KR20180005130A - 연골 무세포 파쇄물 및 줄기세포를 포함하는 연골분화 촉진용 복합체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 또는 그의 배양물과 연골 무세포 파쇄물을 포함하는 연골분화 촉진용 복합체, 상기 복합체를 이용하여 연골을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 연골, 상기 복합체를 포함하는 관절질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 조성물을 이용하여 관절질환을 예방 또는 치료하는 방법, 상기 제조된 연골세포를 포함하는 연골세포 분화유도용 조성물 및 상기 제조된 연골세포를 이용하여 연골을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 줄기세포 또는 그의 배양물과 연골 무세포 파쇄물을 포함하는 연골분화 촉진용 복합체는 생체내에서도 부작용 없이 연골세포로 분화될 뿐만 아니라, 분화된 연골세포에서 나타나는 주변분비작용(Paracrine effect)으로 생체내 존재하는 내재적인 줄기세포까지도 연골세포로의 분화를 촉진시켜, 손상된 연골을 효과적으로 재생시킬 수 있으므로, 연골 손상을 수반하는 관절질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

연골 무세포 파쇄물 및 줄기세포를 포함하는 연골분화 촉진용 복합체 및 그의 용도{Complex for promoting catilage differentiation comprising Catilage cell-free crush and Stem Cell and Uses thereof}

본 발명은 연골 무세포 파쇄물 및 줄기세포를 포함하는 연골분화 촉진용 복합체 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 줄기세포 또는 그의 배양물과 연골 무세포 파쇄물을 포함하는 연골분화 촉진용 복합체, 상기 복합체를 이용하여 연골을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 연골, 상기 복합체를 포함하는 관절질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 조성물을 이용하여 관절질환을 예방 또는 치료하는 방법, 상기 제조된 연골세포를 포함하는 연골세포 분화유도용 조성물 및 상기 제조된 연골세포를 이용하여 연골을 제조하는 방법에 관한 것이다.

관절질환(arthropathy)은 통각의 결여 및 관절이상을 수반하는 질환을 통칭하는 용어로서, 관절의 신경영양성 질환의 하나로 분류된다. 대체로, 다발성 관절증(Polyarthrosis), 엉덩이관절증(Coxarthrosis), 무릎관절증(Gonarthrosis), 척추관절증(spondyloarthropathy) 등을 포괄하며, 연골손상 또는 연골기능 이상을 수반할 수 있는데, 대부분의 관절질환은 염증을 수반하기 때문에 관절염으로 진행될 수 있다고 알려져 있다.

상기 관절질환으로부터 유래된 관절염은 인류가 앓고 있는 질환 중 유병률 1위의 다발성 질환으로서, 이에 포함되는 퇴행성 관절염은 65 세 이상 인구 중 70 ~ 80 %가 75 세 이상인 경우에는 거의 100 %가 가지고 있는 대표적인 노인성 질환이다. 현재 우리나라는 전체 인구의 10 % 이상이 퇴행성 관절염을 앓고 있으며, 이러한 유병률은 한국 사회의 급속한 고령화 추세로 인해 매우 빠르게 증가하고 있다. 또한, 최근에는 젊은층에서도 많이 발병하고 있으며, 전 세계적으로는 약 5 억명 이상의 퇴행성 관절염 환자가 있는 것으로 추정된다. 또한 인간 평균수명의 연장과 함께 인간의 사회활동 기간이 늘어남에 따라, 인류 생활의 질적 측면에서 시급히 극복해야 할 중요한 위치를 차지하고 있다.

상기 퇴행성 관절염은 주로 무릎관절에 위치한 연골조직이 손상되어 나타나는데, 상기 연골조직에 포함되는 연골세포는 연골조직이 정상적인 기능을 유지하기 위해 필수적인 콜라겐 및 프로테오글리칸 등의 매트릭스를 합성, 분비하고 또한 적정속도로 분해하는 역할을 담당함으로써 관절 연골 조직의 기능적 항상성을 유지시켜 주는 데에 필수적인 역할을 담당하고 있다. 이같은 관절염 증상을 치료하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 미국등록특허 제6025334호에는 상어 연골 추출물을 포함하는 관절염 치료용 제제가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1569168호에는 태반 줄기세포 또는 제대(umbilical cord) 줄기세포를 이용하여 류마티스 관절염을 치료하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 상기 상어 연골 추출물은 연골손상을 억제하는 효과를 나타낼 뿐, 손상된 연골을 치료하거나 재생시키는 효과를 나타내지는 못하고, 줄기세포는 관절조직에서 연골세포가 아닌 다른 세포로 분화될 가능성이 있어, 부작용이 우려된다는 단점이 있다. 이에 따라, 부작용이 없으면서도, 손상된 연골을 치료하거나 재생시킬 수 있는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 연골손상을 수반하는 관절질환을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 예의 연구노력한 결과, 손상된 연골부위에 줄기세포 또는 그의 배양물과 무세포 연골 파쇄물을 복합적으로 투여할 경우, 상기 줄기세포가 반드시 연골세포로 분화되어 연골조직을 재생시키거나, 투여 부위 주변에 주변분비작용으로 인하여 손상된 연골의 재생을 촉진시킴으로써, 상기 관절질환을 보다 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 줄기세포 또는 그의 배양물과 연골 무세포 파쇄물을 포함하는 연골분화 촉진용 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 이용하여 연골을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 연골을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 관절질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 관절질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조된 연골세포를 포함하는 연골세포 분화유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조된 연골세포를 이용하여 연골을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 관절질환을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 줄기세포에 주목하게 되었다. 대부분의 관절질환은 관절에 위치한 연골의 손상에 의해 유발되기 때문에, 상기 손상된 연골을 회복시키거나 또는 재생할 수 있으면, 이에 따라 관절질환을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 가정하고, 줄기세포를 이용하여 연골을 재생시키는 방법에 대한 연구를 수행하였다. 그러나, in vitro 조건에서는 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 다양한 방법이 알려져 있지만, in vivo 조건에서는 줄기세포를 연골세포로 분화시키기가 용이하지 않은데, 이는 in vitro 조건에서 줄기세포를 연골세포로 분화시키는데 사용되는 대부분의 분화유도촉진제는 생체내에서 부작용을 유발시킬 수 있기 때문이다. 이에, 본 발명자들은 생체내(in vivo)에서 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있으면서도, 생체내에서 부작용을 유발시키지 않는 성분을 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과, 분말상의 돼지유래 무세포 연골 파쇄물(Porcine Catilage Powder, PCP)을 사용할 경우, 생체내에서 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있으면서도 부작용을 유발시키지 않음을 확인하였다.

특히, in vitro 조건에서 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있는 분화유도촉진제가 생체내(in vivo)에서는 정상적인 역할을 수행하지 못할 수 있다. 실제로, in vitro 조건에서 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있다고 알려진 히알루론산(HA)의 경우, 생체내에서는 HA 동시투여시 줄기세포를 연골세포로 분화시키지 못함은 물론 정상적인 줄기세포의 분화를 저해할 수 있음을 확인하였다.

그러나, 상기 PCP는 in vitro 조건 뿐만 아니라, 생체내(in vivo)에서도 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 과정을 유도 또는 촉진할 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 줄기세포를 단독으로 처리할 경우 보다도, 상기 PCP를 줄기세포와 함께 처리하면 연골세포로의 분화를 더욱 촉진시켜서, 생체내에서 발병된 관절질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.

특히, 상기 PCP와 줄기세포를 포함하는 복합체를 관절질환이 발병된 개체에 투여하면, 상기 복합체에 포함된 줄기세포가 PCP에 의하여 연골세포로 분화될 뿐만 아니라, 상기 분화된 연골세포에 의하여, 생체내에 내재적으로 존재하는 줄기세포까지도 연골세포로 분화될 수 있어, 보다 향상된 관절질환 치료효과를 나타낼 수 있다.

