KR20180092641A

KR20180092641A - 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 구심성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20180092641A
Application number: KR1020170018629A
Authority: KR
Inventors: 오우택; 홍규상; 이병준
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2018-08-20
Anticipated expiration: 2037-02-10
Also published as: KR102068290B1; WO2018147518A1

Abstract

본 발명은 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 구심성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로써, 구체적으로는 기계감각적(mechanosensitive) 채널 단백질의 구성요소인 텐토닌 3(Tentonin3, TTN3)을 억제하였을 때, 기계감각적 전류가 감소되고, 마우스의 근방추감각신경의 활성이 크게 감소되며 마우스의 혈압과 맥박이 크게 감소되는 것을 확인함으로써, 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 구심성 신경질환 및 저혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 구심성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of afferent nerve diseases comprising Tentonin 3 and use thereof}

본 발명은 구심성 질환의 예방 또는 치료를 위한 텐토닌 3(Tentonin3, TTN3)의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

생리적 반응(Mechanosensation)이란 외부의 느낌 및 내부 기계감각적인 자극을 말하고, 동물의 생존을 위하여 필수적이다. 포유류에서, 촉각 및 압각 느낌, 고유수용감각 (propriocption), 및 통증의 인식을 위해서는 생리적 반응이 요구된다. 추가적으로, 청력, 신체 발란스, 압수용기(baroreceptor) 반사작용, 혈관의 근육 활동, 및 신장에서 혈액량조절과 같은 생리적 기능들은 기계 감각적인 자극의 감지를 요구한다. 촉각 자극은 인식 또는 물체 잡기, 보행, 다른 사람과 소통, 음식 먹기 외에 심지어 모성간호와 같은 일상생활에서도 필수적이다. 촉각 자극은 신경 신호로 변환되고 주요한 구심성 신경을 통하여 척수로 전달되는, 메이스너 소체(Meissner corpuscles), 메르켈원반(Merkel disks), 루피니 말단(Ruffini endings), 파씨니안 소체(Paccinian corpuscles), 및 털의 모낭에 있는 다른 종말기관과 같은 피부에 있는 특정화된 종말기관에 의해 검출된다.

상기 피부의 기계수용체(mechanoreceptors)는 지연된 기계감각적인 자극에 대해 이들의 반응에 의존하는, 낮고 높은 한계 기계수용체(threshold mechanoreceptors), 또는 빠르고 느리게 적응하는 수용체(receptors)로 나뉜다. 따라서, 기계수용체의 형태, 피부 위치, 및 민감도 또는 적응 성질은 각각의 촉각들에 대하여 매우 다양방식들의 반응을 나타낼 수 있다

촉각 자극에 민감한 이온 채널은 기계감각적으로 활성화된 (mechanically activated (MA))전류를 매개하는 것으로 알려졌다. 최근 밝혀진 기계채널인 기계수용채널 채널(mechanosensitive channel, MscL)은 박테리아에서 삼투압 밸브로서 기능하는 기계수용 전류를 생성하며, DEG/ENaC 및 NOMPC 패밀리는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 및 초파리(Drosophila melanogaster)의 기계 감각 신경(mechanosensory neurons)에서 기계변환 채널의 구성요소로 작용하고 있다.

상기 채널들은 그동안 포유류에서 발견되지 않았으나, 최근 피에조 1 및 2(Piezo 1 및 2)가 포유류에서 새롭게 발견되었으며, 이 채널은 기계감각적 자극에 의해 열리며 열린 후 곧 바로 닫히는 특성을 지닌 것으로 알려졌다. 이들은 후근신경절(dorsal-root ganglion(DRG)) 신경세포 및 메르켈 세포(Merkel cell)에 발현하고, 또한 피에조 2(Piezo2)의 유전자 결손이 이들 세포에서 기계감각적 자극에 반응하는 전류 중 빠르게 적응(rapidly adapting (RA))하는 MA 전류를 크게 감소시키기 때문에 피에조2는 RA 타입 기계채널로 여겨지며 특히, 피에조2는 피부 촉각에 중요한 낮은 역치(threshold)의 기계감각적 자극에 반응하는 이온채널로 알려져 있어 촉각에 중요한 기계채널로 여겨지고 있다. 이 외에, 피에조 1(Piezo 1)은 혈관 생성에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

그러나 DRG 신경세포는 기계감각적 자극에 대해 다양한 전류의 반응을 보인다. 이들은 활성 후 빠르게, 느리게, 또는 중간으로 비활성화하는 양이온 전류를 보이는데, 이는 서로 다른 기계채널들이 존재함을 의미한다. 이 중 DRG신경세포에서 피에조 2(Piezo 2)는 활성 후 빠르게 비활성화(적응)하는 기계전류에 관여하듯, 피에조 2와는 별개의 이온 채널이 존재할 가능성이 매우 크다.

한편, 고유수용감각(혹은 고유감각, proprioception)은 삼차 공간에서 근육의 위치나 움직임을 느끼는 감각이며 이는 운동이나 자세 및 미세한 근육운동에 필수적인 근육들의 상호조절(coordination)에 필수적이다(Akay et al., 2014; de Nooij et al., 2015; Proske and Gandevia, 2012). 고유감각은 근육과 피부 및 관절로부터의 감각정보가 필요하며 이 중 근방추(muscle spindle, MS)로부터의 감각신호가 가장 중요하다. 이러한 근방추감각신경은 근육이 수축할 때 일어나는 근육의 신장에 매우 민감하고 또한 이 근방추감각신경에 존재하는 기계채널들이 이러한 움직임을 감지하여 중추신경계에 보내므로, 근육신장에 대한 근방추감각신경의 기계채널 반응은 우리 몸의 근육조절에 필수적 신호라고 할 수 있다.

또한, 혈압조절은 혈압을 바람직한 수치로 유지하기 위한 신체작용으로 순환계 대사 유지의 필수 장치로, 경동맥 및 대동맥 등의 신경에 존재하는 압력수용기에 의해서 이루어진다. 이러한 압력수용기로부터의 구심성 섬유를 포함한 혈압조절신경들이 혈압을 조절하는 역할을 담당하고 있어 혈압수용기(baroreceptor)의 혈압조절반사 반응 역시 생명유지에 매우 필수적이다.

