KR20180099427A - 생체 스트레스 진단용 항원의 제조방법, 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법, 생체 스트레스 진단용 조성물 및 진단용 키트 - Google Patents
생체 스트레스 진단용 항원의 제조방법, 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법, 생체 스트레스 진단용 조성물 및 진단용 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 스트레스를 받았을 때 유비퀴틴 단백질과 결합한 리보솜 단백질S3을 감지하는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항원을 제조하는 생체 스트레스 진단용 항원의 제조방법, 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법, 생체 스트레스 진단용 조성물 및 생체 스트레스 진단용 조성물을 제안한다. 상기 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법은 스트레스를 받아 변형된 리보솜 단백질 S3을 검출하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는 방법으로, 항원의 제조단계, 면역력 생성단계 및 생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계를 수행한다.
Description
본 발명은 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 특히, 생체가 스트레스를 받을 때에는 리보솜을 구성하는 리보솜 단백질 S3의 라이신 잔기에 유비퀴틴 단백질이 결합함으로써 단백질의 변형(리보솜 단백질 S3의 모노 유비퀴틴화)이 일어나게 되어 세포의 단백질 합성을 멈춘다는 많은 연구 결과를 이용하는 것으로, 스트레스를 받았을 때 유비퀴틴 단백질과 결합한 리보솜 단백질S3을 감지하는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항원을 이용하여 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
리보솜(ribosome)은 생체의 모든 단백질을 생합성(biosynthesis)하며 에너지를 가장 많이 소비하는 세포소기관(organelle)이다. 인간 및 미생물에 있어서 리보솜은 개체가 성장할 때 생체 에너지의 80% 정도를 소비할 만큼 중요한 기관이다. 스트레스 발생시 생체는 리보솜을 이용한 단백질의 합성을 중단하고, 이 때 단백질 합성에 사용하지 않은 생체 에너지를 스트레스를 극복하는데 사용함으로써 한정된 생체 에너지를 효과적으로 이용하도록 작동한다.
ribosomal protein S3(이하 리보솜 단백질 S3)은 리보솜의 구성요소이며 DNA 손상시 이를 감지하고 복구하는 효소로 알려져 있다. 최근에 이러한 기능 이외에 생체 스트레스에 반응하는 다양한 부가적 기능들과 관련된 리보솜 단백질 S3의 역할에 대해서 밝혀지고 있다. 여기서 다양한 부가적 기능으로는, 예를 들면, DNA 복구, 암 전이(metastasis), 세포 사멸(apoptosis) 및 면역반응에 있어서의 전사 등이 있다.
76~121개의 아미노산으로 구성된 단백질(protein)인 유비퀴틴(ubiquitin)이나 NEDD8(Neural precursor cell Expressed, Developmentally Down-regulated-8) 및 SUMO-1(Small Ubiquitin-related MOdifier-1)과 같은 유비퀴틴 유사 단백질들(ubiquitin-like proteins)에 의해 리보솜 단백질 S3의 생리활성이 조절된다는 연구결과가 보고되고 있다. (Herhaus L, Dikic I. 2015, Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16(9):1071-83)
리보솜 단백질 S3은 단백질 합성 저해제(protein synthesis inhibitor)인 액티노마이신 D(actinomycin D) 또는 시스테인 단백질 가수분해효소 억제자(cysteine protease inhibitor)의 일종인 MG132를 처리한 세포주(cell lilne)의 인(nucleolus)에서 NEDD8에 의해 변형이 이루어지는데, 이러한 네딜화(neddylation)는 리보솜 단백질 S3의 핵에서 분해와 연결되어 있을 가능성이 있다고 보고 되었다. (Xirodimas DP, Sundqvist A, Nakamura A, Shen L, Botting C, Hay RT. 2008, Ribosomal proteins are targets for the NEDD8 pathway. EMBO Rep. 9(3):280-286)
리보솜 단백질 S3은 필수 아미노산 중 하나인 Lys18(라이신 18), Lys214, 혹은 Lys230 잔기(residue)에 SUMO-1에 의한 단백질 변형이 이루어지는데, 이러한 수모화(sumoylation)는 리보솜 단백질 S3의 안정성을 증가시키는 것으로 알려졌다. (Jang CY, Shin HS, Kim HD, Kim JW, Choi SY, Kim J. 2011, Ribosomal protein S3 is stabilized by sumoylation. Biochem Biophys Res Commun. 414(3):523-237)
리보솜 단백질 S3의 유비퀴틴화(ubiquitylation)는 아래와 같이 폴리 유비퀴틴화(poly-ubiquitylation) 및 모노 유비퀴틴화(mono-ubiquitylation)로 구분할 수 있다.