이처럼, 줄기세포와 무세포 연골 파쇄물을 함께 사용하여 손상된 연골을 재생시킴으로써 관절질환을 치료하는 방법은 지금까지 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 줄기세포 또는 그의 배양물, 및 무세포 연골 파쇄물을 포함하는 연골분화 촉진용 복합체를 제공한다.

본 발명의 용어 "줄기세포"란, 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 '미분화세포'를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 본 발명의 무세포 연골 파쇄물에 의하여 연골세포로 분화될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 제대혈 유래 줄기세포(Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cell: UCB-MSC), 배아줄기세포, 태반줄기세포, 자가유래 줄기세포 등이 될 수 있다.

상기 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)는 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래하는 다분화성의 성질을 갖는 줄기세포이다. 예를 들어, 골수(bone marrow)로부터 유래된 중간엽 줄기세포는 지방조직, 뼈/연골 조직, 근육조직으로 분화될 수 있는 다분화성에 의해 세포치료제로서의 개발을 위해 다양한 연구가 진행되고 있다.

한편, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell) 또는 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cell;hUCB-MSC)일 수 있다. 각 조직에서 줄기세포를 얻는 방법은 종래 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있으며, 본 발명의 실시예의 방법에 한정되지 않는다.

본 발명의 용어 "배양물"이란, 세포를 특정 조건에서 배양하여 얻어진 산물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양물은 줄기세포를 포함하는 세포 배양액, 상기 세포 배양액으로부터 줄기세포를 제거한 배양상등액, 이들의 희석액 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 배양물의 조성은 통상의 줄기세포 배양에 필요한 성분뿐만 아니라, 줄기세포 증식에 상승적으로 작용을 하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.

상기 줄기세포의 배양에 사용되는 배지로서는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려진 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 또는 Keratinocyte-SFM(Keratinocyte serum free medium)을 사용할 수 있다.

상기 줄기세포 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.

본 발명의 용어 "연골(catilage)"이란, 연골세포와 상대적으로 다량의 연골기질로 구성된 생체내 결합조직을 의미한다. 결합조직에 속하는 근육, 연골 및 골 중에서, 연골은 골보다는 유연성이 있고, 근육보다는 단단하다.

대부분의 연골조직에서 상기 연골세포는 대체로 동일하지만, 연골조직의 위치, 역할 등에 따라 서로 상이한 연골기질을 포함하는데, 이처럼 연골기질에 따라 연골은 대체로 3가지(초자연골, 탄성연골 및 섬유연골)로 분류된다. 그러나, 연골이 형성된 부위, 발달시기, 분화유도 방법 등의 조건에 따라, 생성된 연골기질은 서로 다른 구성요소 및 상기 구성요소의 조성비를 포함할 수 있다.

예를 들어, 생체내 줄기세포에 의하여 자연적으로 재생된 연골기질과 시험관조건에서 줄기세포를 분화시켜서 생성된 연골기질은, 이들 연골기질에 포함된 단백질의 종류 및 함량면에서 현저한 차이를 나타낼 수 있다. 또한, 줄기세포를 분화시켜서 생성된 연골의 경우, 대체로 줄기세포에 연골분화용 분화유도촉진제를 처리하여, 줄기세포를 연골세포로 분화시킨 후, 분화된 연골세포를 연골기질로 분화시키는데, 이때 사용된 분화유도촉진제의 종류에 따라 생성된 연골기질에 포함된 단백질의 종류 및 함량면에서 현저한 차이를 나타낼 수 있다. 이처럼 서로 다른 단백질의 종류 및 함량을 포함하는 연골기질은 생체내에서 서로 상이한 역할을 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 시험관 조건(in vitro)에서 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있는 분화유도촉진제가 생체내에서는 서로 다른 형태의 연골분화를 유도할 수 있음을 확인한 바 있다. 구체적으로, 시험관 조건(in vitro)에서 본 발명의 돼지유래 무세포 연골 파쇄물(PCP)와 히알루론산(HA)은 각각 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있음을 확인하였다. 이어, 동물의 관절부위에 존재하는 초자연골 부분을 손상시킨 모델 동물을 제작하고, PCP와 줄기세포를 포함하는 복합체 또는 HA와 줄기세포를 포함하는 복합체를 투여한 다음, 이들의 연골손상 치료효과를 비교하였다. 그 결과, PCP와 줄기세포를 포함하는 복합체를 투여한 경우에는 줄기세포를 단독으로 투여한 경우보다도 향상된 연골재생 효과를 나타낸 반면, HA와 줄기세포를 포함하는 복합체를 투여한 경우에는 줄기세포를 단독으로 투여한 경우보다도 상대적으로 낮은 수준의 연골재생 효과를 나타냄을 확인하였다. 상기 결과로부터, PCP는 생체내에서 줄기세포를 초자연골로 분화시켜서 손상된 초자연골의 재생을 향상시킨 반면, HA는 생체내에서 줄기세포를 초자연골이 아닌 다른 종류의 연골로 분화시켜서 손상된 초자연골의 재생을 저해하는 결과를 초래한 것으로 분석되었다.

본 발명의 용어 "초자연골(hyaline catilage)"이란, "유리연골"이라고도 하며, 기질이 대체로 반투명하여 생체내에서 청백색을 띄고 투명하며, 육안상으로 균일한 조직으로 형성되고, 60 내지 80%의 수분을 포함하며, 황산콘드로이틴을 함유한 복합단백질(무코이드) 및 연골막을 포함하는 연골을 의미한다. 초자연골의 구조상 연골세포는 연골기질의 주변에 존재한다. 상기 초자연골은 생체내에서 늑연골, 비연골, 후두연골, 관절연골, 기관연골 등을 구성하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 용어 "탄성연골(elastic catilage)"이란, 불투명하고 황색을 나타내며, 그물구조를 포함하는 탄력섬유가 연골기질내에 포함되어 있으며, 연골막을 포함하는 연골을 의미한다. 상기 탄성연골은 생체내에서 이개연골, 외이도 연골, 푸두개 연골 등을 구성하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 용어 "섬유연골(fibrous catilage)"이란, 흰색의 섬유조직과 연골기질이 다양한 비율로 혼합된 형태의 연골을 의미한다. 섬유연골에 포함된 섬유조직은 대체로 콜라겐으로 구성되어 있고, 대체로 초자연골과 탄성연골의 중간수준의 특징을 나타내지만, 연골막은 포함하지 않는다. 연골세포는 상기 섬유조직에 혼합된 형태로 존재하는데, 단독으로 유리되어 있거나, 소규모의 세포집단을 형성한다. 상기 섬유연골은 생체내에서 추간원판, 관절순, 고나절반월 등을 구성하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 용어 "무세포 연골 파쇄물(cell-free crush of catilage)"이란, 연골로부터 연골세포가 제거된 연골기질을 공지된 방법으로 파쇄하여 수득한 생체유래 물질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 무세포 연골 파쇄물은 줄기세포에 작용하여 연골세포로 분화를 유도하는 역할을 수행하는데, 상기 역할은 무세포 연골 파쇄물에 포함된 분화유도 성분 뿐만 아니라, 무세포 연골 파쇄물 자체의 물리적인 특성에 의해 수행될 수 있다. 즉, 상기 무세포 연골 파쇄물은 연골세포에 비하여 상대적으로 경도가 높은 연골기질로 구성된 입자형태이므로, 상기 입자형태의 파쇄물은 줄기세포의 지지체 역할을 부가적으로 수행하여, 줄기세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.

상기 무세포 연골 파쇄물은 줄기세포를 연골세포로 분화유도 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 연골세포가 제거된 연골기질을 기계적으로 파쇄하거나, 연골세포가 제거된 연골기질을 대상으로 냉동/해동을 반복하거나, 또는 연골세포가 제거된 연골기질에 초음파를 처리하여 수득한 파쇄물; 연골세포가 제거된 연골기질에 다양한 효소(트립신, 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 등)를 처리하여 얻어진 효소분해물; 연골세포가 제거된 연골기질에 알칼리 또는 산성 시약을 처리하거나 또는 연골세포가 제거된 연골기질에 계면활성제를 처리하여 수득한 반응산물; 등이 될 수 있다.

