KR20180110144A - C1-고정 박테리아에 대한 crispr/cas 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문구조 반복부(CRISPR)/CRISPR-연관(Cas)(CRISPR/Cas) 시스템을 이용하여 C1-고정 박테리아를 유전자 조작하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, Cas 단백질은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
Description
원핵생물은 병원균, 예컨대 바이러스 또는 다른 세포외 핵산에 의한 감염과 싸우기 위해 적응성 면역계인 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문구조 반복부(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR)를 진화시켰다(Marraffini, Nature, 526: 55-61, 2015). 원핵생물이, 예컨대 바이러스로부터의 외래 핵산의 공급원과 만날 때, 그들은 CRISPR에서 짧은 회문구조 반복부 서열 간의 "스페이서"로서 그들의 게놈 내로 바이러스의 세그먼트를 복제하고 혼입할 수 있다. 재노출 사건에서, CRISPR 스페이서는 바이러스의 빠른 동정을 허용하며 CRISPR 반복부는 그들이 바이러스 핵산을 스플라이싱하고 무력화시키는 부위에 전문화된 CRISPR-연관(Cas) 효소를 안내한다.
지난 몇 년간, CRISPR/Cas 시스템은 의학 및 생명 공학에서의 매우 다양한 적용분야에 대해 활용되었다(예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호 참조; 문헌[Travis, Science, 350: 1456-1456, 2015; Jinek, Science, 337: 816-821, 2012]). 그러나, 산업적으로 적절한 미생물, 예컨대 C1-고정 박테리아의 유전자 변형을 위해 최적화된 CRISPR/Cas 시스템에 대한 필요가 남아있다.
본 발명은 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 C1-고정 박테리아를 유전자 조작하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 표적 서열을 포함하는 DNA 분자를 함유하는 C1-고정 박테리아 내로 (a) 표적 서열과 혼성화되는 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 유도성 프로모터의 제어 하에 II형 Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된, 비-천연 유래 CRISPR/Cas 시스템을 도입하는 단계를 수반한다. CRISPR/Cas 시스템은 하나 이상의 벡터 상에서 (c) 표적 서열의 상류에서 혼성화되는 5' 상동성 아암(arm) 및 표적 서열의 하류에서 혼성화되는 3' 상동성 아암을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함함으로써, 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암이 DNA 분자와 혼성화하고 상동성 재조합이 일어나서, 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 사이에 위치된 DNA로 표적 서열의 대체를 야기할 수 있다. 이들 구성요소는 동일 또는 상이한 벡터 상에 위치될 수 있다.
상이한 유형의 Cas9가 사용될 수 있다. DNA 분자를 절단하기 위해, 예를 들어, 틈내기 효소(nickase) Cas9와 같은 변이체를 포함하는 촉매적으로 활성인 Cas9가 사용될 수 있다. 다른 예로서, 촉매적으로 비활성인 Cas9는 DNA 분자를 차단/침묵시키기 위해(그러나 절단하지는 않음) 사용될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 매우 다양한 용도, 예컨대 DNA의 결실, 삽입, 전위, 비활성화 또는 활성화를 가진다.
CRISPR/Cas 시스템은 유전자의 절단, 유전자 내로 추가적인 DNA의 삽입 또는 유전자의 침묵/차단을 통해 유전자 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, Cas9는 유전자를 암호화하는 영역에서 DNA 분자를 절단함으로써, 유전자 발현이 감소된다. 다른 실시형태에서, Cas9는 유전자를 암호화하는 영역에서 DNA 분자를 차단함으로써, 유전자 발현이 감소된다. 추가 실시형태에서, 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 사이에 위치된 DNA는 유전자를 암호화하는 영역에서 DNA 분자를 붕괴시킴으로써, 유전자 발현이 감소된다.
대안적으로 또는 추가적으로, CRISPR/Cas 시스템은 외인성 유전자를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 사이에 위치된 DNA는 외인성 유전자를 암호화함으로써, 상동성 재조합은 DNA 분자 내로 외인성 유전자를 삽입한다. 이어서, C1-고정 박테리아는 외인성 유전자를 발현시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 또는 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)로부터 유래된다.
CRISPR/Cas 시스템은 유도성 프로모터의 제어 하에 Cas9 단백질을 포함한다. 이 유도성 프로모터는, 예를 들어, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 예컨대 tet3no 또는 ipl12, 또는 락토스 유도성 프로모터일 수 있다.
전형적으로, C1-고정 박테리아는 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 박키(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 뷰티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리듐 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 무렐라 써마우토트로피카(Moorella thermautrophica), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박터 프펜니기(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides) 및 써모아나에로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, C1-고정 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이이다. 특히 바람직한 실시형태에서, C1-고정 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다.
도 1A 및 도 1B는 클로스트리듐 오토에타노게눔 secAdh 유전자에서 결실을 선별하기 위한 콜로니 PCR을 나타내는 겔 이미지를 도시한 도면. 야생형(비변형) 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693인 대조군 "W"를 제외하고 모든 콜로니는 cas9 유전자를 운반하였다. 행에서 "Cas9+T1_HA"로 표지한 콜로니는 표적 T1에 대한 스페이서를 운반하고, 행에서 "Cas9+T2_HA"로 표지한 콜로니는 표적 T2에 대한 스페이서를 운반하였다. 도 1C는 상동성 아암 5'HA 및 3'HA를 갖는 secAdh 좌위, 선별을 위해 사용된 프라이머 SNscCR-09 및 OgAM58, 및 secAdh 유전자 내의 스페이서 표적화 영역 gRNA-T1 및 gRNA-T2를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. CRISPR/Cas9 시스템의 활성 때문에 결실된 secAdh의 단편이 표시된다(5'과 3' 상동성 아암 사이).
도 2a는 cas9 유전자의 발현이 강한 테트라사이클린 유도성 프로모터 Pipl12에 의해 제어되는 플라스미드 pLZipl12-cas9의 맵을 도시한 도면. 표적 유전자에 대한 가이드 RNA 및 상동성 아암은 제2 플라스미드 상의 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 내로 도입되었다. 도 2b는 2,3- bdh 유전자에 대한 상동성 아암과 함께 2,3-bdh 유전자에 대한 가이드 RNA를 운반하는 예시적 플라스미드의 맵을 도시한 도면.
도 3A는 프라이머 Og33f 및 Og34r을 이용하여 클로스트리듐 오토에타노게눔 2,3-bdh 유전자에서의 결실을 선별하기 위해 콜로니 PCR을 나타내는 겔 이미지를 도시한 도면. 야생형(비변형) 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 "W", cas9 유전자만을 운반하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 "C1", 2,3-bdh 유전자 상에서 영역 T1을 표적화하기 위해 가이드 RNA 및 상동성 아암을 운반하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 "C2" 및 2,3-bdh 유전자 상에서 영역 T2를 표적화하기 위해 가이드 RNA 및 상동성 아암을 운반하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 "C3". cas9를 갖는 2개의 플라스미드를 운반하고, 영역 T2를 표적화하기 위해 가이드 RNA 및 상동성 아암을 운반하는 8개의 콜로니를 2,3-bdh 유전자에서의 결실에 대해 선별하였다(1 내지 8로 표시한 레인). 도 3B는 상동성 아암 5'HA 및 3'HA를 갖는 2,3-bdh 좌위, 선별을 위해 사용된 프라이머 Og33f 및 Og34r, 및 2,3-bdh 유전자 내의 스페이서 표적화 영역 gRNA-T1 및 gRNA-T2를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. CRISPR/Cas9 시스템의 활성 때문에 결실된 2,3-bdh의 단편은 상동성 아암 사이에 위치된다.
도 4는 플라스미드 pLZipl12-D10A-all3의 맵을 도시한 도면.
