KR20160035316A - Method for forming monolayers of vascular endothelial cell using nanofibrous mats and hydrogel - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나노섬유매트와 하이드로젤을 이용한 혈관내피세포 단일층 형성방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인체의 실제 혈관조직 구조와 유사한 혈관조직 구조를 구현할 수 있는 혈관내피세포 단일층 형성방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 혈관내피세포 단일층 형성방법은 나노섬유매트를 형성하는 단계; 상기 나노섬유매트의 일면에 하이드로젤을 이용하여 코팅층을 형성하는 단계; 및 상기 코팅층 위에 혈관내피세포를 배양하여 상기 혈관내피세포가 서로 결합된 구조의 단일층을 형성하는 단계를 포함한다.The present invention relates to a method for forming a vascular endothelial cell monolayer using a nanofiber mat and a hydrogel, and more particularly, to a method for forming a vascular endothelial cell monolayer capable of realizing a vascular tissue structure similar to that of a human body will be. The method for forming a vascular endothelial cell monolayer according to the present invention comprises the steps of: forming a nanofiber mat; Forming a coating layer on one side of the nanofiber mat using a hydrogel; And culturing vascular endothelial cells on the coating layer to form a monolayer having a structure in which the vascular endothelial cells are bonded to each other.
Description
본 발명은 나노섬유매트와 하이드로젤을 이용한 혈관내피세포 단일층 형성방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인체의 실제 혈관조직 구조와 유사한 혈관조직 구조를 구현할 수 있는 혈관내피세포 단일층 형성방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for forming a vascular endothelial cell monolayer using a nanofiber mat and a hydrogel, and more particularly, to a method for forming a vascular endothelial cell monolayer capable of realizing a vascular tissue structure similar to that of a human body will be.
혈관신생을 통한 암 전이 연구 또는 약물 테스트와 같은 혈관과 관련된 연구를 생체 외(in vitro)에서 효과적으로 수행하기 위해서는, 생체 외에서 실제 혈관과 유사한 혈관 구조를 구현해내는 것이 매우 중요하며, 특히 혈관외벽을 둘러싸고 있는 세포외 기질(extracellular membrane)과 혈관내벽을 감싸는 기저막층(basement membrane)위에 혈관내피세포들이 서로 결합하여 단일층(monolayer)을 형성하는 것이 무엇보다 중요하다.In order to effectively perform blood vessel-related studies such as cancer metastasis research through angiogenesis or drug testing in vitro, it is very important to realize an actual blood vessel-like blood vessel structure in vitro, particularly, It is important that vascular endothelial cells bind to the extracellular membrane and the basement membrane surrounding the inner vessel wall to form a monolayer.
종래에는 반 투과막(semi-permeable membrane) 위에 혈관내피세포를 부착시켜 배양하여 생체 외 혈관을 형성하였다. 하지만 이 방법은 시간과 노동력 그리고 비용이 많이 들어 경제성이 낮을 뿐만 아니라, 특히 생체 외 혈관 자체가 3차원 구조가 아니어서 실체 혈관과 유사한 구조를 구현하기가 어렵다는 문제점이 있었다.Conventionally, vascular endothelial cells were attached to a semi-permeable membrane to form an in vitro blood vessel. However, this method has a problem in that it is difficult to implement a structure similar to the actual blood vessel because the in vitro blood vessel itself is not a three-dimensional structure, because it is not only economical because of its time, labor and cost.
최근에는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 재질의 마이크로 구조물에 미세한 구멍을 형성하고, 상기 구멍의 하면에 혈관내피세포(vascular endothelial cell)를 배양한 다음 혈관내피세포가 단일층 충분히 형성하도록 유도하였다. 하지만 이 방법 역시 혈관조직의 기저막층이나 세포외 기질과 같은 3차원적인 구조를 재현하지 못할 뿐만 아니라, 단순히 혈관내피세포의 단일층 형성에만 초점을 맞춘 접근방식 이였다.
