(dAb™)는 인간 항체 가변 도메인일 수 있다. dAb™은 인간 기원일 수 있다. 즉, dAb™은 인간 Ig 프레임워크 서열을 기초로 할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 단백질 상의 부위를 나타내며, 이는 단일 도메인일 수 있거나, 이는 표준 항체에서 발견될 수 있는 바와 같이 쌍을 이룬 VH/VL 도메인일 수 있다. 단일-사슬 Fv(ScFv) 도메인은 또한 항원-결합 부위를 제공할 수 있다.

항원 결합 단백질은 상이한 항원에 대한 추가의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 하나 초과의 항원, 예를 들어, 2개의 항원, 또는 3개의 항원, 또는 4개의 항원에 대한 특이성을 가질 수 있다.

항원 결합 단백질은 각각의 말단에서 결합 도메인에 직접적 또는 간접적(예를 들어, 링커 서열을 통함)으로 연결된 항체의 Fc 영역 또는 이의 일부로 구성되거나, 본질적으로 이로 구성될 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 Fc 영역 또는 이의 일부에 의해 분리된 2개의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 분리된은 결합 도메인이 서로 직접 연결되지 않고, Fc 영역 또는 임의의 다른 스캐폴드 영역의 반대 말단(C 및 N 말단)에 위치될 수 있음을 의미한다.

항원 결합 단백질은 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로, 예를 들어, 각각의 스캐폴드 영역의 N 및 C 말단에서 2개의 결합 도메인에 각각 결합된 2개의 스캐폴드 영역을 포함할 수 있다. 각각의 결합 도메인은 상이한 항원에 결합할 수 있다.

항원 결합 단백질은 mAbdAb의 단백질 스캐폴드 포맷을 취할 수 있다. "mAbdAb" 및 "dAbmAb"는 상호교환적으로 사용되며, 본원에서 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 상기 항원-결합 단백질은 단백질 스캐폴드, 예를 들어, Ig 스캐폴드, 예를 들어, IgG, 예를 들어, 추가 결합 도메인, 예를 들어, 도메인 항체에 연결되는 모노클로날 항체를 포함한다. mAbdAb는 적어도 2개의 항원 결합 부위를 가지며, 이 중 적어도 하나는 도메인 항체로부터 유래되고, 적어도 하나는 쌍을 이룬 VH/VL 도메인으로부터 유래된다.

도메인 항체가 존재할 수 있고, 단량체 또는 다합체(예를 들어, 이량체) 형태로 표적에 결합할 수 있으며, 포맷화 및 표적화 접근을 위해 다른 분자와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 도메인 중 하나가 알부민과 같은 혈청 단백질에 결합하는 다수의 도메인을 갖는 항원-결합 단백질이 제조될 수 있다. 혈청 알부민에 결합하는 도메인 항체(AlbudAbs)는 공지되어 있으며, 자체로 도메인 융합 파트너에 연장된 혈청 반감기를 제공할 수 있다.

dAb는 또한, 예를 들어, 다른 분자, 예를 들어, 약물, 또 다른 단백질, 항체 분자 또는 항체 단편과의 dAb-컨쥬게이트 또는 dAb-융합체의 형태로 다른 분자에 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, dAb™은 포맷화된 dAb™으로 존재할 수 있으며, 예를 들어, dAb™은 dAb-Fc 융합체 또는 컨쥬게이트로 존재할 수 있다. 대안적으로, 포맷화된 dAb™은 mAbdAb로 존재할 수 있다. dAb™은 혈청 알부민(AlbudAb), 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 반감기 연장 화학 모이어티에 결합하는 반감기 연장 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 추가 dAb™와의 융합체 또는 컨쥬게이트로 존재할 수 있다. dAb™은 추가 치료 또는 활성 분자와의 융합체 또는 컨쥬게이트로 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 "약물"은 개체에서 생물학적 표적 분자에 대한 결합 및/또는 이의 기능 변경을 통해 이로운 치료 또는 진단 효과를 발생시키기 위해 개체에 투여될 수 있는 임의의 화합물(예를 들어, 작은 유기 분자, 핵산, 폴리펩티드)을 나타낸다. 표적 분자는 개체의 유전체에 의해 인코딩되는 내인성 표적 분자(예를 들어, 개체의 유전체에 의해 인코딩되는 효소, 수용체, 성장 인자, 사이토카인) 또는 병원체의 유전체에 의해 인코딩되는 외인성 표적 분자일 수 있다. 약물은 dAb™ 또는 mAb일 수 있다.

"dAb 컨쥬게이트"는 약물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 화학적으로 컨쥬게이션되는 dAb™을 포함하는 조성물을 나타낸다. 바람직하게는, dAb™ 및 약물은 공유적으로 결합된다. 상기 공유 결합은 펩티드 결합 또는 다른 수단, 예를 들어, 변형된 측쇄를 통해 발생할 수 있다. 비공유 결합은 직접적(예를 들어, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용) 또는 간접적(예를 들어, 상보적 결합 파트너(예를 들어, 비오틴 및 아비딘)의 비공유 결합을 통함, 여기서 하나의 파트너는 약물에 공유적으로 결합되고, 상보적 결합 파트너는 dAb™에 공유적으로 결합됨)일 수 있다. 상보적 결합 파트너가 이용되는 경우, 결합 파트너 중 하나는 약물에 직접 또는 적합한 링커 모이어티를 통해 공유적으로 결합될 수 있고, 상보적 결합 파트너는 dAb™에 직접 또는 적합한 링커 모이어티를 통해 공유적으로 결합될 수 있다.

본원에서 사용되는 "dAb 융합체"는 dAb™ 및 폴리펩티드 약물(폴리펩티드, dAb™ 또는 mAb일 수 있음)을 포함하는 융합 단백질을 나타낸다. dAb™ 및 폴리펩티드 약물은 단일 연속 폴리펩티드 사슬의 별개의 부분(모이어티)로 존재한다.

따라서, 본 발명의 개시의 방법은 치료 단백질, 모노클로날 항체(mAb), 도메인 항체(dAb™), dAb™ 컨쥬게이트, dAb™ 융합체, mAbdAb, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 항원 결합 단백질 중 하나 이상에 적용될 수 있다.

일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 TNFα 신호전달을 방해하는 dAb™이다. 일 구현예에서, dAb™은 TNFα를 중화시킨다. 일 구현예에서, dAb™은 TNFα 또는 TNFα 수용체에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, dAb™은 TNFR1에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:53(DOM0101)의 VH dAb™(항-TNFR1)/DOM0101)이다.

단백질의 발현: 숙주 세포

적합한 숙주 세포는 미생물 세포, 예를 들어, 그람-음성 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아 콜리(예를 들어, W3110, 및 BL21), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 살모넬라(Salmonella)를 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜리이다. 일 구현예에서, E. 콜리 균주는 W3110이다.

신호 서열 및 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터가 또한 본원에 기재된다. 상기 벡터는 원하는 단백질 생성물을 발현시키기 위해 세포를 유전학적으로 조작하는데 사용된다. 벡터는 신호 서열 및 재조합 핵산에 작동 가능하게 연결되는 하나 이상의 발현 조절 요소 또는 서열을 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드 및 파지미드를 포함한다.

적합한 발현 벡터는 다수의 구성요소, 예를 들어, 복제 기점, 선택 가능한 마커 유전자, 하나 이상의 발현 조절 요소, 예를 들어, 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종료자) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 선도 서열을 함유할 수 있다. 발현 조절 구성요소 및 신호 서열은 존재시 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 인코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 조절 서열이 발현을 유도하는데 사용될 수 있다.

프로모터는 원하는 세포에서의 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 항시성 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 항체, 항체 사슬 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있어, 핵산의 전사를 유도한다. 그람 음성 박테리아에 대한 다양한 적합한 프로모터(예를 들어, E. 콜리에 대해 lac, tac, trp, phoA, lambdapL, T3, T7 (T7A1, T7A2, T7A3) 프로모터)가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 작동유전자 서열은 lac, gal, deo 및 gin을 포함한다. 하나 이상의 완전한 회문 작동유전자 서열이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 개시의 재조합 단백질의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 예를 들어, E. 콜리 lac, tac, 및 trc 프로모터는 락토스 또는 비-가수분해성 락토스 유사체, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도 가능하며, phoA, trp 및 araBAD 프로모터는 각각 포스페이트, 트립토판 및 L-아라비노스에 의해 유도 가능하다.

