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KR20120120382A - 파지 내성에 기초하여 선별된 식품의 텍스처 조절용 유산균 - Google Patents

파지 내성에 기초하여 선별된 식품의 텍스처 조절용 유산균 Download PDF

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KR20120120382A
KR20120120382A KR1020127022559A KR20127022559A KR20120120382A KR 20120120382 A KR20120120382 A KR 20120120382A KR 1020127022559 A KR1020127022559 A KR 1020127022559A KR 20127022559 A KR20127022559 A KR 20127022559A KR 20120120382 A KR20120120382 A KR 20120120382A
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토마스 얀젠
디테 엘레가르드 크리스티안센
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시에이치알. 한센 에이/에스
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Abstract

본 발명은 텍스처 조절 특성이 있는 세균 세포, 상기 세포를 포함하는 스타터 컬처, 및 상기 스타터 컬처를 이용하여 발효된 유제품에 관한 것이다.

Description

파지 내성에 기초하여 선별된 식품의 텍스처 조절용 유산균{LACTIC BACTERIUM FOR TEXTURIZING FOOD PRODUCTS SELECTED ON BASIS OF PHAGE RESISTANCE}
본 발명은 파지 내성이 향상된 세균 세포, 이러한 세포를 포함하는 스타터 컬처(starter cultures) 및 이러한 스타터 컬처로 발효된 유제품에 관한 것이다.
식품 산업에는 식품의 맛과 텍스처(texture:조직감)을 개선시키기 위해서 뿐만 아니라, 이들 식품의 저장수명을 연장시키기 위해서도 다양한 세균, 특히 유산균이 이용된다. 유제품 산업의 경우, 밀크의 산성화(발효에 의하여) 뿐만 아니라, 식품에 이들을 혼입할 경우 식품의 텍스처를 개선하기 위해서도 유산균이 집중적으로 사용되고 있다. 식품 산업에 사용되는 유산균으로는 특히, 스트렙토코커스 Streptococcus, 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc ), 페디오코커스(Pediococcus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속의 미생물을 들 수 있다. 이 중에서도 스트레토코커스 써모필러스 (Streptococus thermophilus) 종에 속하는 유산균은 단독으로 또는 다른 세균과 조합되어 식품 특히 발효 제품을 만드는데 사용된다. 이들은 특히 발효유, 예컨대 요구르트를 만드는데 사용되는 발효물(ferments)의 형성에 사용된다. 이들 중 몇몇은 발효제품의 텍스처를 개발하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 특성은 다당류의 생성과 밀접한 관계가 있다. 스트렙토코커스 써모필러스 균주들은 텍스처 조절이 가능한 균주와 그렇지 못한 균주로 나눌 수 있다.
WO2007095958 A1에는 텍스처 조절 특성이 있는 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 개시되어 있다. 이 문헌의 도 1에는 텍스처 조절 특성이 가장 우수한 균주인 CHCC8833 (DSM17876)의 전단응력 값은 약 59 Pa인 것으로 나타났다.
산업상 요구사항을 만족하기 위해, 식품의 텍스처를 조절하기 위하여 유산균, 특히 스트렙토코커스 써모필러스 중에서도 새로운 텍스처 조절 균조를 제공할 필요가 있다. 특히 락토바실러스(Lactobacillus) 종의 균주와 함께 사용될 수 있는, 신규한 텍스처 조절용 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 개발할 필요가 있다. 본 발명이 속한 산업분야에서 요구되는 또 다른 사항은 이 균주가 식품업에서 일반적으로 발견되는 박테리오파지에 내성이 있어야 한다는 것이다.
발명의 개요
본 발명자들은 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 종 및 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) 종에 속하는 새로운 그룹의 유산균을 제공하게 되었는데, 이들은 놀랍게도 파지 공격에 대하여 이들의 모균주(mother strain) 보다 더 우수한 내성을 갖는다. 또한, 놀랍게도 이 세균 그룹은 이들 세균을 밀크를 발효시킬 때 사용할 경우 모균주보다 더 높은 전단응력 및/또는 겔 강성(gel stiffness)를 발생시키는 것으로 밝혀졌다.
파지 내성 돌연변이 균주가 (밀크를 발효시키는데 사용될 경우) 그의 모균주보다 더 높은 전단응력 및/또는 겔 강성을 발생시킨다는 것은 놀라운 일이며, 그것도 galK 유전자(야생형 균주에 비해)에 돌연변이주가 생긴 균주의 파지 내성 돌연변이 균주가 그 모균주보다 더 높은 텍스처 (그 균주가 밀크를 발효시키는데 사용될 경우)를 갖는다는 것은 특히나 더더욱 놀라운 일이다.
전술한 놀라운 발견에 따라, 본 발명은 모균주의 파지 내성 돌연변이주를 스크리닝함으로써 텍스처를 조절하는 유산균 균주를 제조하는 방법, 예를 들어, 다음 단계들, 즉:
a) 유산균 균주(모균주)를 제공하는 단계; 및
b) 모균주에 비해 더 많은 파지에 대하여 (예컨대 더 많은 유형의 파지 또는 더 많은 균주(strains)의 파지) 내성을 나타내는 돌연변이 균주를 모균주로부터 분리하는 단계
를 포함하여 이루어지는, 텍스처를 조절하는 유산균(예컨대 파지 내성을 갖는 것 이외에도, 실질적인 파지 내성을 갖거나 및/또는 모균주에 비하여 증가된 파지 내성을 갖거나, 모균주보다 텍스처 조절 특징이 더 강한 유산균)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 모균주에 비해 더 많은 파지에 대해 내성을 갖도록 변형된, 특히 CHPC658, CHPC1057, CHPC1089 및 CHPC1152 파지들 중 어느 하나에 특히 내성을 갖도록 변형된 S. 써모필러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스 균주와 같은 텍스처를 조절하는 유산균 균주에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
첫번째 측면에서, 본 발명은 다음 단계들:
a) 유산균 균주(모균주)를 제공하는 단계; 및
b) 모균주에 비해 더 많은 파지(예컨대 더 많은 유형의 파지 또는 더 많은 균주(strains)의 파지)에 대하여 내성을 나타내거나 및/또는 모균주는 내성을 나타내지 않는 파지에 대하여 (동일 조건 하에서) 내성을 나타내는 돌연변이 균주를 모균주로부터 분리하는 단계
를 포함하여 이루어지는 유산균 (예컨대 파지 내성, 실질적 파지 내성, 및/또는 모균주에 비하여 증가된 파지 내성을 갖거나, 또는 밀크 발효에 사용될 경우 모균주보다 더 높은 전단응력 및/또는 겔 강성을 발생시키는 유산균)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
한가지 흥미로운 측면에서, 본 발명은 다음 단계들:
a) 유산균 균주(모균주)를 제공하는 단계; 및
a1) 박테리오파지, 예컨대 CHPC658, CHPC1057, CHPC1089　및 CHPC1152로 구성된 군으로부터 선택되는 파지와 같이, 모균주를 용균(lyse)시킬 수 있는 박테리오파지에 상기 유산균 균주를 토출시키는 단계, 및;
b) 상기 파지에 대하여 내성인 돌연변이 균주 (또는 파지에 의하여 용균되지 않는 균주)를 모균주로부터 분리하는 단계
를 포함하여 이루어지는 유산균 (예컨대 파지 내성, 실질적 파지 내성, 및/또는 모균주에 비하여 증가된 파지 내성을 갖거나, 또는 밀크 발효에 사용될 경우 모균주보다 더 높은 전단응력 및/또는 겔 강성을 발생시키는 유산균)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다음 단계들:
a) 유산균 균주(모균주)를 제공하는 단계; 및
a1) 박테리오파지, 예컨대 CHPC658, CHPC1057, CHPC1089　및 CHPC1152로 구성된 군으로부터 선택되는 파지와 같이, 모균주를 용균(lyse)시킬 수 있는 박테리오파지에 상기 유산균 균주를 노출시키는 단계, 및;
a2) 상기 노출된 세균 세포를 성장 배지에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 박테리오파지에 의하여 용균되지 않는 돌연변이 균주를 모균주로부터 분리하는 단계
를 포함하여 이루어지는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 다음 단계, 즉:
c) 상기 단계 a1)의 전, 도중 또는 후에 모균주를 돌연변이시키는 단계 (예컨대 화학물질 처리 또는 방사능 처리 또는 유전자조작 기술에 의함)
를 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명의 방법은 다음 단계, 즉:
d) 예컨대 상기 단계 c)의 전, 도중 또는 후에, 또는 상기 단계 a1)의 전, 도중 또는 후에 상기 균주의 galK 유전자 또는 galK 조절 서열(예컨대 프로모터)에 돌연변이를 도입(예컨대 화학물질 처리 또는 방사능 처리 또는 유전자조작 기술에 의함)하는 단계
를 포함할 수도 있다.
한가지 흥미로운 구체예에서, 본 발명의 방법은 다음 단계들, 즉:
- 유산균 균주 (모균주)를 제공하는 단계;
- 상기 모균주를 돌연변이시키는 단계 (예컨대 화학물질 처리 또는 방사능 처리 또는 유전자조작 기술에 의함);
- 박테리오파지, 예컨대, CHPC658, CHPC1057, CHPC1089　및 CHPC1152로 구성된 군으로부터 선택되는 파지와 같이, 모균주를 용균시킬 수 있는 박테리오파지에 상기 얻어진 유산균 균주를 노출시키는 단계,;
- 상기 노출된 세균 세포를 성장 배지에서 배양하는 단계; 및
- 박테리오파지에 의하여 용균되지 않은 돌연변이 균주를 모균주로부터 분리하는 단계
를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 방법에 의하여 예컨대 프리브노우 박스와 리보좀 결합 부위 사이 또는 -10 대역(프리브노우 박스)과 같은 galK 유전자의 프로모터 대역에 돌연변이가 도입될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 모균주에 비해 갈락토스 발효 활성 증가를 유발하는 돌연변이를 유도할 수 있다.
이러한 돌연변이는 galK 유전자의 프리브노우 박스와 리보좀 결합 부위 사이의 대역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드를 치환할 수 있다. 예를 들어, 야생형 프리브노우 박스 하류의 서열 TTCAGT 중의 C가 A, T 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드에 의해 치환될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 돌연변이는 다음을 결과시킬 수 있다:
- galK 유전자의 프리브노우 박스와 리보좀 결합 부위 사이의 대역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환. 예를 들어, 야생형 프리브노우 박스 하류의 서열 TTCAGT(SEQ ID NO: 6) 중의 C가 A, T 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드에 의해 치환될 수 있다; 및/또는
- 야생형 -10 대역 (TACGAT, SEQ ID NO: 7) 중의 C와 G 중 어느 하나 또는 두개 모두가 A 및 T로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오타이드에 의해 치환될 수 있다; 및/또는
- 야생형 -10 대역 (TACGAT, SEQ ID NO: 7) 중의 C가 A 및 T로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오타이드에 의해 치환될 수 있다; 및/또는
- 야생형 -10 대역 (TACGAT, SEQ ID NO: 7) 중의 C가 T에 의하여 치환될 수 있다; 및/또는
- 뉴클레오타이드 서열 TATGAT (SEQ ID NO: 8), TATTAT (SEQ ID NO: 9) 또는 TACTAT (SEQ ID NO: 10)을 갖는 -10 대역.