In recent years, fine holes have been formed in polydimethylsiloxane (PDMS) microstructures, vascular endothelial cells have been cultured on the lower surface of the holes, and vascular endothelial cells have been induced to form a single layer sufficiently. However, this method not only failed to reproduce the three-dimensional structure such as the basement membrane layer or extracellular matrix of vascular tissue, but also focused on the formation of monolayer of vascular endothelial cells.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로 세포외 기질과 유사한 구조의 나노섬유매트 일면에 기저막층의 역할을 하는 하이드로젤을 코팅하고 혈관내피세포를 시딩하여 세포가 서로 결합된 균일한 단일층을 형성함으로써 인체의 실제 혈관조직과 유사한 혈관조직 구조를 모사할 수 있는 혈관내피세포 단일층 형성방법을 제공한다.
In order to solve the problems of the prior art described above, the present invention provides a nanofiber mat having a structure similar to an extracellular matrix coated with a hydrogel serving as a basement membrane layer, seeding vascular endothelial cells, Layer to form a vascular endothelial cell monolayer formation method capable of simulating a vascular tissue structure similar to the actual vascular tissue of the human body.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 혈관내피세포 단일층 형성방법은, 나노섬유매트를 형성하는 단계; 상기 나노섬유매트의 일면에 하이드로젤을 이용하여 코팅층을 형성하는 단계; 및 상기 코팅층 상에 혈관내피세포를 배양하여 상기 혈관내피세포가 서로 결합된 구조의 단일층을 형성하는 단계를 포함한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for forming a vascular endothelial cell monolayer comprising: forming a nanofiber mat; Forming a coating layer on one side of the nanofiber mat using a hydrogel; And culturing vascular endothelial cells on the coating layer to form a monolayer of a structure in which the vascular endothelial cells are bonded to each other.
상기 나노섬유매트는 두께가 1 mm 내지 2 mm 인 것이 바람직하다.The thickness of the nanofiber mat is preferably 1 mm to 2 mm.
상기 나노섬유매트는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리에테르술폰(polyethersulfone, PES), 폴리비닐리덴 플로라이드( polyvinylidene fluoride, PVDF), 셀룰로오즈(cellulose), 나이론(nylon), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL) 및 이들의 공중합체 중 어느 하나의 물질로 이루어질 수 있으나, 폴리카프로락톤인 것이 더욱 바람직하다.The nanofiber mat may be formed of a material selected from the group consisting of polyethylene terephthalate (PET), polyethersulfone (PES), polyvinylidene fluoride (PVDF), cellulose, nylon, polyethylene, , Polypropylene, polycarbonate, polyurethane, polyacrylate, polycaprolactone (PCL), and copolymers thereof. However, the poly It is more preferable that caprolactone is used.
상기 하이드로젤은 콜라겐(collagen), 매트리젤(matrigel), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 도파민(dopamine), 알지네이트(alginate) 및 젤라틴(gelatin) 중 어느 하나일 수 있으나, 콜라겐인 것이 더욱 바람직하다.
The hydrogel may be any one of collagen, matrigel, laminin, fibronectin, dopamine, alginate and gelatin, but it is preferably collagen. desirable.
또한 본 발명은, 고분자 물질을 용매에 용해한 방사용액을 전기방사하여 나노섬유매트를 제조하는 단계(단계 1); 상기 나노섬유매트의 일면에 하이드로젤을 코팅하여 코팅층을 형성하는 단계(단계 2); 상기 코팅층 상에 혈관내피세포를 배양하여 단일층을 형성하는 단계(단계 3); 및 상기 코팅층 및 상기 단분차층이 형성된 나노섬유매트를 관 형상으로 형성하는 단계(단계 4)를 포함하는 혈관내피세포 단일층 형성방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing a nanofiber mat by electrospinning a spinning solution in which a polymer material is dissolved in a solvent (step 1); Coating a hydrogel on one side of the nanofiber mat to form a coating layer (step 2); Culturing the endothelial cells on the coating layer to form a single layer (step 3); And forming a nanofiber mat having the coating layer and the single-phase separate layer in a tubular shape (step 4).