또한, 상기 연골기질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 돼지, 소, 토끼 등의 포유동물로부터 유래된 연골기질을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 인간과 가장 유사한 돼지로부터 유래된 연골기질을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 돼지의 연골로부터 연골세포가 제거된 연골기질을 수득한 후, 동결건조 및 파쇄과정을 거쳐 수득한 분말상의 돼지 유래 무세포 연골 파쇄물(Porcine Catilage Powder, PCP)을 무세포 연골 파쇄물로 사용하였다.

본 발명의 용어 "복합체(complex)"란, 줄기세포와 연골 무세포 파쇄물을 포함하는 연골분화 촉진용 제제를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 복합체는 단순히 줄기세포와 연골 무세포 파쇄물이 혼합된 조성물 뿐만 아니라, 상기 줄기세포와 연골 무세포 파쇄물이 담체에 고정된 형태의 복합체, 상기 줄기세포와 연골 무세포 파쇄물이 각각 개별적으로 포장된 형태의 키트 등과 같이, 줄기세포와 연골 무세포 파쇄물을 포함하는 어떠한 형태의 제제도 포괄적으로 포함한다. 아울러, 상기 제제 형태 이외에도 상기 연골 무세포 파쇄물에 의하여 줄기세포로부터 분화된 연골세포, 상기 연골세포의 배양물, 상기 배양물의 배양상등액, 상기 배양물의 추출물, 상기 추출물의 분획물 등과 같이, 줄기세포와 연골 무세포 파쇄물의 반응에 의하여 생성된 반응산물 또는 상기 반응산물의 부산물 까지도 포괄적으로 모두 포함한다.

또한, 상기 복합체는 줄기세포와 연골 무세포 파쇄물에 더하여, 줄기세포의 연골분화를 촉진시킬 수 있는 연골분화 촉진용 제제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 연골분화 촉진용 제제는 연골 무세포 파쇄물과 함께 작용하여 줄기세포의 연골세포 분화를 촉진시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, BMP 6(Bone morphogenetic protein 6) 등이 될 수 있다.

다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 복합체를 이용하여 연골 또는 연골세포를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 연골 또는 연골세포의 제조방법은 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어지는 현상을 들 수 있다. 상대적으로, "미분화"란 상술한 분화가 일어나지 않은 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다.

본 발명의 목적상 상기 분화는 무세포 연골 파쇄물의 처리에 의하여, 줄기세포가 연골세포로 변화되는 일련의 과정을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

예를 들어, 돼지유래 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제대혈 유래 줄기세포를 분화시켜서 연골 또는 연골세포를 제조할 수 있다.

상기 연골세포로의 분화효율을 향상시키기 위하여, 본 발명의 무세포 연골 파쇄물을 줄기세포에 처리하기 전, 처리와 동시 또는 처리한 후에 상기 연골분화 촉진용 제제를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 연골분화 촉진용 제제는 앞서 정의한 바와 동일하다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 연골 또는 연골세포를 제공한다.

상술한 바와 같이, 연골은, 연골이 형성된 부위, 발달시기, 분화유도 방법 등의 조건에 따라, 서로 다른 구성요소 및 상기 구성요소의 조성비를 포함하는 연골기질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 연골 또는 연골세포는 상술한 바와 같이, 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 줄기세포로부터 연골세포를 분화시켜서 제조될 수 있다. 이처럼 제조된 연골 또는 연골세포는 종래의 방법으로 분화유도된 연골과 명백히 구별되는 특성을 나타낸다. 상기 특성 중의 하나는, 히알루론산에 의하여 분화유도된 연골세포 보다도, 생체내의 연골손상을 효과적으로 치료할 수 있다는 것이고, 다른 하나는 상기 제조된 연골 또는 연골세포 만으로도 주변분비작용(Paracrine effect)에 의해 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있다는 것이다.

특히, 본 발명의 연골 또는 연골세포가 나타내는 주변분비작용은 지금까지 전혀 보고되어 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 확인되었다.

본 발명에서 제공하는 연골 또는 연골세포는 돼지유래 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제대혈 유래 줄기세포를 분화시켜서 제조된 것이 될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는 관절질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 상기 복합체는 시험관 조건(in vitro)에서 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 생체내 조건(in vivo)에서 손상된 연골 또는 연골세포를 재생 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 복합체는 외상과 같은 외인성 요인에 의해 손상된 연골 또는 연골세포 뿐만 아니라, 노화, 유전적 질환, 면역질환과 같은 내재적 요인에 의해 손상 또는 손실된 연골 또는 연골세포 까지도 재생시킬 수 있다. 특히, 상기 내재적 요인에 의한 연골 또는 연골세포의 손상 또는 손실은 병리증상이 즉각적으로 나타나지 않고, 서서히 나타나게 되므로, 본 발명의 복합체를 투여하여 상기 내재적 요인에 의한 연골 또는 연골세포의 손상 또는 손실을 억제하는 경우, 결과적으로 관절질환을 예방하는 효과를 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명의 복합체는 관절질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "관절질환(arthropathy)"이란, "관절증(Arthrosis)" 또는 "골관절증(Osteo-arthrosis)"으로도 호칭되고, 통각의 결여 및 관절이상을 수반하는 질환을 의미하는데, 관절의 신경영양성 질환의 하나로 분류된다. 대체로, 다발성 관절증(Polyarthrosis), 엉덩이관절증(Coxarthrosis), 무릎관절증(Gonarthrosis), 척추관절증(spondyloarthropathy) 등을 포괄하며, 연골손상 또는 연골기능 이상을 수반할 수 있다. 대부분의 관절질환은 염증을 수반하기 때문에 관절염으로 진행될 수 있다고 알려져 있다.

본 발명의 용어 "치료"란, 상기 약학 조성물의 투여로 관절질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 무세포 연골 파쇄물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 0.1 내지 100 ng/㎖이 될 수 있고, 다른 예로서 1 내지 10 ng/㎖이 될 수 있으며, 또 다른 예로서 5 ng/㎖가 될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 줄기세포 또는 그의 배양물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 1㎖ 당 1.0×10⁵개 내지 1.0×10⁹개, 다른 예로서 1.0×10⁶개 내지 1.0×10⁸개, 또 다른 예로서 1.0×10⁷개의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 또는 그의 배양물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 줄기세포 또는 그의 배양물과, 무세포 연골 파쇄물을 포함하고, 상기 약학 조성물을 관절질환이 발병된 개체에 투여하면, 상기 조성물에 포함된 무세포 연골 파쇄물에 의하여 함께 투여된 줄기세포가 연골세포로 1차적으로 분화될 뿐만 아니라, 상기 1차적으로 분화된 연골세포의 주변분비작용에 의하여, 생체내에 내재적으로 존재하는 줄기세포까지도 2차적으로 연골세포로 분화될 수 있어, 보다 향상된 관절질환 치료효과를 나타낼 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 복합체 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하여 관절질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 관절질환 예방 또는 치료방법은 상기 복합체 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 관절질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 관절질환이 발병된, 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "개체"란, 관절질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 살아있는 유기체를 의미하는데, 일 예로서, 관절조직을 포함하는 고등 척추동물이 될 수 있고, 다른 예로서, 포유동물이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 영장류가 될 수 있고, 또 다른 예로서, 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 행위를 의미하며, 유효성분을 인체 또는 수의용으로 제형화시킨 후, 다양한 경로로 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 투여는 관절질환이 발병된 개체에게 본 발명의 복합체 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 복합체를 포함하는 약학 조성물의 투여경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 비경구 경로, 예컨대 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 등의 경로로 투여될 수 있고, 다른 예로서, 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 복합체는 이에 포함된 줄기세포 또는 그의 배양물과, 무세포 연골 파쇄물을 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 복합체는 줄기세포가 포함된 연골조직에 투여할 수 있다.