본 발명의 방법에 사용되는 모균주는 gal+ 균주일 수 있으며, 좋기로는 배지 1 ml 당 세포를 적어도 10E4개의 양으로 접종할 경우, 2% 갈락토스가 보강된 M17 배지(유일한 탄수화물원으로서 갈락토스가 첨가됨) 중 섭씨 37도에서 16 시간 배양시 pH를 적어도 1.0의 값으로 감소시킬 수 있는 균주인 것이 바람직하다. 이러한 균주의 예는 다음과 같다:
- galK 유전자의 프리브노우 박스와 리보좀 결합 부위 사이의 대역에서 1개 이상의 뉴클레오타이드가 치환된 것, 예컨대 야생형 프리브노우 박스 하류의 서열 TTCAGT (SEQ ID NO:6) 중의 C가 A, T 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드에 의하여 치환된 것; 및/또는
- 야생형 -10 대역 (TACGAT, SEQ ID NO:7) 중의 C와 G 중 어느 하나 또는 두개 모두가 A 및 T로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오타이드에 의하여 치환된 것; 및/또는
- 야생형 -10 대역(TACGAT, SEQ ID NO:7) 중의 C가 A 및 T로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오타이드에 의하여 치환된 것; 및/또는
- 야생형 -10 대역(TACGAT, SEQ ID NO:7) 중의 C가 T에 의하여 치환된 것; 및/또는
- 뉴클레오타이드 서열 TATGAT (SEQ ID NO:8), TATTAT (SEQ ID NO:9) 또는 TACTAT (SEQ ID NO:10)을 갖는 -10 대역.
본 발명의 방법은:
c1) 예컨대 모균주에 비하여 증가된 파지 내성을 갖는 것과 같은, 파지 내성을 갖는 돌연변이주를 스크리닝하는 단계; 및
c2) 예컨대 모균주에 비하여 갈락토스 분해 활성이 증가된 것과 같은, Gal+ 표현형을 갖는 돌연변이 균주를 스크리닝하는 단계
로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 단계(들)을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 일구체예는 다음 단계들, 즉:
- 유산균 균주(모균주)를 제공하는 단계;
- 임의로 모균주를 돌연변이시키는 단계;
- 상기 임의로 돌연변이된 모균주를 박테리오파지, 예컨대 CHPC658, CHPC1057, CHPC1089 및 CHPC1152로 이루어진 군으로부터 선택된 파지와 같이 모균주를 용균시킬 수 있는 박테리오파지에 노출시키는 단계;
- 필요에 따라 상기 노출된 세균 세포를 성장 배지에서 배양하는 단계; 및
- 파지 내성, 예컨대 모균주에 비하여 증가된 파지 내성을 갖는 돌연변이 균주를 스크리닝하는 단계; 및/또는 모균주에 비하여 증가된 갈락토스 분해 활성을 갖는 것과 같은, Gal+ 표현형을 갖는 돌연변이 균주를 스크리닝하는 단계
를 포함하는, 유산균의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법으로 얻어지는 돌연변이 균주는 자발적인 돌연변이 균주, 예컨대 화학물질 처리 또는 방사능 처리에 의한 모균주의 돌연변이에 의하여 얻은 돌연변이 균주이거나 또는 유전자조작 기술에 의하여 얻어진 돌연변이 균주일 수 있다.
본 발명의 방법의 일구체예에서, 돌연변이 균주는 파지 내성, 실질적인 파지 내성, 및/또는 모균주에 비하여 증가된 파지 내성을 가지며, 여기서 파지는 모균주를 용균시킬 수 있는 것, 즉, CHPC658, CHPC1057, CHPC1089　및 CHPC1152로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
현재 세균(모균주)은 락토코커스 spp. (Lactococcus spp.), 스트렙토코커스 spp. (Streptococcus spp.) (예컨대, 스트렙토코커스 써모필러스), 락토바실러스 spp. (Lactobacillus spp.), 류코노스톡 spp. (Leuconostoc spp.), 슈도류코노스톡 spp. (Pseudoleuconostoc spp.), 페디오코커스 spp. (Pediococcus spp.), 브레비박테리움 spp. (Brevibacterium spp.), 엔테로코커스 spp. (Enterococcus spp.), 프로피오니박테리움 spp. (Propionibacterium spp,) 및 비피도박테리움 spp. (Bifidobacterium spp)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종들로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법의 한가지 흥미로운 구체예에서, 세균(모균주)은 밀크의 텍ㅅ처를 조절할 수 있는 능력, 엑소다당류 또는 캡슐 다당류와 같은 다당류의 생산능력, 밀크에서 배양시 점도를 발생시키는 능력, 및 밀크에서 배양시 전단응력을 증가시키는 능력으로 이루어진 특성 중에서 선택된 한가지 이상의 특성을 갖는 균주로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 유산균 또는 균주에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 양으로 세포를 접종하여 섭씨 37도에서 12시간 배양한 경우 발효유 중의 점도를 전단응력으로서 측정시 약 70 Pa(파스칼)을 초과 (예컨대 73 Pa 초과, 77 Pa 초과 또는 79 Pa 초과 또는 80 Pa 초과)하는 점도를 생성시키는, 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 세균 또는 균주와 같은 유산균 또는 균주에 관한 것이다. 발효유 중의 점도를 100 Pa까지, 120 Pa 까지, 150 Pa 까지, 심지어 200 Pa 까지 생성시킬 수 있는 균주를 수득하는 것이 가능한 것으로 믿어진다. 수득가능한 점도범위의 예는 다음과 같다: 70 내지 200 Pa, 75 내지 150 Pa, 78 내지 120 Pa, 79 내지 100 Pa, 및 80 내지 90 Pa. 특히, 본 발명은 발효유 중 79 내지 100 Pa의 점도를 생성시킬 수 있는 S.써모필러스 균주에 관한 것이다.
본 발명의 균주의 예로는 다음의 균주, 즉: CHCC11342 (DSM 22932), CHCC11977 (DSM22935), CHCC12339 (DSM24090), 및 CHCC13140 (DSM 24023), 및 이들의 돌연변이주(mutants) 및 변이체(variants)로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 것들을 들 수 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 언급된 신규한 모든 균주들 및 이들의 돌연변이주와 변이체를 모두 포괄한다. 특히, 본 발명은 균주 CHCC11977, 및 그의 돌연변이주에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명은 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 양으로 세포를 접종하여 섭씨 37도에서 12시간 배양하여 측정시, 약 60 Pa(파스칼)을 초과 (예컨대 65 Pa 초과, 69 Pa 초과 또는 72 Pa 초과)하는 전단응력을 발효유 중에 발생시키는 균주들이다. 특히 흥미로운 균주들은 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 양으로 세포를 접종하여 섭씨 37도에서 12시간 배양하여 측정시, 60 내지 100 Pa (예컨대 65 내지 90 Pa, 69 내지 85 Pa 또는 72 내지 80 Pa)의 전단응력을 발효유 중에 발생시키는 균주들이다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 양으로 세포를 접종하여 섭씨 37도에서 12시간 배양하여 측정시, 약 110 Pa를 초과(예컨대 115 Pa 초과, 120 Pa 초과, 또는 125 Pa 초과)하는 겔 강성을 발효유 중에 발생시키는, 본 발명의 유산균 또는 균주 또는 그의 돌연변이주 또는 변이체에 관한 것이다. 특히 겔 강성이 110 내지 200 Pa 범위에 드는 것이 바람직하고, 더욱 좋기로는 120 내지 190 Pa 또는 125 내지 180 Pa 범위인 것이 바람직하다. 세균 또는 균주는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus) 종에 속하는 것일 수 있다. 특히, 보 발명은 발효유 중에 125 내지 175 Pa의 겔 강성을 발생시킬 수 있는 S. 써모필러스 균주에 관한 것이다.
흥미로운 구체예에서, 본 발명은 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스에 속하는 유산균 또는 균주에 관한 것이다. 이 구체예의 흥미로운 예는 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 양으로 세포를 접종하여 섭씨 37도에서 12시간 배양하여 전단응력으로서 측정시, 발효유 중에 약 60 Pa를 초과(예컨대 65 Pa 초과, 69 Pa 초과 또는 72 Pa 초과)하는 점도를 발생시키는 세균 또는 균주, 및/또는, 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 양으로 세포를 접종하여 섭씨 37도에서 12시간 배양하여 전단응력으로서 측정시, 발효유 중에 60 내지 100 Pa 범위 (예컨대 65 내지 90 Pa, 69 내지 85 Pa 또는 72 내지 80 Pa)의 점도를 발생시키는 유산균 또는 균주에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 유산균이나 균주, 예컨대 균주 CHCC11977 또는 그의 돌연변이주에 속하는 세균을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 상기 세균을 적어도 10exp10 CFU (세포형성단위:cell forming units)의 양으로 함유하는 것이 바람직하다.
한가지 구체예에서, 조성물은:
- 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스(유의어: 락토바실러스 불가리쿠스), 락토바실러스 존스니이(L. johnsonii) 또는 락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum) 균주와 같은 락토바실러스 종에 속하는 균주; 및
- 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주와 같은 본 발명의 유산균 균주, 예컨대 CHCC11342 (DSM 22932), CHCC11977 (DSM22935), CHCC12339, and CHCC13140 (DSM 24023), 그의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 균주를
혼합물이나 키트-오브-파츠로서 함유할 수 있으며, 즉
조성물 중의 균주는 락토바실러스 종에 속하는 균주는 다당류 (예컨대 헤테로다당류, 호모다당류) 및/또는 프럭토실 트랜스페라제 효소를 생성하는 락토바실러스 종에 속하는 균주일 수 있다.
본 발명의 조성물은 락토바실러스종에 속하는 균주를 적어도 10exp10 CFU (세포형성단위) 및/또는 스트렙토코커스 써모필러스종에 속하는 균주를 적어도 10exp10 CFU 함유할 수 있다.
한가지 흥미로운 구체예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 10exp10 CFU (세포형성단위)의 다당류(예컨대 호모다당류) 및/또는 프럭토실 트랜스페라제 효소를 생성하는 락토바실러스 종에 속하는 균주; 및 적어도 10exp10 CFU의 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주를 포함한다.
