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KR20180017511A - 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트 - Google Patents

고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트 Download PDF

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KR20180017511A
KR20180017511A KR1020160101431A KR20160101431A KR20180017511A KR 20180017511 A KR20180017511 A KR 20180017511A KR 1020160101431 A KR1020160101431 A KR 1020160101431A KR 20160101431 A KR20160101431 A KR 20160101431A KR 20180017511 A KR20180017511 A KR 20180017511A
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pla2g7
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김민주
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명의 고혈압 관련 예후 또는 위험도를 평가하는 방법에 관한 것으로, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 PLA2G7(phospholipase A2 group VII) V279F의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

Description

고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR ASSESSING THE RISK OF HYPERTENSION}
본 발명은 특정 바이오마커에 기반하여 고혈압 관련 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
고혈압은 개개인의 유전적 배경과 다양한 환경인자의 상호작용에 의해 발병되는 다인자성 질환이다.
고혈압은 관동맥질환, 뇌졸중, 만성신장질환의 주요한 위험인자이므로, 고혈압의 예방은 사회적·공중 위생학적으로 중요한 일이다. 고혈압을 예방하기 위한 하나의 방법은, 고혈압 감수성 유전자를 동정하는 것이다.
한편, Lp-PLA2(Lipoprotein-associated phospholipase A2)는 혈액을 순환하며 LDL 콜레스테롤 입자에 결합하는 효소로서, Lp-PLA2가 결합된 콜레스테롤 입자가 동맥 혈관벽에 흡착하면 산화가 일어난다(Libby, Ridker, & Maseri, 2002; Macphee, et al., 2001; Suckling, et al., 2003; Tsimihodimos, et al., 2003). 그러나 체내에서 동맥경화 촉진(pro-atherogenic) 또는 항동맥경화(anti-atherogenic)와 관련된 Lp-PLA2의 역할에 대한 상반된 연구결과들이 제시되고 있다.
PLA2G7(phospholipase A2 group VII) 유전자 상의 단일염기다형성(SNP)에 대한 연구에 의해 Lp-PLA2의 활성은 유전적 요인과 밀접하게 관련되고 있음이 밝혀졌다.
이와 관련하여 V279F SNP는 이형접합체 대립인자를 가진 경우 효소 활성을 가지나, 동형접합체의 경우 주목할 만한 효소 활성이나 단백질 수준을 가지지 않는다. 그러나, 상기 Lp-PLA2의 활성이 고혈압 관련 질환의 발병에 있어서 어떤 작용을 하는지 명확히 밝혀진 바 없으며, 비만도 관련 직접적인 연관성은 연구된 바 없다.
Lp-PLA2 V279F 다형성과 연관된 Lp-PLA2 활성 및 고혈압 간의 관계를 명확히 하고자 광범위하고 효율적으로 통제되는 연구가 요구된다. 본 발명자들은 V279F의 변형에 의한 Lp-PLA2의 활성 및 고혈압에 대한 마커를 포함하는 고혈압 질환 인자의 연관성을 연구하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 PLA2G7 유전자상의 특정 SNP를 검출하고 이를 통해 고혈압 관련 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 PLA2G7(phospholipase A2 group VII) V279F의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 PLA2G7(phospholipase A2 group VII) V279F의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 낮은 것으로 판단할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 PLA2G7 단백질의 279번째 아미노산의 변이, 또는 상기 단백질의 279번째 아미노산을 암호화하는 유전자(rs76863441)의 변이를 판단할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 방법은 (c) 상기 대상체의 비만도를 측정하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 체질량지수(BMI)를 측정할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 대상체의 비만도가 높은 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 방법은 기준시점으로부터 3년 이후 고혈압의 위험성을 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, PLA2G7(phospholipase A2 group VII) 단백질의 279번째 아미노산을 암호화하는 단일염기다형성(SNP) 부위(rs76863441)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 고혈압 관련 질환의 진단용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, PLA2G7(phospholipase A2 group VII) 단백질의 279번째 아미노산에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 고혈압 관련 질환의 진단용 키트가 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 특정 유전자의 다형성(polymorphism)에 기반하여 고혈압 관련 질환의 위험도를 효과적으로 예측할 수 있다.
특히, 상기 방법은 기준시점으로부터 3년 이후의 고혈압 가능성을 예측할 수 있으므로 고혈압 관련 질환에 대한 선제적인 대응 가능성을 제공한다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 PLA2G7 V279F의 유전적 다형성에 따른 Lp-PLA2 활성, 수축기 혈압, 산화 LDL의 변화를 3년간 추적한 결과이다.
도 2는 과체중(*) 및 정상체중(○) 참가자에 있어서 PLA2G7 V279F의 유전형에 따른 Lp-PLA2 및 수축기 혈압의 변화(Δ)의 연관성, 산화 LDL 및 수축기 혈압의 변화의 연관성을 나타낸 것이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 PLA2G7(phospholipase A2 group VII) V279F의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.