상기 고분자물질은 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리덴 플로라이드, 셀룰로오즈, 나이론, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체 중 어느 하나일 수 있으나, 폴리카프로락톤인 것이 더욱 바람직하다.The polymer material may be any one of polyethylene terephthalate, polyethersulfone, polyvinylidene fluoride, cellulose, nylon, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyurethane, polyacrylate, polycaprolactone, and copolymers thereof However, it is more preferable that it is polycaprolactone.
상기 용매는 클로로포름(chloroform), 디메틸 포름아미드(dimethyl formamide), 디메틸 아세트아미드(dimethylacetamide), 아세톤(acetone), 디클로로메탄(dichloromethane), 초산(acetic acid), 개미산(formic acid) 및 물 중 어느 하나일 수 있으나, 클로로포름인 것이 더욱 바람직하다.The solvent may be any one selected from the group consisting of chloroform, dimethyl formamide, dimethylacetamide, acetone, dichloromethane, acetic acid, formic acid, But chloroform is more preferred.
상기 단계 2는 상기 나노섬유매트의 일면에 콜라겐, 매트리젤, 라미닌, 피브로넥틴, 도파민, 알지네이트 및 젤라틴 중 어느 하나의 물질을 직접 코팅하여 상기 코팅층을 형성할 수 있다.In the step 2, the coating layer may be formed by directly coating one surface of the nanofiber mat with collagen, matrigel, laminin, fibronectin, dopamine, alginate and gelatin.
상기 단계 2는 상기 나노섬유매트의 일면에 섬유아세포(fibroblast)를 시딩하고, 상기 섬유아세포로부터 형성된 콜라겐에 의해 상기 코팅층을 형성할 수 있다.
In the step 2, a fibroblast may be seeded on one surface of the nanofiber mat, and the coating layer may be formed of collagen formed from the fibroblasts.
본 발명은 수 내지 수백 나노미터 두께의 나노섬유가 불규칙적으로 얽혀있는 구조의 나노섬유매트를 이용함으로써 인체조직의 세포외기질(extracellular matrix, ECM)과 구조가 유사하여 세포의 증식, 생성 및 분화에 용이한 효과를 갖는다.The present invention utilizes a nanofiber mat having irregularly intertwined nanofibers of several to several hundred nanometers in thickness, which is similar in structure to the extracellular matrix (ECM) of human tissue, It has an easy effect.
또한 본 발명에 따르면 상기 나노섬유매트의 일면을 하이드로젤로 코팅함으로써 실제 혈관 내면을 감싸는 기저막층의 역할을 수행할 수 있게 한다. 이에 따라 상기 하이드로젤 코팅층 위에서 배양된 혈관내피세포가 서로 결합되어 단일층을 형성하게 할 수 있게 함으로써 실제 혈관조직과 유사한 구조를 구현할 수 있다.In addition, according to the present invention, one side of the nanofiber mat is coated with a hydrogel, so that it can serve as a basement membrane wrapping the inner surface of the blood vessel. Accordingly, the vascular endothelial cells cultured on the hydrogel coating layer can be bonded to each other to form a single layer, thereby realizing a structure similar to that of actual vascular tissue.
또한 본 발명은 인체의 실제 혈관과 유사한 구조를 모사함으로써 혈관신생을 통한 암 전이 연구 또는 약물 테스트와 같은 혈관과 관련된 연구를 생체 외(in vitro)에서 효과적으로 수행할 수 있는 효과를 갖는다.
In addition, the present invention has the effect of effectively performing blood vessel-related research such as cancer metastasis research through angiogenesis or drug test in vitro by simulating a structure similar to an actual blood vessel of a human body.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 하이드로젤이 코팅된 나노섬유매트 위에 혈관내피세포 단일층이 형성되는 모습을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예를 구성하는 나노섬유매트의 (a)나노섬유매트를 제조하기 위한 전기방사장치 (b) 상기 전기방사장치에 의해 제조된 나노섬유매트를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예를 구성하는 나노섬유매트를 정렬매트로 제조하기 위한 전기방사장치와 상기 전기방사장치에 의해 제조된 나노섬유매트(정렬매트)를 주사전자현미경(SEM)으로 분석한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 나노섬유매트 일면에 하이드로젤 코팅층을 형성하고 이를 주사전자현미경(SEM)으로 분석한 사진이다. (a)는 콜라젠이 코팅된 나노섬유매트의 SEM 이미지, (b)는 섬유아세포가 코팅된 나노섬유매트의 SEM 이미지이다.
