KR20180081812A

KR20180081812A - 허혈성 뇌졸중 치료용 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20180081812A
Application number: KR1020187017549A
Authority: KR
Inventors: 데이빗 엘마레
Original assignee: 아즈테라피즈 인코포레이티드
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2016-11-23
Publication date: 2018-07-17
Also published as: US20180344682A1; MX2018006390A; EP3380095A1; US20220125753A1; EP3380095A4; AU2016359674A1; CN108472275A; EP3380095B1; JP2018538273A; MX390748B; CA3005909A1; WO2017091644A1

Abstract

본 발명은 치료가 필요한 개체에게 하나 이상의 식 I 또는 식 II의 화합물을 치료학적 유효량으로 투여함으로써 허혈성 뇌졸중을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기한 화합물은 식 I 또는 식 II를 가지거나, 또는 (I) 또는 (II)의 염 또는 에스테르이다:

상기 식에서,
X는 OH, C₁-C₆ 알콕실,　¹⁸F 또는 ¹⁹F이고;
Y 및 Z는 독립적으로 C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알콕실, 할로겐, 치환 또는 비치환된 C₁-C₆ 아민, ¹⁸F, ¹⁹F 또는 H로부터 선택되고; 및
n은 1, 2 또는 3이다.

Description

허혈성 뇌졸중 치료용 조성물 및 방법

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2015년 11월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/258,882에 대한 우선권을 주장하며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

발명의 기술 분야

본 발명은 크로몰린 및/또는 이의 유도체와 선택적으로 다른 비만세포 저해제를 치료가 필요한 개체에게 투여함으로써 허혈성 뇌졸중을 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은, 허혈성 뇌졸중을 앓고 있는 개체에 대한 임상 치료의 보강제로서 또는 치료를 위해 비만세포 저해제와 조합하여, 항염증제 및 혈관 치료제를 투여하는 단계를, 더 포함한다. 본 방법은, 인지 저하를 늦추거나 또는 중단시키기 위해, 비-제한적인 예로, 뇌졸중 후 신경-염증, 신경교 활성화 및 뉴런 소실 등의 허혈성 뇌졸중 이후의 뇌 병증에 대한 비만세포 매개 부작용을 저해하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 허혈성 뇌졸중 후 인지 장애 (PSCI-뇌졸중 후 인지 장애)를 가진 환자를 치료하기 위한 잠재적으로 효과적인 보강제를 포함할 수 있다.

뇌졸중은 질병 방제 및 예방 센터에 따르면 미국의 사망 요인의 5번째를 차지하고 있으며, 미국에서 주요한 장애 요인이다. 해마다 약 795,000명의 미국인에게서 허혈성 또는 출혈성 뇌졸중이 신규로 발생하거나 또는 재발하고 있다 (American Heart Association, Heart Disease and Stroke Statistics - 2015 Update, A Report From the American Heart Association. Circulation (2015)131:434-441). 이들 중 약 610,000건이 일차 발병한 사례이고, 185,000건은 뇌졸중이 재발한 사례이다.

허혈성 뇌졸중은 허혈증 및 염증에 의해 매개되는 1차 및 2차 공격의 결과로서 손상을 야기한다. 경색 조직내 뉴런은 초기 손상의 결과로서 사멸하지만, 경색 주변 (penumbra)의 세포는 면역 세포, 반응성 산소 종 및 독성 염증 매개인자들의 빠른 유입에 의해 영향을 받는다.

뇌졸중 생존자는 마비, 시력 문제, 말하기/언어 문제, 행동 방식의 변화 및 기억력 저하와 같은 의학적 합병증 및 장기적인 장애를 종종 경험한다. 뇌졸중 생존자들 중 높은 비율 (~30%)이 혈관 치매, 퇴행성 치매 및 혼합성 치매 등의 뇌졸중 후 치매를 앓는다. 문헌을 참조한다 (Kase et al., "Intellectual Decline After Stroke The Framingham Study," Stroke (1998), 29:805-812; Lees et. al., "Test Accuracy of Cognitive Screening Tests for Diagnosis of Dementia and Multidomain Cognitive Impairment in Stroke," Stroke (2014) 45:3008-3018; Del Ser et al., "Evolution of Cognitive Impairment After Stroke 및 Risk Factors for Delayed Progression," Stroke (2005) 36:2670-2675; Mok et al., "Cognitive impairmen and functional outcome after stroke associated with small" 2004). 뇌졸중 후 치매 및 경도 인지 장애 (MCI)의 발병률은 다양하다 (Nys et al., "Restrictions of the Mini-Mental State Examination in acute stroke," Arch Clin Neuropsychol (2005) 20:623-9; Madureira et al., "Dementia and cognitive impairment three months after stroke," Eur J Neurol (2001) 8(6):621-627; Ihle-Hansen et al., "Incidence and subtypes of MCI and dementia 1 year after first-ever stroke in patients without pre-existing cognitive impairment," Dement Geriatr Cogn Disord (2011) 32:401-407). 그러나, 뇌졸중 후 인지 장애는 혈관성 인지 장애 (VCI) 뿐만 아니라 알츠하이머 질환 (AD)의 발병에 의해서도 유발되며 (Sun et al., "Post-stroke cognitive impairment: epidemiology, mechanisms and management," Ann Transl Med (2014) 2(8): 80), 뇌졸중 후 치매 사례들 중 약 1/3에서 나타난다 (Desmond et al., "Frequency and clinical determinants of dementia after ischemic stroke," Neurology (2000), 54:1124-1131). 부검 실험에 따르면, 치매건 중 약 50%가 VCI 및 AD 둘다에 기인한 것이다 (Jellinger, KA., "Alzheimer disease and cerebrovascular pathology: an update," J Neural Transm (2002) 109:813-36).

뇌졸중 후 인지 장애의 기전은 뇌졸중 (Zekry et al., "The vascular lesions in vascular and mixed dementia: the weight of functional neuroanatomy," Neurobiol Aging (2003) 24:213-219; Szabo et al., "Hippocampal lesion patterns in acute posterior cerebral artery stroke: clinical and MRI findings," Stroke (2009) 40:2042-2045), 뇌 미세출혈 (Greenberg, et al., "Cerebral microbleeds: a guide to detection and interpretation," Lancet Neurol (2009) 8:165-174; Park, et al., "Pathogenesis of cerebral microbleeds: In vivo imaging of amyloid and subcortical ischemic small vessel disease in 226 individuals with cognitive impairment," Ann Neurol (2013) 73:584-593) 및 뇌졸중을 동반한 혼합형 치매에 의해 유발되는 신경 해부학적 상해를 포함한다.

현재, 뇌졸중으로 인한 VCI를 비롯한 VCI에 대한 특수 치료제는 미국 FDA로부터 승인된 바 없다 (Gorelick et al., "Vascular Contributions to Cognitive Impairment and Dementia, A Statement for Healthcare Professionals From the American Heart Association/American Stroke Association," Stroke (2011) 42:00-00). VCI의 예방은 뇌졸중 및 심혈관 질환에 대한 전통적인 위험 인자를 검출 및 통제하는데 초점이 맞추어져 있다. 혈관성 치매의 인지 기능, 전반적인 기능 및 일상 기능 수행에 있어 콜린 에스테라아제 저해제 (예, 도네페질 (donepezil), 리바스티그아민 (rivastigamine) 및 갈란트아민 (galantamine)) 및 메만틴 (methantine)의 효능이 연구된 바 있다.