이에, 본 발명자들은 피에조 1(Piezo 1) 및 피에조 2(Piezo 2) 이외에 인간세포에서 다른 기계감각적으로 활성화된(mechanically activated(MA)) 채널을 발굴하기 위하여 노력한 결과, 느리게 반응하는(slowly adapting, SA) 채널인 텐토닌 3(Tentonin 3, TTN3)를 발견하였고, 마우스의 텐토닌 3를 억제하였을 때, 근육들의 상호조절(coordination)이 억제 되고, 평균혈압 및 맥박수(heart rate)가 정상 마우스 대비 현저히 낮아짐을 확인함으로써, 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 구심성 신경질환 및 저혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 구심성 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 텐토닌 3(Tentonin 3, TTN3)의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 텐토닌 3(Tentonin 3, TTN3)의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검물질을 텐토닌 3 유전자를 발현하는 세포에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 텐토닌 3 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 텐토닌 3 유전자의 발현 수준이 무처리 대조군에 비해 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 저혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 텐토닌 3를 억제하였을 때, 기계감각적 전류가 감소되고, 마우스의 근방추감각신경의 활성이 크게 감소되며 마우스의 혈압과 맥박이 크게 감소되는 것을 확인함으로써, 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 구심성 신경질환 및 저혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 TMHMM 프로그램에 의해 예상되는 TTN3의 추정되는 위상을 나타낸 도이다. 각각의 점은 마우스 TTN3의 아미노산을 대표한다.
도 2는 척추동물(phylum Chordata)의 상이한 종 사이에서 TTN3 유전자 패밀리의 계통발생 트리(Phylogenetic tree)를 나타낸 도이다. 서열 정렬 및 계통수를 CLUSTALW 프로그램을 사용하여 나타냈다. Cm, Chelonia mydas ; Dr, Danio reiro ; Fc, Felis catus ; Gg , Gallus gallus ; Hs , Homo sapiens; Mm, Mus musculus ; Rn , rattus norvegicus ; Xt , Xenopus tropicalis .
도 3은 TTN3 유전자의 mRNA 프로파일을 나타낸 도이다. 정량적 PCR을 21개의 어른 마우스 기관(organs)으로부터 수행하였다. 발현 수준을 GAPDH의 mRNA 수준으로 정규화(nomalized)하였다.
도 4는 안티센스(왼쪽, 갈색 점) 및 센스(오른쪽) 가닥을 사용하여 DRG 신경에서 현장 혼성화(in situ hybridization)를 나타낸 도이다. 현장 혼성화 후에, 단면을 신경사상체(neurofilament) M (NFM) 항체(pink)로 면역 염색하였다.
도 5는 총 DRG 신경 중에서 TTN3-양성(positive) 신경이 차지하는 비율 및 TTN3-양성 신경 중 마커인 신경사상체 M(neurofilament M, NFM+)이 차지하는 비율을 함께 나타낸 도이다.
도 6은 텐토닌 3(이하 TTN3)가 느린 비활성 동역학으로 MA 전류를 유도하는 것으로, Ttn3 - 및 Gfp -형질을 도입한 HEK293T 세포에서 기계감각적인 자극에 의해 활성화된 전류를 나타낸 도이다. 홀셀(whole cell)을 형성한 후에, 600 ms동안 기계감각적 자극을 주었으며, -60 mV에서 전압을 고정(holding potential)하였다.
도 7은 Ttn1 - 및 Ttn2 - 을 도입한 HEK293T 세포에서 기계감각적인 자극에 의해 활성화된 전류를 나타낸 도이다. 홀셀(whole cell)을 형성한 후에, 600 ms동안 기계감각적 자극을 주었으며, -60 mV에서 전압을 고정(holding potential)하였다.
도 8은 Ttn3 - 및 Gfp -형질을 도입한 HeLa 세포에서 기계감각적인 자극에 의해 활성화된 전류를 나타낸 도이다. 홀셀(whole cell)을 형성한 후에, 600 ms동안 기계감각적 자극을 주었으며, -60 mV에서 전압을 고정(holding potential)하였다.
도 9는 Ttn1 -, Ttn2 -, Ttn3 -, 및 Gfp-형질을 도입한 HEK293T 및 HeLa 세포에서 기계감각적 자극에 의해 활성화된 MA 전류의 평균 피크 진폭(amplitude)을 나타낸 도이다. 바(Bars)는 S.E.M를 나타내며, 괄호 안에는 테스트된 세포의 수를 나타낸다.
도 10은 F11, HEK293T, 및 HeLa 세포에서 측정된 전류의 피크 (I_MAX) 및 정지상태(steady state)의 전류 (I_SS)사이의 비율을 나타낸 도이다. 정지상태(steady state)의 전류를 600 ms에서 측정하였다.
도 11은 Ttn3 -, Gfp -, 및 siRNA(Scrmble) 형질을 도입하여 분화된 F11 세포에서 측정된 MA 전류와, 이들 세포에서의 텐토닌 3(TTN3) 유전자 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 12는 Ttn3 -, Gfp -, 및 siRNA(Scrmble) 형질을 도입하여 분화되지 않은 F11 세포에서 측정된 MA 전류를 나타낸 도이다.
도 13은 siRNA(Scrmble), Ttn3 - 및 Ttn3-siRNA 형질을 도입하여 분화된 F11 세포에서 기계감각적 자극에 의해 활성화된 MA 전류의 평균 피크 진폭을 나타낸 도이다.
도 14는 MA 전류(I)를 기계감각적인 자극의 이동(displacement)에 의해 활성화된 최대 피크 전류 (I_MAX)로 평준화한 결과를 나타낸 도이다. 기계감각적 자극을 600 ms 동안 적용하였으며, 이동(displacement)은 세포 표면으로부터 기계감각적 자극의 거리를 나타낸다. 평준화된 전류를 I/Imax (%) = [(1+exp(-(D-D₁ _/2)/k))-1]에 의해 주어진 Boltzmann equation으로 최적화하였다. 상기 D는 지나간(indentation) 거리를 나타내고 D₁ _/2은 최대 이동거리의 절반값을 의미하며, k는 흔적자국(indentation)에 대한 반응 민감도이다. 붉은색 점(Red dots)은 D₁ _/2s의 평균값을 나타낸다.
도 15는 TTN3의 결핍(knockdown)이 DRG 신경에서 SA MA 전류를 억제함을 나타낸 도로써, siRNA(Scrmble) 및 Ttn3-siRNA 형질이 도입된 DRG 신경에서 MA 전류의 한 유형을 나타낸 도이다. DRG 신경은 100 ms 동안 0.42 μm 증가되는 기계감각적 자극에 의해서 자극되었다.
도 16은 siRNA(Scrmble) 및 Ttn3-siRNA 형질이 도입된 DRG 신경에서 MA 전류의 또 다른 유형을 나타낸 도이다.
도 17은 siRNA(Scrmble) 및 Ttn3-siRNA 형질이 도입된 DRG 신경에서 MA 전류의 다른 하나의 유형을 나타낸 도이다. DRG 신경은 600 ms 동안 0.84 μm 증가되는 기계감각적 자극에 의해서 자극되었다.
도 18은 siRNA(Scrmble) 및 Ttn3-siRNA가 형질 도입된 DRG 신경(28 PCR 사이클, 형질 도입 후 48시간)에서의 TTN3의 유전자 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 19는 siRNA(Scrmble) 또는 Ttn3-siRNA를 형질 도입한 후에 6.3 μm 기계감각적 자극에 의해서 활성화된 DRG 신경의 피크 전류를 나타낸 도이다. DRG 신경을 MA 전류의 비활성 동역학으로 분류하였으며, RA, IA, 및 SA MA 전류에 대한 비활성 시간 상수 (τi)은 각각 < 10 ms, 10 < τi < 30 ms, 및 > 30 ms이었다.
도 20은 siRNA(Scrmble) 또는 Ttn3-siRNA가 형질 도입된 DRG 신경의 세포유형 히스토그램을 나타낸 도이다.
도 21은 TTN3가 DRG 신경의 SA MA 전류의 생물리학적(biophysical) 특성을 따르는 것을 나타낸 도로써, Ttn3가 형질 도입된 F11 세포에서 기계감각적 자극이 지속되는 동안 정지상태(steady state)의 전류가 1000ms까지 유지된 것을 나타낸 도이다. 별표는 기계감각적 자극의 말단에서의 정지상태 전류를 나타낸다.
도 22는 18 및 66 μm/s 두 가지 속도를 갖는 기계감각적 자극에 의해 활성화된 TTN3 발현 세포에서의 MA 전류를 나타낸 도이다.
도 23은 Ttn3가 형질 도입된 세포의 MA 전류 상의 컨디셔닝(conditioning) 자극의 영향을 나타낸 도이다. 100 ms 동안 0.42㎛의 증가 및 2.9 - 4.6 ㎛의 자국(indentations)을 갖는 기계감각적 자극을 적용하고, 4.6 ㎛의 자극을 갖는 테스트 펄스를 수행하였다.
도 24는 컨디셔닝 및 테스트 자극에 의해 유도된 피크 및 정지상태(steady state)에서의 전류를 나타낸 도이다. 피크 또는 정지상태의 전류(I)를 최대 피크(I_MAX) 또는 정지상태의 전류 (I_SS)로 평준화하였다(normalized).
도 25는 Ttn3가 형질 도입된 HeLa 세포에서 기록한 MA 전류를 나타낸 도이다.
도 26은 상이한 조성을 갖는 피펫(pipet) 용액 조건에서 측정된, TTN3가 발현된 F11 세포에서의 정지상태(steady state) MA 전류의 전류-전압(I-V) 상호관계를 나타낸 도이다. 전압 ramp(-80 ~ +80 mV)를 600 ms, 4.2 ㎛ 기계감각적 자극 동안 적용하였다. 피펫 용액에는 150 mM CsCl을 포함하고 배스(bath) 용액은 150 mM NaCl, 150 mM KCl, 100 mM CaCl₂ 또는 100 mM MgCl₂를 포함하였다.
도 27은 TTN3가 발현된 F11 세포의 정지(안정)상태(steady state)에서의 MA 전류의 이온 투과성 비율(P_X/P_Cs)을 나타낸 도이다.
도 28은 TTN3가 관여하는 MA 전류의 약학적 프로파일을 나타낸 도로써, F11 세포에서 30 μM의 가돌리니움(gadolinium, Gd ³⁺)에 의해 억제되는 TTN3 관여- MA 전류를 나타낸 도이다. 기계감각적인 자극을 반복하였으며, 각각의 억제제는 두 번째 기계감각적 자극 전에 1 분간 처리하였고 복구 전류(recovery currents)를 위하여 세척하였다.
도 29는 F11 세포에서 30 μM의 FM1-43 에 의해 억제되는 TTN3 관여- MA 전류를 나타낸 도이다. 기계감각적인 자극을 반복하였으며, 각각의 억제제는 두 번째 기계감각적 자극 전에 1 분간 처리하였고 복구 전류(recovery currents)를 위하여 세척하였다.
도 30은 F11 세포에서 2.5 μM의 GsMTx4에 의해 억제되는 TTN3 관여- MA 전류를 나타낸 도이다. 기계감각적인 자극을 반복하였으며, 각각의 억제제는 두 번째 기계감각적 자극 전에 1 분간 처리하였고 복구 전류(recovery currents)를 위하여 세척하였다.
도 31은 TTN3 관여- MA 전류를 억제하는 Gd³ ⁺ 의 Gd³ ⁺ 농도-반응 상호관계를 나타낸 도이다(IC₅₀ = 3.9 μM, n = 7 - 8).
도 32는 TTN3 관여 - MA 전류 상에서 50 μM 클로로프로마진(chloropromazine (CPZ)), 10 μM HC-030031, 1 mM 아밀로라드(amiloride), 30 μM 루테니움 레드(ruthenium red (RR)), 30 μM 가돌리니움(gadolinium (Gd)), 30 μM FM1-43 및 2.5 μM GsMTx4의 효과를 나타낸 도이다.
도 33은 pEGFP-N1(STOP)-TTN1 또는 pEGFP-N1이 형질 도입되어 있는 HEK(HEK293T)과 F11 세포의 원형질막 상의 TTN3의 위치를 나타낸 도이다. 세포는 Hoechst33342로 염색되었다.
도 34는 TTM3 MA 전류의 비활성 비율이 단일(mono)- 또는 이중지수(bi-exponential)곡선과 잘 부합함을 나타내는 도이다:
a: 비활성 비율이 단일지수곡선(mono-exponential curve)과 잘 부합함을 보이는 F11세포에서의 TTM3 MA 전류를 나타낸 도;
b: HEK293T와 F11 세포에서 발현된 TTN3의 비활성 시간 상수(τi)의 분포를 나타낸 도이다. 괄호 안에는 테스트된 세포의 수를 나타낸 도;
c: 비활성 비율이 이중지수곡선(bi-exponential curve)과 잘 부합함을 보이는 F11세포에서의 TTM3 MA 전류를 나타낸 도; 및
d: HEK293T, HeLa 및 F11 세포에의 TTN3의 비활성 시간 상수(τ1 과 τ2)의 분포를 나타낸 도.
도 35는 정상(WT)마우스의 뒷다리 근육의 장지신근(extensor digitorum longus, EDL)의 근방추 중심영역에 TTN3가 풍부하게 위치하고 있음을 보이고, TTN3 녹아웃(knockout) 마우스에서 신장-유도성 신경방전의 활동과 근신장에 대한 민감도가 감소되어 있음을 나타낸 도이다:
a: 마우스의 뒷다리 근육의 장지신근(extensor digitorum longus, EDL)의 근방추 사진
b: 근방추의 중심영역에서의 TTN3 및 neurofilament M의 분포를 나타낸 도;
c: 고리나선신경말단(annulospiral structures)에서의 TTN3 및 neuro-
filament M의 분포를 나타낸 도;
d: 근육 신장-유도성 신경방전의 활동을 나타낸 도; 및
e: 근신장 범위(1-3mm)의 전반에서 관측된 근방추에서의 구심성 활성을 나타낸 도.
도 36은 거꾸로 매달려 버티기, 평균대 횡단 테스트, 보행 족적 분석 등의 실험을 통해 TTN3 녹아웃(knockout) 마우스의 운동 조절(motor coordination)능력이 감소되어 있음을 나타낸 도이다:
a: inverted screen test;
b: beam walking test;
c: average speed;
d: swing speed;
e: stride length;
f: regularity index; 및
g: phase dispersion.
도 37은 TTN3 녹아웃(knockout) 마우스의 평균혈압과 맥박수(심박동수)를 측정하여 TTN3 녹아웃(knockout) 마우스의 혈압과 맥박이 감소되어 있음을 나타낸 도이다:
a: 대조군(정상) 마우스 대비 TTN3 녹아웃 마우스에서 혈압(blood pressure)측정 결과; 및
b: 대조군(정상) 마우스 대비 TTN3 녹아웃 마우스에서 맥박(heart rate) 측정결과.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 텐토닌 3 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되고, 기계감각적 자극에 의해 활성화되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 텐토닌 3의 위상, 계통발생 계통수 및 조직 분포를 확인한 결과, 각각 인간 및 래트 오솔로그(orthologs)의 96% 및 99% 아미노산 서열 유사성을 가짐을 확인하였고(도 2 참조), 부고환(epididymis), 췌장(pancreas), DRG, 안구, 뇌, 및 척수에서 높은 발현을 나타냄을 확인하였다(도 3 참조). 그리고 텐토닌 3의 현장 혼성화(In situ hybridization analysis) 및 마우스 조직에서 분포를 확인한 결과, DRG에서 약 1/3의 신경이 텐토닌 3에 대하여 양성인 것을 확인하였고(도 4 참조), 텐토닌 3를 포함하는 신경신경사상체 M(neurofilament M)와 같이 공동이동 함을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 293T세포에서 텐토닌 3의 활성을 측정한 결과, 강한 전류가 활성화됨을 확인하였고(도 6 참조), 600 ms 기계감각적인 자극에서 정지상태(steady state)의 전류는 TTN3/HEK293T 세포에서 피크 전류의 약 52.5%임을 확인하였다(도 10 참조). 또한, 형질 도입된 F11 세포에서 기계감각적 자극에 의한 텐토닌 3의 활성 측정을 측정한 결과, MA 전류를 유도함을 확인하였고(도 11 및 13 참조), 마우스로부터 유래된 DRG 세포에서 텐토닌 3가 어떤 유형의 전류에 필수적으로 작용하는지를 측정한 결과, SA(slow adapting)전류에 필수적임을 확인하였다(도 19 참조). 또한 텐토닌 3의 생물리학적(Biophysical) 특성을 확인한 결과, Ca² ⁺에 대해 높은 투과성을 가지는 양이온 채널임을 확인하였고, PCl/PNa가 0.13 ± 0.03 (n = 8)이므로, Cl^-에 대하여 상대적으로 높은 투과성을 가짐을 확인하였다(도 27 참조). 그리고 텐토닌 3의 채널 차단제들을 이용하여 MA 전류의 약학적 프로파일을 확인한 결과, MA 전류를 현저하게 억제함을 확인하였다(도 28, 29, 30 및 32 참조).