또한, 발현 벡터는 통상적으로 벡터를 운반하는 세포의 선택을 위한 선택 가능한 마커, 및 복제 가능한 발현 벡터의 경우, 복제 기점을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 인코딩하는 유전자는 통상적인 선택 가능한 마커이며, 사용될 수 있다(예를 들어, 락타마제 유전자(앰피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자). 디하이드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 세포에서 메토트렉세이트를 이용한 선택을 허용한다.

WO2007/088371호에 기재된 바와 같은 발현 벡터(예를 들어, pAVE037, pAVE007, 또는 pAVE011)가 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 벡터는 pAVE011이다. 대안적으로, pJExpress401과 같은 벡터가 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다.

예시적인 대안적 발현 벡터 및 방법(예를 들어, CHO, PerC6 등과 함께 사용하기 위함)이 또한 공지되어 있다.

숙주 세포는 상기 기재된 재조합 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다.

본 발명의 개시의 숙주 세포 배양물은 숙주 세포 성장 및 재조합 단백질의 발현을 지지하는 임의의 배지에서 배양될 수 있다. 상기 배지는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

단백질 표적화

재조합 단백질의 발현은 세포질에서 발생하지만, 재조합 단백질의 최종 위치는 재조합 단백질의 특성, 사용되는 숙주 세포 및 이용되는 발효 조건에 따라 세포질, 원형질막공간 또는 세포외에 존재할 수 있다.

본 발명에서의 신호 서열의 사용은 세포의 원형질막공간(예를 들어, 그람 음성 박테리아 내)으로 표적화되는 재조합 단백질에 관한 것일 수 있다.

그람-음성 박테리아에서, 일부 분비된 단백질은 타입 I, 타입 III, 타입 IV 또는 타입 VI 분비 경로를 통해 단일 단계로 내막 및 외막을 가로질러 배출되는 반면, 다른 단백질은 보편적인 Sec 또는 Tat 경로를 통해 원형질막공간으로 먼저 배출된 후, 주로 타입 II 또는 타입 V 기구를 통해 외막을 가로질러 전위된다. 타입 II 시스템은 Sec 선도 서열을 함유하는 미성숙 단백질이 Sec 경로를 이용하여 원형질막공간으로 배출되는 2-단계 과정을 포함한다. 신호 서열은 단백질분해에 의해 제거되어 원형질막공간에 존재하는 성숙한 가공된 단백질을 발생시키고, 단백질이 배양 배지로 분비되거나 분비되지 않는 지의 여부는 선도 서열, 단백질, 세포 및 배양 조건의 특징에 크게 의존한다. 또한, 세포 용해(자가용해)의 경우, 배양 배지 내의 단백질 대부분이 원형질막공간으로부터 유래되고, 이에 따라 가공된다는 것이 추측될 수 있다. 재조합 단백질은 신호 서열을 통해 배양 배지로 능동적으로 분비될 수 있거나, 당 분야에 공지된 다른 세포 경로를 통해 원형질막공간으로부터 배양 배지로 수동적으로 분비될 수 있다.

신호 서열의 가공은 단백질로부터의 신호 서열의 절단 및 제거를 포함한다. 그러나, 신호의 일부 아미노산은 단백질의 N-말단에 남아 있을 수 있어, 신호 서열이 적절히 가공되지 않는다. 신호 서열은 90% 이상 가공될 수 있어, 서열의 10% 이하가 단백질의 N-말단에 남아 있는다. 신호 서열은 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 가공될 수 있다. 신호 서열은 약 100% 가공될 수 있어, 세포의 분비 경로를 통한 통과 후에 단백질의 N-말단에 남아 있지 않는다.

신호 서열은 원형질막공간 표적화 신호 서열, 예를 들어, N-말단 원형질막공간 표적화 서열일 수 있다. 원형질막공간 또는 세포외 환경으로 단백질을 유도하는 신호 서열은 당 분야에 공지되어 있다. 신호 서열은 이종성 신호 서열을 포함할 수 있다.

수확

수확은 발효의 끝일 수 있다. 수확은 발효 과정을 종료시키고, 발현되는 재조합 단백질을 회수하기에 충분한 것으로 간주되는 발효 동안의 임의의 시점일 수 있다. 수확은 유도 후 10 내지 160시간 사이에 발생할 수 있다. 예를 들어, 수확은 유도 후 15 내지 60시간 사이에 발생할 수 있다. 수확은 유도 후 24, 48 또는 55시간에서 발생할 수 있다. 수확시, 미생물 세포 집단의 고체 함량은 5 내지 30% 습윤 세포 중량(WCW)일 수 있다.

발효조 부피는 다음과 같을 수 있다:

(i) 약 10,000 리터; 약 5,000 리터; 약 2,000 리터; 약 1,000 리터; 약 500 리터; 약 125 리터; 약 50 리터; 약 20 리터; 약 10 리터; 약 5 리터; 또는

(ii) 5 내지 10,000 리터; 10 내지 5,000 리터; 20 내지 2,000 리터; 50 내지 1,000 리터.

수확은 자가용해로도 공지된 자연적으로 용해되는 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 수확물 내의 세포의 1 내지 50%는 자가용해를 겪을 수 있다. 대안적으로, 수확물 내의 세포의 20 내지 50%; 또는 30 내지 50%; 또는 40 내지 50%는 자가용해된다. 대안적으로, 수확물 내의 세포의 10% 이상; 20% 이상; 30% 이상; 40% 이상; 또는 50% 이상은 자가용해된다. 자가용해는 정화된 수확물 내에서의 DNA 농도 또는 커패시턴스에 의해 간접적으로 결정될 수 있다.

수확은 세포 및 세포외 배지(즉, 세포 배양물 또는 브로쓰)의 발효조를 비우는 선택적 단계를 포함할 수 있다.

수확의 선택적 전처리

숙주 세포 및 재조합 단백질에 따라, 수확의 전처리는 수확을 조절하는 방법이다. 이러한 단계는 발효조에서, 또는 수확물이 발효조에서 분리된 후에 수행될 수 있다. 전처리는 수확물의 열적, 기계적 또는 화학적 용해(예를 들어, 균질화, 냉동-해동, 용해에 의함); 및 원형질막공간 추출을 포함한다. 적어도 하나의 원형질막공간 추출물이 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 추출될 수 있다. 대안적으로, 충분한 생성물이 세포외 환경에 이미 존재하는 경우, 상기 전처리는 요구되지 않을 수 있다.

정화

정화는 고체 미립자를 제거하는 과정이다. 정화는 정제 동안 후속 크로마토그래피 단계에 대한 부담을 낮출 수 있다. 통상적인 정화 단계는 침강(예를 들어, 중력에 의함)으로도 공지된 침전 단계, 및/또는 원심분리 단계, 및/또는 여과 단계를 포함한다.

원심분리 단계는 연속 원심분리(예를 들어, 연속 공급 구역을 이용함)일 수 있다. 원심분리기 자체는 고체 배출과 관련하여 "배치식(batch)" 또는 "간헐적" 또는 "연속적"으로 작동할 수 있다. 예를 들어, 관형 보울(bowl) 원심분리기가 연속 원심분리 단계로 사용될 수 있다.

재조합 단백질의 정제

재조합 단백질은 배양 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 재조합 단백질의 회수에 이어 재조합 단백질의 적절한 순도를 보장하기 위한 정제가 후속된다. 하나 이상의 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 하나 이상의 크로마토그래피 수지; 및/또는 하나 이상의 여과 단계가 정제에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 A 또는 L과 같은 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피가 재조합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 양이온-교환과 같은 이온-교환 수지가 재조합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다.