도 2a는 cas9 유전자의 발현이 강한 테트라사이클린 유도성 프로모터 Pipl12에 의해 제어되는 플라스미드 pLZipl12-cas9의 맵을 도시한 도면. 표적 유전자에 대한 가이드 RNA 및 상동성 아암은 제2 플라스미드 상의 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 내로 도입되었다. 도 2b는 2,3- bdh 유전자에 대한 상동성 아암과 함께 2,3-bdh 유전자에 대한 가이드 RNA를 운반하는 예시적 플라스미드의 맵을 도시한 도면.
도 3A는 프라이머 Og33f 및 Og34r을 이용하여 클로스트리듐 오토에타노게눔 2,3-bdh 유전자에서의 결실을 선별하기 위해 콜로니 PCR을 나타내는 겔 이미지를 도시한 도면. 야생형(비변형) 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 "W", cas9 유전자만을 운반하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 "C1", 2,3-bdh 유전자 상에서 영역 T1을 표적화하기 위해 가이드 RNA 및 상동성 아암을 운반하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 "C2" 및 2,3-bdh 유전자 상에서 영역 T2를 표적화하기 위해 가이드 RNA 및 상동성 아암을 운반하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 "C3". cas9를 갖는 2개의 플라스미드를 운반하고, 영역 T2를 표적화하기 위해 가이드 RNA 및 상동성 아암을 운반하는 8개의 콜로니를 2,3-bdh 유전자에서의 결실에 대해 선별하였다(1 내지 8로 표시한 레인). 도 3B는 상동성 아암 5'HA 및 3'HA를 갖는 2,3-bdh 좌위, 선별을 위해 사용된 프라이머 Og33f 및 Og34r, 및 2,3-bdh 유전자 내의 스페이서 표적화 영역 gRNA-T1 및 gRNA-T2를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. CRISPR/Cas9 시스템의 활성 때문에 결실된 2,3-bdh의 단편은 상동성 아암 사이에 위치된다.
도 4는 플라스미드 pLZipl12-D10A-all3의 맵을 도시한 도면.
본 발명자들은 구성적 프로모터의 제어 하에 Cas9에 의존하는 기존의 시스템이 이러한 박테리아에 대해 독성이 있다는 것을 발견한 후에 C1-고정 박테리아에서 사용하기에 적합한 새로운 CRISPR/Cas 시스템을 개발하였다. 특히, 천연의 구성적으로-발현된 포스포트랜스아세틸라제-아세테이트 키나제(Ppta-ack) 프로모터의 제어 하에 cas9를 운반하는 플라스미드를 이용하여 C1-고정 박테리아 클로스트리듐 오토에타노게눔을 형질전환하기 위한 시도는 성공적이지 않았다. 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 구성적 프로모터 대신에 유도성 프로모터를 이용하는 데, 이를 C1-고정 박테리아에서 사용하기에 적합하게 제공한다.
대부분의 진핵생물에서, 이중 가닥 파손(double stranded break: DSB)은 비-상동성 말단 결합 방법(NHEJ)에 의해 수선된다(Mali, Science, 339: 823-826, 2013; Cong, Science, 339: 819-823, 2013). 그러나, 원핵생물에서, 수선은 상동성 재조합에 의하며, DNA 수선 또는 주형 또는 상동성 아암(HA)에 의해 매개된다. CRISPR/Cas9 매개된 게놈 변형은 당화성 클로스트리디아(Clostridia)를 포함하는 다양한 미생물 시스템에서 나타났지만(Xu, Appl Environ Microbiol, 81: 4423-4431, 2015; Wang, J Biotechnol, 200: 1-5, 2015), C1-고정 박테리아에서는 그렇지 않았는데, 본 발명자들이 발견함에 따라, C1-고정 박테리아가 CRISPR/Cas9 툴, 예컨대 cas9의 제어된 발현의 설계에서 상당한 변형을 필요로 하기 때문이다.
용어 "비천연 유래" 또는 "조작된"은 상호 호환적으로 사용되며, 사람 손의 관여를 나타낸다. 예를 들어, 유전자 조작된 미생물은 비조작 또는 천연-유래 미생물에 비해 변형된(예를 들어, 결실, 돌연변이, 삽입, 차단, 침묵 또는 과발현된) 게놈 또는 다른 핵산을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 조작된 CRISPR/Cas 시스템은 비-조작 또는 천연 유래 CRISPR/Cas 시스템에 존재하지 않는 가이드 RNA 또는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드," "뉴클레오타이드," "뉴클레오타이드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 호환적으로 사용된다. 그들은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 즉, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유도체 중 하나를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 알려진 또는 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호 또는 비암호 영역, 결합 분석으로부터 정해진 좌위들(좌위), 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전에 또는 후에 주어질 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 가로막힐 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후에, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본 발명의 양상에서, 용어 "키메라 RNA", "키메라 가이드 RNA", "가이드 RNA", "단일 가이드 RNA" 및 "합성 가이드 RNA"는 상호 호환적으로 사용되고, 가이드 서열, tracr 서열 및 tracr 메이트(mate) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 구체화하는 가이드 RNA 내의 약 20bp 서열을 지칭하고, 용어 "가이드" 또는 "스페이서"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "tracr 메이트 서열"은 또한 용어 "직접 반복부(들)"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 DNA 주형으로부터(예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사체 내로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 암호화된 폴리펩타이드는 총괄적으로 "유전자 산물"로서 지칭될 수 있다. "발현 변경"은 유전자 산물 발현의 변화, 예를 들어 비변형 또는 모 미생물에 비한 발현의 증가, 감소 또는 제거를 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 가로막힐 수 있다. 상기 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함한다; 예를 들어, 이황화결합 형성, 글리코실화, 지질, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지 성분과의 접합. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 다, 및 아미노산 유사체 및 펩타이드모방체를 포함하는, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다.
"돌연변이된"은 야생형 또는 본 발명의 미생물이 유래된 모 미생물에 비해 본 발명의 미생물에서 변형된 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 효소를 암호화하는 유전자에서의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다. 다른 실시형태에서, 돌연변이는 효소에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다.
특히, "파괴적 돌연변이"는 유전자 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 또는 제거하는(즉, "파괴하는") 돌연변이이다. 파괴적 돌연변이는 유전자 또는 효소를 부분적으로 비활성화시키거나, 완전히 비활성화시키거나 또는 결실시킬 수 있다. 파괴적 돌연변이는 넉아웃(KO) 돌연변이일 수 있다. 파괴적 돌연변이는 효소에 의해 생성된 산물의 생합성을 감소시키거나, 방지하거나 또는 차단하는 임의의 돌연변이일 수 있다. 파괴적 돌연변이는, 예를 들어, 효소를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이, 효소를 암호화하는 유전자 발현에 수반된 유전자 조절 요소에서의 돌연변이, 효소 활성을 감소시키거나 또는 저해하는 단백질을 생성하는 핵산의 도입 또는 효소 발현을 저해하는 핵산(예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA, CRISPR) 또는 단백질의 도입을 포함할 수 있다.
파괴적 돌연변이의 도입은 유전자 산물을 생성하지 않거나 또는 유전자 산물을 실질적으로 생성하지 않거나 또는 본 발명의 미생물이 유래된 모 미생물에 비해 감소된 양의 유전자 산물을 생성하는 본 발명의 미생물을 초래한다. 예를 들어, 본 발명의 미생물은 유전자 산물이 없거나 또는 모 미생물보다 적어도 약 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 미만의 유전자 산물을 생성할 수 있다.