염증은 허혈성 뇌졸중 및 다른 형태의 허혈성 뇌 손상의 발병에 중요한 역할을 담당한다. 실험적으로 그리고 임상적으로, 뇌는 상주 세포 (예, 미세아교세포)의 조기 활성화, 전염증성 매개인자의 생산 및 다양한 유형의 염증 세포 (호중구, T 세포의 여러가지 서브타입, 단핵세포/대식세포 및 기타 세포 등)의 허혈성 뇌 조직으로의 침윤을 특징으로 하는, 급성 및 만성적인 염증성 프로세스로 허혈성 손상에 반응한다 (Jin, et al., "Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells," J Leukoc Biol (2010) 87(5): 779-789). 이들 세포 현상들이 총체적으로 허혈성 뇌 손상에 기여한다 (Bona, et al., "Chemokine and inflammatory cell response to hypoxia-ischemia in immature rats," Pediatr Res (1999) 45:500-509; Silverstein, et al., "Cytokines and perinatal brain injury," Neurochem Int (1997) 30:375-383; Cowell et al., "Hypoxic-ischemic injury induces macrophage inflammatory protein-1alpha expression in immature rat brain," Stroke (2002) 33:795-801).

뇌에 존재하는 대식세포인 미세아교세포는 뇌 손상에 반응하여 빠르게 활성화된다 (Aloisi F, "Immune function of microglia," Glia (2001) 36:165-179; Nakajima, et al., "Microglia: activation and their significance in the central nervous system," J Biochem (2001) 130:169-175). 상주하는 미세아교세포는 허혈증 발생 수 분내 활성화되어 전염증성 매개인자를 생산하며, 이 전염증성 매개인자가 조직의 손상을 악화시키지만 (Banati et al., "Cytotoxicity of microglia," Glia, 1993, 7:111-118; Barone, et al., "Tumor necrosis factor-α: a mediator of focal ischemic brain injury," Stroke (1997) 28:1233-1244; Rothwell, et al., "The role of interleukin 1 in acute neurodegeneration and stroke: pathophysiological and therapeutic implications," J Clin Invest (1997) 100:2648-2652), 또한 허혈성 손상 및 흥분독성 손상 (excitetoxic injury)으로부터 뇌를 보호할 수 있는 것으로 (Mattson, et al., "Cellular signaling roles of TGFβ, TNF α and β APP in brain injury responses and Alzheimer's disease," Brain Res Brain Res Rev., (1997) 23:47-61; Raivich, et al., "Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function." Brain Res Brain Res Rev (1999) 30:77-105; Hallenbeck, JM., "The many faces of tumor necrosis factor in stroke," Nat Med (2002) 8:1363-1368), 나타났다. 허혈증 후 미세아교세포의 증식은 국소성 뇌 허혈증 발생 후 48-72시간에 최고조에 도달하며, 첫 손상 후 수 주간 지속될 수 있다 (Lalancette-Heμbert, et al., "Selective ablation of proliferating microglial cells exacerbates ischemic injury in the brain," J Neurosci (2007) 27:2596-2605; Denes, et al., "Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice," J Cereb Blood Flow Metab (2007) 27:1941-1953). 이러한 빠른 상주 미세아교세포의 반응과는 대조적으로, 혈액 유래 백혈구는 통상 수 시간 내지 수일 정도 지연된 양상으로 뇌 조직으로 동원된다 (Yilmaz, et al., "Role of T lymphocytes and interferon-γ in ischemic stroke," Circulation (2006) 113:2105-2112; Schilling, et al., "Microglial activation precedes and predominates over macrophage infiltration in transient focal cerebral ischemia: a study in green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice," Exp Neurol (2003) 183:25-33; Tanaka, et al., "Migration of enhanced green fluorescent protein expressing bone marrow- derived microglia/macrophage into the mouse brain following permanent focal ischemia." Neuroscience (2003) 117:531-539).

최근 연구들에서 뇌 허혈증 및 출혈의 병리생리학적 측면에서 뇌 비만세포의 역할이 부각되었다 (Jin, et al., "Mast cell stabilization limits hypoxic-ischemic brain damage in the immature rat," Dev Neurosci (2007) 29(4-5):373-84; Strbian, et al., "An emerging role of mast cells in cerebral ischemia and hemorrhage," Ann Med (2009) 41(6):438-50). Jin 등 (Jin, 2007, Jin, et al., "Mast cells are early responders after hypoxia-ischemia in immature rat brain," Stroke (2009) 40(9):3107-12)에 따르면, 미성숙 뇌에서 저산소성 허혈증 상황에서 비만세포 동원 및 비만세포의 활성화가 뉴런, 신경교 및 내피세포의 반응을 2-4시간 앞서는 것으로 확인되었다. 비만세포의 조기 활성화가 신생아 허혈증 동물 모델에서 뇌의 히스타민 침착과 뇌 손상에 기여하는 것으로 제안되었는데, 이는 신생아 뇌 손상에 대한 비만세포의 어떤 역할을 뒷받침한다. 또한, 비만세포는 허혈성 뇌졸중 실험 모델에서 tPA-매개 뇌 출혈에 어떤 역할을 하며, 뇌내 출혈 발생 후 혈종 및 부종의 확장에 관여하는 것으로 보인다 (Strbian, et al., "Cerebral mast cells regulate early ischemic brain swelling and neutrophil accumulation," J Cereb Blood Flow Metab (2006) 26:605-612; Strbian, et al., "Mast cell stabilization reduces hemorrhage formation and mortality after administration of thrombolytics in experimental ischemic stroke," Circulation (2007) 116:411-418). 비만세포 안정화가 허혈성 뇌졸중 실험 모델에서 혈전용해제 투여 후 출혈성 변환 (hemorrhagic transformation)과 사망률을 낮추는 것으로 보고되었다 (Strbian, 2007). 또한, 크로모글리케이트 (cromoglycate)에 의한 비만세포의 조기 반응의 저해가 동물 모델에서 장기적인 보호를 제공하는 것으로 입증되었다 (Strbian, 2009).

최근 연구들에서 뇌 허혈증 및 출혈의 병리생리학적 측면에서 뇌 비만세포의 역할이 부각되었다 (Jin, 2007, Strbian, 2009). Jin 등 (Jin, 2007, Jin, 2009)에 따르면, 미성숙 뇌에서 저산소성 허혈증 상황에서, 비만세포 동원 및 비만세포의 활성화가 뉴런, 신경교 및 내피세포의 반응을 2-4시간 앞서는 것으로 확인되었다. 비만세포의 조기 활성화가 신생아 허혈증 동물 모델에서 뇌의 히스타민 침착과 뇌 손상에 기여하는 것으로 제안되었으며, 신생아 뇌 손상에서의 비만세포의 역할을 추가로 뒷받침해주었다. 또한, 비만세포는 허혈성 뇌졸중 실험 모델에서 tPA-매개 뇌 출혈에 역할을 하며, 뇌내 출혈 발생 후 혈종 및 부종의 확대에 관여하는 것으로 보인다 (Strbian, 2006, 2007). 비만세포 안정화가 허혈성 뇌졸중 실험 모델에서 혈전용해제 투여 후 출혈성 변환과 사망률을 낮추는 것으로 보고되었다 (Strbian, 2007). 또한, 크로모글리케이트에 의한 이러한 비만세포의 조기 반응의 저해가 동물 모델에서 장기적인 보호를 제공하는 것으로 입증되었다.