이러한 조성물은 스타터 컬처(starter culture)로서 사용할 수 있으며, 냉동상태, 동결건조 상태 또는 액상 형태로 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 밀크 기질 (예컨대 우유)을 본 발명의 유산균, 본 발명의 균주 또는 본 발명의 조성물을 이용하여 발효시키는 것을 포함하여 이루어지는, 발효유 제품의 제조방법에 관한 것이다.
이 방법은 예컨대 CHCC10019, CHCC10935, 또는 CHCC3984, 및 그의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 락토바실러스 불가리쿠스 또는 락토바실러스 퍼멘툼 균주와 같은 락토바실러스 종에 속하는 균주를 이용하여 밀크 기질을 발효시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 밀크 기질을 락토바실러스 종에 속하는 균주로 발효시키기 전, 발효시키는 동안, 또는 발효시킨 후에, 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주와 같은 본 발명의 조성물, 균주 또는 세균으로 발효시키거나, 밀크 기질을 다당류를 생산하는 락토바실러스 종에 속하는 균주를 이용하여 발효시키는 동안 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 세균 또는 균주로 발효시킬 수 있다.
발효유 제품을 제조하기 위한 본 발명의 방법은 단백질을 가교할 수 있는 효소, 트랜스글루타미나제, 아스파르틱 프로테아제, 키모신 및 렌넷으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 발효 전, 발효 중 및/또는 발효 후에 밀크 기질에 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 방법에 의하여 수득가능한 유제품, 예컨대 발효유 제품(예컨대 요구르트 또는 버터밀크) 또는 치즈 (예컨대 프레쉬 치즈 또는 파스타 필라타)에 관한 것이다. 발효유 제품은 예컨대 스터드형(stirred-type) 제품, 드링크형 제품, 또는 세트형(set-type) 제품일 수 있다. 본 발명의 유제품은 과일 농축물, 시럽, 프로바이오틱 세균 컬처, 색소, 농후제, 풍미제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분들을 임의로 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명은 필요에 따라 과일 농축물, 시럽, 프로바이오틱 세균 컬처, 색소, 농후제, 풍미제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있고; 및/또는 임의로 스터드형 제품, 세트형 제품 또는 드링크형 제품의 형태일 수 있는, 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 발효유 제품에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 유산균(예컨대 DSM 22884와 같은 스트렙토코커스 써모필러스종에 속하는 균주) 및 락토바실러스 불가리쿠스 및 락토바실러스 퍼멘툼(예컨대 CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251) 및 CHCC2008 (DSM22584))로부터 선택되는 종의 유산균으로 밀크 기질을 발효시킴으로써 만들어지는 유제품에 관한 것이다.
한가지 흥미로운 구체예에서, 본 발명의 유제품은 예컨대, 밀크 중 섭씨 37도에서 12시간 배양시킨 후 전단응력으로서 측정시, 100 Pa를 초과 (예컨대 102 Pa 초고 또는 104 Pa 초과)하는 점도/텍스처를 갖는다. 특히 바람직한 구체예에서, 이러한 100 Pa를 초과하는 점도는 세균 세포를 단독으로 배양하여 얻어지지만, 전분, 젤라틴, 카라기난 등과 같은 화학물질을 첨가하면 더 높은 점도를 얻을 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 유제품은 전단응력으로서 측정시, 100 내지 200 Pa, 예컨대 100 내지 150 Pa, 또는 105 내지 125 Pa 범위의 점도/텍스처를 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 유제품은 예컨대 마시는 요구르트와 같은, 드링크형 제품이다.
본 발명은 또한 CHPC658　(DSM 23961), CHPC1057, CHPC1089　 및 CHPC1152 (DSM 23994), 및 이들의 돌연변이주 및 변이체, 예컨대 균주 CHCC6[008과 같이, 본 명세서에 언급된 균주들을 용균시킬 수 있는 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리오파지와 같은, 본 발명의 방법에서 이용할 수 있는 신규한 박테리오파지에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 CHCC11342 (DSM22932), CHCC10019 (DSM19252), CHCC11379 (DSM 22884), CHCC11976 (DSM 22934), 및 그의 돌연변이주로 이루어진 군으로부터 선택된 균주와 같은, 본 발명의 방법에서 모균주로서 이용가능한 신규한 세균 균주에 관한 것이다.
본 발명에서, "유산균(lactic acid bacterium)"이라 함은 당을 발효시켜 아세트산 및 프로피온산과 함께 주로 젖산을 생산하는, 그램-양성의 미호기성 또는 혐기성 세균을 가리킨다. 산업상 가장 유용한 유산균은 "락토바실랄레스 (Lactobacillales)" 목에서 발견되는 것들로서, 여기에는 락토코커스 spp. (Lactococcus spp.), 스트렙토코커스 spp. (Streptococcus spp.), 락토바실러스 spp. (Lactobacillus spp.), 류코노스톡 spp. (Leuconostoc spp.), 슈도류코노스톡 spp. (Pseudoleuconostoc spp.), 페디오코커스 spp. (Pediococcus spp.), 브레비박테리움 spp. (Brevibacterium spp.), 엔테로코커스 spp. (Enterococcus spp.) 및프로피오니박테리움 spp. (Propionibacterium spp.)가 속한다. 이에 더해서, 편성 혐기성 세균 그룹인 비피도박테리아에 속하는 젖산 생성균, 즉, 비피도박테리움 spp. (Bifidobacterium spp.) 역시도 일반적으로 유산균 그룹에 포함된다. 이들은 흔히 식품 컬처에 단독으로 사용되거나 또는 다른 유산균과 조합하여 사용된다. 락토바실러스 종 및 스트렙토코커스 써모필러스 종의 세균을 포함하는 유산균은 보통 유제품 산업에서 발효유 제품과 같은 유제품 생산을 위한 발효용기 또는 발효통(vat) 내로의 직접 접종을 위하여, 소위 소위 "Direct Vat Set (DVS)" 컬처로서 또는 벌크 스타터 번식을 위해 냉동된 컬처 또는 동결건조된 컬처로서 공급된다. 이러한 컬처는 일반적으로 "스타터 컬처(starter cultures)" 또는 "스타터"로서 칭해진다.
본 명세서에서 "밀크(milk)"라 함은 소, 양, 염소, 버팔로 또는 낙타와 같은 여하한 모든 포유동물을 착유하여 수득되는 젖의 분비로서 이해하여야 한다. 바람직한 구체예에서, 밀크는 우유이다. 밀크라는 용어는 또한 예컨대 두유와 같이, 식물성 물질로 만들어진 단백질/지방 용액도 포함한다.
"밀크 기질(milk substrate)"이라는 용어는 본 발명의 방법에 따라 발효될 수 있는 모든 원유 밀크 및/또는 가공된 밀크 물질일 수 있다. 따라서, 유용한 밀크 기질의 비제한적인 예로는 호울 밀크, 또는 저지방 밀크, 스킴 밀크, 버터밀크, 재조성된 분유, 농축유, 건조유, 유청, 퍼미에이트(permeate), 락토스, 락토스를 결정화시켜 얻은 모액, 유청단백질 농축물, 또는 크림을 포함한 모든 밀크 또는 밀크 유사 제품의 용액/현탁액을 들 수 있다. 밀크 기질은 예컨대 실질적으로 순수한 포유동물 밀크로부터 유래한 것일 수도 있고, 도는 재조성된 분유로부터 유래된 것일 수도 있다.
좋기로는, 밀크 기질 중 단백질의 적어도 일부는 카제인 또는 유청 단백질과 같이 밀크 중에서 자연발생하는 단백질인 것이 바람직하다. 그러나, 단백질 부분은 밀크에서 자연발생하지 않는 단백질일 수도 있다.
"밀크"라는 용어는 소, 양, 염소, 버팔로 또는 낙타와 같은 여하한 모든 포유동물을 착유하여 수득되는 젖의 분비로서 이해하여야 한다. 바람직한 구체예에서, 밀크는 우유이다.
발효에 앞서서, 본 발명이 속한 기술 분야에 알려진 방법에 따라 밀크 기질을 균질화시킨 다음 파스퇴르처리할 수 있다.
본 명세서에서 "균질화(homogenizing)"이라는 용어는 가용성 현탁액 또는 에멀젼을 얻기 위해 격렬히 혼합하는 것을 의미한다. 만일 발효에 앞서서 균질화를 수행할 경우, 이는 유지방을 보다 작은 크기로 분해하여 밀크로부터 더 이상 분리되지 않도록 하기 위하여 수행되는 것일 수 있다. 이것은 밀크를 작은 오리피스를 통해 고압으로 밀크에 힘을 가함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서 "파스퇴르 처리(Pasteurizing)"라 함은 미생물과 같은 살아있는 생명체의 존재를 감소시키거나 박멸하기 위한 밀크 기질의 처리를 의미한다. 좋기로는, 파스퇴르 처리는 특정 온도를 특정 기간 동안 유지함으로써 달성된다. 특정 온도는 일반적으로 가열에 의하여 달성한다. 온도 및 기간은 유해 세균과 같은 특정 세균을 사멸시키거나 불활성화시키도록 선택될 수 있다. 급속 냉각 단계가 이어질 수 있다.
본 발명의 방법에서 "발효"라 함은 미생물의 작용에 의하여 탄수화물이 알코올 또는 산으로 전환되는 것을 의미한다. 좋기로는, 본 발명의 방법에서 발효는 락토스를 젖산으로 변환시키는 것이다.
발효유 제품을 생산하는데 사용되는 발효법은 잘 알려져 있으며 당업자라면 적절한 작업 조건, 예컨대 온도, 산소, 미생물(들)의 양 및 특징, 및 가공 시간과 같은 적절한 공정 조건을 어떻게 선별해야할지 잘 알 것이다. 발효 조건은 본 발명을 달성하기 위하여, 즉, 유제품을 고체 또는 액체 형태(발효유 제품)로 수득할 수 있도록 선택된다.
"스터드형 제품(starried type product"라는 용어는 발효 후 기계적 처리를거쳐 발효 단계 하에서 형성된 응고물(coagulum)의 파괴(destructuration) 및 액화(liquefaction)가 일어난 발효유 제품을 가리킨다. 기계적 처리의 비제한적인 예로는 겔을 교반, 펌핑, 여과 또는 균질화시키거나 다른 성분과 혼합하는 것을 의미한다. 스터드형 제품은 일반적으로 무지고형분 함량(milk solid non-fat content)이 9 내지 15%이다.
"세트형 제품(set-type product)"이라는 용어는 예컨대 스타터 컬처 접종 후 포장 된 다음 포장 상태로 발효되는 밀크에 기초한 제품을 포함한다.