또한, 상기 구심성 신경은 체강과 내장 구심성(Somatic and visceral afferents), 시각적 구심성(Visual afferent), 후각(Olfaction), 청각적 구심성(Auditor afferents), 피질시상하부 구심성(Corticohypothalamic afferents), 해마시상하부 섬유(Hippocampohypothalamic fibers), 편도체시상하부 섬유(Amygdalohypothalamic fibers), 시상하부 섬유(Thalamohypothalamic fibers) 및 외피 섬유(Tegmental fibers)로부터 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

아울러, 여러 생리적 기능이 종합적으로 조절되는 중추인 시상하부는 구심성 신경섬유(Afferents to the hypothalamus)의 다양한 운동, 감각 및 여러 뇌 영역으로부터 신경입력을 받는데, 이와 관련하여, 구심성 신경활성에 관여하는 것으로 알려진 근방추는 근육의 길이변화를 감지하여 근육의 위치나 움직임을 파악하는 고유감각기능 조절에 필수적이어서, 운동조절(motor coordination)이나 미세 움직임 등에 관여한다. 이러한 고유감각기능은 근방추에 있는 근방추감각신경의 활성으로 시작되며 근육이 수축하거나 이완할 때 근방추신경이 근육의 길이변화를 감지하여 중추신경계에 보낸다. 따라서 근방추감각신경에 있는 기계채널들은 고유감각기능에도 필수적이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 텐토닌 3는 근방추 감각신경에 다량 발현되며(도 35a 참조), TTN3 녹아웃(knockout) 마우스는 근방추감각신경의 활성이 대조군보다 크게 억제되어 있음을 확인하였다(도 35d 및 e 참조). 또한 TTN3 녹아웃(knockout) 마우스의 운동조절 능력을 관찰한 결과, 대조군 대비 근육의 운동조절능력이 저하되어 있음을 확인하였다(도 36 참조).

또한, 본 발명은

상기 세포는 HeLa, HEK293T, F11, 인간 DRG, 망막색소상피(retinal pigment epithelium(RPE)), 인간 각질(keranocyte(HaCaT)), 간암세포 암종(HepG2) 및 인간 자궁 암종(SiHa) 세포로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상으로 선택될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

혈압조절은 carotid sinus나 대동맥, 심방 등에 존재하는 압수용기(baroreceptor)라는 혈압 측정 센서가 신호를 받아들여 혈압조절중추가 교감신경 및 부교감신경의 활성을 조절하게 되므로, 이러한 압수용기에 텐토닌 3와 같은 기계채널이 작용할 가능성이 높다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 텐토닌 3(TTN3) 녹아웃(knockout)마우스는 대조군 대비 평균혈압(mean arterial pressure)과 심박동수(heart rate)가 훨씬 적게 나타남을 확인하였다(도 37 참조).

따라서, 본 발명은 텐토닌 3(TTN3)가 느린 비활성 동역학을 갖는 기계감각적 자극에 의해 활성화되고, 마우스에서 직접 발현되어 있으며, 텐토닌 3를 차단제에 의해 억제시켰을 때 기계감각적 전류를 감소시키는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 텐토닌 3 결손 마우스에서 근방추 감각신경의 활성과 근육의 운동조절능력 및 혈압이 저하되어 있음을 확인함으로써, 본 발명의 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 구심성 신경질환 및 저혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량 %로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다.

바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사 가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> TTN 패밀리의 분자 클로닝 단계

TTN 유전자 패밀리(Ttn 1, 2, 및 3)의 단편을 구축하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 프라이머를 NCBI 데이타베이스(NM_144916.3, NM_177887, 및 NM_182841)로부터 Ttn1 , 2 및 3의 마우스 cDNA 서열을 사용하여 프라이머를 다자인하였다. Ttn1 , 2 및 3의 각각의 뉴클레오티드(Nucleotide) 단편의 816, 717, 및 750 bp를 어른 C57BL/6J 마우스의 신장, 작은 창자(small intestine), 및 부고환(epididymis)의 cDNA 라이브러리로부터 증폭하였다. 하기에 사용된 프라이머 서열을 나타냈다.

1) 제한 부위 XhoI 및 HindIII와 같이 Ttn1 정방향 (5' ctcgaggccaccatgaccgcct 3'; 서열번호 1) 및 Ttn1 역방향 (5' aagcttgatcatggcaatactctcgggag 3'; 서열번호 2);

2) 제한 부위 XhoI 및 KpnI와 같이 Ttn2 정방향 (5'ctcgaggccaccatgtggaattacct 3'; 서열번호 3) 및 Ttn2 역방향 (5' aagcttgagcacctgtgccatctgta 3'; 서열번호 4); 및

3) 제한 부위 XhoI 및 Kpn와 같이 Ttn3 정방향(5'ctcgaggccaccatggacgggaagaaat 3'; 서열번호 5) 및 Ttn3 역방향 (5' ggtaccctcacctgatccgtctgatattc 3'; 서열번호 6).

상기 Ttn 1, 2 및 3 단편을 pEGFP-N1으로 클론하였다.

전기생리학(electrophysiological) 기록을 위하여, 상기 유전자와 GFP 서열(pEGFP-N1 STOP) 사이에 종결 코돈(stop codon)을 포함시키기 위하여 추가적으로 벡터를 돌연변이시켰고, GFP 융합 효과를 피하기 위하여 상기 유전자를 pIRES2-AcGFP1로 서브클론시켰다(sub-cloned).

TTN 1의 단백질 서열은

MTAWILLPVSLSAFSITGIWTVYAMAVMNRHVCPVENWSYNESCSPDPAEQGGPKSCCTLDDVPLISKCGTYPPESCLFSLIGNMGAVMVALICLLRYGQLLEQSRHSWINTTALITGCTNAAGLVVVGNFQVDHAKSLHYIGTGVAFTAGLLFVCLHCVLFYHGATTPLDMAMAYLRSVLAVIAFITLVLSGVFFLHESSQLQHGAALCEWVFVLDILIFYGTFSYEFGTISSDTLVAALQPAPGRACKSSGSSSTSTHLNCAPESIAMI(서열번호 7) 이고,

TTN 2의 단백질 서열은

MWNYLSLLPVILFLWAIAGIWIVFAIAVVNGSVDLNEGFPFISICGSYAPQSCIFGQVLNIGAALTVWICIVRHHQLRDWGVKTWQNQLILWSGILCALGTSIVGNFQDKNQKPTHLAGAFLAFILGNLYFWLQFFLSWWVKGLPQPGPHWIKSLRLSLCSLSTILIVAMIVLHALHMRSASAICEWVVAMLLFMLFGFFAVDFSILRGCTLHLHPRLDSSLPQAPSGSPNIQMAQVL(서열번호 8)이며,

TTN3의 단백질 서열은

MDGKKCSVWMFLPLVFTLFTSAGLWIVYFIAVEDDKILPLNSAARKSGAKHAPYISFAGDDPPASCVFSQVMNMAAFLALVVAVLRFIQLKPKVLNPWLNISGLAALCLASFGMTLLGNFQLTNDEEIHNVGTSLTFGFGTLTCWIQAALTLKVNIKNEGRRAGIPRVILSAVITLCVVLYFILMAQDIHMYAARVQWGLVMCFLAYFGTLAVEFRHYRYEIVCSEYQENFLSFSESLSEASEYQTDQV(서열번호 9)이다.