상기 대상체(subject)는 진단 대상으로서 인간일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 고혈압 관련 질환의 위험성을 평가하고자 하는 상기 대상체에서 분리된 시료로써, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 복막액, 활막액, 타액, 소변, 대변 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있으며, 구체적으로 혈액에서 분리된 혈장일 수 있다.
상기 PLA2G7(phospholipase A2 group VII) 유전자는 당해 분야에서 일명 Lp-PLA2, LDL-PLA2, 혈소판 활성화 인자 아세틸 가수분해효소(PAF 아세틸 가수분해효소; PAFAD 또는 PAFAH)로서 지칭된다. 상기 Lp-PLA2 는 저밀도 지단백질(LDL)이 산화 형태로 전환될 때 포스파티딜콜린을 라이소포스파티딜콜린으로 전환하는 역할을 한다. 상기 효소는 산화된 포스파티딜콜린의 sn-2 에스테르를 가수분해시켜 라이소포스파티딜콜린 및 산화적으로 변형된 지방산을 제공하는 것으로 알려진다.
본 발명자들은 고혈압 관련 질환에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과 PLA2G7 유전자상의 특정 SNP(rs76863441)가 효소의 활성에 영향을 미치고, 이를 통해 고혈압 관련 질환과 연관될 수 있음을 확인하였다.
상기 “단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.
예컨대, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)과 같이 단일염기에서 차이가 있을 때, 이를 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며 대다수의 SNP는 두 개의 대립 유전자를 포함한다.
상기 SNP는 한 집단(population)내에서 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 일부 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 상기 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있으므로, 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.
상기 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열의 변화를 수반하는 것은 아니다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고, 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 상기 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 상기 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시킬 수 있고 상기 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성할 수 있다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.
인간의 DNA 서열 상의 변이는 질병의 발병 또는 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 대한 인체의 반응에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 상기 SNP는 맞춤형 의약의 중요한 도구(key enabler)로 활용될 수 있다. 특히, 상기 SNP는 질병군 또는 비질병군 간의 게놈 부위를 비교하는 방식으로 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 고려될 수 있다. 상기 SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). 상기 SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 표현형에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 자동화된 유전자형규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000).
한편, 상기 (b) 단계에서 상기 PLA2G7(phospholipase A2 group VII) V279F의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 낮은 것으로 판단할 수 있다.
상기 PLA2G7 279VV 유전형 및 과체중은 상승 작용을 통해 고혈압의 위험성을 증가시킬 수 있는 반면, 상기 PLA2G7 279F 대립형질은 Lp-PLA2 활성을 저하시키므로 과체중에도 불구하고 결과적으로 고혈압 위험성을 감소시킬 수 있다.
따라서, 상기 방법은 (c) 상기 대상체의 비만도를 측정하는 단계;를 더 포함할 수 있고, 상기 (c) 단계에서 체질량지수(BMI)를 측정할 수 있다.
이 때, 상기 대상체의 비만도가 높은 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있고, 특히, PLA2G7 279VV 유전형과 함께 비만도가 높은 것으로 판단될 때 고혈압 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.
또한, 상기 방법은 기준시점으로부터 3년 이후 고혈압의 위험성을 판단할 수 있다. 상기 “기준시점”은 상기 유전적 다형성(polymorphism)을 판단한 특정 시점을 의미한다. 상기 PLA2G7은 유전적 다형성으로 인해 체내 대사에 영향을 미칠 수 있으며, 오랜 기간 경과 후의 질병 발병과 연관될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, PLA2G7(phospholipase A2 group VII) 단백질의 279번째 아미노산을 암호화하는 단일염기다형성(SNP) 부위(rs76863441)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 고혈압 관련 질환의 진단용 키트가 제공된다.
상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 표적 미생물의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.
상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 바람직하게는 단쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(Deoxyribonucleotide)일 수 있다. 상기 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조 릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지할 수 있다.
상기 연장 프라이머는 타겟 핵산의 특정 위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길수 있다. 상기 프라이머의 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정될 수 있고 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 상대적으로 낮은 온도가 요구될 수 있다. 상기 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성할 수 있다.
상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 상기 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, NucleotideAnalogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).
상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예컨대, 형광 핵산 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.AcidsRes., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR이 사용될 수 있다.
서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여 이동성이 다른 밴드가 형성될 수 있으며, 상기 SSCA는 상기 밴드를 검출할 수 있다. 상기 DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 상이한 이동성을 나타내는 서열을 검출할 수 있다.
다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다.
상기 RNase 보호 분석에서, 상기 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단할 수 있다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우 상대적으로 작은 밴드가 관찰될 수 있다.
상기 혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 DM 또는 MS 여부를 결정할 수 있다.