비만세포는 저산소성-허혈성 공격시 뇌 손상에 기여하는 것으로 보고되었다 (Strbian 2006, 2007). 뇌 허혈증/재관류 실험 모델에서, 비만세포는 혈액-뇌 장벽의 투과성, 뇌 부종 발생 및 국소 호중구 침윤 정도를 조절하였다. 중요한 점은, 비만세포-안정화제인 크로모글리케이트가 뇌 병증에 대한 비만세포-매개 부작용을 억제하고, 실험 동물의 생존성을 개선시켰다는 것이다 (Jin, 2009).

크로몰린은 1970년대에 천식 및 알레르기성 비염을 치료하기 위한 용도로 승인된 약물인데, 편측 저산소증-허혈증 랫 신생아 모델에서, 비만세포 안정화 물질로서, 비만세포의 이동 및 탈과립화, 신경교 활성화 및 뉴런 사멸을 저해하는 것으로 입증되었다 (Jin, 2007). 최근 성체 랫에 대한 실험에서, 뇌내 크로몰린의 주입이 일시적인 중뇌 동맥 폐색 후 조기 뇌 부종과 호중구의 침착을 낮추고 (Strbian, 2006), tPA 처리 후 출혈 발생을 저해하는 것으로 (Strbian, 2007), 입증되었다. 편측 저산소증-허혈증 랫 신생아 모델을 이용한 실험에서, 저산소 조건의 말기에 공급된 크로몰린이, 48시간째에 분석한 바에 따르면, 비만세포 이동/탈과립화, 신경교 활성화 및 뉴런 소실을 제한하였다 (Jin, 2007). 또한, 장기간-지속되는 신경보호도 Jin 등에 의해 입증되었다 (Jin, 2009). 처음 24시간 동안 비만세포의 안정화가 뇌로의 추가적인 비만세포의 이동을 현저하게 제한하였으며, 4주간의 회복 기간 내내 신경보호를 제공하였다 (Jin, 2009).

본 발명은 치료가 필요한 개체에게 하나 이상의 식 I 또는 식 II의 화합물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌졸중의 치료 방법을 포함하며, 상기 화합물은 하기 식 I 또는 식 II를 가지거나, 또는 (I) 또는 (II)의 염 또는 에스테르이다:

상기 식에서,

X는 OH, C₁-C₆ 알콕실,　¹⁸F 또는 ¹⁹F이고;

Y 및 Z는 독립적으로 C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알콕실, 할로겐, 치환 또는 비치환된 C₁-C₆ 아민, ¹⁸F, ¹⁹F 또는 H로부터 선택되고; 및

n은 1, 2 또는 3이다. 일 구현예에서, 본 발명은, X가 ¹⁸F 또는 ¹⁹F이고; Y 및 Z가 독립적으로 C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알콕실, 할로겐, ¹⁸F, ¹⁹F 또는 H로부터 선택되고; n이 1, 2 또는 3인, 방법을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 식 I에서 Y 및 Z가 H이고, n = 1이면, X가 OH가 아닌, 방법을 포함한다. 다른 구현예에서, 화합물은 크로몰린이다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 크로몰린 소듐이다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 부가적인 약물을 투여하는 단계를 더 포함한다. 부가적인 약물은 비만세포 저해제, 항염증제 또는 혈관 치료제일 수 있다. 일 구현예에서, 부가적인 약물은 이부프로펜이다. 다른 구현예에서, 화합물 및 부가적인 약물은 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.

본 발명은, 식 I 또는 식 II의 화합물이 흡입에 의해 투여되는 방법을 포함한다. 일 구현예는, 화합물이 10 미크론 미만의 평균 입자 크기를 가진 입자로 마이크로화 (micronization)된, 방법을 포함한다. 다른 구현예는, 화합물이 5 미크론 미만의 평균 입자 크기를 가진 입자로 마이크로화된, 방법을 포함한다. 또 다른 구현예는, 화합물이 약 5 - 20 mg의 양으로 투여되는, 방법을 포함한다. 일 구현예는, 화합물이 약 17.1 mg/kg의 양으로 투여되는, 방법을 포함한다. 다른 구현예는, 화합물이 매일 2회로 투여되는, 방법을 포함한다.

도 1은 Aβ (Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂) 응집에 대한 나노몰 농도의 크로몰린의 저해 효과를 예시한 것이다. 좌측 패널: DMSO (상단 패널) 또는 크로몰린 소듐 (5 nM, 50 nM 및 500 nM, 하단 패널) 첨가 후 Aβ 원섬유화시 티오플라빈 T 형광 증가를 보여주는 대표적인 그래프. 합성 Aβ₄₀ (좌측 컬럼) 또는 Aβ₄₂ (우측 컬럼) 펩타이드의 원섬유화를 1시간 동안 추적하였다. 대응되는 Vmax 인덱스 (milli- units/minute)를 각 그래프에 표시된다. 우측 패널: Aβ₄₂ 원섬유화 과정에 대한 효과가 좀더 낮은 수준으로 관찰되지만, 크로몰린 소듐의 존재시 현저하게 감소되는 Aβ₄₀ (상단 그래프) 및 Aβ₄₂ (하단 그래피) 원섬유화를 요약 개시한, 막대 그래프.
도 2는 Aβ 아밀로이드 펩타이드의 올리고머 중합을 도시한 개략도.
도 3A-B는 모델링 구조 데이타로부터 유래된 Aβ-42 아밀로이드 펩타이드 (베타-시트 리본 구조)에 대한 크로몰린 약물의 결합을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 ALZT-OP1 처리 PS1 형질전환 마우스의 수영 미로 기억 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 5A-C는 크로몰린 소듐을 1주일 급성 투여함으로써 APP/PS1 마우스 뇌에서 Aβ 올리고머가 아닌 용해성 Aβ 단량체가 감소됨을 도시한 것이다.
도 6은 미세아교세포의 크로몰린 소듐 흡수 효과를 도시한 것이다.
도 7은 마우스에서 방사성 표지된 크로몰린의 생체분포를 도시한 것이다.

뇌졸중 후 신경-염증, 신경교 활성화 및 뉴런 소거를 비롯한, 허혈성 뇌졸중 이후의 뇌 병증에 대한 비만세포 매개의 부작용을 저해하는 화합물 및 제형은, 뇌졸중으로 유발되는 인지 저하를 늦추거나 또는 정지시키는데 도움이 된다. 허혈성 뇌졸중시, 뇌 영역으로의 혈액 공급이 감소하여, 그 영역의 뇌 조직이 파괴된다. 이러한 현상이 발생하는 원인으로는 4가지가 있다: 혈전증, 색전, 전신 저혈증 또는 뇌 정맥동 혈전증. 뇌 경색은 뇌에 혈액을 공급하는 혈관의 폐색으로 인해 발생하는 허혈성 뇌졸중 타입으로, 이러한 혈액 공급 감소는 그 영역의 조직의 사멸을 유발한다.

본 발명은 허혈성 뇌졸중 발병 후 요법에서 보조적 치료 (adjuvant treatment)를 포함한다. 특정 구현예들에서, 허혈성 뇌줄증 후 뇌 병증 및 신경교 활성화에 대한 비만세포-매개 부작용을 저해하기 위해, 크로몰린이 흡입에 의해 투여되며, 크로몰린은 신경퇴행을 야기하는 병리학적 케스케이드를 차단하는 것으로 예상된다. 허혈성 뇌졸중으로부터 회복 중인 개체에서, 크로몰린의 보조적 투여 (adjuvant administration)가 허혈성 뇌졸중 후 뇌 병리학적 측면에서 비만세포-매개 부작용을 저해하는 것으로 생각된다.