"내인성" 또는 "상동성"은 야생형 또는 본 발명의 미생물이 유래된 모 미생물에서 존재하거나 또는 발현된 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 내인성 유전자는 야생형 또는 본 발명의 미생물이 유래된 모 미생물에서 천연으로 존재하는 유전자이다. 일 실시형태에서, 내인성 유전자의 발현은 외인성 조절 요소, 예컨대 외인성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
"외인성" 또는 "이종성"은 야생형 또는 본 발명의 미생물이 유래된 모 미생물에서 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 일 실시형태에서, 외인성 유전자 또는 효소는 이종성(즉, 상이한) 균주 또는 종으로부터 유래되고 본 발명의 미생물에 도입되거나 또는 발현될 수 있다. 다른 실시형태에서, 외인성 유전자 또는 효소는 인공적으로 또는 재조합적으로 생성되고, 본 발명의 미생물에 도입되거나 또는 본 발명의 미생물에서 발현될 수 있다.
"코돈 최적화"는 특정 균주 또는 종에서 핵산의 최적화된 또는 개선된 번역을 위한 핵산, 예컨대 Cas 단백질, 예컨대 Cas9를 암호화하는 유전자의 돌연변이를 지칭한다. 코돈 최적화는 더 빠른 번역 속도 또는 더 높은 번역 정확도를 초래할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 유전자는 클로스트리듐(Clostridium), 특히 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 유전자는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
"과발현"은 야생형 또는 본 발명의 미생물이 유래된 모 미생물에 비해 본 발명의 미생물에서의 핵산 또는 단백질 발현의 증가를 지칭한다.
"상보성"은 전통적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 다른 비전통 유형에 의해 다른 핵산 서열과의 수소 결합(들)을 형성하는 핵산 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 서열과의 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내 잔기의 백분율(예를 들어, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10은 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보성임)을 나타낸다. "완벽한 상보성"은 핵산 서열의 모든 인접한 잔기가 제2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접한 잔기와 수소 결합한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 상보성"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오타이드 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상인 상보성 정도를 지칭하거나, 또는 엄격한 조건 하에 혼성화되는 2개의 핵산을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 대해 상보성을 갖는 핵산이 표적 서열과 우세하게 혼성화하고, 후속적으로 비-표적 서열과 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존적이며, 다수의 인자에 따라 다르다. 일반적으로, 서열이 길수록 서열이 그의 표적 서열에 특이적으로 혼성화되는 온도는 더 높다. 엄격한 조건의 비제한적 예는 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Tijssen, Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay," Elsevier, N.Y, 1993]).
"혼성화"는 뉴클레오타이드 잔기 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하기 위해 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍, 후그스테인(Hoogstein) 결합에 의해 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 이중가닥 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자기-혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 더 광범위한 과정 내 단계, 예컨대 PCR의 개시 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오타이드의 절단을 구성할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보체"로서 지칭된다.
핵산은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 본 발명의 미생물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 네이키드(naked) 핵산으로서 전달될 수 있거나 또는 하나 이상의 다른 제제, 예컨대 리포좀에 의해 제형화될 수 있다. 핵산은 DNA, RNA, cDNA 또는 적절하다면 이들의 조합일 수 있다. 제한 저해제는 특정 실시형태에서 사용될 수 있다. 추가적인 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 플라스미드를 이용하여 본 발명의 미생물에 전달된다. 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함)은 전기천공법, 초음파 처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 자연적 역량, 원형질체 형질전환, 프로파지 유도 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 활성 전사 효소 시스템을 갖는 특정 실시형태에서, 이는 미생물 내로 핵산의 도입 전에 핵산을 메틸화하는 데 필수적일 수 있다.
더 나아가, 핵산은 특정 핵산의 발현을 증가시키거나 또는 달리 제어하기 위해 조절 요소, 예컨대 프로모터를 포함하도록 설계될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로 프로모터, 페레독신 프로모터, 파이루베이트:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합체 오페론 프로모터, ATP 신타제 오페론 프로모터, 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터일 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 방법에서, Cas 9는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 유도성 프로모터는, 예를 들어, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 예컨대 tet3no 또는 ipl12 또는 락토스 유도성 프로모터일 수 있다.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 총괄적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(전사-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성인 부분적 atracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "직접 반복부" 및 tracrRNA-가공 부분적 직접 반복부를 포함), 가이드 서열(또한 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "스페이서"로서 지칭됨), 또는 CRISPR 좌위로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하는 CRISPR-연관("Cas") 유전자의 발현에 수반되거나 또는 이의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 써모필루스를 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소(또한 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 프로토스페이서(protospacer)로서 지칭됨)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성과 관련하여, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 완전한 상보성이 반드시 필요하지는 않으며, 단, 혼성화를 야기하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키기 위한 충분한 상보성이 있다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함)의 형성은 표적 서열 내 또는 근처의(예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 내의) 가닥 중 하나 또는 둘 다의 절단을 초래한다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 야생형 tracr 서열의 모두 또는 일부(예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 이상의 뉴클레오타이드)를 포함하거나 또는 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한, 예컨대 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 모두 또는 일부에 tracr 서열의 적어도 일부를 따라 혼성화에 의해 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, tracr 서열은 혼성화하고 CRISPR 복합체의 형성에 참여하는 tracr 메이트 서열에 대해 충분한 상보성을 가진다. 표적 서열과 같이, 완전한 상보성이 필요하지 않으며, 단, 기능성이 되기에 충분한 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, tracr 서열은 최적으로 정렬될 때 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 서열 상보성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 가진다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터가 숙주 세포 내로 도입된다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열, 및 tracr 서열은 각각 별개의 벡터 상에서 별개의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있었다. 대안적으로, 동일 또는 상이한 조절요소로부터 발현된 2 이상의 요소는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공하는 하나 이상의 추가적인 벡터와 함께 단일 벡터에서 조합될 수 있다. 단일 벡터에서 조합된 CRISPR 시스템 요소, 예컨대 제2 요소에 대해 5'에("상류에") 또는 제2 요소에 대해 3'에("하류에") 위치된 하나의 요소는 임의의 적합한 배향으로 배열될 수 있다. 하나의 요소의 암호 서열은 제2 요소의 암호 서열의 동일한 가닥 또는 반대 가닥 상에 위치될 수 있고, 동일한 방향 또는 반대 반향으로 배향된다. 일부 실시형태에서, 단일 프로모터는 CRISPR 효소를 암호화하는 전사체 및 가이드 서열, tracr 메이트 서열(선택적으로 가이드 서열에 작동 가능하게 연결됨) 및 하나 이상의 인트론 서열 내에 함입된 tracr 서열(예를 들어, 상이한 인트론에서 각각, 적어도 하나의 인트론에서 2 이상, 또는 단일 인트론에서 모두) 중 하나 이상의 발현을 유도한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 이로부터 발현된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예컨대 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열(또한 "클로닝 부위"로서 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 삽입 부위(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 삽입 부위)는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 삽입 부위 내로 가이드 서열의 삽입 후 그리고 가이드 서열의 발현 시 세포 내 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하도록 tracr 메이트 서열 상류에 그리고 선택적으로 tracr 메이트 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소의 하류에 삽입 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 2개 이상의 삽입 부위를 포함하며, 각각의 삽입 부위는 각각의 부위에서 가이드 서열의 삽입을 허용하도록 2개의 tracr 메이트 서열 사이에 위치된다. 이러한 배열에서, 2 이상의 가이드 서열은 단일 가이드 서열의 2 이상의 복제물, 2 이상의 상이한 가이드 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다중의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 세포 내에서 다중의 상이한 대응하는 표적 서열에 대한 CRISPR 활성을 표적화하기 위해 단일 발현 작제물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 이러한 가이드-서열-함유 벡터가 제공될 수 있으며, 선택적으로 세포에 전달될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 CRISPR 효소, 예컨대 Cas 단백질을 암호화하는 효소-암호 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(또한 Csn1 및 Csx12로서 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 상동체, 또는 이들의 변형된 형태를 포함한다. 이들 효소는 공지되어 있으며; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2 하의 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비변형 CRISPR 효소는 DNA 절단 활성, 예컨대 Cas9를 가진다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소는 Cas9이며, 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스(S. thermophilus), 또는 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae)로부터의 Cas9일 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서, 예컨대 표적 서열 내의 그리고/또는 표적 서열의 상보체 내의 가닥 중 하나 또는 둘 다의 절단을 지시한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 처음 또는 마지막 뉴클레오타이드로부터의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 이상의 염기쌍 내의 가닥 중 하나 또는 둘 다의 절단을 지시한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥 중 하나 또는 둘 다를 절단하는 능력이 없도록 대응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이되는 CRISPR 효소를 암호화한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매적 도메인에서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 치환(D10A)은 틈내기 효소에 대한 가닥을 둘 다 절단하는(단일 가닥을 절단하는) 뉴클레아제로부터의 Cas9를 전환시킨다. Cas9 틈내기 효소를 제공하는 돌연변이의 다른 예는 H840A, N854A 및 N863A를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 양상에서, 틈내기 효소는 상동성 재조합을 통한 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다.