상기 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미할 수 있다. 상기 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥일 있고, 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 상기 프로브로서 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.
상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 10 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정될 수 있으므로, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 상기 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic AcidHybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 상기 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 상기 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 상이하게 결정될 수 있다.
상기 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)를 포함할 수 있다.
본 발명의 평가 방법에 따르면, 상기 SNP의 존부가 확인되면, 생체 내 Lp-PLA2 활성의 감소로 인한 고혈압 관련 질환의 위험도가 낮은 것으로 판단될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, PLA2G7(phospholipase A2 group VII) 단백질의 279번째 아미노산에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 고혈압 관련 질환의 진단용 키트가 제공된다.
상기 SNP는 단백질의 아미노산 서열에도 변이를 일으켜 야생형(wild-type) PLA2G7 단백질의 279번째 아미노산인 Val을 Phe로 치환시킬 수 있다. 따라서, 상기 키트는 본 상기 SNP가 인코딩하는 변이 PLA2G7 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 고혈압 관련 질환을 진단할 수 있다.
상기 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.
예컨대, 상기 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 변이 PLA2G7 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 변이 PLA2G7 단백질에 대한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
상기 변이 PLA2G7 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, EuropeanJournalofImmunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., UsingAntibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., MonoclonalAntibodies: A Manual ofTechniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991을 참조할 수 있다.
예컨대, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 불사멸화 세포주 및 항체-생산 림프구를 융합시켜 제조될 수 있다. 폴리클로날 항체는 변이 PLA2G7 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 후, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리할 수 있다.
전술한 면역분석 과정에 의해 분석된 최종적인 시그널을 통해 고혈압 관련 질환을 진단할 수 있다. 즉, 인간의 시료에서 변이 PLA2G7 단백질에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우 고혈압 관련 질환의 위험도가 낮은 것으로 판단할 수 있다.
상기 키트는 상기 항체 대신에 변이 PLA2G7 단백질에 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 포함할 수 있다. 상기 “앱타머”는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자로서 특정 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature. 355(6360): 5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8): 42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)를 참조할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 유전적 다형성(polymorphism)은 마이크로어레이 또는 유전자 증폭에 의해 식별될 수 있다.
상기 “증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미할 수 있다. 다양한 증폭 반응이 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 상기 증폭 반응은 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, MolecularCloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 수행될 수도 있다. 상기 마이크로어레이는 고상표면에 고정화된 프로브를 이용할 수 있다. 상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 각 유전자상의 10 내지 100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
상기 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용될 수 있고 기체(substrate) 상에 고정화될 수 있다. 상기 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화될 수 있다.
상기 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수도 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.
상기 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화될 수 있다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있고, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수도 있다.
상기 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다.
상기 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methodsin Enzymology, 65:499(1986))을 라벨링될 수 있다. 상기 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공할 수 있다.
상기 분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
상기 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킬 수 있다. 상기 적절한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 상기 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시될 수 있다. 예컨대, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 상기 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)을 참조할 수 있다.
예컨대, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다. 또는 상기 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있고, 저 엄격조건은 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다.
상기 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출할 수 있다. 예컨대, 상기 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 상기 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다.
상기 효소 및 기질은 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)이 사용될 수 있다.
상기 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수도 있다.
또한, 본 발명의 변이형 아미노산 서열을 검출하는 단계는 면역분석(immunoassay) 방법을 이용할 수 있다.
상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 EnzymeImmunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA), in Methods inMolecularBiology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, UsingAntibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 방법이 ELISA 방법은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 변이 PLA2G7 단백질과 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트일 수 있다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함할 수 있다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용될 수 있고, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용될 수 있다.
상기 캡처-ELISA 방법은 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 변이 PLA2G7 단백질에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 변이 PLA2G7 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 상기 시그널은 당업계에 공지된 다양한 방법에 측정될 수 있다. 상기 시그널은 변이 PLA2G7 단백질의 정성적 또는 정량적 정보를 제공할 수 있다. 상기 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.
실험방법
실험대상
실험 대상자는 일산 병원 건강증진센터(health promotion center of the Ilsan Hospital)에서 2007년 1월 내지 2011년 5월의 기간의 건강 검진 대상자 중 선정되었다. 건강증진센터에서 확보한 데이터를 기반으로, 연구 기준에 충족하고 참가를 희망하는 대상자를 선별하였다.
잠재적 대상자의 건강 상태를 재평가하였으며, 연구 기준에 충족하는 대상자를 대상으로 실험 참가를 권유하였다. 연구 기준에 따라 최종적으로 500명의 참가자(35 내지 60세)가 선별되었다.