실시예

E. 콜리 W3110 숙주 균주로부터의 도메인 항체(dAb) 발현을 위해 다양한 고유의 내인성 E. 콜리 N-말단 신호 서열(SS)을 연구하였다. 유망한 속성을 갖는 2개의 서열 YceISS 및 IvySS를 현재 사용되는 신호 서열 OmpASS와 비교하여 생물반응기 연구에 이용하였다. 연구된 생물반응기 조건에 대해, OmpASS의 이용은 짧은 발효 시간 동안이지만 고도로 점성인 브로쓰를 갖는 높은 생성물 역가를 발생시켰으며, 이는 초 규모-축소 연구에 의해 완전한 규모의 원심분리에 의해 정화시키기에 어려운 것으로 예측되었다. YceISS의 사용은 역가 및 점도 및 원심분리의 어려움과 관련하여 OmpASS의 성능과 유사한 성능을 발생시킨 한편, IvySS의 사용은 원심분리하기에 비교적 용이한 저 점도 브로쓰, 및 더 긴 발효 시간에 걸쳐 달성되지만 높은 생성물 역가를 발생시켰다. IvySS의 코돈 최적화는 원심분리에 적합한 유사하게 낮은 점도의 브로쓰 및 OmpASS를 이용한 대조군의 발효 시간과 동등한 이제 더 짧은 발효 시간에 걸친 높은 역가를 발생시켰다. IvySS 또는 이의 최적화된 형태를 이용하여 달성된 개선은 dAb의 감소된 기저 발현, 즉, 유도 전과 관련되는 것으로 보인다. 이러한 감소된 발현은 신호 서열의 N-말단으로부터의 8개의 코돈 카세트의 존재로 인한 것으로 생각되며, 제거되는 경우, OmpASS를 이용하여 획득된 것과 유사한 고 점도 브로쓰를 발생시켰다. 기저 발현과 브로쓰 점도 사이의 관계를 조사하였다.

재료 및 방법

분비 카세트의 분자 클로닝 . E. 콜리 균주 One Shot™ TOP10(Life Technologies, California, USA) 및 W3110(ATCC 27325)을 클로닝 및 재조합 단백질 발현을 위한 숙주 균주로서 각각 사용하였다. 다양한 업스트림 신호 서열을 갖는 dAb 분비 카세트의 생성을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드(표 2)를 명세사항에 따라 작제하였다(Invitrogen, Paisley, UK). 사용된 시약은 제한 효소(NdeI 및 XhoI), T4 DNA 리가제(New England Biolabs UK Ltd., Hertfordshire, UK) 및 DNA 중합효소(Phusion™ flash high-fidelity PCR master mix, Finnzymes Oy, Espoo, Finland)였다. 테트라사이클린 내성 유전자, tetA, 및 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 유도성 T7A3 프로모터(WO2007088371; Fujifilm Diosynth Biotechnologies UK Ltd., Billingham, UK)를 함유하는 pAVEway™ 발현 벡터, pAVE011(본원에서 p11로 표시됨)을 dAb 분비 카세트에 대한 백본으로 사용하였다.

표 2. 다양한 신호 서열을 갖는 dAb 유전자 작제물의 작제에 사용된 올리고뉴클레오티드. 제한 부위 NdeI(CATATG) 및 XhoI(CTCGAG)에는 밑줄이 그어져 있다.

7개의 내인성 E. 콜리 신호 서열(표 3)의 선택물을 약 13.1 kDa의 분자량을 갖는 TNFR1에 대한 V_H 도메인 항체(본원에서, dAb로 표시됨, SEQ ID NO:53)를 인코딩하는 유전자의 업스트림에 유전적으로 융합시켰다. 원하는 신호 서열을 위한 DNA로 dAb의 업스트림 말단을 연장시키기 위해 4회 이하의 순차적 PCR 반응을 이용하였다. 이는 3 또는 4개의 정방향 올리고(각각의 순차적 PCR 반응에 대해 1개), 역방향 올리고 SEQ ID NO:32(표 2 참조) 및 초기 주형으로서 p11 발현 플라스미드(pDAB01, 표 3 참조)를 필요로 하였다. PCR 반응물은 적절한 정방향(fwd) 올리고 및 역방향(rev) 올리고 SEQ ID NO:32(표 2), DNA 주형 및 Phusion™ 플래시 고-충실도 PCR 마스터 믹스를 함유하였다. 열 주기는 다음과 같은 조건으로 수행하였다: 10초 동안 98℃ 후, 1초 동안 98℃, 5초 동안 55℃ 및 15초 동안 72℃의 30 주기, 및 1분 동안 72℃에서의 최종 인큐베이션. 각각의 라운드의 PCR 후, 생성물을 컬럼 크로마토그래피(QIAquick™ PCR Purification Kit, QIAGEN Ltd., Manchester, UK)를 이용하여 정제하고, NdeI 및 XhoI 제한 부위가 측접된 신호 서열-dAb 융합 카세트가 생성될 때까지 다음의 순차적 PCR 반응에 대한 DNA 주형으로 사용하였다. 분비 카세트를 NdeI 및 XhoI으로 절단하고, T4 DNA 리가제를 이용하여 NdeI-XhoI 절단된 p11 발현 벡터에 라이게이션시킨 후, 열 충격에 의해 E. 콜리 One Shot™ TOP10 세포로 형질전환시키고, vLB 아가 테트라사이클린 플레이트에서 선택하였다. 플라스미드 pDAB02 내지 pDAB08(표 3)을 DNA 시퀀싱에 의해 확인한 후, 단백질 발현 연구를 위해 E. 콜리 W3110 세포로 형질전환시켰다. 각각의 제조된 작제물의 세포 은행(글리세롤 스톡, 20% v/v)을 -80℃에서 보관하였다.

표 3. dAb 발현 연구에 사용된 발현 플라스미드 및 E. 콜리 신호 서열. ^a 신호 서열 명칭 및 [코돈의 수]; ^b 서열 말단에 C-말단 절단 부위를 갖는 신호 서열 아미노산 서열. c 각각의 신호 서열에 대한 코돈 적응 지수(CAI)가 E. 콜리 클래스 II(고 발현) 유전자(Eecoli_high.cut)에 대한 코돈 사용에 대해 참조된 EMBOSS 슈트를 이용하여 분석되었다.

표 4. 모델 dAb의 발현 속도에 대한 코돈 적응 지수(CAI)의 효과 및 높은 세포 밀도의 유가식 발효 동안의 브로쓰 점도에 대한 이후의 효과를 조사하기 위한 변형된 E. 콜리 Ivy 신호 서열을 함유하는 발현 플라스미드. ^a 신호 서열 명칭 및 [코돈의 수]. ^b 각각의 신호 서열에 대한 코돈 사용 지수가 E. 콜리 클래스 II(고 발현) 유전자(Eecoli_high.cut)에 대한 코돈 사용에 대해 참조된 EMBOSS 슈트를 이용하여 분석되었다.

표 5. 높은 세포 밀도의 E. 콜리 발효 동안의 기저 dAb 발현, 브로쓰 점도 및 초기 생산성의 수준에 대한 N-말단 신호 펩티드 서열의 효과. ^a 초기 생산성은 유도후 처음 24시간 내에 발현된 전체 dAb이다(도 2E 및 4E). ^b N-말단 카세트는 IvySS로부터의 처음 8개의 아미노산에 대한 코돈을 포함한다.

코돈 최적화된 Ivy 신호 서열 IvyOpt1SS 및 IvyOpt2SS를 함유하는 dAb 발현 플라스미드 pDAB021 및 pDAB022(표 4)에 대한 분비 카세트를 정방향 올리고 23 내지 25 및 26 내지 28 각각 및 역방향 올리고 SEQ ID NO:32(표 2)를 이용하여 pDAB01로부터의 dAb에 대해 코딩하는 유전자의 PCR 증폭(상기 기재된 바와 같음)에 의해 생성시켰다. dAb의 업스트림의 트렁케이션된 Ivy 신호 서열(IvyTruncSS)을 함유하는 pDAB023(표 4)에 대한 분비 카세트를 주형으로서 pDAB02(표 3) 및 정방향 올리고 29 및 역방향 올리고 31을 이용한 PCR 증폭에 의해 생성시켰다. 업스트림의 신호 서열 Ivy'OmpASS를 갖는 dAb를 인코딩하는 pDAB011에 대한 분비 카세트는 OmpASS에 융합된 IvySS의 처음 8개의 코돈으로 구성되었다. 이는 정방향 올리고 30 및 역방향 올리고 SEQ ID NO:32를 이용하여 pDAB01(표 3)로부터 OmpASS-dAb를 인코딩하는 유전자를 증폭시킴으로써 생성되었다. 모든 분비 카세트를 이후 NdeI/XhoI에서 p11 벡터로 라이게이션시키고, E. 콜리 W3110 균주로 형질전환시켰다.