프로테아좀 의존성 분해(proteasome-dependent degradation)를 유도하는 리보솜 단백질 S3의 폴리 유비퀴틴화는 세포 내 단백질인 Hsp90(Heat-shock-protein 90)이 리보솜 단백질 S3와 결합하는 것이 방해되었을 때 발생한다. 리보솜 단백질 S3의 폴리 유비퀴틴화 즉 리보솜 단백질 S3의 분해는 결국 리보솜 구성성분들의 세포 내 유지에 중요한 메커니즘임이 밝혀졌다. (Kim TS, Jang CY, Kim HD, Lee JY, Ahn BY, Kim J. 2006, Interaction of Hsp90 with ribosomal proteins protects from ubiquitination and proteasome-dependent degradation. Mol Biol Cell. 17(2):824-833)
생체가 스트레스를 받았을 때 발생하는 리보솜 단백질 S3의 모노 유비퀴틴화는 단백질의 라이신 214(Lys214) 잔기에 단백질 변형(모노 유비퀴틴 단백질의 결합)이 이루어지는 것이며, 이러한 단백질 변형은 리보솜의 단백질 생합성 단계 중 신장 단계(elongation)를 멈추게 하므로 단백질 합성을 중지시키는데 매우 중요한 역할을 한다. 리보솜 단백질 S3의 라이신 214(Lys214) 잔기를 돌연변이화하여 모노 유비퀴틴화가 될 수 없도록 한때에는 단백질 합성이 중단되지 않아 리보솜에서 잘못된 단백질 생합성의 생성을 유도하게 만들어 세포사멸(apoptosis)을 촉진하게 된다. 따라서 세포 내 리보솜 단백질 S3의 모노 유비퀴틴화는 리보솜의 항상성을 유지하는 중요 기작임을 알 수 있다. (Higgins R, Gendron JM, Rising L, Mak R, Webb K, Kaiser SE, Zuzow N, Riviere P, Yang B, Fenech E, Tang X, Lindsay SA, Christianson JC, Hampton RY, Wasserman SA, Bennett EJ. 2015, The Unfolded Protein Response Triggers Site-Specific Regulatory Ubiquitylation of 40S Ribosomal Proteins. Mol Cell. 59(1):35-49)
본 발명이 해결하고자 하는 제1 기술적 과제는, 스트레스를 받았을 때 유비퀴틴 단백질과 결합한 리보솜 단백질S3을 감지하는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항원을 제조하는 생체 스트레스 진단용 항원의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 제2 기술적 과제는, 상기 생체 스트레스 진단용 항원을 이용하여 스트레스를 받았을 때 유비퀴틴 단백질과 결합한 리보솜 단백질S3과 특이적으로 결합하는 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 제3 기술적 과제는 스트레스 진단용 항체를 포함하는 생체 스트레스 진단용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 제4 기술적 과제는 상기 생체 스트레스 진단용 항체를 포함하는 생체 스트레스 진단용 키트를 제공하는 것에 있다.
상기 제1 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명에 따른 생체 스트레스 진단용 항원의 제조방법은, 스트레스를 받아 변형된 리보솜 단백질 S3을 검출하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 L자형 펩타이드 항원을 제조하는 방법으로, 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신 잔기부터 218 잔기까지 펩타이드를 합성한 후, 상기 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신의 입실론 아미노기에 유비퀴틴 단백질의 카복실 말단에 위치하는 글라이신을 포함하는 6개의 잔기를 아이소펩타이드 결합하여 L자형 펩타이드 항원을 제조한다.
상기 제2 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명에 따른 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법은 스트레스를 받아 변형된 리보솜 단백질 S3을 검출하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는 방법으로, 항원의 제조단계, 면역력 생성단계 및 생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계를 수행한다. 상기 항원의 제조단계에서는 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신 잔기부터 218 잔기까지 펩타이드를 합성한 후, 상기 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신의 입실론 아미노기에 유비퀴틴 단백질의 카복실 말단에 위치하는 글라이신을 포함하는 6개의 잔기를 아이소펩타이드 결합하여 L자형 펩타이드 항원을 제조한다. 상기 면역력 생성단계에서는 상기 항원의 제조단계에서 생성한 L자형 펩타이드 항원을 토끼에 복수회 접종하여 항원에 대한 면역력을 강화한다. 상기 생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계에서는 상기 면역력 생성단계를 거친 토끼의 혈장을 이용하여 상기 생체 스트레스 진단용 항체를 제조한다.
상기 제3 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명에 따른 생체 스트레스 진단용 조성물은 제2항의 제조방법에 따라 생성된 생체 스트레스 진단용 항체를 이용하여 제조된 것이다.
상기 제4 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명에 따른 생체 스트레스 진단용 키트는 청구항 제2항의 제조방법에 따라 생성된 생체 스트레스 진단용 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 생체 스트레스 진단용 항원을 이용하여 조성한 생체 스트레스 진단용 항체, 조성물 및 키트를 활용하면, 사람은 물론 효모와 같은 미생물에 이르기까지 진핵생물의 생체 스트레스 및 생체 스트레스의 정도를 매우 간편하고 정확하게 측정할 수 있어, 환자의 구두 진료로부터는 확인할 수 없을 수도 있는 생체 스트레스의 조기 진단 및 치료에 활용할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법을 설명한다.
도 2는 리보솜 단백질 S3 인식용 항체를 제조하는 방법을 나타낸다.
도 3은 항원을 이용하여 생산된 항체를 L자형 펩타이드 항원 혹은 T자형 펩타이드 항원을 이용하여 생산된 항체를 친화도 순수분리 정제를 위하여 Affi-Gel 10 레진에 고정할 GST-rpS3 단백질을 발현시키기 위한 사람 rpS3 전체 단백질 코딩 유전자 발현 플라스미드 유전자 지도이다.
도 4는 모노 유비퀴틴화된 리보솜 단백질 S3 형상의 펩타이드에 대한 항원을 나타낸다.