아울러, 상기 관절질환의 치료효과를 향상시키기 위하여, 본 발명의 약학 조성물을 투여하기 전, 투여와 동시 또는 투여한 후에, 생체내에서 부작용 없이, 연골재생, 연골분화 등을 촉진시킬 수 있는 연골분화 촉진용 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 연골분화 촉진용 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, BMP 6(Bone morphogenetic protein 6) 등이 될 수 있다.

본 발명의 복합체 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), 메드셉 (Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.

상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 또는 그의 배양물과 연골 추출물을 포함하는 약학 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포 또는 다른 관절질환 치료용 제제와 함께 또는 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.

상기 약학 조성물에 포함되는 줄기세포의 1일 투여량은 일 예로서 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹⁰ 세포/kg 체중, 다른 예로서 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 줄기세포로부터 분화된 연골 또는 연골세포를 포함하는, 연골세포 분화유도용 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 연골 또는 연골세포는 추가적인 연골 무세포 파쇄물 없이도 그 자체만으로도 주변분비작용(Paracrine effect)에 의해 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있으므로, 상기 제조된 연골 또는 연골세포는, 연골세포 분화유도용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

즉, 상기 연골 또는 연골세포를 줄기세포와 공배양하여, 상기 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있다.

또한, 상기 연골 또는 연골세포는 돼지유래 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제대혈 유래 줄기세포를 분화시켜서 제조된 것을 사용할 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 제조된 연골세포를 이용하여 연골세포를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 연골세포를 이용한 연골세포의 제조방법은 (a) 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제1 줄기세포로부터 제1 연골세포를 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 분화된 제1 연골세포와 제2 줄기세포를 공배양하여, 공배양된 제2 줄기세포를 제2 연골세포로 분화시키는 단계를 포함한다.

이때, 상기 (a) 단계는 돼지유래 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제대혈 유래 줄기세포(제1 줄기세포)를 분화시키는 방식으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 줄기세포 또는 그의 배양물과 연골 무세포 파쇄물을 포함하는 연골분화 촉진용 복합체는 생체내에서도 부작용 없이 연골세포로 분화될 뿐만 아니라, 분화된 연골세포에서 나타나는 주변분비작용(Paracrine effect)으로 생체내 존재하는 내재적인 줄기세포까지도 연골세포로의 분화를 촉진시켜, 손상된 연골을 효과적으로 재생시킬 수 있으므로, 연골 손상을 수반하는 관절질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 연골분화 유도제의 종류 및 처리농도에 따른 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)의 연골분화 수준을 평가한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1b는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포를 알시안 블루로 염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1c는 UCB-MSC로부터 분화된 연골세포에서 연골분화 유도제의 종류 및 처리농도에 따른 단백질 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포와 0.5%(w/v) HA를 처리하여 분화시킨 세포에서, 아그레칸(agg)을 대상으로 면역형광 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 1e는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포와 0.5%(w/v) HA를 처리하여 분화시킨 세포에서, 2형 콜라겐(Col2a)을 대상으로 면역형광 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 1f는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포에서 BMP 6의 발현수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1g는 BMP 6를 처리하여 UCB-MSC로부터 분화된 연골세포에서 단백질 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1h는 PCP의 처리농도에 따른 세포 생존율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 1차 분화된 연골세포를 이용한 UCB-MSC의 2차 분화 실험과정을 나타내는 개략도이다.
도 2b는 PCP 또는 HA를 처리하여 분화된 연골세포와 UCB-MSC를 공존배양한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2c는 PCP 또는 HA를 처리하여 분화된 연골세포와 공존배양된 UCB-MSC에서 발현된 단백질(아그레칸, 2형 콜라겐 및 1형 콜라겐)의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골회복 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골재생 면적을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골결손 부위내 프로테오글리칸 함량을 분석하기 위한 사프라닌-오 염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3d는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골결손 부위내 2형 콜라겐의 발현수준을 분석하기 위한 면역형광 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 3e는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골결손 부위내 글리코사미노글리칸의 수준을 분석하기 위한 알시안 블루 염색을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 관절염 개선효과를 시간의 경과에 따라 촬영한 X-ray 사진이다.
도 4b는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 행동검사 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 관절강액내 TNF-a의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 슬관절의 대퇴골과(femoral condyle)와 경골 고평부(tibial plateau) 부위를 촬영한 사진이다.
도 4e는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 관절면의 부식 (erosion), 표면변화, 골극 및 대퇴골과의 비대수준을 종합적으로 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 무세포 돼지연골 추출물(PCP)의 연골분화능 평가

실시예 1-1: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 연골분화 유도

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC; Umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell)를 10%(v/v) FBS 및 1%(w/v) 겐타마이신을 포함하는 KSB-3 배지(강스템바이오텍, 한국)에 접종하고, 37℃ 및 5%(v/v) 이산화탄소 조건에서 배양하였다.

5㎕ 당 상기 배양된 UCB-MSC 5 X 10⁵ 개를 포함하는 방울을 수득하고, 이를 48웰 플레이트의 각 웰에 접종한 다음, 37℃ 및 5%(v/v) 이산화탄소 조건에서 2시간 동안 방치하여 상기 웰의 바닥에 부착시켰다.

상기 부착된 방울에 연골분화 유도제인 무세포 돼지연골 추출물(Porcine Catilage Powder, PCP; 0.5, 1 또는 2%(w/v)) 또는 히알루론산(HA; 0.25, 0.5 또는 1%(w/v))을 포함하는 연골 분화 유도 배지 (StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit, ThermoFisher)를 가하고, 7일 동안 배양하여, 상기 UCB-MSC를 연골세포로 분화시켰다(도 1a). 이때, 대조군으로는 연골분화 유도제를 처리하지 않은 UCB-MSC를 사용하였고, 상기 무세포 돼지연골 추출물은, 돼지의 연골로부터 세포를 제거한 후, 세포가 제거된 돼지연골을 동결건조, 파쇄, 여과 등의 가공단계를 수행하여 수득하였다.

도 1a는 연골분화 유도제의 종류 및 처리농도에 따른 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)의 연골분화 수준을 평가한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

도 1a에서 보듯이, 공지된 연골분화 유도제인 HA 뿐만 아니라, PCP를 다양한 농도로 처리한 경우에 모두 UCB-MSC로부터 펠렛형태의 연골이 형성됨을 확인하였다.

실시예 1-2: 알시안 블루 염색 분석

상기 실시예 1-1의 시료 중에서, 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포에 4 % 파라포름알데히드(PFA)를 가하고 하루동안 반응시켜서, 세포를 고정하였다. 상기 고정된 세포에 1 % 알시안 블루(Alcian Blue)를 가하여 20분간 염색하고, 상기 고정된 세포에 연골마커인 프로테오글리칸의 일종인 글리코사미노글리칸(GAG; Glycosaminoglycan)이 검출되는지의 여부를 확인하였다(도 1b).

도 1b는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포를 알시안 블루로 염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

도 1b에서 보듯이, 대조군의 경우에는 알시안 블루로 염색된 GAG가 검출되지 않았으나, 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포에서는 알시안 블루로 염색된 GAG가 검출되었다.

실시예 1-3: 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCT)

상기 실시예 1-1에서 분화된 각 세포에 TRIzol(Invitrogen) 용액을 가하여 각각의 총 RNA를 추출하고, 추출된 총 RNA와 AccuPower RT PreMix (Bioneer)를 이용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA와 하기 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 다양한 단백질(아그레칸(agg), 2형 콜라겐(Col2a), SOX9 및 1형 콜라겐(Col1))의 발현수준을 비교하였다(도 1c). 이때, 내부대조군으로는 RPL13a를 사용하였다.