< 실시예 2> 세포 배양 및 형질도입( transfection )

상기 <실시예 1>에서 제조된 벡터 및 siRNA를 형질 도입시키기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, HeLa, HEK293T, 및 F11 세포를 10% 소태아혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's modified Eagle(DMEM) 배지에서 배양하였다. 세포를 35 mm 디쉬(dish)에서 유리 커버슬립 상에 분주하였다.

F11 세포를 DRG-같은 세포로 분화(differentiation)를 유도하기 위하여 10 μM 포르스콜린(forskolin) (Sigma)로 처리하였다. 포르스콜린(forskolin)-처리된 F11 세포를 35 mm 디쉬에서 1% FBS, 2 mM L-글루타민, 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM이 있는 라민-코팅된(laminin-coated) (2 mg/ml) 유리 커버슬립 상에 분주하였다. 배지의 절반을 매 이틀마다 교체하였다.

pIRES2-AcGFP1-TTN1, pIRES2-AcGFP1-TTN2, pIRES2-AcGFP1-TTN3, pEGFP-N1(STOP)-TTN1, pEGFP-N1(STOP)-TTN2 또는 pEGFP-N1(STOP)-TTN3 벡터를 리포펙타민 2000 (Life Technologies) 또는 후진(FuGene) (Promega)으로 48 시간 동안 형질 도입하였다.

Ttn3 및 스크램블(scrambled)된 siRNA 세트를 디자인하고, 합성하고, Cy3 형광발광(fluorescence)(Bioneer, Seoul, Korea)으로 태그하였다. 상기 siRNA는 뉴클레오티드(Nucleotide) 421-439에 위치되었고 서열은 Tnt3_siRNA 센스 5'-GCUUGUGGAUAGUGUACUU (dTdT)-3'(서열번호 10) 및 안티센스 5'-CGAACTCCTATCACATGAA(dTdT)-3'(서열번호 11)이다. 배양된 DRG 세포에 Cy3가 태그된 siRNA를 리포펙타민 2000을 사용하여 형질 도입시켰으며 siRNA-처리된 세포는 사용하기 전에 48 내지 72 시간 동안 배양되었다.

< 실시예 3> 실시간 정량적 PCR

모든 조직을 C57BL/6J 야생형 마우스로부터 분리하였고 총 RNA 샘플을 총 RNA 추출 키트(Intron)를 사용하여 추출하였다. 첫째 가닥 cDNA를 GoScript 역방향 전사 키트 (Promega)를 사용하여 합성하였다. 템플레이트를 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 증폭하였고, ABI StepOne Plus 및 StepOne 실시간 시스템을 사용하여 2번씩(duplicate) 실행하였다. 생성물 보정(calibration) 및 표준화(normalization)를 2-사이클 한계(threshold) (Ct)방법을 사용하여 수행하였다. 여기서, Ct은 (Ct (표적 유전자) - Ct (reference 유전자))를 나타낸다.

다른 조직에서 mRNA 발현 분석을 위하여, GAPDH를 참조 유전자로서 사용하였으며, 하기의 프라이머가 사용되었다.

Ttn1: 5'-ggtcctacaatgaatcctgctc-3' (정방향)(서열번호 12),

5'-ggccaccataacagcaccc-3' (역방향)(서열번호 13);

Ttn2: 5'-tgtcctggtgggtgaaagg-3' (정방향)(서열번호 14),

5'-tcatagccacgatgaggatgg-3' (역방향)(서열번호 15);

Ttn3: 5'-cgtgtggatgtttctacctctc-3' (정방향)(서열번호 16),

5'-gcacccgatttccttgcag-3' (역방향)(서열번호 17); 및

GAPDH: 5'-aggtcggtgtgaacggatttg-3' (정방향)(서열번호 18),

5'-tgtagaccatgtagttgaggtca-3' (역방향)(서열번호 19).

< 실시예 4> 전기생리학( Electrophysiology )

홀셀(whole-cell) 전류를 패치 클램프의 전압고정(volatage-clamp)방식을 사용하여 기록하였다. 기가 실링(giga seals)이 형성된 후 유리 피펫(pipet) 하에서 원형질 막을 깨트려 홀셀(whole-cell)을 형성하였다. 유리 피펫전극의 저항은 2-3 MΩ이었다. 접합 포텐셜은 제로(zero)로 조정되었고, -60 mV에서 전압을 고정(holding potential)하였다. 전류를 Axopatch200B (Molecular Devices)로 증폭하였고, 0.5 kHz로 여과(filtered)되었고, Digidata 1440 (Molecular Devices)로 5 kHz의 샘플링 비율(sampling rate)에서 계수화(digitized)하였으며, 컴퓨터에 저장되었다. 저장된 전류는 pClamp 소프트웨어(version 10.0, Molecular Devices)을 사용하여 분석되었다.

세포에서 전류를 기록하기 위한 피펫 용액은 130 mM CsCl, 2 mM MgCl₂, 10 mM 히피스(HEPES), 2 mM Mg-ATP, 0.2 mM Na-GTP 및 25 mM D-만니톨을 포함하였고 pH는 CsOH를 사용하여 7.2로 맞추었다. DRG 뉴런(neuron) 기록을 위하여, 피펫 용액은 130 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA, 10 mM 헤페스, 2 mM Mg-ATP, 0.2 mM Na-GTP 및 20 mM D-만니톨을 포함하였고 pH는 KOH로 7.2로 맞추었다. 배스 용액(bath solution)은 NaOH로 조정된 pH 7.2에서 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM 히피스 및 10 mM D-만니톨을 포함하였다.

이온 선별 실험(ion selectivity)을 하기 위하여, 피펫 용액은 CsOH로 조정된 pH 7.2에서 150 mM CsCl 및 10 mM 헤페스를 포함하였다. 배스 용액은 150 mM NaCl, 150 mM KCl, 150 mM NMDG-Cl, 100 mM CaCl₂ 또는 100 mM MgCl₂ 및 10 mM 히피스를 포함하였다. pH는 2가 양이온(divalent cation) 용액을 위하여 NaOH, KOH 또는 CsOH를 사용하여 7.2로 맞추었다. 모든 용액의 삼투성(osmolarity)는 D-만니톨을 첨가하여 290 mOsm으로 조정되었다.

전류-전압(I-V)의 상호관계를 결정하기 위하여, -80부터 +80 mV까지의 전압 램프(voltage ramp)는 홀셀에 있어 600 ms 기계감각적인 자극 동안 150 ms가 적용되었다. 차단 실험(blocker experiments)을 위하여, 50 μM 클로로프로마진(chloropromazine)(Sigma), 10 μM HC-030031(Sigma), 1 mM 아밀로리드(amiloride) (Sigma), 30 μM 루테니움 레드(ruthenium red)(Sigma), 30 μM FM1-43(Biotium), 2.5 μM GsMTx-4(Tocris) 또는 30 μM GdCl₃(Sigma)를 배스 용액에 첨가하였다. Gd³ ⁺억제를 위한 선량-반응 커브(dose-responsive curve)를 얻기 위하여, 표준화된 전류 (I/I_MAX)를 힐 공식(Hill equation)으로 적용하였다.

I/I_MAX (%) = [1 + (K_D/[Gd³ ⁺])ⁿ]^-1

여기서 K_D는 Gd³ ⁺의 최대 효과의 절반값을 의미하고, n은 힐 계수(Hill coefficient)를 뜻한다.

< 실험예 1> TTN3 의 위상(topology), 계통발생(Phylogenetic) 계통수, 및 조직 분포 확인

<1-1> TTN3 의 위상, 계통발생 계통수 확인

TTN3의 위상, 계통발생 계통수, 및 조직 분포를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 계통발생(Phylogenetic) 분석을 위하여, 다수의 서열 정렬 및 계통발생(Phylogenetic) 계통수는 CLUSTALW 프로그램을 사용하여 수행되었다. 유전자 은행 인식번호(GenBank accession ID)를 하기의 표에 나타냈다.

단백질 Acc.	Gene	Organism
NP _001073975.1	Ttn3	H. sapiens	인간
NP _878261.1	Ttn3	M. musculus	마우스
NP _001101824.1	Ttn3	R. norvegicus	래트
XP_420558.4	Ttn3	G. gallus	닭(chicken)
XP_005155606.1	Ttn3	D. rerio	제브라피쉬( zebrafish )
XP_002936503.1	Ttn3	X. tropicalis	개구리(frog)
XP_007065696.1	Ttn3	C. mydas	거북이(turtle)
XP_003985286.1	Ttn3	F. catus	고양이(cat)
NP _001026908.1	Ttn1	H. sapiens	인간
NP _659165.1	Ttn1	M. musculus	마우스
NP _620807.1	Ttn1	R. norvegicus	래트
XP_421633.3	Ttn1	G. gallus	닭
NP _001038875.1	Ttn1	D. rerio	제브라피쉬
NP _001016894.1	Ttn1	X. tropicalis	개구리
XP_007069920.1	Ttn1	C. mydas	거북이
XP_003984259.1	Ttn1	F. catus	고양이
NP _001268940.1	Ttn2	H. sapiens	인간
NP _001136264.1	Ttn2	M. musculus	마우스
NP _001100946.1	Ttn2	R. norvegicus	래트
NP _001032458.1	Ttn2	D. rerio	제브라피쉬
NP _001015997.1	Ttn2	X. tropicalis	개구리
XP_003997471.1	Ttn2	F. catus	고양이

그 결과, TTN3의 위상(topology)은 짧은 N- 및 C- 말단을 가진 6개의 트랜스멤브레인 도메인을 가지는 것으로 예측되었고(도 1), 추정상 재진입 영역이 트랜스멤브레인 도메인 1과 2 사이에 위치하는 것으로 나타났다. Ttn 유전자는 동물 또는 식물의 하위 종족(lower phyla)에서는 발견되지 않았다(도 2). TTN3는 다른 2개의 파랄로그(paralogs)인 TTN1 및 TTN2와 26.5%와 28.1%의 서열 동일성을 가지며 덜 연관되는 것처럼 보이나, 반대로 TTN3는 각각 인간 및 래트 오솔로그(orthologs)의 96% 및 99%의 아미노산 서열 유사성을 가졌다. 21개 마우스 조직에서의 3개 Ttn 유전자의 정량적 PCR 분석은 각각 유전자에 대하여 상이한 발현 패턴을 나타냈으며(도 3), TTN3이 부고환(epididymis), 췌장(pancreas), DRG, 안구, 뇌 및 척수에서 높은 발현을 나타냄을 확인하였다.