"드링크형 제품(drinkable product)"이라는 용어는 "마시는 요구르트(drinking yoghurt)" 및 이와 유사한 제품과 같은 음료를 포함한다. "마시는 요구르트에는 일반적으로 락토바시러스 종 및 스트렙토코커스 써모필러스의 조합에 의해 발효되어 생산된 유제품이 포함된다. 마시는 요구르트는 일반적으로 무지고형분 함량이 8% 이상이다. 또한, 마시는 요구르트의 라이브 컬처 카운트(live culture count)는 대체로 1 ml 당 적어도 10E6 세포형성단위 (CFU)이다.
본 발명에 따른 "드링크형 제품"은 산성화된 밀크 기질에 기초한 모든 드링크형 제품을 포괄하며, 따라서 발효유 드링크 및 액상 요구르트 드링크 제품도 여기에 포함된다. 본 발명의 방법에서, 산성화는 필요에 따라 산, 예컨대 유기산(예컨대 젖산, 락토바이온산 또는 GDL)을 첨가하면서 발효시킴으로써 수행된다.
본 발명에 따른 드링크형 제품은 이들이 액상이고 음료수로서 소비된다는 관점에서 마실 수 있는 제품이다. 즉, 이들은 숟가락으로 떠먹는 대신에 마시기에 적합한 제품이다. "액상 형태(In liquid form)"라는 용어는 제품이 제품이 유동성인 상태임으로 해서 금방이라도 흐를 수 있는 특징을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 액체의 형태는 예컨대 요구르트나 푸딩과 같이, 부드럽기는 하지만 자유유동형인 것은 아닌 겔형 제품과 반대로, 일반적으로 그 제품이 담기는 용기의 모양에 의하여 결정된다. 본 발명에 따른 드링크형 제품은 소비자가 원한다면 빨대를 이용하여 제품을 마실 수 있을 정도의 점도를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 드링크형 제품은 pH가 4.6 미만, 좋기로는 4.4 미만, 더욱 좋기로는 4.2 미만, 더더욱 좋기로는 pH가 약 4 미만이다. 한가지 측면에서, 드링크형 제품의 pH는 3.8 미만, 예컨대 3.6 미만이다.
본 발명에 따른 드링크형 제품은 지방 함량이 0 내지 2%, 좋기로는 1.5% 미만, 1% 미만 또는 0.5% 미만, 더욱 좋기로는 약 0.1% 이하이다. 드링크형 제품은 무지고형분 함량이 20% 미만, 좋기로는 8.5% 미만, 8% 미만, 7.5% 미만, 7% 미만, 6.5% 미만 또는 6% 미만, 더욱 좋기로는 약 5% 미만인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 드링크형 제품은 단백질 함량이 0.5% 내지 4%일 수 있다. 한가지 바람직한 측면에서, 드링크형 제품은 단백질 함량이 1% 미만이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 드링크형 제품은 단백질 함량이 2% 내지 3%이다.
본 발명에 따른 드링크형 제품은 저장기간이 7일 이상, 좋기로는 14일 이상, 더욱 좋기로는 28일 이상, 예컨대 3개월을 상회한다.
본 발명의 드링크형 제품은 개선된 침강 안정성(sedimentation stability)를 가질 수 있다. 안정성은 드링크형 제품을 적절한 일수 동안 저장한 다음 시너레시스(syneresis)로 인하여 표면 상에 모인 유청의 높이를 측정함으로써 산정할 수 있다. 이것은 또한 원심분리와 같은 가속화된 시너레시스 후에 측정될 수도 있다.
드링크형 제품, 예컨대 마시는 요구르트의 경우에는, 부드럽고, 균질하며 마실수 있는 제품을 얻기 위해서는, 단백질 네트워크를 파괴시키기 위하여, 발효 후 고전단 처리 (에컨대, 균질화)가 일반적으로 요구된다. 이러한 네트워크의 파괴는 마시는 요구르트가 감소된 침강 안정성을 갖는다는 것을 암시하며, 이로 인해 저장기간 동안 단백질이 바닥에 침강된다. 높은 지방 수준과 높은 단백질 함량은 침강 안정성을 증가시키는 반면, 낮은 단백질 함량 (1-2.5%)와 함께 지방 함량이 낮은(0-0.5% 지방) 생성물은 이러한 단백질 침강을 회피하기 위하여 일반적으로 안정화제를 필요로 한다.
본 발명에서, "박테리오파지(bacteriophage)"라는 용어는 이 분야에서 널리 이해되는 통상적인 의미, 즉, 1종 이상의 세균을 선택적으로 감염시키는 바이러스의 의미로 사용된다. 많은 박테리오파지들은 특정 속의 박테리아 또는 특정 종의 박테리아 또는 특정 박테리아 균주에 대해 특이적이다. "박테리오파지"라는 용어는 "파지"라는 용어와 동의어이다. 박테리오파지의 비제한적인 예로는 다음의 바이러스 패밀리에 속하는 것들을 들 수 있다: 코르티코비리데, 시스토비리데, 이노비리데, 리베비리데, 마이크로비리데, 미오비리데, 포도비리데, 시포비리데 또는 텍티비리데. 박테리오파지는 용균성(lytic) 박테리오파지이거나 또는 용원성(lysogenic) 박테리오파지일 수 있다. 용균성 박테리오파지는 용균 사이클이 완결된 후, 용원성 경로에 들어가지 않고, 용균 경로를 따르는 박테리오파지이다. 용균성 박테리오파지는 바이러스를 복제하여 세포막의 용해를 일으켜 세포를 파괴하고, 자손 박테리오파지 입자들이 방출되어 이들이 다른 세포들을 감염시킬 수 있게 된다. 용원성 박테리오파지는 용원성 경로에 들어가서, 박테리오파지가 휴지기에 접어들어, 그의 용균 사이클이 종료되기 전에 세포의 게놈의 수동적인 일부가 된다.
한가지 구체예에서, 본 발명에 따른 유산균은 1종 이상의 박테리오파지 또는 1종 이상의 박테리오파지 세트에 내성이며, 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 유산균은 본 발명에 따라 기탁된 균주가 내성을 나타내는 동일한 박테리오파지에 대해 내성을 나타낸다. 본 명세서에서, "파지 로버스트(phage robust)"라는 용어는 "파지에 내성인(phage resistant)"라는 용어와 호환된다.
본 명세서에서, "돌연변이주(mutant)"라는 용어는 예컨대 유전자 조작, 방사능 및/또는 화학물질 처리 수단에 의하여 본 발명의 균주(또는 모균주)로부터 유도된 균주 또는 유도될 수 있는 균주인 것으로 이해되어야 한다. 이러한 돌연변이주는 기능적으로 동등한 돌연변이주, 예컨대, 모균주와 동등하거나 개선된 특성 (예컨대, 텍스처, 전단응력, 점도, 겔 강성, 마우쓰 코팅, 풍미, 포스트 산성화, 산성화 속도 및/또는 파지 로버스트성)을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 돌연변이주 역시 본 발명의 일부이다. 특히, "돌연변이주"라는 용어는 본 발명의 균주를 에탄 메탄 설포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)와 같은 화학적 돌연변이원, UV 광선을 이용한 처리와 같은 돌연변이 처리하여 얻어진 균주 또는 자연발생적인 돌연변이주를 가리킨다. 돌연변이주는 수회에 걸쳐 돌연변이 처리될 수 있으나 (일회 처리는 스크리닝/선별 단계를 수반하는 한번의 돌연변이 단계이다), 좋기로는 이러한 처리(또는 스크리닝/선별 단계)를 20회 이하, 또는 10회 이하, 또는 5회 이하로 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 바람직한 돌연변이주에서는 모균주에 비하여 세균 게놈 중의 뉴클레오타이드의 5% 미만 또는 1% 미만 또는 심지어 0.1% 미만이 다른 뉴클레오타이드로 치환되거나, 결실된다. 본 명세서에서, "변이체(variant)"라는 용어는 본 발명의 균주와 기능적으로 동등한 균주인 것으로서, 예컨대, 텍스처, 전단응력, 점도, 겔 강성, 마우스 코팅, 풍미, 포스트 산성화, 산성화 속도, 및/또는 파지 로버스트성의 측면에서 본 발명의 균주와 실질적으로 동등하거나 더욱 개선된 특성을 갖는 균주인 것으로 이해되어야 한다. 적절한 스크리닝 기술을 이용하여 동정될 수 있는 이러한 변이체는 본 발명의 일부이다.
본 명세서에서 "텍스처/조직감 (texture)"는 섭씨 37도에서 12시간 배양 후 전단응력으로서 측정된다. 전단응력과 겔 강성의 SI 단위는 파스칼(Pa)이다.
텍스처 분석에 이용되는 분석법:
배양 다음 날, 발효된 밀크를 13℃의 온도로 조정하고, 샘플이 균질해질 때까지 천공된 디스크(bored disc)에 끼워진 스틱을 이용하여 가볍게 교반하였다. 샘플의 레올로지 특성을 C25 동축 측정시스템이 구비된 레오미터(StressTech, Reologica Instruments, Sweden)을 이용하여 평가하였다. 21 단계로 0.27 내지 300 l/s 사이에서 가변하는 전단속도를 이용하여 점도를 테스트하였다. 전단속도가 증가한 다음 감소하였으며 이러한 전단응력과 겉보기 점도의 증감을 기록하여다. 지연시간 및 인테그레이션 시간은 각각 5초 및 10초였다.
본 발명의 문맥상 (특히 첨부된 특허청구범위에서) "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 용어는 달리 언급되거나, 문맥상 명백히 반대의 뜻을 가리키는 것이 아닌 한 단수와 복수를 모두 포괄하는 것이다. "포함하는", "갖는", "비롯하여", 및 "함유하는" 등의 용어는 달리 언급하지 않는 한 확장가능한(open-ended) 용어로서 이해되어야 한다 (즉, "...을 포함하나 이에 한정되지 않는"의 의미). 본 발명에서 어떤 값을 범위로 나타낼 경우, 달리 언급하지 않는 한 그 범위 내에 속하는 각각의 개별적인 값들도 모두 칭하여 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 이러한 각각의 분리된 개별적인 값들은 명세서에서 개별적으로 명시된 것처럼 이해되어야 한다. 본 발명에 설명된 모든 방법은 달리 언급하거나, 명백히 반대되는 문맥으로 이해되지 않는 한 여하한 적절한 순서로 수행되어도 무방하다. 모든 예시, 예시적인 언어 (예컨대 "..와 같은") 등의 용오는 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위하여 사용된 용어일 뿐, 달리 주장되지 않는 한, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 어떠한 표현도 필수구성이 아닌 구성요소를 본 발명에 있어서 필수적인 것으로 이해되도록 해석되어서는 아니된다.
도 1은 StressTech 레오미터를 이용하여 측정된 갈락토스 양성 균주 CHCC11342 및 갈락토스 양성 파지 내성 돌연변이주 CHCC11977의 전단응력을 나타낸 도면이다. 전단응력은 37℃에서 밀크를 하룻밤 배양한 후 응고된 밀크에서 측정하였다.