Aggrecan_F: 5'-ctgcattccacgaagctaacct-3'(서열번호 1)

Aggrecan_R: 5'-gacgcctcgccttcttgaa-3'(서열번호 2)

collagen type 2 alpha 1_F: 5'-ctactggattgaccccaaccaa-3'(서열번호 3)

collagen type 2 alpha 1_R: 5'-tccatgttgcagaaaaccttca-3'(서열번호 4)

SOX9_F: 5'-gacttctgaacgagagcgaga-3'(서열번호 5)

SOX9_R: 5'-ccgttcttcaccgacttcctc-3'(서열번호 6)

collagen type 1_F: 5'-caggaagggccacgacaaa-3'(서열번호 7)

collagen type 1_R: 5'-ctgcggcacaagggattg-3'(서열번호 8)

RPL 13a_F: 5'-ctatgaccaataggaagagcaacc-3'(서열번호 9)

RPL 13a_R: 5'-gcagagtatatgaccaggtggaa-3'(서열번호 10)

도 1c는 UCB-MSC로부터 분화된 연골세포에서 연골분화 유도제의 종류 및 처리농도에 따른 단백질 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1c에서 보듯이, 연골마커 단백질로 알려진 아그레칸(agg), 2형 콜라겐(Col2a) 및 SOX9의 발현수준은 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 연골세포에서 상대적으로 가장 높은 수준을 나타내는 반면, 연골마커 단백질이 아닌 1형 콜라겐(Col1)의 발현수준은 모든 실험군에서 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 1-4: 면역 형광 분석

실시예 1-1의 시료 중에서, 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포와 0.5%(w/v) HA를 처리하여 분화시킨 세포에서, 아그레칸(agg) 및 2형 콜라겐(Col2a)을 대상으로 면역형광 염색을 수행하였다.

대략적으로, 상기 분화된 각 세포를 고정시키고, 1%(w/v) BSA를 가하여 블로킹한 다음, 아그레칸 또는 2형 콜라겐에 대한 항체(1:100, abcam)를 가하고, 4 ℃에서 하루밤 동안 반응시켰다. 이어, 세포를 PBS로 세척하고, 염소-Alexa 488-컨쥬게이트 항 마우스 IgG/IgM 폴리클로날 항체(Invitrogen)를 가하여 반응시킨 후, 형광현미경으로 관찰하였다(도 1d 및 1e). 이때, 대조염색은 Hoechst 33342 trihydrochloride, trihydrate (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다.

도 1d는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포와 0.5%(w/v) HA를 처리하여 분화시킨 세포에서, 아그레칸(agg)을 대상으로 면역형광 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이고, 도 1e는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포와 0.5%(w/v) HA를 처리하여 분화시킨 세포에서, 2형 콜라겐(Col2a)을 대상으로 면역형광 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.

도 1d 및 1e에서 보듯이, 0.5%(w/v) HA를 처리하여 분화시킨 세포 보다는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포에서 연골마커인 아그레칸과 2형 콜라겐이 상대적으로 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

실시예 1-5: BMP 6의 발현에 미치는 영향

실시예 1-1의 시료 중에서, 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포에서 발현되는 BMP 6(Bone morphogenetic protein 6)의 발현수준을 하기 프라이머를 사용한 실시예 1-3의 방법을 이용하여 측정하였다(도 1f). 이때, 대조군으로는 PCP를 처리하지 않고 분화시킨 세포에서 측정된 BMP 6의 발현수준을 사용하였다.

BMP 6_F: 5'-gctatgctgccaattactgtgatg-3'(서열번호 11)

BMP 6_R: 5'-tgcattcatgtgtgcgttga-3'(서열번호 12)

도 1f는 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포에서 BMP 6의 발현수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1f에서 보듯이, 2%(w/v) PCP를 처리하여 분화시킨 세포에서는 BMP 6의 발현수준이 급격히 증가됨을 확인하였다.

또한, 연골분화 유도제로서 500ng/ml의 BMP 6를 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 1-1의 방법을 수행하여, UCB-MSC를 분화시키고, 이로부터 수득한 분화된 세포에서 발현된 다양한 단백질(아그레칸(agg), 2형 콜라겐(Col2a), SOX9 및 1형 콜라겐(Col1))의 발현수준을 실시예 1-3의 방법을 이용하여 비교하였다(도 1g).

도 1g는 BMP 6를 처리하여 UCB-MSC로부터 분화된 연골세포에서 단백질 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1g에서 보듯이, 연골마커 단백질로 알려진 아그레칸(agg), 2형 콜라겐(Col2a) 및 SOX9의 발현수준은 BMP 6를 처리하여 분화시킨 연골세포에서 급격히 증가된 반면, 연골마커 단백질이 아닌 1형 콜라겐(Col1)의 발현수준은 변화되지 않음을 확인하였다.

실시예 1-6: PCP의 세포독성 평가

24웰 플레이트의 각 웰에 3 X 10⁴개의 UCB-MSC를 접종하고, 다양한 농도(0.5, 1 또는 2%(w/v))의 PCP를 첨가한 다음, 3일 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양 배지 100 ㎕ 당 10 ㎕의 Cell Counting Kit-8 (Dojindo)를 가하고 1시간 동안 반응시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하여, PCP의 세포독성여부를 확인하였다(도 1h).

도 1h는 PCP의 처리농도에 따른 세포 생존율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1h에서 보듯이, PCP를 높은 농도로 처리하여도, 세포 생존율에 별다른 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

상기 실시예 1-1 내지 1-6의 결과를 종합하면, PCP를 안전한 연골분화 유도제로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: PCP로 분화된 연골세포의 UCB - MSC 분화능 평가

실시예 2- 1: 1차 분화된 연골세포를 이용한 UCB - MSC의 2차 분화

상기 실시예 1-1의 방법에 따라, UCB-MSC에 PCP 또는 HA를 처리하여 분화된 연골세포를 0.4μm 포어 폴리카보네이드 멤브렌 삽입체가 구비된 Transwell®(Corning)의 상단부 삽입체에 가하고, 연골세포 분화 유도 배지(StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit, ThermoFisher) 하에서, 5㎕ 당 상기 배양된 UCB-MSC 5 X 10⁵ 개를 포함하는 방울과 함께 공존 배양(co-culture)하였다(도 2a). 이때, 음성대조군으로는 연골분화 유도제를 처리하지 않고 공존배양하지 않은 상태로 연골세포 분화 유도 배지에서 분화시킨 UCB-MSC를 사용하였고, 양성대조군으로는 연골분화 유도제를 처리하지 않고 분화된 세포와 공존배양된 UCB-MSC를 사용하였으며, 실험군 1은 PCP를 처리하여 분화된 세포와 공존배양된 UCB-MSC를 사용하였고, 실험군 2는 HA를 처리하여 분화된 세포와 공존배양된 UCB-MSC를 사용하였다.

도 2a는 1차 분화된 연골세포를 이용한 UCB-MSC의 2차 분화 실험과정을 나타내는 개략도이다. 즉, 상기 Transwell은 삽입체가 구비된 상단부와 삽입체가 없는 하단부로 구분되는데, 상기 상단부에는 분화된 세포를 위치시키고, 상기 하단부에는 아직 분화되지 않은 UCB-MSC를 위치시킨 후, 이들 각 세포를 공존배양하였다.

실시예 2-2: 분화능 평가

상기 실시예 2-1의 방법으로 7일 또는 10일 동안 공존배양한 UCB-MSC의 분화결과를 현미경으로 관찰하였다(도 2b).

도 2b는 PCP 또는 HA를 처리하여 분화된 연골세포와 UCB-MSC를 공존배양한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

도 2b에서 보듯이, 공존배양하지 않거나(양성대조군), PCP를 처리하지 않고 분화된 세포와 공존배양된 UCB-MSC(음성대조군 또는 실험군 2)의 경우에는 UCB-MSC를 연골세포로 분화시키지 못한 반면, PCP를 처리하여 분화된 세포와 공존배양된 UCB-MSC(실험군 1)의 경우에는 UCB-MSC를 연골세포로 분화시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 2-3: RT-PCT 분석

상기 실시예 2-1의 방법으로 7일 또는 10일 동안 공존배양한 각 UCB-MSC에서 발현된 연골마커인 아그레칸(agg) 및 2형 콜라겐(Col2a)과, 연골마커가 아닌 1형 콜라겐(Col1)의 발현수준을 실시예 1-3의 방법으로 분석하였다(도 2c).