추가적인 예로서, Cas9의 2 이상의 촉매적 도메인(RuvC I, RuvC II 및 RuvC III)은 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 없는(촉매적으로 비활성) 돌연변이된 Cas9를 생성하도록 돌연변이될 수 있다. 일부 실시형태에서, D10A 돌연변이는 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 없는 Cas9 효소를 생성하기 위해 H840A, N854A 또는 N863A 돌연변이 중 하나 이상과 조합된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소는 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 그의 비돌연변이 형태에 비해 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 미만이거나 또는 더 낮을 때 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 없는 것으로 고려된다. 다른 돌연변이가 유용할 수 있으며; 여기서 Cas9 또는 다른 CRISPR 효소는 스트렙토코커스 피오게네스 이외의 다른 종으로부터 유래되고, 대응하는 아미노산에서의 돌연변이는 유사한 효과를 달성하도록 이루어질 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하도록 그리고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하도록 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과의 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때 가이드 서열과 그의 대응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용에 의해 결정될 수 있으며, 이의 비제한적 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우스-휠러(Burrows-Wheeler) 전환(예를 들어, 버로우즈 휠러 정렬기(Burrows Wheeler Aligner))에 기반한 알고리즘, ClustalW, Clustal X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(노보크라프트 테크놀로지즈(Novocraft Technologies), 이랜드(ELAND)(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 일루미나(Illumina)), SOAP 및 Maq를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 길이가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 길이가 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 이하의 뉴클레오타이드이다. 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하는 데 충분한 CRISPR 시스템의 성분은, 예컨대 CRISPR 서열을 암호화하는 벡터에 의한 형질감염에 의한 다음에, 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가에 의해 대응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 서열, 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 제어 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공함으로써, 그리고 시험 서열과 제어 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서 결합 또는 절단 속도를 비교함으로써 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 절단은 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 분석이 가능하며, 당업자에게 일어날 것이다.
일반적으로, tracr 메이트 서열은, (1) 대응하는 tracr 서열을 함유하는 세포 내 tracr 메이트 서열에 측접하는 가이드 서열의 절단; 및 (2) 표적 서열에서 CRISPR 복합체의 형성 중 하나 이상을 촉진하기 위해 tracr 서열과의 충분한 상보성을 갖는 임의의 서열을 포함하되, CRISPR 복합체는 tracr 서열에 혼성화된 tracr 메이트 서열을 포함한다. 일반적으로, 상보성 정도는 두 서열 중 더 짧은 길이를 따라서 tracr 메이트 서열 및 tracr 서열의 최적의 정렬과 관련된다. 최적의 정렬은 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있고, 2차 구조, 예컨대 서열 또는 tracr 메이트 서열 중 하나에서의 자기-상보성을 추가로 고려할 수 있다. 일부 실시형태에서, 최적으로 정렬될 때 둘 중 더 짧은 것의 길이를 따라서 tracr 서열과 tracr 메이트 서열 사이의 상보성 정도는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99%이거나 또는 더 클 수 있다. 일부 실시형태에서, tracr 서열은 길이가 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, tracr 서열 및 tracr 메이트 서열은 둘 사이의 혼성화가 2차 구조, 예컨대 헤어핀을 갖는 전사체를 생성하도록 단일 전사체 내에 포함된다.
"상동성 재조합"은 뉴클레오타이드 서열이 DNA의 두 유사한 또는 동일한 분자 간에 교환되는 유전자 재조합 유형이다. 특히, 상동성 재조합은 벡터 작제물 상에서 상동성 아암 사이에 위치된 DNA를 숙주 세포에서 상동성 아암 표적 사이에 위치된 DNA로 대체하기 위해 사용될 수 있다. 상동성 아암은 바람직하게는 숙주 세포 내 표적 영역에 대해 100% 상보성을 가진다. 그러나, 상동성 아암은 그들이 상동성 재조합을 허용하기에 충분한 상보성을 가진다면, 숙주 세포 내 표적 영역에 대해 100% 상보성 미만을 가질 수 있다.
"미생물"은 미시적 유기체, 특히 박테리아, 고세균, 바이러스 또는 진균이다. 본 발명의 미생물은 전형적으로는 박테리아이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "미생물"의 설명은 "박테리아"를 포함하는 것으로 취해져야 한다.
"모 미생물"은 본 발명의 미생물을 생성하기 위해 사용되는 미생물이다. 모 미생물은 천연 유래 미생물(즉, 야생형 미생물) 또는 이전에 변형된 미생물(즉, 돌연변이체 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 발명의 미생물은 모 미생물에서 발현 또는 과발현되지 않은 하나 이상의 효소를 발현 또는 과발현시키도록 변형될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 미생물은 모 미생물에 의해 함유되지 않은 하나 이상의 유전자를 함유하도록 변형될 수 있다. 본 발명의 미생물은 또한 모 미생물에서 발현된 더 소량의 하나 이상의 효소를 발현시키지 않거나 또는 발현시키도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 클로스트리듐 융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이이다. 바람직한 실시형태에서, 모 미생물은 부다페스트 협약 및 합의된 수탁 번호 DSM23693 하에서 2010년 6월 7일에 독일 브라운슈바이크 D-38124 인호펜스트라베타 7B에 위치한 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH:DSMZ)에 의해 2010년 6월 7일에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561이다.
용어 "로부터 유래된"은 새로운 핵산, 단백질 또는 미생물을 생성하기 위해 핵산, 단백질 또는 미생물이 상이한(예를 들어, 모 또는 야생형) 핵산, 단백질 또는 미생물로부터 변형되거나 또는 적합하게 된다는 것을 나타낸다. 이러한 변형 또는 적응은 전형적으로 핵산 또는 유전자의 삽입, 결실, 돌연변이 또는 치환을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 모 미생물로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 클로스트리듐 융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이로부터 유래된다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561로부터 유래된다.
본 발명의 미생물은 기능성 특징에 기반하여 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미생물은 C1-고정 미생물, 혐기성, 아세토겐(acetogen), 에타노로젠(ethanologen), 일산화탄소 영양체(carboxydotroph) 및/또는 메탄영양체일 수 있거나 또는 이들로부터 유래될 수 있다. 표 1은 미생물의 대표적인 목록을 제공하며, 그들의 기능적 특징을 확인한다.
"C1"은 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2, CH4 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-옥시게네이트"는 또한 적어도 하나의 산소 원자, 예를 들어, CO, CO2 또는 CH3OH를 포함하는 1-탄소 분자를 지칭한다. "C1-탄소 공급원"은 본 발명의 미생물에 대한 부분적 또는 유일한 탄소 공급원으로서 작용하는 1 탄소-분자를 지칭한다. 예를 들어, C1-탄소 공급원은 CO, CO2, CH4, CH3OH 또는 CH2O2 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, C1-탄소 공급원은 CO와 CO2 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. "C1-고정 미생물"은 C1-탄소 공급원으로부터 하나 이상의 산물을 생성하는 능력을 갖는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 C1-고정 박테리아이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 C1-고정 미생물로부터 유래된다.