<1-2> TTN3 의 현장 혼성화 분석 및 조직 분포 확인

TTN3의 현장 혼성화(in situ hybridization)분석 및 조직 분포를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 현장 혼성화 분석 및 면역형광분석을 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 어른 마우스 DRG를 절개하고 이소펜탄(isopentane)상에서 즉시 냉동하였다. 이들을 최적 절단 온도 화합물에 내장시켜 14 μm 절편(section)으로 연속 절편화하였다. Ttn3 mRNA 표적 프로브의 서열을 Advanced Cell Diagnostics (Hayward, CA)에서 제작하였고, 박테리아 유전자 dapB를 표적화하는 프로브는 대조군으로 사용하였다.

Ttn3 mRNA의 현장 혼성화(in situ hybridization)분석은 RNAscope 2.0 HD 검출 키트 (Brown)를 사용하여 급 냉동 절편화(sectioned)된 샘플 상에서 수행되었다. 조직절편(tissue section)을 30분 동안 50℃에서 건조시킨 후 15분 동안 4%의 파라포름알데하이드로 고정하였다. 조직절편을 5 분 동안 점진적으로 50%, 70% 및 100% 에탄올로 탈수화하였고 혼성화 전, 프로브 키트로 전처리하였다. 2 시간 동안 40℃에서 Ttn3 mRNA로 혼성화한 후에, 신호 증폭을 위해 RNAscope 2.0 HD 검출 키트를 사용하였다. 색원의 검출(Chromogenic detection)은 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 사용하여 수행되었고, 면역조직화학염색(Immunohistochemistry)은 신경사상체 M(neurofilament M)(NFM, 1:200, Santa Cruz)에 대한 일차 항체를 사용하여 수행되었다. Alexa 546-이 결합된 donkey anti-rabbit IgG을 30 분 (1:500)동안 처리하였고 절편은 3회 세척 후 표본고정(mount)되었다.

그 결과, DRG에서 약 1/3(849/2,690 신경)이 TTN3에 대하여 양성인 것을 확인하였다(도 4). 추가적으로, TTN3을 포함하는 신경(302/849 신경)의 약 36%가 유수신경세포(myelinated neuron)의 마커인 신경사상체 M(neurofilament M)와 같이 공동이동 함을 확인하였다(도 5).

< 실험예 2> MA 채널 스크리닝 및 유전자 동정

피에조(Piezo)1 및 2 이외의 다른 MA 채널을 찾기 위하여, 생물정보 조사를 수행하였다.

구체적으로, 인간 DRG 세포 및 6 개의 인간 세포주인 인간 배아 신장 (HEK)293T, HeLa, 망막색소상피(retinal pigment epithelium(RPE)), 인간 각질세포 (keranocyte(HaCaT)), 간암세포 암종(HepG2), 및 인간 자궁 암종(SiHa) 세포로부터 분리된 mRNA로 교배(hyb21ridization)한 후에 DNA 칩(Agilent)을 스크린하였다. 느리게 적응하는(slowly adapting) MA 채널은 DRG 뉴런(DRG neurons)에서 주로 발견되므로, 교배 강도가 DRG 세포 강도의 70% 보다 적은 6개의 세포주 유전자를 선택하였다.

추가적으로, 알려진 가능을 가진 유전자 또는 5개 미만의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 암호화하는 유전자를 선별하였고, 6개의 유전자인 Gdpd2, Sidt1 , Tmem26 , Tmem150c , Tmem163 및 Tmem229a으로 좁혔다. 성체 마우스로부터 분리된 DRG 신경으로 선별된 후보 유전자에 Cy3가 태그된 siRNA를 형질 도입시키고, 기계감각적 자극에 반응하는 SA 전류에서 감소를 나타내는지 여부를 테스트하였다.

그 결과, 하나의 유전자, TMEM150C의 결핍(knockdown)은 SA 전류의 진폭(amplitude)에서 현저한 감소를 나타냄을 확인하였다(도 19).

< 실험예 3> 기계감각적 자극(mechanical stimulation)에 의한 활성

<3-1> 형질 도입된 293T 세포에서 TTN3 의 활성 측정

텐토닌 3(Tentonin 3(TTN3))는 6개의 트랜스멤브레인 도메인을 가지고 있고, 249개의 아미노산을 가진 상대적으로 작은 단백질이다. 텐토닌 3를 HEK293T 세포에 과발현시켰을 때 원형질막으로 표적화되는 것을 알 수 있었다(도 33).

텐토닌 3의 기계감각적 민감도(mechanosensitivity)를 테스트하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 2>에서와 같이 pIRES2-AcGFP1-TTN3 또는 pEGFP-N1(STOP)-TTN3로 형질 도입된 다양한 세포주로부터 상기 <실시예 4>에서 사용된 기술을 이용하여 홀셀 전류(whole-cell currents)를 기록하였다. TTN3 발현 세포의 원형질 막 표면을 피에조-전기적(piezo-electrically driven)으로 된 유리 프로브로 찔렀다. 불로 매끄럽게 다듬은 피펫 전극(fire-polished electrode, 팁 지름: 3 - 4 μm)을 세포 표면에 대하여 약 50°의 각도로 위치하였으며, 프로브(probe)를 극미조작장치(micromanipulator)(Nano-controller NC4, Kleindiek Nanotechnik, Germany)에 의해 이동시켰다. 프로브 이동은 조이스틱(joystick) 또는 컴퓨터에 의해 조절된다. 세포 표면 상의 프로브의 초기 위치는 현미경(x400)을 통하여 세포 표면의 자국에서 관찰하여 결정된다. 이후 모든 기계감각적인 자극의 초기 지점으로 간주되는 수축(retraction)이 만들어지고, 상기 초기 위치로부터 기계감각적 자극이 2.5 - 7.2로부터 0.42 μm 증가하여 유리 프로브 정방향으로 움직여지며 만들어진다. 기계감각적인 자극의 일반적인 시간은 100 또는 600 ms이다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 기계감각적 자극이 세포에 적용되었을 때, 강한 전류가 활성화되었다(도 6). 빠른 활성화 후에, 상기 전류는 기계감각적 자극이 오랫동안 유지되는 한, 빠른 비활성(inactivation)를 나타내고 다시 느린 비활성화 MA 전류를 나타냈다. 기계감각적 자극이 제거되었을 때 잔여전류가 몇 초간 지속되며, 활성화되지 않았다(도 6). 66 개의 테스트된 세포 중에, 34개의 세포(52%)가 300 pA보다 큰 MA 전류를 나타냈다.

30개의 Gfp-형질 도입 세포 중에 단지 7개 만이 작은 전류 진폭(amplitudes)으로 기계감각적 자극에 반응하였다(도 6 및 9). 또한, 2개의 상동(homologs)인 TTN 1 및 TTN 2는 HEK293T 세포에서 발현될 때 매우 적은 강도의 MA 전류를 나타냈다(도 7 및 9). TTN3-발현 세포에서 MA 전류의 비활성 비율은 단일(mono)- 또는 이중지수(bi-exponential)곡선에 잘 부합한다(도 34). 단일-기하급수적 곡선의 비활성 시간 상수(τi) (inactivation time constant of constant of mono-exponential curve)는 286.1 ± 41.1 ms (n = 7)이었다. TTN3/HEK293T 세포에서 600 ms 기계감각적인 자극 시 정지(안정)상태(steady state)의 전류는 피크 전류의 약 52.5%이었다(도 2e). 느린 비활성 시간 상수(> 30 ms)에 기인하여, 상기 TTN3-의존적 MA 전류는 DRG 신경에서 관찰된 SA 전류로 그룹(grouped)화되었다.

또한, Ttn3가 형질 도입된 HeLa 세포에서 기계감각적 자극이 느린 비활성 동역학을 가진 큰 MA 전류를 유도하였다. 비활성의 비율은 이중지수(bi-exponential) 곡선과 가장 잘 부합되었다. 이중지수(bi-exponential)곡선의 빠른(τ1) 및 느린 비활성(τ2)을 위한 시간 상수는 각각 12.0 ± 1.6 및 213.0 ± 17.1 ms (n = 19)이었다. 또한 기계감각적 자극 후 대조군 세포의 일부분은 작은 전류(127.7 ± 15.5 pA, n = 22)를 유발하였다(도 8 및 9).

<3-2> 형질 도입된 F11 세포에서 TTN3 의 활성 측정

Ttn3가 형질 도입된 F11 세포에서 기계감각적 자극에 의한 활성화를 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, F11은 마우스 신경아종(neuroblastoma), N18TG-2와 래트 DRG 신경 사이에서 교배된(hybridized) 세포주이다. F11 세포는 포르스콜린(forskolin) 처리하여(10 μM, 4 - 6 일), DRG 유사 신경으로 분화될 수 있다.