본 발명의 방법은 허혈성 뇌졸중 및 뇌 출혈시 잠재적인 뇌 손상을 치료 및 예방하기 위해 크로몰린 및/또는 그 유도체 뿐만 아니라 비만세포 안정화제로서 작용하기 위한 기타 비만세포 저해제를 투여함으로써, 뇌 병리학적 측면에서의 작용과 이의 유해한 작용을 해결하고자 한다.

본 발명은, 식 I의 화합물 또는 크로몰린을 치료학적 유효량으로 허혈성 뇌졸중을 앓고 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 치료 방법을 포함한다. 이 방법은 식 I의 화합물 또는 크로몰린과 조합하여, 하나 이상의 비만세포 저해제, 항염증제, 혈관 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다.

구체적으로, 본 발명은, 치료가 필요한 개체에게 마이크로화된 형태의 크로몰린을 투여함으로써 허혈성 뇌졸중의 작용들을 치료하고 동시에 큰 입자의 크로몰린 및 그 유도체와 관련된 독성 효과를 회피하는, 허혈성 뇌졸중 후 뇌 병리학적 측면에서 비만세포-매개 부작용을 저해하는 방법을 포함한다.

크로몰린은 실험실 검사에서 나노몰 농도에서 아밀로이드 β (Aβ) 펩타이드에 결합하여 이의 올리고머화를 저해하는 것으로 입증되어 있다. Aβ 단량체 및 이량체에 크로몰린의 결합으로, 올리고머 및 고차원의 응집체로의 중합을 방해한다 (Hori, et al., "FDA approved asthma therapeutic agent impacts Aβ in the brain in a transgenic model of Alzheimer's disease," J Biol Chem . (2015) 290(4):1966-78; Elmaleh, et al., "Evaluation of F-18 Radiolabeled Cromolyn as a Potential Aβ Polymerization Inhibitor and PET Tracer," Poster at Human Amyloid Image ( HAI ) Conference, Miami, Florida, January 2014, see Section 2.3).

본 발명의 연구에서, 크로몰린은 미세아교세포의 이코노미 (microglial economy)에 영향을 미치는 것으로 보인다. 아래에서 설명되고 도 6에 예시된 바와 같이, 크로몰린은 미세아교세포의 Aβ 제거를 촉진한다. 식 I 또는 II에 언급되는, 크로몰린과 비만세포 저해제의 조합된 작용 기전은, 이들 약물을 허혈성 뇌졸중 및 혈관성 치매와 같은 뇌 손상을 치료하기 위한 후보 물질로 만든다.

크로몰린과 더불어, 본 발명의 화합물은 하기 식 I 및 식 II로 예시되거나 또는 (I) 또는 (II)의 염 또는 에스테르이다:

상기 식에서,

X는 OH, C₁-C₆ 알콕실,　¹⁸F 또는 ¹⁹F이고;

n은 1, 2 또는 3이며,

식 I에서 Y 및 Z가 H이고, n = 1이면, X는 OH가 아니다.

바람직하게는, 식 (I) 및 (II)로 표시되는 화합물은, X가 ¹⁸F 또는 ¹⁹F이고; Y 및 Z가 독립적으로 C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알콕실, 할로겐, ¹⁸F, ¹⁹F 또는 H로부터 선택되고; n이 1, 2 또는 3이되, 식 I에서 Y와 Z 둘다 H일 경우 X가 OH가 아닌, 화합물을 포함한다.

본 발명의 화합물 및 제형에 사용되는 화합물의 제조 방법은 미국 특허 제 8,617,517에 기술되어 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 크로몰린은, X = OH; Y 및 Z = H인, 식 I로 표시된다.

본 발명의 방법은, 허혈성 뇌졸중 후 치료시 개체를 치료하는데 있어 식 (I) 및/또는 (II)의 크로몰린 또는 화합물의 사용을 포함한다. 일부 환자는 허혈성 뇌졸중 후 인지 장애 (PSCI)를 겪을 수 있다. 본 발명의 실험에서는, 크로몰린 (식 (I), X = OH, Y 및 Z = H)이 동물 모델에서 혈액-뇌 장벽을 침투함으로써, 크로몰린 흡입에 따른 혈장 생체이용성이 Aβ 올리고머화 및 침착을 방해하기에 충분한 농도로 뇌에 전달된다는 것을, 확인하였다.

크로몰린의 흡입 후 혈장내 크로몰린 농도는 개체내 및 개체별 편차가 높은 것으로 보고되어 있으며, 천식 환자에서는 크로몰린 흡수가 건강한 자원자에서의 흡수 보다 낮은 것으로 나타나있다 (Richards, et al., "Absorption and Disposition Kinetics of Cromolyn Sodium and the Influence of Inhalation Technique," J. Pharmacol. Exp. Therapeutics (1987) 241:1028-1032; Keller, et al., "Have inadequate delivery systems hampered the clinical success of inhaled disodium cromoglycate? Time for reconsideration," (2011) 8:1-17). 그러나, 본 발명의 제형은 활성 성분의 입자를 적절한 크기로 조정함으로써 이러한 문제를 방지한다.

그러나, 본 발명의 제형은 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 투여 방법은 흡입에 의한 투여이다. 활성 성분이 흡입에 의해 전달되는 경우, 활성 성분은 5 미크론 이하의 평균 입자 크기를 달성하도록 마이크로화된다. 입자 크기가 10 미크론 미만이고, 대부분의 입자가 2 - 5 미크론 범위에 해당되는 것이 중요한데, 그 이유는 흡입하였을 때 호흡기의 이차 기관지 (secondary bronchi)에 성공적으로 침착하는데 필수적이기 때문이다. 따라서, 식 (I) 또는 (II)의 크로몰린 또는 화합물은 약 1 내지 10 ㎛ 미만의 크기, 바람직하게는 5 ㎛ 이하, 더 바람직하게는 3 ㎛ 이하의 크기로 마이크로화된다. 예를 들어, 흡입에 의해 전달되는 활성 약제 성분은, API가 3 ㎛ 이하의 크기로 마이크로화된, 건조 분말이다. 나아가, 흡입 제형은 보다 효과적으로 폐에 침투하도록 제형화될 수 있다. 다른 예로, 제형은 경구용 환제 (oral pill)를 포함할 수 있다.

활성 약제 성분은 비만세포에 작용하는 하나 이상의 약물과 조합될 수 있다. 2가지 이상의 약물이 동시에 (예, 혼합물로서) 또는 순차적으로 (예, 별개의 2가지 전달 방법으로서) 전달될 수 있다. 다른 구현예에서, 용량은 치료되는 손상의 작용을 타이트레이션 (titration)하도록 계산된다.

본 발명의 제형은, 본 발명의 화합물 외에도, 하나 이상의 부가적인 약물을 더 포함한다. 이러한 부가적인 약물로는, 비-제한적으로 비만세포 저해제, 항염증제 또는 혈관 치료제를 포함한다. 이 리스트는 일반적인 약물 타입에 의한 것일 수 있으며, 범주에 해당되는 특수 약물들의 구성된 제2 리스트에 의한 것일 수 있다. 일 특정 구현예에서, 부가적인 약물은 이부프로펜이다.