도 5는 상기 도 3에 따른 정렬매트(나노섬유매트)에 콜라젠으로 코팅층을 형성하고 주사전자현미경(SEM)으로 분석한 사진과 혈관내피세포 단일층을 형성하고 형광현미경으로 분석한 사진이다.
(a) 콜라젠이 코팅된 정렬매트(나노섬유매트)의 SEM 이미지, (b)는 그 위에 혈관내피세포가 단일층이 형성된 현미경 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 나노섬유매트 일면에 형성된 하이드로젤 코팅층 위에 혈관내피세포 단일층을 형성하고 이를 형광현미경으로 분석한 사진이다. (a)는 top view, (b)는 side view이다.FIG. 1 is a schematic view of a vascular endothelial cell monolayer formed on a hydrogel-coated nanofiber mat according to an embodiment of the present invention.
Fig. 2 is a view showing a nanofiber mat manufactured by the electrospinning apparatus; Fig. 2 (a) is an electrospinning device for producing a nanofiber mat; Fig.
FIG. 3 is a graph showing the results of analysis of an electrospinning device for producing a nanofiber mat as an alignment mat constituting an embodiment of the present invention and a nanofiber mat (alignment mat) produced by the electrospinning device by a scanning electron microscope (SEM) It's a picture.
4 is a photograph of a hydrogel coating layer formed on one surface of a nanofiber mat according to an embodiment of the present invention and analyzed by a scanning electron microscope (SEM). (a) is an SEM image of a nanofiber mat coated with a collagen, and (b) is an SEM image of a nanofiber mat coated with a fibroblast.
FIG. 5 is a photograph of a monolayer of vascular endothelial cells formed by forming a coating layer with collagen on the alignment mat (nanofiber mat) according to FIG. 3 and analyzing it by a scanning electron microscope (SEM) and analyzing it by fluorescence microscope.
(a) an SEM image of an alignment mat (nanofiber mat) coated with collagen, and (b) a microscope image in which a monolayer of vascular endothelial cells was formed thereon.
FIG. 6 is a photograph of a vascular endothelial cell monolayer formed on a hydrogel coating layer formed on one surface of a nanofiber mat according to an embodiment of the present invention and analyzed by a fluorescence microscope. (a) is top view, and (b) is a side view.
이하에 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이다. 다음에서 설명되는 실시예들은 여러 가지 다양한 형태로 변형할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 기술적 사상을 명확히 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Preferred embodiments of the present invention will now be described with reference to the accompanying drawings. The embodiments described below can be modified into various forms, and the scope of the present invention is not limited to the following embodiments. The embodiments of the present invention are provided to clearly convey the technical idea of the present invention to a person having ordinary skill in the art.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈관내피세포 단일층 형성방법은 나노섬유가 불규칙적으로 얽혀있는 구조의 나노섬유매트(100)를 형성하는 단계; 나노섬유매트(100)의 일면에 코팅층(200)을 형성하는 단계; 및 코팅층(200) 상에 단일층(300)을 형성하는 단계를 포함한다.Referring to FIG. 1, a method for forming a vascular endothelial cell monolayer according to an embodiment of the present invention includes: forming a