그 결과, Ttn3가 형질 도입된 분화된 F11 세포 상의 기계감각적 자극은 느린 비활성 동역학을 갖는 MA 전류(2,397 ± 229 pA, n = 25)를 유도함을 확인하였다(도 11 및 13). 스크램블 siRNA를 형질 도입한 F11 세포 상의 기계감각적 자극은 작지만 강한 MA 전류 (187.9 ± 22.2 pA, n = 19)를 유도하였다(도 11). 이는 내재된 TTN3(endogenous TTN3)의 적은 양이 포함되어있기 때문인 것으로 보여진다. 마우스 Ttn3- siRNA가 F11 세포로 형질 도입되었을 때, MA 전류가 현저하게 억제되었고(60.6 ± 9.0 pA, n = 14, p < 0.001, Student's t-테스트), 포르스콜린(forskolin) 처리를 하지 않은 F11 세포에서 Ttn3 가 형질 도입되었을 때, 기계감각적 자극에 의해 확연히 큰 MA 전류가 활성화됨을 확인하였다(도 12, 13).

다양한 기계감각적 자극이 F11 세포의 표면에 적용되었을 때, 등급별로 나뉠 수 있는 MA 전류들이 관찰되었다(도 14). 활성화되는 TTN3를 위한 최대 거리의 절반값은 3.5 ± 0.1 μm (n = 6)이고, 이는 F11 세포에서 발현되는 인간 피에조1(Piezo1) (4.7 ± 0.3 μm, p < 0.01, Student's t-테스트)의 수치보다 현저하게 낮다. 따라서, 다양한 세포 유형에서 TTN3가 이종적으로 발현될 때 기계감각적 자극에 의해 활성화됨을 실험을 통해 확인하였다.

< 실험예 4> DRG 뉴런에서 느린 적응 MA 전류에 대한 TTN3 의 필수성 확인

TTN3가 어떤 유형의 전류에 필수적으로 작용하는지 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, DRG 신경을 분리하기 위하여 DRG 세포의 배양을 준비하였다. 흉부(thoracic) 및 요추(lumbar)의 DRG 신경을 7-8 주령 마우스로부터 절개(dissected)하였고, 차가운 배지 (DMEM/F12, Life Technologies)에서 수득하였다. 분리된 DRG를 37℃에서 45 분 동안 2 mg/ml 콜라제나제 IA(collagenase IA) (Sigma)를 포함하는 배지에서 배양하였다. 세포를 Ca² ⁺- 및 Mg² ⁺- 가 없는 행크 발란스드 설트(Hank's balanced salt) 용액(HBSS, Life Technologies)으로 3회 세척하고, 배양 배지로 2 또는 3회 세척하고, 현탁하고, 둥근 유리 커버슬립 (Fisher) 상에 분주하기 전에 1 ml 파이펫으로 연마하였다(triturated). 세포를 사용하기 전에 48 - 72 시간 동안 95% 공기/5% CO₂ 대기에서 DMEM/F12, 10% FBS, 50 ng/ml 신경성장인자(Life Technologies), 5 ng/ml 신경교 세포 주-유래 신경영양인자(neurotrophic factor)(Life Technologies) 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양배지에서 배양하였다.

분리된 DRG 신경 상의 기계감각적 자극은 각각 세 가지 별개 유형의 전류인, τi of < 10 ms, 10 < τi < 30 ms 및 > 30 ms을 가지는 빠른 적응(rapidly adapting, RA), 중간 적응(intermediatelt adapting, IA) 및 SA를 유도하였다(도 15 16 및 17).

MA 전류의 세 가지 유형은 DRG 신경에 존재하는 비활성 동역학에 의해 구별되는데, 운동적으로 정의된 DRG 신경은 지연된 촉각 자극에 다르게 반응한다. RA 신경은 짧은 단계 방전에 유발되는 경향이 있고 반면에 SA 신경은 지연된 방전에 유발하는 경향이 있다. SA 신경은 높은 빈도로 기계감각적인 자극을 따르는 경향이 있고 SA 신경에서 작용 잠재력의 빈도는 기계감각적 자극의 강도에 비례한다. 기계감각적 자극의 속도에서 변화에 반응하는 RA 신경의 전류변화 정도는 SA 신경에서보다 훨씬 더 크다. 따라서, RA 신경은 기계감각적인 자극의 다이나믹한 변화를 담당하는 것이 적합하고 반면에 SA 신경은 정체의 변화를 담당하는 것에 더 적합하다.

스크램블 siRNA로 형질 도입하여 실험하였을때, RA, IA, 및 SA MA 전류를 가진 DRG 신경의 비율은 상대적으로 적은 DRG 신경(20 - 25 μm 지름, 206개의 세포)군으로서 각각 47%, 20%, 및 20%이었다. 반대로, Cy3가 태그된 Ttn3 siRNA가 DRG 신경에 형질 도입되었을 때, SA MA 전류를 가지는 세포의 비율은 감소되었으나, 반면에, RA 및 IA 동역학을 가지는 세포의 비율은 영향을 받지 않음을 확인하였다(도 20). 유사하게, Ttn3-siRNA 형질도입은 SA 전류의 진폭에서 현저한 감소를 유도하였으나, RA 또는 IA 전류는 유도하지 않았다(도 19). 따라서, TTN3가 DRG 신경에서 SA 전류에 필수적임을 확인하였다.

< 실험예 5> TTN3 의 생물리학적(Biophysical)특성의 확인

TTN3의 생물리학적(Biophysical)특성을 알아보기 위하여 상기 <실시예 4>에서 나타낸 바와 같은 실험을 수행하였다.

그 결과, 기계감각적인 자극이 오랫동안 지속되는 동안 기계감각적 자극에 의해 유도된 TTN3의 정지상태(steady state)의 전류는 1,000 ms까지 유지되었다(도 21). 추가적으로, MA TTN3 전류의 강도는 기계감각적 자극의 속도에 비례하였고, 기계감각적 자극이 더 빠르게 적용될수록, 더 큰 전류가 관찰되었다(도 22). 2 단계로 이루어진 기계감각적 자극 프로토콜로써, 첫째, 0.42 μm 증가량과 2.9 내지 4.6 μm의 자국(indentation)을 가지는 100 ms 컨디셔닝 단계(conditioning step)에 뒤이어, 4.6-μm 테스트 단계를 수행하였다. 조절단계의 강도가 다양했지만, 테스트 단계의 피크 또는 정지상태(steady state)의 MA 전류는 변하지 않았다(도 23 및 24). 따라서, MA 전류의 상당부분이 테스트 단계에서 지속되었다. 추가적으로, 사인 곡선(sinusoidal) MA 전류에 이어 200-ms 컨디셔닝 단계 후 적용되는 사인 곡선단계(sinusoidal step)를 적용하였다(도 25). 이 결과는 일부 TTN3가 DRG 신경에서 발견되는 SA 전류의 특성인 지속적인 기계감각적 자극 후, 여전히 활동적이라는 것을 나타낸다.

MA TTN3 전류는 각각 피펫 및 배스(bath) 용액 속 150 mM CsCl 및 150 mM NaCl로 6.7 ± 0.7 mV (n = 9)으로 역전 전위(reverse potential)을 갖는 양이온(cationc)이고, 배스 용액이 150 mM NaCl, 150 mM KCl, 100 mM CaCl₂, 또는 100 mM MgCl₂으로 변화되었을 때의 역전 전위(reversal potential)를 감안하면, Na+, K+, Mg² ⁺ 또는 Ca² ⁺ 와 Cs⁺사이의 투과성 비율(permeability ratio, Px/Pcs)은 각각 1.31 ± 0.04 (n = 9), 1.24 ± 0.05 (n = 6), 1.41 ± 0.15 (n = 6)및 2.01 ± 0.11 (n = 8)이었다(도 27). 따라서, TTN3는 Ca² ⁺에 대해 높은 투과성을 갖는 양이온 채널임을 확인하였다. 또한, P_Cl/P_Na가 0.13 ± 0.03 (n = 8)이므로, TTN3는 Cl^-에 대하여 상대적으로 높은 투과성을 가짐을 확인하였다.

< 실험예 6> MA 전류의 약리학(Pharmacology)

MA 전류의 약학적 프로파일을 결정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 3>에서 분리된 DRG 뉴런에서 MA 전류를 가돌리니움(gadolinium, Gd³ ⁺) 및 다른 차단제(blocker)들로 차단하였다. 상기 <실시예 2>에서와 같이 Ttn3이 형질 도입된 F11 세포를 동일한 거리의 3회 연속적인 기계감각적 자극(3.6 또는 4.2 μm)으로 자극하였다.

그 결과, MA TTN3 전류는 기존에 알려져 있는 기계감각적 채널 차단제인 가돌리니움(Gd³⁺, 30 μM)에 의해 차단되는 것을 확인하였다. 가돌리니움은 TTN3 발현 세포에서 MA 전류를 현저하게 억제하였다(도 28 및 32). 억제를 위한 최대 농도의 절반값(IC₅₀)은 3.9 μM (n = 7 - 8)이었다(도 31). 추가적으로, TTN3 전류는 DRG 신경에서 MA 전류를 차단하는 것으로 알려진 형광염료(fluorescent dye)인 루테니움 레드(ruthenium red, 30 μM) 및 FM1-43에 의해 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 29 및 32). 또한, 다양한 세포 유형에서 MA 전류를 억제하는 것으로 알려진 정제된 타란튤라독(tarantula toxin(GsMTx4), 2.5 μM)이 MA TTN3 전류를 강하게 억제함을 확인하였다(도 30 및 32). MA TTN3 전류는 MA TREK1 채널을 억제하는 것으로 알려져 있는 세포막 변형제제인 클로로프로마진(chloropromazine, 50 μM) 및 기계감각적 전류를 억제하는 것으로 알려진 TRPA1 차단제인 HC030031(10 μM)에 의해서는 차단되지 않는 것을 확인하였으며, ENaC 전류를 차단하는 것으로 알려진, 아밀로리드(Amiloride, 1 mM)는 MA 전류를 약간 감소시킴을 확인하였다.