투여되는 API 용량은 특히 질병의 상태, 건강, 나이, 성별, 체중과 같은 개체의 다양한 조건들에 따라 결정될 것이다. 제형이 흡입용으로 제형화되는 경우, 전형적으로 본 발명의 크로몰린 또는 화합물의 1회분 (single dose) 양은 약 5 내지 약 20 mg, 바람직하게는 약 10 내지 19 mg, 더 바람직하게는, 약 15 내지 18 mg이다. 일 특정 구현예에서, 본 발명의 크로몰린 또는 화합물의 양은 약 17.1 mg이다.

예를 들어, 제형은 건조 분말 흡입기 장치를 사용해 이용하도록 조제된 크로몰린 분말 블렌드를 포함할 수 있다. 각 단위 (unit)는 크로몰린 17.1 mg과 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 것이다. 제형은 현재 천식 치료를 위해 투여되는 1일 4회로 승인된 용량 수준의 크로몰린 용량 (1일 당 크로몰린 총량 80 mg)에 50% 미만인 양을 하루에 2번 (34.2 mg) 투여할 수 있다.

매일 투여하는 경우, 전형적으로 식 (I) 또는 (II)의 크로몰린 또는 화합물의 양은 약 5 mg 내지 약 45 mg일 것이며; 바람직하게는, 일일 용량 (daily dose)의 양은 약 20 mg 내지 약 38 mg일 것이며, 더 바람직하게는, 그 양은 약 30 gm 내지 약 36 mg일 것이다. 예를 들어, 일일 용량, 즉 34.2 mg의 크로몰린 (17.1 mg 크로몰린, 건조 분말 흡입기를 사용해 아침 및 저녁에 매일 2회 흡입)은 뇌졸중 후 신경-염증을 저해하고, 비만세포 이동/탈과립화, 신경교 활성화 및 뉴런 소실을 제한하며, 잠재적으로 인지 저하를 늦출 것이다.

식 (I) 또는 (II)의 크로몰린 또는 화합물은, 제2 활성 성분과 함께 투여되는 경우, 이부프로펜과 함께 투여될 수 있다. 전형적으로, 크로몰린은 약 17.1 mg의 양으로 투여되고, 이부프로펜은 20 mg으로 투여된다 (예, 2번 경구 투여되는 10 mg의 용량으로 연속 복용됨). 다른 예로, 식 (I) 또는 (II)의 크로몰린 또는 화합물은 34.2 mg으로 투여되고 (예, 17.1 mg 씩 2번 연속 흡입 용량으로 투여), 이부프로펜을 20 mg으로 투여된다. 바람직하게는, 식 (I) 또는 (II)의 크로몰린 또는 화합물의 용량은 2분 이하의 간격으로 투여된다.

인간 약동학 데이타에 따르면, 혈장내 크로몰린 농도는 크로몰린 17.1 mg을 흡입하였을 때 23.3±16.9분 (범위: 5-60분)에 최고치 47.1±33.6 ng/ml (범위: 14.0 - 133 ng/ ml)에 도달하였다. CSF에 의한 크로몰린 흡수도 마찬가지로 빨랐다. CSF에 존재하는 크로몰린은 흡입 후 20분 내지 2시간내에 검출되었으며, 측정하는 동안 크로몰린 농도는 증가하였다 (요추 천자 카테터를 통한 CSF 수집의 한계로 인해, 샘플을 4시간 이상 수집할 수 없었음).

크로몰린 17.1 mg을 흡입한 후 4시간 경과시 CSF내 크로몰린의 농도는 0.24±0.08 ng/ml (범위: 0.15-0.36 ng/ml)이었으며, 이는 0.46±0.15 nM에 해당한다. 이 수준은 허혈성 뇌졸중 후 신경-염증 손상을 늦추는데 충분한 것으로 추정된다.

혈장에서 크로몰린 제거는 신속하게 이루어졌으며, 평균 체류 시간은 3.3±2.9h (범위: 0.79-12.1h)이며, 반감기는 약 2.3h이다. 흡입 후 12시간 경과시, 혈장내 크로몰린 농도는 미미할 것이다. CSF에서도 비슷한 소거 속도인 것으로 가정하여, 하루종일 혈장 및 CSF에서 충분한 수준의 크로몰린 농도를 유지하기 위해, 크로몰린을 하루에 2번씩 장기간 흡입하는 용법을 선택하였다.

식 (I) 또는 (II)의 크로몰린 또는 화합물을 일일 2회로 장기간 제안된 용량으로 복용하는 경우, 사이토카인 생산, 미세아교세포 활성화 및 비만세포 증식을 타이트레이션 및 통제함으로써, 약물의 장기 사용으로 인한 잠재적인 독성 문제 없이, 허혈성 뇌졸중 후 신경-염증 손상을 늦추거나 중단시킬 것으로 추정된다.

크로몰린은, 입자 크기 분포가 흡입용으로 적합할 경우 (d₅₀<5　㎛ 및 d₉₀<10　㎛), 흡습성 물질 (hygroscopic material)일 수 있다. 즉, 본 발명의 제형은 제품의 성능 및 안정성을 개선하기 위해 분말 제형에 하나 이상의 소수성 부형제를 포함할 수 있다. 소수성 부형제의 첨가는 건조 분말 흡입 제형에 수분으로 인한 부정적인 효과를 방지하는 고유한 내성을 제공해준다. 일 예에서, 소수성 부형제는, 건조 분말 흡입기 (DPI) 제품에 상업적으로 사용된다는 점에서, 마그네슘 스테아레이트이다. 또한, 이의 안전성 프로파일이 충분히 연구되어 있으며, 흡입 제품에서의 사용이 제안되어 있다. 특정 구현예에서, 희석제로서 락토스 일수화물이 부가적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 제형에 사용되는 그외 부형제로는, 비-제한적으로 하이드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC)를 포함한다. 바람직하게는, 부형제는 클리어 #3 HPMC (clear #3 HPMC)이다.

제형의 예들을 표 1에 나타낸다.

표　1. ALZT-OP1a (크로몰린) 제형

화합물	품질 표준	기능	ALZT-OP1a 조성물
				약물 제품
				% w/w	mg/캡슐
크로몰린 소듐 (마이크로화됨)	USP	활성		58.0	17.1^a
락토스 일수화물	NF	희석제		40.0	12.8
마그네슘 스테아레이트 (마이크로화됨)	NF	안정제		2.0	0.6
하이드록시프로필메틸셀룰로스 캡슐^b	In-house	캡슐화제		NA	NA
총				100%	32
^a 캡슐 당 크로몰린 소듐, USP의 양은 무수물 기준으로 17.1 mg임 (현 상태 기준 (as-is basis)으로는 캡슐 당 18.6 mg). ^b 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 캡슐은 건조 분말 흡입기를 통해 약물 제품을 계량 및 전달하는 기능만 수행하며, 투여시 섭취되지 않음.

RS01은 공기 저항 (airflow resistance) 측면에서 다양한 버전, 즉 40L, 60L, 80L 및 100L 버전으로 상업적으로 입수가능하다. 40L 및 60L 버전은 고-저항성 디바이스이고, 이의 사용은 노년층, 어린이 및 중증 호흡 장애 환자를 제외한 정상적인 호흡 기능을 가진 특정 환자 집단 범위로 제한된다.

표　2. API의 선택 치료 제형들에 대한 NGI 검사 결과.