도 2는 StressTech 레오미터를 이용하여 측정된 CHCC10019의 파지 내성 돌연변이주의 전단응력을 나타낸 도면이다. 이 전단응력은 37℃에서 밀크를 하룻밤 배양한 후 응고된 밀크에서 측정하였다.
도 3은 StressTech 레오미터를 이용하여 측정된, CHCC5086의 파지 내성 돌연변이주인 CHCC13140의 전단응력을 나타낸 도면이다. 전단응력은 37℃에서 밀크를 하룻밤 배양한 후 응고된 밀크에서 측정하였다.
도 4는 StressTech 레오미터를 이용하여 측정된, CHCC5086의 파지 내성 돌연변이주인 CHCC13140의 전단응력을 나타낸 도면이다. 전단응력은 37℃에서 밀크를 하룻밤 배양한 후 응고된 밀크에서 측정하였다.
실험
실시예 1: 텍스처 특성이 개선된 파지 내성 스트렙토코커스 써모필러스
균주의 개발
CHCC11977 의 개발
실시예 5에 설명된 바와 같이 모균주 CHCC11342를 수득하였다. 이 균주는 CHCC6008의 돌연변이주로서 갈락토스를 발효시키는 스트렙토코커스 써모필러스 균주인 것으로 여겨진다.
1 ml 당 10E09 (10exp9)개의 파지 입자를 함유하는 파지 CHPC1152 0.1 ml와 함께, CHCC11342의 M17 오버나잇 컬처 0.1 ml를 플레이팅한 후 M17 한천 플레이트 상에서 균주 CHCC11977를 분리하고 37℃에서 2일간 배양하였다. CHCC11977이라 칭해지는 하나의 돌연변이주를 3회 콜로니 정제하고 파지 내성이 확인된 (단 하나의 플라크도 관찰되지 않음) 파지 CHPC1152를 이용하여 37℃에서 M17 한천 플레이트상에서 플라크 테스트를 이용하여 재검사하였다.
이어서 이 돌연변이 균주를 파지 CHPC1152의 존재 하에 37℃에서 M17 브로쓰를 이용하여서도 검사하였다. CHCC11977은 액상 멀처에서도 그의 파지 내성을 유지한 반면, CHCC11342는 예상된 바와 같이 CHPC1152의 공격을 받았다.
CHCC11977을 다른 온도의 밀크에서도 검사하자 (감염 파지는 첨가하지 않음) 모균주인 CHCC11342에 필적할만한 산성화 활성(acidification activity)을 나타내었다.
발효유 중 CHCC11342 의 텍스처 분석
배양 다음날, 발효유를 13℃의 온도로 조정하고 샘플이 균질해질 때까지 천공된 디스크(bored disc)에 끼워진 스틱을 이용하여 가볍게 교반하였다. 샘플의 레올로지 특성을 C25 동축 측정시스템이 구비된 레오미터(StressTech, Reologica Instruments, Sweden)을 이용하여 평가하였다.
21 단계로 0.27 내지 300 l/s 사이에서 가변하는 전단속도를 이용하여 점도를 테스트하였다. 전단속도가 증가한 다음 감소하였으며 이러한 전단응력과 겉보기 점도의 증감을 기록하였다.
지연시간 및 인테그레이션 시간은 각각 5초 및 10초였다. 추가 분석을 위하여, 300 s-1에서의 전단응력을 선택하였다.
레오미터 측정 결과 CHCC11342는 73.0 Pa의 전단응력값을 나타내었으며, 이는 CHCC6008의 전단응력값 68.0 Pa에 필적하는 것이었다. 도 1 참조.
발효유 중 CHCC11977 의 텍스처 분석
발효유를 수득하고, 텍스처와 관련된 특성들을 gal-양성 파지 내성 돌연변이주에 대하여 전술한 바와 같이 분석하였다.
레오미터 측정 결과 CHCC11977은 CHCC11342에 비해 전단응력 값이 10% 더 개선된 것으로 나타났다 (CHCC11977의 전단응력 값은 80.0 Pa이고,모균주인 CHCC11342의 전단응력 값은 73.0 Pa임, 도 1 참조).
뿐만 아니라, 겔 강성(G*) 역시 파지 내성 돌연변이주 CHCC11977의 경우 126.0 Pa를 나타내었는데 이는 CHCC11342 (겔 강성 104.0 Pa)의 경우에 비해 20% 증가된 것이다. 이와 같이, 갈락토스 양성 모균주로부터 파지 내성 돌연변이주를 분리함으로써, 중요한 변수인 전단응력과 겔 강성을 유의적으로 개선시키는 것이 가능하였다.
CHCC11342 로부터 galK 프로모터 대역의 서열결정
갈락토스 양성 돌연변이주 CHCC11342의 돌연변이주 유형을 밝히기 위하여, galK 유전자 (S. 써모필러스로부터 갈락토키나제를 코딩함)의 서열을 분석하였다. CHCC11342의 경우 galK 프로모터 대역의 돌연변이가 동정되었다 (하기 서열 참조). 돌연변이는 galK 유전자의 -10-프로모터 박스 하류의 3개의 뉴클레오타이드에서 일어났으며 이에 의하여 C에서 A로의 뉴클레오타이드 쉬프트가 일어났다.
Figure pct00001
CHCC11342로부터 galK 유전자의 프로모터 대역. CHCC11342 galk 프로모터 대역 내의 점 돌연변이 부분을 회색 코드로 표시하였다. 비교를 위하여 S. 써모필러스 ST111 (Genbank 수탁번호 AY704368)의 간행된 galK 서열을 나타내었다. -35: -35-프로모터 박스; -10: -10-프로모터 박스; RBS: 리보좀 결합 부위.
추가의 파지 내성 돌연변이주들
파지 내성과 갈락토스 양성 표현형 간의 가능한 관계를 규명하기 위하여, CHCC11342 (gal+)의 모균주인 균주 CHCC6008 (gal-)로부터 M17 갈락토스 한천 플레이트 상에 5개의 추가적인 파지 내성 돌연변이주들을 분리하였다. 이들 5개의 파지 내성 돌연변이주 CHCC11396, CHCC11397, CHCC11398, CHCC11399, 및 CHCC11340 (파지 CHPC1152에 대하여 내성임)는 모두 갈락토스를 발효시키지 못하였으며, 이는 gal+ 표현형이 파지 내성과 직접적으로 연관되어 있지 않음을 의미하는 것이다. 이와 반대로 플라크 분석 결과 CHCC11342 (gal+)는 파지 CHPC1152에 대하여 여전히 민감하였다..
실시예 2: 개선된 텍스처 특성을 갖는 파지 내성 락토바실러스 델브루에키
아종 불가리쿠스의 개발.
모균주 CHCC10019 (DSM19252)로부터, 파지 내성 돌연변이주들을 다음과 같이 분리하였다:
1 ml 당 10E06개의 파지 입자를 함유하는 CHPC658 파지 용균물 0.1 ml와 함께 CHCC10019의 MRS 오버나잇 컬처 0.1 ml를 플레이팅한 후 10 mM CaCl2/10 mM MgCl2를 함유하는 MRS 한천 플레이트로부터 돌연변이주들을 선별하여 37℃에서 2일간 혐기 배양하였다. 30개의 돌연변이주들을 분리하고 이들을 파지 CHPC658에 대해 크로스-스트리킹하여 검사하였다. 29개의 돌연변이주들은 크로스-스트리킹 검사에 내성을 나타내었으며 이어서 37℃ MRS 한천 플레이트 상에서 3회 콜로니-정제하였다.
이들 29개의 돌연변이주들을 산성화 프로파일 및 파지 내성에 대해 마이크로타이터 플레이트로 검사하였다. 2개의 마이크로타이터 플레이트를 밀크와 함께 준비하고 각각의 플레이트에 각 돌연변이주 2%를 접종하였다. 하나의 플레이트에 대하여는, 2% 펩톤-염 희석물(대조군)을 각각의 웰에 첨가하고, 다른 마이크로플레이트에는 1 ml 당 10E06개의 파지 입자를 함유하는 2% CHPC658을 첨가하였다. 2개의 플레이트를 37℃에서 2일간 배양하고, 각 웰의 pH를 12분마다 측정하였다. 모든 돌연변이주들은 파지 CHPC658에 의해 공격을 당한 모균주인 CHCC10019에 비하여 파지 내성을 나타내었다.
12개의 돌연변이주들을 MRS 및 밀크 중에서의 산성화 프로파일 및 균주의 ㅈ저점도에 근거해서 선별하였다.
발효유 중 텍스처 특성에 대한 CHCC10019 파지 내성 돌연변이주의 분석
상기 12개의 돌연변이주와 모균주 CHCC10019를 37℃에 밀크에서 밤새 배양한 후, 발효유의 온도를 13℃로 조정하고 각 샘플이 균질해질 때까지 구멍이 난 디스크에 끼워진 스틱을 이용하여 가볍게 교반하였다. 각 샘플의 레올로지 특성을 C25 동축 측정 시스템이 구비된 레오미터 (StressTech, Reologica Instruments, Sweden) 상에서 평가하였다.
21 단계로 0.27 내지 300 l/s 사이에서 가변하는 전단속도를 이용하여 점도를 테스트하였다. 전단속도는 증가한 다음 감소하였으며 이러한 전단응력과 겉보기 점도의 증감을 기록하였다. 지연시간 및 인테그레이션 시간은 각각 5초 및 10초였다. 추가 분석을 위하여, 300 s-1에서의 전단응력을 선택하였다.
레오미터 측정 결과 12개의 돌연변이주(예컨대 CHCC12813 및 CHCC12841) 모두 전단응력으로서 측정시, CHCC10019에 비해 개선된 점도를 나타내었다. 최고 전단응력 값은 CHCC12841 (74.0 Pa)에서 얻어진 반면 CHCC10019는 전단응력 값이 58.0 Pa였다. 도 2 참조. 도면에, 12개의 파지 내성 돌연변이주에 대한 레올로지 데이터가 나타나있다. 모든 돌연변이주들은 CHCC10019에 비하여 10% 내지 28% 범위의 전단응력 증가를 나타내었다.
돌연변이주들이 다른 균주 CHCC12813과 공배양될 때의 산성화 활성 및 레올로지 데이터에 기초해서, 분리된 돌연변이주들 중 추가 응용검사에 가장 유망한 후보를 선별하였다.
이 실험 결과 세균 균주의 중요한 레올로지 변수인 전단응력은 그 균주의 파지 내성 돌연변이주를 분리함으로써 현저히 개선됨이 입증되었다.