< 실험예 7> 근방추에서의 TTN3 발현

근방추에서 TTN3가 발현되는지 여부를 알아보기 위해 생후 7-8주 된 마우스의 장지신근(extensor digitorum longus, EDL)을 분리하여 10 μm 크기로 절단 후 4% polyformaldehyde로 고정하였다. PBS 세척 후 1시간 동안 4% bovine serum albumin으로 블로킹하고 Polyclonal TTN3 (1:700) 또는 NFM (sc-51683, SantaCruz, 1:500)을 48 시간 동안 4℃에서 처리하였다. 다시 세척 후 Alexa Fluor 546 conjugated goat anti-rabbit (A11010, Life Technology, 1:500) 및 Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-guinea pig (AP193F, Invitrogen, 1:800)를 처리하였으며, 핵은 Hoechst 33342(H3570, Thermofisher Scientific, 1:2000)를 사용하여 10분간 염색한 후 confocal microscope(LSM700, Carl Zeiss)를 사용하여 관찰하였다.

그 결과, 마우스의 뒷다리 근육의 장지신근(extensor digitorum longus, EDL)의 근방추에 TTN3가 풍부하게 위치하고 있음을 확인하였다(도 35 a). TTN3은 방추속근육세포(intrafusal muscle)의 핵이 모여있는 곳인 근방추의 중심영역에서 두드러지게 관찰되었고, 근방추에서 일차 구심성(typical primary afferent)을 담당하는 방추속근육세포(intrafusal muscles)를 감싸고 있는 고리나선신경말단(annulospiral structures)에서 neurofilament M과 함께 위치해 있었다(도 35 b 및 c). 그러나 TTN3가 녹아웃(knockout)된 마우스의 근방추에서는 TTN3가 관찰되지 않았다.

근방추에서의 TTN3의 존재를 확인하였으므로, 다음으로 대조군(Wild Type, WT)과 TTN3 녹아웃(knockout) 마우스를 통해 근방추 구심성 활성에서의 TTN3의 기능을 알아보았다.

분리된 긴발가락평근(extensor Digitorum Longus muscle, EDL)과 연결된 비골신경(peroneal nerve)에서 세포외측 신경기록(Extracellular neural recording)을 수행하기 위해, 마우스를 isoflurane으로 마취 후, 긴발가락평근(extensor Digitorum Longus muscle, EDL)과 연결된 비골신경(peroneal nerve)을 128 mM NaCl, 1.9 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO⁴, 26 mM NaHCO₃, 0.85 mM CaCl₂, 6.5 mM MgSO₄, and 10 mM glucose (pH 7.4)을 포함하는 4℃의 용액에서 분리하였고, 얇은 실크 봉합사로 긴발가락평근을 센서에 연결하여 근육의 힘과 조절 능력을 평가하였다. 센서의 출력신호는 근육에 가해진 힘과 연관된 근육신장의 크기를 파악하고자 증폭 처리되었다. 팁 지름이 70 μm인 유리 흡입 전극(suction electrode)을 준비하여 배스(bath)용액으로 채웠고 비골신경(peroneal nerve)의 자유단부(free end)를 전극 끝으로 흡입(suction)하였다. 근방추 구심성을 파악하기 위해, 근육의 신장동안 신경세포의 활동이 관찰될 때까지 흡입(suction)을 반복하였고, 길이 2 mm, 5초 간의 신장을 세 번 반복하였으며 1과 3 mm 길이의 신장이 두 번 더 실시되었다. 팁 내의 전극 신호는 ISO-80 (World Precision Instruments)으로 증폭되었고, Digidata 1322 (Molecular Devices)을 사용하여 10 kHz의 샘플링 비율(sampling rate)에서 계수화(digitized)하였으며, 1 kHz로 여과(filtered)되어 컴퓨터에 저장되었다. 저장된 전류는 pClamp 소프트웨어(version 10.0, Molecular Devices)을 사용하여 분석되었으며, 노이즈(noise) 하나의 표준편차를 넘어서는 스파이크는 신경의 활동전위(action potential)로 파악하여 계산하였다.

그 결과, 대조군(WT)의 긴발가락평근(EDL muscles)에서의 5 초간의 2 mm 신장(~10 mm)은 신경방전들(barrage of nerve discharges)을 일으켰으나, TTN3 녹아웃(knockout) 마우스에서는 근방추 구심성에서의 근육 신장-유도성 신경방전의 활동(muscle stretch-evoked discharge)이 극적으로 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 35 d 및 e). 근방추에서의 구심성 활성(afferent activity)의 감소가 근신장 범위(1-3mm)의 전반에서 관측되었으며(p < 0.0001, two-way ANOVA, F(1,132) = 56.5), TTN3 녹아웃(knockout) 마우스는 대조군(WT)마우스와 비교하여 근신장에 대한 민감도(sensitivity, slope)가 상당히 감소되어 있음을 확인하였다(5.81 ± 0.72 vs 2.77 ± 0.36 spikes/mm, p < 0.001, n = 23-24, Student-t test) (도 35 e). 이러한 결과는 TTN3가 신장 유도성(stretch-evoked) 근방추 구심성 활동에 관여한다는 것을 보여준다.

< 실험예 8> TTN3 억제 마우스에서의 운동 조절능력 상실

근방추의 감각 입력(input)은 근육 조절(muscle coordination)을 위해 필수적이기 때문에, 근육의 조절과 근육 강도를 테스트해보기 위해 마우스의 사지(팔, 다리)로 격자(grid)를 붙잡고 매달리게 하는 실험을 실시 하였다.

마우스는 11.5 mm x 11.5 mm (0.8 mm 지름)으로 구성되어 있는 용접된 와이어 메시(wire mesh)(560 mm x 510 mm)를 사지를 사용하여 붙잡도록 준비되었으며, 이 와이어 메시는 천천히 뒤집어져셔 부드러운 바닥 위 30cm 에 고정되도록 설치하였다. 마우스가 떨어질 때까지 시간을 측정하였다.

그 결과, TTN3 녹아웃(knockout) 마우스는 정상 마우스(WT)와 비교하여 매달려 버티는 시간이 짧았다. 대조군(WT) 마우스는 10분 이상을 매달렸으나 TTN3 녹아웃 마우스는 대부분 2분 이상 매달리지 못했다(도 36 a).

또한, 평균대 횡단 테스트(Beam walking test)를 수행하였는데, 마우스를 12 mm의 폭을 갖는 플라스틱 평균대(길이 80cm, 높이 50cm)에서 이틀간 하루에 세 번씩 건너는 훈련을 시킨 뒤, 그 보다 좁은 6 mm 플라스틱 평균대에서 세 번 실험을 수행하였다. 평균대를 횡단한 뒤에는 마우스들이 어두운 공간으로 숨을 수 있도록 해주었으며, 움직임은 비디오로 촬영되어 분석되었다.

그 결과, TTN3 녹아웃 마우스는 정상군 대비 3배 이상의 빈도로 사지(팔, 다리)의 미끄러짐이 관찰되었고 평균대를 건너기 위해 소요되는 시간도 현저히 증가되었다(4.6 sec vs 6.5 sec, p < 0.01, n = 10-11, Student-t test)(도 36 b).

그리고 마우스들의 보행을 분석하고자 다음과 같이 실험을 수행하였다.

마우스의 보행분석은 CatWalk system(Noldus Information Technology)을 사용하였으며, 실험장치는 어두운 공간에서 조명이 바닥을 비추는 1.3 m의 긴 유리 층으로 구성되어 있고, 마우스가 움직이면 발의 영역이 빛의 광편향(light deflection)현상으로 인해 밝게 빛나는 원리를 이용하였다. 실험은 비디오로 촬영하였으며 컴퓨터로 저장하였다. 마우스는 세 번의 연속적인 러닝을 하도록 했으며, 마우스가 5초 이상 걸어다닌 경우 마우스 러닝에 성공한 것으로 간주하였다. 각 마우스들의 보행족적을 식별 및 라벨링한 후, Catwalk XT software를 사용하여 분석하였으며, 세 번의 시험값의 평균을 사용하였다. 발 뻗는 속도(swing)는 마우스의 이동 시 사지의 이동속도를 의미하며 보폭은 걸음걸이 사이클의 길이를 의미한다. 또한, 규칙성 지수(Regularity index)는 마우스의 발 족적의 총 수에 대한 정상 족적 패턴의 비율을 의미하며, 위상분산(Phase dispersion)은 고정된 다른 발의 보폭 주기를 기준으로 한 타겟(target)발의 초기 접촉 비율을 의미한다.

그 결과, TTN3 녹아웃 마우스는 대조군 대비 비정상적인 결과를 보여주었다. TTN3 녹아웃 마우스의 보행은 발 뻗는 속도(swing) 및 보폭이 정상군(WT) 대비하여 상당히 느려지는 것을 확인하였다(도 36 c,d 및 e). 그리고 TTN3 녹아웃 마우스는 앞-뒤 다리 조절능력(fronto-hind limb coordination)의 감소를 보여주었다(도 36 f 및 g).

이와는 대조적으로, TTN3의 억제가 촉각이나 통증감각뿐만 아니라 일반적인 운동 활성에는 영향을 주지 않는 것으로 보여지는데, 이러한 결과들은 TTN3가 마우스에서 근방추 구심성 신경을 통해 운동 조절(motor coordination)에 관여한다는 것을 의미한다.