NGI 스테이지	1차	2차	3차	평균 (n=3)
디바이스	1258.81	1715.34	1935.36	1636.50
목 (Throat)	2302.09	1881.67	1976.39	2053.38
프리-세퍼레이터	1253.40	987.22	1091.60	1110.74
스테이지 1	751.75	767.65	815.73	778.38
스테이지 2	3492.75	3724.59	3537.15	3584.83
스테이지 3	3050.88	3650.68	3191.88	3297.82
스테이지 4	2444.30	2866.43	2512.38	2607.70
스테이지 5	1234.73	1486.88	1252.32	1324.64
스테이지 6	405.14	442.18	393.11	413.48
스테이지 7	83.40	121.44	103.88	102.91
MOC	43.92	66.63	50.16	53.57
총 회수	16321.15	17710.71	16859.97	16963.94
총 ex-device	15062.34	15995.37	14924.60	15327.44
스테이지 총합 T - 2 (>3.86㎛)	7799.98	7361.13	7420.87	7527.33
스테이지 총합 2 - MOC (<6.9㎛)	10755.11	12358.82	11040.88	11384.94
스테이지 총합 3 - MOC (<3.86㎛)	7262.37	8634.24	7503.73	7800.11
스테이지 총합 4 - MOC (<2.44㎛)	4211.48	4983.56	4311.85	4502.30
회수율 %	96.01	104.18	99.18	99.79

다른 제형으로, 본 발명의 제형은, 1회분 (monodose) 건조 분말 흡입기 (DPI)로 사용하기 위한 캡슐제와 같은 캡슐제이다. 젤라틴 또는 HPMC 캡슐제가 1회분 DPI 제품으로 상업적으로 이용된다. 이러한 목적으로, HPMC 캡슐제는 RS01 DPI 흡입기 디바이스와의 상용성이 공지되어 있으므로, 바람직한 구현예에서는, HPMC 캡슐제가 사용된다. 바람직하게는, 캡슐제 제형에 사용되는 부형제는 크로몰린 소듐과 같은 수분에 민감한 약물에 매우 적합하여야 한다. 전형적으로, 캡슐제는 수분 함량이 낮아야 하며, 50% 상대 습도 (RH)에서 측정하였을 때 전형적으로 13% 내지 16%인 젤라틴 카운터파트와 비교해, 전형적으로 약 4% 내지 6%이어야 한다.

본 발명의 방법에서 식 (I) 또는 (II)의 크로몰린 또는 화합물을 이용하는 경우의 이점으로는 친지성 (lipophilicity, LogP)과 극성 표면 면적 (polar surface area) 등이 있다. 예를 들어, 크로몰린 및 이의 불소 유사체, 즉 F 유사체는 각각 1.39 및 2.1의 LogP 값을 가진다 (표 3). LogP >3인 약물은 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과하지 못하거나 또는 제한이 있는 것으로 추정된다. BBB 통과에 영향을 주는 다른 인자는 분자의 크기, 전하 및 극성 표면 면적 (PSA)이다. 크로몰린 및 이의 F 유사체의 경우, PSA가 각각 125.43 및 127.20으로, 양호한 뇌 침투 범위에 해당된다.

표　3. 크로몰린 및 크로몰린 유사체의 뇌 침투에서의 LogP 및 극성 표면 면적 계산

화합물	구조	MW	LogP*	PSA**
F 유사체		514.32	2.1	127.20
크로몰린		512.33	1.39	125.43

* Log P는 ChemDraw Pro Software, Version 10에 의해 결정됨

** 분자 극성 표면 면적 (PSA)은 http://www.daylight.com/meetings/emug00/Ertl/tpsa.html을 이용하여 결정됨.

Aβ 아밀로이드 펩타이드에 크로몰린의 결합 및 이의 고차원 올리고머(이는 뇌에 포획됨)로의 응집 저해는, 복수의 독립적인 분석 방법들에 의해 검증되었다. Aβ 중합을 모니터링하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방식들 중 한가지는 티오플라빈 T 결합 분석이다 (Elmaleh, 2014; Hori, 2015). 티오플라빈 T가 아밀로이드 응집체와 같은 베타-시트가 다량 포함된 구조에 결합하면, 염료가 강화된 형광을 발색하며, 특징적인 적색이 방출 스펙트럼에서 쉬프트된다. Aβ 펩타이드 5　μM를 여러가지 농도의 약물과 더불어 10　μM 티오플라빈 T와 혼합하였다. 약물이 첨가되지 않은 경우, Aβ의 중합이 60-180분 동안 티오플라빈 T의 형광을 증가시키는 것으로 관찰된다.

티오플라빈 T는 아밀로이드 원섬유 구조에만 결합할 수 있는 반면, ALZT-OP1a (크로몰린) 저해제는 모노머와 미스폴딩된 아밀로이드 베타 펩타이드의 저차원의 올리고머 중간산물에 결합한다 (약물 첨가한 경우와 약물 첨가하지 않은 경우, 5　μM Aβ; 티오플라빈 10　μM; 헤파린 0.5　mg/ml, 200 ㎕ 분석 부피) (데이타는 도시 안함). 크로몰린을 나노몰 농도로 첨가하였을 때, 도 1에 도시된 바와 같이, Aβ 응집이 저해되는 것으로 관찰되었다. 도 1의 좌측 패널은, DMSO (상단 패널) 또는 크로몰린 소듐 (5nM, 50nM 및 500nM, 하단 패널) 첨가 후, Aβ가 원섬유를 형성한 경우에 티오플라빈 T 형광이 증가하는 그래프들의 예를 도시한다. 합성 Aβ40 (좌측 컬럼) 또는 Aβ42 (우측 컬럼) 펩타이드의 원섬유화를 1시간 동안 추적하였다. 대응되는 Vmax 인덱스 (milli- unit/minute)를 각 그래프에 표시한다. 도 1의 우측 패널에서, 막대 그래프는 Aβ40 (상단 그래프) 및 Aβ42 (하단 그래피)의 원섬유화를 요약 개시한 것으로, Aβ42의 원섬유화 과정에 대한 효과가 좀더 약하게 관찰되었지만, 크로몰린 소듐의 존재시 원섬유화가 현저하게 감소하였다.

펩타이드 올리고머 응집

각각의 4번의 시험관내 분석에서, 크로몰린 및 이의 불소화 유도체는, 도 2에 나타낸 바와 같이, Aβ 아밀로이드 펩타이드가 올리고머 및 고차원의 응집체로 중합되는 것을 나노몰 농도에서 효과적으로 저해한다. 도 3은 크로몰린이 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합하는 것을 모델링하기 위해 구조 데이타에 대한 예비 분석을 예시한 것으로, 크로몰린은 아밀로이드 펩타이드의 베타 가닥 표면에 결합한다. 구조 데이타의 모델링을 통해 수득한, Aβ-42 아밀로이드 펩타이드 (베타-시트 리본 구조)에 크로몰린 약물이 결합된, 측면도 (상단 패널) 및 정상도 (하단 패널).

사이토카인 생산에 미치는 효과

크로몰린은 마우스 뇌 저산소성-허혈증 모델에 유효한 것으로 입증되어 있다. 이 모델에서 일차 매개인자는 종양 괴사 인자 알파이다. 크로몰린-처리된 마우스는 비만세포 이동 감소, 뇌 손상/뉴런 소실 저하, 신경교 활성화 감소 및 뇌 위축증 저하를 나타내었다. 본 실험에서, 크로몰린이 비만세포를 타겟팅하여, 사이토카인의 생산을 저해함이 입증되었으며, 즉 허혈성 뇌졸중 후 이와 관련된 염증 반응을 치료하는데 부가적인 기능을 가진다 (Jin, 2009).