실시예 3: 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC9204 의 파지 내성
돌연변이주의 분리
Chr. Hansen 컬처 컬렉션에 등록된 모균주 CHCC9204로부터, 파지 내성 돌연변이주를 분리하였다. 1 ml 당 1x10exp09개의 파지 입자를 함유하는 파지 CHPC1057 0.1 ml와 함께 CHCC9204의 M17 락토스 오버나잇 컬처 0.1 ml를 플레이팅한 후, 10 mM MgCl2/CaCl2를 이용하여 M17-2% 락토스 한천 플레이트 상에서 돌연변이주를 분리하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
몇개의 돌연변이주들 중 CHCC12339라 칭해지는 하나의 균주를 3회 콜로니 정제하고 파지 챌린지를 위해 파지 CHPC1057을 이용하여 37℃에서 M17 락토스 한천 플레이트 상에서 플라크 검사하여 파지 내성을 확인하였다 (플라크 테스트에서 단 하나의 플라크도 관찰되지 않음). CHCC12339를 밀크에서도 검사하자 모균주에 필적할만한 산성화 활성을 나타내었다.
발효유 중 파지 내성 돌연변이주 CHCC12339 의 텍스처 특성 분석
돌연변이주 CHCC12339 및 모균주 CHCC9204를 37℃에서 밀크에서 배양한 후 발효유 온도를 13℃로 조정하고, 각 샘플이 균질해질 때까지 구멍이 난 디스크에 끼워진 스틱을 이용하여 가볍게 교반하였다. 각 샘플의 레올로지 특성을 C25 동축 측정 시스템이 구비된 레오미터 (StressTech, Reologica Instruments, Sweden) 상에서 평가하였다.
21 단계로 0.27 내지 300 l/s 사이에서 가변하는 전단속도를 이용하여 점도를 테스트하였다. 전단속도는 증가한 다음 감소하였으며 이러한 전단응력과 겉보기 점도의 증감을 기록하였다. 지연시간 및 인테그레이션 시간은 각각 5초 및 10초였다. 추가 분석을 위하여, 300 s-1에서의 전단응력을 선택하였다.
레오미터 측정 결과 CHCC12339는 CHCC9204에 비해 겔 강성 (G*)이 22% 증가된 것으로 나타났다. 도 3 참조. 이 도면에는, 파지 내성 돌연변이주 CHCC12339의 겔 강성 (G*) (78.0 Pa) 및 모균주 CHCC9204의 겔 강성 (64.0 Pa)이 비교 도시되어 있다.
실시예 4: 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC5086 의 파지 내성 돌연변이주의 분리
Chr. Hansen 컬처 컬렉션에 등록된 모균주 CHCC5086으로부터 파지 내성 돌연변이주를 분리하였다.
1 ml 당 1x10exp08개의 파지 입자를 함유하는 파지 CHPC1089 0.1 ml와 함께 CHCC5086의 M17-2% 락토스 오버나잇 컬처 0.1 ml를 플레이팅한 후, 10 mM MgCl2/CaCl2를 이용하여 M17-2% 락토스 한천 플레이트 상에서 돌연변이주를 분리하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
몇개의 돌연변이주들 중 CHCC13140이라 칭해지는 하나의 균주를 3회 콜로니 정제하고 파지 챌린지를 위해 파지 CHPC1089를 이용하여 37℃에서 M17 락토스 한천 플레이트 상에서 플라크 검사하자 파지 내성이 확인되었다 (플라크 테스트에서 단 하나의 플라크도 관찰되지 않음).
CHCC13140을 밀크에서도 검사하자 모균주에 필적할만한 산성화 활성을 나타내었다.
발효유 중 파지 내성 돌연변이주 CHCC12339 의 텍스처 특성 분석
돌연변이주 CHCC13140 및 모균주 CHCC5086을 37℃에서 밀크에서 배양한 후 발효유 온도를 13℃로 조정하고, 각 샘플이 균질해질 때까지 구멍이 난 디스크에 끼워진 스틱을 이용하여 가볍게 교반하였다. 각 샘플의 레올로지 특성을 C25 동축 측정 시스템이 구비된 레오미터 (StressTech, Reologica Instruments, Sweden) 상에서 평가하였다.
21 단계로 0.27 내지 300 l/s 사이에서 가변하는 전단속도를 이용하여 점도를 테스트하였다. 전단속도는 증가한 다음 감소하였으며 이러한 전단응력과 겉보기 점도의 증감을 기록하였다. 지연시간 및 인테그레이션 시간은 각각 5초 및 10초였다. 추가 분석을 위하여, 300 s-1에서의 전단응력을 선택하였다.
레오미터 측정 결과 CHCC13140은 CHCC5086에 비해 전단응력이 14% 증가한 것으로 나타났다. 도 4 참조. 이 도면에는, 파지 내성 돌연변이주 CHCC13140의 전단응력 데이터 (전단응력 33.0 Pa) 및 모균주 CHCC5086의 전단응력 (28.0 Pa)이 비교 도시되어 있다.
실시예 5: 스트렙토코커스 균주의 갈락토스 양성 돌연변이주의 제조
gal + 균주를 얻기 위한 일반적인 방법
돌연변이주를 분리하기에 앞서서 모균주 (예컨대 CHCC6008)를 2% 갈락토스가 보강된 M17 한천 플레이트 (M17-gal 플레이트) 상에 스트리킹하였다. CHCC6008은 갈락토스가 유일한 탄수화물 공급원인 경우 생육하지 않기 때문에 모균주는 gal-인 것으로 여겨진다.
모균주의 오버나잇 컬처를 M17-gal 플레이트에 도말하고, 37℃에서 2일간 배양시킨 후 몇몇 콜로니들을 분리할 수 있었다.
몇개의 돌연변이주를 M17-gal 플레이트 상에서 정제하고 유일한 탄수화물로서 2% 갈락토스를 함유하는 M17 브로쓰에서 재검사하였다.
돌연변이주는 예컨대 유전자 조작, 방사능 및/또는 화학물질 처리에 의해 얻어질 수 있으며 또는 돌연변이주는 자연발생적인 돌연변이주일 수도 있다.
배지 1 ml 당 적어도 10E4개의 세포의 양으로 접종하여 섭씨 37도에서 2% 갈락토스가 보강된 M17 (갈락토스가 유일한 탄수화물로서 첨가됨) 중에서 16시간 동안 인큐베이션한 후 pH가 적어도 1.0만큼 감소되면 그 돌연변이주는 갈락토스 양성인 것으로 간주하였다.
CHCC6008은 M17-gal 브로에서 pH를 유의적으로 저하시키지 않은 반면, 정제된 돌연변이주들 중 하나인 CHCC11342의 경우 37℃에서 16 시간 배양 후 pH가 5.4로 되었으므로, 이는 CHCC6008의 갈락토스-발효 (gal+) 돌연변이주인 것으로 여겨졌다.
갈락토스 발효 균주의 분리
스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC6008 (=ST6008, DSM18111)의 갈락토스 발효 돌연변이주로서 돌연변이주를 분리하였다. CHCC6008 세포는 돌연변이주 분리 단계에 앞서서 어떠한 돌연변이 유발 화합물이나 UV 광선에 의해서도 돌연변이 처리 되지않았다. 분리된 균주들은 따라서 CHCC6008의 자연발생적인 갈락토스 양성 돌연변이주와 유사하였다.
돌연변이주 분리에 앞서서, CHCC6008을 2% 갈락토스 (M17-gal 플레이트)가 보강된 M17 한천 플레이트 상에 스트리킹하였다. CHCC6008은 갈락토스가 유일한 탄수화물 공급원이면 생장하지 않았다.
이어서 CHCC6008의 오버나잇 컬처를 M17-gal 플레이트상에 도말하고 37℃에서 2일간 배양한 후 몇개의 콜로니들을 분리할 수 있었다. 몇몇 돌연변이주들을 M17-gal 플레이트 상에서 정제하고 2% 갈락토스를 유일한 탄수화물 공급원으로서 함유하는 M17 브로쓰에서 재검사하였다.
CHCC6008은 M17-gal 브로쓰의 pH를 유의적으로 저하시키지 않은 반면, 정제된 돌연변이주들 중 하나인 CHCC11379의 경우 37℃에서 10시간 후 pH가 5.3이 되었으므로, CHCC6008로부터 유래된 갈락토스-발효 돌연변이주인 것으로 간주되었다.
균주 CHCC11342와 CHCC11976은 동일한 방식으로 분리되었다.
유전자 조작에 의한 돌연변이주의 분리
갈락토스 양성 돌연변이주는 위치 지향된 돌연변이주에 의해 발생시킬 수도 있다. galK -10 프로모터 박스 내에 돌연변이된 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 PCR에 의하여 특이적인 DNA 단편을 증폭시켰다. 원하는 ㄷ돌연변이를 지니는 PCR 단편을 벡터 플라스미드 내로 클로닝시켜 스트렙토코커스 써모필러스 표적 균주 내로 형질전환시켜 상기 돌연변이를 염색체 내로 통합시켜 야생형 galK 프로모터 대역을 재조합에 의해 교환시켰다. 균주 분리는 전술한 바와 같이 실시하였다.
발효유 중의 텍스처 분석
배양 다음 날, 발효유의 온도를 13℃로 조정하고 샘플이 균질해질 때까지 구멍난 디스크에 끼워진 스틱을 이용하여 가볍게 교반하였다. 샘플의 레올로지 특성을 C25 동축 측정 시스템이 구비된 레오미터 (StressTech, Reologica Instruments, Sweden) 상에서 평가하였다. 21 단계로 0.27 내지 300 l/s 사이에서 가변하는 전단속도를 이용하여 점도를 테스트하였다. 전단속도는 증가한 다음 감소하였으며 이러한 전단응력과 겉보기 점도의 증감을 기록하였다. 지연시간 및 인테그레이션 시간은 각각 5초 및 10초였다. 추가 분석을 위하여, 300 s-1에서의 전단응력을 선택하였다. 레오미터 측정 결과 CHCC11379는 CHCC6008에 비해 전단응력이 10% 증가한 것으로 나타났다 (CHCC11379의 경우 전단응력 값은 74.0 Pa (파스칼)이고 모균주인 CHCC6008의 전단응력은 67.5 Pa임).
밀크 중의 텍스처 분석
또 다른 실험에서 CHCC11379를 요구르트 컬처의 일부로서 사용하였는데 여기서는 43℃에서 탈지유에서 S. 써모필러스로부터의 균주를 락토바실러스 델브루에키 ssp. 불가리쿠스와 함께 공배양시켰다. 요구르트 생산에 있어서 유일한 차이점이 야생형 CHCC6008 대신 CHCC11379를 사용한 것일 때의 전단응력 역시 10% 증가하였다 (CHCC11379를 함유하는 요구르트 컬처의 경우 105.0 Pa인데 비하여 CHCC6008를 함유하는 요구르트 컬처의 경우에는 94.7 Pa 였음).