각각의 신호 서열에 대한 코돈 적응 지수(CAI)(Sharp and Li 1987)를 클래스 II(높은 발현) 유전자 단독(Eecoli_high.cut)에 대한 코돈 사용을 참조로 하여 EMBOSS 슈트(Rice et al. 2000)를 이용하여 결정하였다. IvySS를 코돈 적응 알고리즘(Leto Software, 버전 1.0.26, Entelechon GmbH, Regensburg, Germany)을 이용하여 E. 콜리에서의 발현에 대해 코돈 최적화시켰다. 코돈(Leto) 임계값을 모든 E. 콜리 K12 유전자 및 또한 E. 콜리 K12 클래스 II(높은 발현) 유전자 단독을 참조로 하여 70%로 설정하여, IvyOpt1SS 및 IvyOpt2SS를 각각 생성시켰다(표 4).

발효 . 모든 배지 및 시약을 명시하지 않는 한 Sigma-Aldrich(Dorset, UK)로부터 구입하였다. 접종 및 24-딥 웰 플레이트(24 dwp) 배양을 Luria Bertani(vLB) 배지(pH 7.0)에서 수행하였다: 10 g.L^-1 Difco™ Select Soytone(Becton Dickinson and Co. (BD), New Jersey, USA), 5 g.L^-1 Bacto™ 효모 추출물(BD) 및 5 g.L^-1 NaCl. 24 dwp 배양을 위한 10x 농축 글리세롤 부스트(pH 7.0)는 다음을 함유하였다: 70 g.L^-1 글리세롤, 50 g.L^-1 효모 추출물(BD), 25 g.L^-1 (NH₄)₂SO₄ 및 1.0 μg.mL^-1 티아민. 높은 세포 밀도 발효를 다른 곳에 기재된 바와 같이 복합 배지에서 수행하였다(Voulgaris et al. 2015). 모든 발효 배지(TB/SB 공급물 제외)는 p11 발현 플라스미드를 함유하는 E. 콜리 클론의 선택성을 위해 15 μg.mL^-1 테트라사이클린(Tet)이 보충되었다.

딥 웰 플레이트 발현을 위해, vLB 배지(20 mL) 중의 접종 배양물을 pDAB 발현 플라스미드로 형질전환된 0.5% v/v E. 콜리 W3110을 갖는 125 mL 에를렌마이어(Erlenmeyer), 배플드(baffled), 벤트 캡(vent cap) 진탕 플라스크(Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands)에서 제조하였다. 배양물을 25 mm 오프셋을 갖는 회전식 진탕기(Climo-shaker ISF1-X, Kuhner Shaker Ltd., Derbyshire, UK)에서 23℃, 230 rpm에서 밤새 1 내지 2의 OD_600nm로 인큐베이션하였다. 이를 신선한 vLB 배지에 0.05의 OD_600nm로 접종시키는데 사용하였고, 24-딥 웰 미세역가 플레이트(24 dwp; Porvair Sciences Ltd., Wrexham, UK)의 피라미드 하부 사각형 형태의 웰(2 mL 작업 부피)에 분배하고, 높은 세포 밀도 가스-투과성 뚜껑 시스템(Applikon Biotechnology, Tewkesbury, UK)으로 덮었다. 플레이트를 37℃, 230 rpm에서 OD_600nm 0.7 내지 1.0으로 인큐베이션한 후, 10x 글리세롤 부스트(레시피에 대해서는 상기 참조)의 동시 첨가와 함께 0.1 mM IPTG로 dAb 형성을 유도하였다. 배양물을 23℃, 230 rpm에서 추가 24시간 동안 인큐베이션하였다. 수확 배양물(2 mL)을 펠렛화(10분 동안 16100 x g)시키고, 브로쓰 상층액을 추출하였다. 펠렛을 1 mL의 0.1M PBS에 재현탁시키고, 상기와 같이 다시 원심분리하였다. 브로쓰 상층액 및 펠렛을 -20℃에서 보관하였다.

생물반응기 발현을 위해, vLB 배지(200 mL) 중의 접종 배양물을 500 mL 에를렌마이어, 배플드, 벤트 캡 진탕 플라스크(Corning Life Sciences) 중에서 0.5% v/v 글리세롤 스톡으로 제조하였다. 배양물을 1 내지 2의 OD_600nm까지 4 내지 5시간 동안 회전식 진탕기에서 37℃, 230 rpm에서 인큐베이션시키고, 상기 언급된 복합 배지를 함유하는 1 L 작업 부피 반응기(SR1000DLL 생물반응기, 용기 직경 100 mm, 종횡비 2.4:1, 오버헤드 구동 삼중 Rushton 6-블레이드, 46 mm 직경, 임펠러, DASGIP AG, Julich, Germany)에 0.05% v/v로 접종시키는데 사용하였다. 반응기를 30℃, pH 7.0 ±0.05(25% v/v H₃PO₄ 및 30% v/v NH₄OH를 이용함); 용존 산소(DO) 30±5%((1) 임펠러 속도(400 내지 1200 rpm); (2) 가스 유속(1 내지 2 vvm) 및 (3) 산소 함량(21 내지 100%)를 이용한 캐스케이드 조절에 의함)에서 유지시켰다. 완전한 글리세롤 소비를 나타내는 DO 스파이크 10분 후부터 시작하여 6.0 mL.L^- ¹.h^-1로 공급 배지를 자동적으로 첨가하였다. 배양물이 75±3의 OD_600nm(약 25 dcw g.L^-1의 바이오매스에 해당함)에 도달하면 0.2 mM IPTG의 첨가로 dAb의 생성을 유도하고, 나머지 발효에 대해 공급 속도를 3.6 mL.L^- ¹.h^-1로 감소시켰다. pH, 용존 산소, 진탕 속도, 온도, 공기 유량, 산속 백분율, 산소 흡수율, 이산화탄소 발생률의 실시간 값을 기록하였다(DASGIP Control, Julich, Germany). 신선한 세포 브로쓰의 레올로지 특징을 25℃에서 증가 및 감소하는 전단 스윕(각각의 증분에서 30초 유지와 함께 5개의 증분에서 1.3 내지 110 s^-1)에 걸쳐 측정하였다(ULA, 1.233N 또는 SSA, 1.32N 스핀들(spindle)이 장착된 DV-II+ 프로그램화 가능한 점도계, Brookfield Engineering Laboratories Inc., Massachusetts, USA). 레올로지는, 예를 들어, 원심분리에 의한 브로쓰 가공성의 지표로 사용된다.

세포 브로쓰 가공. 20초 동안 0.53 x10⁶ W.kg^-1의 최대 에너지 소산율(ε)에 세포 브로쓰 샘플을 노출시키기 위해 초 규모-축소 전단 장치(UCL mechanical workshop에서 작제된 스테인레스 강철 회전 디스크(40 mm 직경 x 0.1 mm 두께, 12000 rpm)가 장착된 20 mL 스테인레스 강철 챔버(50 mm 직경 x 10 mm 높이))를 사용하였다(Chatel et al. 2014a). 상기 ε 값은 통상적으로 고 전단 연속-흐름형 산업 규모 원심분리의 공급 구역에서 발생하는 것을 모방한다. 이후, 샘플(2 mL의 전단되거나 전단되지 않은 브로쓰)을 원심분리하고(21℃에서 7분 동안 3400 x g, Centrifuge 5415R, Eppendorf, Cambridge, UK), 상층액(0.8 mL)을 회수하였다. 이들을 잘-정화된 샘플(30분 동안 16100 x g)에 대한 기준선 OD_600nm 값에 대해 보정된 OD_600nm에서의 측정에 의해 남은 고체의 측면에서 특성규명하였다. 원심분리 조건은 V/tΣ의 측면에서 특성규명되었고, 여기서 V는 원심분리된 부피이고(2.0 mL), t는 원심분리 시간이고(420 s), Σ는 원심분리기 헤드의 특정 회전 속도 및 기하구조에 대한 원심분리기 튜브의 등가 침전 영역이다(= 0.164 m² - 계산의 세부사항에 대해서는 문헌[Chatel et al. 2014a] 참조).