도 5는 사람, 캔디나 및 효모의 리보솜 단백질 S3 아미노산 및 유비퀴틴 아미노산 부분을 비교한 것이다.
도 6은 2종류의 항체를 사용하였을 때의 시간별 샘플에 대한 웨스턴 블로팅 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 효모 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법에 대해 설명한다.
도 8은 효모 생체 스트레스 진단용 항체를 이용하여 효모에 대한 수행한 웨스턴 블로팅 실험결과이다.
도 9는 효모에 다양한 스트레스를 준 상태에서의 수행한 웨스턴 블로팅 실험결과이다.
도 10은 효모 리보솜 단백질 항체의 유비퀴틴 결합실험결과를 나타낸다.
도 2는 리보솜 단백질 S3 인식용 항체를 제조하는 방법을 나타낸다.
도 3은 항원을 이용하여 생산된 항체를 L자형 펩타이드 항원 혹은 T자형 펩타이드 항원을 이용하여 생산된 항체를 친화도 순수분리 정제를 위하여 Affi-Gel 10 레진에 고정할 GST-rpS3 단백질을 발현시키기 위한 사람 rpS3 전체 단백질 코딩 유전자 발현 플라스미드 유전자 지도이다.
도 4는 모노 유비퀴틴화된 리보솜 단백질 S3 형상의 펩타이드에 대한 항원을 나타낸다.
도 5는 사람, 캔디나 및 효모의 리보솜 단백질 S3 아미노산 및 유비퀴틴 아미노산 부분을 비교한 것이다.
도 6은 2종류의 항체를 사용하였을 때의 시간별 샘플에 대한 웨스턴 블로팅 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 효모 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법에 대해 설명한다.
도 8은 효모 생체 스트레스 진단용 항체를 이용하여 효모에 대한 수행한 웨스턴 블로팅 실험결과이다.
도 9는 효모에 다양한 스트레스를 준 상태에서의 수행한 웨스턴 블로팅 실험결과이다.
도 10은 효모 리보솜 단백질 항체의 유비퀴틴 결합실험결과를 나타낸다.
본 발명과 본 발명의 동작상의 이점 및 본 발명의 실시에 의하여 달성되는 목적을 충분히 이해하기 위해서는 본 발명의 예시적인 실시 예를 설명하는 첨부 도면 및 첨부 도면에 기재된 내용을 참조하여야만 한다.
이하 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 설명함으로써, 본 발명을 상세히 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조부호는 동일한 부재를 나타낸다.
본 발명의 핵심 아이디어는, 생체가 스트레스를 받을 때에는 리보솜을 구성하는 리보솜 단백질 S3의 라이신 잔기(residue)에 유비퀴틴 단백질이 결합함으로써 단백질의 변형(리보솜 단백질 S3의 모노 유비퀴틴화)이 일어나게 되어 세포의 단백질 합성을 멈춘다는 많은 연구 결과를 이용하는 것으로, 스트레스를 받았을 때 유비퀴틴 단백질과 결합한 리보솜 단백질S3을 감지하는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항원을 제조하는 방법, 생체 스트레스 진단용 항원을 이용하여 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는 방법, 및 생체 스트레스 진단용 항체를 포함하는 생체 스트레스 진단용 조성물을 제공한다.
이하의 설명에서는, 생체 스트레스 진단용 항체를 인간 생체 스트레스 진단용 항체 및 미생물 생체 스트레스 진단용 항체로 구분한다. 인간 생체 진단용 항체는 모노 유비퀴틴화된 인간 리보솜 단백질 S3에 특이 반응을 보이는 항체이고, 미생물 생체 스트레스 진단용 항체는, 효모를 미생물의 예로 선별하였을 때, 모노 유비퀴틴화된 효모 리보솜 단백질 S3에 특이 반응을 보이는 항체이다.
도 1은 본 발명에 따른 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법을 설명한다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법은, 항원의 제조단계(110), 면역력 생성단계(120) 및 생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계(130)를 수행한다.
항원의 제조단계(110)에서는 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신 잔기(residue)부터 218 잔기까지 펩타이드(K-D-E-I-L)를 합성한 후, 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신(Lys214)의 입실론 아미노기(ε-amino group)에 유비퀴틴 단백질의 카복실 말단에 위치하는 글라이신(G)을 포함하는 6개의 잔기(G-G-R-L-R-L)를 아이소펩타이드 결합(iso-peptide bond)하여 L자형 펩타이드 항원을 제조한다.
면역력 생성단계(120)에서는 항원의 제조단계(110)에서 생성한 L자형 펩타이드 항원을 토끼에 복수회 접종하여 항원에 대한 면역을 강화한다. 본 발명의 실험에서는 약 2주령인 체중 1.8~2㎏의 토끼의 정맥에 농도가 800㎍/㎖인 L자형 펩타이드 항원 1㎖를 1차로 투입하였고(1차 접종), 1차 접종 2주 후에 농도가 400㎍/㎖인 L자형 펩타이드 항원 1㎖를 2차 투입하였으며(2차 접종), 2차 접종 3주 후에 농도가 400㎍/㎖인 L자형 펩타이드 항원 1㎖를 3차 투입하였다(3차 접종). 3차 투입 때로부터 7일 이후에 토끼의 면역은 완료되었음을 확인하였다.
