KR20120105543A

KR20120105543A - 인간 사이토메갈로바이러스에 대한 결합 멤버

Info

Publication number: KR20120105543A
Application number: KR20127019531A
Authority: KR
Inventors: 울프 그라분더; 미카엘 마흐; 루이스 마르틴-파라스; 존야 푀츠쉬; 나디야 스핀들러; 하인리히 스티히트; 안나-카타리나 비거스; 토마스 빙클러
Original assignee: 4-안티바디 아게
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2012-09-25
Also published as: NZ600974A; JP5833565B2; CN102892782A; BR112012015523A2; CO6640284A2; HK1181398A1; WO2011076883A1; CN102892782B; AU2010334809A1; CA2785587A1; ZA201204513B; IL220617A0; AU2010334809C1; PH12012501308A1; EA201270662A1; EP2516463A1; SG181901A1; EP2516463B1; MX2012007489A; AU2010334809B2

Abstract

본 발명은 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)의 생물학적 효과를 중화시키는 결합 멤버, 특히 항체 분자에 대한 것이다. 상기 결합 멤버는hCMV 감염의 치료 및 예방에 유용하다.

Description

인간 사이토메갈로바이러스에 대한 결합 멤버{Binding Members for Human Cytomegalovirus}

본 발명은 결합 멤버(binding member), 구체적으로는 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)의 생물학적 효과를 중화시키는 항체 분자에 대한 것이다. 상기 결합 멤버는 hCMV 감염의 치료 및 예방에 유용하다.

인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)는 널리 분포된 병원균으로, 지리학적 및 사회경제학적 기원에 따라 인간 집단의 40-80%에서 일반적으로 무증상이고 오랜 기간 동안 잔류하는(life-long persistance) 병원균이다. 그러나 이식 받은 환자, HIV 감염자, 그리고 갓 태어난 생명체와 같은 면역이 약화된 사람들에서, hCMV 감염은 이환(morbidity)과 사망(mortality)의 주 원인이고 건강보호 시스템의 중요한 경제적 부담 중 하나이다.

hCMV는 실질기관 이식(solid organ trasplantation: SOT) 및 조혈줄기세포 이식(hematopoietic stem cell: SCT) 이식 결과에 영향을 주는 중요한 감염이다(Razonable & Paya, 2003). 이식 후에, 활성 hCMV 감염은, 약 60-70%의 hCMV-혈청반응양성 환자 또는 혈청반응양성 기부자로부터 장기 이식을 받은 혈정반응음성 환자에게서 발생한다(Razonable & Paya, ibid). 만약 예방 조치가 없다면, hCMV 질환으로 진행될 위험성이 20-30%이다. 2008년에 약 26,000건의 동종(allogenic) SCTs가 수행된 것을 고려한다면(www.cibmtr.org), 이 치료법의 성공 및 이식 후의 이환 및 사망의 감소는 상당한 경제적 함의를 가진다. hCMV 연관 질환으로 인해 환자 당 25,000에서 50,000 유로의 추가 비용이 초래된다.

게다가, 이식 환자의 hCMV 감염은 이식과 관련된 죽상경화증 및 이식 손실(graft loss)와 관련된다(Stereblow et al., 2007).

앞서 언급한 바와 같이, hCMV는 주산기 병원균과 관련이 있다. 매해 민감성 여성의 약 1%가 임신 기간 동안 혈청변환된다(seroconvert). 미국에서는 이들의 약 40%가 hCMV를 그들의 태아에게 전달하여 매해 40,000명의 감염 태아가 출생한다(Kenesson & Cannon, 2007). 감염 어린이의 10-20%는 출생시에 급성 증상을 나타낸다. 이들의 20%까지는 사망하고 남아있는 사람들은 중간 정도에서 매우 심한 정도의 질환을 나타낸다. 환자들과 그 가족들에서 나타는 피폐한 결과와는 별도로, 이 환자들의 건강관리 비용은 매우 중요한데, 특히 주산기 감염은 심각하고 영속적인 장애를 초래한다.

현재까지, 미국에서 5개의 항바이러스제가 hCMV 감염용으로 승인되었다: Ganciclovir/Valganciclovir, Cidofovir, Foscarnet 및 Fomivirsen. 모든 화합물은 용량 의존적 부작용을 일으키고 저항성 바이러스주를 발생시켰다(Schreiber et al., 2009). 어떤 약물도 아이들이나 임산부용으로 허가받지 못하였다. 게다가 CytoGam® (CSL Behring) 및 Cytotect® (Biotest)와 같은 IVIG(intravenous immunoglobulin preparations)는 hCMV 감염 위험 속에서 환자들의 예방 및 치료에 사용되었다. 그러나 이식할 때 이 치료가 유용한지가 불확실한 것은 명백하다(Sokos et al., 2002; Raanani et al., 2009). hCMV-특이적 사이토톡식 T-세포의 양자 전달(adoptive transfer)이 조혈 SCT 환자들에게 성공적으로 이용되었으나(Moss & Rickinson, 2005), 이 치료법은 비용이 매우 비싸고 필요한 전문 인력이 구비된 소수의 이식 센터로 제한되어 있다.

더욱이, 이 치료법은 이식받는 이가 hCMV에 대한 양성혈청반응을 나타내는 경우로 제한된다. 반대로, IVIG는 선천적 CMV 감염의 치료 및 예방에 효과적인 것으로 알려졌다(Nigro et al., 2005). 그러나 hCMV 치료용 IVIG는 hCMV 양성혈청반응을 가지는 기부자로부터 분리되어 정제되기 때문에 타이터(titers)가 다양하게 나타나고 그리하여 이 조제물들에서는 hCMV 특이적 항체에 대한 배치간의 변동(batch-to-batch variation)이 나타난다. 게다가 인간 혈액 유래 약물들은 항상 인간의 병원균을 전달할 위험성을 가지고 있다. 그 결과 재조합 항체 생산물은, hCMV 감염에 의해 발생하는 질병의 예방 및 치료를 위해 hCMV를 충분히 중화해야 한다.

hCMV 감염의 항체 치료 타겟은 hCMV 비리온(virion) 표면에 발현된 단백질이다. hCMV 비리온 표면(envelope) 조성은 매우 복잡하고 표면을 구성하는 많은 구조 단백질이 확인되었으나, 여전히 완전하게 명확하게 확인된 것은 아니다. hCMV 치료용 항체를 개발하는 동안, 표면 당단백질 복합체 gp58/ll6 (gB or gC-1), gp 47-52 (gC-II; gM 및 gN) (Shimamura et al., 2006) 및 gp 86 (gH or gC-III) (Urban et al., 1996)에서 항원 결정기(antigenic determinant)를 확인하였다. 현재까지 확인된 대부분의 중화 항체는 gB 단백질에 결합하고 다수의 중화 에피토프를 포함하는 것을 보여주고 있다(Britt et al., 1990). gB 복합체는 130kD의 전구체로 합성되고 두 개의 공유 결합 분자로 쪼개져 있고, gp58 및 gp116으로 명명되었다. N-말단 조각(fragment)(gp116)은 20개 아미노산(마미노산 67-86)의 AD-2(antigenic domain-2)라 불리는 한 개의 선형, 중화 에피토프를 포함하는데, 이는 항체-매개 생물학적 활성을 위한 보체를 필요로 하지 않는다(Meyer et al., 1990). gB의 gp58 모이어티는 중화 도메인 AD-1을 운반하는데, 이는 74개의 아미노산(아미노산 557-630)을 포함하고 필시 입체형태 에피토프(conformational epitope)를 나타낼 것이다(Ohlin et al., 1993; Wagner et al., 1992).

처음 단클론 항체의 출현으로, hCMV에 대한 다양한 중화 마우스 단클론 항체가 확인되었다. 그러나 마우스 단클론 항체는 이들의 단백질이 인간 면역체계에서는 외부 물질로 인식되기 때문에 인간 치료에는 적합하지 않고, 매우 짧은 시간 후에 연속적으로 제거되어 임상 효능이 매우 낮거나 거의 나타나지 않는다. hCMV 단백질에 대한 키메릭 항체가 개발되었고 EP664834B(Harris et al)SMS gH라 불리는 hCMV의 86kD 당단백질을 타겟팅하는 키메릭 항체를 개시하고 있다. 그러나 이러한 항체들은 임상 세팅이 성공적으로 나타나지 않는다.

하이브리도마 생산용 헤테로마이엘로마(heteromyeloma) 이용 기술이, 바이러스 표면 양쪽에서 모두 발견되는 다양한 hCMV 당단백질들은 인식하는 인간 단클론항체 생산에 사용되고 있다. US5,043,281 (Masuho et al)는 분자량이 130,000에서 55,000 사이인 CMV 항원 단백질은 인식하는 중화 인간 단클론항체에 대해 기재하고 있다. US5,750,106 (Ostberg)는 gH 당단백질을 인식하는 SDZ MSL 109라는 CMV에 대한 인간 단클론 항체와 이 항체 생산용 하이브리도마 세포주에 대해 개시하고 있다. 바이러스 중화 인간 단클론 항체 중 하나로, SDZ MSL-109는 면역저하 환자의 hCMV 유도 망막염(retinitis)에 대한 임상 I/II기 평가를 하였으나, 약효 부족으로 임상은 더 이상 진행되지 않았다(Borucki et al., 2004; Hamilton et al., 1997; Boeckh et al., 2001). 이 임상실험들의 실패에 대한 타당한 설명으로, hCMV 항원 변이들을 들 수 있다. hCMV는 인간 헤르페스 바이러스 중에서 독특한데, 항원 변이이고 대부분의 인간 단클론 항체들은, 표현 항원과 반응하면서, 스트레인 특이적 중화능을 보인다. 이는 특히 SDZ MSL-109와 같은 gH 특이적 인간 단클론 항체들에 맞다. 이러한 단점은 서로 다른 분리물(isolates) 사이에서 보존되는 hCMV의 에피토프에 대한 직접적인 단클론 항체를 사용함으로써만 극복할 수 있다.

과거에는 중화능이 있는 항체에 대한 대량 탐색 기술(high-throughput screens)을 사용할 수 없었기 때문에, hCMV 중화 단클론 항체를 분리시키는 과정에 시간이 걸렸다. 게다가 수년 동안 EBV (Epstein Barr virus) 불멸화 방법이 관심있는 항체를 생산하는 불멸화 B세포 생산에 자주 사용되었다. 이 기술은 항원 특이적 선택법을 이용하여 건강한 사람으로부터의 말초혈액(Casali et al., 1986), 림프절, 이자 또는 환자의 말초 혈액(Yamaguchi et al., 1987; Posner et al., 1991; Raff et al., 1988; Steenbakkers et al 1993 and 1994)과 같은 서로 다른 인간 B세포 소스로부터 항체 분비 세포를 생산하는 데 성공적이다. 이 기술은 CMV-혈청양성반응 혈액 기부자로부터 분리한 말초혈액 단핵세포의 불멸화 및 그 이후의 3개의 항체(ITC52, ITC63b 및 ITC88)의 분리에 사용되었다(WO 93/021952 A1). ITC52 및 ITC63b는 CMV gp58의 아미노산 서열 557-630로 구성되는 CMV의 입체형태 AD-1 에피토프와 반응하고, ITC88은 CMV gp116의 아미노산 서열 67-86(AD-2)을 포함하는 AD-2에 대해 반응한다(WO 93/021952 A1).

EBV 트랜스포메이션 방법에 대한 개량 방법이 Lanzavecchia (WO 04/076677 A2) 및 Funaro et al (WO 07/068758 A1)에 의해 공지되었고, 이 방법들은 hCMV 항체 생산에 사용되고 있다. WO 08/084410 A2 (Lanzavecchia & Macagno)는 EBV 세포주 1F11, 2F4, 5A2 및 9A11로부터 생산되는 항체이고, 내피세포, 표피세포, 망막세포 및 수지상세포의 hCMV 감염을 중화시키고 gpUL130 및 gpUL131A에 의해 형성된 입체형태 에피토프에 직접적인 항체에 대해 기재하고 있다. 그러나 이 EBV주로부터 얻은 항체들은, 만약 파이브로블라스트가 감염 타겟 세포로 사용된다면 hCMV 중화능을 가지지 못한다. WO 08/084410 A2는 또한 0.3에서 2.0 μg/ml 범위의 억제중간농도(half-maximal inhibitory concentrations) (IC50)에서 파이브로블라스트와 내피세포의 hCMV 감염을 중화하는 항체를 생산하는 EBV 주 10C6, 5F1, 6B4 및 7H3에 대해 언급하고 있다.

EBV 주에서 생산된 항체들은 gB의 기능 에피토프(functional epitope)에 결합한다고 기재되어 있다. 그러나 앞서 언급된 EBV 세포주 일부로부터 항체의 중쇄 및 경쇄 서열이 빠진다고 해도, 이 데이터는 재조합 발현을 확인하지 못했고 공개된 서열에 의해 암호화된 항체를 정제하였다. Lanzavecchia 및 Macagno 의 최근의 특허출원(WO 10/007463 A1)은, 항체 6G4를 기재하고 있는데, 이 항체는 UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 의해 결정된 에피토프와 결합하고 내피, 망막 및 수지상세포의 hCMV 감염을 중화한다. 더욱이, WO 10/007533 A1 (Lanzavecchia & Macagno)는 hCMV UL128 단백질, gH, gL에 의해 형성된 에피토프, UL128 및 UL130 단백질, UL128, UL130에 의해 형성된 에피토프 및 UL131A 단백질 또는 UL130 및 UL131A 단백질에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 중화 항체에 대해 기재하고 있다.

WO 08/071806 A1 (Funaro et al)는 hCMV에 결합하여 중화하는 항체 26A1에 대해 기재하고 있으나, ELISA로 검사해 보았을때 gB 또는 gH에 의미있게 결합하는 것을 보여주지 못했다. 26A1의 억제중간농도(half-maximal inhibitory concentrations) (IC50)는 제1 파이브로블라스트(primary fibroblast) 및 내피세포에 대해 1μg/ml로 보고되었고, 따라서 종래기술에 기재된 항체에 의해 도달되는 범위이다. Funaro 및 그 동료들에 의한 최근 특허출원은 gH를 인식하는 항체 1F7에 대해 기재하고 있다(WO 09/003975 A1). 항체 26A1과 유사하게, WO 08/071806 A1에 기재된 것과 같이, 항체 1F7의 억제중간농도(IC50)는 제1 파이브로블라스트(primary fibroblast) 및 내피세포에 대해 1μg/ml로 보고되었고, 따라서 종래기술에 기재된 항체에 의해 도달되는 범위이다. 한편 Funaro 및 그 동료들의 다른 특허출원(WO 09/024445 A1)은 8C10, 37B7, 8A11 및 10B7 항체에 대해 기재하고 있는데, gB의 AD-2 도메인 (클론 8C10, 8A11, 10B7), 또는 gB나 gH(클론37B7)와 관련없는 단백질을 인식한다. Funaro 및 그 동료들의 특허출원 (WO 08/071806 A1 및 WO 09/003975 A1)에서와 같이, WO 09/024445 A1에서 언급된 항체는 제1 파이브로블라스트(primary fibroblast) 및 내피세포에 대해 1μg/ml 의 억제중간농도(IC50)를 나타내거나(10B7, 8A11, 37B7), 약 10μg/ml 보다 높고(8C10), 따라서 이미 공개된 hCMV 중화 항체의 범위이다.

또한 최근의 특허출원에서는 비슷한 특징을 가지는 hCMV 중화항체에 대해 기재하고 있다. 예를 들면, WO 09/114560 A2 (Olsen)는 2F10, 2M16, 2N9, 3C21, 3G7, 4P12, 5P9, 9C16의 항체 클론을 언급하고 있는데, 모두 gB의 AD-2 에피토프에 결합하고 파이브로블라스트의 hCMV 감염의 억제중간농도(IC50)는 1μg/ml을 보인다.

US20090004198 (Nakajima et al)는 분명한 PM 결합 친화도를 가지고 1μg/ml 및 더 높은 농도(10μg/ml and 100μg/ml)로 사용한다면 80%의 중화 활성을 가지는, gB AD-1 도메인에 대한 고친화도 항체를 기재하고 있다. Evec Inc.의 두 개의 최근 특허출원 WO 10/114105 A1 및 WO 10/114106 A1에서는, 각각 AD-2에 결합하는 항체와 AD-1의 불연속적 에피토프에 대해 기재하고 있다.

본 발명에 개시한 것과 같이, 본 발명자들은 hCMV의 gB 단백질에 고친화도로 결합하는 hCMV 중화항체를 개발하였다. 게다가, 이 항체들은 hCMV에 민감한 세포 형태들(파이브로블라스트, 내피세포, 표피세포 및 수지상세포)의 넓은 범위를 사용해서 hCMV 중화시 유사하게 고 효능(IC50s 0.5μg/ml 이하)을 보여주었고, 실험실 AD-169 스트레인 뿐만 아니라 임상 분리 테스트에서까지도 고효능을 보여주었다. 게다가 본 명세서에 언급된 항체들은 gB 단백질 새로운 중화 에피토프를 인식하는데 이는 전에 공개되지 않은 것이다. 이들의 고친화도 및 고효능 덕분에, 여기 소개된 기능 연구에 의해 결정된 이들의 새로운 에피토프 결합 특성들과, 본 발명의 결합 멤버들은 특히 인간 환자의 hCMV 감염의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용하다. 상기 결합 멤버는 본 명세서에 상세하게 기재된 다양한 CMV 감염성 질환의 치료에 유용하다.

발명의 요약

다수의, 고효능의, gB 특이적 및 hCMV 중화 인간 항체가 본 명세서에 개시되어 있고, 이 항체들은 전혀 새로운 hCMV 중화 에피토프를 인식하고 따라서 다른 이미 알려진 hCMV 특이적 항체와 비교했을 때 다른 치료 원리를 가진다. 이러한 발견과 기능적 특성은 이하에서 자세히 설명하기로 한다. 실시예에서 자세히 기재한 것과 같이, 50개의 완전한 인간 hCMV 중화 항체를 확인하였다. 이것들은 hCMV-감염 기부자로부터 유래한, EBV 형질전환된(transformed) 인간 말초 혈액 유래 B세포로부터 분리되었다.

항체 1에서 50의 CDR 서열은표 19 및 20에 자세히 나타내었다. 항체 1에서 46의 패널용 VH 도메인 및 VL 도메인의 조합은 표 7에 자세히 나타내었다. 표 7에서 19에 언급한 모든 서열은, 본 명세서의 일부분인 첨부된 서열 목록에 나타나 있다.

아래에서 자세히 설명하는 것과 같이, 본 발명에 따른 결합 멤버는, 치료적으로 의미가 있는 농도, 즉 IC50 값 1μg/ml 이하에서 타겟 세포의 hCMV 감염을 중화함을 보여준다. 대부분의 활성 결합 멤버는 특히 IC50 값 0.5μg/ml 이하에서 hCMV를 중화한다. 상기 중화능은 또한 서로 다른 gB 표현형을 나타내는 다른 임상 분리물에서도 관찰되었다(Towne 및 Altu; 표 16). 본 발명의 결합 멤버는 하나 또는 그 이상의 hCMV 활성을 중화할 수 있다. 예를 들면, 저해 생물학적 활성은 파이브로블라스트, 내피세로, 표피세포, 망막세포 및/또는 수지상세포의 감염을 예방하는 것이다. 파이브로블라스트의 감염 예방은 재조합 hCMV 스트레인, 루시페라아제 리포터 유전자를 발현하는 AD169를 이용한 in vitro 중화 분석을 통해 증명하였다. 이 유전적으로 변형된 hCMV 스트레인을 이용한 감염이 일어나면, 타겟 세포는 루시페라아제 효소 발현에 의해 양성이 되고, 이는 표준 광도계의 적절한 기질-변환에 의해 감지될 수 있다. 본 발명의 결합 멤버는, 재조합물과 루시페라아제 양성 바이러스 스트레인을 제1 인큐베이쇼셔을 하고 그 다음 제1 인간 표피 파이브로블라스트(primary human foreskin fibroblasts: HFFs)에 뿌렸을 때, hCMV 스트레인 AD169의 감염을 중화하는 것을 보여준다. 그 다음의 인큐베이션에서, 광도계를 이용하여 발광을 감지하였고 RLU(relative light units)를 감지하였다. 그 다음 중화 퍼센트를 계산하였고 여기서 중화 타이터(titer)가 타겟 세포의 hCMV 감염이 50% 또는 100% 감소한 것을 보여주는 결합 멤버의 농도(μg/ml)로 나타났다. 결합 멤버는 0.1 에서 5.0μg/ml, 바람직하게는 0.1 에서 2.0μg/ml, 더 바람직하게는 0.3에서 1.3μg/ml 또는 더욱 바람직하게는 0.1에서 0.6μg/ml에서 hCMV 감염이 50% 감소하였다. 상기 결합 멤버는 치료적으로 의미있는 농도인 0.1, 0.5, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.5 또는 2.0μg/ml에서 hCMV 감염이 50% 감소하는 결과를 보여준다.

hCMV 감염 중화를 확인하기 위한 다른 방법으로, ELISA, FACS, 웨스턴 블랏팅, 면역침전법, 플라그 형성 및 카운팅에 기초한 시각관찰법을 포함한다.

본 명세서에는 파이브로블라스트 뿐만 아니라 내피세포, 표피세포 및 수지상세포에서는 인간 hCMV 중화 효능을 보여준다(실시예 4의 제1 표피 파이브로블라스트를 이용한 분석, 실시예 7의 HUVEC(human umbilical vein endothelial cells), 인간 ARPE-19의 망막 피그먼트 표피세포 및 제1 수지상세포를 이용한 분석).

본 발명은 hCMV에 대한 고친화도 결합 멤버 및 hCMV gB 단백질에 특이적인 고친화도 결합 멤버를 개시한다. 본 발명의 결합 멤버는 50nM 이하, 즉 25nM, 15nM, 10nM, 5nM, 3nM, 1.5nM, 1nM, 0.5nM, 0.1nM, 75pM 또는 57pM 이하의 KD를 가지는 hCMV gB 단백질에 결합할 수 있다. 바람직하게는 상기 결합 멤버는 1nM 또는 그보다 덜한, 바람직하게는 0.5nM 보다 작은, 더 바람직하게는 75pM보다 KD를 가진다. KD는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance ) 예를 들면, 실시예 5에 기재한 것과 같은 Biacore®. Biacore® 의 친화도 측정법으로 확인할 수 있다.

본 명세서에 기재된 것과 같이, 표면 플라스몬 공명은 고체 지지체에 붙어있는 리간드 위의 플루이드상에 분석물을 통과시키고 분석물과 리간드 사이의 결합률(ka)과 해리율(kd) 을 측정하는 것을 포함한다. 표면 플라스몬 공명은 이러한 측정을 수행하기 위한 하나의 예이고, 이에 의해 결합 멤버는 지지체에 붙어 있는 gB 단백질 위를 플루이드상으로 통과한다. 표면 플라스몬 공명 데이터는 1가(monovalent) 분석물 데이터 모델에 적합할 수 있다. 친화도는 해리 상수, KD로 나타낼 수 있는데, 1가 분석물 데이터 모델을 사용한 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 것과 같은 해리 및 결합비율 상수 kd/ka로 계산된다.