알츠하이머 질환의 동물 모델

모리스 워터 네비게이션 검사 (Morris Water Navigation Test)

마우스 그룹 3종 (각 그룹 당 동물 5마리)에 대해 모리스 워터 네비게이션 검사를 수행하였다 (비공개 데이타). 4월령의 어린 APP/PS1 마우스 2 그룹 (AD 동물 모델로서 돌연변이 마우스)을 대상으로 테스트하였다. APP/PS1 한 그룹에는 크로몰린과 이부프로펜 조합을 6개월간 매주 2회로 복막내 처리하고 (도 4: 가운데 패널 그룹), 2번째 그룹에는 AD 대조군으로서 무 처리하였다 (도 4: 좌측 패널의 그룹). 3번째 그룹은 무처리 야생형 (WT) 정상 대조군이다 (도 4: 우측 패널). 플랫폼 위치를 기억하도록 마우스를 7일간 훈련시켰다. 8일째에, 플랫폼을 이동시키고, 플랫폼 영역을 건너는 횟수를 기록하였다.

ALZT-OP1 처리한 APP/PS1 형질전환 마우스는 WT 정상 대조군과 비슷한 수준의 거동을 나타내었으나, 약물 비-처리된 PP/PS1 형질전환 마우스에서는 기억 미로 경로 인지력이 저하되었다 (도 4).

APP/PS1 마우스에 단기간 OLZT-OP1a 처리

생체내, 용해성 Aβ의 전체 농도는 크로몰린 소듐을 1주일 말초 투여한 이후에 50% 이상 감소한다 (Hori, 2015) (도 5). 부가적인 미세투석 실험에서, 크로몰린 소듐이 뇌내 용해성 Aβ의 반감기를 단축시키는 것으로, 또한 확인되었다. 크로몰린 소듐을 1주일간 3가지 용량 수준으로 매일 7.5월령의 APP/PS1 마우스에 복막내 주사하였다. 도 5, 패널 (A) 일일 주사하고 1주일 경과시, 트리스-완충화된 염수 (TBS) 용해성 Aβx-40 (좌측 그래프) 및 Aβx-42 (우측 그래프)를, Aβ ELISA를 사용해, 구아니딘 (Gdn)-HCl과 예비-인큐베이션 조건 (검정색 막대) 또는 예비-인큐베이션하지 않는 조건 (백색 막대)에서 측정하였다. Gdn-HCl와 인큐베이션한 경우의 값은 TBS 용해성 Aβ의 총 농도이고, Gdn-HCl와 인큐베이션하지 않은 경우의 값은 Aβ 단량체의 농도이다. 도 5, 패널 (B) TBS 용해성 뇌 추출물내 Aβ 올리고머를 82E1/82E1 Aβ 올리고머 특이적인 ELISA를 사용해 측정하였다. 도 5, 패널 (C)는 항-Aβ 항체 (6E10 및 82E1)를 이용한 TBS 용해성 뇌 추출물의 면역블롯팅 결과를 도시한다 (좌측 패널). Aβ 단량체의 밀도를 정량하였다 (우측 그래프) (n = 3-5마리/그룹; *, P<0.05, **, P<0.01). 이들 데이타는 Aβ 이코노미에 대한 말초 투여된 FDA 승인 약물의 명확하고 강력한 효과를 시사하는데, 이는 AD에서 잠재적인 장기적인 효과에 대한 추가적인 조사 필요성을 뒷받침해준다 (Hori, 2015).

도 6A-B는 PBS 또는 크로몰린 소듐 (3.15 g/kg)으로 처리된 APP/PS1 마우스의 뇌 단편에서 Aβ 및 미세아교세포 마커 Iba1의 면역염색 결과를 도시한 것이다. 염색 결과를 중첩하는 시스템 분석을 통해, 크로몰린 소듐이 투여된 동물에서 아밀로이드와 Iba1 면역반응성이 겹치는 영역의 %가 높은 것으로 (상단 패널) 확인되었으며, 이는 화합물에 의해 유발되는 플라그 주위로의 미세아교세포의 동원이 다소 증가되었음을 의미하는 것일 수 있다. 나아가, 합성 Aβ40 및 Aβ42 펩타이드를 크로몰린 소듐의 존재 또는 부재 하에 미세아교세포의 시험관내 배양물에 적용하였다. 16시간 인큐베이션한 후, 크로몰린 소듐 존재 조건에서는 Aβ40 및 Aβ42 수준에서 용량-의존적인 감소가 관찰되었는데, 이는 크로몰린 소듐이 Aβ 응집 기전에 미치는 효과가 미세아교세포의 흡수에 의한 Aβ 제거 촉진일 수 있다는 것을 (하단 패널) 시사해준다. 이들 생체내 결과와 시험관내 결과를 종합하면, 크로몰린 소듐이 Aβ의 원섬유 형성을 저해할 뿐만 아니라 또한 미세아교세포의 활성화 및 Aβ 제거에 영향을 미칠 수 있는 것으로, 시사될 수 있다.

도 6에서, 패널 A는 크로몰린 소듐 (3.15 mg/kg) 또는 PBS를 7일간 매일 처리한 마우스에서 아밀로이드 침착물 (6E10, 녹색)과 미세아교세포 (Iba1, 적색)의 위치를 도시한 사진이다. 각 침착물에서 Iba1 양성인 아밀로이드의 %를 계산한 결과, 크로몰린 소듐 처리 후 Aβ 및 Iba1 간에 중첩되는 영역이 증가하였다 (PBS의 경우 n = 마우스 3마리, 크로몰린 소듐의 경우 n = 5마리. 각 동물에서 플라그 10-20개를 평가하였다). 스케일 바 = 10 ㎛.

도 6에서, 패널 B, 미세아교세포를 배양한 다음 50 nM 합성 Aβ40 또는 Aβ42 및 0, 10 nM, 10 μM 또는 1 mM 크로몰린 소듐과 함께 16시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지내 Aβx-40 (좌측 패널) 및 Aβx-42 (우측 패널)를 Aβ ELISA로 측정하였으며, PBS 대조군에 대해 미세아교세포 수를 정규화 (normalization)하였다 (n=3번의 실험; *, P<0.05, **, P<0.01)

안전성 약학 실험

크로몰린이 허가되었을 때 1970년대에는 공식적인 안전성 약학 실험이 일반적으로 수행되지 않았기 때문에, 공식적인 동물 안전성 약학 실험로부터 유래된 공개적으로 공개된 데이타는 2종의 API 성분들에 대해 입수할 수 없었다. 그러나, 의도하지 않은 효과가 있을 가능성은 제시된 임상 용량에서는 거의 없음을 시사하는 광범위한 인간 데이타가 존재하고 있다.

발표된 연구들에서 요약 개시된 인간을 제외한 영장류에 대한 몇몇 실험들에서, 심전도 (ECG) 및 호흡 검사가 수행된 것으로 기술되어 있다 (Beach, et al., "Cromolyn Sodium Toxicity Studies in Primates," Toxicol. Appl. Pharmacol. (1981) 57, 367-400). 흡입 실험으로 구체적인 폐 및 심혈관 (CV) 기능을 검사한 결과, 치료 효과는 없는 것으로 나타났다 (표 3).