생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계(130)에서는 혈장의 채취단계(131), 배양단계(132), 중화단계(133) 및 항체분리단계(134)를 수행한다.
혈장의 채취단계(131)에서는 면역력 생성단계(120)에서 면역이 완료된 토끼로부터 혈장을 채취한다. 실험에서는 마리당 약 5㎖를 채취하였다.
배양단계(incubation step, 132)에서는 L자형 펩타이드 항원 5㎖를 4℃의 PBS(Phosphate Buffer Saline) 1ℓ에 녹인다. PBS는 생리 식염액만으로는 그 생명을 오래 유지할 수 없는 조직의 부유액으로 이용되는 물질이다. L자형 펩타이드 항원 및 PBS의 혼합액을 Affi-Gel 10 레진(Bio-Rad, Cat. #1536099, 염기성 단백질에 대해 활성화된 친화성 크로마토그래피 매질) 1㎖와 반응시켜 각각의 펩타이드(L자형 펩타이드 항원 & T자형 펩타이드 항원)가 고정된 레진을 제조한 후, 면역이 완료된 토끼의 혈장 10㎖를 고정된 레진에 섞은 후 pH 7.5 상태에서 16시간 동안 배양한다.
상기의 설명에서는 L자형 펩타이드 항원만을 사용하는 실시 예에 대해서 설명하였지만, T자형 펩타이드 항원을 사용하는 실시 예도 가능하며, 상기의 설명에서 L자형 펩타이드 항원을 T자형 펩타이드 항원으로 대체하면 설명이 가능하다. L자형 펩타이드 항원 및 T자형 펩타이드 항원에 대해서는 후술한다.
중화단계(133)에서는 배양단계(132)를 거친 용액을 용리액(elution buffer)에 통과시켜 펩타이드 항체를 정제한 후, 1M(Mole) pH 9.0의 TRIS 버퍼를 이용하여 중화시킨다. 여기서 TRIS 버퍼는 생물학적 용액에 사용하는 완충재의 일종을 의미한다.
항체분리단계(134)에서는 각각의 펩타이드 항원 즉 L자형 혹은 T자형 펩타이드 항원에 특이적으로 결합하는 항체만을 최종 분리하였다.
도 1에 도시된 방식으로 제조한 생체 스트레스 진단용 항체는 아래와 같은 실험을 통해 그 효과를 확인하였다. 다만, 실험의 비교를 위해 아래에 설명하는 것과 같은 전체 리보솜 단백질 S3를 인식하는데 사용할 리보솜 단백질 S3 인식용 항체를 더 생성하였다. 실험은 생체의 전체 리보솜 단백질 S3의 양과 이들 중 변형이 일어난 리보솜 단백질 S3을 비교하는 것이다.
도 2는 리보솜 단백질 S3 인식용 항체를 제조하는 방법을 나타낸다.
도 2를 참조하면, 변형되지 않은 본래의 리보솜 단백질 S3를 인식하는데 사용되는 리보솜 단백질 S3 인식용 항체의 제조방법(200)은, 발현단계(210), 융합 단백질 정제단계(220) 및 면역력 강화단계(230)를 수행한다.
발현단계(210)에서는 인간 리보솜 단백질 S3을 6xHis로 표지시킨 후 대장균에서 발현시킨다. 여기서 6xHis는 단백질 내 최소 6개 이상의 히스티딘 잔기(residue)로 구성된 아미노산 모티프이다.
융합 단백질 정제단계(220)에서는 발현단계(210)를 거친 인간 리보솜 단백질 S3을 니켈-니트릴로트리아세트산 한천 레진(Nickel_NTA agarose resin)을 이용하여 분리 정제한다.
도 3은 항원을 이용하여 생산된 항체를 L자형 펩타이드 항원 혹은 T자형 펩타이드 항원을 이용하여 생산된 항체를 친화도 순수분리 정제를 위하여 Affi-Gel 10 레진에 고정할 GST-rpS3 단백질을 발현시키기 위한 사람 rpS3 전체 단백질 코딩 유전자 발현 플라스미드 유전자 지도이다.
도 3을 참조하면, pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia Biotech Cat. #27-4584-01) 벡터의 MCS 중 EcoRI 및 SalI을 이용하여, 리보솜 단백질 S3(rpS3)의 코딩 유전자를 융합, GST 단백질과 융합된 GST-rpS3 융합 재조합 단백질 발현용 플라스미드 pGEX-5X-1-rpS3를 제조한다는 것을 알 수 있다. 플라스미드를 BL-21 세균주에 형질전환시킨 수 후술하는 효모 항원의 제조과정과 동일한 과정을 통해 GST-rpS3 재조합 단백질을 발현시킨 후, 이를 GST-sepharose 4B 레진(GE Healthcare Life Sciences, Cat. 17075601)에 세포 용해액을 흘려 넣어 GST-rpS3 단백질을 회수하여 정제하였다.