CHCC11379 로부터의 galK 프로모터 대역의 서열결정
gal 양성 돌연변이주 CHCC11379의 돌연변이 유형을 밝히기 위하여 galK 유전자 (S. 써모필러스로부터의 갈락토키나제를 코딩하는 유전자)의 서두 부분을 서열분석하였다.
CHCC11379에 있어서의 galK 프로모터 대역의 돌연변이를 동정하였다 (하기 참조). 각각의 돌연변이는 모균주 6008에 비해 더욱 강력한 프로모터 활성을 가질 것인데, 이는 관찰된 gal-양성 표현형을 설명해준다. 이것은 -10-프로모터 박스의 컨센서스 서열이 "TATAAT"이고, CHCC6008의 경우 -10 박스 (대역)의 뉴클레오타이드 3에서의 돌연변이 ("TACGAT")로 인하여 CHCC11379에서의 컨센서스 서열과 더 많이 유사한 -10 박스("TATGAT)를 결과시킨다는 사실에 기인한 것이다.
Figure pct00002

CHCC11379로부터의 galK 유전자의 프로모터 대역. CHCC11379 galk 프로모터 내의 점 돌연변이를 회색 코드로 나타내었다. S. 써모필러스 ST111로부터의 간행된 galK 서열 (Genbank 수탁번호 AY704368)을 대조를 위해 함께 나타내었다. -35: -35-프로모터 대역; -10: -10-프로모터 대역; RBS: 리보좀 결합 부위.
본 발명자들이 아는 한 본 발명의 최적 실시 모드를 포함하여 본 발명의 바람직한 구체예들을 설명하였다. 당업자들은 전술한 상세한 설명을 참고하면 상기 바람직한 구체예들의 변형예들을 쉽게 추정할 수 있을 것이다. 본 발명자들은 당업자들이 이러한 변형예들을 적절히 차용할 수 있을 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 특히 설명된 형태가 아닌 다른 형태로 실시될 경우도 상정한다. 따라서, 본 발명은 관련법이 허용하는 한도 내에서 첨부된 특허청구범위에 명시된 본 발명의 모든 변형예 및 동등예를 모두 포괄한다. 뿐만 아니라, 전술한 구성들의 가능한 모든 변형의 조합 역시도 달리 언급하거나, 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명의 범위에 포괄된다.
기탁 및 전문가 진술 ( DEPOSITS AND EXPERT SOLUTION )
균주 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CHCC11977 및 CHCC11342를 2009년 9월 8일자로 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)에 각각 수탁번호 DSM22935 및 DSM22932로 기탁하였다. CHCC6008은 2006년 3월 29일에 DSMZ에 수탁번호 DSM 18111로 기탁된 바 있다.
박테리오파지 CHPC658, CHPC1057 및 CHPC1152는 2010년 8월 27일자로 DSMZ에 각각 수탁번호 DSM23961, DSM23962, 및 DSM23994로 기탁하였다.
DSMZ에 수탁된 추가 기탁:
CHCC10019 (DSM19252) 및 CHCC3984 (DSM19251): 기탁일 2007년 4월 3일,
CHCC2008 (DSM22584) 및 CHCC5086 (DSM22587): 기탁일 2009년 5월 19일,
CHCC11379 (DSM22884): 기탁일 2009년 8월 26일,
CHCC11976 (DSM22934): 기탁일 2009년 9월 8일;
CHCC13140 (DSM 24023), CHCC12813 (DSM24074), 및 CHPC1089 (DSM 24022): 기탁일 2010년 9월 29일;
CHCC12339 (DSM24090): 기탁일 2010년 10월 14일.
스트렙토코커스 써모필러스 CHCC5086 (DSM22587): 기탁일: 2009년 5월 19일.
CHCC9204 (DSM19243): 기탁일 2007년 3월 27일.
상기 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 협약의 규정 하에 이루어졌다.
본 출원인은 기탁된 미생물들의 시료가 본 출원인에 의하여 승인된 전문가에게만 분양될 것을 요구하는 바이다.
참고문헌
Appl. Environ. Microbiol. 71, 7, p. 3659-67 (2005);
International Journal of Food Microbiology 113 (2007) 195-200;
Applied And Environmental Microbiology, Feb. 2002, p. 784-790;
J Dairy Sci 92: 477-482 (2009)
WO2008/040734A1, WO2007/025097A2, US7241610B2, WO2007/144770A2, WO2004/085607A, WO2008/148561A, WO11000879A, WO11000883A, WO10023178A
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그 내용 전체가 본 발명에 참조되었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22884 20090826 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24022 20100929 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24023 20100929 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24074 20100929 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24090 20101014 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22584 20090519 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM19251 20070403 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22587 20090519 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM18111 20060323 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM19243 20070329 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM19252 20070403 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22932 20090908 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22934 20090908 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22935 20090908 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM23961 20100827 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM23962 20100827 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM23994 20100827
SEQUENCE LISTING <110> Chr. Hansen A/S <120> Bacterium <130> P3968PC00 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 1 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttaag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 2 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 3 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 4 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 5 aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt atgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70 <210> 6 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 6 ttcagt 6 <210> 7 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 7 tacgat 6 <210> 8 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 8 tatgat 6 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 9 tattat 6 <210> 10 <211> 6 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 10 tactat 6

Claims (48)

  1. 다음 단계들, 즉:
    a) 유산균 균주(모균주)를 제공하는 단계; 및
    b) 모균주에 비해 더 많은 파지에 대하여 (예컨대 더 많은 유형의 파지 또는 더 많은 균주(strains)의 파지) 내성을 나타내는 돌연변이 균주를 상기 모균주로부터 분리하는 단계
    를 포함하여 이루어지는, 유산균(예컨대 밀크 발효에 이용될 경우 모균주보다 더 높은 전단응력 및/또는 겔 강성을 발생시키는 세균)의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 a) 후에 다음 단계, 즉
    a1) 박테리오파지, 예컨대 CHPC658 (DSM 23961), CHPC1057 (DSM 23962), CHPC1089 (DSM 24022)　및 CHPC1152 (DSM 23994) 및 그의 돌연변이주 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 파지와 같이, 모균주를 용균시킬 수 있는 박테리오파지에 상기 유산균 균주를 토출시키는 단계
    를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 다음 단계들, 즉:
    a) 유산균 균주(모균주)를 제공하는 단계; 및
    a1) 박테리오파지, 예컨대 CHPC658, CHPC1057, CHPC1089　및 CHPC1152로 구성된 군으로부터 선택되는 파지와 같이, 모균주를 용균시킬 수 있는 박테리오파지에 상기 유산균 균주를 노출시키는 단계, 및;
    a2) 상기 노출된 세균 세포를 성장 배지에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 박테리오파지에 의하여 용균되지 않은 돌연변이 균주를 모균주로부터 분리하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 방법.
  4. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다음 단계, 즉
    c) 예컨대 상기 단계 a1)의 전, 도중 또는 후에, 또는 단계 a) 후에, 모균주를 돌연변이시키는 단계 (예컨대 화학물질 처리 또는 방사능 처리 또는 유전자조작 기술에 의함)
    를 포함하는 것인 방법.
  5. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다음 단계, 즉
    d) 예컨대 상기 단계 c)의 전, 도중 또는 후에, 또는 상기 단계 a1)의 전, 도중 또는 후에 상기 균주의 galK 유전자 또는 galK 조절 서열(예컨대 프로모터)에 돌연변이를 도입하는 단계 (예컨대 화학물질 처리 또는 방사능 처리 또는 유전자조작 기술에 의함)
    를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 다음 단계들, 즉:
    - 유산균 균주 (모균주)를 제공하는 단계;
    - 상기 모균주를 돌연변이시키는 단계 (예컨대 화학물질 처리 또는 방사능 처리 또는 유전자조작 기술에 의함);
    - 박테리오파지, 예컨대, CHPC658, CHPC1057, CHPC1089　및 CHPC1152로 구성된 군으로부터 선택되는 파지와 같이, 모균주를 용균시킬 수 있는 박테리오파지에 상기 얻어진 유산균 균주를 노출시키는 단계,;
    - 상기 노출된 세균 세포를 성장 배지에서 배양하는 단계; 및
    - 박테리오파지에 의하여 용균되지 않은 돌연변이 균주를 모균주로부터 분리하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것인 방법.
  7. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돌연변이는 galK 유전자의 프로모터 대역에 도입되는 것인 방법.
  8. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돌연변이는 galK 유전자의 프리브노우 박스와 리보좀 결합 부위 사이로 또는 -10 대역 (프리브노우 박스) 내로 도입되는 것인 방법.
  9. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돌연변이로 인하여 모균주에 비하여 갈락토스 발효 활성이 증가되는 것인 방법.
  10. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돌연변이는 다음을 결과시키는 것인 방법:
    - galK 유전자의 프리브노우 박스와 리보좀 결합 부위 사이의 대역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환. 예를 들어, 야생형 프리브노우 박스 하류의 서열 TTCAGT(SEQ ID NO: 6) 중의 C가 A, T 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드에 의해 치환될 수 있다; 및/또는
    - 야생형 -10 대역 (TACGAT, SEQ ID NO: 7) 중의 C와 G 중 어느 하나 또는 두개 모두가 A 및 T로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오타이드에 의해 치환됨; 및/또는
    - 야생형 -10 대역 (TACGAT, SEQ ID NO: 7) 중의 C가 A 및 T로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오타이드에 의해 치환됨; 및/또는
    - 야생형 -10 대역 (TACGAT, SEQ ID NO: 7) 중의 C가 T에 의하여 치환됨; 및/또는
    - 뉴클레오타이드 서열 TATGAT (SEQ ID NO: 8), TATTAT (SEQ ID NO: 9) 또는 TACTAT (SEQ ID NO: 10)을 갖는 -10 대역.
  11. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 추가 단계(들)을 포함하는 것인 방법:
    c1) 모균주에 비하여 증가된 파지 내성을 갖는 것과 같은, 파지 내성을 갖는 돌연변이주를 스크리닝하는 단계; 및
    c2) 모균주에 비하여 갈락토스 분해 활성이 증가된 것과 같은, Gal+ 표현형을 갖는 돌연변이 균주를 스크리닝하는 단계.
  12. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돌연변이 균주는 자연발생적인 돌연변이주, 모균주를 예컨대 화학물질 처리 또는 방사능 처리로 돌연변이시켜 얻은 돌연변이주 또는 유전자조작 기술에 의하여 얻어진 돌연변이주인 것인 방법.