분석 방법. 세포 펠렛을 해동시키고, 1 mL(24 dwp 샘플) 또는 4 mL(1 L 생물반응기 샘플)의 50 mM Tris-HCl pH 7.5에 재현탁시켰다. 1 mL의 각각의 재현탁된 펠렛을 진폭 8.0에서 30 s 온(on) 및 10 s 오프(off)의 2개의 펄스를 이용하여 용해시켰다(지수적 마이크로프로브가 장착된 Soniprep 150 Plus Ultrasonic 분해기, part no. 38121-114A, MSE (UK) Ltd., London, UK). 이후, 용해된 전체 세포 샘플을 20분 동안 16100 x g에서 원심분리시키고, 상층액을 회수하였다. 이후, 발효 브로쓰 샘플 및 전체 세포 용해질을 30분 동안 3000 x g에서 원심분리되는 0.22 μm 필터 플레이트(GHP 막, AcroPrep™ 96 Filter Plate, Pall Life Sciences, Portsmouth, UK)를 이용하여 여과시켰다. E. 콜리 24 dwp 배양물로부터의 dAb의 발현을 SDS-PAGE로 분석하였다. 샘플을 제조업체의 설명서에 따라 환원시키고, 변성시키고, SDS-PAGE 젤(NuPAGE® 4 내지 12% Bis-Tris, Invitrogen) 상에 로딩하고, 1x MES 런닝 완충액(Invitrogen) 중에서 젤 전기영동을 수행하였다. 단백질을 쿠마시 염색에 의해 검출하고, 생성물을 밀도측정 소프트웨어(Image Lab 버전 3.0, Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 정량하였다. 높은 세포 밀도의 E. 콜리 발효를 위해, 브로쓰 상층액 및 전체 세포 용해질에서의 dAb 생성물 역가를 1 mL HiTrap MabSelect Xtra 컬럼(GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, UK)이 장착된 Protein A HPLC(냉동된 오토샘플러(autosampler)를 갖는 HP1100, Agilent Technologies UK Limited, Cheshire, UK)로 결정하였다. 컬럼을 평형화시키고, 0.1 M PBS pH 7.3로 세척하고, 생성물 용리를 위해 20 mM HCl pH 1.8을 사용하였다(단백질 농도를 280 nm에서 모니터링하였다). dAb의 농도를 표준 곡선을 이용하여 결정하였다. 정제된 dAb의 분자량을 액체 크로마토그래피 비행 시간 질량 분광법(전기분무 이온화(ESI) 프로브가 장착되고, MassLynx, 버전 4.1, Waters 소프트웨어를 이용하여 제어되는, Micromass LCT 질량분광계(Waters, Massachusetts, USA)에 커플링된 Agilent HP1100(Agilent Technologies UK Ltd.)를 이용한 GSK 사내 방법)을 이용하여 결정하였다. 이중-가닥 DNA를 제조업체의 설명서에 따라 형광측정법(Qubit™ dsDNA BR Assay kit, Life Technologies)을 이용하여 측정하였다.

실시예 1

도 1은 N-말단 신호 서열의 초기 스크린의 세포외 및 세포내 위치와 관련하여 dAb의 발현을 상술하는 최종 바이오매스 수준 및 SDS-PAGE 젤을 제시한다.

24 dwp 발효에서 E. 콜리 W3110으로부터의 dAb의 발현에 대한 다양한 N-말단 신호 서열의 효과가 도 1에 제시된다. 기호표: B - 세포외(상층액) 위치된 dAb; C - 세포내(전체 세포 용해질: 원형질막공간 + 세포질) 위치된 dAb. B + C - 전체 dAb, B/(B + C) - 방출된 비율. B와 C의 합계는 형성된 전체 dAb의 시각적 평가를 가능하게 한다. 샘플은 유도 24시간 후에 채취되었고, 환원되었고, 밴드가 쿠마시 염색된 SDS-PAGE에 의해 시각화되었다. 'Std'는 0.5 mg.mL^-1 농도에서의 dAb 표준을 나타낸다.

OmpA 신호 서열(OmpASS), IvySS 및 YceISS의 사용은 브로쓰(브로쓰 = 세포 + 상층액, 즉, 세포외 배지)의 단위 부피 당 높은 dAb 발현 수준을 발생시킨 반면, YgiWSS, YncESS, FimASS, YehZSS 및 YcdOSS 신호 서열의 사용은 중등도의 발현 수준을 제공한다. OmpASS, IvySS, YceISS 및 FimASS는 단위 OD_600nm 당 높은 세포내 생성물 수준을 발생시킨 반면, YgiWSS, YncESS, YehZSS 및 YcdOSS는 중등도의 수준을 생성시킨다. OmpASS, YceISS, YgiWSS, FimASS, 및 YehZSS에 대해 단위 OD_600nm 당 세포내 생성물 수준과 상층액으로의 생성물 방출 사이의 일부 양의 상관관계가 존재한다. YceISS, YncESS 및 YcdOSS의 사용은 높은 방출 수준을 발생시키는 것으로 보이며, YceISS에 대해, 이에 더하여 높은 역가가 달성되었으며, 이는 이를 추가 연구를 위한 한 후보로 만든다. IvySS는 비교적 낮은 상층액으로의 방출 및 높은 OD_600nm를 나타내며, 이는 dAb 형성에 대한 추가의 잠재성을 의미할 수 있다. 이에 더하여 결과로서 발생된 높은 전체 생성물 및 브로쓰로의 dAb의 비교적 낮은 비례적 방출은 이를 추가 연구를 위한 제2의 후보로 확인한다. 이들 2개의 균주는 대조군으로서의 OmpASS의 사용에 대해 생물반응기에서의 더욱 상세한 성장 연구를 위해 진행시켰다.

실시예 2

E. 콜리 W3110의 유가식 발효에 대한 OmpASS, YceISS 및 IvySS를 이용한 효과가 도 2에 기재되어 있다. 발효는, 예를 들어, 원심분리에 의해 세포 성장의 지표로서 OD_600nm를 통한 유도-후 단계, 용해의 지표로서 dsDNA 방출, 생산성 및 생성물 위치의 지표로서 세포외 및 세포내 dAb, 브로쓰 가공성의 지표로서 레올로지가 모니터링되었다.

도 2는 높은 세포 밀도의 E. 콜리 W3110 유가식 배양에 대한 유도-후 발효 프로파일을 제시한다. N-말단 신호 서열 및 기저(유도-전) 발현 수준: (Δ), OmpASS, 0.30 g.L^-1, (□), YceISS, 0.64 g.L^-1 또는 (◇), IvySS, 0.061 g.L^-1. 모든 결과는 IPTG를 이용한 dAb 형성의 유도-후에 취해진다. (A) 바이오매스는 OD_600nm에 의해 측정되었고; (B) 세포외 가용성 dsDNA 농도; dAb 수율은 (C) 세포내(전체 세포 용해질), (D) 세포외(상층액), (E) 형성된 전체 dAb(세포내 + 세포외) 및 (F) 세포외 공간에서의 전체 dAb의 백분율로 결정되었다. 브로쓰 점도 μ는 멱급수 법칙의 관계 μ = K γ ^n-1에 의해 기재되며, 여기서 γ는 전단 속도이고, (G) K는 흐름 조밀도 지수이고, (H) n은 유동 지수이다. 결과는 평균을 낸 복제된 발효조(n = 2 내지 4)로부터 채취되었고, 오차 막대는 하나의 표준 편차에 대응하여 추가되었다.

표 6

OmpASS(Δ)를 이용한 균주는 동시적인 OD_600nm에서의 감소(도 2A) 및 세포외 dsDNA의 증가(도 2B)에 의해 입증되는 바와 같이 신속한 성장 후 세포 자가용해의 통상적인 단계를 나타내었다. 이는 세포외 환경/상층액으로의 방출과 함께 dAb의 신속한 형성과 일치하였다(도 2C 및 D). 형성된 전체 dAb는 도 2E에 요약되어 있으며, 발효의 종료까지 세포외에서 거의 모두 발생한다(도 2F). 유도 시점에서, 유의한 양(0.30 g.L^-1)의 dAb가 이미 세포에서 발현되었다(도 2C 및 범례). 이는 유도 단계의 시작에 의해 고도로 점성인 전단 약화 브로쓰의 형성을 수반하였다(도 2G 및 H). 브로쓰 점도는 세포외 dsDNA 수준의 병행 증가와 함께 유도-후 단계 동안의 24시간 동안 지속적으로 증가하였다(도 2G).