면역력 강화단계(230)에서는 융합 단백질 정제단계(220)에서 분리 정제된 융합 단백질 즉 6xHis 리보솜 단백질 S3을 약 2주령의 토끼 정맥에 주사하여 리보솜 단백질 S3 인식용 항체를 생성한다. 구체적으로는, 융합 단백질 정제단계(220)를 거친 GST-rpS3을 Affi-Gel 10 레진(Bio-Rad, Cat. #1536099)와 반응시켜 GST-Rps3가 고정된 레진을 제작한 후, 여기에 면역화시킨 토끼에서 채혈한 혈장을 통과시킨 후 항체 용리액(elution buffer: 100mM Glycine-HCl pH2.4, 150mM NaClm 4oC)를 2분간(two minutes) 반응시켜 Rps3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체만을 분리하였다.
도 4는 모노 유비퀴틴화된 리보솜 단백질 S3 형상의 펩타이드에 대한 항원을 나타낸다.
도 4a는 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신 잔기에 유비퀴틴이 결합한 L자형 폴리 펩타이드 항원(immunogen)을 나타내고, 도 4b는 T자형 펩타이드 항원을 나타낸다.
단백질의 최소단위인 펩타이드(peptide)는 두 분자 이상의 아미노산 중 하나의 아미노산의 카르복실기(-COOH)와 이웃하는 다른 하나의 아미노산의 아미노기(NH2)가 탈수 결합하여 -CONH- 결합을 형성하여 생긴 화합물로, 다수의 아미노산 분자가 연속하여 결합한 것을 폴리펩타이드(poly-peptide)라 한다.
도 5는 사람, 캔디나 및 효모의 리보솜 단백질 S3 아미노산 및 유비퀴틴 아미노산 부분을 비교한 것이다.
도 5a는 캔디나(Ca), 효모(Sc) 및 사람(human)의 리보솜 단백질 S3의 전체 아미노산 시퀀스 (sequence)를 나타내고, 도 5b는 사람, 캔디나 및 효모의 유비퀴틴의 전체 아미노산 시퀀스를 나타낸다.
도 5a에 표시된 사각 박스는 L자형 아미노산 중 리보솜 단백질 S3 아미노산의 일부를 나타내며, 도 5b에 표시된 사각 박스는 L자형 아미노산 중 유비퀴틴 아미노산의 일부를 나타낸다.
L자형 펩타이드(도 5a 및 도 5b의 사각 박스 참조)는 T자형 펩타이드에 비해 짧기 때문에 먼저 만들어졌는데, 도 4a에 도시된 L자형 펩타이드는 도 4b에 도시된 T자형 폴리 펩타이드를 기본으로 하여 만든 항원 펩타이드로써, 인간 리보솜 단백질 S3(Genbank EAW74963.1)의 214번 라이신 잔기부터 218 잔기까지 펩타이드(K-D-E-I-L)를 합성한 후, 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신(Lys214)의 입실론 아미노기(ε-amino group)에 유비퀴틴 단백질의 카복실 말단에 위치하는 글라이신(G)을 포함하는 6개의 잔기(G-G-R-L-R-L, 도 5b의 사각박스 참조)를 아이소펩타이드 결합(iso-peptide bond)하는 과정을 거쳐 완성된 것이다.
도 4a에 도시된 L자형 펩타이드는, C-터미널 L 아미노산으로부터 N-터미널 K 잔기를 합성한 후, 잔기 214 라이신과 유비퀴틴의 글리신 잔기에 대해 아이소펩타이드 결합을 수행함으로써 얻어진다.
T자형 펩타이드는, 인간 리보솜 단백질 S3로부터 추출한 223 이소류신 잔기의 C-터미널로부터 209 세린 잔기의 N-터미널까지 합성한 후, 도 4b 및 도 5에 도시된 바와 같이, 유비퀴틴의 글리신 잔기가 아이소펩타이드 결합함으로써 생성될 수 있다.
도 4a와 도 4b를 비교하면 도 4b에 도시된 L자형 펩타이드 항원은 도 4a에 도시된 T자형 펩타이드의 일부(파란색 사각형 참고)에 대응된다는 것을 알 수 있다.
도 1에 도시된 과정을 통해 생성된 생체 스트레스 진단용 항체 및 도 2에 도시된 과정을 통해 생성된 리보솜 단백질 S3 인식용 항체가 도 4a 및 도 4b에 도시한 유비퀴틴이 결합된 리보솜 단백질 S3을 인식하는가 하는 것을 확인하기 위해 웨스턴 블로팅(western blotting)실험을 수행하였다. 단백질흡입법이라고도 하는 웨스턴 블로팅은, 전기영동으로 분리한 단백질을 소수성 막에 고정하고, 특이적 항체를 사용하는 목적으로 단백질을 검출하는 방법이다.
스트레스원(stress source)으로 자외선(UV 150 J/㎡)을 인간 세포주인 HT1080에 조사하면서 시간별로 일정량씩 수확하고, 수확한 각각의 세포를 단백질분해효소 억제제(protease inhibitors)가 포함된 Tris-NaCL-sodium deoxycholate 완충용액(TND buffer)에 넣고 용해시켰다. 용해된 세포 즉 세포 용해물(cell lysate) 5㎍에 대해 웨스턴 블로팅 실험을 수행하였다.
도 6은 2종류의 항체를 사용하였을 때의 시간별 샘플에 대한 웨스턴 블로팅 실험 결과를 나타낸다.
도 6a는 2종류의 항체 즉 리보솜 단백질 S3 인식용 항체(Anti-rpS3)의 검출결과(30kDa & 35kDa) 및 생체 스트레스 진단용 항체(Anti-monoUb rpS3)의 검출결과(35kDa)를 각각 표시하였다.