"혐기성"은 성장을 위해 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성은 산소가 특정 역치 초과로 존재한다면 부정적으로 반응하거나 또는 심지어 죽을 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 혐기성이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 혐기성으로부터 유래된다.
"아세토겐"은 혐기성 호흡의 산물로서 아세테이트(또는 아세트산)을 생성하거나 또는 생성할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 아세토겐은 에너지 보존을 위한 그리고 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA-유래 산물, 예컨대 아세테이트의 합성을 위한 그들의 주요 메커니즘으로서 우드-융달 경로를 사용하는 절대 혐기성 박테리아이다(Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). 아세토겐은 (1) CO2로부터 아세틸-CoA의 환원적 합성을 위한 메커니즘, (2) 최종 전자-받기, 에너지 보존 과정, (3) 세포 탄소의 합성에서 CO2의 고정(동화)을 위한 메카니즘으로서 아세틸-CoA 경로를 사용한다(Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006). 모든 천연 유래 아세토겐은 C1-고정, 혐기성, 자가영양성 및 비-메탄영양성이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 아세토겐이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인되는 아세토겐으로부터 유래된다.
"에타노로젠"은 에탄올을 생성하거나 또는 에탄올을 생성할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 에타노로젠이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1로부터 확인되는 에타노로젠으로부터 유래된다.
"독립영양생물"은 유기 탄소의 부재 하에 성장할 수 있는 미생물이다. 대신에, 독립영양생물은 무기 탄소 공급원, 예컨대 CO 및/또는 CO2를 사용한다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 독립영양생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인되는 독립영양생물로부터 유래된다.
"일산화탄소 영양체(Carboxydotroph)"는 탄소의 유일한 공급원으로서 CO를 이용할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 일산화탄소 영양체이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인되는 일산화탄소 영양체로부터 유래된다.
"메탄영양체"는 탄소 및 에너지의 유일한 공급원으로서 메탄을 이용할 수 있는 미생물이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 메탄영양체이거나 또는 메탄영양체로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 메탄영양체가 아니거나 또는 메탄영양체로부터 유래되지 않는다.
더 광범위하게는, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인되는 임의의 속 또는 종으로부터 유래될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리 및 클로스트리듐 라그스달레이 종을 포함하는 클로스트리듐강의 무리로부터 유래된다. 이들 종은 문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994](클로스트리듐 오토에타노게눔), 문헌[Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993](클로스트리듐 융달리), 및 Huhnke, WO 2008/028055(클로스트리듐 라그스달레이)에 의해 처음 보고되고 특성규명되었다.
이들 3가지 종은 다수의 유사점을 가진다. 특히, 이들 종은 모두 클로스트리듐 속의 C1-고정, 혐기성, 아세토겐, 에타노로젠 및 일산화탄소 영양체 구성원이다. 이들 종은 유사한 유전자형 및 표현형 및 에너지 보존 및 발효 대사 방식을 가진다. 게다가, 이들 종은 99% 초과로 동일한 16S rRNA DNA를 갖는 클로스트리듐 rRNA 상동성 그룹에서 무리지어지며, 약 22 내지 30㏖%의 DNA G + C 함량을 가지고, 그램-양성이며, 유사한 형태 및 크기(0.5-0.7 x 3-5㎛ 사이의 대수적 성장 세포)를 가지고, 중온성(최적으로는 30 내지 37℃에서 성장)이며, 약 4 내지 7.5의 유사한 pH 범위를 가지고(최적의 pH는 약 5.5 내지 6임), 사이토크롬을 결여하며, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다. 또한, 카복실산의 그의 대응하는 알코올로의 환원은 이들 종에서 나타났다(Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). 중요하게는, 이들 종은 또한 모두 CO-함유 기체 상에서 강한 자가영양성 성장을 나타내며, 주요 발효 산물로서 에탄올 및 아세테이트(또는 아세트산)을 생성하며, 특정 조건 하에서 소량의 2,3-부탄다이올 및 락트산을 생성한다.
그러나, 이들 3가지 종은 또한 다수의 차이를 가진다. 이들 종은 상이한 종으로부터 단리되었다: 토끼 장으로부터의 클로스트리듐 오토에타노게눔, 닭장 쓰레기로부터의 클로스트리듐 융달리, 및 담수 침전물로부터의 클로스트리듐 라그스달레이. 이들 종은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 알기닌, 히스티딘) 및 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 이용에 차이가 있다. 게다가, 이들 종은 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 바이오틴)에 대한 영양 요구성에 차이가 있다. 이들 종은 이들 유전자 및 단백질의 일반적 조직 및 수가 모든 종에서 동일한 것으로 발견되었지만, 우드-융달 경로 유전자 및 단백질의 핵산 및 아미노산 서열에 차이가 있다(
, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).
따라서, 요약하면, 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이의 다수의 특징은 해당 종에 특이적이 아니며, 오히려 클로스트리듐 속의 C1-고정, 혐기성, 아세토겐, 에타노로젠 및 일산화탄소 영양체 구성원의 이 무리에 대한 일반적 특징이다. 그러나, 이들 종은 사실 별개이기 때문에, 이들 종 중 하나의 유전자 변형 또는 조작은 이들 종의 다른 것에서 동일한 효과를 갖지 않을 수도 있다. 예를 들어, 성장, 성능 또는 산물 생성에서의 차이가 관찰될 수 있다.
본 발명의 미생물은 또한 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이의 단리물 또는 돌연변이체로부터 유래될 수 있다. 클로스트리듐 오토에타노게눔의 단리물 및 돌연변이체는 JA1-1(DSM10061)(Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200) 및 LZ1561(DSM23693)을 포함한다. 클로스트리듐 융달리의 단리물 및 돌연변이체는 ATCC 49587(Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PETCT(DSM13528, ATCC 55383), ERI-2(ATCC 55380)(미국 특허 제5,593,886호), C-01(ATCC 55988)(미국 특허 제6,368,819호), O-52(ATCC 55989)(미국 특허 제6,368,819호), 및 OTA-1(Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010)을 포함한다. 클로스트리듐 라그스달레이의 단리물 및 돌연변이체는 PI 1(ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)을 포함한다.
"기질"은 본 발명의 미생물에 대한 탄소 및/또는 에너지 공급원을 지칭한다. 전형적으로, 기질은 기체이며 C1-탄소 공급원, 예를 들어, CO, CO2 및/또는 CH4를 포함한다. 바람직하게는, 기질은 CO 또는 CO + CO2의 C1-탄소 공급원을 포함한다. 기질은 다른 비-탄소 성분, 예컨대 H2, N2 또는 전자를 추가로 포함할 수 있다.
기질은 일반적으로 적어도 일부량의 CO, 예컨대 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100㏖% CO를 포함한다. 기질은 다양한 CO, 예컨대 약 20 내지 80, 30 내지 70 또는 40 내지 60㏖% CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 기질은 약 40 내지 70㏖% CO(예를 들어, 제강 공장 또는 용광로 가스), 약 20 내지 30㏖% CO(예를 들어, 염기성 산소 고로 가스), 또는 약 15 내지 45㏖% CO(예를 들어, 합성 가스)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기질은 상대적으로 소량의 CO, 예컨대 약 1 내지 10 또는 1 내지 20㏖% CO를 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물은 전형적으로 기질 내 CO의 적어도 일부를 생성물로 전환시킨다. 일부 실시형태에서, 기질은 CO를 포함하지 않거나 또는 실질적으로 포함하지 않는다(< 1㏖%).
기질은 일부량의 H2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20 또는 30㏖% H2를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 상대적으로 고량의 H2, 예컨대 약 60, 70, 80 또는 90㏖% H2를 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, 기질은 H2를 포함하지 않거나 또는 실질적으로 포함하지 않는다(< 1㏖%).