OmpASS 배양물의 사용에 대한 유사한 경향이 YceISS의 사용에 대해 관찰된다(□). 여기서, 유도에서의 생성물 발현 수준(0.64 g.L^-1)은 OmpASS를 이용한 균주보다 더 크다. 이는 유도시 더 큰 브로쓰 점도, 및 이후 감소된 세포 성장 및 전체로서 또는 세포외 dAb로서 약간 낮은 생성물 수준을 수반한다.

대조적으로, IvySS(◇)의 사용은 유도 시점에서 0.061 g.L^-1의 낮은 dAb 발현 수준 및 저 점도 브로쓰를 발생시켰다. 이는 증가된 dsDNA 방출과 동시에 발효 진행 전체에 걸친 점도 증가가 후속된다(도 2B). 세포 성장은 즉, OmpASS 및 YceISS의 사용에 대해 관찰된 약 12시간에 비해 약 72시간에서의 용해의 개시 이전에 더 긴 기간 동안 계속된다. 발생된 효과는 dAb 발현의 느린 속도 및 세포외 공간으로의 dAb의 지연된 방출이다(도 2D 및 F). 전반적으로, OmpASS 및 YceISS에 비해 IvySS의 사용은 유도 전에 dAb 형성의 더 엄격한 제어를 제공하는 것으로 보인다.

실시예 3

OmpASS, YceISS 및 IvySS 사이의 아미노산 서열 정렬(도 3A) 및 이들의 코돈 적응 지수(CAI)의 평가(도 3B 및 표 3)는 아미노산 서열의 측면에서 OmpASS 및 YceISS와 유의하게 상이하나, 많은 비율의 희귀 코돈(표 3)을 또한 함유한 한 IvySS의 N-말단에서의 8개의 아미노산의 카세트(Ivy'SS)를 확인하였다.

도 3은 신호 서열 아미노산 서열 정렬 및 이의 코돈 적응 지수의 평가를 제시한다. (A) YceISS(SEQ ID NO:35) 및 IvySS(SEQ ID NO:34)에 대한 아미노산 서열 정렬은 OmpASS(SEQ ID NO:33)를 참조로 한다. 보존된 아미노산은 강조되어 있다. (B) 각각의 코돈 위치의 적응성은 카즈사(Kazusa) E. 콜리 코돈 사용 데이터베이스로부터 유래된 E. 콜리 코돈 사용 표를 참조로 하여 가장 풍부한 동의어 코돈에 대한 코돈 빈도의 비율로 계산되었다. 'B'의 아미노산 서열은 Ivy'SS 카세트 이후 첫번째 메티오닌으로부터 정렬된다.

이러한 8-코돈 카세트 또는 IvySS에 대한 발생된 아미노산의 존재는 유도 전(즉, 기저 수준) dAb 발현의 수준 및 속도에 영향을 미칠 수 있다고 가설이 세워졌다. 높은 세포 밀도의 유가식 발효 동안 dAb 형성의 촉진에서의 확인된 Ivy'SS 카세트의 영향을 조사하기 위해, 2개의 변형된 신호 서열을 개발하였다; Ivy'SS가 제거된 IvySS에 대한 것을 기초로 한 신호 서열인 IvyTruncSS; 및 또한 OmpASS의 N-말단에 대한 Ivy'SS에 대한 코돈의 융합의 생성물인 Ivy'OmpASS. 또한, dAb의 발현율이 기저 dAb 발현 수준 및 브로쓰 점도를 변화시키지 않고 증가될 수 있는지 탐색하기 위해 2개의 코돈 최적화된 IvySS 신호 서열인 IvyOpt1SS 및 IvyOpt2SS를 생성시켰다(도 3B, 세부사항에 대해서는 재료 및 방법). 4개의 변형된 Ivy 관련된 신호 서열에 대한 생성된 CAI 값이 표 4에 제공된다.

실시예 4

변형된 신호 서열을 갖는 dAb를 발현하는 E. 콜리 W3110 배양물의 성장이 도 4에 기재된다. 도 4에 제시된 모든 변형된 신호 서열을 효율적으로 절단하여 정확하게 폴딩된 dAb 분자를 생성시켰다.

도 4는 높은 세포 밀도의 E. 콜리 W3110 유가식 배양에 대한 유도-후 발효 프로파일을 제시한다. N-말단 신호 서열 및 기저(유도-전) 발현 수준: (Δ), IvyTruncSS, 0.90 g.L^-1, (□), Ivy'OmpASS, 0.086 g.L^-1, (◇), IvyOpt1SS, 0.16 g.L^-1 및 (◆), IvyOpt2SS, 0.089 g.L^-1. 세부사항은 도 2를 참조한다. 결과는 단일 발효 샘플(m = 3)에서 취하였다.

표 7

IvyTruncSS의 사용은 IvySS의 사용에 대해 관찰된 것보다 성장의 이른 중단, 더 큰 dsDNA 방출 및 낮은 dAb 형성을 발생시켰다(도 2). 유도시의 dAb의 기저 발현의 수준은 IvySS의 사용에 대한 것보다 높으며, 유도 직전 및 유도 후 둘 모두의 점도는 유의하게 더 높다. 따라서, Ivy'SS의 존재는 유도 전의 조기 발현 및 이에 따른 결과로서 발생되는 높은 점도 수준을 감소시키는데 결정적인 것으로 보인다(도 4G). 관찰된 증가된 발현율(도 4E)은 많은 비율의 희귀 코돈을 함유하는 서열의 제거와 일치한다. Ivy'OmpASS의 사용은 IvySS를 이용하는 경우에 관찰된 것과 유사한 성장, dsDNA 방출, dAb 형성 및 위치 및 점도 프로파일을 발생시켰고(도 2), 이는 기저 dAb 발현을 감소시키는데 있어서의 Ivy'SS의 중요성을 확인한다. 다시, 저 점도가 유도 단계의 시작에서 Ivy'OmpASS에 대해 관찰되며, 후속 점도 상승은 세포외 dsDNA의 존재에 기인한다. 유사하게, IvySS와 마찬가지로, dAb의 유의한 발현 수준 및 세포외 환경으로의 방출을 발생시키는데 연장된 발효 시간이 필요하였다. IvyOpt1SS 및 IvyOpt2SS의 사용은 유도 시점에서 dAb의 낮은 기저 발현을 발생시켰다(도 4 범례). 결과는 저 점도 브로쓰이다(도 4G). 예상된 바와 같이, 최적화된 신호 서열에서 희귀 코돈의 감소된 발생률은 dAb 형성의 증가된 속도를 발생시켰다(도 4E). 다시, IvySS의 사용과 마찬가지로, 유도-후 브로쓰의 점도에서의 상승은 dsDNA 방출에 기인할 수 있다. IvyOpt2SS는 IvyOpt1SS보다 낮은 기저 발현, 높은 dAb 역가 및 낮은 점도 브로쓰를 발생시키는 것으로 보인다.

실시예 5

유도-후 전체 역가에 대해 측정된 바와 같은 발효조 생산성은 연구된 신호 서열의 범위에 대해 도 5A에서 비교된다. IvySS 및 Ivy'OmpASS를 이용한 균주에 대한 dAb의 낮은 값은 생성물 형성 및 방출에 필요한 연장된 시간(약 150시간)으로 인한 것이 명백하다. IvyOpt1SS, IvyOpt2SS 및 IvyTruncSS를 이용한 균주는 모두 유도 24시간 이내에 최대 dAb 농도 및 높은 발효조 생산성 수준을 발생시켰다. 질량분광법 분석(여기에 제시하지 않음)은 도 5에서 연구된 작제물 모두에 대해 dAb로부터 신호 서열이 완전히 제거된 것을 나타내었다. USD 원심분리를 이용한 최종 브로쓰의 정화가 도 5B에 요약되어 있다. 이용된 조건은 이러한 유량 용량의 최하단에서 작동하고, 고전단 스트레스 공급 구역이 장착된 산업용 규모 디스크 스택 또는 고체 보울 연속 흐름 원심분리기를 나타낸다. 벤치 탑(bench top) 원심분리기에 대해서와 같은 전단 스트레스가 없는 공급물은 비교 대조군으로 모방된다.