도 6a를 참조하면, 리보솜 단백질 S3 인식용 항체(Anti-rpS3)에 대한 실험결과는 하부의 전체 리보솜 단백질 S3 검출신호(30kDa)와 상부의 검출신호(35kDa) 2개의 신호가 검출되었다. 생체 스트레스 진단용 항체(Anti-monoUb rpS3)의 검출결과(35kDa)는 리보솜 단백질 S3 인식용 항체(Anti-rpS3)의 검출결과(30kDa & 35kDa) 중 상부에 위치하는 검출결과(35kDa)와 거의 동일한 양상을 가진다는 것을 알 수 있다.
도 6b는 세포 내의 인간 리보솜 단백질 S3 유전자의 214번 잔기를 라이신 대신 아르지닌(혹은 아르기닌)으로 치환시킨 돌연변이 단백질(Flag-rpS3 K214R) 즉 융합단백질을 발현하는 플라스미드(plasmid)를 이용하여 수행한 형질주입(transfection) 실험결과를 나타낸다. 플라스미드는 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있다.
도 6b를 참조하면, HT1080세포주에 Flag-rpS3 wild type과 rpS3의 214번 라이신을 아르지닌으로 치환한 돌연변이 Flag-rpS3 K214R를 만들어 형질주입시켰고, 형질주입 이틀 후 150J/m2의 UV(자외선)을 조사한 다음 웨스턴 블러팅으로 확인하였다. FLAG에 대한 항체(Anti-FLAG)로 확인한 결과 외인성(exogenous) Flag-rpS3 융합단백질은 Flag 단백질이 2kDa이므로 Anti-monoUb rpS3(37kDa)는 wild type(좌측) 에서만 나타남을 알 수 있었다. rpS3 항체(Anti-rpS3)로 확인하였을 때 외인성 rpS3의 Anti-monoUb rpS3(35kDa)는 양쪽에서 나타나지만 외인성 Flag-rpS3 K214R의 Anti-monoUb rpS3(37kDa)는 Flag-rpS3 wild type에서만 나타남을 알 수 있다. 이러한 양상은 제작한 rpS3 monoUb 항체(Anti-monoUv rpS3)의 경우와 동일하게 나타났다. 따라서 rpS3 monoUb 항체(Anti-monoUv rpS3)는 rpS3의 214번 lysine에 특이적으로 결합하는 mono Ubiquitination만을 감지한다는 사실을 알 수 있었다.
도 6에는 도시하지 않았지만, 인간 세포주인 HT1080 세포에 Cycloheximide, Deoxynivalenol, Anisomycin, Blasticidin S, Pactamycin 및 Emetine 등 다양한 스트레스를 처리한 결과도 자외선 처리 후 나온 결과와 동일했다.
상기의 설명은 인간 리보솜 단백질 S3의 항체에 대한 웨스턴 블로팅 실험결과이고, 이하에서는 미생물 중 효모 리보솜 단백질 S3의 항체에 대한 웨스턴 블로팅 실험결과에 대해서 설명한다.
도 7은 효모 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법에 대해 설명한다.
도 7을 참조하면, 효모 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법(600)은 효모항원의 제조단계(610), 면역력 생성단계(620) 및 효모항체의 정제단계(630)를 수행한다.
효모항원의 제조단계(610)에서는 pET-21a(Merck Millipore-Novagen Cat. #69740)의 다중 클로닝 부위(MCS) 중 BamHI - XhoI 제한효소 부위를 사용하여, 효모 Rps3p(ribosomal protein small subunit 3, Genbank accession number Z71454 Y13139)의 전체 단백질 코딩 유전자(723bp)를 삽입하여 6개의 히스티딘 아미노산(6xHis)이 표지된 전체 길이(full-length)의 Rps3 단백질을 발현시킬 수 있는 플라스미드를 구축한다.
플라스미드를 E. coli 계통의 단백질표현용 세균주 BL-21(Amersham Pharmacia Biotech, Cat. #27-1542-01)에 형질전환(transformation)하여 유전자재조합 세균을 제조한 후, 재조합 세균을 LB(Lysogeny broth) 액체배지 내에서 37℃의 온도에서 3시간 동안 배양한 후, 0.1mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 배지에서 강하게 유도(induction)한 후 30℃의 온도에서 l3시간 배양하였다.
이렇게 배양한 세균을 초음파분산기(sonicator)를 사용하여 세포벽과 세포막을 분해하였다. 6xHis 표지와 강하게 결합하는 성질을 가진 니켈-니트릴로트리아세트산 한천 레진(Nickel-NTA agarose resin)에 흘려 넣어 6xHis 표지된 Rps3 단백질이 니켈 이온을 통해 한천 레진에 결합하도록 하였다.
Rps3 단백질이 결합된 레진을 레진 부피의 20배 양의 세척액으로 세척하여 불특정한 단백질을 제거한 후, 이미다졸(Imidazol)이 첨가된 용출 용액(Elution buffer)을 주입하여 융합된 단백질을 레진에서 회수하였다. 이를 다시 셀룰로오스 반투막을 통한 투석(dialysis) 정제를 거쳐 이미다졸을 제거한 후, 최종적으로 얻어진 6xHis-Rps3 융합단백질의 농도는 1㎎/㎖에 달했다.