기준시점에 혈압 측정을 포함하는 임상 및 혈액 검사를 수행하였다. i) 고혈압 대상자(수축기 혈압 ≥ 140 mmHg 또는 이완기 혈압 ≥ 90 mmHg, 항고혈압제 복용시), ii) 심혈관계질환, 이상지질혈증, 진성 당뇨병, 고혈압, 간 질환, 신장병, 뇌졸중, 췌장염, 또는 암 질환 환자, iii) 임신 또는 수유 중인 자, iv) 약물 복용자는 실험 대상에서 제외되었다.
실험에 착수하기 전에 모든 참가자들에게 실험의 목적을 상세히 설명한 후 동의서를 받았다. 수행된 실험의 프로토콜은 일산병원 및 연세대학교의 승인을 받았으며 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 따라 수행되었다.
PLA2G7 V279F 유전자 다형성의 지노타이핑
상업적으로 구입 가능한 DNA 분리 키트(WIZARD® Genomic DNA purification kit, Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 5 mL 전혈(whole blood)로부터 지놈 DNA를 추출하였다.
V279F(rs76863441) 지노타이핑은 SNaPShot 분석 키트(Applied Biosystems)를 이용한 단일염기 프라이머 연장 분석을 통하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었다.
혈압 및 상완 발목 맥파 속도 검사
혈압은 앉은 자세에서 20분간 휴식을 취한 후 적절한 사이즈의 커프를 포함하는 random-zero 혈압계(HM-1101, Hico Medical Co., Ltd., Chiba, Japan)를 통해 측정되었다.
혈압은 두 팔, 및 팔 상단에서 측정한 후 기록되었다. 방문시 각각 혈압을 측정하였으며 수축기 혈압의 오차는 2 mmHg 이내였다. 혈압의 평균 값은 수축기 및 이완기 혈압의 기준으로 사용되었다. 참가자는 혈압 측정 30분 전 흡연 또는 음주가 금지되었다.
상완 발목 맥파 속도(baPWV)는 전술한 바와 같이 자동 파형 분석기(model VP-1000; Nippon Colin Ltd., Komaki, Japan)를 통해 측정하였다.
임상 및 생화학적 평가
임상 및 생화학적 평가에 대한 상세한 정보는 개별적으로 제공되었다. 체중, 키, 허리 둘레는 측정되었고, BMI는 kg/m2 단위로 산출되었다. 혈액 샘플은 12시간 이상 하루 밤 동안 단식한 후 수집되었다. 공복 트리글리세리드, HDL(high-density lipoprotein) 및 LDL(low-density lipoprotein) 콜레스테롤, 글루코오스, 인슐린, 및 산화 LDL(ox-LDL)은 전술한 바와 같이 측정되었다.
인슐린 저항성(IR: Insulin resistance)은 하기 방정식을 이용하여 항상성 모델 평가(HOMA: homeostasis-model assessment)에 의하여 계산하였다: HOMAIR=[공복 인슐린(μIU/mL)×공복혈당(mmol/L)]/22.5.
8-epi-프로스타글란딘(PG) F2α의 수준은 Urinary Isoprostane ELISA kit(Oxford Biomedical Research Inc., Rochester Hills, MI)에 의해 측정되었다.
통계적 분석
통계적 분석은 SPSS v. 21.0(IBM/SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 수행하였다. HWE(Hardy Weinberg Equilibrium) 검사는 PLINK 버전 1.07에 의해 수행되었다. 대응표본 독립 t-검정을 이용하여 실험군 및 대조군 간의 파라미터를 비교하였다.
기준시점 및 3년 후 측정값 간의 차이를 계산하기 위하여 대응표본 t-테스트(Paired t-test)를 이용하였다. 유전자형(genotype) 및 체중의 상호 관계는 이원분산분석(two-way analysis of variance)에 의해 검정되었다. 다중 선형 회귀분석(Multiple linear regression analysis)은 수축기 및 이완기 혈압의 주요 독립 예상인자를 동정하기 위하여 수행되었다. 변수 간의 상관관계를 평가하기 위하여 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)가 이용되었다.
본 연구 집단에서 대사체 및 생화학적 측정값들 간의 관계를 시각화 및 평가하기 위해 히트 맵들(Heat maps)을 생성하였다. 왜곡된 변수들은 통계적 분석을 위하여 대수적으로(logarithmically) 변형하였다. 결과값은 평균±표준오차(S.E.)로 표현하였으며, 양측 P-검정값(two-tailed P-value)<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실험결과
실험예 1 : 정상체중 및 과체중 대상자의 PLA2G7 V279F 유전적 다형성
실험을 위하여 참가자를 정상체중((18.5 kg/m2 ≤ BMI < 25 kg/m2, n=352) 및 과체중(25 kg/m2 ≤ BMI < 30 kg/m2, n=148) 참가자 그룹으로 나누었다.