  13. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돌연변이 균주는 파지 내성, 실질적인 파지 내성이고, 및/또는 모균주에 비하여 증가된 파지 내성을 갖는 것이고, 여기서 상기 파지는 모균주를 용균시킬 수 있는 박테리오파지, CHPC658, CHPC1057, CHPC1089　및 CHPC1152, 및 그의 돌연변이주 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세균(모균주)은 락토코커스 spp. (Lactococcus spp.), 스트렙토코커스 spp. (Streptococcus spp.) (예컨대, 스트렙토코커스 써모필러스), 락토바실러스 spp. (Lactobacillus spp.), 류코노스톡 spp. (Leuconostoc spp.), 슈도류코노스톡 spp. (Pseudoleuconostoc spp.), 페디오코커스 spp. (Pediococcus spp.), 브레비박테리움 spp. (Brevibacterium spp.), 엔테로코커스 spp. (Enterococcus spp.), 프로피오니박테리움 spp. (Propionibacterium spp,) 및 비피도박테리움 spp. (Bifidobacterium spp)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종들로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세균(모균주)은 밀크의 텍스처를 조절할 수 있는 능력, 엑소다당류 또는 캡슐형 다당류와 같은 다당류를 생산하는 능력, 밀크에서 배양될 경우 점도를 생성시키는 능력, 및 밀크에서 배영될 경우 전단응력을 증가시키는 능력으로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 특성을 갖는 균주로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 수득될 수 있는 유산균 또는 균주.
  17. 선행하는 항에 있어서, 예컨대 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 세포의 양으로 접종되어 섭씨 37도에서 12시간 배양 후 측정시, 발효유 중에서 약 70 Pa을 초과하는 (예컨대 73 Pa 초과, 77 Pa 초과 또는 80 Pa 초과) 전단응력을 발생시키는 유산균 또는 균주.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 또는 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus) 종에 속하는 것인 유산균 또는 균주.
  19. CHCC11342 (DSM 22932), CHCC11977 (DSM22935), CHCC12339 (DSM24090), 및 CHCC13140 (DSM 24023), 및 이들의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 종에 속하는 세균 균주로서, 여기서 상기 돌연변이주와 변이체는 예컨대 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 세포의 양으로 접종되어 섭씨 37도에서 12시간 배양 후 측정시, 발효유 중에서 약 70 Pa을 초과하는 (예컨대 73 Pa 초과, 77 Pa 초과 또는 80 Pa 초과) 전단응력을 발생시키는 것인, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 종에 속하는 세균 균주.
  20. CHCC12813 (DSM24074) 및 CHCC12841, 및 이들의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus) 종에 속하는 세균 균주.
  21. 선행하는 항에 있어서, 예컨대 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 세포의 양으로 접종되어 섭씨 37도에서 12시간 배양 후 측정시, 발효유 중에서 약 60 Pa을 초과하는 (예컨대 65 Pa 초과, 69 Pa 초과 또는 72 Pa 초과) 전단응력을 발생시키는 것인 세균 또는 균주.
  22. 선행하는 항에 있어서, 예컨대 밀크 1 ml 당 적어도 10E4개의 세포의 양으로 접종되어 섭씨 37도에서 12시간 배양 후 측정시, 발효유 중에서 60 내지 100 Pa 범위 (예컨대, 65 내지 90 Pa, 69 내지 85 Pa 또는 72 내지 80 Pa)의 전단응력을 발생시키는 것인 세균 또는 균주.
  23. CHCC11342 (DSM 22932), CHCC11977 (DSM22935), CHCC12339, CHCC13140 (DSM 24023), CHCC12813, 및 이들의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 균주에 속하는 세균과 같은, 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 유산균 또는 균주를 포함하는 조성물.
  24. - 락토바실러스(Lactobacillus) 종에 속하는 균주; 및
    - 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 종에 속하는 균주와 같은 본 발명의 유산균 균주, 예컨대 CHCC11342 (DSM 22932), CHCC11977 (DSM22935), CHCC12339, and CHCC13140 (DSM 24023), 및 이들의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 균주와 같은 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는, 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 유산균 또는 균주
    를 혼합물 또는 키트-오브-파츠로서 함유하는 조성물.
  25. - 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 종에 속하는 균주; 및
    - 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스 (species Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 종에 속하는 균주와 같은 락토바실러스 종에 속하는, 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 유산균 또는 균주
    를 혼합물 또는 키트-오브-파츠로서 함유하는 조성물.
  26. - CHCC11342 (DSM 22932), CHCC11977 (DSM22935), CHCC12339, 및 CHCC13140 (DSM 24023), 및 이들의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 균주와 같은 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 종
    - 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스 (species Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus) 종에 속하는 균주와 같은 락토바실러스 종에 속하는, 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 유산균 또는 균주
    를 혼합물 또는 키트-오브-파츠로서 함유하는 조성물.
  27. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 락토바실러스 종에 속하는 균주는 다당류(예컨대 헤테로다당류, 호모다당류) 및/또는 프럭토실 트랜스페라제 효소를 생산하는 락토바실러스(Lactobacillus) 종에 속하는 균주인 것인 조성물.
  28. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 10exp10 CFU (세포형성단위)의 락토바실러스(Lactobacillus) 종에 속하는 균주; 및/또는 적어도 10exp10 CFU의 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 종에 속하는 균주를 포함하여 이루어지는 조성물.
  29. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 10exp10 CFU (세포형성단위)의 다당류(예컨대 호모다당류) 및/또는 프럭토실 트랜스페라제 효소를 생산하는 락토바실러스(Lactobacillus) 종에 속하는 균주; 및 적어도 10exp10 CFU의 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 종에 속하는 균주를 포함하여 이루어지는 조성물.
  30. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스타터 컬처로서 사용가능하며 냉동되거나 동결건조되거나 또는 액체 형태인 것인 것인 조성물.
  31. 밀크 기질을 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 유산균 또는 선행하는 항중 어느 하나의 항에 기재된 균주 또는 선행하는 항 주 어느 하나의 항에 기재된 조성물을 이용하여 발효시키는 것을 포함하여 이루어지는, 발효유 제품의 제조방법.
  32. 선행하는 항에 있어서, 예컨대 CHCC10019 (DSM19252), CHCC2008 (DSM22584), 또는 CHCC3984 (DSM19251)로 이루어진 군으로부터 선택되는 균주 및 이들의 돌연변이주 및 변이체와 같은, 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스 (species Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus) 종, 락토바실러스 존스니이(L. johnsonii) 또는 락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum) 균주와 같은 락토바실러스(Lactobacillus) 종에 속하는 균주를 이용하여 밀크 기질을 발효시키는 것을 더 포함하는 방법.
  33. 선행하는 항에 있어서, 상기 밀크 기질을 락토바실러스(Lactobacillus) 종에 속하는 균주를 이용하여 발효시키기 전, 발효시키는 동안 또는 발효시킨 후에, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 종에 속하는 균주와 같은, 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 균주, 세균 또는 조성물을 이용하여 발효시키는 것인 방법.
  34. 선행하는 항에 있어서, 상기 밀크 기질을 다당류를 생산하는 락토바실러스(Lactobacillus) 종에 속하는 균주를 이용하여 발효시키는 동안, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 종에 속하는 균주와 같은, 균주나 세균을 이용하여 발효시키는 것인 방법.
  35. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단백질을 가교할 수 있는 효소, 트랜스글루타미나제, 아스파틱 프로테아제, 키모신 및 렌넷으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소와 같은 효소를 발효 전, 발효 중 및/또는 발효 후에 밀크 기질에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  36. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단백질을 가교할 수 있는 효소, 트랜스글루타미나제, 아스파틱 프로테아제, 키모신 및 렌넷으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소와 같은 효소를 발효 전, 발효 중 및/또는 발효 후에 밀크 기질에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  37. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 수득가능한 발효유 제품 (예컨대 요구르트 또는 버터밀크) 또는 치즈 (예컨대 프레쉬 치즈 또는 파스타 필라타)와 같은 유제품.
  38. 선행하는 항에 있어서, 필요에 따라, 과일 농축물, 시럽, 프로바이오틱 세균 컬처, 색소, 농후제, 풍미제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있고; 및/또는 임의로 스터드형 제품, 세트형 제품 또는 드링크형 제품의 형태일 수 있는 유제품.
  39. 필요에 따라, 과일 농축물, 시럽, 프로바이오틱 세균 컬처, 색소, 농후제, 풍미제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있고; 및/또는 임의로 스터드형 제품, 세트형 제품 또는 드링크형 제품의 형태일 수 있는, 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 수득가능한 유제품 (예컨대 발효유 제품).
  40. 밀크 기질 (예컨대 우유)을 본 발명의 유산균 [예컨대 DSM 22935와 같은, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)에 속하는 균주] 및 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus) 및 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)으로부터 선택된 유산균 종을 이용하여 발효시킴으로써 만들어지는 것인 유제품.
  41. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 전단응력으로서 측정시 점도가 100 Pa를 초과하는 것인 유제품.
  42. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 전단응력으로서 측정시 점도가 100 내지 200 Pa의 범위, 예컨대 100 내지 150 Pa의 범위, 또는 105 내지 125 Pa의 범위인 것인 유제품.
  43. CHPC658 (DSM 23961), CHPC1057 (DSM 23962), CHPC1089 (DSM 24022)　및 CHPC1152 (DSM 23994) 및 이들의 돌연변이주 및 변이체 (여기서 상기 돌연변이주와 변이체는 모균주와 동일한 균주를 용균시킬 수 있는 것임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리오파지.
  44. 선행하는 항에 있어서, CHPC658 및 그의 돌연변이주 및 변이체(여기서 상기 돌연변이주와 변이체는 균주 CHCC10019 (DSM19252)를 용균시킬 수 있는 돌연변이주와 변이체, 및/또는 균주 CHCC12813를 용균시킬 수 없는 돌연변이주와 변이체임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리오파지.
  45. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, CHPC1152 및 그의 돌연변이주 및 변이체(여기서 상기 돌연변이주와 변이체는 균주 CHCC6008 및/또는 CHCC11342를 용균시킬 수 있는 돌연변이주와 변이체, 및/또는 균주 CHCC11977을 용균시킬 수 없는 돌연변이주와 변이체임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리오파지.
  46. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, CHPC1057 및 그의 돌연변이주 및 변이체(여기서 상기 돌연변이주와 변이체는 균주 CHCC9204를 용균시킬 수 있는 돌연변이주와 변이체, 및/또는 균주 CHCC12339를 용균시킬 수 없는 돌연변이주와 변이체임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리오파지.
  47. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, CHPC1089 및 그의 돌연변이주 및 변이체(여기서 상기 돌연변이주와 변이체는 균주 CHCC5086을 용균시킬 수 있는 돌연변이주와 변이체, 및/또는 균주 CHCC13140을 용균시킬 수 없는 돌연변이주와 변이체임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리오파지.
  48. CHCC11342 (DSM22932), CHCC10019 (DSM19252), CHCC11379 (DSM 22884), CHCC11976 (DSM 22934) CHCC9204 (DSM19242), CHCC5086 (DSM22587), 및 그의 돌연변이주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에서 모균주로서 사용될 수 있는 세균 균주.
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