도 5는 (A) 전체 유도-후 시간 당 브로쓰 리터 당 세포외 dAb의 질량으로 계산된 전체 생산성을 제시하고; (B) 상이한 N-말단 신호 서열 OmpASS(유도 48시간 후), YceISS(48시간), IvyTruncSS(55시간), Ivy'OmpA(153시간) 및 Ivy 코돈 최적화된 신호 서열 IvyOpt1(48시간) 및 IvyOpt2(55시간)을 갖는 dAb를 발현하는 E. 콜리 수확 배양물의 원심분리 성능을 제시한다. 세포 브로쓰는 (■), 전단 없음; (□), 고 전단 스트레스(20초 동안 0.53 x10⁶ W.kg^-1의 최대 에너지 소산율(ε))의 조건에 노출되었고, 이후 USD 원심분리(V = 2.0 mL, t = 420 s, Σ = 0.164 m², (본문 참조), V/tΣ = 2.9 x 10^-8 m.s^- ¹)에 의해 처리되었다. 결과는 OmpASS 및 YceISS에 대한 복제된 발효조(n = 3) 또는 나머지 신호 서열에 대한 단일 발효조 샘플로부터 취하였다. (B)에 대한 샘플 특성규명은 삼중(m = 3)이었다. 결과는 평균 +/- SD로 제시된다.

OmpASS 및 YceISS를 이용하여 획득된 브로쓰의 고 점도는 상층액에 여전히 약 50% 및 약 80%의 고체를 각각 갖는 불량하게 정화된 상층액을 발생시켰다. 남아 있는 브로쓰는 모두 성능에서의 차이가 덜 명백하도록 10배 초과로 더 큰 정도(약 1 내지 4%의 남아 있는 고체)로 정화된다. IvyTruncSS(도 4G)를 이용하는 경우에 획득된 중간 점도 브로쓰는 상기 범위의 상단(약 4%)의 정화된 브로쓰를 발생시켰다. 남아 있는 브로쓰를 모두 최종 브로쓰의 더 낮은 점도를 반영하는 더 큰 정도로 정화시켰다. 거의 모든 경우에, 고 전단 스트레스의 효과는, 예를 들어, 유체 구조(예를 들어, 중합체 브릿지)의 파괴로 인해 점도의 가능한 감소를 나타내는 정화에서의 5 내지 30% 개선을 발생시켰다. 여러 균주는 높은 발효조 생산성 및 우수한 원심분리 정화를 발생시킨다. IvyOpt2SS 및 이후 IvyOpt1SS를 이용한 균주는 이러한 연구를 기초로 하여 가장 유망한 선택을 제공한다. IvyTruncSS의 사용은 또한 잘 수행되나, 원심분리에 의한 정화가 더욱 어려운 것을 나타냈다.

실시예의 개요

2개의 신호 서열 IvySS 및 YceISS이 확인되었고, 이는 E. 콜리 원형질막공간에서 이종성 단백질의 분비를 가능하게 한다. YceISS를 이용한 균주는 OmpASS의 사용과 유사한 방식으로 1 L 유가식, 교반-탱크 발효조에서 수행하는 것으로 나타났다(도 2). IvySS의 사용은 느린 생산 속도(도 2 및 표 3) 및 낮은 전반적인 생산성(도 5A)과 함께 OmpASS 및 YceISS의 사용으로 획득된 것과 비교하여 상당히 낮은 브로쓰 점도를 발생시켰다. 본 발명자는 첫째로 본원에서 사용된 배지 및 발효 전략을 이용한 고 점도의 브로쓰의 형성에 대한 이유 및 둘째로 IvySS를 기초로 한 신호 서열의 개발을 논의한다.

OmpASS, YceISS 및 IvySS를 이용한 초기 연구는 dAb의 높은 기저(즉, 유도-전) 발현이 유도 시작시 고도로 점성인 발효 브로쓰의 형성을 발생시키는 것을 암시한다(도 2). 상기 높은 점도는 증가된 세포 자가용해로 인한 DNA 방출에 아마 기인할 수 있는 임의의 추가 증가와 함께 나머지 발효 전체에 걸쳐 지속된다. 기저 발현과 점도 사이의 이러한 관계는 다양한 다른 신호 서열을 이용한 관찰에 의해 뒷받침되며(또 4), 이는 표 5에 요약되어 있다. 여기에 제시되지 않은 예비 연구는 유도가 높은 기저 발현을 모방하는 지수적 성장 단계의 종료 후가 아니라 지수적 성장 단계 동안에 수행되는 경우 IvySS에 대한 고 점도 브로쓰(K 약 1.1 Nsⁿm^-2)를 나타내었다.

유도 시간에 의해 관찰된 고 점도는 아마 발효 동안 세포외 중합체 물질(EPS)의 형성에 기인할 수 있으며, 이들은 미생물 균막의 핵심 성분이다. 성장 단계, 배지 조성, 온도, 산소 제한, 질소 및 양이온 결핍과 같은 요인이 EPS 생합성을 조절하는 것으로 나타났다. 다른 미생물 시스템에 대해, 지수적 성장 자체는 EPS 및 균막의 형성과 관련되었다. 아세테이트는 또한 EPS 형성과 관련되었다. 균막 및 EPS 형성은 일반적으로 성장률의 감소를 초래하는 것으로 나타났다. 본 연구에서의 관찰은 유도-전 환경 조건의 효과와 조합된 dAb의 발현이 EPS 형성을 촉진할 수 있음을 암시한다.

본원에서 연구된 발효에 대해, DO에 대한 조절 전략은 저산소 조건을 야기시키는 산소 제한(DO 약 0%)이 유도 전에 지수적 성장 단계에서 발생하도록 하는 것이다. 저산소증 및 지수적 성장 둘 모두는 아세테이트와 같은 발효 대사 부산물 및 오버플로우 대사 산물 각각의 형성과 관련된다. dAb의 높은 기저 수준의 존재와 조합된 상기 조건은 가능하게는 EPS 형성을 발생시킨다. 유도에 이어, 조건은 영양소 공급 시작 전에 형성된 임의의 아세테이트가 소비될 수 있도록 하는 것이다. 이러한 포인트로부터, 조절된 일정한 영양소 공급 속도는 세포가 성장의 선형 또는 정지 단계에 있고, DO 조절이 30%에서 효율적으로 유지되는 것을 의미할 것이며; 즉, 높은 수준의 dAb에도 불구하고 임의의 유의한 수준의 아세테이트 형성이 존재할 가능성이 없고, 따라서 추가 EPS 형성이 없을 것이다. 따라서, 유도 전의 발효 조건의 조절은 아세테이트 형성을 피하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 배지 조정, 예를 들어, 소이(soy)의 감소된 존재 또는 탄소원으로서의 글리세롤이 아닌 글루코스의 사용(본 작업에서 사용되는 바와 같음)이 균막 형성을 감소시킬 수 있다. 본 연구에서, 발효를 소이톤(soytone) 함유 배지를 이용하여 수행하였고; 동일한 dAb를 생성시키기 위해 OmpASS를 이용하는 경우의 고 점도 브로쓰의 단점은 소이 비함유 발효 배지의 사용을 통해 극복되었다. 기저 발현(이에 따라, 본원에서 연구된 시스템에 대해, EPS 형성)은 더욱 엄격하게 조절된 발현 시스템의 사용에 의해 감소될 수 있으나, 이는 다른 공정 관련 난제를 발생시킬 수 있다. EPS 형성을 제거하기 위한 또 다른 잠재적 경로는 균막 결핍성 E. 콜리 균주의 사용이다. 이후의 연구는 본 연구에서 관찰된 고 점도를 발생시키는 EPS의 영향을 확인하고자 하는 것일 것이다. 본원의 초점은 기존의 배지 및 발효 작업 조건을 이용하여 저 점도 발효를 달성하기 위해 선택된 신호 서열이 개선될 수 있는 방법에 대한 것이다.