352 명의 정상체중 그룹 중 PLA2G7 V279F 유전형 분포는 다음과 같았다: 278의 참가자가 동형접합체(homozygous) V 대립형질(VV), 69명의 참가자가 이형접합체(heterozygous) F 대립형질(VF), 5명의 참가자가 동형접합체(homozygous) F 대립형질(FF).
148명의 과체중 그룹 중 PLA2G7 V279F 유전형 분포는 다음과 같았다: 111의 참가자가 동형접합체(homozygous) V 대립형질(VV), 37명의 참가자가 이형접합체(heterozygous) F 대립형질(VF).
상기 분포는 HWE(P > 0.05) 검사 결과에서 현저히 벗어나지 않았다. 소수의 대립형질 빈도는 정상체중 및 과체중 그룹에서 각각 0.112, 0.125로 확인되었으며, 상기 결과는 종래 연구와 상응하였다. 본 실험에서 통계적 검증력을 뒷받침 하고자 이형접합체 F 대립형질(VF), 동형접합체 F 대립형질(FF)을 합쳤다.
실험예 2 : PLA2G7 V279F 유전형에 따른 임상적 특성 및 생화학적 매개 변수
기준시점의 나이, 성별 분포에 따른 정상체중 및 과체중 그룹 간 PLA2G7 V279F의 유전적 다형성의 현저한 차이는 없었다(표 1).
또한, 기준시점 및 3년 경과 후 정상체중 및 과체중 그룹 간 흡연 및 음주 여부의 현저한 변경도 없었다.
기준시점에 정상체중 그룹에서, F 대립형질 참가자의 Lp-PLA2의 활성은 VV 유전형 참가자 보다 낮게 관찰되었다.
유전형에 따른 효과는 Lp-PLA2 활성 및 혈장 산화 LDL(ox-LDL)에서 관찰되었다. 특히, F 대립형질의 정상체중 참가자의 경우 VV 유전형의 참가자와 비교하여 Lp-PLA2 활성 및 산화 LDL이 낮게 확인되었다(도 1).
정상체중의 VV 유전형 참가자의 경우 3년 경과 후 기준시점과 비교하여 Lp-PLA2 활성, 산화 LDL, 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 글루코오스의 수준이 현저히 증가하였고, HDL 콜레스테롤, 인슐린, HOMA-IR 지수가 현저히 감소하였다(표 1).
정상체중의 F 대립형질 참가자의 HDL 콜레스테롤은 3년 경과 후 기준 시점과 비교하여 현저히 감소하였다(표 1).
3년 경과 후, 과체중의 VV 유전형 참가자의 경우 수축기 혈압, Lp-PLA2 활성, 산화 LDL, 수축기 혈압, 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, baPWV가 현저히 증가하였고, HDL 콜레스테롤 및 인슐린은 현저히 감소하였다(표 1).
과체중 그룹은 유전형과 무관하게 기준시점 및 3년 경과 후 시점에 BMI, 혈청 트리글리세리드, 글루코오스, 인슐린, HOMA-IR 지수 값이 높았고, HDL 콜레스테롤 값이 낮았다.
기준 시점에서 과체중의 F 대립형질 참가자의 경우 정상체중의 F 대립형질 참가자와 비교하여 이완기 혈압 및 Lp-PLA2 활성이 높았다.
과체중의 VV 유전형 참가자의 경우 정상체중 VV 유전형 참가자와 비교하여 기준 시점 및 3년 경과 후 시점에 수축기 및 이완기 혈압 및 산화 LDL 값이 높았다.
또한, 3년 경과 후의 시점에 과체중의 VV 유전형 참가자의 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, Lp-PLA2 활성, 소변 8-epi-프로스타글란딘 F2α, 및 baPWV가 정상체중 VV 유전형 참가자 보다 높았다.
3년 경과 후의 시점에 과체중의 F 대립형질 참가자의 경우 정상체중 참가자와 비교하여 수축기 혈압, Lp-PLA2 활성이 낮았다.
또한, 과체중의 F 대립형질 참가자의 경우 기준시점 및 3년 경과 후의 시점에 VV 유전형 참가자와 비교하여, Lp-PLA2 활성, 산화 LDL이 낮았으며, 3년 경과 후의 시점에 수축기 및 이완기의 혈압, LDL 콜레스테롤 수준이 낮았다(표 1).