본 발명의 결합 멤버는 hCMV gB 단백질의 특정 영역에 결합하는 것을 보여준다. hCMV gB 단백질의 알려진 에피토프는 서열번호 239의 gB 스트레인 AD169의 항원 도메인 1 (AD-1; 아미노산 552-635 사이) 및/또는 항원 도메인 2 (AD-2; 아미노산 67-86 사이) 내에 있다. 본 발명에서 우리는 hCMV gB 단백질의 새로운 두 개의 항원 도메인, 항원 도메인 4(AD-4; 서열번호 239의 gB 스트레인 AD169의 아미노산 121-132 및 344-438 사이의 비연속적) 및 항원 도메인 5(AD-5; 서열번호 239의 gB 스트레인 AD169의 아미노산 133에서 343 사이)에 결합하는 결합 멤버를 설명한다. 초기 실험에서, 여기에 설명된 6개의 결합 멤버, 단클론, 재조합 항체 Ab-04, Ab-11, Ab-14, Ab-19, Ab-28 및 Ab-42의 hCMV gB 단백질의 특정 영역에 대한 결합 능력이 조사되었다. 특히 이 6개의 결합 멤버의 에피토프 결합 특이성은 이 기술분야에 알려진 gB 단백질의 AD-1 또는 AD-2 에피토프에 결합하는 항-hCMV 항체 선택법을 이용하여 Biacore® 경쟁 분석으로 조사되었다. 본 발명의 결합 멤버는 특히 고친화도를 가지고 gB 단백질에 결합하지만, gB 결합을 할 때 AD-1 및 AD-2 특이적 항체들과 경쟁할 수 없었는데, 이는 본 발명의 결합 멤버가 gB 단백질의 새로운 중화 에피토프를 인식하기 때문임이 분명하다. 아미노산 잔기 100에서 447 (gB 스트레인 AD169; 서열번호 239)을 포함하는 잘려진 버전의 gB 단백질을 발현시켜서 이러한 결과를 뒷받침하는 데이터를 얻었는데, COS 세포에서 발현시켰을때 본 발명의 결합 멤버에 의해 인식되었다.

hCMV gB 단백질(AD169 스트레인 ; 서열번호 239) 분자 모델의 생산과, 표면에 노출된 단백질 도멘인의 확인, 아미노산 잔기 121-132 및 344-438 사이의 불연속적 아미노산이 본 발명의 결합 멤버가 결합하는 에피토프로 예상되는 것에 대한 내용이 이후에 서술된다. 이 예상 에피토프가 아미노산 116에서 132 및 344에서 440(gB 스트레인 AD169; 서열번호 239) -이들은 합성 아미노산 링커로 연결됨-으로발현되었다. 이 재조합 단백질은 특히 본 발명의 결합 멤버 Ab-11, Ab-14 또는 Ab-28에 의해 인식되었다. 이 새로운 에피토프는 AD-4로 명명되었다. 그러므로 본 발명의 상기 결합 멤버는 hCMV gB 단백질의 AD-1 영역에는 결합하지 않는다. 또한 본 발명의 상기 결합 멤버는 hCMV gB 단백질의 AD-2 영역에 결합하지 않는다. 반대로 본 발명의 결합 멤버 Ab-01에서 Ab-46은 새로운 입체형태 에피토프인, 아미노산 잔기 100에서 447 사이, 바람직하게는 아미노산 잔기 121에서 438 사이의 AD-4(또한 도메인 II(Dom II)로 명명)에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 결합 멤버는 gB 스트레인 AD169(서열번호 239)의 아미노산 116-132 및 344-440의 불연속적 아미노산 스트레치(streches), 더 바람직하게는 gB 스트레인 AD169 (서열번호 239)의 아미노산 121-132 및 344-438 아미노산 스트레치에 결합한다. 이에 대해 본 발명에 따른 gB 스트레인 AD169 (서열번호 239)의 아미노산 스트레치 121-132 및 544-438에 의해 만들어지는 불연속적 에피토프는, gB 스트레인 AD169 (서열번호 239)의 아미노산 116-132 및 344-440에 만들어지는 불연속적 에피토프와 같은 에피토프로 이루어진다는 것을 이해해야 한다.

항체 Ab-01에서 Ab-46은 모두 구조적으로 연관된 CDRs(특히 동일 길이와 관련 서열의 HCDR3)을 가지고 단일 도너(donor)로부터 유래했으며, 이 항체 분자들은 거의 대부분 오리지널 gB-반응성 클론들의 체세포 돌연변이이고, 그러므로 hCMV gB 단백질의 동일 또는 매우 유사하게 겹쳐진 에피토프에 결합할 것으로 예상된다. 따라서 재조합 항체 Ab-11, Ab-14 또는 Ab-28로 얻어진 에피토프 특성 결과물은 여기 기재된 모든 항체인 Ab-01 에서 Ab-46에도 나타날 것이다. 그리하여 본 발명은 항체 Ab-11, Ab-14 또는 Ab-28에 의해 인식되는 gB 단백질의 입체형태 에피토프에 결합하는 결합 멤버, 바람직하게는 항체에 대한 것이다. 또한, Ab-11, Ab-14 또는 Ab-28 항체들에 인식되는 gB 단백질의 입체형태 에피토프에 결합하기 위해 이 항체들과 경쟁하는 결합 멤버에 대한 것이다.

첫 번째 구체예에서, 본 발명의 결합 멤버는, 구조 모델에서 예측된 것과 같이, 아미노산 116에서 132 또는 아미노산 121에서 132를 포함하는 영역에서 hCMV gB 단백질과 결합할 것이다(실시예 9). 또한 본 발명의 결합 멤버는, 구조 모델에서 예측된 것과 같이, 아미노산 344에서440 또는 아미노산 344에서 438을 포함하는 영역에서 hCMV gB 단백질과 결합할 것이다(실시예 9). 선택적으로, 아미노산 116에서 132 및/또는 아미노산 344에서 440에 결합하는 것에 더해, 결합 멤버는 hCMV gB 아미노산 서열의 플랭킹 잔기(flanking residues) 또는 구조적으로 이웃한 잔기에 결합할 수 있다.

구체적인 실험에서, 여기에 설명된 4개의 결합 멤버, 단클론, 재조합 항체 Ab-47, Ab-48, Ab-49, Ab-50 의 hCMV gB 단백질의 특정 영역에 대한 결합 능력이 조사되었다. 특히 이 4개의 결합 멤버의 에피토프 결합 특이성은 처음에는 ELISA 경쟁 분석으로 조사되었고(실시예 8.3) 그 다음 캡쳐 ELISA를 사용하였다(실시예 10.2). 이 4개의 결합 멤버는 gB 단백질의 중화 에피토프를 인식하는 것이 분명하다.

hCMV gB 단백질(AD169 스트레인 ; 서열번호 239) 분자 모델의 생산, 표면에 노출된 단백질 도멘인의 확인, 아미노산 잔기 133에서 343이 본 발명의 결합 멤버가 결합할 수 있는 에피토프로 예측되는 내용이 이후에 서술된다. 상기 예상 에피토프는 두 개의 서브 도메인으로 구분되고 발현되었다: 서브도메인 1(아미노산 133-144 및 251-343)과 서브도메인 2(아미노산 140에서 255) (gB 스트레인 AD169; 서열번호 239). 캡쳐 ELISA에서 테스트했을 때, 서브도메인 1은 본 발명의 결합 멤버 Ab-47, Ab-49 또는 Ab-50에 의해 인식되었다. 아미노산 134에서 344의 새로운 에피토프 영역(gB 스트레인 AD169; 서열번호 239).은 AD-5로 명명되었다.

따라서 본 발명의 결합 멤버 Ab-47, Ab-48, Ab-49 또는 Ab-50은 hCMV gB 단백질의 AD-1 영역에 결합하지 않는다. 또한 본 발명의 결합 멤버는 hCMV gB 단백질의 AD-2 영역에 결합하지 않는다. 반대로, 본 발명의 결합 멤버 Ab-47에서 Ab-50은 AD-5로 명명된(또한 도메인 I (Dom I)으로 명명) 새로운 입체형태 에피토프에, gB 스트레인 AD169 (서열번호 239)의 아미노산 잔기 133에서 343 사이에서 결합한다.

그리하여 본 발명은 항체 Ab-47, Ab-48, Ab-49 또는 Ab-50 에 의해 인식되는 gB 단백질의 에피토프에 결합하는 결합 멤버, 바람직하게는 항체에 대한 것이다. 또한, 이 항체들에 인식되는 gB 단백질의 입체형태 에피토프에 결합하기 위해 이 4개의 항체들과 경쟁하는 결합 멤버에 대한 것이다.

두 번째 구체예에서, 본 발명의 결합 멤버는, 구조 모델에서 예측된 것과 같이, 아미노산 133에서 343를 포함하는 영역에서 hCMV gB 단백질과 결합할 것이다(실시예 9). 선택적으로, 아미노산 116에서 132 및/또는 아미노산 133에서 343에 결합하는 것에 더해, 결합 멤버는 hCMV gB 아미노산 서열의 플랭킹 잔기(flanking residues) 또는 구조적으로 이웃한 잔기에 결합할 수 있다. 일반적으로, 잔기 넘버링은 hCMV gB 스트레인 AD169 (서열번호 239)에 대응한다.

본 발명의 결합 멤버는 완전한 인간 아미노산 서열을 가진 항체와 같은 항체 분자를 포함할 수 있다. 상기 결합 멤버는 정상적으로 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 결합 멤버의 V_H 및 V_L 도메인은 본 발명의 일부로 개시되어 있다. 각각의 VH 및 VL 도메인은 상보성 결정 영역(CDRs) 및 프레임워크 영역(FRs)을 포함한다. 항체 V_H 도메인은 HCDR₁, HCDR₂, 및 HCDR₃로 명명된 세 개의 HCDR 영역을 포함한다. 항체 V_L도메인은 LCDR₁, LCDR₂, 및 LCDR₃을 포함하는 세 개의 LCDR 영역을 포함한다. V_H 또는 V_L 도메인 프레임워크는 다음 구조로 CDRs 사이에 배치된, 4개의 FWR1, FWR2, FWR3 및 FWR4를 포함한다: FWR1 - CDRl - FWR2 - CDR2 - FWR3 - CDR3 - FWR4.

본 발명에 따른 항체 V_H 및 V_L 도메인과 CDRs은 본 발명의 일부로서 첨부된 서열 목록에 기재되어 있다. 또한 아래 및 표 19에 CDRs이 기재되어 있다. 모든 V_H 및 V_L 서열, CDR 서열, CDRs 세트, HCDRs 세트 및 LCDRs 세트는 본 발명의 일 측면 및 구체예로 본 명세서에 개시되어 있다. 본 명세서 상의 'CDRs 세트'는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한다. 그리고 CDRs 중쇄 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 나타내고 CDRs 경쇄 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 나타냈다. 만약 그렇게 언급되지 않았다면, 'CDRs 세트'는 HCDRs 및 LCDRs을 포함한다.

일반적으로 본 발명의 결합 멤버는 단클론 항체이다.

본 발명의 결합 멤버는, 아래에서 더 논의되는 것과 같이, 정상적으로 비항체 단백질 스캐폴드의 CDRs 세트와 같은 하나 또는 그 이상의 CDRs에 의해 제공되는, 비항체 분자 내의 항원 결합 부위를 포함한다.

본 발명에 따른 결합 멤버 Ab-01에서 Ab-46은 hCMF 감염 기부자(donor)로부터 처음 분리되었고, SM1, SM3, SM4, SM5, SM6, SM7, SM9, SM10 또는 SM11로 명명된, EBV 불멸화 B세포주로부터 분리되었다. 이 9개의 세포주로부터 인간 항체의 37개의 서로 다른 VH와 62개의 서로 다른 VL 서열을 확인할 수 있었다(표 6). IgH 및 IgL 체인과 같이 각 세포주로부터 확인된 모든 VH및 VL 서열조합을 통해 이론적으로 295개의 서로 다른 항체를 만들 수 있다. 이들 중에서, 46개의 서로 다른 항체가 확인되었고, 이 항체들은 루시페라아제 발현, hCMV 실험실-스트레인 AD-169 및 제1 인간 표피 파이브로블라스트를 사용한 중요한(firtst-line) 생물학적 스크리닝 분석에서 hCMV를 중화하였다. 이 재조합 항체들 중 6개는 고효능으로 hCMV를 중화하고(IC50s 1μg/ml 이하), 15nM 또는 그 아래의 KD 값을 가지는 고친화도로 gB 단백질과 결합한다(하기 표 13 및 15).

결합 멤버 가변 도메인(binding member variable domains)의 구조와 위치는 to Kabat et al., (1991) 및 이의 개정본을 참고하여 결정하였다. 본 명세서는 표 19 및 20에 구체적으로 나타낸 CDRs 세트를 각각 포함하는 결합 멤버 패널을 개시하고 있는데, HCDR1은 Kabat 잔기 31-35을 가지고; HCDR2은 Kabat 잔기 50-65를 가지고; HCDR3은 Kabat 잔기 95-102를 가진다. LCDR1은 Kabat 잔기 24-34를 가지고; LCDR2은 Kabat 잔기 50-56을 가지고 그리고 LCDR3는 Kabat 잔기 89-97을 가진다. Kabat 넘버링은 웹사이트(http://www.bioinf.org.uk/ abs/abnum/)를 사용하여 결정하였다.

본 발명 제1 구체예의 결합 멤버는 CDR3와 같이 본 명세서에 기재된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 CDRs을 포함할 수 있고, 선택적으로 CDR1 및 CDR2를 CDRs 세트로 포함할 수 있다. 상기 CDR 또는 CDR 세트는, 본 명세서에 기재된 것과 같이, 항체 Ab-01에서 Ab-46 중 어느 하나의 CDR 또는 CDR 세트일 수 있고, 그 돌연변이일 수 있다.

결합 멤버는, 개시된 H 및 L CDRs 세트 내에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지는 항체 Ab-01에서 Ab-46 중 어느 하나의 H 및/또는 L CDRs 세트를 포함할 수 있다. 아미노산 돌연변이는 하나의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입이다. 본 명세서에 제공되는 실시예 및 개시된 서열에 기초하여, H 및/또는 L CDRs 세트 내에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개까지의 돌연변이, 예를 들면, 치환과 같은 돌연변이 일 수 있다. 또한 HCDR3에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개까지 일 수 있고, 그리고/또는 HCDR2에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개까지 일 수 있고, 그리고/또는 LCDR3에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개까지 일 수 있고, 그리고/또는 LCDR2 및/또는 LCRD1에서 1개 돌연변이 일 수 있다. 상기 돌연변이는 치환일 수 있고, 또는 상기 H 및/또는 L CDRs은 선택적으로, 상기 기재된 H 및/또는 L CDRs과 비교하여 하나의 아미노산이 치환 또는 결실된 것을 포함할 수 있다.

치환, 삽입 또는 결실은 CDRs의 어떤 위치(point)에서도 만들어질 수 있다. 예를 들면, HCDR1의 치환은 Kabat 잔기 31, 32, 34 및/또는 35의 어느 한 곳과 같은 Kabat 잔기 31-35 중 어느 한 곳에서 일어날 수 있고, HCDR2의 치환은 Kabat 잔기 50, 53, 54, 58, 60 및/또는 64 의 어느 한 곳과 같은 Kabat 잔기 50-65 중 어느한 곳에서 일어날 수 있고, HCDR3의 치환은 Kabat 잔기 99-100C, 100E, 100F 및/또는 100K-102의 어느 한 곳과 같은 Kabat 잔기 99-102 중 어느 한 곳에서 일어날 수 있다. 예를 들면, LCDR1의 치환은 Kabat 잔기 26 또는 27과 같은 Kabat 잔기 24-34 중 어느 한 곳에서 일어날 수 있고, LCDR2의 치환은 Kabat 잔기 56과 같은 Kabat 잔기 50-56 중 어느 한 곳에서 일어날 수 있고, LCDR3의 치환은 Kabat 잔기 89와 같은 Kabat 잔기 89에서 97 중 중 어느 한 곳에서 일어날 수 있고, 그리고 Kabat 잔기 95B에서 삽입이 일어날 수 있다. Ab-28의 서열과 비교되는 특정 아미노산 서열 돌연변이에 대한 상세한 설명은, 아미노산 치환 또는 삽입과 같은, HCDRs 및 LCDRs에 대한 각각의 표 20a 및 20b에서 찾을 수 있다.

예를 들면, 본 발명은 hCMV에 대한 분리된 결합 멤버를 제공하는데, 상기 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 상기 CDRs 세트는 22개의 아미노산을 가지거나 또는 CDRs 세트로부터 그 보다 적은 아미노산 변이(alteration)를 가지고,

CDRs 세트에서,

HCDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고;

HCDR2은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고;

HCDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고;

LCDR1은 서열번호 93의 아미노산 서열을 가지고;

LCDR2은 서열번호 94의 아미노산 서열을 가지고; 그리고

LCDR3은 서열번호 95의 아미노산 서열을 가진다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버 또는 VH 도메인은 하나 또는 그 이상의 다음 돌연변이를 가지는 항체 Ab-28의 HCDR1을 포함할 수 있다:

Gly로 대체된 Kabat 잔기 Asp 31;

Phe 또는 Tyr로 대체된 Kabat 잔기 His 32;

Ile 또는 Leu로 대체된 Kabat 잔기 Met 34; 그리고

Asn로 대체된 Kabat 잔기 Val 35.

본 발명의 결합 멤버 또는 VH 도메인은 하나 또는 그 이상의 다음 돌연변이를 가지는 항체 Ab-28의 HCDR2를 포함할 수 있다:

Ser 또는 Cys로 대체된 Kabat 잔기 Trp 50;

Asn 또는 His로 대체된 Kabat 잔기 Gln 53;

Thr으로 대체된 Kabat 잔기 Ser 54;

Lys, Asn 또는 His으로 대체된 Kabat 잔기 Gly 58;

Ala으로 대체된 Kabat 잔기 Gly 60; 그리고

Arg으로 대체된 Kabat 잔기 Gln 64.

본 발명의 결합 멤버 또는 VH 도메인은 하나 또는 그 이상의 다음 돌연변이를 가지는 항체 Ab-28의 HCDR3를 포함할 수 있다:

Ala으로 대체된 Kabat 잔기 Thr 99;

Met 으로 대체된 Kabat 잔기 Val 100;

Thr으로 대체된 Kabat 잔기 Ser 100A;

Thr 으로 대체된 Kabat 잔기 Asn 100B;

Phe 으로 대체된 Kabat 잔기 Ser 100C;

Met 또는 Ala으로 대체된 Kabat 잔기 Leu 100E;

Gly으로 대체된 Kabat 잔기 Ser 100F;

Tyr 으로 대체된 Kabat 잔기 His 100K;

Ser 또는 Asp으로 대체된 Kabat 잔기 Asn 100L;

Val 또는 Ile으로 대체된 Kabat 잔기 Arg 100M;

Met으로 대체된 Kabat 잔기 Leu 100N;

Gly으로 대체된 Kabat 잔기 Asp 101; 그리고

Val 또는 Ile으로 대체된 Kabat 잔기 Ala 102.

본 발명에 따른 결합 멤버 또는 VL 도메인은, Kabat 잔기 Ser 26이 Asn으로 대체되고 또는 Kabat 잔기 Ser 27이 Arg으로 대체된, 항체 Ab-28의 LCDR1을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 결합 멤버 또는 VL 도메인은, Kabat 잔기 Ser 56이 Pro으로 대체된, 항체 Ab-28의 LCDR2를 포함할 수 있다.

본 발명의 결합 멤버 또는 VL 도메인은 하나 또는 그 이상의 다음 돌연변이를 가지는 항체 Ab-28의 LCDR3를 포함할 수 있다:

Ala으로 대체된 Kabat 잔기 Gly 89;

Trp 으로 대체된 Kabat 잔기 Pro 91;

Ser 으로 대체된 Kabat 잔기 Arg 93;

Asp으도 대체된 Kabat 잔기 Ser 94;

Gly 또는 Ala으로 대체된 Kabat 잔기 Ser 95a;

Kabat 잔기 95b에 삽입된 Ala;

Tyr으로 대체된 Kabat 잔기 Val 96; 그리고

Val 으로 대체된 Kabat 잔기 Ile 97.

본 발명은 Kabat 잔기 95b가 Ala 또는 Kabat 잔기 95b가 없는(absent) LCDR3를 포함할 수 있다.

본 발명은 항체 Ab-01에서 Ab-46 중 어느 하나의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 그리고/또는 표 19 또는 20에 나타난 항체 Ab-01에서 Ab-46 중 어느 하나의 CDRs 세트와 같은 항체 1에서 46 중 어느 하나의 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3을 제공한다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 8; HCDR2는 서열번호 9; HCDR3는 서열번호 10; LCDR1은 서열번호 98; LCDR2는 서열번호 99; 그리고 LCDR3는 서열번호 100이고, 항체 Ab-02의 CDRs을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 13이고; HCDR2는 서열번호 14이고;

HCDR3은 서열번호 15이고; LCDR1은 서열번호 103이고; LCDR2는 서열번호 104이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 105이고, 항체 Ab-04의 CDRs을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 18이고; HCDR2은 서열번호 19이고; HCDR3은 서열번호 20이고; LCDR1은 서열번호 108이고; LCDR2는 서열번호 109이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 110이고 항체 Ab-11의 CDRs을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 23이고; HCDR2은 서열번호 24이고; HCDR3는 서열번호 25이고; LCDR1은 서열번호 113이고; LCDR2는 서열번호 114이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 115이고, 항체 Ab-14의 CDRs을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 3이고; HCDR2은 서열번호 4이고; HCDR3는 서열번호 5이고; LCDR1은 서열번호 93이고; LCDR2은 서열번호 94이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 95이고, 항체 Ab-28의 CDRs을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 28이고; HCDR2는 서열번호 29이고; HCDR3는 서열번호 30이고; LCDR1은 서열번호 108이고; LCDR2는 서열번호 109이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 110이고, 항체 Ab-42의 CDRs을 나타낸다.

결합 멤버는 이 항체들 중 하나의 V_H CDRs 세트를 포함할 수 있다. 선택적으로 이 항체들의 V_L CDRs 세트를 포함할 수 있고 V_L CDRs은 V_H CDRs과 같은 항체나 다른 항체로부터 일 수 있다.

본 발명은 항체 Ab-01에서 Ab-46 중 어느 하나의 HCDRs 세트를 포함하는 V_H 도메인, 그리고/또는 항체 Ab-01에서 Ab-46 중 어느 하나의 LCDRs 세트를 포함하는 V_L 도메인을 제공한다.

비록 아래 설명되는 것과 같이 V_H 또는 V_L 도메인 홀로 항원에 결합하도록 사용될 수 있지만, 일반적으로 V_H 도메인은 V_L 도메인과 짝을 이루어서 항체 항원-결합 부위를 제공한다. 상기 항체 Ab-28의 V_H 도메인은 항체 Ab-28의 V_H 도메인과 짝을 이루어서, 항체 항원-결합 부위가 양쪽 항체 Ab-28의 V_H 및 V_L 를 포함하여 형성된다. 여기에 기재된 다른 V_H 및 V_L 도메인에 대한 유사 구체예를 제공한다. 다른 구체예에서, 항체 Ab-28 V_H는 다른 항체 V_L 이외의 V_L 과 짝을 이룬다. 경쇄 뒤범벅(Light-chain promiscuity)은 종래 기술에 잘 나타나 있다(Kang et al., 1991). 다시, 유사한 구체예에서는 본 명세서에서 언급한 V_H 및 V_L 도메인에 대한 발명을 제공한다.

따라서 항체 1에서 46 중 어느 하나의 V_H를 포함하는 IgH 체인은 항체 Ab-01에서 Ab-46 중 어느 하나의 V_L을 포함하는 IgL 체인과 쌍을 이루어서 gB 특이적 결합 멤버를 생성한다.

결합 멤버는 항체 프레임워크 내에 CDRs 세트와 같은 하나 또는 그 이상의 CDRs를 가지는 항체 분자를 포함할 수 있다. 상기 프레임워크 영역은 인간 배선(germline) 유전자 세그먼트 서열일 수 있다. 인간 배선 유전자 세그먼트 서열은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있고 샘플을 얻기 위해 VBase 컴필레이션 또는 IMGT 온라인 데이터베이스(http://imgt.cines.fr)에 할 수 있다.

본 발명의 결합 멤버는 IGHV1-2과 같은 인간 배선 프레임워크의 HCDRs 세트를 포함하는 VH 도메인을 가지는 인간 항체 분자로부터 분리될 수 있다. 그리하여, 상기 VH 도메인 프레임워크 영역 FWR1, FWR2 및/또는 FWR3는 인간 배선 유전자 세그먼트 서열 IGHV1-2를 포함할 수 있다. FWR4는, 예를 들면, 서열번호 188에서 191로부터 선택된 인간 배선 J 세그먼트를 포함할 수 있다. V_H FWR1의 아미노산은 서열은 서열번호 181일 수 있다. V_H FWR2의 아미노산 서열은 서열번호 182일 수 있다. V_H FWR3의 아미노산 서열은 서열번호 183 또는 184일 수 있다.

본 발명의 항체 분자 또는 V_H 도메인은 다음 중쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다: FWR1 서열번호 181; FWR2 서열번호 182; FWR3 서열번호 183 또는 184. 또는 치환, 삽입 또는 결실과 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변이(alteration)를 가지는 중쇄 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

이에 더해, 본 발명의 항체는 IGHV1-2 배선 유전자 서열과 적어도 80% 상동성을 가지는 핵산 서열에 의해 암호화된 V_H 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는 IGHV1-2 배선 유전자 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97% 상동성, 더욱 바람직하게는 98%, 99% 상동성을 가진다. 본 발명 항체의 V_H 도메인은 IGHV1-2 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 V_H 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성을 가질 수 있다. 바람직하게는 IGHV1-2 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97% 상동성, 더욱 바람직하게는 IGHV1-2 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 98%, 99% 상동성을 가진다.

또한 정상적으로 상기 결합 멤버는 IGLV1-51과 같은 인간 배선 프레임워크에 LCDRs 세트를 포함하는 V_L 도메인을 가진다. 그리하여 V_L 도메인 프레임워크 영역은 인간 배선 유전자 세그먼트 IGLV1-51의 프레임워크 영역 FWR1, FWR2 및/또는 FWR3을 포함할 수 있다. FWR4는 인간 배선 J 세그먼트 IGLJ2 (서열번호 193)을 포함할 수 있다. V_L FWR1의 아미노산 서열은 서열번호 186일 수 있다. V_L FWR2의 아미노산 서열은 서열번호 186일 수 있다. V_L FWR3의 아미노산 서열은 서열번호 187일 수 있다.