기질은 일부량의 CO2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 약 1 내지 80 또는 1 내지 30㏖% CO2를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 약 20, 15, 10 또는 5㏖% CO2 미만을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 기질은 CO2를 포함하지 않거나 또는 실질적으로 포함하지 않는다(< 1㏖%).
기질은 전형적으로 기체이지만, 기질은 또한 대안의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 기질은 마이크로버블 분산 생성기를 이용하여 CO-함유 기체로 포화된 액체 중에 용해될 수 있다. 추가적인 예로서, 기질은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업 공정의 부산물로서 또는 일부 다른 공급원으로부터, 예컨대 자동차 배기 흉 또는 바이오매스 가스화로부터 얻은 폐가스일 수 있다. 특정 실시형태에서, 산업 공정은 철 금속 생성물 제조, 예컨대 제강 공장 제조, 비철 생성물 제조, 석유 정련 공정, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 임의의 편리한 방법을 이용하여 그것이 대기로 방출되기 전에 산업 공정으로부터 포획될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 합성가스, 예컨대 석탄 또는 정유공장 잔여물, 바이오매스 또는 목질 섬유소 물질의 가스화, 또는 천연 가스의 개질에 의해 얻어진 합성가스일 수 있다. 다른 실시형태에서, 합성가스는 지방 자치제 고체 폐기물 또는 산업 고체 폐기물의 가스화로부터 얻을 수 있다.
기질의 조성은 반응 효율 및/또는 비용에 대해 상당한 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, 산소(O2)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 기질 조성에 따라서, 임의의 목적으로 하지 않는 불순물, 예컨대 독소, 목적으로 하지 않는 성분, 또는 먼지 입지를 제거하기 위해 그리고/또는 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위해 기질을 처리, 스크럽 또는 여과하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 미생물은 하나 이상의 산물을 생성하기 위해 배양될 수 있다. 예를 들어, 클로스트리듐 오토에타노게눔은 에탄올(WO 2007/117157), 아세테이트(WO 2007/117157), 부탄올(WO 2008/115080 및 WO 2012/053905), 뷰티레이트(WO 2008/115080), 2,3-부탄다이올 (WO 2009/151342), 락테이트(WO 2011/112103), 뷰텐(WO 2012/024522), 뷰타다이엔(WO 2012/024522), 메틸 에틸 케톤(2-부탄온)(WO 2012/024522 및 WO 2013/185123), 에틸렌(WO 2012/026833), 아세톤(WO 2012/115527), 아이소프로판올(WO 2012/115527), 지질(WO 2013/036147), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)(WO 2013/180581), 아이소프렌(WO 2013/180584), 지방산(WO 2013/191567), 2-부탄올(WO 2013/185123), 1,2-프로판다이올(WO 2014/0369152) 및 1-프로판올(WO 2014/0369152)을 생성하거나 또는 생성하도록 조작될 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 임의의 방법으로 그의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
본 실시예는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693의 배양을 입증한다.
클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693(DSM10061의 유도체)은 DSMZ(독일 브라운슈바이크 38124 인호펜스트라베타 7B에 소재한 독일생물자원센터)로부터 얻었다. 엄격한 혐기성 조건 및 기법을 이용하여 37℃에서 성장을 수행하였다(Hungate, Meth Microbiol, 3B: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microb Physiol, 6: 107-146, 1971). 효모 추출물이 없는 화학적으로 한정된 PETC 배지를 사용하였다. 자가영양성 성장을 위한 기질로서 30psi 기체 혼합물(44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)을 사용하였다. 고체 배지에 대해, 1.2% 박토 한천(미국 뉴저지주 07417 플랭클린 레이크스에 소재한 BD)을 첨가하였다.
실시예 2
본 실시예는 CRISPR/Cas9를 이용하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693에서의 2차 알코올 탈수소효소 유전자(secAdh)의 결실을 입증한다.
스트렙토코커스 피오게네스(NC_002737.2 핵산 서열; NP_269215.1 아미노산 서열)로부터의 cas9 유전자는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693에 적합한 코돈이었고, NdeI과 HindIII 제한엔도뉴클레아제 부위 사이의 벡터 pLZtet3no 내로 클로닝하여 벡터 pLZtet3no-cas9를 형성한다. cas9의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 위치되었다.
클로스트리듐 오토에타노게눔 2차 알코올 탈수소효소 유전자(secAdh)(CAETHG_0053; CP006763.1 핵산 서열; AGY74782.1 아미노산 서열)에 대한 2개 스페이서를 젠스크립트(GenScript)에 의해 설계하였다. 스페이서를 합성하고 나서, NdeI와 PvuII 부위 사이의 벡터 pMTL83557 내로 클로닝하여 벡터 pMTL83557-secAdh-T1 및 pMTL83557-secAdh-T2를 형성한다. pMTL83557-secAdh-T1 및 pMTL83557-secAdh-T2에서의 β-락타마제 항생제 선택 마커를 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(catP) 항생제 선택 마커로 대체하여 벡터 pMTL83157-secAdh-T1 및 pMTL83157-secAdh-T2를 형성한다. secAdh의 대략 1kb 5' 및 3' 상동성 아암은 프라이머 5-HAf3/5-HAr2 및 3-HAf2/3-HAr 및 KAPA 중합효소(바이오라드(BioRad))를 이용하여 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 게놈 DNA로브터 PCR 증폭시켰다.
문헌[Bertram, Arch Microbiol, 151: 557-557, 1989]에 의해 변형된 방법을 이용하여 게놈 DNA를 단리시켰다. 100-㎖ 밤새 배양물을 채취하고 나서(6,000 x g, 15분, 4℃), 인산칼륨 완충제(10mM, pH 7.5)로 세척하고, 1.9㎖ STE 완충제(50mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, 200mM 수크로스; pH 8.0) 중에서 현탁시켰다. 300㎕ 라이소자임(대략 100,000 U)을 첨가하고 나서, 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후에, 280㎕의 10%(w/v) SDS 용액을 첨가하고, 10분 동안 다시 인큐베이션시켰다. 240㎕의 EDTA 용액(0.5M, pH 8), 20㎕ 트리스-HCl(1M, pH 7.5), 및 10㎕ RNase A(퍼멘타스 라이프 사이언시즈(Fermentas Life Sciences))의 첨가에 의해 RNA를 실온에서 분해시켰다. 이어서, 100㎕ 프로테이나제 K(0.5U)를 첨가하고 나서, 1 내지 3시간 동안 37℃에서 단백질 분해가 일어났다. 최종적으로, 600㎕의 과염소산나트륨(5M)을 첨가한 후에, 페놀-클로로폼 추출 및 아이소프로판올 침전을 하였다. DNA 양 및 질을 분광광도학적으로 연구하였다.
진아트 심레스(GeneArt seamless) 클로닝 키트를 이용하여 벡터 pMTL83157-secAdh-T1 및 pMTL83157-secAdh-T2 내로 상동성 아암을 클로닝시켰다. 심레스 클로닝을 위한 벡터 골격은 프라이머 BBf2 / BBr2 및 KAPA 중합효소를 이용하여 PCR 증폭시켰다. 얻어진 벡터를 pMTL83157-secAdh-T1-HA 및 pMTL83157-secAdh-T2-HA로서 지칭한다.