구분 정상체중(n=352) 과체중(n=148)
VV (n=278) F 대립형질(n=74) VV (n=111) F 대립형질(n=37)
기준시점 Follow-up 기준시점 Follow-up 기준시점 Follow-up 기준시점 Follow-up
연령 (년) 47.9±0.44 47.5±0.91 47.5±0.75 48.9±1.29
남성/여성(%) 131 (47.1) / 147 (52.9) 30 (40.5) / 44 (59.5) 53 (47.7) / 58 (52.3) 17 (45.9) / 20 (54.1)
BMI(kg/m2) 22.1±0.11 22.2±0.12 21.9±0.22 21.9±0.23 26.6
±0.14e 		26.6
±0.16f 		26.8
±0.35g 		26.8
±0.43h
이완기혈압(mmHg) 71.2
±0.63		 72.0
±0.65		 70.8
±1.29		 72.1
±1.18		 76.2
±0.86e 		81.0
±1.16f,*** 		75.3
±1.73g 		75.7
±1.53d
변화량 0.77±0.62 1.38±1.24 4.84±0.91k 0.46±1.69
트리글리세리드(mg/dL)∮ 99.3
±3.71		 106.6
±4.56		 89.1
±5.78		 88.1
±5.72		 135.8
±7.36e 		138.1
±7.89f 		156.3
±14.9g 		166.1
±16.9h
총 콜레스테롤(mg/dL)∮ 188.1
±2.00		 198.7
±2.31*** 		190.7
±3.75		 191.8
±3.24		 194.7
±3.13		 208.7
±3.89f,*** 		199.0
±4.55		 194.5
±4.49
변화량 10.6±1.94 1.11±3.36i 14.1±3.05 -4.49±4.10j
HDL-콜레스테롤(mg/dL)∮ 54.7
±0.90		 52.3
±0.79** 		57.2
±1.60		 54.7
±1.57* 		49.8
±1.23e 		45.7
±1.32f,*** 		50.0
±1.80g 		48.1
±1.61h
LDL-콜레스테롤(mg/dL)∮ 114.0
±1.93		 126.0
±2.11*** 		115.7
±3.53		 119.5
±3.17		 117.9
±2.91		 135.6
±3.36f,*** 		118.3
±5.00		 113.1
±4.70d
변화량 12.0±1.93 3.77±3.71 17.7±2.97 5.17±4.50j
글루코오스(mg/dL)∮ 90.0
±0.53		 91.6
±0.53** 		90.0
±1.11		 90.5
±1.09		 95.0
±1.04e 		96.5
±1.24f 		97.0
±1.60g 		98.3
±1.85h
인슐린(μIU/dL))∮ 7.97
±0.18		 7.36
±0.18** 		7.98
±0.37		 7.31
±0.35		 9.82
±0.37e 		9.01
±0.37f,* 		9.91
±0.65g 		9.89
±0.84h
HOMA-IR(mg/dL)∮ 1.78
±0.04		 1.67
±0.04* 		1.78
±0.09		 1.64
±0.08		 2.32
±0.10e 		2.18
±0.10f 		2.36
±0.18g 		2.39
±0.24h
8-epi-PGF2α(pg/mg creatinine)∮ 1382.0
±36.1		 1424.0
±34.6		 1380.6
±60.1		 1401.4
±61.8		 1409.3
±50.1		 1490.8
±43.0f 		1412.9
±134.9		 1354.5
±77.6
baPWV(cm/s)∮ 1296.4
±11.3		 1310.5
±12.1		 1270.8
±19.5		 1289.7
±24.9		 1325.6
±17.2		 1360.1
±19.6f,** 		1303.1
±30.8		 1313.3
±29.6
각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ∮은 로그 변환으로 검사한 값이다.
aP<0.05은 기준시점에서 정상체중의 VV 유전형 참가자 및 F 대립형질 참가자를 비교한 것이다. bP<0.05는 3년 경과 후 시점에서 정상체중의 VV 유전형 참가자 및 F 대립형질 참가자를 비교한 것이다. cP<0.05는 기준시점에서 과체중의 VV 유전형 참가자 및 F 대립형질 참가자를 비교한 것이다. dP<0.05는 3년 경과 후 시점에서 과체중의 VV 유전형 참가자 및 F 대립형질 참가자를 비교한 것이다. eP<0.05는 기준시점에서 과체중 및 정상체중의 VV 유전형 참가자를 비교한 것이다. fP<0.05는 3년 경과 후 시점에서 과체중 및 정상체중의 VV 유전형 참가자를 비교한 것이다. gP<0.05는 기준시점에서 과체중 및 정상체중의 F 대립형질 참가자를 비교한 것이다. hP<0.05는 3년 경과 후 시점에서 과체중 및 정상체중의 F 대립형질 참가자를 비교한 것이다. iP<0.05는 정상체중의 참가자 중 VV 유전형 참가자 및 F 대립형질 참가자를 비교한 것이다. jP<0.05는 과체중의 참가자 중 VV 유전형 참가자 및 F 대립형질 참가자를 비교한 것이다. kP<0.05는 VV 유전형 참가자 중에서 정상체중 및 과체중의 참가자를 비교한 것이다. lP<0.05는 F 대립형질 참가자 중에서 정상체중 및 과체중의 참가자를 비교한 것이다.
* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001은 대응표본 t-검정(paired t-test)에 따른 값이다.