본 발명의 항체 분자 또는 V_L 도메인은 다음의 경쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다: FWR1 서열번호 185; FWR2 서열번호 186; FWR3 서열번호 187, 또는 치환, 삽입 또는 결실과 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14의 아미노산 변이(alteration)를 가지는 경쇄 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

이에 더해, 본 발명의 항체는 IGHV1-2 배선 유전자 서열과 적어도 80% 상동성을 가지는 핵산 서열에 의해 암호화된 V_L 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는 IGLV1-51 배선 유전자 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97% 상동성, 더욱 바람직하게는 98%, 99% 상동성을 가진다. 본 발명 항체의 V_L 도메인은 IGLV1-51 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 V_L 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성을 가질 수 있다. 바람직하게는 IGLV1-51 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97% 상동성, 더욱 바람직하게는 IGLV1-51 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 98%, 99% 상동성을 가진다.

예를 들면, 본 발명의 항체 분자는 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역 세트를 포함하는데, 여기서 중쇄 FWR1은 서열번호 181이고; 중쇄 FWR2는 서열번호 182이고; 중쇄 FWR3는 서열번호 183이고; 경쇄 FWR1은 서열번호 185이고; 경쇄 FWR2는 서열번호 186이고; 경쇄 FWR3는 서열번호 187이다. 또한 상기 항체 분자는 10 또는 그 보다 작은 아미노산 변이(예: 치환)를 가지는 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다.

본 발명에 따른 결합 멤버 Ab-47에서 Ab-50은 3개의 hCMF 감염 기부자(donor)로부터 처음 분리되었고, SM10, SM12, 2C2 또는 1G2로 명명된, EBV 불멸화 B세포주로부터 분리되었다. 이 4개의 세포주로부터 인간 항체의 4개의 서로 다른 V_H와 5개의 서로 다른 V_L 서열을 확인할 수 있었다(표 12). IgH 및 IgL 체인과 같이 각 세포주로부터 확인된 모든 V_H 및 V_L 서열조합을 통해 이론적으로 20개의 서로 다른 항체를 만들 수 있다. 이들 중에서, 46개의 서로 다른 항체가 확인되었고, 이 항체들은 루시페라아제 발현, hCMV 실험실-스트레인 AD-169 및 제1 인간 표피 파이브로블라스트를 사용한 중요한(firtst-line) 생물학적 스크리닝 분석에서 hCMV를 중화하였다. 이 모든 재조합 항체들은 고효능으로 hCMV를 중화하였다(IC50s 0.6μg/ml 이하, 표 14).

결합 멤버 가변 도메인(binding member variable domains)의 구조와 위치는 Kabat et al., (1991) 및 이의 개정본을 참고하여 결정하였다. 본 명세서는 표 19 및 20에 구체적으로 나타낸 CDRs 세트를 각각 포함하는 결합 멤버 Ab-46, Ab-47, Ab-48 및 Ab-50를 개시하고 있는데, CDRs는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 확인되었고(Kabat & Wu, 1991), 웹사이트(http://www.bioinf.org.uk/ abs/abnum/)를 사용하여 결정하였다.

본 발명 제2 구체예의 결합 멤버는 CDR3와 같이 본 명세서에 기재된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 CDRs을 포함할 수 있고, 선택적으로 CDR1 및 CDR2를 CDRs 세트로 포함할 수 있다. 상기 CDR 또는 CDR 세트는, 본 명세서에 기재된 것과 같이, 항체 Ab-47에서 Ab-50 중 어느 하나의 CDR 또는 CDR 세트일 수 있고, 그 돌연변이일 수 있다.

결합 멤버는, 개시된 H 및 L CDRs 세트 내에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지는 항체 Ab-47에서 Ab-50 중 어느 하나의 H 및/또는 L CDRs 세트를 포함할 수 있다. 아미노산 돌연변이는 하나의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입이다. 본 명세서에 제공되는 실시예 및 개시된 서열에 기초하여, H 및/또는 L CDRs 세트 내에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개까지의 돌연변이, 예를 들면, 치환과 같은 돌연변이 일 수 있다. 상기 돌연변이는 치환일 수 있고, 또는 상기 H 및/또는 L CDRs은 선택적으로, 상기 기재된 H 및/또는 L CDRs과 비교하여 하나의 아미노산이 치환 또는 결실된 것을 포함할 수 있다. 치환, 삽입 또는 결실은 CDRs의 어느 위치에서나 만들어질 수 있다.

본 발명은 항체 Ab-47에서 Ab-50 중 어느 하나의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 그리고/또는 표 19에 나타난 항체 Ab-47에서 Ab-50 중 어느 하나의 CDRs 세트와 같은 항체 47에서 50 중 어느 하나의 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3을 제공한다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 243이고; HCDR2는 서열번호 244이고; HCDR3은 서열번호 245이고; LCDR1은 서열번호 263이고; LCDR2는 서열번호 264이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 265이고, 항체 Ab-47의 CDRs을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 248이고; HCDR2는 서열번호 249이고; HCDR3은 서열번호 250이고; LCDR1은 서열번호 268이고; LCDR2는 서열번호 269이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 270이고, 항체 Ab-48의 CDRs을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 253이고; HCDR2는 서열번호 254이고; HCDR3은 서열번호 255이고; LCDR1은 서열번호 273이고; LCDR2는 서열번호 274이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 275이고, 항체 Ab-49의 CDRs을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 258이고; HCDR2는 서열번호 259이고; HCDR3은 서열번호 260이고; LCDR1은 서열번호 278이고; LCDR2는 서열번호 279이고; 그리고 LCDR3는 서열번호 280이고, 항체 Ab-50의 CDRs을 나타낸다.

본 발명의 결합 멤버는 IGHV4-39 또는 IGHV4-59과 같은 인간 배선 프레임워크의 HCDRs 세트를 포함하는 V_H 도메인을 가지는 인간 항체 분자로부터 분리될 수 있다. 그리하여, 상기 V_H 도메인 프레임워크 영역 FWR1, FWR2 및/또는 FWR3는 인간 배선 유전자 세그먼트 서열 IGHV4-39 또는 IGHV4-59를 포함할 수 있다. FWR4는 6개의 중쇄 J 세그먼트 중 하나로부터 선택된 인간 배선 J 세그먼트의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다(Ravetch et al., 1981 참고).

Ab-47 또는 Ab-50 V_H 도메인의 아미노산 서열은 다음 IGHV4-39 중쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다: FWR1 서열번호 281; FWR2 서열번호 282; FWR3 SEQ ID No: 283. 또는 치환, 삽입 또는 결실과 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 아미노산 변이(alteration)를 가지는 중쇄 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

Ab-48 또는 Ab-48 V_H 도메인의 아미노산 서열은 다음 IGHV4-59 중쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다: FWR1 서열번호 284; FWR2 서열번호 285; FWR3 서열번호 286. 또는 치환, 삽입 또는 결실과 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 아미노산 변이(alteration)를 가지는 중쇄 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

이에 더해, 본 발명의 항체는 IGHV4-39 또는 IGHV4-59 배선 유전자 서열과 적어도 75% 상동성을 가지는 핵산 서열에 의해 암호화된 V_H 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는 IGHV4-39 또는 IGHV4-59 배선 유전자 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 상동성, 더욱 바람직하게는 98%, 99% 상동성을 가진다. 본 발명 항체의 V_H 도메인은 IGHV4-39 또는 IGHV4-59 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 V_H 도메인의 아미노산 서열과 적어도 75% 상동성을 가질 수 있다. 바람직하게는 IGHV4-39 또는 IGHV4-59 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 상동성, 더욱 바람직하게는 IGHV4-39 또는 IGHV4-59 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 98%, 99% 상동성을 가진다.

또한 본 발명의 결합 멤버는 IGKV2D-28 또는 IGKV1D-33과 같은 인간 배선 프레임워크의 카파(kappa) 경쇄 CDRs 세트를 포함하는 V_L 도메인을 포함할 수 있다. 그리하여, 상기 V_L 도메인 프레임워크 영역 FWR1, FWR2 및/또는 FWR3는 인간 배선 유전자 세그먼트 서열 IGKV2D-28 또는 IGKV1D-33를 포함할 수 있다. FWR4는 5개의 카파 J 세그먼트 중 하나로부터 선택된 인간 배선 J 세그먼트의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다(Hieter et al., 1982참고).

Ab-47 또는 Ab-48 VL 도메인의 아미노산 서열은 다음 IGKV2D-28 카파 경쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다: FWR1 서열번호 287; FWR2 서열번호 288; FWR3 서열번호 289. 또는 치환, 삽입 또는 결실과 같은, 1 또는 2개의 아미노산 변이(alteration)를 가지는 중쇄 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

Ab-49 V_L 도메인의 아미노산 서열은 다음 IGKV2D-33 경쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다: FWR1 서열번호 290; FWR2 서열번호 291; FWR3 서열번호 292. 또는 치환, 삽입 또는 결실과 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 아미노산 변이(alteration)를 가지는 중쇄 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 결합 멤버는 IGLV1-47과 같은 인간 배선 프레임워크의 람다(lamda) 경쇄 CDRs 세트를 포함하는 V_L 도메인을 포함할 수 있다. 그리하여, 상기 V_L도메인 프레임워크 영역 FWR1, FWR2 및/또는 FWR3는 인간 배선 유전자 세그먼트 서열 IGLV1-47를 포함할 수 있다. FWR4는 4개의 람다 J 세그먼트 중 하나로부터 선택된 인간 배선 J 세그먼트의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다(Udey & Blomberg 1987; Vasicek & Leder, 1990 참고).

Ab-50 VL 도메인의 아미노산 서열은 다음 IGLV1-47 람다 경쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다: FWR1 서열번호 293; FWR2 서열번호 294; FWR3 서열번호 295. 또는 치환, 삽입 또는 결실과 같은, 1 또는 2개의 아미노산 변이(alteration)를 가지는 중쇄 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

이에 더해, 본 발명의 항체는 IGKV2D-28, IGKV1D-33 또는 IGLV1-47 배선 유전자 서열과 적어도 90% 상동성을 가지는 핵산 서열에 의해 암호화된 V_L 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 핵산 서열은 IGKV2D-28, IGKV1D-33 또는 IGLV1-47 배선 유전자 서열과 적어도 95%, 96%, 97% 상동성을, 더욱 바람직하게는 98%, 99% 상동성을 가진다. 본 발명 항체의 V_L 도메인은 IGKV2D-28, IGKV1D-33 또는 IGLV1-47 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 V_L 도메인의 아미노산 서열과 적어도 90% 상동성을 가질 수 있다. 바람직하게는 IGKV2D-28, IGKV1D-33 또는 IGLV1-47 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97% 상동성, 더욱 바람직하게는 IGKV2D-28, IGKV1D-33 또는 IGLV1-47 배선 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 98%, 99% 상동성을 가진다.

본 발명의 결합 멤버는, (i) hCMV에 결합하고 (ii) 결합 멤버, 본 명세서에 기재된 CDRs 세트 및/또는 HCDR3와 같은 V_H 및/또는 V_L 도메인을 포함하는 어떠한 결합 멤버를 이용하여, hCMV에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다.

결합 멤버 사이의 경쟁은 in vitro에서 분석되었는데, 에를 들면, ELISA법, 표면 플라스몬 공명법 및/또는 특정 리포터 유전자를 결합 멤버에 부착(tagging)하여 하나 또는 그 이상의 부착되지 않은 결합 멤버의 존재시 감지되도록 함으로써 같은 에피토프 또는 겹쳐지는 에피토프에 결합하는 결합멤버를 확인할 수 있는 분석법을 이용하였다. 이러한 방법들은 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려져 있고 본 명세서에서 상세하게 설명하였다(실시예 참고). 따라서 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 hCMV에 결합하기 위해, 항체 분자(예를 들면, VH 및/또는 VL 도메인, HCDR3 또는 Ab-01에서 Ab-50 중 하나의 CDRs 세트와 같은 CDR)와 경쟁하는 항체 항원-결합 사이트를 포함하는 결합 멤버를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함하고 결합 멤버를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 그리고 본 발명은 상기 결합 멤버의 생산이 일어나는 조건 하에서 상기 핵산에 의해 암호화되고 V_H 도메인 및/또는 V_L 도메인을 포함하는 결합 멤버의 제조 방법 및 이를 회복하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 명세서상에 기재된 V_H CDR 또는 V_L CDR 서열 중 어느 하나를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하거나 본 발명의 핵산으로 감염된 숙주세포를 제공한다.

다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 결합 멤버를 포함하는 조성물, 인간 또는 동물의 치료 방법을 포함하여 결합, 저해 및/또는 hCMV 감염 중화 방법에 사용하는 결합 멤버의 용도를 기재하고 있다.

본 발명의 결합 멤버는 예방적 처치(prophylactic treatment )를 포함하여 인간 또는 동물체(예: 인간 환자)의 질병 및 질환 치료법과 같은 치료 및 진단 방법으로 사용될 수 있는데, 상기 인간 및 동물체에 본 발명의 결합 멤버 또는 본 발명의 여러 개의 결합 멤버의 조합물을, 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 처치 조건은, 본 명세서에 상세히 기재된 것과 같이, hCMV가 그 역할을 할 수 있는 모든 조건을 포함한다.

아래에서 본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면이 상세히 서술된다.

■ 용어

■ 본 명세서에서 사용된 '및/또는'은 각각 두 개의 세분화된 특징 또는 구성을 서로 가지거나 가지지 않은 것을 나타내는 것으로 편의상 이해한다. 예를 들면, 'A 및/또는 B'는, 각각이 개별적으로 개시된 것과 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각을 세부적으로 기재한 것으로 간주되어야 한다.

■ hCMV

■ 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)의 전장 아미노산 서열은 GenBank Acc. No. X17403 (Human cytomegalovirus strain AD169 complete genome)이고 229354 염기쌍 서열을 포함한다(Chee et al., 1990; Bankier et al., 1991).

■ gB

■ gB 복합체는 CMV 비리온(virion)막(envelope)의 표면 당단백질 복합체이다. 서로 다른 다수의 gB 단백질 스트레인이 있다:

gB 스트레인 AD169 - SwissProt Acc. No. P06473(서열번호 239)

gB 스트레인 Towne - SwissProt Acc. No. P13201(서열번호 240)

gB의 중화 도메인으로, 항원 도메인-1(AD-1; 서열번호 239 [AD169]의 아미노산 552-635) 및 항원 도메인-2(AD-2; 서열번호 239 [AD169]의 아미노산 67-86)을 포함한다. 또 다른 항원 도메인, AD-3 또한 존재한다(서열번호 239 [AD169]의 아미노산 783-906). 이 도메인은 바이러스 내부(intraviral)에 위치하고 중화 항체의 타겟이 아니다.

■ 결합 멤버

■ 이것은 서로 결합하는 하나의 분자 쌍의 한 개 멤버를 의미한다. 이 결합쌍 멤버는 자연적으로 발생하거나 전체적 또는 부분적으로 합성된다. 결합 쌍의 하나의 멤버는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지방, 작은 분자량 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 올리고펩타이드, RNA 간섭물(RNAi; Milhavet et al., 2003 참고), 안티센스(Opalinska & Gewirtz, 2003 참고), 재조합 단백질, 항체 또는 이의 단편 또는 이의 접합 및 융합 단백질일 수 있다.

본 발명에서 이용하는 안티센스 또는 RNAi 저해제는, hCMV gB 단백질을 암호화하는 서열을 저발현시키는 것과 같은 유전자 발현을 조절할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 다음을 포함하나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다: 안티센스 분자, siNA, dsRNA(double-stranded RNA), 마이크로 RNA, shRNA, 핵산 센서 분자, 알로자임, 효소성 핵산 분자 및 트리플렉스 올리고뉴클레오타이드 및 RNA 간섭(RNAi) 매개 또는 서열 특이적 방법으로 유전자 침묵(gene silencing)을 매개하는 데 사용하는 다른 모든 핵산 분자.

분자쌍의 하나의 멤버는, 그 표면에 결합하는 영역(area) 또는 캐버티(cavity)를 가지고 있어서 특정 공간에 상보적이고 분자쌍의 다른 멤버의 극성 조직화를 나타낸다. 결합 쌍의 예로는, 항원-항체, 수용체-리간드 및 효소-기질이 있다.

보통 결합 멤버는 결합 부위를 가지는 분자를 포함한다. 예를 들면, 항체 분자 또는 결합 부위를 가지는 비항체 단백질일 수 있다. 결합 부위는 항체 프레임워크 및/또는 파이브로넥틴이(fibronectin)이나 사이토크롬 B(cytochrome B) 등과 같은 비항체 단백질 스캐폴드 상에 CDR을 배열하여 얻는다(Haan & Maggos 2004; Koide et al., 1998; Nygren et al., 1997). 또는 단백질 스캐폴드 내 루프(loop)의 아미노산 잔기를 랜덤화하거나 돌연변이를 일으켜서 원하는 타겟에 대한 결합 특이성을 부여한다. 단백질에서 새로운 결합 부위를 만들기 위한 스캐폴드는 Nygren et al., ibid에 의해 자세하게 검토되었다. 항체 모방체(mimics)에 대한 단백질 스캐폴드는 WO 00/034784 A1 (Lipovsek)에 기재되어 있고, 여기에 적어도 하나의 랜덤화 루프를 가지는 파이브로넥틴 타입 III를 포함하는 단백질(항체 모방체)를 개시하고 있다. HCDRs 세트와 같은 하나 또는 그 이상의 CDRs이 그래프트되기 적당한 스캐폴드가 이뮤노글로불린 유전자 수퍼패밀리의 어떠한 도메인 멤버에 의해서든 제공될 수 있다. 상기 스캐폴드는 인간 또는 비인간 단백질일 수 있다. 비항체 단백질 스캐폴드의 장점은, 일부 항체 분자들보다 더 작고 제조하기 쉬운 스캐폴드 분자에 항원-결합 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 작은 크기의 결합 멤버는 세포에 들어가는 능력, 조직에 깊이 침투하는 능력 또는 다른 구조 내의 타겟에 도달하는 능력, 또는 타겟 항원의 단백질 캐버티에 결합하는 능력과 같은 유용한 생리학적 성질을 부여한다. 비항체 단백질 스캐폴드에서 항원 결합 부위를 사용하는 것은 Wess, 2004에 나와 있다. 일반적으로 안정적 백본(backbone) 및 하나 또는 그 이상의 변이 루프들을 가지는 단백질에서, 루프 또는 루프들의 아미노산 서열(들)은 특이적으로 또는 랜덤으로 돌연변이되어 타겟에 결합하는 항원-결합 부위를 만든다. 이러한 단백질들은 S. aureus로부터 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트렌스페린(transferrin), 테트라넥틴(tetranectin), 파이브로넥틴(fibronectin), 리포칼린스(lipocalins) 뿐만 아니라 감마-크리스탈린(gamma-crystalline) 및 다른 Affilin™ 스캐폴드(Scil 단백질)를 포함한다.

다른 측면의 실시예들은, 사이틀로타이드(cyclotides)-내부의 분자적 이황화결합(intra-molecular disulphide bonds)을 가지는 작은 단백질에 기초한 합성 '마이크로바디', 마이크로단백질(Versabodies™, Amunix) 및 앙키린 반복 단백질(ankyrin repeat proteins) (DARPins, Molecular Partners)을 포함한다.

항체 서열 및/또는 항원-결합 부위에 더해, 본 발명의 결합 멤버는 펩타이드 또는 접힌 도메인과 같은 폴리펩타이드와 같은 다른 아미노산 서열, 또는 항원에 결합하는 능력 외에 다른 기능적 특성을 상기 분자에 전달하기 위한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 멤버는 감지 가능한 라벨을 운반할 수 있고, 독성 물질 또는 타겟팅 모이어티 또는 효소(예를 들면, 펩타이드 결합 또는 링커를 경유하여)에 결합할 수 있다. 예를 들면, 결합 멤버는 촉매 사이트(에를 들면, 효소 도메인에서) 뿐만 아니라 항원 결합 부위를 포함하는데, 상기 항원 결합 부위는 항원에 결합함으로써 항원에서 촉매 사이트를 목적으로 삼는다. 상기 촉매 사이트는, 예를 들면 쪼개짐(cleavage)에 의해 항원의 생물학적 활성을 저해할 수 있다.

언급한 것과 같이, 비록 CDRs은 비항체 스캐폴드에 의해 운반될 수 있지만, 본 발명의 CDR 또는 CDRs 세트를 운반하기 위한 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열이거나 이의 치환부분 일 것이다. 여기서 CDR 또는 CDRs 세트는 재배열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 암호화되는, 자연적으로 발생하는 VH 및 VL 항체 변이 도메인의 CDR 또는 CDRs 세트에 대응하는 위치에 위치한다. 이뮤노글로불린 변이 도메인의 구조 및 위치는 Kabat & Wu, (1991) 및 이의 개정본을 참고하여 결정될 수 있다. 다수의 학문적 또는 상업적 온라인 리소스는 이 데이터베이스의 쿼리(query)로 이용할 수 있다. 예를 들면, Martin, 1996을 및 연관된 온라인 리소스, http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html를 참고할 수 있다.

CDR 영역 또는 CDR에 의해, Kabat et al., ibid에 의해 정의된 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)을 나타내려고 한다. 일반적으로 항체는 HCDR1, HCDR2, 및HCDR3로 명명된 3개의 중쇄와 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 명명된 3개의 경쇄를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 CDR 또는 CDRs는, 이 영역들 중 하나 또는 여러 개, 또는 전체를 나타내거나, 항원에 적합한 항체의 친화도에 의해 결합해야 하는 다수의 아미노산을 포함하는 영역들 중 하나를 나타내기 위해 사용한다.

6개의 CDF 서열 사이에서, 본질적으로 이 기술분야에 알려진 배선 이뮤노글로불린 중쇄 유전자 로커스의 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 V(D)J 재배열 때문에, 중쇄의 세번째 CDR(HCDR3)은 가장 큰 크기의 변이, 즉 더 큰 다양성을 가진다. 상기 HCDR3는 두 개의 아미노산으로 이루어질 정도로 짧거나 26개의 아미노산으로 이루어질 정도로 길거나 이 두 극단의 길이 사이의 어느 길이나 가질 수 있다. CDR 길이는 또한 매우 다양해서 특정의 기본(underlying) 프레임워크에 적합할 수 있다. 기능적으로, HCDR3는 항체의 특이성을 결정하는 데 있어 중요한 역할을 한다(Segal et al., 1974; Amit et al., 1986; Chothia et al., 1987, 1989; Caton et al., 1990; Sharon 1990a, Sharon 1990b, Kabat et al., 1991).

표 20a 및 b에 기재된 것과 같이, 본 발명의 결합 멤버 Ab-01에서 Ab-46에서, HCDR1은 Kabat 잔기 31-35로 구성되는 5개 아미노산 길이일 수 있다. HCDR2는 Kabat 잔기 50-65로 구성되는 17개 아미노산 길이일 수 있다. HCDR3는 Kabat 잔기 95-102로 구성되는 13개 아미노산 길이일 수 있다. LCDR2는 Kabat 잔기 50-56으로 구성되는 7개 아미노산 길이일 수 있다. LCDR3는 Kabat 잔기 89-97로 구성되는 10개 아미노산 길이일 수 있다.

본 발명의 결합 멤버 Ab-47에서 Ab-50에서, HCDR1은 Kabat 잔기 31-37 또는 31-35 각각으로 구성되는 7 또는 5개 아미노산 길이일 수 있다. HCDR2는 16개 아미노산 길이일 수 있고, HCDR3는 10, 15, 17 또는 22개 아미노산 길이일 수 있다. LCDR1은 Kabat 잔기 24-34로 구성되는 11개 아미노산 길이일 수 있고; 또는 Kabat 잔기 23-35로 구성되는 13개 아미노산 길이일 수 있고, 또는 Kabat 잔기 24-39로 구성되는 16개 아미노산 길이일 수 있다. LCDR2는 7개 아미노산 길일 수 있고, LCDR3는 9개 아미노산 길이일 수 있다.

■ 항체 분자

■ 이것은 자연적으로 생겼거나 부분적 또는 전체적으로 합성된 이뮤노글로불린을 의미한다. 이 용어는 또한 항체 항원-결합 부위를 포함하는 모든 폴리펩타이드 또는 단백질을 커버한다. 본 발명은 자연적 형태의 항체에 대한 것이 아닌, 항체 분자들이 자연 환경에 있는 것이 아니고 자연으로(natural source)으로부터 정제하여 분리하거나 얻을 수 있고, 또는 유전자 재조합 또는 화학 합성에 의해 얻을 수 있다. 그래서 이 항체들은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 항체 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편에는 다음의 분자들이 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다: Fab, Fab', F(ab')2, Fab' ?SH, scFv, Fv, dAb 및 Fd. 하나 또는 그 이상의 항체를 포함하는 다양한 항체 분자들은, 예를 들면 Fab2, Fab3, 다이어바디(diabodies), 트라이어바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies) 및 미니바디, 그리고 이중특이성(bispecific) 및 삼중특이성(trispecific) 항체를 포함하는 제조된다. 항체 분자와 이들의 구축 방법 및 용도는 Hollinger & Hudson (2005)에 기재되어 있다.