항체 제작을 위해서 면역력 생성단계(620)에서는 융합 단백질 정제단계(220)를 거친 His-Rps3 융합 단백질을 약 20주령의 토끼에 정맥 주사하였고, 1차 접종 2주 후 2차 접종을, 그 후 3주 후 다시 3차 접종하여 면역을 증강하였다.
도 7b에 나타낸 바와 같이, pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia Biotech Cat. #27-4584-01) 벡터의 MCS 중 EcoRI 및 SalI을 이용하여, Rps3의 코딩 유전자를 융합, GST 단백질과 융합된 GST-Rps3 융합 재조합 단백질 발현용 플라스미드 pGEX-5X-1-Rps3를 제조하였다. 상기 플라스미드를 BL-21 세균주에 형질전환시킨 후 효모항원의 제조단계(610)와 동일한 방법으로 GST-rpS3 재조합 단백질을 발현시킨 후, 이를 GST-sepharose 4B 레진(GE Healthcare Life Sciences, Cat. 17075601)에 세포 용해액을 흘려 넣어 GST-Rps3 단백질을 회수하여 정제하였다.
정제한 GST-Rps3 단백질을 Affi-Gel 10 레진(Bio-Rad, Cat. #1536099)과 반응시켜 GST-Rps3가 고정된 레진을 제작하고, 여기에 면역화시킨 토끼에서 채혈한 혈장을 통과시킨 후 항체 용리액(elution buffer: 100mM Glycine-HCl pH2.4, 150mM NaClm 4oC)를 2분간 반응시켜 Rps3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체만을 분리하였다. 도 1에 도시된 과정을 통해 생성된 다클론 항체가 도 4a 및 도 4b에 도시한 유비퀴틴이 결합된 리보솜 단백질 S3를 특이적으로 인식하는가 하는 것을 아래와 같은 모노 유비퀴틴 항체를 이용한 인간 세포에 대한 웨스턴 블로팅 실험을 수행하였다.
스트레스원(stress source)으로 자외선(UV 150 J/㎡)을 인간 세포주인 HT1080에 조사하면서 시간별로 일정량씩 수확하고, 수확한 각각의 세포를 단백질분해효소 억제제(protease inhibitors)가 포함된 Tris-NaCL-sodium deoxycholate 완충용액(TND buffer)에 넣고 용해시켰다. 용해된 세포 즉 세포 용해물(cell lysate) 5㎍에 대해 웨스턴 블로팅 실험을 수행하였다.
도 8은 효모 생체 스트레스 진단용 항체를 이용하여 효모에 대한 수행한 웨스턴 블로팅 실험결과이다.
도 8을 참조하면, 효모 생체 스트레스 진단용 항체가 인간(homo sapiens)의 리보솜 단백질, 캔디다(candida albicans) 및 효모(saccharomyces cerevisiae) 단백질을 인식하는지 여부를 웨스턴 블로팅 실험을 통해 확인한 결과, 효모 다클론 항체는 인간(homo sapiens)의 단백질은 인식할 수 없으나, 캔디다(candida albicans) 및 효모(saccharomyces cerevisiae) 단백질은 인식할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
도 9는 효모에 다양한 스트레스를 준 상태에서의 수행한 웨스턴 블로팅 실험결과이다.
도 9a는 스트레스 원으로 3-AT(3-Amino-1,2,4-triazole)를 사용한 경우, 도 9b는 스트레스 원으로 Rapamycin(B)를 사용한 경우 그리고 도 8c는 스트레스 원으로 자외선(C)을 사용한 경우이다. 도 8에 도시된 것과 같이 다양한 스트레스를 주고 수확한 후, 각각의 세포를 단백질 분해효소 억제제가 포함된 Tris-Nacl-NP40 완충용액(TAP lysis buffer)과 유리구슬(glass bead)을 넣고 구슬 분쇄기(bead beater)를 이용하여 세포를 용해시켰고, 여기서 얻은 세포 용해물 10㎍의 단백질을 가지고 두 가지 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅 실험을 수행하였다.
도 9를 참조하면, 효모의 전체 리보솜 단백질 S3을 인식하는 항체(Anti-Rps3)를 이용하여 검출한 2개의 신호(30kDa & 35kDa)가 상하로 도시되어 있다. 다음으로 효모 다클론 항체(Anti-monoUb Rps3)를 사용한 경우에 검출된 신호(35kDa)는 효모의 전체 리보솜 단백질 S3을 인식하는 항체(Anti-Rps3)를 이용하여 검출한 2개의 신호 중 상부에 있는 신호(35kDa)와 동일한 양상으로 나타났다는 것을 확인하였다.
도 10은 효모 리보솜 단백질 항체의 유비퀴틴 결합실험결과를 나타낸다.
도 10을 참조하면, 인간 리보솜 단백질 S3(rpS3)의 214번 라이신은 효모 리보솜 단백질 S3(yeast ribosomal protein S3, Rps3) 단백질에서 212번 라이신에 해당하므로, 실제 효모 리보솜 단백질 S3의 212번 라이신에 유비퀴틴이 붙는지를 확인하고자 하였다.