마우스에서 방사성 표지된 크로몰린의 생체분포

크로몰린의 여러 장기내 분포를 마우스에서 조사하였다. 방사성 표지된 크로몰린을 정맥내 (IV) 주사하였다. 도 7은 IV 주사 후 5, 30 및 60분째에, 여러 장기에서의 방사성 표지된 크로몰린의 흡수를 나타낸 것이다 (그래프에서 각각 청색, 적색, 녹색 막대). 뇌 조직에 축적된 방사성 표지된 크로몰린의 양은 1% (용량/g)이며, 주사 후 1시간 동안 거의 또는 전혀 없어지지 않았다. 최대 장기 축적은 폐 및 간에서 측정되었다.

인간에서의 효능은, 55-75세의 정상적인 건강한 지원자를 대상으로 실시된, 크로몰린 1회분 흡입 용량 17.1 mg을 투여한 후 이루어진 혈장 및 CSF에서의 크로몰린 약동학 (PK) 특성을 통해 설명된다 (이부프로펜 1회 용량 10 mg이 경구로 함께 복용됨). 또한, 55-75세의 정상적인 건강한 지원자를 대상으로 크로몰린 34.2 mg을 투여한 다음 혈장 및 CSF에서 크로몰린의 약동학 (PK) 특성을 조사하였다 (흡입 용량 17.1 mg을 2분 이하의 간격으로 2회 연속 투여하고, 이부프로펜 캡슐제 10 mg을 2번 경구 투여함).

그 결과는 AZTherapies의 I상 약동학 실험 리포트에 요약 개시되어 있다 (AZTherapies, 2015).

크로몰린 1회분 (17.1 mg)을 흡입할 경우, 크로몰린 혈장내 농도는 23.3± 16.9분 (범위: 5-6분)에 최대치 47.1±33.6 ng/ml (범위: 14.0 - 133 ng/ ml)에 도달하였다. 혈장내 평균 체류 시간은 3.3±2.9 h (범위: 0.79-12.1h)이며, 이는 신속 내지 중간 수준의 제거 속도를 의미한다. CSF내 크로몰린 농도는 2시간째부터 4시간째까지 계속 증가하였다. 1회 흡입하고 4시간 경과시, 크로몰린 농도는 0.24±0.08 ng/ml (범위: 0.15-0.36 ng/ml)이었다.

크로몰린을 2배 용량 (34.2 mg)으로 흡입할 경우, 크로몰린은 22.2 ±19.4분 (범위: 5-60분)에 혈장내 최고 농도 95.0±45.5 ng/ml (범위: 36.1-236 ng/ml)에 도달하였다. 혈장내 평균 체류 시간은 2.8±1.0 h (범위: 1.0-5.4 h)이었으며, 이는 혈장에서의 소거 속도가 신속 내지 중간 수준임을 의미한다.

크로몰린을 2배 용량을 흡입한 지 4시간 후 CSF내 크로몰린 농도는 0.36± 0.17 ng/ml (범위: 0.16-0.61 ng/ml)이었다. AUC (혈장)는 1회분 (17.1 mg) 흡입시 147.5±67.1 ng/mlxh (범위: 44.7-287.0 ng/mlxh)에서 2회분 (34.2 mg) 흡입시 254.4±93.8 ng/mlxh (범위: 122.1-443.3 ng/mlxh)로 증가하였다. 이들 크로몰린 농도는, 약물의 장기 사용으로 인한 독성 문제없이, 사이토카인 생산, 미세아교세포의 활성화 및 비만세포 이동을 효과적으로 타이트레이션 및 통제할 수 있는 것으로 추정된다.

8시간 동안의 배가된 농도로 추정된, 17.1 mg을 투여한 후 CSF에서 관찰되는 크로몰린 농도는, 예를 들어, 추정되는 일일 아밀로이드 플라그 22-27　ng (27 ng/512 MW　=　0.06　nM) 및 관련 염증 반응을 타이트레이션하기 위해 필요한 함량의 10배 보다 높은 수준 (15배)을 형성한다.

흡입된 크로몰린은 심부 폐를 통해 혈액으로, 뇌로, 그리고 CSF로 전달된다. 뇌에서 CSF로의 크로몰린 흐름은 느리며, 요추 천자 설치된 카테터를 사용하였을 때 최대 4시간까지 증가하는 프로파일이 측정되었다. 추가적인 CSF 약동학 실험을 통해 흡수 및 워시아웃 CSF 샘플링 곡선을 완성하여야 한다.

크로몰린의 혈장 소거 반감기는 1.75 ± 0.9 h (범위: 0.5-3.7 h)이었다. 흡입한 지 12시간 후, 혈장내 크로몰린의 농도는 미미할 것으로 예측된다. CSF에서도 비슷한 소거 속도일 것이라고 가정하면, 크로몰린을 매일 2번 장기간 흡입하는 용법이 혈장 및 CSF내 크로몰린 농도를 하루종일 충분한 수준으로 유지시킬 것으로 예상된다.

매일 2회씩 장기간 복용하는 것으로 제안된 용량 17.1 mg은, 사이토카인 생산, 미세아교세포의 활성화 및 비만세포 증식을 타이트레이션 및 통제함으로써, 약물의 장기간의 사용으로 인한 잠재적인 독성없이, 허혈성 뇌졸중후 신경-염증성 손상을 늦추거나 또는 중단시킬 것으로 추정된다.

Claims

허혈성 뇌졸중의 치료 방법으로서,
하나 이상의 식 I 또는 식 II의 화합물을 치료학적 유효량으로 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 화합물이 식 I 또는 식 II를 가지거나, 또는 (I) 또는 (II)의 염 또는 에스테르인, 치료 방법:

상기 식에서,
X는 OH, C₁-C₆ 알콕실,　¹⁸F 또는 ¹⁹F이고;
Y 및 Z는 독립적으로 C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알콕실, 할로겐, 치환 또는 비치환된 C₁-C₆ 아민, ¹⁸F, ¹⁹F 또는 H로부터 선택되고; 및
n은 1, 2 또는 3임.
제1항에 있어서,
X가 ¹⁸F 또는 ¹⁹F이고; Y 및 Z가 독립적으로 C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알콕실, 할로겐, ¹⁸F, ¹⁹F 또는 H로부터 선택되고; n이 1, 2 또는 3인, 치료 방법.
제1항에 있어서,
식 I에서, Y 및 Z가 H이고 n = 1이면, X는 OH가 아닌, 치료 방법.
제1항에 있어서,
하나 이상의 부가적인 약물을 투여하는 단계를 더 포함하는, 치료 방법.
제4항에 있어서,
상기 부가적인 약물이 비만세포 저해제, 항염증제 또는 혈관 치료제인, 치료 방법.
제4항에 있어서,
상기 부가적인 약물이 이부프로펜인, 치료 방법.
제4항에 있어서,
상기 화합물 및 상기 부가적인 약물이 동시에 또는 연속적으로 투여되는, 치료 방법.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 크로몰린인, 치료 방법.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 크로몰린 소듐인, 치료 방법.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 흡입에 의해 투여되는, 치료 방법.
제10항에 있어서,
상기 화합물이 평균 입자 크기가 10 미크론 미만인 입자로 마이크로화 (micronization)된 것인, 치료 방법.
제10항에 있어서,
상기 화합물이 평균 입자 크기가 5 미크론 미만인 입자로 마이크로화 (micronization)된 것인, 치료 방법.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 약 5 내지 20 mg의 양으로 투여되는, 치료 방법.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 약 17.1 mg/kg의 양으로 투여되는, 치료 방법.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 하루에 2번 투여되는, 치료 방법.