단클론 및 다른 항체를 가지고 재조합 DNA 기술을 이용하여, 타겟 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메릭 항체를 생산할 수 있다. 이러한 기술은 이뮤노글로불린 가변 영역, 또는 CDRs, 불변 영역에 대한 항체에 대한 것, 불변 영역, 불변 영역 더하기 프레임워크 영역, 서로 다른 이뮤노글로불린에 대한 것을 암호화하는 DNA를 도입하는 단계를 수반할 수 있다. 예를 들면, EP0184187A(Kudo et al) 또는 EP0239400A(Winter)이다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 유전적 돌연변이 또는 다른 변화에 놓일 수 있고, 이는 생산된 항체의 결합 친화도를 변경할 수도 있고 변경하지 않을 수도 있다.

항체는 수많은 방법으로 변형될 수 있기 때문에, '항체 분자'라는 용어는 어떤 결합 멤버 또는 항원에 대해 원하는 특이성 및/또는 결합력을 가지는 항체 항원-결합 부위를 가지는 물질을 포괄하는 것으로 파악되어야 한다. 따라서 이 용어는 이중특이성 또는 삼중특이성 항체 뿐만 아니라 항체 단편 및 그 유도체를 포괄하는 단어이고, 자연적인 것이든 전체적으로 또는 부분적으로 합성한 것이든, 항체 항원-결합 부위를 포함하는 어떠한 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서 항체 항원-결합 부위 또는 등가물, 다른 펩타이드와의 융합물(예: 다른 종에서 유래하였거나 클래스 또는 서브클래스가 서로 다른 것에 속하는 것)이 포함된다. 키메릭 항체의 클로닝과 발현의 일례는, EP0120694A(Boss et al) and EP0125023A(Cabilly et al)에 기재되어 있다.

항제 제조 기술분야의 또 다른 기술들을 이용하여 인간 및 인간화항체를 분리할 수 있다. 예를 들면, 인간 하이브리도마가 Kontermann & Dubel (2001)에 기재된 것과 같은 방법으로 만들어질 수 있다. 결합 멤버를 생산하기 위한 파지 디스플레이 또는 다른 확립된 기술들은 Kontermann & Dubel, ibid 및 WO 92/01047 A1 (McCafferty et al) 등의 많은 공개 문헌에 상세히 기재되어 있다.

마우스 면역계의 다른 성분은 손상되지 않고, 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체된 트랜스제닉 마우스(transgenic mice)는 인간 항체를 분리하는 데 사용할 수 있다. 다른 방법으로, Grawunder & Melchers (WO 03/068819 A1)에 기재된 방법을 사용하여, 이종항체(heterologous antibodies) 또는 결합 단백질을 생산하기 위해 유전적으로 변형된 척추동물 전구체 림포사이트를 이용할 수 있다. 인간화항체는 예를 들면, WO 91/09967 A1 (Adair et al)에 기재된 방법과 같은 종래기술을 이용하여 생산할 수 있다. 또한, WO 04/006955 A1 (Foote)는, 비인간 항체의 가변 영역 CDR 서열에 대한 표준(canonical) CDR 구조 타입과, 배선(germline) 항체 유전자 세그먼트와 같은 인간 항체 서열의 라이브러리로부터 대응 CDRs에 대한 표준 CDR 구조 타입을 비교함으로써, 인간 항체 유전자로부터 가변 영역 프레임워크 서열을 선택하는 것에 기초한 인간화항체에 대한 것이다. 비인간 CDRs에 대한 유사한 표준 CDR 구조 타입을 가지는 인간 항체 가변 영역은, 인간 항체 서열 멤버 서브세트를 형성하고 이로부터 인간 프레임워크 서열을 선택한다. 상기 서브세트 멤버는 인간과 비인간 CDR 서열 사이의 아미노산 유사성에 의해 평가된다. WO 04/006955 A1 ibid 방법에서는, 맨 위를 차지한(top ranking) 인간 서열이 선택되어, 선택된 서브세트 멤버 인간 프레임워크를 사용하여, 인간 CDR 서열을 기능적으로 비인간 CDR 대응물(counterpart)로 대체한 키메릭 항체를 구축하기 위하여, 프레임워크 서열을 제공한다. 이 방법에 의해, 인간과 비인간 항체 사이의 프레임워크 서열을 비교할 필요가 없이, 고친화도와 낮은 면역원성(immunogenicity)을 가지는 인간화 항체를 제공한다.

전체 항체 단편은 항원과 결합하는 기능을 수행할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 결합 단편의 예로는, (i) V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성되는 Fab 단편; (ii) V_H 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; V_H 또는 V_L 도메인으로 구성되는 dAb 단편(Ward et al., 1989; McCafferty et al., 1990; Holt et al., 2003); 분리된 CDR 영역; (vi) Fab 단편이 2개 연결된 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 펩타이드 링커로 연결되어 두 개의 도메인이 결합하여 항원 결합 부위를 형성하는 단일쇄 Fv 분자(scFv) Bird et al., 1998; Huston et al 1988); (viii) 이중 특이성 단일쇄 Fv 다이머(dimer) (WO 93/011161 A1 (Whitlow et al)) 및 (ix) '다이어바디', 유전자 융합에 의해 제작돠는 다가 또는 다중특이성 단편이 있다. Fv, scFv 또는 다이어바디 분자는 V_H 및 V_L 도메인을 이중황 가교로 연결하여 통합함으로써 안정화될 수 있다(Reiter et al., 1996). CH3에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디 역시 만들 수 있다(Hu et al; 1996). 결합 단편의 다른 예로는, Fab'가 있는데, 중쇄 CH1 도메인의 카르복시기 말단에 소수의 잔기를 추가함으로써 Fab로부터 분화된 것으로, 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함한다. 그리고 Fab' -SH는 불변 영역의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 가진 Fab' 단편이다. 프레임워크 영역에 의해 두 개의 CDRs이 연결된 항체 분자가 개시되어 있다 Qui et al., 2007). VH or VL 도메인으로부터의 CDR3는, 프레임워크 영역을 경유하여, CDR1 또는 선택된 CDR1의 C 말단을 통하여 연결된 다른 도메인의 CDR2 루프 또는 CDR3 N 말단에 대한 CDR2와 연결되어 있다.

도메인 항체(dAb)는 항체의 모노머성 항체-결합 단편으로, 예를 들면 항체 중쇄 또는 결쇄의 가변영역이다(Holt et al., 2003). VH dAbs는 낙타류(예: 낙타, 라마)에서 자연적으로 발생하고 타겟 항원으로 낙타류를 면역화시켜서 항원 특이성 B 세포를 분리하고 개별 B세포로부터 dAb 유전자를 직접 클로닝하여 얻을 수 있다. 또한 dAbs는 세포 배양을 통해서 생산할 수 있다. 본 발명의 결합 멤버는, 실질적으로 본 명세서에서 설명한 것과 같은, V_H 또는 V_L 도메인을 포함하는 dAb 또는 CDRs 세트를 포함하는 V_H 또는 V_L 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.

본 발명의 항체 단편은 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나로부터 시작하여 얻을 수 있는데, 펩신(pepsin)이나 파파인(papain)과 같은 효소에 의한 분해법 및/또는 화학 환원법에 의한 이중황 가교 쪼개기 방법을 이용한다. 다른 방법으로, 본 발명에 포함되는 상기 항체 단편들은 펩타이드 합성, 또는 핵산 합성 및 발현에 의해 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 유전자 재조합 기술을 통해 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 항체 단편은, 특히 페그화(PEGylation)에 의한 화학 변형, 또는 리포좀 연결과 같은 결합에 의해 반감기가 증가된 기능성 단편을 포함한다.

이중특이성 또는 이중기능성 항체는 단클론 항체의 제2세대를 형성하는데, 단클론항체에서 두 개의 서로 다른 가변영역이 같은 분자에 결합될 수 있다(Holliger & Bohlen, 1999). 따라서 이중특이성 항체는 가변 영역에 의해 암호화되는 두 개의 서로 다른 결합 특이성을 가질 수 있고, 따라서 단일 또는 다중 타겟 항원의 두 개의 서로 다른 에프토프에 결합한다. 이들의 새로운 작용기(effector function)를 선택하는 능력 또는 종양세포 표면에서 다수의 분자를 타겟팅하는 능력을 통해, 진단 분야 및 치료 분야 양쪽에서 이들의 사용이 증명되었다. 예를 들면, 항체들에 방사성 동위원소, 박테리아성 독성물질, 염증성 사이토카인, 화학치료제 또는 프로드러그와 같은 세포독성 메커니즘(cytotoxic mechanism)이 부가적으로 장착될 수 있다. 이중특이성 항체가 사용되는 곳에서, 이들은 일반적인 이중특이성 항체일 수 있고, 다양한 방법으로 제조될 수 있다(Holliger & Winter, 1993). 이중특이성 항체의 예는, BiTE® 기술 (Micromet, Inc.)에 대한 것들을 포함할 수 있는데, 여기서 서로 다른 특이성을 가지는 두 개의 항체의 결합 도메인이 사용될 수 있고 짧은 유동적 펩타이드를 통해 직접적으로 연결될 수 있다. 이것은 두 개희 항체를 짧은 단일 폴리펩타이드 체인으로 연결한다. 다이어바디(Diabodies) 및 scFv는, 항유전자형 반응(anti-idiotypic reaction) 효과를 잠재적으로 감소시키면서, 오로지 가변 영역을 사용하여 Fc 영역 없이 제작될 수 있다.

이중특이성 항체는 IgG로서, 쿼드로마(quadroma)(이중-특이성(dual-specific) 항원 결합 단편(Fab) 에 Fcγ를 더한 것)로서, 이중특이성 F(ab')2로서, Fab'PEG로서, 헤테로다이머성 Fab(heterodimeric Fab )로서, 다이어바디로서, 또는 이중특이성 또는 헤테로다이머성 scFv(Kufer et al., 2004에서 검토)로서 제작될 수 있다. 이중특이성 다이어바디는 이중특이성 전체 항체와 반대로, 쉽게 제작되고 E.coli. 에서 쉽게 발현될 수 있기 때문에 구체적으로 유용할 수 있다.

다중특이성 항체에 대한 최근의 연구는, 항체 혼합물의 개발로 이어지고 있는데, 여기서 3개에서 5개의 재조합 인간 단클론 항체들이 단일 또는 클론세포에 의해 제조된다. 상기 부분 항체들은 같은 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 공유하고 혼합물내 항체 종들과 결합된 모든 결합 부위들의 기능성을 보장해준다(Oligoclonics™; Merus Biopharmaceuticals BV; WO 04/106375 A1). 상기 부분 항체들은, 개량된 바이러스 중화능, 개량된 사이토카인 중화능 및 제거능, 그리고 강화된 종향세포 살해능력 및 도피 예방(prevention of escape) 그리고 개량된 바이러스 보호 흔적(breath of viral protection)과 같은 우수한 생물학적 활성을 위해 선택된다.

이 기술분야의 다양한 방법들을 hCMV에 대한 항체를 얻기 위해 이용할 수 있다. 상기 항체들은 특히 인간 유래의 단클론 항체일 수 있고, 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 표준 방법들을 통해 얻을 수 있다. 일반적으로, 특히 쥐과(murine) 유래의 단클론 항체 또는 이의 기능성 단편을 제조하기 위해서, 'Antibodies' (Harlow & Lane, 1988)에 기재된 구체적인 매뉴얼이나 Kohler and Milstein, 1975에 기재된 하이브리도마 제조 기술을 참고할 수 있다.

단클론 항체는, 예를 들면, hCMV에 대한 동물 또는 인간 면역화 B세포 또는 상기 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 이의 하나의 단편, 예를 들면 gB로부터 얻을 수 있다. 이들을 포함하는 적당한 단편, 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 본 명세서에 기재되어 있고, 동물을 면역화하여 hCMV에 대한 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. hCMV 또는 이의 단편들은, hCMV 또는 이의 단편을 암호화하는 cDNA 서열들에 포함되어 있는 핵산 서열로 유전적 재조합을 하거나, 또는 hCMV 및/또는 이의 단편의 펩타이드 서열에 포함된 아미노산 서열로부터 펩타이드를 합성하는 방법에 의한 일반적인 연구 방법에 따라 생산될 수 있다.

단클론 항체는, 예를 들면, 친화도 컬럼에서 정제될 수 있는데, 이 컬럼 상에서 hCMV 단백질 또는 이의 구성 성분 중 하나가 이미 불멸화되어 있다. 더욱 구체적으로, 단클론 항체는 단백질 A 및/또는 G 상에서 크로마토그래프로 정제될 수 있고, 이후에 잔기 단백질 오염물 및 DNA와 LPS를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않을 수 있다. 그리고 이후에 다이머 또는 다른 멀티머의 존재 때문에 생기는 잠재적 응축물을 제거하기 위해 세파로스겔 상에서 이온배제 크로마토그래피(exclusion chromatography)를 수행하거나 수행하지 않을 수 있다. 이 기술들 중 어느 것이든지 동시에 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

항원 결합 부위(Antigen-binding site)

이것은 타겟 항원에 결합하는 분자 부분을 의미하고, 타겟 항원의 전부 또는 일부에 상보적이다. 항체 분자에서는 항체 항원-결합 부위로 불리고, 타겟 항원에 결합하고 타겟 항원의 전부 또는 일부분에 상보적인 항체 분자의 부분을 포함한다. 항원이 크면, 항체는 항원의 특정 부분에 결합하는데, 이 부분을 에피토프라고 한다. 항체 항원-결합 부위는 하나 또는 그 이상의 항체 변이 도메인에 의해 제공된다. 항체 항원-결합 부위는 항체 경쇄 가변영역(VL) 및 항체 중쇄 가변영역(VH)을 포함한다.

항원 결합 부위는, CDRs의 자연적 위치, 예를 들면 V_H 또는 V_L 도메인의 프레임워크 영역 내 또는 CH1 및/또는 CH3에 제한되지 않는 항체 불변 도메인의 자연적 위치와 분리되어, 항체 분자 영역에서 제작될 수 있다. 구조 영역에서 제작된 항원 결합 부위는, V_H 및 V_L 도메인의 CDRs 세트에 의해 형성된 항원 결합 부위에 부가되거나 이를 대신할 수 있다. 이들은, 예를 들면, hCMV 위의 동일한 항원 도메인에 결합함으로써 그 결합력(avidity)을 증가시킨다. 이와 달리, 다중 항원 결합 부위는 hCMV의 다른 항원 및/또는 하나 또는 그 이상의 항원에 결합할 수 있고, 이는 작용기 (effector functions)를 첨가하거나 반감기를 연장시키거나 항체 분자의 in vivo 전달을 향상시키는 데 사용될 수 있다.

분리(Isolated)

이것은 본 발명의 결합 멤버 또는 이 결합 멤버를 암호화하는 핵산이, 일반적으로, 본 발명에 따라 존재하는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 결합 멤버, V_H 및/또는 V_L 도메인, 암호화 핵산 분자 및 벡터는, 그들의 자연 환경으로부터 분리 및/또는 정제되어, 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로, 또는 핵산, 자유 또는 실질적으로 자유 핵산 또는 필요한 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 아닌 유래의 유전자로 제공될 수 있다. 분리 멤버 및 분리 핵산은 이들이 자연적으로 결합하는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산이 없거나(free) 실질적으로 없는데, 이 다른 폴리펩타이드나 핵산은 분리 멤버 및 분리 핵산의 자연적 환경에 또는 in vitro 또는 in vivo에서 재조합 DNA 기술을 수행하여 분리 멤버 및 분리 핵산 제조물을 준비(예, 세포 배양)하는 환경에서 이들과 함께 발견된다. 멤버와 핵산은 희석제 또는 보조제(adjuvant)를 이용하여 제제화될 수 있고, 또한 실용적 목적으로 분리된다. 예를 들면, 면역분석법에 사용하기 위해 마이크로타이터(microtitre)를 코팅하여 사용한다면, 일반적으로 이 멤버들은 젤라틴 또는 다른 캐리어와 혼합될 것이다. 또는 진단 또는 치료에 사용시에는 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 희석제와 혼합될 것이다. 결합 멤버는 자연적으로 또는 이질적 진핵세포(예, CHO 또는 NS0 세포)시스템에 의해 글라이코실화되거나, 또는 예를 들어 이들이 원핵세포에서 생산된다면 글라이코실화되지 않을 것이다.

항-hCMV 항체 분자를 포함하는 이질성 제조물도 본 발명의 일부를 형성한다. 에를 들어, 이러한 제조물은 다양한 정도의 글라이코실화 및/또는 N-말단 글루탐산이 파이로글루탐산(pyroglutamic acid) 잔기로 고리화(cyclisation)되는 것과 같은 유도 아미노산을 가지면서, 전장 중쇄 및 C-말단 라이신이 결핍된 중쇄의 혼합물일 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 '실질적으로 나타낸 것과 같이(substantially as set out)'는 본 명세서 기재된 결합 멤버의 VH 및 VL 도메인의 관련 CDRs의 특성(들)에 대한 것으로, 여기 나타낸 구체적인 서열과 동일하거나 매우 유사할 것이다. 하나 또는 그 이상의 변이 도메인의 구체적 영역에 대해 '매우 유사한(highly similar)'이란, 1에서 약 5, 예를 들면 1에서 3, 또는 1, 2, 3 또는 4를 포함하여 1에서 4의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인에서 만들어진 것으로 생각된다.

■ 도면의 간단한 설명

도 1은 알려진 도메인 AD-1, AD-2 및 AD-3의 위치를 나타내면서 gB 단백질(스트레인 AD169; 서열번호 239)을 개략적으로 도식화한것이다(Ohlin et al., 1993; Wagner et al., 1992). 괄호에 나타난 것과 같이, 아미노산 460에서 갈라지는 부위(cleavage site)가 있고, 두 개의 모이어티가 이중황화 결합으로 함께 연결되어 있다. Signal: 신호 서열(아미노산 1-22), TM: 트랜스멤브레인 도메인 (아미노산 751-771).

도 2는 예비 FACS(fluorescent activated cell sorting)에 의한 gB-특이적 기억 B 세포 농축을 보여준다. gB-특이적, IgG-양성 B세포를 분리하기 위해, 항-CD20 MACS-풍부(MACS=magnetic activated cell sorting) B 세포가 다음 항체로 마킹되었다(stained): a. 항-인간 CD19 (B 세포 마커); b. 항-인간 CD27 (기억 B 세포 마커); c. 항-인간 IgG. 또한 B 세포는 형광 염색제로 라벨링된 재조합 글라이코단백질 B와 함께 인큐베이션되었다. CD19+/CD27+/IgG+/gB+ 반응 B세포는 방사능 처리된 배양세포 위로 정렬되었고 실시예 1과 같이 항체-생산 세포가 구축되었다.

도 3은 hCMV gB의 도메인 아키텍쳐이다. 개별 도메인을 나타내는 영역이 서로 다른 음영으로 나타나있고 출발 잔기의 숫자가 나타나있다. 괄호는 이중황화결합을 나타낸다. Signal: 신호 서열(아미노산 1-22), TM: 트랜스멤브레인 도메인.

도 4는 항-hCMV 항체 및 Ab-50 사이의 경쟁 ELISA이다. 도 4a는 항체 Ab-47, Ab-48, Ab-49 및C23 (gB 특이적 컨트롤 항체)와 경쟁하는 Ab-50을 보여준다. gB 단백질에 대한 결합 경쟁이 Ab-50 대 Ab-47 및 Ab-49 사이에서 관찰되었고 Ab-48 (또는 C23 컨트롤 항체)에서는 나타나지 않았다. 도 4b는 ITC52, ITC88, 89-104 및 89-109와 경쟁하는 Ab-50을 보여준다. Ab-50 및 테스트 항체들 중 어떤 항체 사이에서도 경쟁은 관찰되지 않았다. 그래프 4a 및 4b의 맨 윗부분을 가로지르는 쇄선은 0.5ng/well의 Ab-50을 나타낸다.

도 5는 gB 및 gB 단편에 대한 인간 혈청의 항체 타이터를 나타낸 것이다. hCMV 혈청양성반응의 환자로부터 선택된 8개의 무작위 혈청이 재조합 gB 및 항원 도메인 1 AD-1), 2(AD-2), 4(AD-4/Dom II) 및 5 (AD-5/Dom I)의 반응성을 알아보기 위해 ELISA로 분석되었다. 가로선은 개별 항원의 컷오프(cut off)를 나타낸다.

도 6은 서로 다른 항원 영역에 대한 항체 타이터 사이의 관계를 나타내고(ELISA로 측정된 것과 같이) 50% 중화 타이터를 보여준다. r: Spearman 순위 상관계수.

도 7은 친화 정제된 항-AD-4 다클론 항체의 특이성 및 중화능을 보여준다.

a) ELISA 플레이트는 각각 gB, AD-1, AD-2 및 AD-4로 코팅되었고 다양항 항체로 테스트되었다. E3: 친화 정제된 IgG 분획; Pre: 친화 정제 전 혈청 풀(serum pool); Post: 친화 정제 후 혈청 풀; C23: 인간 AD-2-특이적 단클론 항체; 89-104: 인간 항-AD-1 특이적 단클론 항체; 항-GST: GST 특이적 쥐과 단클론 항체.

b) 혈청 풀을 사용한 중화 분석으로, 인간 단클론 항체 C23과 친화 정제된 AD-4 특이적 IgG 분획(E3).

도 8은 AD-4 아미노산 서열과 돌연변이 단백질을 보여준다. 포유류 세포용으로 사용된 AD-4 아미노산 서열이 맨위 래인(lane)에서 보인다. 알라니으로 교환된 잔기는 래인 A-Q로 나타내었다. 사선(dash)은 야생형 서열과의 유사성을 나타낸다.

도 9는 인간 단클론 항체(Ab-28, Ab-11, Ab-14)에 의한 AD-4 및 AD-4 돌연변이 단백질 인식과 hCMV 혈청양성반응 기부자로부터 친화 정제된 IgG이다. ELISA 플레이트는 AD-4 융합 단백질로 코팅되었고 인간 단클론 항체(Ab-28, Ab-11, Ab-14; 도 9a) 또는 친화 정제된 IgG 분획(E3; 도 9b)의 분석을 위해 사용되었다. 항-GST 항체는 항원 코팅 효능에 대한 컨트롤로 사용되었다.

도 10은 인간 혈청에 의한 재조합 AD-4 돌연변이이다. 혈청 패널(80개 표본)은 AD-4를 포함하는 GST 융합 단백질 또는 돌연변이 펩타이드 AD-4G (K378K379), AD-4H (Q380E381), AD-4E (E359D362), AD-4I (N383S385) 및 AD-4L (N405T406)에 대해 ELISA로 테스트되었다. 각각의 혈청 비율은 제일 높은 OD 값과 제일 낮은 OD 값 사이에서 계산되었고 배수 차이(fold difference)로 그래프를 나타냈다. 점선은 모든 혈청 샘플의 평균차이다.

도 11은 gB 단백질 항원 도메인 및 서브도메인의 캡쳐-ELISA 확인 항체 인식 결과이다. 293T 세포가 (pcUL132SigHA), AD-4 + AD-5, AD-5의 서브도메인 1(AD-5-S1) 또는 AD-5의 서브도메인 (AD-5-S2)으로 감염되었다. 항체 Ab-47에서 Ab-50이 감지용으로 사용되었다. 결과는 간접 면역형광법(indirect immunofluorescence )에 의해 감지되었다.

도 12는 중화 항체 Ab-28과 서로 다른 인간 항체를 이용하여 경쟁 중화 분석(competitive neutralisation assay )을 한 것이다. 그래프의 왼쪽 데이터는, 일정한 농도인 약 50% 중화 활성에서 적용된, 3번의(triplicate) 서로 다른 hCMV-양성 혈청 및 hCMV-음성 혈청(x축 상에서)을 나타낸다. 그래프의 오른쪽 곡선은 그림의 왼쪽 데이터에 나타난 농도와 같은 일정한 농도에서 첨가된 hCMV-양성 또는 hCMV-음성 혈청을 가지는 적정(titrated) Ab-28의 조합을 나타낸 것이다. 모든 곡선은 혈청의 일정 IgG-농도를 추가하지 않은 Ab-28 만의 IgG-농도를 반영한 것이다. 모든 샘플은 세번 분석되었다. 부호 설명: ● hCMV-음성 혈정의 일정 농도; ?▲ hCMV-양성 혈청의 일정 농도; ■ Intratec® 의 일정 농도; ○ CMV-음성 혈청의 일정 농도를 가지는 적정화된 Ab-28; ▽ hCMV-양성 혈청의 일정 농도를 가지는 적정화된 Ab-28; □ Intratect의 일정 농도를 가지는 적정화된 Ab-28; ◇ 적정화된 Ab-28 단독.