벡터 pLZtet3no-cas9를 접합을 통해 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693으로 형질전환시켰다. 이를 위하여, 표준 열 충격 형질전환을 이용하여 발현 벡터를 접합 공여자 균주 이콜라이(E. coli) HB101+R702(CA434)(Williams, J Gen Microbiol, 136: 819-826)(공여자) 내로 처음 도입하였다. 공여자 세포를 SOC 배지에서(Sambrook, Molecular cloning: A laboratory manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) 37℃에서 1시간 동안 회수한 후에 100㎍/㎖ 스펙티노마이신 및 25㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지(Sambrook, Molecular cloning: A laboratory manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) 플레이트 상에 플레이팅하였다. LB 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, 100㎍/㎖ 스펙티노마이신 및 25㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 5㎖ LB 분취액을 몇몇 공여자 콜로니와 함께 접종하고 나서, 37℃에서, 대략 4시간 동안 진탕시키면서 또는 배양물이 시각적으로 밀집하지만 아직 정상 상태에 들어가지 않았을 때까지 인큐베이션시켰다. 1.5㎖의 공여자 배양물을 4000rpm에서 2분 동안 원심분리에 의해 실온에서 마이크로원심분리관에서 채취하고 나서, 상청액을 폐기하였다. 공여자 세포를 2㎖ 멸균 PBS 완충제에서 부드럽게 재현탁시키고 나서(Sambrook, Molecular cloning: A laboratory manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) 4000rpm에서 5분 동안 원심분리시키고, PBS 상청액을 폐기하였다. 펠렛을 혐기성 챔버 내로 도입하고 나서, 후기 대수기 동안 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양물(수용자) 200㎕에서 부드럽게 재현탁시킨다. 접합 혼합물(공여자 세포와 수용자 세포의 혼합물)을 PETC-MES 한천 플레이트 상에 스팟팅하고 나서, 건조를 위해 남겨두었다. 스팟이 더 이상 시각적으로 젖지 않았을 때, 플레이트를 압력 단지 내로 도입하고 나서, 합성가스를 이용하여 25 내지 30 psi로 압력을 가하고, 37℃에서 대략 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 24시간 인큐베이션 후에, 접합 혼합물을 10㎕ 접종 루프를 이용하여 부드럽게 긁어냄으로써 그것을 플레이트로부터 제거하였다. 제거된 혼합물을 200 내지 300㎕ PETC 배지에서 현탁시켰다. pLZtet3no-cas9 벡터를 보유하는 형질전환체에 대한 선택을 위해 5㎍/㎖ 클라리트로마이신 및 이콜라이를 반대선택하기 위해 10㎍/㎖ 트라이메토프림으로 보충한 PETC 배지 한천 플레이트 상에 접합 혼합물의 100㎕ 분취액을 두었다.
pLZtet3no-cas9 벡터를 보유하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693의 3개의 별개의 콜로니 또는 클론을 5㎍/㎖ 클라리트로마이신을 갖는 2㎖의 PETC-MES 배지에 접종하고 나서, 3일 동안 100rpm 오비탈 진탕시키면서 자가영양적으로 37℃에서 성장시켰다. pLZtet3no-cas9를 보유하는 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693의 하나의 클론을 상기 설명한 바와 같은 제2 플라스미드 pMTL83157-secAdh-T1_HA 또는 pMTL83157-secAdh-T2_HA로 형질전환시켰다. 형질전환체를 5㎍/㎖ 클라리트로마이신, 10㎍/㎖ 트라이메토프림 및 15㎍/㎖ 티암페니콜을 함유하는 PETC 한천 배지 상에서 선택하였다. cas9의 발현을 유도하기 위해 모두 3가지 항생제 및 32ng/㎕ 안하이드로테트라사이클린을 함유하는 PETC 한천 플레이트 상에서 콜로니를 도말시켰다. 얻어진 콜로니로부터, 프라이머 SNsc-CR-09/ OgAM58 및 KAPA 중합효소를 이용하여 PCR에 의한 secAdh 유전자의 결실에 대해 8가지를 선별하였다. 비변형 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693은 3382 bp의 산물을 증폭시키고, secAdh 유전자 내의 그리고 상동성 아암 사이의 891bp 단편의 결실을 갖는 돌연변이체는 2491 bp의 산물을 증폭시킨다.
cas9+T1_HA를 함유하는 3개의 클론은 유전자(도 1C)의 3' 말단에서 466bp 결실을 갖는 절단된 secAdh 유전자(도 1A 및 도 1B)를 가졌다. 이는 PCR 산물의 생어 서열분석(Sanger sequencing)에 의해 확인하였다. cas9+T2_HA를 함유하는 클론 중 어떤 것도 secAdh 유전자에서 임의의 변형을 갖지 않았다(도 1A 및 도 1B). 본 실시예에서, 클로스트리듐 오토에타노게눔에서 유전자 결실을 만들기 위한 CRISPR-II/Cas9의 효율은 대략 20%가 되는 것으로 나타난다. 이는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 CRISPR-II/Cas9 시스템이 클로스트리듐 오토에타노게눔에서 기능성이라는 것을 분명하게 나타낸다.
실시예
3
본 실시예는 CRISPR/Cas9를 이용하여 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693에서의 2,3-부탄다이올 탈수소효소 (2,3- bdh) 유전자의 결실을 입증한다.
클로스트리듐 오토에타노게눔에서의 더 양호한 효율을 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 추가로 최적화하기 위해, cas9 유전자의 발현을 더 강한 테트라사이클린 유도성 프로모터, ipl12의 제어 하에 두었다. 추가적으로, 상동성 아암은 Cas9 절단 부위로부터 100bp 내가 되도록 설계하였다.
pLZtet3no-cas9로부터의 cas9 유전자는 NdeI와 HindIII 부위 사이의 pLZipl12 플라스미드 내로 클로닝되어 플라스미드 pLZipl12-cas9를 형성한다(도 2a). pIPL12는 pLZtet3no에 비해 더 강한 테트라사이클린 유도성 프로모터를 가졌다.
클로스트리듐 오토에타노게눔 2,3-부탄다이올 탈수소효소 유전자(CAETHG_0385; CP006763.1 뉴클레오타이드 서열; AGY74614.1 아미노산 서열)에 대한 2개의 스페이서를 젠스크립트(GenScript)에 의해 설계하였다. 스페이서를 NdeI와 PvuII 부위 사이의 pMTL83557 내로 클로닝하여 벡터 pMTL83557-2,3bdh-T1 및 pMTL83557-2,3bdh-T2를 형성하였다. pMTL83557-2,3bdh-T1 및 pMTL83557-2,3bdh-T2에서 β-락타마제 항생제 선택 마커(도 2b)를 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(catP) 항생제 선택 마커로 대체하여 벡터 pMTL83157-2,3bdh-T1 및 pMTL83157-2,3bdh-T2를 얻었다. 프라이머 SNr05f / SNr06r 및 SNr07f/ SNr08r 및 KAPA 중합효소(바이오라드)를 이용하여 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 게놈 DNA로부터 2,3bdh 유전자에 측접하는 대략 1kb 5' 및 3' 상동성 아암을 PCR 증폭시켰다. 상동성 아암은 Cas9 절단 부위로부터 대략 70bp였다. PmeI 제한 부위를 포함하는 프라이머 SNr05f / SNr08r을 이용하여 PCR에 의해 2개의 PCR 산물을 스플라이싱하였다. 얻어진 대략 2kb PCR 산물을 PmeI 제한 부위 사이의 벡터 pMTL83157-2,3bdh-T1 및 pMTL83157-2,3bdh-T2 내로 클로닝하여 벡터 pMTL83157-2,3bdh-T1￢_HA 및 pMTL83157-2,3bdh-T2_HA를 얻었다.
벡터, pLZipl12-cas9, pMTL83157-2,3bdh-T1_HA 및 pMTL83157-2,3bdh-T2_HA를 상기 설명한 바와 같은 접합을 통해 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693으로 형질전환시켰다. 상기 설명한 바와 같은 제2 플라스미드 pMTL83157-2,3bdh-T1_HA 또는 pMTL83157-2,3bdh-T2_HA를 이용하여 pLZipl12-cas9를 보유하는 하나의 클론을 형질전환시켰다. 5㎍/㎖ 클라리트로마이신, 10㎍/㎖ 트라이메토프림 및 15㎍/㎖ 티암페니콜을 함유하는 PETC 한천 배지 상에서 형질전환체를 선택하였다. pLZipl12-cas9 및 pMTL83157-2,3bdh-T2_HA만을 갖는 콜로니를 관찰하였다. 이로부터, 모두 3종의 항생제 및 32ng/㎕ 안하이드로테트라사이클린을 함유하는 PETC 한천 플레이트 상에 8개의 콜로니를 도말하여 Cas9 유전자의 발현을 유도하였다.