IvySS의 구성의 두가지 측면은 dAb의 기저 발현 및 유도-후 생산성을 결정하는데 있어서의 이의 성능과 관련된 것으로 보인다. 첫째로, IvySS의 시작시의 8개 코돈 카세트(Ivy'SS)의 존재는 유도 전의 단백질 발현의 엄격한 조절, 즉, 낮은 기저 발현을 발생시킨다. 둘째로, 낮은 코돈 적응 지수(CAI)는 단백질의 낮은 발현율을 발생시키는 것으로 보인다. 생산성을 증가시키면서 낮은 기저 발현을 유지하기 위해 변형된 Ivy 신호 서열을 포함하는 신호 서열 선택의 효과는 표 5에 요약되어 있다. Ivy'SS가 신호 서열의 N-말단에 존재하는 경우, dAb 발현의 유도 전의 기저 발현의 수준은 낮았고, 저 점도의 브로쓰가 획득되었다. IvyOpt1SS 및 IvyOpt2SS로 달성된 낮은 기저 수준(도 4)은 그것이 아미노산 서열이고, 기저 발현 수준을 결정하는 유전자 서열에서 희귀 코돈의 존재가 아니라는 것을 암시한다.

초기 생산성은 가능하게는 CAI와 관련이 있으며, 이는 차례로 번역 신장 및 dAb 형성의 속도와 관련된다. mRNA의 5' 말단의 희귀 코돈의 존재는 감소된 리보솜 트래픽 잼(traffic jams)으로의 번역 동안의 초기 폴리펩티드의 느린 신장을 초래하고, 이는 낮은 초기 세포 생산성을 발생시키는 것으로 가설이 세워졌다. 표 5로부터, 예를 들어, IvySS 및 Ivy'OmpASS에 대해 관찰되는 바와 같이 서열 길이에 대한 낮은 CAI 값은 낮은 초기 생산성을 발생시킨 반면, 다른 모든 신호 서열에 대해서는, 코돈 수 당 높은 CAI 값이 높은 초기 생산성을 발생시킨다. 이상적으로는, 이러한 분석은 작제물의 N-말단에 대해 가중되어야 한다. 이는 희귀 코돈이 IvySS 및 Ivy'OmpASS를 이용한 것과 같이 낮은 초기 생산성을 제공하는 2개의 균주에 대해 존재하는 경우에 특히 그렇다. IvySS를 이용하여 획득된 것과 비교하여 IvyOpt1SS 및 IvyOpt2SS에 대한 dAb의 초기 생산성의 증가는 변형된 코돈 서열 또는 희귀 코돈의 제거로 인한 것일 수 있다.

IvyOpt2SS는 지수 성장 동안 고도로 및 연속적으로 발현되는 유전자에서 빈번히 나타나는 최적 코돈의 참조 세트를 기초로 한 최적화에 의해 설계되는 반면, IvyOpt1SS는 모든 E. 콜리 유전자의 발현을 기초로 하여 설계된다. 전자는 코돈 수 당 더 높은 CAI를 발생시키며(표 5), 이는 언급된 더 큰 전반적 생산성을 발생시킨다(도 5A). 향후 작업은 고 점도 브로쓰를 발생시키는 유의한 기저 발현을 여전히 방지하면서 전반적 발현 수준을 추가로 개선시키기 위한 상기 최적화에 대한 잠재성을 추가로 탐구할 것이다.

저널 참고문헌

기타 서열

SEQ ID NO:53: DOM0101의 아미노산 서열

SEQ ID NO:54: DOM0101의 DNA 서열 - (신호 서열 없음)

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Ala Ala 1 5 10 15 Leu Phe Ser Ser Ala Phe Met Ala Asn Ala 20 25 <210> 41 <211> 63 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 41 atgaagaaaa ctgctatcgc tattgcggtt gctctggcag gttttgccac ggttgcgcag 60 gcc 63 <210> 42 <211> 84 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 42 atgggcagga taagctcggg aggaatgatg tttaaggcaa taacgacagt cgccgctctg 60 gtcatcgcta ccagtgcaat ggcg 84 <210> 43 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 43 atgaaaaaaa gcctgcttgg tttaaccttc gcgtccctga tgttctctgc cggttcagcg 60 gttgcc 66 <210> 44 <211> 60 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 44 atgaaaaaat tcgcagcagt aatcgcagta atggccctgt gcagcgcacc ggtgatggca 60 <210> 45 <211> 90 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 45 atgcatttac gtcatctgtt ttcatcgcgc ctgcgtggtt cattactgtt aggttcattg 60 cttgttgttt catcattcag tacgcaggcc 90 <210> 46 <211> 69 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 46 atgaaaatta aaactctggc aatcgttgtt ctgtcggctc tgtccctcag ttctacagcg 60 gctctggcc 69 <210> 47 <211> 69 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 47 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Synthetic sequence <400> 53 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30 Thr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser His Ile Pro Pro Asp Gly Gln Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 54 gaagtacaac tgctggagag cggtggcggc ctggttcaac cgggtggttc cctgcgcctg 60 tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca tggtgtgggt tcgccaagct 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac attcctccag atggccagga cccattctat 180 gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatt tctcgtgata actccaaaaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg cgccgaggat actgcggtgt accattgtgc gctgctgcct 300 aaacgtggcc cgtggttcga ttactggggt cagggtactc tggtcaccgt aagcagc 357 <210> 55 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 55 Met Gly Arg Ile Ser Ser Gly Gly Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala 20 25

Claims

(a) 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1) 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열이 상이한 이의 변이체, 및 (b) (a)에 대한 이종성 신호 서열 C-말단을 포함하는 재조합 신호 서열.
(a) 제1항의 재조합 신호 서열; 및 (b) (a)에 대한 이종성 재조합 단백질 C-말단을 포함하는 재조합 융합 단백질.
제1항의 재조합 신호 서열 또는 제2항에 정의된 재조합 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열.
서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1)를 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 재조합 핵산 서열로서, 핵산 서열이 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인, 재조합 핵산 서열.
제4항에 있어서, 코돈 최적화된 핵산 서열이 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1) 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체, 및 (b) (a)에 대한 이종성 신호 서열 C-말단을 포함하는 재조합 신호 서열을 인코딩하는 재조합 핵산 서열.
제4항에 있어서, 코돈 최적화된 핵산 서열이 서열 MGRISSGGMMFKAITTVAALVIATSAMA(SEQ ID NO:34) 또는 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체를 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 재조합 핵산 서열.
제4항에 있어서, 코돈 최적화된 핵산 서열이 서열 MGRISSGGMKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID NO:55) 또는 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체를 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 재조합 핵산 서열.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었고, 0.40 이상의 코돈 적응 지수(Codon Adaptation Index; CAI)를 갖는 재조합 핵산 서열.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제9항에 있어서, 신호 서열이 재조합 단백질에 작동 가능하게 연결된 재조합 발현 벡터.
(a) 숙주 세포에 존재하는 제9항 또는 제10항에 따른 재조합 발현 벡터로부터 재조합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는,
숙주 세포에서 재조합 단백질을 생성시키기 위한 방법.
재조합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포가 (i) 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1) 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체를 포함하는 재조합 신호 서열, 및 (ii) 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는, 단계를 포함하는,
재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포 브로쓰(broth)의 점도를 조절하기 위한 방법.
유도-전 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포가 (i) 서열 MGRISSGG(SEQ ID NO:1) 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입만큼 서열에 있어서 상이한 이의 변이체를 포함하는 재조합 신호 서열, 및 (ii) 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는, 단계를 포함하는,
숙주 세포 브로쓰에 의해 발현된 재조합 단백질의 기저 발현을 조절하기 위한 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 핵산 서열이 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질이 원형질막공간 또는 세포외 배지로부터 회수되는 방법.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 서열이 재조합 단백질에 작동 가능하게 연결되는 방법.
제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질의 유도-전 발현 수준이 0.5g/L 이하이고/이거나; 재조합 단백질의 유도-후 발현 수준이 5g/L 이상인 방법.
제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 서열이 재조합 단백질로부터 절단되는 방법.
제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질이 항원 결합 단백질인 방법.
제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 원형질막공간을 갖는 미생물 세포인 방법.