도 2c는 PCP 또는 HA를 처리하여 분화된 연골세포와 공존배양된 UCB-MSC에서 발현된 단백질(아그레칸, 2형 콜라겐 및 1형 콜라겐)의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2c에서 보듯이, 7일 동안 공존배양된 UCB-MSC 중에서, 연골마커인 아그레칸(agg) 및 2형 콜라겐(Col2a)의 발현수준은 PCP를 처리하여 분화된 세포와 공존배양된 UCB-MSC(실험군 1)에서 모두 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

이에 반하여, 공존배양하지 않거나(양성대조군), PCP를 처리하지 않고 분화된 세포와 공존배양된 UCB-MSC(음성대조군 또는 실험군 2)의 경우에는, 대체로 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

아울러, 연골마커가 아닌 1형 콜라겐(Col1)은 모든 경우에, 대체로 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

상기 실시예 2-1 내지 2-3의 결과에서 보듯이, 분화된 연골세포의 근거리 분비효과(paracrine effect)에 의한 UCB-MSC의 분화유도는, PCP를 처리하여 분화된 연골세포만이 나타내었으므로, 분화유도촉진제의 종류에 따라 분화된 연골세포가 전혀 상이한 특성을 나타내고, 분화된 연골세포가 서로 동일한 것은 아님을 알 수 있었다.

실시예 3: 생체내에서 PCP 및 줄기세포를 이용한 연골손상 치료효과 분석

실시예 3-1: 연골 결손 모델 동물을 이용한 분석

실시예 3-1-1: 연골 결손 모델 동물의 제작

수컷 뉴질랜드 화이트(NZW; New Zealand White) 토끼에 졸레틸(Zoletil 50, Virbac, 15mg/kg)과 럼푼(Rompum, Bayer, 5mg/kg)을 근육 내로 주사하여 전신마취하였다. 우측 무릎 주변의 털을 제거하고 무릎 관절의 내측 피부를 절개하여 근막과 관절낭을 절개한 후 무릎뼈를 외측으로 젖혀 관절낭을 노출시켰다. 대퇴골의 내과부(무릎관절고랑 정중앙)에 직경 1 mm 드릴 비트(drill bit)를 이용하여 직경 5 mm, 깊이 2 mm의 연골결손 부위를 만들고, 소파기로 결손부위 내의 연골을 모두 제거한 후 관절낭을 봉합하였다. 수술 후 3일간 항생제 폭소린(Foxolin, 삼진제약, 10 mg/kg)과 진통제 마리트롤(Maritrol, 제일제약, 3 mg/kg)을 매일 2회 근육 내로 주사하였고, 이후 3일간 폭소린을 매일 1회 추가로 처치하여, 연골 결손 모델(ACD; Articular Cartilage Defect) 동물을 제작하였다.

실시예 3-1-2: 연골 결손 모델 동물에 대한 PCP 및 줄기세포의 치료효과

상기 실시예 3-1-1에서 제작된 연골 결손 모델 동물에서 연골이 제거된 시점을 기준으로 30분이 경과된 후, PBS에 희석된 UCB-MSC(실험군 11), UCB-MSC/PCP(실험군 12) 또는 UCB-MSC/HA(실험군 13)을 토끼당 0.2 mL의 용량으로 관절강 내에 투여하고, 4주 동안 사육하였다.

사육된 모델 동물의 관절의 외측 대퇴골과 (femoral condyle)의 손상 부위가 포함되도록 하여 관절면을 절단한 후 연골결손 부위의 변화, 연골결손 부위 표면상태, 결손 경계부위와 새롭게 생긴 조직과의 경계부의 연속성에 대한 육안관찰, 그리고 사진 촬영을 통한 연골재생 정도를 국제 연골 재생 학회 스코어링 시스템 (International Cartilage Repair Society(ICRS) scoring system)에 따라 점수화하여 분석하였다.

대략적으로, 관절조직은 10% 중성 포르말린 용액에 3일간 고정 후 10% EDTA(pH 8.0) 용액으로 충분히 탈회시킨 다음 파라핀 절편을 제작하였다. 조직절편은 헤마톡실린 & 에오신 염색(H&E; Hematoxylin & eosin staining)하여 현미경 영상분석 프로그램인 Image J 4.8v(Wayne Rasband, National Institute of Health, UAS)으로 [연골재생부위/절단면 넓이]의 비율 분석하여 연골재생 면적을 ICRS 점수로 수치화하였다(도 3a 및 3b). 이때, 대조군으로는 연골 결손 모델 동물에 아무것도 처리하지 않은 것을 사용하였다.

도 3a는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골회복 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다.

상기 도 3a에서 보듯이, 대조군의 연골회복 수준은 결손부위의 90.48 ± 0.9 % 이고, 실험군 11의 연골회복 수준은 결손부위의 91.82 ± 0.8 % 이며, 실험군 12의 연골회복 수준은 결손부위의 94.41 ± 5.58 % 이고, 실험군 13의 연골회복 수준은 결손부위의 90.51 ± 3.36% 로 측정되었다.

또한, 도 3b는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골재생 면적을 ICRS 점수로 수치화한 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 도 3b에서 보듯이, 대조군의 ICRS 점수는 4.3 ± 0.9점 이고, 실험군 11의 ICRS 점수는 7.0 ± 0.87점 이며, 실험군 12의 ICRS 점수는 8.0 ± 0.83점 이고, 실험군 13의 ICRS 점수는 4.3 ± 0.78점 임을 확인하였다.

상기 도 3a 및 3b의 결과로부터, 연골 결손 모델 동물에 UCB-MSC와 PCP를 조합처리한 경우에, 연골회복이 가장 높은 수준을 나타내고, 연골 결손 모델 동물에 UCB-MSC와 HA를 조합처리한 경우 보다는, UCB-MSC를 단독으로 처리한 경우에 상대적으로 높은 연골회복 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-1-3: 사프라닌-오( Safranin -O) 염색 분석

상기 실시예 3-1-2에서 4주 동안 사육한 연골 결손 모델 동물로부터, 연골결손 부위를 적출하였다. 상기 적출된 연골결손 부위에 포함된 프로테오글리칸(proteoglycan)의 함량을 확인하기 위하여, 사프라닌-오(Safranin-O) 염색을 수행하였다(도 3c).

도 3c는 연골 결손 모델 동물에서 UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골결손 부위내 프로테오글리칸 함량을 분석하기 위한 사프라닌-오 염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

도 3c에서 보듯이, 연골 결손 모델 동물에 UCB-MSC와 PCP를 조합처리한 경우(실험군 12)에, 연골결손 부위내 프로테오글리칸 함량이 가장 높은 수준을 나타내었다. 또한, 연골 결손 모델 동물에 UCB-MSC와 HA를 조합처리한 경우(실험군 13) 보다는, UCB-MSC를 단독으로 처리한 경우(실험군 11)에 연골결손 부위내 프로테오글리칸 함량이 상대적으로 높은 연골회복 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 3-1-4: 면역형광 염색 분석

상기 실시예 3-1-3에서 적출한 연골결손 부위를 대상으로, 실시예 1-4의 방법을 수행하여, 2형 콜라겐에 대한 면역염색을 실시하였다(도 3d).

도 3d는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골결손 부위내 2형 콜라겐의 발현수준을 분석하기 위한 면역형광 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.