나노섬유매트(100)는 전기방사법(electrospinning)을 이용하여 균일한 두께를 가지도록 제조될 수 있으며, 상기 두께는 1 mm 이상 2 mm 이하인 것이 바람직하다. 전기방사법에 의한 나노섬유매트(100)의 구체적인 제조 방법에 관한 설명은 도 2에 대한 설명에서 자세하게 후술하기로 한다.The
나노섬유매트(100)는 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리덴 플로라이드, 셀룰로오즈, 나이론, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체 중 어느 하나의 물질로 이루어질 수 있으나, 폴리카프로락톤 재질로 이루어지는 것이 바람직하다.The
나노섬유매트(100)는 세포외기질(ECM)과 유사한 구조를 가지고 있어 표면적이 크고 세포 배양 시 세포의 증식, 생성 및 분화가 용이할 뿐만 아니라, 나노섬유매트(100)의 일면에 배양되는 세포가 나노섬유매트(100)의 두께 방향으로 통과 가능함으로써 3차원적인 세포 이동(cell migration)이나 또는 세포 반응(cell reaction)을 관찰할 수 있는 효과를 갖는다.Since the
코팅층(200)은 나노섬유매트(100)의 일면에 하이드로젤을 직접 코팅하거나 또는 나노섬유매트(100)의 일면에 섬유아세포(fibroblast)를 시딩하고 상기 섬유아세포로부터 형성된 콜라겐에 의해 코팅층(200)을 형성할 수 있다.The
코팅층(200)의 두께는 50 ~ 150nm 인 것이 바람직하며, 상기 하이드로젤은 콜라겐, 매트리젤, 라미닌, 피브로넥틴, 도파민, 알지네이트 및 젤라틴 중 어느 하나일 수 있으나, 후술하는 균일한 단일층(300)의 형성을 고려할 때 콜라겐인 것이 바람직하다.The thickness of the
나노섬유매트(100)에 후술하는 혈관내피세포를 배양하는 경우에는 상기 혈관내피세포간의 결합이 이루어지지 않아 균일한 단일층(300)을 형성하기 어려우나, 나노섬유매트(100)에 하이드로젤로 이루어진 코팅층(200)을 형성한 다음 코팅층(200) 상에 혈관내피세포를 배양하면 상기 혈관내피세포간에 세포 연결(cell junction)이 형성됨으로써 균일한 단일층(300)을 형성하는 효과를 갖는다.In the case of culturing vascular endothelial cells described later on the
단일층(300)은 코팅층(200) 상에 배양된 혈관내피세포간의 세포 연결에 의해 균일하게 형성되며, 단일층(300)의 두께는 5~10um 인 것이 바람직하다.The
상기 혈관내피세포간의 세포 연결에 의해 균일한 단일층(300)이 형성됨으로써 인체의 실제 혈관의 구조와 유사하여 혈관신생을 통한 암 전이 연구 또는 약물 테스트와 같은 혈관과 관련된 연구를 생체 외(in vitro)에서 효과적으로 수행할 수 있는 효과를 갖는다.
By forming a uniform monolayer (300) by the cell connection between the vascular endothelial cells, blood vessel-related studies such as cancer metastasis research or drug test through an angiogenesis similar to the actual blood vessel structure of the human body are carried out in vitro ), Which is an effect that can be effectively performed.
이하 도 2 내지 도 6를 참조하여, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명하기로 한다.
Hereinafter, a specific embodiment of the present invention will be described in detail with reference to FIG. 2 to FIG.
나노섬유매트 제조Manufacture of nano fiber mats
도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈관내피세포 단일층 형성에 이용되는 나노섬유매트는 고분자로 폴리카프로락톤과 용매로 클로로포름을 사용하고 이들을 교반기에서 2시간 동안 섞어서 용액을 제조한 다음, 온도 20∼21℃, 습도 50∼55%의 환경에서 노즐에 24∼25㎸의 전압을 인가하여 방사하여 제조하였다.Referring to FIG. 2, the nanofiber mat used in the formation of a vascular endothelial cell monolayer according to an embodiment of the present invention is prepared by using polycaprolactone as a polymer, chloroform as a solvent, and mixing them in a stirrer for 2 hours to prepare a solution Then, a voltage of 24 to 25 kV was applied to the nozzles in an environment of a temperature of 20 to 21 캜 and a humidity of 50 to 55%, and spun.