도 13은 Ab-02, Ab-04 및 Ab-28을 이용한 포스트-흡착 분석(post-adsorption assay)을 나타낸 것이다. hCMV는 4℃에서 1 시간 동안 인간 표피 파이브로블라스트 속으로 침투하지 않고 된다. 그 다음에 항체 Ab-02, Ab-04 또는 Ab-28이 첨가되고 4℃에서 30, 80 또는 120분 동안 인큐베이션된다. 각각의 항체에 대해 150에서부터 5μg/ml로 1:2 연속 희석이 3번 수행된다. C23 (AD-2 특이 항체)이 세포 내로 바이러스가 침투하는 것을 막아주는 컨트롤 항체로 사용되었다. x-축은 IgG 농도(μg/ml)를, y-축은 %-중화(%-neutralisation)를 나타낸다. 부호 설명: ● 30분 인큐베이션 기간; ■ 80분 인큐베이션 기간; ▲ 120분 인큐베이션 기간.

도 14는 AD-1 및 AD-2-특이적 항체 및 Ab-28 사이의 대표 경쟁 중화 분석(representative competitive neutralisation assay )을 나타낸다. 도 12a 및 12b에 나타난 것 과 같이, ITC52(AD-1 특히 항체) 또는 ITC88(AD-2 특이 항체)는 각각 Ab-28의 부존재(●) 또는 존재(■) 상태에서 적정화되었다. Ab-28은 0.5μg/ml(▲)의 일정 농도로 적정 항체에 첨가되었다. 도 12c는 3μg/ml의 일정 농도로 적정 항체에 첨가되는 ITC88(▲)의 부존재(●) 또는 존재(■) 상태에서 적정화된 ITC52를 보여준다. 모든 결과는 세번 분석되었다.

도 15는 AD-4-특이적 및 AD-5-특이적 항체 사이의 경쟁 중화 분석(competitive neutralisation assay)이다. 이 분석에서는 하나의 대표 AD-4(DOM II) 특이 항체(Ab-28) 및 두 개의 대표 AD-5-(Dom I) 특이 항체(Ab-49 and Ab-50)가 사용되었다. x-축은 IgG 농도(μg/ml)를, y-축은 %-중화를 나타낸다. 부호 설명: ● AD-5 항체(Ab-49 또는 Ab-50) 단독; ▲ AD-4항체 단독; ■ AD-5 및 AD-4 항체 혼합물. 각각 항체의 1.5μg/ml가 첫번째 웰에 적용되는데, 혼합물의 개시 농도는 3μg/ml이다.

■ 발명의 상세한 설명

■ 앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 결합 멤버는 hCMV의 생물학적 활성을 조절하고 중화할 수 있다. 고효능 결합 멤버는 생물학적 hCMV 중화 분석과 같은 초기 스크린을 통해 직접적으로 얻을 수 있다.

EBV(Epstein-Barr Virus) 형질전환(transformation)은 포유류 세포를 불멸화시키는 방법으로 믿을 만하다. 다수의 EBV 형질전환 프로토콜이 개발되었다(Rosen et al., 1977; Steinitz et al., 1977; Steinitz et al., 1980; Kozbor & Roder, 1981; Lundgren et al., 1983; Rosen et al., 1983; Steinitz et al., 1984; Lanzavecchia, 1985; Bernasconi et al., 2002; Jung et al., 2002; Traggiai et al., 2004). 이 기술은 DNA 및 단백질 분리시 영구적 원천이 되는 인간 림포사이트로부터 세포주를 얻을 때 매우 자주 사용되고, 유전자형 검사시 환자 DNA의 영구적 원천을 생산하는 원칙적 방법으로 임상에서 널리 사용되고 있다. EBV는 헤르페스(Herpes) 바이러스이고 이의 지놈(genome)은 172kb의 선형 ds DNA이고 서열이 완전하게 분석되었다. EBV의 분자생물적 측면 및 발병 기전은 광범위하게 연구되었고 발병시의 다수의 중요한 EBV의 역할과 숙주세포 유전자가 알려져 있다. EBV는 특정 포유류 표피세포 및 B 림포사이트만 감염시킨다. 다수의 세포 주기 조절 유전자 및 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 B 세포 특이적 유전자를 활성화시킴으로써, In Vitro에서 EBV는 B세포를 불멸화시킨다. 그 다음 특정 항체를 분비하는 성장중인 클론이 분석을 위해 선택되었다. 그 다음 관심있는 항체들은 클로닝되고 이들의 서열은 일반적인 방법으로 결정된다.

상기 선택된 결합 멤버의 아미노산 서열을 가지는 항체 V_H 변이 도메인이 분리된 형태로 제공될수 있고, VH 도메인을 포함하는 결합 멤버일 수 있다.

hCMV에 결합하는 능력에 대해 더 테스트될 것이고, 또한 hCMV에 결합하기 위해 본 발명의 항체 분자 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 항체(예를 들면, scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷, 예를 들면 IgG₁)와 경쟁하는 능력이다. hCMV를 중화하는 능력을, 본 명세서의 다른 부분에 기재된 것과 같이, 테스트하였다.

서로 다른 결합 멤버의 결합 친화도 및 중화 효능이 적당한 조건 하에서 비교되었다.

본 발명의 V_H 및 V_L 도메인 및 CDRs 변이는 본 명세서에서 설명한 아니모산 서열을 포함하고 본 발명의 결합 멤버로 채택될 수 있는데, 서열 변이(alteration) 또는 돌연변이 및 원하는 특성을 가지는 항원 결합 멤버 스크리닝 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 원하는 특성의 예는 다음과 같으나 이에 한정되는 것은 아니다:

? 알려진 항원 특이적 항체와 비교하여 증가된 항원 친화도

? 만약 활성이 알려져 있다면, 이미 알려진 항원 특이적 항체의 활성과 비교하여 증가된 항원 활성의 중화도

? 특정 몰 비율에서 알려진 항체 또는 리간드에 대한 구체적 경쟁 능력

? 면역침전 복합체에 대한 능력

? 비연속적 잔기에 의해 형성된, 선형 및/또는 구속 입체형태(constrained conformation) 에피토프 또는 입체형태 에피토프에서 스크리닝된 펩타이드를 이용하여 선형 에피토프와 같은 구체적 에피토프에 결합하는 능력

? hCMV의 새로운 생물학적 활성 또는 다운스트림 분자의 활성을 조절하는 능력. 이 방법들은 본 명세서에 기재되어 있다.

V_H 도메인 및 V_L 도메인으로 구성된 항체 항원-결합 분위는 일반적으로 6개의 폴리펩타이드 루프로 형성된다: 경쇄 변이 도메인(V_L)으로부터 3개, 중쇄 변이 도메인으로부터 3개(V_H). 알려진 원자 구조의 분석으로 항체 결합 부위의 서열 및 3차원 구조 사이의 관계를 설명하였다. 이 관계들은, VH 도메인의 제3 영역(루프)을 제외하고, 결합 부위 루프는 적은 수의 주쇄 입체형태 또는 기본(canonical) 구조를 가지고 있음을 암시한다. 특정 루프에서 형성되는 이 기본 구조는 그 크기, 그리고 루프와 프레임워크 영역 양쪽의 핵심이 되는 부위(key site)에서 특정 잔기가 존재함으로써 결정된다는 것을 보여주고 있다(Chothia et al., 1992; Al-Lazikani et al., 1997).

서열-구조의 관계성 연구는 서열이 알려졌으나 3차원 구조가 알려지지 않은 항체에서 이 잔기들의 예측에 사용되는데, 이는 항체의 CDRs 루프의 3차원 구조를 유지하고 결합 특이성을 유지하는 데 중요한 것이다. 구조 접근법에서, WAM (Whitelegg & Rees, 2000)와 같이, 자유롭게 입수가능하거나 또는 상업적으로 구입할 수 있는 패키지를 이용하여 항체 모델을 만들 수 있다(Chothia et al., 1986). 단백질 시각화 및 Insight II (Accelrys, Inc.) 또는 Deep View (Guex & Peitsch, 1997)와 같은 분석 소프트웨어 패키지는 CDR의 특정 위치에서 가능한 치환들을 계산할 때 사용할 수 있다. 이 정보는 그 다음 활성에 최소한의 또는 유익한 효과를 나타낼 것 같은 치환을 만드는 데 사용할 수 있다.

CDRs, 항체 V_H 또는 V_L 도메인 그리고 결합 멤버의 아미노산 서열 내에 치환을 일으키기 위해 필요한 기술은 일반적으로 이 기술분야에서 얻을 수 있다. 활성에 최소한의 또는 유익한 영향을 주거나 또는 주지 않을 것으로 예상되는 치환들을 이용하여 변이 서열을 만들 수 있고, 그 다음에 결합 능력을 테스트하고 그리고/또는 hCMV 중화 능력을 테스트하고 그리고/또는 다른 원하는 성질에 대해 테스트한다.

특히 본 명세서에 기재된 어떠한 V_H 및 V_L 도메인의 변이 도메인 아미노산 서열은, 언급된 바와 같이, 본 발명에 맞게 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 첨부되는 서열 목록에 나타난 것과 같이 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나의 V_H 도메인과 아미노산 서열 상동성이 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99 %인 V_H 도메인, 그리고/또는 첨부되는 서열 목록에 나타난 것과 같이 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나의 V_L 도메인과 아미노산 서열 상동성이 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99 %인 V_L 도메인을 포함하는 항체 분자에 대한 것이다. 두 개의 아미노산의 % 동일성을 계산하기 위한 알고리즘으로, 예를 들면 디폴트 파라미터를 이용하면서, BLAST (Altschul et al., 1990), FASTA (Pearson & Lipman, 1988), 또는 the Smith-Waterman 알고리즘 (Smith & Waterman, 1981)을 포함한다. 특정 변이들은 하나 또는 그 이상의 아미노산 변이(alterations)(아미노산 잔기의 부가, 결실, 치횐 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다.

변이는 하나 또는 그 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 또는 그 이상의 CDRs에서 만들어질 수 있다. 정상적으로 이러한 변이들은 기능 상실을 초래하지 않기 때문에, 이러한 변이 아미노산 서열을 포함하는 결합 멤버는 hCMV에 결합하여 중화하는 능력을 가진다. 본 명세서에 언급된 분석법으로 측정했을 때, 결합 멤버 내에 변이가 일어나지 않았을 때와 같은 양의 결합능 및/또는 중화능을 가진다. 이러한 변이 아미노산 서열을 포함하는 결합 멤버는 향상된 결합능 및 hCMV 감염 중화능을 가질 수 있다.

변이에는, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 비자연적으로 발생하는 아미노산 또는 비표준 아미노산으로 대체하는 것, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 비자연적 발생 아미노산 또는 비표준 아미노산으로 변형시키는 것, 또는 하나 또는 그 이상의 비자연적 발생 아미노산 또는 비표준 아미노산을 서열에 삽입하는 것이 포함된다. 본 명세서에서의 다른 부분에서는 다수의 변이의 개수와 위치의 예들을 기재하고 있다. 자연 발생 아미노산은, 표준 단일 문자 코드에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 표시되는 20개의 '표준' L-아미노산을 포함한다. 비표준 아미노산은 폴리펩타이드 백본에 결합된 어떤 다른 아미노산, 또는 존재하는 아미노산의 변형 결과물을 포함한다. 비표준 아미노산은 자연적으로 발생한 아미노산 일 수도 있고 비자연적으로 발생한 아민노산일 수도 있다. 자연적으로 발생한 많은 종류의 아미노산이 이 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline), 5-하이드록시라이신(5-hydroxylysine),3-메틸히스티딘(3-methylhistidine), N-아세틸세린(N-acetylserine) 이다. (Voet & Voet, 2004). N-알파 위치에서 유래한 이 아미노산 잔기들은 아미노산 서열의 N-말단에만 위치한다. 일반적으로 본 발명의 아미노산은 L-아미노산이지만, D-아미노산일 수도 있다. 따라서 변이는, L-아미노산으로의 변형하는 것, 이를 D-아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 메틸화된, 아세틸화된, 그리고/또는 포스포릴화된 아미노산이 알려져 있고, 본 발명의 아미노산들에 이러한 변형이 가해질 수 있다.

본 발명의 항체 도메인 및 결합 멤버의 아미노산 서열은 앞서 언급한, 비자연적 또는 비표준적 아미노산들을 포함한다. 비표준적 아미노산(예, D-아미노산)은, 합성하는 동안 아미노산 서열에 결합할 수 있고, 또는 아미노산 서열 합성 후에 '원래(original)'의 표준 아미노산 서열로 변형 또는 체됨으로써 아미노산 서열에 결합할 수 있다.

비표준 및/또는 비자연 발생 아미노산을 사용하면 구조 및 기능의 다양성을 증가시킬 수 있고, 그리하여 본 발명의 결합 멤버에서 원하는 hCMV 결합 및 중화 성질을 얻기 위한 잠재적 가능성을 증가시킬 수 있다. 게다가 D-아미노산 및 유사체들은, 인간과 같은 동물에 투여 후 L-아미노산이 가지는 폴리펩타이드의 in vivo 변성때문에, 표준 L-아미노산과 비교하여 서로 다른 약동력학적 프로필을 보여준다. 이는 일부 in vivo 적용시 D-아미노산이 장점이 있음을 의미한다.

본 발명의 CDR-유래 서열을 운반하는 새로운 VH 또는 VL 영역은, 하나 또는 그 이상의 선택된 VH 또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이발생법(random mutagenesis)에 의해 발생되어 전체 변이 도메인의 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 이러한 기술은 Gram et al.,(1992)에 기재되어 있는데, 에러-프론 PCR(error-prone PCR)을 사용하였다. 일부 구체예에서, 전체 변이 도메인 또는 CDRs 세트 내에서 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이 만들어졌다. 다른 방법으로, VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 직접적 돌연변이방생법이 사용될 수 있다.

앞서 언급한 기술은 이 기술분야에서 모두 알려진 기술이고 통상의 기술자들은 이 기술들을 사용하여 통상적인 방법으로 본 발명의 결합 멤버를 제공할 수 있다.

다른 측면에서 본 발명은, hCMV에 대한 항체 항원-결합 부위를 얻는 방법을 제공한다. 이 방법은 여기 개시된 V_H 도메인의 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 제공하는 것을 포함하고, V_H 도메인은 V_H 도메인의 아미노산 서열 변이이다. 선택적으로 이 방법은 이렇게 제공된 V_H 도메인과 하나 또는 그 이상의 V_L 도메인을 조합하는 것을 포함한다. 그리고 이 방법은 hCMV 중화능과 같은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 성질을 가지는 hCMV에 대한 결합 멤버 또는 항체 항원-결합 부위를 확인하기 위해, V_H 도메인 또는 V_H/V_L 조합물 또는 조합물들을 검사하는 것을 포함한다. 상기 VL 도메인은 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 이는 본 명세서에 실질적으로 나타나 있다(substantially as set out). 이와 유사한 방법도 이용할 수 있는데, 여기 개시된 하나 또는 그 이상의 V_L 도메인 서열 변이는 하나 또는 그 이상의 VH 도메인과 결합된다. 위에서 언급한 것과 같이, 본 명세서에 실질적으로 나타난(substantially as set out) CDR 아미노산 서열은 인간 항체 변이 도메인 또는 이의 실질적 위치에서 CDR로서 운반될 수 있다. 본 명세서에 실질적으로 나타난 HCDR3 서열은 본 발명의 구체예에 기술하였고 이들 각각은 인간 중쇄 가변 영역 또는 이의 실질적 위치에서 HCDR3로서 운반될 수 있다.

본 발명에서 이용된 변이 도메인들은, 어느 배선세포에서나 얻을 수 있고 또는 어느 배선세포 유래될 수 있고 또는 인간 변이 도메인의 재배열일 수 있고 또는 알려진 인간 변이 도메인의 공통 서열 또는 실제 서열에 기초한 합성 변이 도메인일 수 있다. 변이 도메인은 비인간 항체로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 CDR 서열(예, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여 CDR(예, CDR3)이 없는 변이 도메인 레퍼토리에 도입될 수 있다. 예를 들면, Marks et al. (1992)는 항체 변이 도메인 레퍼토리 생산 방법을 개시하는데, 여기서 공통 프라이머는 변이 도메인의 5' 말단을 향하거나 또는 5' 말단에 인접하고, 공통 프라이머가 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 영역에 연결되어 CDR3가 없는 V_H 변이 도메인 레퍼토리를 제공한다. 또한 Marks et al.는 이 레퍼토리가 어떻게 특정 항체의 CDR3에 결합도리 수 있는지에 대해 서술하고 있다. 유사한 기술을 사용하여, 본 발명의 CDR3 유래 서열은 CDR3가 없는 V_H 또는 V_L 도메인 레퍼토리로 셔플될 수 있고, 셔플된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동종의(cognate) V_L 또는 V_H 도메인과 결합하여 본 발명의 결합 멤버를 제공한다. 그 다음 이 레퍼토리는 파지 디스플레이, 이스트 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 공유 디스플레이와 같이 적당한 숙주 시스템에서 표시될 수 있다.

유사하게, 하나 또는 그 이상, 또는 모든 3개의 CDRs는 VH 또는 VL 도메인 레퍼토리에 이식될 수 있고, 그 다음 결합 멤버 또는 hCMV에 대한 결합 멤버를 스크린할 수 있다.

예를 들면, 항체 Ab-01에서 Ab-50 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 또는 HCDRs 세트가 이용될 수 있고 그리고/또는 항체 Ab-01에서 Ab-50 LCDRl, LCDR2 및 LCDR3 또는 LCDRs 세트가 이용될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 V_H 및 V_L 도메인, CDRs 세트 및 HCDRs 세트 및/또는 LCDRs 세트가 이용될 수 있다.

이뮤노글로불린 변이 도메인의 실질적 부분은 적어도 세 개의 CDR 영역과 이 사이에 끼어 있는 플레임워크 영역을 포함할 수 있다. 이 부분은 또한 적어도 50%의 제 1 및 제 4 프레임워크 중 하나 또는 양쪽 다를 포함할 수 있고, C-말단이 되는 50%, 제 1 프레임워크 영역의 50% 그리고 제4 프레임워크 영역의 N-말단 50%를 포함할 수 있다. 변이 도메인의 N-말단 또는 C-말단에서의 잔기 부가는, 자연적으로 발생하는 변이 도메인 영역과 결합하는 것은 아니다. 예를 들면, 재조합 DNA 기술로 본 발명 결합 멤버를 제작함으로써, 도입된 링커에 의해 암호화되는 N- 또는 C- 말단 잔기에 의해 클로닝이나 다른 조작 단계를 촉진할 수 있다.

다른 조작 단계는 링커를 도입하여 본 발명 변이 도메인을, 항체 불변영역, 다른 변이 도메인 또는 본 발명의 다른 부분에서 설명되는 감지가능/기능성 라벨을 포함하는 단백질 서열에 연결한다.

비록 본 발명의 일부 측면에서, 결합 멤버는 VH 및 VL 도메인쌍, VH 또는 VL 도메인 서열에 기초한 단일 결합 도메인을 포함한다. 단일 이뮤노글로불린, 특히 VH 도메인은, 특정 방법으로 타겟 항원에 결합할 수 있다. 단일 결합 도메인 중 어느 하나의 경우에서, 이 도메인들은 hCMV에 결합할 수 있는 두 개의 도메인 결합 멤버를 형성할 수 있는 상보성 도메인 부분을 스크린하는 데 사용될 수 있다. 이는 WO92/01047(McCafferty et al) and in Marks et al., ibid에 기재된 것과 같이 소위 위계적 이중 조합 접근법이라 불리는 방법을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 결합 멤버는 인간 항체 불변영역 또는 그 일부분과 같이 항체 불변영역 또는 그 일부분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, VL 도메인은 C-말단에서 인간 Cκ 또는 Cλ를 포함하는 항체 경쇄 도메인 불변영역에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 결합 멤버는 C-말단에서 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 다른 어떤 아이소타입 서브클래스로, 특히 IgG₁ 및 IgG₄로부터 유래된 이뮤노글로불린 중쇄의 모든 부분(예, CH1 도메인)에 부착될 수 있다. IgG₁은 작용기(effector function) 및 쉬운 제조법 때문에 유리하다. 이러한 성질들을 가지고 가변영역을 안정화시킬 수 있는 어떠한 합성 또는 다른 불변영역 변이가 본 발명에서 유용하다.

본 발명의 결합 멤버는 또한 이중특이성 또는 다중특이성 항체와 같은 VH 및 VL 도메인쌍 이상을 포함하여 본 발명의 다른 측면을 형성한다. 이중특이성 항체의 경우, V_H 및 V_L 도메인 두 개 쌍을 가지고 VH 및 VL 도메인 중 하나는 본 발명에 기재된 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 유래한다. 예를 들면, V_H 및 V_L 도메인쌍은 항체 Ab-01에서 Ab-50 또는 다른 항체에서 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제1 V_H 및 V_L 도메인쌍은 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 유래하고 제2 V_H 및 V_L 도메인쌍은 도메인쌍은 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 유래하지만 제1 도메인 페어와 다르고, 그래서 이 이중특이성 항체는 hCMV에 결합한다.

또한, 제1 V_H 및 V_L 도메인쌍은 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 선택되고 제2 V_H 및 V_L 도메인쌍은 다른 항체에서 선택된다. 따라서 이중특이성 항체는 hCMV에 결합할 수 있고, 다른 항원 또는 hCMV 상의 다른 항원 또는 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직하게, 상기 이중특이성항체는 hCMV의 AD-4 또는 AD-5에 결합하는 제1 V_H 및 V_L 도메인(즉 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 유래한 제1 V_H 및 V_L 도메인쌍) 및 다음에 기재된 hCMV 결합 항체로부터 선택된 제2 VH 및 VL 도메인쌍을 포함한다: US5,043,281(Mashuho et al), US5,750,106(Ostberg), WO93/021952 A1(Borrebaeck et al), WO08/084410 A2, WO10/007463 A1 and WO10/007533 A2 (Lanzavecchia & Macagno), WO08/071806 A1, WO09/003975 A1 and WO09/024445 A1(Funaro et al), WO09/114560 A2(Olsen), WO10/114105 A1 and WO10/114106 A1(Takada et al).

Oligoclonics™ (Merus Biopharmaceutical BV; WO 04/106375)와 같이 이 기술분야에 알려진 재조합 인간 단클론 항체 혼합물과 같은 항체 혼합물이, hCMV 중화용으로 생산될 수 있다. 이 혼합물들은 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 유래한 결합 멤버를 포함할 수 있다. 이 항체 혼합물들은, 또한 AD-1 또는 AD-2와 같은 gB 단백질의 서로 다른 도메인을 인식하거나 hCMV 단백질 gpUL130, gpUL131A, gp128 등을 인식하는 hCMV에 대한 결합 멤버와 결합된, 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 유래한 결합 멤버를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체 혼합물들은, 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 선택된 V_L 도메인 및 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 선택된 V_H 도메인 및 다음에 기재된 hCMV 결합 항체로부터 선택된 VH 도메인을 포함한다: US5,043,281(Mashuho et al), US5,750,106(Ostberg), WO93/021952 A1(Borrebaeck et al), WO08/084410 A2, WO10/007463 A1 and WO10/007533 A2(Lanzavecchia & Macagno), WO08/071806 A1, WO09/003975 A1 and WO09/024445 A1(Funaro et al), WO09/114560 A2 (Olsen), WO10/114105 A1 and WO10/114106 A1(Takada et al). 이와 다른 것으로, 항체 혼합물들은 다음에 기재된 hCMV 결합 항체 중 어느 하나에서 선택된 VH 도메인 중 어느 하나에서 선택된 VH 도메인 및/또는 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나에서 선택된 VH 도메인과 함께, 다음에 기재된 hCMV 결합 항체 중 어느 하나에서 선택된 V_L 도메인을 포함할 수 있다: US5,043,281(Mashuho et al), US5,750,106(Ostberg), WO93/021952 A1(Borrebaeck et al), WO08/084410 A2,WO10/007463 A1 and WO10/007533 A2(Lanzavecchia & Macagno), WO08/071806 A1, WO09/003975 A1 and WO09/024445 A1(Funaro et al), WO09/114560 A2 (Olsen), WO10/114105 A1 and WO10/114106 A1(Takada et al).

본 발명의 결합 멤버는 또한 변형된 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 단편을 포함할 수 있는데, 상기 변형 Fc 영역은 야생형 Fc와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 상기 변이 Fc 영역은 야생형 Fc 영역을 포함하는 비교 분자와 비교하여 고안될 수 있고, 더 크거나 작은 친화도를 가지고 Fc 수용체에 결합한다. Fc 영역은 IgG의 파파인(papain) 소화에 의해 생산된 IgG C-말단에 상응하는 자연 발생 또는 합성 폴리펩타이드이다. IgG Fc는 분자량이 약 50kD이다. 본 발명의 항체 및/또는 단편을 위해 전체 Fc 영역 또는 단지 반감기 강화 부분이 사용될 수 있다.