도 3d에서 보듯이, 연골 결손 모델 동물에 UCB-MSC와 PCP를 조합처리한 경우(실험군 12)에, 연골결손 부위내 2형 콜라겐의 발현수준이 가장 높은 수준을 나타내었다. 또한, 연골 결손 모델 동물에 UCB-MSC와 HA를 조합처리한 경우(실험군 13) 보다는, UCB-MSC를 단독으로 처리한 경우(실험군 11)에 연골결손 부위내 2형 콜라겐의 발현수준이 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 3-1-5: 알시안 블루 염색 분석

상기 실시예 3-1-3에서 적출한 연골결손 부위를 대상으로, 실시예 1-2의 방법을 수행하여, 글리코사미노글리칸의 수준을 확인하기 위한 알시안 블루 염색을 실시하였다(도 3e).

도 3e는 연골 결손 모델 동물에서, UCB-MSC와 연골분화 유도제의 조합처리에 따른 연골결손 부위내 글리코사미노글리칸의 수준을 분석하기 위한 알시안 블루 염색을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3e에서 보듯이, 연골 결손 모델 동물에 UCB-MSC와 PCP를 조합처리한 경우(실험군 12)에, 연골결손 부위내 글리코사미노글리칸의 수준이 가장 높은 수준을 나타내었고, UCB-MSC를 단독으로 처리한 경우(실험군 11)에도 상기 실험군 12와 유사한 수준의 글리코사미노글리칸의 수준을 나타냄을 확인하였다.

이에 반하여, 연골 결손 모델 동물에 UCB-MSC와 HA를 조합처리한 경우(실험군 13)에는 대조군과 유사한 수준의 연골결손 부위내 글리코사미노글리칸의 수준을 나타냄을 확인하였다.

상기 실시예 3-1-1 내지 3-1-5의 결과를 종합하면, 연골 결손 모델 동물에서 UCB-MSC와 PCP의 조합처리는 연골손상을 효과적으로 치료하는 효과를 나타낸 반면, UCB-MSC와 HA의 조합처리는 연골손상 치료에 별다른 영향을 나타내지 못함을 알 수 있었다.

실시예 3-2: 골관절염 모델 동물을 이용한 분석

실시예 3-2-1: 골관절염 모델 동물의 제작

수컷 뉴질랜드 화이트 토끼를 전신마취하고, 무릎 관절의 내측 피부를 절개하고 근막과 관절낭을 절개한 후 무릎뼈를 외측으로 젖혀 전방십자인대를 노출시켰다. 외과용 칼 (Surgical blade)로 전방십자인대의 중간 실질부위와 반월판 인대를 완전히 절단한 후 관절낭을 봉합하였다. 수술 후 기존과 같은 방법으로 항생제 및 진통제를 처방하여, 골관절염 모델(ACLT-OA) 동물을 제작하였다.

실시예 3-2-2: 골관절염 모델 동물에 대한 PCP 및 줄기세포의 치료효과

상기 실시예 3-2-1에서 제작한 골관절염 모델 동물을 8주 동안 사육한 다음, X-ray 검사를 통해 골관절염의 발생여부를 확인하였다. 대략적으로, 전신마취하여 우측 무릎관절을 CC(cranio-caudal) view로 보정하고 X-ray(Genoray)로 방사선 사진을 촬영하였다. 이를 통해 관절사이 간격의 좁아짐(narrowed joint space)과 경골중앙(medial tibia)에서의 골변형 등을 점수화(KL 등급; KL grade; Kellgren-Lawrence score system) 하여 골관절염의 진행정도를 평가하였다.

상기 골관절염의 등급이 결정된 동물의 관절강에 치료후보 물질로서 PBS를 처리한 양성대조군(PC), PBS에 희석된 PCP(실험군 21), UCB-MSC(실험군 22) 또는 UCB-MSC/PCP(실험군 23)를 토끼당 0.2 mL의 용량으로 투여하고, 3, 5 및 7주차에 X-ray 촬영하여 점수화(KL 등급) 함으로써, 골관절염의 진행 정도를 평가하였다(도 4a). 이때, 음성대조군(NC)으로는 골관절염이 유발되지 않은 동물을 사용하였다.

도 4a는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 관절염 개선효과를 시간의 경과에 따라 촬영한 X-ray 사진이다.

도 4a에서 보듯이, 양성대조군(PC)의 경우, 시간이 경과하여도 KL 점수가 일정수준을 유지(3주: 4.00, 5주: 3.67, 7주: 4.00)한 반면, PCP 단독투여군(실험군 21; 3주: 3.25, 5주: 3.50, 7주: 3.63), UCB-MSC 단독투여군(실험군 22; 3주: 5.71, 5주: 3.50, 7주: 3.38) 및 UCB-MSC와 PCP 병용 투여군(실험군 23; 3주: 2.75, 5주: 2.88, 7주: 3.13)에서는 골관절염이 개선되는 경향을 나타내었다.

특히, UCB-MSC 단독투여군 보다는 UCB-MSC와 PCP 병용 투여군에서 골관절염 개선효과가 증가됨을 확인하였다.

실시예 3-2-3: 행동학적 평가

상기 실시예 3-2-2에서 준비된 골관절염 유발 직후와 치료후보 물질을 처리하고 3, 5 또는 7주가 경과된 시점에서, 각 모델 동물을 넓은 공간에서 자유 보행시켜 관절염 유발에 따른 행동검사를 실시하여 걸음걸이와 발디딤 (gait), 자세 및 무게중심 (weight bearing) 및 활동성 (activity)을 점수화하고, KL 등급과 함께 관절염의 진행정도를 종합적으로 평가하였다(도 4b).

도 4b는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 행동검사 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4b에서 보듯이, 아무것도 처리하지 않은 경우(양성대조군)에는 시간의 경과에 따라 골관절염 증상이 지속적으로 악화된 반면(3주-10.22; 5주-10.22; 7주-11.22), PCP를 단독으로 처리한 경우(실험군 21; 3주-8.87; 5주-9.29; 7주-10.26), UCB-MSC를 단독으로 처리한 경우(실험군 22; 3주-8.71; 5주-9.21; 7주-9.55) 및 UCB-MSC와 PCP를 조합하여 처리한 경우(실험군 23; 3주-7.96; 5주-8.17; 7주-8.92)에는 골관절염 증상이 개선됨을 확인하였다.

특히, UCB-MSC와 PCP를 조합하여 처리한 경우(실험군 23)에는 PCP(실험군 21) 또는 UCB-MSC(실험군 22)를 단독으로 사용한 경우보다도, 골관절염 개선효과가 향상됨을 알 수 있었다.

실시예 3-2-4: 사이토카인 수준 평가

실시예 3-2-2에서와 같이, 각각의 치료후보 물질을 투여하고 8주가 경과된 시점에서, 토끼를 마취한 후 오른쪽 관절염 유발부위 관절강에 생리식염수 (0.1 mL)를 주사 후 회수를 2회 반복을 통하여 관절강액을 채취하였다. 관절강액은 콜라게나아제 (collagenase, 400 ㎍/ml)와 히알루로니다아제 (hyaluronidase, 40 U/ml)를 37 ℃에서 10분간 처리한 후 TNF-a (R&D system) 효소결합면역흡착제 검정법 (ELISA)을 통하여 염증성 사이토카인의 하나인 TNF-a의 수준을 정량분석하였다(도 4c).

도 4c는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 관절강액내 TNF-a의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4c에서 보듯이, 골관절염이 유발되지 않은 동물(NC)에 비하여, 골관절염이 유발된 모델 동물(PC)에서는 관절강액내 TNF-a의 수준이 급격히 증가하였으나, PCP(실험군 21), UCB-MSC(실험군 22) 또는 UCB-MSC/PCP(실험군 23)를 투여함에 따라, 관절강액내 TNF-a의 수준이 감소됨을 확인하였다.

특히, UCB-MSC와 PCP를 조합하여 처리한 경우(실험군 23)에는 PCP(실험군 21) 또는 UCB-MSC(실험군 22)를 단독으로 사용한 경우보다도, 관절강액내 TNF-a의 수준이 저하됨을 향상됨을 알 수 있었다.