이를 위해 효모 리보솜 단백질 S3(Rps3)의 212번 라이신을 알지닌(혹 아르기닌)(arginine)으로 치환시켜 생체 내에서 유비퀴틴이 붙을 수 없는 돌연변이를 제작하였다. 실험 결과, 돌연변이 효모 세포의 Rps3 단백질은 효모 다클론 항체로 인식되지 않고, 또한 모노 유비퀴틴 특이 항체로도 35kDa의 밴드가 나타나지 않음을 알 수 있었다. 대조군으로 사용된 효모(Pgk1p)는 모든 조건에는 같은 양이 나타나므로, 사용된 전체 단백질의 양은 같은 양이 사용되었음을 알 수 있다. 따라서, 효모 Rps3p 단백질 212번 라이신에 유비퀴틴이 결합됨을 알 수 있었다.
상술한 생체 스트레스 진단용 항체를 이용하여 제조되는 생체 스트레스 진단용 조성물 및 상술한 생체 스트레스 진단용 항체를 포함하는 생체 스트레스 진단용 키트를 제조하는 것은 이 분야의 통상의 기술을 가진 사람들에게는 어려운 일이 아니므로 여기서는 그 과정을 자세하게 설명하지 않는다.
이상에서는 본 발명에 대한 기술사상을 첨부 도면과 함께 서술하였지만 이는 본 발명의 바람직한 실시 예를 예시적으로 설명한 것이지 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 기술자라면 누구나 본 발명의 기술적 사상의 범주를 이탈하지 않는 범위 내에서 다양한 변형 및 모방 가능함은 명백한 사실이다.
110: 항원의 제조단계
120: 면역력 생성단계
130: 생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계
210: 발현단계
220: 융합단백질 정제단계
230: 면역력 강화단계
120: 면역력 생성단계
130: 생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계
210: 발현단계
220: 융합단백질 정제단계
230: 면역력 강화단계
Claims (5)
- 스트레스를 받아 변형된 리보솜 단백질 S3을 검출하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 L자형 펩타이드 항원을 제조하는 방법에 있어서,
리보솜 단백질 S3의 214번 라이신 잔기부터 218 잔기까지 펩타이드를 합성한 후, 상기 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신의 입실론 아미노기에 유비퀴틴 단백질의 카복실 말단에 위치하는 글라이신을 포함하는 6개의 잔기를 아이소펩타이드 결합하여 L자형 펩타이드 항원을 제조하는 것을 특징으로 하는 생체 스트레스 진단용 항원의 제조방법. - 스트레스를 받아 변형된 리보솜 단백질 S3을 검출하는데 사용되는 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는 방법에 있어서,
리보솜 단백질 S3의 214번 라이신 잔기부터 218 잔기까지 펩타이드를 합성한 후, 상기 리보솜 단백질 S3의 214번 라이신의 입실론 아미노기에 유비퀴틴 단백질의 카복실 말단에 위치하는 글라이신을 포함하는 6개의 잔기를 아이소펩타이드 결합하여 L자형 펩타이드 항원을 제조하는 항원의 제조단계;
상기 항원의 제조단계에서 생성한 L자형 펩타이드 항원을 토끼에 복수회 접종하여 항원에 대한 면역을 강화하는 면역력 생성단계; 및
상기 면역력 생성단계를 거친 토끼의 혈장을 이용하여 상기 생체 스트레스 진단용 항체를 제조하는 생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계; 를
수행하는 것을 특징으로 하는 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법. - 제2항에서, 상기 생체 스트레스 진단용 항체의 정제단계는,
상기 면역력 생성단계에서 면역이 완료된 토끼로부터 혈장을 채취하는 혈장의 채취단계;
상기 항원의 제조단계에서 생성한 상기 L자형 펩타이드 항원을 4℃의 PBS에 녹여 상기 L자형 펩타이드 항원 및 PBS의 혼합액을 생성하고, 상기 혼합액을 Affi-Gel 10 레진과 반응시켜 상기 L자형 펩타이드 항원이 고정된 레진을 제조하고, 면역이 완료된 토끼의 혈장을 상기 고정된 레진과 섞은 후 pH 7.5 상태에서 16시간 동안 배양하는 배양단계;
상기 배양단계를 거친 용액을 용리액에 통과시켜 펩타이드 항체를 정제한 후, 1M, pH 9.0의 TRIS 버퍼를 이용하여 중화시키는 중화단계; 및
상기 중화단계를 거친 후 상기 L자형 펩타이드 항원에 특이적으로 결합하는 상기 생체 스트레스 진단용 항체를 최종적으로 분리하는 항체분리단계; 를
수행하는 것을 특징으로 하는 생체 스트레스 진단용 항체의 제조방법. - 제2항의 제조방법에 따라 생성된 생체 스트레스 진단용 항체를 이용하여 제조된 생체 스트레스 진단용 조성물.
- 제2항의 제조방법에 따라 생성된 생체 스트레스 진단용 항체를 포함하는 생체 스트레스 진단용 키트.
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| KR20200127550A (ko) * | 2019-05-03 | 2020-11-11 | 부경대학교 산학협력단 | Wap65를 이용한 어류의 건강도 평가 |
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| KR20050055165A (ko) * | 2003-12-05 | 2005-06-13 | 학교법인 한림대학교 | 리보솜 단백질 ｓ3의 단일클론 항체 |
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| Molecular & cellular proteomics 15, 2016, 2576-2593. * |
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