< 실험예 9> TTN3 억제 마우스에서의 혈압 및 맥박 측정

다음으로, TTN3 녹아웃 마우스에서의 혈압 및 맥박수의 변화를 알아보기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로 TTN3 녹아웃 마우스 및 대조군(정상) 마우스의 혈압(blood pressure)은 비침습 혈압측정기법으로 실시하였으며, Kent Scientific사의 CODA 8-Channel high throughput non-invasive blood pressure system을 사용하였다. 이는 사람의 혈압측정기와 비슷한 원리로서 마우스의 꼬리에 커프(cuff)을 씌워 여기에 공기압을 주고 공기압을 천천히 낮추어 가는 방식으로 혈압을 측정하였다. 우선 플랫폼(platform)의 온도를 33 - 35℃으로 일정하게 유지하고 마우스를 움직이지 않게 억제틀(restrainer)에 넣어 고정시킨 다음, 꼬리에 occlusion cuff(O-cuff)와 volume pressure recording cuff (VPR-cuff)를 씌웠다. 이때, 마우스는 적어도 5분간 순화(habituation)시킨 다음 혈압을 측정하였다. 혈압은 VPR에 달려있는 센서에 의해 자동 측정되었으며, 각 마우스마다 혈압을 20회씩 측정하여 그 평균값을 혈압으로 보았다. 또한, 이와 동시에 자동으로 맥박수(심박동수)도 기록하여 평균값을 맥박수로 보았다.

그 결과, 도 37에 나타낸 바와 같이, 대조군(정상) 마우스 대비 TTN3 녹아웃 마우스에서 혈압(blood pressure)이 현저히 낮게 측정되었다. 실험동물의 수가 많지 않아 통계적 유의성은 없었다(도 37 a)(p<0.09. N = 3). 또한, 맥박(heart rate)의 측정결과, TTN3 녹아웃 마우스에서 현저한 맥박의 감소가 유의적으로 확인되었다(도 37 b)(p<0.04, N = 3).

<110> Seoul National University - Industry Collaboration Foundation <120> Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of afferent nerve diseases comprising Tentonin 3 and use thereof <130> 2015P-01-030 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn1 F <400> 1 ctcgaggcca ccatgaccgc ct 22 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn1 R <400> 2 aagcttgatc atggcaatac tctcgggag 29 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn2 F <400> 3 ctcgaggcca ccatgtggaa ttacct 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn2 R <400> 4 aagcttgagc acctgtgcca tctgta 26 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn3 F <400> 5 ctcgaggcca ccatggacgg gaagaaat 28 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn3 R <400> 6 ggtaccctca cctgatccgt ctgatattc 29 <210> 7 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TTN 1 <400> 7 Met Thr Ala Trp Ile Leu Leu Pro Val Ser Leu Ser Ala Phe Ser Ile 1 5 10 15 Thr Gly Ile Trp Thr Val Tyr Ala Met Ala Val Met Asn Arg His Val 20 25 30 Cys Pro Val Glu Asn Trp Ser Tyr Asn Glu Ser Cys Ser Pro Asp Pro 35 40 45 Ala Glu Gln Gly Gly Pro Lys Ser Cys Cys Thr Leu Asp Asp Val Pro 50 55 60 Leu Ile Ser Lys Cys Gly Thr Tyr Pro Pro Glu Ser Cys Leu Phe Ser 65 70 75 80 Leu Ile Gly Asn Met Gly Ala Val Met Val Ala Leu Ile Cys Leu Leu 85 90 95 Arg Tyr Gly Gln Leu Leu Glu Gln Ser Arg His Ser Trp Ile Asn Thr 100 105 110 Thr Ala Leu Ile Thr Gly Cys Thr Asn Ala Ala Gly Leu Val Val Val 115 120 125 Gly Asn Phe Gln Val Asp His Ala Lys Ser Leu His Tyr Ile Gly Thr 130 135 140 Gly Val Ala Phe Thr Ala Gly Leu Leu Phe Val Cys Leu His Cys Val 145 150 155 160 Leu Phe Tyr His Gly Ala Thr Thr Pro Leu Asp Met Ala Met Ala Tyr 165 170 175 Leu Arg Ser Val Leu Ala Val Ile Ala Phe Ile Thr Leu Val Leu Ser 180 185 190 Gly Val Phe Phe Leu His Glu Ser Ser Gln Leu Gln His Gly Ala Ala 195 200 205 Leu Cys Glu Trp Val Phe Val Leu Asp Ile Leu Ile Phe Tyr Gly Thr 210 215 220 Phe Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Ile Ser Ser Asp Thr Leu Val Ala Ala 225 230 235 240 Leu Gln Pro Ala Pro Gly Arg Ala Cys Lys Ser Ser Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Thr Ser Thr His Leu Asn Cys Ala Pro Glu Ser Ile Ala Met Ile 260 265 270 <210> 8 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TTN 2 <400> 8 Met Trp Asn Tyr Leu Ser Leu Leu Pro Val Ile Leu Phe Leu Trp Ala 1 5 10 15 Ile Ala Gly Ile Trp Ile Val Phe Ala Ile Ala Val Val Asn Gly Ser 20 25 30 Val Asp Leu Asn Glu Gly Phe Pro Phe Ile Ser Ile Cys Gly Ser Tyr 35 40 45 Ala Pro Gln Ser Cys Ile Phe Gly Gln Val Leu Asn Ile Gly Ala Ala 50 55 60 Leu Thr Val Trp Ile Cys Ile Val Arg His His Gln Leu Arg Asp Trp 65 70 75 80 Gly Val Lys Thr Trp Gln Asn Gln Leu Ile Leu Trp Ser Gly Ile Leu 85 90 95 Cys Ala Leu Gly Thr Ser Ile Val Gly Asn Phe Gln Asp Lys Asn Gln 100 105 110 Lys Pro Thr His Leu Ala Gly Ala Phe Leu Ala Phe Ile Leu Gly Asn 115 120 125 Leu Tyr Phe Trp Leu Gln Phe Phe Leu Ser Trp Trp Val Lys Gly Leu 130 135 140 Pro Gln Pro Gly Pro His Trp Ile Lys Ser Leu Arg Leu Ser Leu Cys 145 150 155 160 Ser Leu Ser Thr Ile Leu Ile Val Ala Met Ile Val Leu His Ala Leu 165 170 175 His Met Arg Ser Ala Ser Ala Ile Cys Glu Trp Val Val Ala Met Leu 180 185 190 Leu Phe Met Leu Phe Gly Phe Phe Ala Val Asp Phe Ser Ile Leu Arg 195 200 205 Gly Cys Thr Leu His Leu His Pro Arg Leu Asp Ser Ser Leu Pro Gln 210 215 220 Ala Pro Ser Gly Ser Pro Asn Ile Gln Met Ala Gln Val Leu 225 230 235 <210> 9 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TTN 3 <400> 9 Met Asp Gly Lys Lys Cys Ser Val Trp Met Phe Leu Pro Leu Val Phe 1 5 10 15 Thr Leu Phe Thr Ser Ala Gly Leu Trp Ile Val Tyr Phe Ile Ala Val 20 25 30 Glu Asp Asp Lys Ile Leu Pro Leu Asn Ser Ala Ala Arg Lys Ser Gly 35 40 45 Ala Lys His Ala Pro Tyr Ile Ser Phe Ala Gly Asp Asp Pro Pro Ala 50 55 60 Ser Cys Val Phe Ser Gln Val Met Asn Met Ala Ala Phe Leu Ala Leu 65 70 75 80 Val Val Ala Val Leu Arg Phe Ile Gln Leu Lys Pro Lys Val Leu Asn 85 90 95 Pro Trp Leu Asn Ile Ser Gly Leu Ala Ala Leu Cys Leu Ala Ser Phe 100 105 110 Gly Met Thr Leu Leu Gly Asn Phe Gln Leu Thr Asn Asp Glu Glu Ile 115 120 125 His Asn Val Gly Thr Ser Leu Thr Phe Gly Phe Gly Thr Leu Thr Cys 130 135 140 Trp Ile Gln Ala Ala Leu Thr Leu Lys Val Asn Ile Lys Asn Glu Gly 145 150 155 160 Arg Arg Ala Gly Ile Pro Arg Val Ile Leu Ser Ala Val Ile Thr Leu 165 170 175 Cys Val Val Leu Tyr Phe Ile Leu Met Ala Gln Asp Ile His Met Tyr 180 185 190 Ala Ala Arg Val Gln Trp Gly Leu Val Met Cys Phe Leu Ala Tyr Phe 195 200 205 Gly Thr Leu Ala Val Glu Phe Arg His Tyr Arg Tyr Glu Ile Val Cys 210 215 220 Ser Glu Tyr Gln Glu Asn Phe Leu Ser Phe Ser Glu Ser Leu Ser Glu 225 230 235 240 Ala Ser Glu Tyr Gln Thr Asp Gln Val 245 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTN 3 siRNA sense <400> 10 gcuuguggau aguguacuu 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTN 3 siRNA antisense <400> 11 cgaactccta tcacatgaa 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn1 F <400> 12 ggtcctacaa tgaatcctgc tc 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn1 R <400> 13 ggccaccata acagcaccc 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn2 F <400> 14 tgtcctggtg ggtgaaagg 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn2 R <400> 15 tcatagccac gatgaggatg g 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn3 F <400> 16 cgtgtggatg tttctacctc tc 22 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ttn3 R <400> 17 gcacccgatt tccttgcag 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 18 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 19 tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims

텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 텐토닌 3는 기계감각적 자극에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 구심성 신경은 체강과 내장 구심성(Somatic and visceral afferents), 시각적 구심성(Visual afferent), 후각(Olfaction), 청각적 구심성(Auditor afferents), 피질시상하부 구심성(Corticohypothalamic afferents), 해마시상하부 섬유(Hippocampohypothalamic fibers), 편도체시상하부 섬유(Amygdalohypothalamic fibers), 시상시상하부 섬유(Thalamohypothalamic fibers) 및 외피 섬유(Tegmental fibers)로부터 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
1) 피검물질을 텐토닌 3 유전자를 발현하는 세포에 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 텐토닌 3 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 텐토닌 3 유전자의 발현 수준이 무처리 대조군에 비해 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
제 5항에 있어서, 상기 세포는 HeLa, HEK293T, F11, 인간 DRG, 망막색소상피(retinal pigment epithelium(RPE)), 인간 각질(keranocyte(HaCaT)), 간암세포 암종(HepG2) 및 인간 자궁 암종(SiHa) 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 구심성 신경질환의 예방 또는 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
텐토닌 3의 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 저혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.