실험예 3 : PLA2G7 V279F 유전형 및 기준시점 BMI의 상호 작용
과체중 및 정상체중 그룹에서 PLA2G7 V279F의 유전형에 따른 효과는 표 1과 같다.
3년 경과 후의 시점에 나이, 성별, 흡연, 음주에 따른 보정 후 결과값은 Lp-PLA2 활성(P-interaction=0.002), 수축기 혈압(P-interaction=0.001), 산화 LDL(P-interaction<0.001)의 변화와 연관된 PLA2G7 V279F 유전형 및 BMI 간 상호 관련성을 시사한다.
과체중의 VV 유전형 참가자의 경우 정상체중의 VV 유전형 참가자와 비교하여 Lp-PLA2 활성, 수축기 혈압, 및 산화 LDL의 수준이 현저하게 증가하였다.
또한, 정상체중의 VV 유전형 참가자는 F 대립형질 참가자와 비교하여 산화 LDL 수준히 현저히 높았다.
이와 유사하게, 이완기 혈압(P-interaction=0.004), 총 콜레스테롤(P interaction=0.002), LDL 콜레스테롤(P-interaction<0.001)의 변화와 연관된 PLA2G7 V279F 유전형 및 BMI 간의 상호 관련성이 확인되었다.
과체중의 VV 유전형 참가자의 경우 F 대립형질의 참가자와 비교하여 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 값이 높게 관찰되었다.
실험예 4 : 수축기 혈압 및 이완기 혈압의 변화의 연관성
3년에 걸친 수축기 혈압의 변화는 기준시점의 BMI(P=0.006), LDL 콜레스테롤의 변화(P=0.008), Lp-PLA2 활성의 변화(P<0.001), 산화 LDL의 변화(P <0.001)와 연관되었다(표 2).
혼재 변수의 보정 후, PLA2G7 V279F 유전형(P=0.043), 기준시점의 BMI(P=0.005), Lp-PLA2 활성의 변화(P=0.039), 산화 LDL의 변화(P=0.003)는 독립적이고 수축기 혈압의 변화와 양의 상관관계가 있었다(표 2).
Δ 수축기 혈압(mmHg) 단일변수 분석 다변수 분석
β-coefficient ± SE P-value β-coefficient ± SE P-value
연령(년) 0.078±0.062 0.211 0.078±0.062 0.203
성별 -0.538±1.151 0.641 0.617±1.145 0.590
PLA2G7 V279F 유전형 0.387±1.386 0.780 2.836±1.398 0.043
기준시점 BMI(kg/m2) 0.570±0.208 0.006 0.573±0.205 0.005
Δ 트리글리세리드(mg/dL) 0.014±0.010 0.146 0.015±0.010 0.140
Δ LDL-콜레스테롤(mg/dL) 0.048±0.018 0.008 0.031±0.019 0.102
Δ HDL-콜레스테롤(mg/dL) 0.002±0.050 0.960 0.046±0.050 0.361
Δ Lp-PLA2 활성
(nmol/mL/min)		 0.427±0.067 <0.001 0.200±0.097 0.039
Δ 산화 LDL (U/L) 0.256±0.040 <0.001 0.168±0.056 0.003
상기 베타-계수는 표준화 회귀계수±표준오차로 나타내었다.
한편, 도 2는 정상체중 및 과체중의 그룹에서 PLA2G7 V279F 유전형에 따른 Lp-PLA2 활성 및 수축기 혈압의 변화 간의 관련성, 산화-LDL 및 수축기 혈압의 변화 간의 관련성을 시사한다.
과체중의 그룹에서 Lp-PLA2 활성 및 수축기 혈압의 변화와 산화-LDL 및 수축기 혈압의 변화 간의 강한 상호 연관성이 관찰되었다.
도 3은 이완기 혈압의 변화 간 상호 관련성을 시사한다. 3년에 걸친 이완기 혈압의 변화는 LDL 콜레스테롤의 변화(P<0.001), Lp-PLA2 활성의 변화(P<0.001), 산화 LDL의 변화(P <0.001)와 연관되었다.
혼재 변수의 보정 후, LDL 콜레스테롤의 변화(P=0.036), Lp-PLA2 활성의 변화(P=0.043), 산화 LDL(P=0.012)의 변화는 독립적이고 수축기 혈압의 변화와 양의 상관관계가 있었다(표 3).
공변량(covariate)에 따른 보정 후, 이완기 혈압의 변화 및 기준시점의 BMI(P=0.068) 간에는 독립적 연관성이 확인되었다.