원한다면 Fc 영역에 돌연변이를 일으켜서, 보체(complement)에 고정하는 능력을 저해하여 Fc 수용체에 고친화도로 결합하도록 할 수 있다. 본 발명에서 항체 또는 단편은 변형 Fc 영역으로 제공될 수 있고, 자연적으로 발생하는 Fc 영역은 변형되어서, 예를 들면 혈청 반감기와 같은 생물학적 환경에서 반감기를 증가시킬 수 있는데, 반감기는 in vitro 분서그로 측정하였다. 또한 IgG의 원래 Fc 영역을 변형시키는 방법은 US6,998,253(Presta & Snedecor)에 기재되어 있다. 효능기는 Fc 영역에 변형을 가하거나 글라이코실화 패턴에 변형을 가하거나 Fc 영역의 아미노산 서열을 변형시키는 방법에 의해 변형될 수 있는데(예를 들면 강화), 다음을 포함하나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다: 강화된 항체 의존 세포성 세포독성(cellular cytotoxicity) 을 포함하는 강화된 Fc-매개 세포독성 및 강화된 보체-매개 라이시스(예, hCMV-감염 세포에서), Fc 수용체, NK(natural killer)세포, 대식세포(macrophages), 모노사이트, 및/또는 다핵세포(polymorphonuclear cell)에 대한 항체 결합의 강화; 강화된 수지상세포 성숙도 및 강화된 T 세포 프라이밍(priming). 변형될 가능성이 있는 것으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삽입, 결실 치환을 포함하고, 알라닌으로의 치환, 보존적 치환, 비보존적 치환 또는 다른 IgG 서브클래스로부터 같은 위치에서 대응하는 아미노산 잔기로의 대체(예를 들면, IgG1 잔기를 대응하는 IgG2 잔기로 같은 위치에서 대체)를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드 변이는, 하나 또는 그 이상의 변형 글라이코폼(glycoform) 즉, Fc 영역을 포함하는 분자에 공유결합으로 부착된 탄수화물 성분을 포함할 수 있다. IgG형 항체의 Fc 영역은 CH2 도멘인의 Asn297 잔기에서 보존된 N-연결 글라이코실화 부위(conserved N-linked glycosylation site)를 포함한다. 이러한 잔기에 연결된 올리고당의 글라이코실화 패턴의 변형은 Fc 수용체와 반응하면서 Fc 영역에 의해 매개되는 작용긴으을 증가시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 조작된(engineered) 글라이코폼은 다양한 목적에 사용될 수 있다-작용기의 증가 또는 감소를 포함하나 이에 제한되지 않음. 조작된 글라이코폼은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법으로 만들어질 수 있는데, 예를 들면 조작 또는 변이 발현 스트레인을 사용하거나 하나 또는 그 이상의 효소(예, β (1,4) -N- 아세틸글루코사미닐 트랜스퍼레이즈 IIIㄴ9 β (1,4) -N- acetylglucosaminyl transferase III)를 동시발현시키거나, 다양한 생물체의 Fc 영역을 포함하는 또는 다양한 생물체의 세포주를 포함하는 분자를 발현시키거나, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시킨 이후에 탄수화물(들)을 변형시키는 방법 등이 있다.

조작된 글라이코폼을 만드는 방법은 이 기술분야에 널리 알려져 있는데, 다음 문헌에 기재되어 있는 것을 포함하나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다: US6,602,684(Umana et al); US20030157108(Presta et al); Umana et al.,(1999); Davies et al.,(2001); Shields et al.,(2002); Shinkawa et al.,(2003); 그리고 Potelligent™ 기술(Biowa, Inc., Princeton, NJ, U.S.)과 GlycoMAb™ 글라이코실화 공학 기술(GLYCART Biotechnology AG, Schlieren, CH)와 관련된 특허 및 특허출원.

따라서 다른 측면에서 본 발명은 본 명세서의 다른 부분에 기재된 hCMV 결합 멤버를 포함하는데, 상기 결합 멤버는 Fc 영역 또는 적어도 IgG CH2 영역을 포함하는 등가 영역을 포함하고 하나 또는 그 이상의 작용기를 증가시키기 위해 변형된다. 일 구체예에서 상기 결합 멤버는 변형되어 Asn 297에서 N-연결 올리고당 글라이코실화 패턴을 변화시켜서, 하나 또는 그 이상의 작용기의 활성이 증가된다. 다른 구체예에서, 상기 결합 멤버는 변형되어 Fc 영역의 아미노산 서열을 변화시켜서, 하나 또는 그 이상의 작용기의 활성이 증가된다.

본 발명의 결합 멤버는 감지 가능성 또는 기능성이 있는 라벨이 붙을 수 있다. 그리하여 결합 멤버 또는 항체 분자는 감지가능한 그리고/또는 정량이 가능한 신호를 얻기 위해 이뮤노컨쥬게이트 형채로 나타날 수 있다. 이뮤노컨쥬게이트는 예를 들면 항체 Ab-01에서 Ab-50 중 어느 하나와 같은 본 발명의 항체 분자를 포함할 수 있고 감지가능하거나 기능성 있는 라벨이 붙을 수 있다. 신호를 생산할 수 있거나 신호 생산을 유도할 수 있는 분자라면 어느 것이나 라벨이 될 수 있는데 형광크롬(fluorochromes), 방사성 라벨(radiolabels), 효소, 화학발광체(chemiluminescers) 또는 광감지제(photosensitizers) 등을 포함하나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서 형광, 발광, 방사성, 효소 활성 또는 흡광을 감지하여 결합을 감지하고 그리고/또는 측정할 수 있다.

적당한 라벨은 다음을 포함하나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다: 알칼린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase'), 알파-D-갈락토시데이즈(alpha-D-galactosidase), 글루코오스 옥시데이즈(glucose oxydase), 글루코오스 아밀레이즈(glucose amylase), 카보닉 언하이드레이즈(carbonic anhydrase), 아세틸콜린에스테레이즈(acetylcholinesterase), 라이소자임(lysozyme), 말레이트 디하이드로제네이즈((malate dehydrogenase) 및 퍼옥시데이즈(peroxidases)(예, 호스래디쉬 퍼옥시데이즈( horseradish peroxidase))와 같은 효소들; 염료(dyes); 플루오로레세인(fluorescein) 및 그 유도체와 같은 형광 라벨 또는 형광크롬, 로다민(rhodamine) 화합물 및 그 유도체, 녹색/노랑 형광 단백질(G/YFP), 붉은색 형광 단백질(RFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 단실(dansyl), 움벨리페론(umbelliferone), 파이코에리트린(phycoerythrin), 파이코야닌(phycocyanin), 알로파이코야닌(allophycocyanin), o-프탈데하이드(o-phthaldehyde), 및 플루오레사민(fluorescamine); 란타나이드 크립테이트(lanthanide cryptates)와 같은 플루오로포어 및 킬레이트, 예, 유로피움(Europium) 등(Perkin Elmer and Cis Biointernational), 화학 발광 표지(chemoluminescent labels) 또는 이소루미놀(isoluminol), 루미놀(luminol) 및 디옥세테인(dioxetanes)과 같은 화학발광자(chemiluminescers); 루시페레이즈(luciferase) 및 루시페린(luciferin)과 같은 바이오-발광표지(bio-luminescent labels); 센서타이저(sensitizers); 조효소(coenzymes); 엔자임 기질(enzyme substrates); 브로민77(bromine77), 카본14(carbon14), 코발트57(cobalt57), 플루오린8(fluorine8), 갈륨67(gallium67), 갈륨68(gallium 68), 하이드로겐3(hydrogen3) (tritium), 인디움111(indium111), 인디움113m(indium113m), 이오다인123m(iodine123m), 이오다인125(iodine125),이오다인126(iodine126), 이오다인131(iodine131), 이오다인133(iodine133), 머큐리107(mercury107), 머큐리203(mercury203), 포스포러스32(phosphorous32), 레늄99m(rhenium99m), 레늄101(rhenium101), 레늄105(rhenium105), 루테늄95(ruthenium95), 루테늄97(ruthenium97), 루테늄103(ruthenium103), 루테늄105(ruthenium105), 스칸디움47

(scandium47), 셀레늄75(selenium75), 설퍼35(sulphur35), 테크네튬99(technetium99), 테크네튬99m(technetium99m), 텔레룸(tellurium121m), 텔레룸(tellurium122m), 텔레룸125m(tellurium125m), 툴륨165(thulium165), 툴륨167(thulium167), 툴륨168(thulium168), 이트륨199(yttrium199) 및 본 명세서에 언급된 다른 방사성표지들을 포함하나 이에 제한되지 않는 방사성표지; 라텍스나 탄소 입자와 같은; 금속 졸(metal sol); 크리스탈라이트(crystallite); 리포솜(liposomes); 세포 등. 이는 염료, 촉매 또는 다른 감지가능한 군, 바이오틴, 다이그옥시제닌(digoxygenin) 또는 5-브로모디옥시유리딘(5-bromodeoxyuridine)과 같은 분자들; 슈도모나스 엑소톡신(Pseudomonas exotoxin)(PE 또는 사이토톡식 단편 또는 그 돌연변이), 디프테리아 톡신(Diptheria toxin) 또는 사이토톡식 단편 또는 그 돌연변이, 보튤리늄 톡신(botulinum toxin) A, B, C, D, E 또는 F, 라이신(ricin) 또는 와 같은 사이토톡식 단편(예, 라이신A), 애브린(abrin) 또는 그 사이토톡식 단편, 사포린(saporin) 또는 그 사이토톡식 단편, 미국자리공 안티바이러스 톡신(pokeweed antiviral toxin) 또는 그 사이토톡식 단편 그리고 브리오딘 1(bryodin 1) 또는 그 사이토톡식 단편 or a cytotoxic fragment thereof와 같은 군으로부터 선택되는 톡신 모이어티로 더 표지될 수 있다.

적당한 효소 및 조효소는 US4,275,149(Litman et al) 및 US4,318,980(Boguslaski et al)에 개시되어 있고 적당한 형광물질 및 화학발광물질은 US4,275,149에 개시되어 있으며, 이들 전체 문헌은 참조문헌으로서 본 명세서의 일부로 포함된다. 라벨은 바이오틴과 같은 화학 모이어티를 더 포함할 수 있는데, 바이오틴은 동종의 감지가능한 모이어티인 표지된 아비딘(avidin), 스트렙트아비딘(streptavidin), 또는 스트렙택틴(streptactin) (IBA GmbH, Gottingen, DE)과 같은 유전적으로 조작된 스트렙트아비딘 등에 특이적으로 결합함으로써 감지될 수 있다. 감지가능한 표지들은 이 기술분야에 알려진 일반적인 화학요법을 이용하여 항체에 부착될 수 있다.

이뮤노컨쥬게이션 또는 이들의 기능적 단편들은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법으로 준비될 수 있다. 이뮤노컨쥬게이션은 효소 또는 형광 표지에 직접 연결되거나 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)와 같은 폴리알데하이드, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), DPTA (diethylene-triaminepentaacetic acid) , 또는 치료용 컨쥬게이트에 대해 앞서 언급한 것과 같은 커플링제의 존재 하에, 스페이서 그룹 또는 연결 그룹의 매개로 연결될 수 있다.

치료용 방사성 동위원소를 앞서 언급한 EDTA, DPTA와 같은 킬레이트제를 매개로 하거나 또는 직접적으로 항체에 연결하는 기술로 통상의 기술자들에게 알려진 기술이 진단에 사용될 수 있는 방사성 요소로 사용될 수 있다. 또한 클로라민 T(chloramine T) 방법(Hunter & Greenwood, 1962)을 이용하여 소듐125로 표지할 수 있고, 또는 US4,424,200(Crockford & Rhodes)에 기재된 기술로 테크네튬-99m(Tc-99m)을 이용하거나 또는 US4,479,930(Hnatowich)에 기재된 것과 같이 DTPA를 경유해 부착할 수 있다. 양쪽 기술은 모두 전체 문헌이 참조문헌으로서 본 명세서의 일부로 포함된다.

상기 라벨이 외부 수단(means)을 이용하여 감지가능한 신호를 생산할 수 있는 많은 방법이 있다. 외부 수단의 예로는, 시각적 조사, 전자기 방사, 혈 및 화학 시약이 있다. 또한 상기 표지는 본 발명의 결합 멤버에 결합하는 다른 결합 멤버 또는 지지체(supporter)에 결합될 수 있다.

상기 표지는 직접적으로 신호를 생산할 수 있고, 따라서 신호를 생산하기 위해 추가 성분을 필요로 하지 않는다. 형광 물질과 같은 많은 유기 분자들은 자외선 및 가시광선을 흡수할 수 있는데, 여기서 흡광은 에너지를 이 분자들에 전달하여 이들을 여기 에너지 상태로 상승시킨다. 이 흡수 에너지는 그 다음 제2 파장에서 방출되어 소멸된다. 이 제2 파장 방출은 에너지를 표지 수용 분자에 전달하고, 그 결과로 생긴 에너지는 FRET (fluorescence resonance energy transfer)와 같은 빛의 방출에 의해 수용 분자들로부터 소멸된다. 신호를 직접 생산하는 다른 표지들은 방사성 동위원소 및 염료를 포함한다.

이와 달리, 상기 표지는 신호를 생산하기 위해 주가 성분이 필요할 수 있고, 그리고 신호 생산 시스템은 측정할 수 있는 신호를 생산하는 데 필요한 모든 성분을 포함할 수 있다. 여기에는 기질, 조효소, 강하제, 부가 효소, 효소성 산물과 반응하는 기질, 촉매, 활성인자(activator), 보조인자(co-factors), 저해제, 스캐빈저(scavengers), 금속 이온, 및 신호 생성 기질 결합용 특정 결합 물질이 포함될 수 있다. 적당한 신호 생성 시스템에 대한 상세한 논의는 US5,185,243(Ullman et al)에서 발견할 수 있다. 본 발명은 hCMV 특이적인 결합 멤버의 결합 방법을 제공한다. 언급한 것과 같이, 이러한 결합은 in vivo에서 발생할 수 있는데, 결합 멤버 또는 결합 멤버를 암호화하는 핵산의 투여를 예로 들 수 있다. 또는 이러한 결합은 in vitro에서 발생할 수 있는데, ELISA, 웨스턴 블랏팅, 친화 크로마토그피, 면역세포화학, 면역침전, 중화 및 생화학 또는 세포 기반 분석을 예로 들 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 결합 멤버를 이용하여 바이오센서 시스템과 같은 곳에서 항원의 수준(level)을 직접적으로 측정하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 hCMV에 결합하는 것을 감지 및/또는 측정하는 방법을 포함하는데, (i) 상기 hCMV에 대한 결합 멤버를 노출시키고, (ii) 상기 hCMV에 대한 결합 멤버를 감지하는 것을 포함한다. 여기서 결합은 본 명세서에서 언급한 모든 방법 또는 감지가능 표지를 이용하여 감지된다. 이러한 방법과 본 명세서에 언급된 결합을 감지하는 다른 모든 방법은, 감지가능 표지를 시각적으로 관찰하는 것과 같이, 그 방법을 수행하는 사람들에게 직접적으로 설명될 수 있다. 이외에, 이러한 방법과 본 명세서에 언급된 결합을 감지하는 다른 모든 방법은, 방사능 사진, 사진, 컴퓨터 프린트 출력물 또는 플로우 사이토메트리 리포트, 그래프, 차트, 테스트 튜브, 결과물을 포함한 컨테이너나 웰(well) 또는 이 방법의 결과물을 표시하는 다른 시각적 또는 물리적 표시장치의 형태로 리포트를 생산할 수 있다.

hCMV에 대한 결합 멤버의 결합량이 결정될 수 있다. 정량화는 테스트 샘플 내의 항원의 양과 관계가 있을 수 있는데, 진단에서 관심을 보일 수 있다. hCMV 결합에 대한 스크리닝 및/또는 이의 정량화는, 예를 들면, 본 명세서에서 언급하는 질병이나 질환 및/또는 비정상적인 hCMV 발현 및/또는 활성과 연관된 다른 어떠한 질환이나 질병을 가진 환자를 스크리닝하는 데 유용할 수 있다.

진단 방법은, (i) 피험자로부터 조직 또는 체액(fluid)을 얻는 단계; (ii) 상기 조직 또는 체액 샘플을 본 발명의 하나 또는 그 이상의 결합 멤버에 노출시키는 단계; 그리고 (iii) 대조군 샘플과 비교하면서 결합 hCMV를 감지하는 단계를 포함하고, 여기서 대조군과 비교하여 hCMV 결합량이 증가한 것은 hCMV 발현 및/또는 활성을 나타낸다. 테스트되는 조직 또는 체액 샘플은 혈액, 혈장, 침, 오줌, 가래, 생체검사 시료(material), 또는 hCMV에 감염되었을 것으로 의심되는 다른 조직을 포함한다. hCMV에 대한 양성 테스트 피험자는 후술하는 치료 방법으로부터 이점이 있다. 이 기술분야의 통상의 기술자들은 그들의 선호와 지식에 따라 본 명세서에 개시된 방법을 고려하여 결합 멤버의 결합을 결정하는 것에 대한 적절한 모드를 선택할 수 있다.

샘플의 결합 멤버의 반응성은 적절한 어떠한 수단에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 분석은, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P or 35S와 같은 방사성 표지가 된 방사성 항원, 또는 리포터 분자에 연결된 항원 또는 그 유사체를 사용하는비방사성 항원을 가지고 이용될 수 있다. 리포터 분자는 형광크롬, 인광물질(phosphor), 또는 스펙트럼으로 분리된 흡수대(spectrally isolated absorption) 또는 발광 특성을 가지는 레이저 염료 일 수 있다. 적당한 형광크롬은 플루오로세신, 로다민, 파이코에리트린 및 텍사스 레드, 그리고 란타나이드(lanthanide) 킬레이트 또는 크립테이트(cryptate)를 포함한다. 적당한 크로모제닉(chromogenic) 염료는 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 포함한다.

다른 리포터들로 거대분자 콜로이드성 입자 또는 채색된 라텍스 비드와 같은 입자화 물질, 자성 또는 상자성 및 생물학적 또는 화학정 활정제이 있는데, 시각적 관찰, 전기적 감지 또는 다른 방식으로 기록될 수 있게, 직접적 또는 간접적으로 감지 가능한 신호를 생산할 수 있다. 이 분자들은 효소일 수 있는데, 예를 들면, 반응이 진행되도록 촉매하거나 색깔을 변화시키거나 또는 전기적 성질을 변화시킨다. 이 분자들은 흥분성 분자이어서 에너지 상태에 따른 전기적 전이로 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방출이 나타난다. 이는 바이오센서와 결합되어 사용될 수 있는 화학적 실체(entity)를 포함할 수 있다. 바이오틴/아비딘 또는 바이오틴/스트렙트아비딘 그리고 알칼린 포스페테이즈 또는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 감지 시스템이 이용될 수 있다.

개별 결합 멤버-리포터 결합물에 의해 생산된 신호는 샘플에 결합한 관련 결합 멤버의 정량화 가능한 절대 또는 상애적 데이터를 얻는데 이용될 수 있다(정상 및 테스트).

본 발명의 어떠한 측면 또는 구체예에 따른 결합 멤버를 포함하는 키트를 제공한다. 키트에서, 결합 멤버는 표지되어서, 후술하는 것과 같이, 그것의 샘플 내 반응성을 결정할 수 있게 해준다. 또한 결합 멤버는 고체 지지체(support)에 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있다. 키트의 구성 성분은 일반적으로 멸균되고 바이얼(vials) 또는 다른 용기로 밀봉된 상태이다. 키트는 진단 분석 또는 결합 멤버가 유용한 다른 방법에 이용될 수 있다. 키트는 본 발명에 따른 방법과 같이, 방법을 수행시의 성분 사용에 대한 설명서(instructions)를 포함할 수 있다. 이 방법을 수행하거나 도와주는 데 필요한 보조 재료들이 본 발명의 키트 안에 포함될 수 있다. 보조 재료는 제1 결합 멤버에 결합하고 감지 가능 표지(예, 형광성 표지, 방사성 동위원소 또는 효소)에 붙는 제2의 서로 다른 결합 멤버를 포함할 수 있다. 항체-기반 키트는 또한 면역침전을 수행하는 비드를 포함할 수 있다. 키트의 각 구성성분은 일반적으로 적당한 그들의 용기 내에 있다. 그리하여 일반적으로 이 키트들은 각각의 결합 멤버에 적당한 분리된 용기(distinct containers)를 포함한다. 게다가 이 키트는 분석 수행 방법 및 분석 수행의 결과 데이터를 해석하고 분석하는 방법에 대한 설명서를 포함한다.

또한 본 발명은 앞서 언급한 경쟁 분석에서 항원 수준을 측정한 것과 같이 결합 멤버의 사용을 제공한다. 즉 경쟁 분석에서 본 발명의 결합 멤버를 사용하여 샘플 내 항원 수준을 측정하는 방법에 대한 것이다. 이는 비결합 항원으로부터 결합 항원을 물리적으로 분리할 필요가 없다. 리포터 분자를 결합 멤버에 연결하여, 결합했을 때 물리적 또는 시각적 변화를 일으키는 것도 가능하다. 상기 리포터 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 감지가능한 신호를 발생시킬 수 있고, 이는 정량화할 수 있다. 리포터 분자의 연결은 펩타이드 결합 또는 비공유결합을 통하는 것과 같이 직접적 또는 간접적일 수 있다. 펩타이드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 암호화하는 유전자 융합의 재조합 발현의 결과일 수 있다.

본 발명의 다양한 측면 및 구체예에서, 본 발명은 IgG 포맷으로 여기에 정의된 항체 Ab-01에서Ab-50 중 어떤 항체를 가지고 hCMV에 대한 결합 경쟁을 하는 결합 멤버까지 확장된다. 결합 멤버 사이의 경쟁은, in vitro로 분석될 수 있는데, 예를 들면 다른 태그되지 않은 결합 멤버의 존재 하에 감지될 수 있는 하나의 결합 멤버에 특정 리포터 분자를 태그하는 것이다. 이러한 in vitro 분석은 어떤 결합 멤버가 같은 에피토프 또는 겹쳐지는 에피토프에 결합하는지 확인할 수 있게 해 준다. 경쟁은 예를 들면, ELISA 또는 표면 플라스몬 공명에 의해 확인할 수 있는데, hCMV가 고체상에서 고정되고 제1 태그 또는 표지된 결합 멤버와 하나 또는 그 이상의 태그되지 않거나 표지되지 않은 결합 멤버가 고체상에 첨가된다. 태그된 결합 멤버와 경쟁하는 태그되지 않은 결합 멤버의 존재가 태그된 결합 멤버의 신호 방출이 감소됨으로써 관찰된다.

예를 들면, 본 발명은 hCMV 결합 화합물을 확인하는 방법을 포함하는데, (i) gB 단백질을 지지체상에 고정하고, (ii) 상기 지지체 상에 고정된 gB 단백질을, 동시에 또는 단계적 방법으로, 적어도 하나의 태그된 또는 표지된 본 발명의 결합 멤버 및 하나 또는 그 이상의 태그되지 않거나 표지되지 않은 테스트 결합 화합물과 접촉시키고, 그리고 (iii) 태그된 결합 멤버로부터 결합 태그의 양이 감소하는 것을 관찰함으로써 새로운 hCMV 결합 화합물을 확인하는 것을 포함한다. 이러한 방법들은 멀티웰 또는 어레이 포맷을 사용하여 고용량 처리방식(high-throughput manner)으로 수행될 수 있다. 이러한 분석들은 용액 상에서 수행될 수도 있다. 예를 들면 US5,814,468(Sliman et al)를 참고하는데, 이는 참조문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 위에 언급한 것과 같이, 결합 감지는 이 방법을 수행하는 사람들이 직접적으로 알아볼 수 있는데, 예를 들면 감지가능 표지를 시각적으로 관찰하거나 감지가능 표지의 존재를 감소시킴으로써 알아볼 수 있다. 이와 달리, 본 발명의 결합 방법은, 방사능 사진, 사진, 컴퓨터 프린트 출력물 또는 플로우 사이토메트리 리포트, 또는 이 방법의 결과물을 표시하는 다른 시각적 또는 물리적 표시장치의 형태로 리포트를 생산할 수 있다.

또한 경쟁 분석은 에피토프 정의(epitope characterisation )에 이용될 수 있다. 일례로, 에피토프 정의는 선택적으로 최적화된 중화 및/또는 조절 특성을 가지는 CMV 결합 멤버에 결합된 에피토프를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 에피토프는 선형 또는 입체형태일 수 있다. 입체형태 에피토프는 적어도 두 개의 서로 다른 hCMV를 포함할 수 있고, 여기서 상기 도메인은, hCMV 단백질이 3차원 또는 4차원 구조로 접히면서 hCMV 저해제에 의해 인식되는 에피토프를 형성할 때, 서로 근접한 위치에 위히한다. 항원의 펩타이드 단편 경쟁을 테스트하는 것이 이용될 수 있는데, 특히 관심 있는 에피토프로 구성되거나 이를 포함하는 펩타이드에 대해서이다. 에피토프 서열과 양쪽 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열이 더해진 펩타이드가 이용될 수 있다. 본 발명의 결합 멤버는, 그들의 항원 결합이 주어진 서열을 가지거나 포함하는 펩타이드에 의해 저해될 수 있다.