보다 자세하게는 방사 시 노즐과 집적판 사이의 거리는 65㎜를 유지하고 집적판을 30㎜/s의 이송속도로 움직이면서 약 100㎛의 간격을 지닌 평행한 패턴을 반복하는 것에 의해 나노섬유를 제조하였으며, 상기 나노섬유를 10회 적층하는 공정을 반복 수행함으로써 균일한 두께를 가지는 나노섬유매트를 제조하였다.
More specifically, nanofibers were prepared by repeating a parallel pattern with a distance of about 100 탆 while maintaining the distance between the nozzle and the integrated plate at 65 mm while moving the integrated plate at a feeding speed of 30 mm / s, And a process of laminating the nanofibers 10 times was repeated to produce a nanofiber mat having a uniform thickness.
상기 나노섬유매트는 방사되는 나노섬유가 랜덤하게 쌓이는 형태로 형성되는 랜덤매트뿐만 아니라 방사되는 나노섬유가 가지런하게 줄지어 늘어선 형태로 형성되는 정렬매트로 제조할 수 있다. 정렬매트는 둥근 드럼을 1,000 ~ 2,000RPM의 속도로 회전 시키면서 방사하는 방법으로 제조될 수 있다(도 3 참조).
The nanofiber mat may be manufactured as an alignment mat formed by laminating aligned nanofibers as well as a random mat formed by randomly stacking the nanofibers to be radiated. The alignment mat can be produced by spinning a round drum while rotating at a speed of 1,000 to 2,000 RPM (see FIG. 3).
나노섬유매트 일면에 하이드로젤 코팅층 형성Formation of hydrogel coating layer on one side of nanofiber mat
하이드로젤 코팅층은 콜라젠을 이용하여 형성할 수 있다. 구체적으로 3mg/ml의 농도를 갖는 콜라젠에 1N의 농도를 갖는 수산화나트륨과 3차 증류수를 각각 일정비율로 섞어 콜라젠을 3차원으로 겔화하여 그물구조를 가지게 만든 후에 나노섬유매트 일면에 코팅한 다음, 온도 37℃, 이산화탄소 5%의 환경을 조성하는 인큐베이터에 1시간 동안 배양시켜 가교(cross linking)시킴으로써 나노섬유매트의 일면이 콜라젠으로 도포되어 혈관내피세포가 단일층을 형성할 수 있는 평평한 층을 이룰 수 있도록 하였다. 또한 콜라젠으로 코팅된 나노섬유매트는 표면에 겔화된 콜라젠의 그물구조를 그대로 발현시켜 분자들이 가교됨으로써 혈관내피세포가 보다 쉽게 부착되고 자랄 수 있도록 하였다(도 4 (a), 도 5 (a) 참조).
The hydrogel coating layer can be formed using collagen. Specifically, collagen having a concentration of 3 mg / ml was mixed with a sodium hydroxide having a concentration of 1 N and a third distilled water at a predetermined ratio to gelize the collagen three-dimensionally to have a net structure, then coated on one surface of the nanofiber mat, The cells were incubated for 1 hour in an incubator with an environment of 37 ° C and 5% carbon dioxide for cross-linking, whereby one surface of the nanofiber mat was coated with collagen to form a flat layer on which vascular endothelial cells could form a single layer . In addition, the collagen-coated nanofiber mat exhibits the network structure of gelled collagen as it is on the surface so that the molecules are crosslinked so that the vascular endothelial cells can be attached and grown more easily (Fig. 4 (a), Fig. 5 ).
상기 하이드로젤 코팅층은 상기 나노섬유매트 일면에 시딩된 섬유아세포부터 형성된 콜라겐에 의해 형성될 수 있다. 구체적으로 상기 코팅층 형성은 섬유아세포를 10mm의 직경과 1mm의 두께를 갖는 나노섬유매트에 시딩하여 1주일 동안 배양시키는 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 하이드로젤 코팅층 형성은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 1mm의 두께의 소수성의 나노섬유매트를 10mm의 직경으로 자른 후 70% 에탄올에 1시간 동안 충분히 저장하여 친수성의 나노섬유매트로 바꾼 뒤에 PBS(Phosphate Buffered Saline Solution)에 다시 1시간 동안 저장하고 하루 동안 세포 배양액에 담가두었다가 48-웰 플레이트에 옮겨 놓았다. 배아상태의 쥐에서 추출된 섬유아세포를 플라스크에 2번 배양한 후 트립신으로 세포를 떼어낸 후 트라이판 블루 분석을 통하여 세포의 숫자를 센 후, 10만 마리의 섬유아세포를 10mm의 직경과 1mm의 두께를 갖는 상기 나노섬유매트에 시딩하고 배양액과 함께 1주일 동안 배양하여 섬유아세포로부터 형성된 콜라겐에 의해 상기 코팅층을 형성하였다(도 4(b) 참조).