얻어진 콜로니를 프라이머 Og33f / Og34r 및 KAPA 중합효소를 이용하는 PCR에 의해 2,3- bdh 유전자에서의 결실에 대해 선별하였다. 비변형 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693은 3512 bp의 산물을 증폭시키고 2,3- bdh 유전자 내에서 그리고 상동성 아암 사이에 967 bp 단편의 결실을 갖는 돌연변이체는 2545 bp의 산물을 증폭시킨다. 3512 bp 단편은 pLZipl12-cas9 또는 pMTL83157-2,3bdh-T1_HA 또는 pMTL83157-2,3bdh-T2_HA 단독 중 하나를 운반하는 비변형 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 및 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693으로부터 증폭되었지만(도 3A, 레인 W, C1, C2 및 C3), 2 벡터 pLZipl12-cas9 및 pMTL83157-2,3bdh-T2_HA를 운반하는 8개의 클론 중 5개에서 2,3- bdh 유전자 내에서 967 bp 단편의 결실이 관찰되었다(도 3A, 레인 1 내지 8, 및 도 3B). PCR 산물의 생어 서열분석에 의해 결실을 추가로 확인하였다.
Cas9 유전자 발현을 유도하는 더 강한 테트라사이클린 유도성 프로모터 및 2,3-bdh의 스페이서-2 내의 Cas9 절단 부위에 가까운 3'-상동성 아암의 근위부의 사용은 클로스트리듐 오토에타노게눔에서 CRISPRii-cas9 시스템의 효율을 60%까지 개선시키는 것으로 나타난다.
실시예
4
본 실시예는 cas9 및 대안의 플라스미드 설계의 틈내기 효소 형식을 이용하여 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693에서의 2,3-부탄다이올 탈수소효소(2,3-bdh) 유전자의 결실을 입증한다.
CRISPR/Cas9 시스템의 효율을 증가시키기 위해 그리고 형질전환 단계의 수를 2(상기 실시예에서와 같음)로부터 1까지 감소시키기 위해, 2개의 변형을 추가로 도입하였다. 제1 변형은 cas9 유전자의 틈내기 효소 형태의 사용이다. 제2 변형은 단일 플라스미드 상에서 모두 3개의 CRISPR/Cas9 성분(틈내기 효소 cas9, gRNA 카세트 및 상동성 아암)의 조립체였다.
Cas9 뉴클레아제는 2개의 엔도뉴클레아제 도메인, RuvC 및 HNH으로 이루어진다. 위치-10에서의 아스파르트산의 RuvC 도메인에서 알라닌(D10A)으로의 돌연변이에 의해, 돌연변이체 cas9는 야생형 cas9 효소에 의해 도입되는 이중 가닥 파손보다는 단일 가닥 파손을 야기하는 틈내기 효소 활성만을 보유하는 것으로 알려져 있다(Jinek, Science, 337: 816-821, 2012).
pLZipl12-cas9에서 D10A 돌연변이는 AscI 부위에서 2,3-bdh-gRNA-T1의 조립체 및 PmeI 부위 사이의 상동성 아암에 후속적으로 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 도입하였다. 얻어진 플라스미드, pLZipl12-D10A-all3(도 4)은 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693 내로 도입한 후에, 틈내기 효소 Cas9 발현을 유도하고 2,3-bdh 유전자 결실에 대해 선별하였다. 유전자 결실 효율은 실시예 3에서 관찰된 것과 유사하였다. 이 설계에 의해, 형질전환 단계 및 가공 시간은 추가로 감소되었다.
본 명세서에서 인용되는 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 참고로 포함되는 것으로 개별적으로 그리고 구체적으로 표시되며 그의 전문이 본 명세서에 제시되는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에서 임의의 선행기술에 대한 언급은 선행 기술이 임의의 국가에서 노력 중인 분야의 통상적인 일반적 지식의 부분을 형성한다는 인정으로서 취해지지 않으며, 취해져서도 안 된다.
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본 발명의 바람직한 실시형태는 본 명세서에 기재된다. 해당 바람직한 실시형태의 변형은 앞서 언급한 설명을 읽을 때 당업자에게 분명하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 적절한 경우 이러한 변형을 사용하는 것을 예상하며, 본 발명자들은 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과 다르게 본 발명이 실행될 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법에 의해 허용된다면 본 명세서에 첨부된 청구 범위에 인용된 대상의 모든 변형 및 동등물을 포함한다. 게다가, 본 명세서에 달리 표시되지 않는다면 또는 문맥에 의해 달리 분명하게 모순되지 않는 다면 이의 모든 가능한 변형에서 상기 기재한 구성요소의 임의의 조합이 본 발명에 의해 포함된다.
Claims (18)
- C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법으로서, 표적 서열을 포함하는 DNA 분자를 함유하는 C1-고정 박테리아 내로 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된, 비천연 유래의 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문구조 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats: CRISPR)/CRISPR-연관(Cas)(CRISPR/Cas) 시스템을 도입하는 단계를 포함하는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법:
(a) 상기 표적 서열과 혼성화되는 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
(b) 유도성 프로모터의 제어 하에 II형 Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열. - 제1항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 시스템은, 상기 하나 이상의 벡터 상에서,
(c) 상기 표적 서열의 상류에서 혼성화되는 5' 상동성 아암(arm) 및 상기 표적 서열의 하류에서 혼성화되는 3' 상동성 아암을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함함으로써, 상기 5' 상동성 아암 및 상기 3' 상동성 아암은 상기 DNA 분자와 혼성화되고, 상동성 재조합이 일어나서, 상기 5' 상동성 아암과 상기 3' 상동성 아암 사이에 위치된 DNA로 상기 표적 서열의 대체를 야기하는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cas9는 촉매적으로 활성인, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cas9는 틈내기 효소(nickase) Cas9인, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 Cas9는 촉매적으로 비활성인, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cas9는 유전자를 암호화하는 영역에서 상기 DNA 분자를 절단함으로써, 상기 유전자의 발현이 감소되는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 Cas9는 유전자를 암호화하는 영역에서 상기 DNA 분자를 차단함으로써, 상기 유전자의 발현이 감소되는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 5' 상동성 아암과 상기 3' 상동성 아암 사이에 위치된 상기 DNA는 유전자를 암호화하는 영역에서 상기 DNA 분자를 붕괴시킴으로써, 상기 유전자의 발현이 감소되는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 5' 상동성 아암과 상기 3' 상동성 아암 사이에 위치된 상기 DNA는 외인성 유전자를 암호화함으로써, 상기 상동성 재조합이 상기 DNA 분자 내로 상기 외인성 유전자를 삽입하는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 C1-고정 박테리아는 상기 외인성 유전자를 발현시키는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항에 있어서, (a) 및 (b)는 동일한 벡터 상에 또는 상이한 벡터 상에 위치되는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제2항에 있어서, (a), (b) 및 (c)는 동일한 벡터 상에 또는 상이한 벡터 상에 위치되는, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 시스템은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 또는 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)로부터 유래된, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 테트라사이클린 유도성 프로모터 또는 락토스 유도성 프로모터인, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 테트라사이클린 유도성 프로모터는 tet3no 또는 ipl12인, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 C1-고정 박테리아는 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 박키(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 뷰티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리듐 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 무렐라 써마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박터 프펜니기(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides) 및 써모아나에로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)로 이루어진 군으로부터 선택된, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 C1-고정 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 융달리 또는 클로스트리듐 라그스달레이인, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 C1-고정 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔인, C1-고정 박테리아의 유전자 조작 방법.
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