Δ 이완기 혈압(mmHg) 단일변수 분석 다변수 분석
β-coefficient ± SE P-value β-coefficient ± SE P-value
연령(년) -0.033±0.050 0.513 -0.035±0.050 0.486
성별 -0.598±0.925 0.518 0.074±0.928 0.937
PLA2G7 V279F 유전형 -0.856±1.109 0.441 1.429±1.134 0.208
기준시점 BMI(kg/m2) 0.302±0.168 0.072 0.304±0.166 0.068
Δ 트리글리세리드(mg/dL) 0.006±0.008 0.414 0.010±0.008 0.243
Δ LDL-콜레스테롤(mg/dL) 0.052±0.014 <0.001 0.032±0.015 0.036
Δ HDL-콜레스테롤(mg/dL) -0.023±0.040 0.558 0.012±0.040 0.768
Δ Lp-PLA2 activity
(nmol/mL/min)		 0.327±0.054 <0.001 0.159±0.078 0.043
Δ 산화 LDL (U/L) 0.192±0.032 <0.001 0.115±0.046 0.012
PLA2G7 유전자(rs76863441)는 6번 염색체에 위치한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism) V279F은 잠재적으로 효소의 활성에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 발린(Valine) 279는 지질가수분해효소(lipase)의 콘센서스 촉매 영역(consensus catalytic site) 부근에 위치하고, 변이된 펩타이드는 효소적 활성을 완전히 상실한다[Yamaguchi, S., et al., Am J Hypertens 2009; 22:742-747; Yoshida, H., et al., J Clin Invest 1996; 97:2784-2791].
종래 연구와 유사하게, 상기 연구는 동형접합 변이체(FF)는 혈장에서 효소의 활성이 상실되고, 이형접합 변이체(VF)는 야생형의 동형접합체(VV) 대비 약 70%의 활성을 가지고 있음을 검증하였다.
과체중의 VV 유전형 참가자의 경우 3년 경과 후 수축기 및 이완기 혈압, LDL 콜레스테롤, Lp-PLA2, 및 산화 LDL이 현저히 증가하였으나, 과체중의 F 대립형질 참가자의 경우 상기 값의 변화가 나타나지 않았다.
따라서, 과체중의 F 대립형질 참가자의 경우 과체중의 VV 유전형 참가자와 비교하여 3년 경과 후의 시점에 Lp-PLA2, 산화 LDL, 수축기 및 이완기 혈압, LDL 콜레스테롤이 낮았다.
PLA2G7 V279F 및 기준시점의 BMI 간 상호 작용으로 인해 PLA2G7 279F 대립형질은 약 32%의 낮은 Lp-PLA2 활성을 야기하고, 이는 3년 초과의 과체중에도 불구하고 고혈압에 대한 위험성을 감소시킬 수 있다.
전향적 연구의 메타 분석에서, 다른 심혈관 질환 위험인자에 대한 보정을 거친 관상동맥질환(CAD)의 위험성은 Lp-PLA2 활성의 증가로 인해 11%까지 증가하였다. 관상동맥질환 연관성의 정도는 수축기 혈압의 연관성과 상응한다[Watson, S., et al., Lancet 2010; 375:1536-1544].
상기 결과는 과체중 그룹에서의 Lp-PLA2 활성 및 수축기 혈압 간의 강한 상호 관련성, 및 산화-LDL 및 수축기 혈압 간의 강한 상호 관련성을 뒷받침한다.
상기 결과는 과체중 및 PLA2G7 279VV 유전형이 동시에 존재할 때 정상 혈압의 대상자에 대한 고혈압을 가속화할 수 있음을 시사한다.
즉, 상기 결과는 나이 및 수축기 혈압의 연관성이 PLA2G7 V279F의 유전형 및 기준시점의 BMI 간의 상호 작용에 의해 상이해질 수 있음을 시사한다.
PLA2G7 279VV 유전형 및 과체중은 상승 작용을 통해 고혈압의 위험성을 증가시킬 수 있는 반면, PLA2G7 279F 대립형질은 Lp-PLA2 활성을 저하(32%)시키므로 과체중에도 불구하고 결과적으로 고혈압 위험성을 감소시킬 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및
    (b) 상기 생물학적 시료에서 PLA2G7(phospholipase A2 group VII) V279F의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 PLA2G7(phospholipase A2 group VII) V279F의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 낮은 것으로 판단하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 PLA2G7 단백질의 279번째 아미노산의 변이, 또는 상기 단백질의 279번째 아미노산을 암호화하는 유전자(rs76863441)의 변이를 판단하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (c) 상기 대상체의 비만도를 측정하는 단계;를 더 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 체질량지수(BMI)를 측정하는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 대상체의 비만도가 높은 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 높은 것으로 판단하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    기준시점으로부터 3년 이후 고혈압의 위험성을 판단하는 방법.
  8. PLA2G7(phospholipase A2 group VII) 단백질의 279번째 아미노산을 암호화하는 단일염기다형성(SNP) 부위(rs76863441)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 고혈압 관련 질환의 진단용 키트.
  9. PLA2G7(phospholipase A2 group VII) 단백질의 279번째 아미노산에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 고혈압 관련 질환의 진단용 키트.
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