The hydrogel coating layer may be formed of collagen formed from fibroblasts seeded on one surface of the nanofiber mat. Specifically, the coating layer formation can be carried out by seeding fibroblasts on a nanofiber mat having a diameter of 10 mm and a thickness of 1 mm and culturing for one week. In one embodiment of the present invention, the hydrogel coating layer formation was carried out in the following manner. The hydrophobic nanofiber mat having a thickness of 1 mm was cut into a diameter of 10 mm and stored in 70% ethanol for 1 hour to be converted into a hydrophilic nanofiber mat, and then stored in PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) for 1 hour. Immersed in cell culture medium, and transferred to a 48-well plate. The fibroblasts extracted from the embryonic rats were cultured twice in the flask, and the cells were removed with trypsin. After counting the number of cells through triplane blue analysis, 100,000 fibroblasts were treated with 10 mm diameter and 1 mm The nanotubes were seeded on the nanofiber mat having a thickness of 1 mm and cultured for one week together with the culture solution to form the coating layer by collagen formed from fibroblasts (see Fig. 4 (b)).
코팅층 위에 혈관내피세포 단일층 형성Formation of vascular endothelial cell monolayer on the coating layer
상기 제조된 나노섬유매트의 코팅층 위에 혈관내피세포를 시딩하고 1주일 동안 배양하면 혈관내피세포가 서로 결합된 구조의 단일층을 형성시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 단일층 형성은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 인간의 배꼽정맥에서 추출된 혈관내피세포를 플라스크에 2번 배양한 뒤, 트립신으로 세포를 떼어낸 후 트라이판 블루 분석을 통하여 세포의 숫자를 센 후, 20만 마리의 혈관내피세포를 기 만들어진 나노섬유매트 코팅 층 위에 시딩하고 배양액과 함께 1주일 동안 배양하였다. 1주일 후에 4.7% 포름알데히드로 세포를 고정하고 세포부착단백질로 형광 염색하여 현미경으로 세포결합을 확인하였다(도 5 (b), 도 6(a) 참조). 또한 나노섬유매트를 10um의 두께로 얇게 잘라서 그 옆을 현미경으로 확인함으로써 단일 층이 제대로 형성되었다는 것을 확인할 수 있었다(도 6(b) 참조). When the vascular endothelial cells are seeded on the coating layer of the prepared nanofiber mat and cultured for one week, a single layer of a structure in which vascular endothelial cells are bonded to each other can be formed. In one embodiment of the present invention, the single layer formation was carried out in the following manner. The vascular endothelial cells extracted from the human umbilical vein were cultured twice in the flask, and then the cells were removed with trypsin. After counting the number of cells through the trypan blue assay, 200,000 vascular endothelial cells Seeded onto the fiber mat coating layer and incubated with the culture for one week. After one week, the cells were fixed with 4.7% formaldehyde and fluorescently stained with the cell adhesion protein, and the cell binding was confirmed by a microscope (Fig. 5 (b) and Fig. 6 (a)). In addition, the nanofiber mat was thinly cut to a thickness of 10 탆, and the side thereof was confirmed by a microscope to confirm that a single layer was properly formed (see Fig. 6 (b)).