또한 본 발명은 결합 멤버를 암호화하는 분리 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 일례로, 본 발명은 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 앞서 정의된 본 발명의 scFv or IgG1 와 같은 항체 분자를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 앞서 언급한 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구조체를 제공한다.

본 발명은 앞서 언급한 하나 또는 그 이상의 구조체를 포함하는 재조합 숙주세포를 제공한다. CDR 또는 CDR 세트 또는 V_H 도메인 또는 V_L 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 앞서 정의된 본 발명의 scFv or IgG1 와 같은 항체 분자를 암호화하는(encoding) 핵산은 그 자체로 본 발명의 한 측면을 형성한다. 암호화된 산물의 생산 방법도 마찬가지로 본 발명의 한 측면을 형성하는 데, 상기 방법은 암호화하는 핵산으로부터의 발현을 포함한다. 적당한 조건에서 핵산을 포함하는 상기 숙주세포를 배양하여 쉽게 발현을 이룰 수 있다. 본 명세서에 기재된 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 결합 멤버의 발현에 생산물이 얻어지고, 결합 멤버는 이 기술분야에 알려진 적당하고 적절한 기술을 이용하여 분리 및/또는 정제된다.

본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고 전제 또는 일부분을 합성할 수 있다. 여기 설명된 핵산 서열에 대한 레퍼런스로, 만약 전후 사정상 다른 것을 필요로 하지 않는다면, 구체적 서열을 가진 DNA 분자를 포함하고 T가 U로 치환된 구체적 서열을 가진 RNA 분자를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 V_H 및/또는 V_L 변이 도메인을 포함하는 결합 멤버 생산 방법을 제공하고, 상기 방법은 핵산을 암호화하여 발현시키는 것이 포함된다. 이러한 방법은 상기 항체 VH 및/또는 VL 변이 도메인 생산용 조건 하에서 재조합 숙주세포를 배양하는 것을 포함한다.

생산 방법은 상기 생산물의 분리 및/또는 정제방법을 포함한다. 생산 방법은 생산물을 약제학적 활성 첨가제와 같은 적어도 하나의 첨가 성분을 포함하는 성분으로 조제하는 것을 포함한다.

다양한 서로 다른 숙주세포로 클로닝 및 발현을 하기 위한 시스템이 잘 알려져 있다. 적당한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 식물세포, 사상균(filamentous fungi), 이스트, 곤충세포 및 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 원핵세포의 항체 및 항체 단편의 발현은 이 기술분야에서 잘 구축되어 있다. 검토를 위해 Pluckthun(1991)를 참고하라. 일반적인 박테리아 숙주는 E. coli 이다.

결합 멤버 생산의 옵션으로서 배양시 진핵세포에서의 발현은 이 기술분야의 통상의 기술자가 쉽게 이용할 수 있다(Chadd & Chamow, 2001; Andersen & Krummen, 2002; Larrick & Thomas, 2001). 이 기술분야에서 이형(heterologous) 폴리펩타이드 발현용으로 이용할 수 있는 포유류 세포는 CHO(Chinese hamster ovary)세포, 헬라세포(HeLa cells), BHK(baby hamster kidney)세포, NS0 마우수 멜라노마 세포(NS0 mouse melanoma cells), YB2/0 랫트 마이엘로마 세포(YB2/0 rat myeloma cells), HEK(human embryonic kidney)세포, 인간 배아 망막세포(human embryonic retina cells) 및 많은 다른 것들을 포함한다.

적당한 조절서열을 포함하고 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 서열 및 적당한 다른 서열을 포함하는 적절한 벡터가 선택되거나 제작될 수 있다. 벡터는 적절하게, 플라스미드, 파지미드, 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다 Sambrook & Russell, 2001). 알려진 많은 기술 및 예를 들면, 핵산 구조물(constructs) 준비, 돌연변이유발(mutagenesis), 시퀀싱, 세포에 DNA 도입 및 유전자 발현과 같은 핵산 조작 프로토콜 뿐만 아니라 단백질 분석이 Ausubel et al., (1999)에 상세히 기재되어 있다.

다른 측면에서 본 발명은 여기 기재된 핵산을 포함하는 숙주세포을 제공한다. 이러한 숙주세포는 in vitro로 유지될 수 있거나 조직배양으로 번식될 수 있다. 이러한 숙주세포는 또한 예를 들면, 복수(ascites)에서 결합 멤버를 생산하기 위해 in vivo 로 유지될 수 있다. 숙주세포의 in vivo 존재는 '인트라바디(intrabodies)' 또는 세포내 항체(intra-cellular antibodies)와 같이 본 발명의 결합 멤버의 세포 내 발현(intra-cellular expression)이 이루어질 수 있도록 한다. 인트라 바디는 유전자 치룡용으로 이용될 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명의 핵산을 숙주세포에 도입하는 것을 제공한다. 상기 도입은 이용 가능한 어떠한 기술이라도 이용할 수 있다. 진핵세포에서, 적당한 기술은 칼슘 포스페이트 형질감염법(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 레트로바이러스 또는 다른 바이러스(예, 우두(vaccinia))를 사용한 형질유도(transduction), 곤충세포로 배큘로바이러스 또는 이들의 조합을 사용한 형질유도를 포함한다. 특히 진핵세포에서 숙주세포에 핵산을 도입하기 위해 바이러스 또는 플라스미드 기반 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피솜으로 유지되고 숙주세포 지놈(genome) 속으로 결합될 수 있거나 인공 염색체로 결합될 수 있다. 결합은 단일 또는 복수(multiple) 로사이(loci)에서 하나 또는 그 이상의 카피가 무작위로 결합되거나 타겟을 정해놓고 결합될 수 있다. 박테리아 세포에서 적당한 기술은 염화칼슘 형질전환(transformation), 전기천공법 및 박테리오파지를 이용한 형질감엽법을 포함한다.

도입이 일어난 다음에는, 예를 들면 결합 멤버의 발현 조건 하에서 숙주세포를 발현시킴으로써 핵산으로부터 발현이 야기되거나 발현이 일어날 수 있다. 발현 산물의 정제는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 핵산은 숙주세포의 지놈(예, 염색체) 속으로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 지놈으로의 재조합을 촉진하는 서열 봉입(inclusion)에 의해 촉진될 수 있다.

또한 본 발명은 위에서 언급한 결합 멤버 또는 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 발현 시스템에서, 앞서 언급한 구조물을 사용하는 것을 포함한다.

본 명세서의 다른 부분에서 언급한 것과 같이, 다양한 질환에 hCMV 감염이 관계되어 있다는 증거가 있다. 그러므로 본 발명의 결합 멤버는 hCMV 감염과 연관된 질환의 진단 또는 치료방법으로 사용될 수 있다. 이러한 질환은 동종이식(allograft)을 받은 사람, HIV 감염 환자와 같은 면역약화(immunocompromised) 환자에게 영향을 줄 수 있다. 이러한 질환의 예는 다음과 같다: 열(fever), 간염(hepatitis), 망막염(retinitis), 폐렴(pneumonitis), 골수억제(myelosuppression), 뇌병(encephalopathy), 신경근병증(polyradiculopathy), 면역억제(immunosuppression), 거부/이식편대숙주병(rejection/graft-versus-host disease ) 또는 죽상동맥경화증(atherosclerosis).

따라서 본 발명은 hCMV와 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 결합 멤버 단독으로 또는 이 기술분야에 알려졌거나 본 명세서에 기재된 다른 적절한 치료제와 함께 병용 치료 조제하여(combined therapeutic regimen), 필요한 환자에게 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다.

특정 질환이 hCMV 감염과 연관이 있다는 것에 대한 증거는 본 명세서의 다른 부분에서 요약하고 있다. 또한 여기 제시된 데이터는 본 발명의 결합 멤버는 예방적 치료 및 질환의 심각성을 완화시키는 것을 포함하여, 이러한 질환들의 치료에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 명세서에 언급된 질환 중 어느 하나의 치료 또는 적어도 하나의 증상이 심해지는 것을 완화시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 결합 멤버 단독으로 또는 이 기술분야에 알려졌거나 본 명세서에 기재된 다른 적절한 치료제와 함께 병용 치료 조제하여(combined therapeutic regimen), 필요한 환자에게 유효한 양을 투여하여 상기 언급한 질환 중 어느 하나의 질환이 심해지는 것을 완화시킨다.

따라서 본 발명의 결합 멤버는, 특히 바이러스가 많은(high viral load) 환자로부터 발생하는, hCMV 감염 및/또는 활성이 관연하는 질병 또는 질환의 치료시 치료제로서 유용하다. 치료 방법은, 필요한 환자에게, hCMV의 비정상적 감염 및/또는 활성이 감소되는, 본 발명의 결합 멤버의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 치료 방법은, (i) 예를 들면, 앞서 언급된 진단 방법을 이용하여 hCMV 감염 수준 또는 활성을 나타내는 환자를 확인하고, (ii) hCMV의 비정상적 감염 및/또는 활성이 감소되는, 본 발명의 결합 멤버의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 유효량이란, hCMV 발현 및/또는 활성을 감소시키는 양인데, hCMV 감염 또는 치료되어야 할 특정 질병이나 질환이 반드시 치료되어야 하는 것은 아니지만, 상기 질병이나 질환의 적어도 하나의 증상의 심각성을 감소시키거나 경감시키기 위해 필요한 양이다.

본 발명은 hCMV 감염에 대한 적어도 하나의 효과를 중화하는(antagonize) 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 결합 멤버의 유효량을 접촉시키거나 투여하여 상기 적어도 하나의 hCMV 감염 효과를 중화시키는 것을 포함한다. 따라서 다른 측면에서 본 발명은 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 준비된 결합 멤버, 이 결합 멤버를 포함하는 약제학적 성분을 투여하고 투여용 치료제 제조에 결합 멤버를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들면 약제학적 활성 첨가제와 함께 결합 멤버를 조제하는 것을 포함하는 치료제 또는 약제학적 성분을 제조하는 방법을 포함한다. 약제학적 활성 첨가제는 제2 반응을 유발하지 않고 약제학적 성분에 들어가는 화합물 또는 화합물 조합일 수 있는데, 이는 활성 화합물(들)의 투여를 촉진하거나 체내에서 활성 화합물의 수명 및/또는 효능을 증가시키거나 용액의 용해성을 증가시키거나 그 외에 활성 화합물의 보존성을 향상시킬 수 있다. 이 약제학적으로 허용가능한 담체들은 이 기술분야에 잘 알려져 있고, 선택된 활성 화합물(들)의 천연 기능과 투약 모드와 같이 통상의 기술자들이 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 결합 멤버는 일반적으로 약제학적 성분 형태로 투여될 수 있는데, 결합 멤버에 적어도 하나의 성분을 더 포함할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 약제학적 성분과 본 발명에 따른 사용을 위한 약제학적 성분은, 활성 성분에 약제학적 활성 첨가제, 캐리어, 버퍼, 안정화제 또는 이 기술분야에 알려진 다른 물질들을 더 포함할 수 있다. 이러하 물질들은 비독성이고 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 캐리어 또는 다른 물질의 세부적 성질은 투여 경로에 따를 수 있다. 투여의 경로는, 후술하는 것과 같이, 경구, 흡입, 기관 내(intra-tracheal), 국소, 소포내(intra-vesicular) 또는 주사(injection)일 수 있다.

경구 투여용 약제학적 조성물은 태블릿, 캡슐, 파우더, 액체 또는 반고형(semisolid form)일 수 있다. 태블릿은 젤라틴 또는 어쥬반트와 같은 고체 캐리어를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유(petroleum), 동물 또는 야채 오일, 미네랄 오일, 또는 합성 오일과 같은 액체 캐리어를 포함할 수 있다. 생리 식염수, 덱스트로스, 또는 다른 당용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.

정맥 내 주사(intra-venous injection) 또는 다른 고통이 일어나는 장소에 주사하기 위해, 활성 성분은, 주사용(pyrogen-free )이고 적당한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는, 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태일 것이다. 이 기술분야에서 이와 관련된 기술은, 예를 들면 소듐 클로라이드 주사(Sodium Chloride Injection), 링거 주사(Ringer's Injection), 락테이티드 링거 주사(Lactated Ringer's Injection)와 같은 등장성 전달물질 (isotonic vehicles)을 사용하여 적당한 용액으로 준비될 수 있다.

보존제, 안정제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제들이 필요에 따라 사용될 수 있다. 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산 및 메티오닌과 같은 항산화제; 보존제(예, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메토늄 클로라이드(hexamethonium chloride); 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride); 벤즈토늄 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀(phenol), 부틸 또는 벤질 알콜(butyl or benzyl alcohol); 알킬 파라벤(alkyl parabens, 예, 메틸 또는 프로필 파라벤); 카테콜(catechol); 레조르시솔(resorcinol); 사이클로헥사놀(cyclohexanol); 3'-펜타놀(3'-pentanol); 및 m-크레솔(m-cresol)); 저분자량 폴리펩타이드; 단백질(예, 알부민 혈철, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린); 친수성 폴리머(예, 폴리비닐피놀리돈); 아미노산(예, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신); 단당류(monosaccharides), 이당류(disaccharides) 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제(예, EDTA); 당(sugars)(예, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨); 염 형성 반대이온(salt-forming counter-ions, 예, 소듐); 금속 복합체(예, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온 계면활성제(예, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 PEG (polyethylene glycol))이 포함된다.

본 발명의 결합 멤버는 분자의 물리화학 성질 및 전달 경로에 따라 액체, 반고체, 또는 고체 형태로 조제될 수 있다. 제제(formulation)은 첨가제, 첨가제 조합을 포함할 수 있다(예, 당, 아미노산 및 계면활성제). 액체 제제는 다양한 범위 항체 농도 및 pH 범위를 포함할 수 있다. 고체 제제는 동결 건조(lyophilisation), 스프레이 건조 또는 초임계 유체에 의한 건조 등에 의해 생산될 수 있다. 결합 멤버 제제는 의도된 전달 경로를 따를 것이다. 결합 멤버는, 약물 조절 방출 제제(controlled release formulation)과 같이 빠른 방출에 대항하여 결합 멤버를 보호하는 캐리어를 이용하여 조제될 수 있는데, 임플란트, 경피 패치(transdermal patches) 및 마이크로캡슐화 전달시스템(microencapsulated delivery systems )을 포함한다. 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate), 폴리언하이드라이드(polyanhydrides), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid), 콜라겐(collagen), 폴리오르쏘에테르(polyorthoesters) 및 폴리락틱산(polylactic acid)과 같은 생분해성, 생체호환성 폴리머를 이용할 수 있다. 이러한 제제를 준비하는 많은 방법들이 이 기술분야에 알려져 있다(Robinson, 1978).

치료는 경구적일 수 있고 또는 주사(예, 피하, 관절 내, 정맥 내, 복막 내, 동맥 내 또는 근육 내), 흡입, 기관 내(intra-tracheal), 소포 내(방광 속으로 점적주입) 또는 국소 주사(눈 안, 코 안, 직장, 상처 속, 피부)로 주어질 수 있다. 상기 치료는 결합 멤버의 양(dose)을 줄이면서 펄스 인퓨전(pulse infusion)에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 분자의 물리화학적 성질에 의해 결정되며, 질환이 특별히 고려되고 최적화된 효능 및 부작용을 최소화 시킬 필요에 따라 투여 경로가 결정된다. 구체적 투여 경로는 정맥 내(intra-venous)이다. 다른 본 발명의 약제학적 성분의 투여 경로는 피하이다. 치료는 임상으로 한정해서 사용되지 않음을 명심해야 한다. 따라서 바늘이 없는 장치(needle-free device)를 이용한 피하 주사 역시 장점이 있다.

치료되어야 할 질환에 따라 동시 또는 연속적으로, 조성물이 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 투여될 수 있다.

본 발명의 결합 멤버는 추가적 치료 성분과 결합하여 병용 요법(combination therapy)일 부분으로 이용될 수 있다. 병용 요법은, 특히 본 발명의 항체 Ab-01에서 Ab-50

중 하나 또는 그 이상의 결합 멤버의 조합 또는 다음 공개기술에 기재된 hCMV 항체들과의 조합으로, 또는 다른 약물과의 조합으로 의미있는 시너지 효과를 제공할 수 있다: US5,043,281(Mashuho et al), US5,750,106 (Ostberg), WO93/021952 A1(Borrebaeck et al), WO08/084410 A2, WO10/007463 A1 and WO10/007533 A2(Lanzavecchia & Macagno), WO08/071806 A1, WO09/003975 A1 and WO09/024445 A1(Funaro et al), WO09/114560 A2(Olsen), WO10/114105 A1 and WO10/114106 A1(Takada et al). 본 발명의 결합 멤버는 병용 조제로서 다른 치료제 또는 치료제들과 함께, 본 명세서에 기재된 질환 목록의 하나 또는 그 이상의 질환의 치료를 위해, 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 결합 멤버는 키모센서타이저(chemosensitiser)로 사용될 수 있는데, 이에 의해 항바이러스제의 치료 효능을 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 결합 멤버는 하나 또는 그 이상의 항바이러스제와 조합하여 동시에 또는 연속적으로 투여되도록 제공될 수 있다.

본 발명의 결합 멤버는 하나 또는 그 이상의 항바이러스제와 결합하거나 또는 조합되어 제공될 수 있다(항 바이러스제의 예: acyclovir, famciclovir, valganciclovir, ganciclovir, cidofovir, amantadine, rimantadine, ribavirin, zanamavir 및/또는 oseltamavir).

본 발명의 결합 멤버와 하나 또는 그 이상의 첨가되는 치료 성분은 치료제 제조에 이용될 수 있다. 이 치료제는 개개의 환자에게 분리되거나 또는 조합되어 투여될 수 있다. 따라서 상기 치료제는 결합 멤버 및 추가 성분을 병용 제제(combined preparation) 또는 분리 제제(separate preparation)로서 포함할 수 있다. 분리 제제는 분리 및 연속 또는 동시 투여를 촉진하는 데 사용될 수 있고, 경구 또는 비경구 투여와 같이, 서로 다른 경로를 통해 성분들의 투여가 이루어지도록 해 준다.

본 발명에 따라, 제공된 조성물은 포유류에 투여될 수 있다. 일전적으로 "'치료적으로 유효한 양"이 투여되고, 환자에게 충분히 이득이 될 수 있다. 이러한 이득이란, 최소한 하나의 증상의 최소한의 완화일 수 있다. 실제 투여되는 양과 투여 흐름에 대한 비율 및 시간은 치료되어야 할 질환의 성질과 심각성에 달려 있는데, 특히 치료할 대상이 포유류인 경우, 질병의 원인, 조성물의 전달 장소, 결합 멤버 형채, 추여 방법, 투여 스케쥴 및 치료 의사가 알고 있는 다른 요소들에 달려 있다. 투여량(dosage) 결정과 같은 처방전은 가정의(general practitioner) 또는 다른 치료 의사에게 책임이 있고 치료될 질환의 증상의 심각도 및/또는 진행 정도에 달려 있다. 항체의 적당한 투여량은 이 기술분야에 잘 알려져 있다(Ledermann et al., 1991; Bagshawe et al., 1991). 본 명세서에 기재된 특정 투여량 또는 Physician's Desk Reference (2009)이 투여될 치료제의 형태에 적합하게 사용될 수 있다. 본 발명 결합 멤버의 치료적으로 유효한 양 또는 적당한 양은 in vitro 활성과 동물 모델의 in vivo 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 마우스 및 다른 테스트 동물에서 인간에 대한 유효한 양을 추론하는 방법은 알려져 있다. 구체적은 투여량은, 어떤 항체가 진단, 예방 또는 치료용인지, 치료될 부위의 크기와 위치, 항체의 세부 성질(예, 전체 항체 또는 단편) 및 항체에 부착되는 감지 표지 또는 다른 분자의 성질을 포함하는 다수의 요소에 따라 결정될 것이다. 전형적인 항체 투여량은, 시스템 투여시 100μg에서 1g 일 것이고, 국소 투여시 1μg에서 1mg일 것이다. 초기의 높은 로드의 투여량으로, 그 이후 하나 또는 그 이상의 낮은 투여량으로 투여될 수 있다. 일반적으로 항체는 전체 항체, 예를 들면 IgG1 아이소타입이다. 이것은 성인 환자에 대한 단일 투여량이고, 어린이, 유아 및 신생아들에 대해서븐 그 비율이 조절될 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷에 대해 조절될 수 있다. 치료는 의사의 재량에 따라, 매일, 격주(twice-weekly), 매주, 한달 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 매 2에서 4주에 피하 투여와 매 4에서 8주의 정맥 내 투여일 수 있다. 치료는 정기적일 수 있고, 투여 사이의 간격은 약 2주 또는 그 이상, 예를 들면 약 3주 또는 그 이상, 4주 또는 그 이상, 또는 약 한달 간격일 수 있다. 치료는 외과이식 전 및/또는 그 후일 수 있고, 그리고/또는 외과 치료의 해부 부위에 투여되거나 직접 도포될 수 있다.

본 발명의 결합 멤버는 앞서 기술한 바와 같이, 이 기술분야의 종래의 hCMV 항체와 비교하여, 투여 방법과 투여 요건에서 장점을 제공한다. 예를 들면, 항-hCMV 치료제의 투여량이 더 낮다면, 낮은 투여량이 피하 주사 및 정맥 내 주사를 촉진한다는 점에서 장점이 있다. 이 기술분야의 통상의 기술자에게 피하 투여량은 투여에 필요한 결합 멤버(예, 항체 분자)의 양에 의해 제한될 수 있다는 것이 알려져 있다. 왜냐하면 피하 주사는 피부의 한 곳에만 주사될 수 있는 부피에 의해 제한되기 때문이다. 피하 주사의 부피는 1.2ml 또는 그 이하인 것이 일반적이다. 50mg/ml 이상의 농도에서 피하 주사용 결합 멤버를 조제하는 것은 매우 어려울 수 있기 때문에, 이 경로를 통한 l00mg 이상의 투여량은 여러 번의 주사를 필요로 하고, 이는 환자에게 불편하다. 따라서 예를 들면, 하나 이상의 잠재적 hCMV 결합 멤버의 낮은 투여량은 투여 경로를 확장할 수 있으므로, 장점이 있다.

실시예

실시예 1: hCMV 특이적인 기억 B 세포의 FACS 분류 및 IgG -양성 기억 B 세포의 EBV 형질전환

통보된 공여자 동의서를 입수한 후, 말초 혈액(300ml)을, 이의 혈청이 고 gB-결합 역가 및 효율적인 hCMV 중화 활성에 대해 예비-스크리닝(pre-screening)된 건강한 hCMV-혈청양성 혈액 공여자로부터 수집하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜-밀도 구배 원심분리(Ficoll-density gradient centrifugation)(제조원: Lymphoflot, Biotest, 독일 드라이히 소재)로 정제하였다. 항-사람 CD22-미세비드(microbead)(제조원: Mitenyi Biotec, 독일 베르기슈 글라트바흐 소재)를 사용하여 B 세포를 농축시킨 후, B 세포를 다음 시약으로 표지(labelling)하였다: a. 항-사람 CD19-FITC(제조원: Miltenyi Biotec, 독일 소재); b. 항-사람 CD27-PE(제조원: BD Bioscience Pharmigen, 스위스 바젤 소재); c. 항-사람 IgG-바이오(제조원: Jackson Immuno-Research, 미국 펜실바니아 웨스트 그로브 소재); d. 스트렙타비딘, Alexa Fluor^® 350 접합체(conjugate)(제조원: Molecular Probes Inc, 미국 오레곤주 유젠 소재) 및 e. Cy5-표지된 당단백질 B (100ng/1 x 10⁶개 B 세포). gB-특이적인, IgG-양성 기억 B 세포를 다음 4개의 기준을 충족하는 세포를 분류함으로써 분리하였다: FITC+/PE+/Alexa Fluor^® 350+ 및 Cy5+(참조: 도 2). 대안적으로, B 세포를 다음 시약으로 표지하였다: a. 항-사람 CD19-PerCP(제조원: Dianova, 독일 함부르크 소재); b. 항-사람 CD27-PE(제조원: BD Bioscience Pharmigen, 스위스 바젤 소재); c. 항-사람 IgG-FITC(제조원: Dianova, 독일 함부르크 소재); d. Cy5-표지된 당단백질 B(100ng/1 x 10⁶개 B 세포). 이들 gB-특이적인, IgG-양성 기억 B 세포를 FACSCalibur^®(제조원: Becton Dickinson, 독일 하이델베르크 소재)를 사용하여 분석하거나 기준 PerCP+/PE+/FITC+ 및 Cy5+를 충족한 세포를 분류함으로써 분리하였다.