실시예 3-2-5: 조직학적 평가

실시예 3-2-2에서와 같이, 각각의 치료후보 물질을 투여하고 8주가 경과된 시점에서, 모델 동물을 희생시키고 내측관절 도달법으로 슬관절을 노출시킨 후, 연골손상에 주의하면서 슬관절 주의의 연부조직을 제거한 다음 관절염 유발부위를 포함한 대퇴골의 과상부를 채취하였다. 이어, 슬관절의 대퇴골과(femoral condyle)와 경골 고평부(tibial plateau)를 촬영하고(도 4d), 관절면의 부식(erosion), 표면변화, 골극 및 대퇴골과의 비대수준을 종합적으로 정량분석하였다(도 4e).

도 4d는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 슬관절의 대퇴골과(femoral condyle)와 경골 고평부(tibial plateau) 부위를 촬영한 사진이고, 도 4e는 골관절염 모델 동물에서, UCB-MSC와 PCP의 개별처리 또는 조합처리에 따른, 관절면의 부식 (erosion), 표면변화, 골극 및 대퇴골과의 비대수준을 종합적으로 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4d에서 보듯이, 양성대조군과 PCP를 개별적으로 처리한 경우(실험군 21)에는 대퇴골과의 심한 손상과 부식 및 골극이 나타남을 확인한 반면, UCB-MSC를 개별적으로 처리하거나(실험군 22), UCB-MSC와 PCP를 조합하여 처리한 경우(실험군 23)에는 중증도의 대퇴골과의 손상과 골극이 나타남을 확인하였다.

도 4e에서 보듯이, 상기 대퇴골과의 손상수준과 골극수준을 정량분석한 결과, 대조군은 14.00 ± 1.67의 손상도를 나타내고, 실험군 21은 13.00 ± 1.26의 손상도를 나타내며, 실험군 22는 12.00 ± 0.72의 손상도를 나타내고, 실험군 23은 10.00 ± 0.92의 손상도를 나타냄을 확인하엿다.

상기 실시예 3-2-1 내지 3-2-5의 결과를 종합하면, 골관절염 모델 동물에서 PCP와 UCB-MSC를 개별적으로 처리하여도 골관절염을 개선시킬 수 있고, PCP 개별처리 보다는 UCB-MSC 개별처리가 보다 향상된 골관절염 개선효과를 나타냄을 확인하였으나, 이처럼 PCP와 UCB-MSC를 개별적으로 처리할 경우 보다는, PCP와 UCB-MSC를 조합하여 처리하는 경우에, 상대적으로 높은 수준의 골관절염 치료효과를 나타냄을 알 수 있었다.

결국, 연골의 손상된 동물에서 손상된 연골을 치료하기 위하여는, 연골분화 유도제의 일종인 HA는 별다른 효과를 나타내지 못하였으나, PCP가 개별적으로도 치료효과를 나타내었고; 상기 PCP를 개별적으로 사용하기 보다는, 상기 PCP와 줄기세포를 조합하여 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kangstem Biotech CO., LTD. <120> Complex for promoting catilage differentiation comprising Catilage cell-free crush and Stem Cell and Uses thereof <130> KPA160811-KR-P1 <150> KR 10-2016-0084171 <151> 2016-07-04 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctgcattcca cgaagctaac ct 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gacgcctcgc cttcttgaa 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctactggatt gaccccaacc aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tccatgttgc agaaaacctt ca 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gacttctgaa cgagagcgag a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccgttcttca ccgacttcct c 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caggaagggc cacgacaaa 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctgcggcaca agggattg 18 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctatgaccaa taggaagagc aacc 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcagagtata tgaccaggtg gaa 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gctatgctgc caattactgt gatg 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgcattcatg tgtgcgttga 20

Claims (21)

1. 줄기세포 또는 그의 배양물, 및 무세포 연골 파쇄물을 포함하는 연골분화 촉진용 복합체.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 배아줄기세포, 태반줄기세포 또는 자가유래 줄기세포인 것인, 연골분화 촉진용 복합체.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 무세포 연골 파쇄물은 연골세포가 제거된 연골기질을 기계적으로 파쇄하거나, 연골세포가 제거된 연골기질을 대상으로 냉동/해동을 반복하거나, 또는 연골세포가 제거된 연골기질에 초음파를 처리하여 수득한 파쇄물; 연골세포가 제거된 연골기질을 효소처리하여 얻어진 효소분해물; 연골세포가 제거된 연골기질에 알칼리 또는 산성 시약을 처리하거나, 또는 연골세포가 제거된 연골기질에 계면활성제를 처리하여 수득한 반응산물; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 연골분화 촉진용 복합체.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 무세포 연골 파쇄물은 돼지의 연골로부터 연골세포가 제거된 연골기질을 수득한 후, 동결건조 및 파쇄과정을 거쳐 수득한 분말상의 돼지 유래 무세포 연골 파쇄물(Porcine Catilage Powder, PCP)인 것인, 연골분화 촉진용 복합체.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 복합체는 줄기세포의 연골분화를 촉진시킬 수 있는 연골분화 촉진용 제제를 추가로 포함하는 것인, 연골분화 촉진용 복합체.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 연골분화 촉진용 제제는 BMP 6(Bone morphogenetic protein 6)인 것인, 연골분화 촉진용 복합체.
   
7. 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 단계를 포함하는, 연골 또는 연골세포의 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 무세포 연골 파쇄물을 줄기세포에 처리하기 전, 처리와 동시 또는 처리한 후에 연골분화 촉진용 제제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 연골 또는 연골세포의 제조방법.
   
9. 제7항 또는 제8항의 방법에 따라, 돼지 유래 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제대혈 유래 줄기세포로부터 분화된 연골 또는 연골세포.
   
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 연골분화 촉진용 복합체를 포함하는, 관절질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 관절질환은 다발성 관절증(Polyarthrosis), 엉덩이관절증(Coxarthrosis), 무릎관절증(Gonarthrosis) 또는 척추관절증(spondyloarthropathy)인 것인, 관절질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 연골분화 촉진용 복합체 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 관절질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 관절질환이 발병된, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 관절질환 예방 또는 치료방법.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 연골분화 촉진용 복합체에 포함된 줄기세포 또는 그의 배양물과, 무세포 연골 파쇄물을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것인, 관절질환 예방 또는 치료방법.
    
14. 제12항에 있어서,
    상기 복합체를 투여하기 전, 투여와 동시 또는 투여한 후에 연골분화 촉진용 제제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 관절질환 예방 또는 치료방법.
    
15. 제12항에 있어서,
    상기 연골분화 촉진용 복합체 또는 약학 조성물은 줄기세포가 포함된 연골조직에 투여하는 것인, 관절질환 예방 또는 치료방법.
    
16. 제12항에 있어서,
    상기 연골분화 촉진용 복합체 또는 약학 조성물을 투여하기 전, 투여와 동시 또는 투여한 후에 연골분화 촉진용 제제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 관절질환 예방 또는 치료방법.
    
17. 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 줄기세포로부터 분화된 연골 또는 연골세포를 포함하는, 연골세포 분화유도용 조성물.
    
18. 제17항에 있어서,
    상기 연골 또는 연골세포를 줄기세포와 공배양하여, 상기 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 것인, 연골세포 분화유도용 조성물.
    
19. 제17항에 있어서,
    상기 연골 또는 연골세포는 돼지유래 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제대혈 유래 줄기세포를 분화시켜서 제조된 것인, 연골세포 분화유도용 조성물.
    
20. (a) 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제1 줄기세포로부터 제1 연골세포를 분화시키는 단계; 및
    (b) 상기 분화된 제1 연골세포와 제2 줄기세포를 공배양하여, 공배양된 제2 줄기세포를 제2 연골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 연골세포를 이용한 연골세포의 제조방법.
    
21. 제20항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 돼지유래 무세포 연골 파쇄물의 존재하에 제대혈 유래 줄기세포(제1 줄기세포)를 분화시키는 방식으로 수행하는 것인, 연골세포를 이용한 연골세포의 제조방법.
    
    
    
    

Images