100: 나노섬유매트
200: 코팅층
300: 단일층100: Nano fiber mat
200: Coating layer
300: single layer
Claims (9)
상기 나노섬유매트의 일면에 하이드로젤을 이용하여 코팅층을 형성하는 단계; 및
상기 코팅층 위에 혈관내피세포를 배양하여 상기 혈관내피세포가 서로 결합된 구조의 단일층을 형성하는 단계를 포함하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
Forming a nanofiber mat;
Forming a coating layer on one side of the nanofiber mat using a hydrogel; And
And forming a monolayer of a structure in which the vascular endothelial cells are bonded to each other by culturing vascular endothelial cells on the coating layer.
상기 나노섬유매트는 두께가 1 ~ 2 mm인 것을 특징으로 하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
The method according to claim 1,
Wherein the nanofiber mat has a thickness of 1 to 2 mm.
상기 나노섬유매트는 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리덴 플로라이드, 셀룰로오즈, 나이론, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체 중 어느 하나의 물질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
The method according to claim 1,
Wherein the nanofiber mat is selected from the group consisting of polyethylene terephthalate, polyether sulfone, polyvinylidene fluoride, cellulose, nylon, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyurethane, polyacrylate, polycaprolactone, and copolymers thereof Wherein the vascular endothelial cell monolayer is formed of a material.
상기 하이드로젤은 콜라겐, 매트리젤, 라미닌, 피브로넥틴, 도파민, 알지네이트 및 젤라틴 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
The method according to claim 1,
Wherein the hydrogel is any one of collagen, matrigel, laminin, fibronectin, dopamine, alginate and gelatin.
상기 나노섬유매트의 일면에 하이드로젤을 코팅하여 코팅층을 형성하는 단계(단계 2); 및
상기 코팅층 상에 혈관내피세포를 배양하여 단일층을 형성하는 단계(단계 3)를 포함하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
Preparing a nanofiber mat by electrospinning a spinning solution in which a polymer material is dissolved in a solvent (step 1);
Coating a hydrogel on one side of the nanofiber mat to form a coating layer (step 2); And
And culturing the vascular endothelial cells on the coating layer to form a monolayer (step 3).
상기 고분자물질은 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리덴 플로라이드, 셀룰로오즈, 나이론, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
The method of claim 5,
The polymer material may be any one of polyethylene terephthalate, polyether sulfone, polyvinylidene fluoride, cellulose, nylon, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyurethane, polyacrylate, polycaprolactone and copolymers thereof ≪ / RTI >
상기 용매는 클로로포름, 디메틸 포름아미드, 디메틸 아세트아미드, 아세톤, 디클로로메탄, 초산, 개미산 및 물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
The method of claim 5,
Wherein the solvent is any one of chloroform, dimethylformamide, dimethylacetamide, acetone, dichloromethane, acetic acid, formic acid, and water.
상기 단계 2는 상기 나노섬유매트의 일면에 콜라겐, 매트리젤, 라미닌, 피브로넥틴, 도파민, 알지네이트 및 젤라틴 중 어느 하나의 물질을 직접 코팅하여 상기 코팅층을 형성하는 것을 특징으로 하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
The method of claim 5,
Wherein the coating layer is formed by directly coating one side of collagen, matrigel, laminin, fibronectin, dopamine, alginate and gelatin on one side of the nanofiber mat, .
상기 단계 2는 상기 나노섬유매트의 일면에 섬유아세포를 시딩하고, 상기 섬유아세포로부터 형성된 콜라겐에 의해 상기 코팅층을 형성하는 것을 특징으로 하는 혈관내피세포 단일층 형성방법.
The method of claim 5,
Wherein the step 2 is performed by seeding fibroblasts on one surface of the nanofiber mat and forming the coating layer by collagen formed from the fibroblasts.
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|---|---|---|---|---|
| KR20190002253A (en) * | 2017-06-29 | 2019-01-08 | 서울대학교산학협력단 | Complex of nanofiber and hydrogel and a scaffold for tissue regeneration |
| WO2020204230A1 (en) * | 2019-04-04 | 2020-10-08 | 서울대학교산학협력단 | Composite of nanofiber and hydrogel, and scaffold for tissue regeneration comprising same |
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- 2014-09-23 KR KR1020140126764A patent/KR20160035316A/en not_active Ceased
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