세포를 5 또는 10개 세포/웰(well)의 농도에서, 조사된(irradiated) 공급자 세포(사람 포피 섬유모세포, HFF)의 합치성 층(confluent layer)을 함유하는 96-웰 평편-바닥 미세플레이트 속에서 MoFlo™ 세포 분류기(제조원: Cytomation, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 분류하였다. 분류된 세포를 2mM 글루타민, 100IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 50μM 2-머캅토에탄올 및 10% 태아 송아지 혈청(열-불활성화된)(제조원: PAN-Biotech, 독일 아이덴바흐)으로 보충된 완전 RPMI-1640 배지 속에서 EBV 함유 세포 배양 상층액(EBV를 생성하는 세포주 B95-8의 30% 상층액) 및 CpG ODN 2006 (2,5㎍/ml)의 존재하에 앞서 기술한 바와 같이(참조: Rosen et al., 1977; Steinitz et al., 1977; Bernasconi et al., 2002; Jung et al., 2002; Traggiai et al., 2004) 성장시켰다. 3주 후, 생성된 세포주로부터의 배양 상층액을 gB-특이성에 대해 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 스크리닝하였다. 요약하면, ELISA 플레이트(Nunc)를 탄산염 완충액, pH 9.6 속에서 0.5㎍/ml 당단백질 B로 4℃에서 16시간 동안 피복시켰다. gB-피복된 플레이트를 0.05% 트윈(ELISA 세척 완충액)으로 보충된 인산염 완충된 염수(PBS)로 6회 세척하고 0.05% 트윈 및 2% 태아 송아지 혈청(ELISA 완충액)으로 보충된 PBS로 2시간 동안 차단하였다. 50μl의 배양 상층액/웰을 1시간 동안 실온에서 항온처리하고, 다른 세척 단계 후, 결합된 항체는 퍼옥시다제(제조원: Jackson ImmunoResearch, 미국 소재)와 커플링된 Fcγ 단편-특이적인 제2 항체를 사용하여 나타내었다. 1시간 항온처리한 후 결합되지 않은 제2 항체를 세척하여 제거하고 효소 활성을 50μl/웰의 o-페닐디아민을 사용하여 0.04mg/ml의 농도에서 0.05M 인산염-시트르산염 완충액(pH 5.0), 0.05% H₂O₂ 속에서 측정하였다. 실온에서 10분 동안 항온처리한 후, 반응을 50μl/웰의 2M H₂SO₄를 첨가하여 중지시키고 광학 밀도(OD)를 492nm에서 SPECTRAmax™ 190 ELISA 광도계(제조원: Molecular Devices, 미국 캘리포니아 서니베일 소재)를 사용하여 측정하였다. 소프트웨어 소프트막스 프로(Software Softmax Pro) 3.0(제조원: Molecular Devices, 미국 소재)를 분석에 사용하였다.

실시예 2: 시험관내 hCMV 중화 검정

gB-특이적인 배양 상층액을 hCMV 게놈내에 루시퍼라제 리포터 유전자 발현 카세트를 함유하고 표적 세포(제공자: Prof. Dr. Thomas Stamminger, 근무처: 독일 에를랑겐 의대(University Hospital Erlangen)의 임상 및 분자 바이러스학 기관(Institute of Clinical and Molecular Virology))의 감염시 루시퍼라제 효소의 발현을 생성하는, hCMV 재조합체 균주 AD169(HB15-UL84prluc)를 사용하여 중화 활성에 대해 스크리닝하였다. 바이러스 상층액중 감염성 역가(infectious titer)를 TCID50 검정으로 주요 섬유모세포(HFF 또는 MRC-5 세포) 속에서 96-웰 플레이트 상에서 문헌[참조: Mahy & Kangro (1996)]에 기술된 바와 같이 측정하였다. 루시퍼라제-계 중화 검정을 위해, 동일한 용적의 gB-특이적인 배양 상층액 및 적정된 AD169△Luc 상층액(300pfu)을 37℃에서 96 U-바닥 미세플레이트 속에서 항온처리하였다. 항체-바이러스 혼합물을 앞서 종균배양한 HFF 단층위로 이전시켰다. 37℃에서 4시간 동안 추가로 항온처리한 후, 항체-바이러스 혼합물을 완전 배지로 교체하였다. 37℃에서 다른 4시간 동안 추가로 항온처리한 후, 세포를 웰당 100μl의 Glo 분해 완충액(제조원: Promega, 위스콘신 매디슨 소재)으로 분해하였다. 30μl의 각각의 분해된 웰을 백색의 96-웰 LIA 플레이트 (제조원: Greiner Bio-one, 독일 프리켄하우젠 소재)내에 두었다. 웰당, 50μl의 검정 완충액(15mM KH₂PO₄, 25mM 글리실글리신, 1M MgSO₄, 0.5M EGTA, 5mM ATP, 1mM DTT)을 가하였다. 웰당 50μl의 D-루시페린(제조원: P.J.K., 독일 글라인비테르스도르프 소재)(25mM 글리실글리신, 1M MgSO₄, 0.5M EGTA, 2mM DTT, 및 0.05mM D-루시페린 중의)의 주입 및 화학발광성의 검출을 센트로(Centro) LB 960 광도계(제조원: Berthold Technologies, 독일 바트 빌트바트 소재)로 수행하였다. MicroWin 2000 소프트웨어(제조원: Mikrotek Laborsysteme, 독일 오베라트 소재)를 분석에 사용하였다. 분광계로 측정한 상대적인 광 단위(RLU)는 다음 수학식을 사용하여 중화 퍼센트로 나타내었다: %-중화 = 100 x (V₀ - V_n)/V₀(여기서, V_n은 바이러스 및 항체를 함유하는 웰에서의 RLU를 나타내고, V₀는 바이러스만을 함유한 웰에서의 RLU를 나타낸다). 제1 스크리닝은, hCMV 감염성으로 중화된 9개의 gB-특이적인 배양 상층액을 나타내었으며, 제2 스크리닝은 hCMV 감염성을 중화시킨 3개의 추가의 gB-특이적인 배양 상층액을 나타내었다. 9개의 EBV-무한증식 기억 B 세포주 및 이들에 의해 생산된 중화 항체는 SM1, SM3, SM4, SM5, SM6, SM7, SM9, SM10 및 SM11으로 명명되었다(참조: 하기 표 1). 3개의 추가의 EBV-무한증식 기억 B 세포주 및 이들에 의해 생산된 중화 항체는 SM12, 2C2 및 1G2로 명명되었다(참조: 하기 표 1).

50%-중화 역가(IC50)는 hCMV 감염을 50% 감소시키는 항체의 농도로 나타낸다. 유사하게, 90%-중화 역가(IC90)는 hCMV 감염을 90% 감소시키는 항체의 농도로 나타낸다. 항체의 중화 활성을 계산하기 위해, 배양 상층액의 IgG-농도를 ELISA로 측정하였다. 이러한 목적으로, ELISA 플레이트를 항-사람 IgG, Fcγ 단편-특이적인 캐칭(catching) 항체(제조원: Jackson ImmunoResearch, 미국 소재)로 피복하였다. ELISA 완충액 중 SM-항체 배양 상층액의 2배 일련 희석물을 공지된 농도(11.1mg/ml 스톡(stock) 농도; 제품 번호: 009-000-003, 제조원: Jackson ImmunoResearch, 미국)의 폴리클로날 IgG 표준물과 비교하였다. 시료의 IgG-농도를 ELISA 소프트웨어 소프트막스 프로 3.0(제조원: Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여 계산하였다. EBV 주 세포 배양 상층액의 IgG 농도에 대한 중화 활성을 하기 표 1에 나타낸다:

EBV 주 상층액의 IgG-농도를 측정하면서, 6개의 세포주 상층액에 대한 추가의 중화 검정을 수행하였다: 이들 상층액은 0.5 내지 2.3㎍/ml의 IC₅₀ 값을 나타내었다(표 2; 하기 참조). 중화 검정을, 완전 배지 중 항체 상층액의 2배 일련 희석물을 바이러스 첨가 전에 3개 제조하는 변형으로 상기 단락에 기술한 바와 같이 수행하였다.

결과는 3회의 독립된 검정의 평균 값을 반영한다. 검정들 사이의 편차는 10 내지 20% 범위이었다.

*ITC88은 양성 대조군으로서 사용하였다(참조: Ohlin et al., 1993).

중화 항체를 생산하는 EBV-무한증식 기억 B 세포주를 펠렛화(pelleting)하고 추가의 가공이 필요할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.

실시예 3: 항-hCMV EBV 세포주로부터 항체 가변 영역의 클로닝

실시예 3.1 내지 3.4에서, 9개의 EBV 형질전환된 사람 B 세포주로부터의 항-hCMV 중화 항체의 가변 영역(SM1, 3-7, 9-11)을 세미-네스티드(semi-nested) PCR로 증폭시키고 적절한 면역글로불린 고정 영역(constant region)을 함유하는 pCDNA3 벡터(제조원: Invitrogen)내에 클로닝(cloning)하였다. 당해 작제물은 후속적으로 CHO 세포를 형질감염시키는데 사용하여 발현된 항체를 현탁액 배열 기술 및 표면 플라스몬 공명(Biacore^®, 제조원: GE Healthcare)(실시예 5) 및 중화 검정(실시예 4)을 제1 스크리닝을 위해 사용하여 시험하였다. 실시예 3.5 내지 3.7에서, 4개의 EBV 형질감염된 사람 B 세포주 (SM10, SM12, 2C2 및 1G2)로부터의 항-hCMV 중화 항체의 가변 영역을 네스티드 PCR로 증폭시키고 문헌(참조: Tiller et al., 2008)에 기술된 방법에 따라 적절한 면역글로불린 고정 영역을 함유하는 발현 벡터 속에서 클로닝하였다. 이들 작제물을 후속적으로 사용하여 HEK 293T 세포를 형질감염시키고 발현된 항체를 중화 검정(실시예 4)에서 초기 스크리닝의 일부로 시험하였다.

용어 '가변 영역'은 중쇄에 대한 VDJ 재배열된 유전자 및 경쇄에 대한 VJ 재배열된 유전자를 의미한다.

3.1 RNA 정제 및 제1-쇄(first-strand) cDNA 합성

EBV 형질감염된 기억 B 세포주 SM1, 3-7 및 9-11의 동결된 세포 펠렛을 총 RNA 정제에 TRIZOL^® 시약(제조원: Invitrogen)을 사용하여 적용시켰다. 세포 펠렛을 -80℃ 동결건조기에서 꺼내고 즉시 TRIZOL^®로 분해하였다. 실온에서 5분 동안 항온처리한 후, 1ml의 TRIZOL^® 당 0.2ml의 클로로포름(제조원: Roth, 독일 소재)을 가하고 튜브를 1분 동안 온화하게 혼합하였다. 분해물을 3분 동안 빙상에서 항온처리하고 튜브를 14000rpm에서 4℃로 15분 동안 항온처리하였다. 수성 상부 상을 새로운 튜브로 이전시키고, 1ml의 TRIZOL^® 당 0.5ml의 이소프로판올(제조원: Roth, 독일 소재)을 가하였다. 실온에서 10분 동안 항온처리한 후, 튜브를 14000 rpm에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, RNA 펠렛을 1ml의 70% 에탄올(제조원: Roth, 독일 소재)로 세척하였다. 펠렛을 10 내지 15분 동안 실온에서 공기-건조시키고 30 내지 50μl의 RNAse-유리된 2회 증류수(제조원: Fermentas Life Sciences)를 가하고 10분 동안 55℃에서 항온처리하여 용해하였다. RNA 농도를 UV 분광광도계로 측정하고 RNA 시료를 -80℃에서 저장하였다. 제1 쇄 cDNA 합성을 RevertAid^TM 제1쇄 cDNA 합성 키트(제조원: Fermentas Life Sciences)를 사용하여 제조업자의 매뉴얼에 따라 수행하였다.

3.2 세미-네스티드 PCR(Semi-nested PCR)

사람 항체의 가변 암호화 영역을 세미-네스티드 PCR로 증폭시켰다. 세미-네스티드 PCR은 2개의 연속적인 PCR(PCR 매개변수는 하기 표 3에 나타낸다)을 동일한 프로그램(TDNPCR1; 하기 표 4a)과, 상이한 5' 전방 프라이머(forward primer) 및 동일한 3' 역방 프라이머(reverse primer) 혼합물(mix)(하기 표 5; 모두 함께 J-분절(segment) 프라이머) 둘다를 작동시켜 수행하였다. 제1 PCR을 위한 주형으로서 1μl cDNA를 사용하였다. 제2 PCR을 위해, 제1 PCR로부터의 1μl의 PCR 생성물을 사용하였다(제1 PCR 후 DNA 수율에 따라 희석되지 않거나 1:10 내지 1:100로 희석됨). 모든 EBV-세포주의 cDNA를 모든 V_H, V_κ 및 V_λ 프라이머 조합을 사용하여 증폭시켰다. 5개의 상이한 전방 프라이머를 5개의 역방 프라이머와 함께 사용하여 카파 경쇄 가변 영역을 증폭시켰다(표 5a). 3개의 상이한 전방 프라이머를 4개의 상이한 역방 프라이머와 함께 사용하여 람다 경쇄 가변 영역을 증폭시켰다(표 5b). 6개의 상이한 전방 프라이머를 4개의 상이한 역방 프라이머와 함께 사용하여 중쇄 가변 영역을 증폭시켰다(표 5c).

모든 EBV 세포주에서 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭시켰다. 증폭된 가변 영역을 HindIII/Eco47III(중쇄 및 카파 경쇄) 또는 HindIII/AvrII (람다 경쇄)으로 분해하고 실시예 3.4에 기술된 바와 같이, 사람 γ1, κ 또는 λ에 대해 일치하는 고정 영역을 이미 함유하는 pCDNA3(제조원: Invitrogen)으로 클로닝하였다.

예측된 길이를 갖는 수득되는 PCR 생성물을 PCR4Blunt-TOPO(제조원: Invitrogen)내로 평활 말단-연결(blunt end-ligating)시키고, 서열 분석 후, 가변 영역을 pCDNA3 (제조원: Invitrogen)내로 실시예 3.4에 기술된 바와 같이 추가로 아-클로닝(sub-cloning)시켰다. 그러나, 증폭된λ 경쇄 가변 영역을 추가로 증가시키기 위해, PCR 조건을 추가로 최적화시켰다(PCR Programme FWUWPCR, 하기 표 4b 참조).

3.3 벡터 골격( backbone ) 제조

증폭된 가변 영역을 적절한 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 고정 영역을 함유하는 pCDNA3 벡터(제조원: Invitrogen)내로 클로닝하였다. 중쇄 가변 영역의 클로닝을 위해, 작제물 pd1612-Je(pCDNA3-EGFP-Cγ)을 HindIII/Eco47III(6505bp 및 727bp의 2개 밴드 생성)으로 분해하고, CIP로 탈포스포릴화하고 6505bp 단편을 겔-정제하였다. 람다 경쇄 가변 영역의 클로닝을 위해, 작제물 pd1864-Je (pCDNA3-2-4 Vλ2-AvrII(-)를 HindIII/AvrII(5858bp 및 394bp의 2개 밴드 생성)로 분해하고, CIP로 탈포스포릴화하며 5858bp 단편을 겔-정제하였다. 카파 경쇄 가변 영역의 클로닝을 위해, 작제물 pd703-Je (pCDNA3-ITC88 Vκ)를 HindIII/Eco47III(6050bp 및 392bp의 2개 밴드 생성)으로 분해하고, CIP로 탈포스포릴화하고 6050 bp 밴드를 겔-정제하였다.

3.4 삽입체 ( insert ) 제조

증폭된 항체 가변 영역의 PCR 생성물을 겔 젱제하고, HindIII/Eco47III(중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역) 또는 HindIII/ AvrII(람다 경쇄 가변 영역)로 분해한 후 프레임내에서 적절한 면역글로불린 고정 영역을 함유하는 pCDNA3 벡터내로 T4 DNA 리가제를 사용하여 효소 제조업자가 추천한 바와 같이 연결하였다. DNA-연결을 밤새 16℃에서 수행하였다. 당해 방법에 대한 예외로서, 항체 가변 영역 SM1 Vλ1, SM4 Vλ1 및 SM9 Vλ2의 PCR 생성물을 우선 PCR4Blunt-TOPO(제조원: Invitrogen)내로 평활-말단 연결 키트(제조원: Invitrogen)의 사용자 매뉴얼에 따라 평활 말단-연결하였다. 각종 미니프렙(miniprep)의 서열을 분석한 후, 보나 파이드(bona fide) Vλ 서열을 함유하는 유일한 클론을 HindIII/ AvrII로 분해하고 가변 영역을 겔-정제하고 적절한 pCDNA3 벡터(pd 1864-Je; 하기 참조)내로 아-클로닝하였다. 1μl의 각각의 연결물을 DH10B 세포(1900V/5ms)내로 전기천공(electroporation)하였다. 이후에, 200μl의 전기천공된 세균을 LB-한천 + 100㎍/ml 암피실린 플레이트내로 플레이팅(plating)하였다. 각각의 작제물로부터 약 10 개의 클론을 집어올려, 밤새 성장시키고 미니프렙을 수행하였다(각각의 콜로니를 또한 LB-한천 + 100㎍/ml 암피실린 플레이트 위에 스트리킹(streaking)하였다). 양성 클론을 확인하기 위한 대조군 분해를 HindIII/Eco47III (H/E)로 중쇄 또는 카파 경쇄를 지닌 작제물에 대해 수행하고 HindIII/AvrII (H/A)를 람다 경쇄를 지닌 작제물에 대해 수행하였다. 양성 클론을 프라이머 179-Je(서열: 5' AGA GAA CCC ACT GCT TAC TG 3'; 서열 확인 번호 196)로 DNA-서열분석하여 분석하였다.

위에서 언급한 바와 같이, 약간의 가변 영역을 pCR4Blunt-TOPO(제조원: Invitrogen) 벡터 골격내로 우선 클로닝하였다. 서열 분석 후, 양성 클론을 pCDNA3 벡터내로 위에서 기술한 바와 같이 아-클로닝하였다. 삽입체 제조를 위해, Pd1887-Je (pCR4Blunt-TOPO-SM9 Vλ1_JL7 #2) 및 pd1888-Je (pCR4Blunt-TOPO-SM1 Vl1_Jl7 #4)을 HindIII/AvrII로 분해하였다. 가변 영역(394 bp)을 겔-정제하고 pCDNA3내로 연결하였다. 1μl의 각각의 연결물을 DH10B 세포(1900V/5ms)내로 전기천공하였다. 250μl의 전기천공된 세균을 LB-한천 + 100㎍/ml 암피실린 플레이트내로 플레이팅하였다. 각각의 연결로부터 5개 콜로니를 집어올려, 미니프렙을 수행하고 DNA를 HindIII/AvrII로 정제하여 양성 클론을 확인하였다.

EBV 형질전환된 사람 B 세포로부터 클로닝된 항체 중쇄 (HC) 가변 영역 및 경쇄 (LC) 가변 영역의 수의 요약은 하기 표 6에 나타낸다.

* 3개의 상이한 SM 세포주로부터 클로닝한 쇄를 나타낸다.

46개 중화 항체(최종 컬럼)은 18개의 유일한 중쇄 및 18개의 유일한 람다 경쇄의 상이한 조합의 결과이다. 중쇄와 카파 경쇄의 조합중 어느 것도 hCMV 중화 항체를 생성하지 않았다. 모든 중쇄(V_H1-계열; 151개 아미노산, 리더 서열 포함)는 하나의 V-배선 유전자: IGHV1-1으로부터 기원하였다. 모든 람다 경쇄(Vλ1 계열; 128개 아미노산, 리더 서열 포함)은 하나의 V-배선 유전자: IGVλ1-51로부터 기원한다. hCMV 중화 항체의 이들 가변 영역은 표 6에 굵게 표시한다. 다른 V-배선 유전자로부터 기원한 중쇄 및 경쇄는 중화 항체를 생성하지 않았다. 중화 항체를 생성하는 모든 중쇄 및 람다 경쇄 조합의 개관은 하기 표 7에 나타낸다. 표 19는 첨부된 서열 목록의 서열번호 수를 요약하며, 중화항체의 중쇄 및 경쇄 CDR에 대해서는 하기 표 7에 나타낸다.

3.5 RNA 정제 및 제1-쇄 cDNA 합성

EBV 형질전환된 기억 B 세포주 SM10, SM12, 2C2, 1G2로부터의 동결된 세포 펠렛의 RNA 정제를 RNeasy^® 미니 키트(제조원: Qiagen)을 사용하여 제조업자의 매뉴얼에 따라 수행하였다. cDNA 합성을 전사인자 고 충실도 cDNA 합성 키트(제조원: Roche)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하였다.

3.6 네스티드 PCR

상기 실시예 3.5로부터 합성된 cDNA로부터, 사람 항체의 가변 암호화 영역을 네스티드 PCR에 의해 2개의 연속적인 PCR (PCR 매개변수는 하기 표 8에 나타낸다)에 의해 주형으로서 1 내지 2μl의 cDNA로부터 출발하여 증폭시켰다. PCR 반응물 둘다를 동일한 프로그램(표 9)을 사용하여 상이한 5' 전방 프라이머 및 3' 역방 프라이머로 수행하였다(표 10). 주형으로서, 제1 PCR 라운드의 경우 50ng의 주형 cDNA를 사용하고 제2 PCR 라운드의 경우 제1 PCR 라운드로부터의 1 내지 2μl의 PCR 생성물(QIAGEN PCR 정제 키트를 사용하여 정제함)을 사용하였다. 모든 EBv-세포주의 cDNA를 V_H, Vκ 및 Vλ 프라이머 조합을 제1 PCR 라운드에 대해 사용하여 표 10a에 나타낸 바와 같이 증폭시키고, V_H, V_κ 및 V_λ 프라이머 조합을 제2 PCR 라운드에 대해 표 10b에 나타낸 바와 같이 증폭시켰다. 제2 라운드의 PCR의 경우, '가장 우수한 핏(best fit)' 프라이머를 제1 라운드의 PCR로부터 수득된 서열에 대해 선택하였다(표 2, 참조: Tiller et al., ibid.).

3.7 발현 벡터 클로닝

클로닝 전에, V_H, Vκ 및 Vλ 쇄 제2 PCR 생성물의 분취량을 QUIAGEN PCR 정제 키트를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하고 각각의 전방 또는 역방 프라이머를 서열분석하였다(표 10). 서열을 IgBLAST(GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)로 서열분석하여 최대 동질성을 갖는 배선 V(D)J 유전자 분절을 확인하였다.

EBV 세포주로부터의 증폭된 가변 영역을 AgeI/Sall(γ1 중쇄), AgeI/BsiWI (κ 경쇄) 또는 AgeI/XhoI (λ 경쇄)로 분해하고 쥐 Ig 유전자 시그날 펩타이드 서열 및 사람 Igγ1, Igκ 또는 Igλ 고정 영역 전방의 다중 클로닝 부위를 함유하는 사람 Igγ1, Igκ 및 Igλ 발현 벡터(진뱅크(GenBank) 수탁 번호: 제DQ407610호)내로 클로닝하였다. 또한 발현 벡터내에는 전사를 구동시키기 위한 사람 CMV 프로모터 및 선택을 위한 암피실린 내성 유전자가 존재한다. 연결을 20μl의 총 용적 속에서 1U T4 DNA-리가제(제조원: Invitrogen), 7.5μl의 분해되고 정제된 PCR 생성물 및 25ng의 선형화된 벡터를 사용하여 수행하였다. 적격 이. 콜라이(competent E. coli) DH10B 세균(제조원: Invitrogen)을 42℃에서 2μl의 연결 생성물을 사용하여 96-웰 플레이트 속에서 전기천공 또는 열 쇼크 형질전환에 의해 형질전환시켰다. 콜로니를 PCR에 의해 5'Ab 센스 전방 프라이머(5'-GCT TCG TTA GAA CGC GGC TAC-3'; 서열번호: 315) 및 3'IgG 내부 역방 프라이머 (5'-GTT CGG GGA AGT AGT CCT TGA C-3'; 서열번호: 316), 3'Cκ494 역방 프라이머 (5' GTG CTG TCC TTG CTG TCC TGC T 3'; 서열번호: 317) 또는 3'Cλ 역방 프라이머 (5' CAC CAG TGT GGC CTT GTT GGC TTG 3'; 서열번호: 318) 각각을 사용하여 스크리닝하였다. 예측된 크기의 PCR 생성물을 원래의 PCR 생성물과의 동질성을 확인하기 위해 서열분석하였다.

EBV 형질전환된 사람 B 세포로부터 클로닝된 항체 중쇄(HC) 가변 영역 및 경쇄(LC) 가변 영역의 수의 요약은 하기 표 11에 나타낸다. 4개의 중화 항체(최종 컬럼)는 4개의 유일한 중쇄 및 유일한 람다 또는 카파 경쇄의 결과이다. 중쇄는 2개의 V-배선 유전자: IGHV4-39 및 IGHV4-59로부터 기원한다. 카파 경쇄는 2개의 V-배선 유전자: IGKV2D-28 및 IGKV1D-33으로부터 기원하고 람다 경쇄는 V-배선 유전자: IGLV1-47로부터 기원한다. V-배선 유전자 IGLV3-10으로부터 기원한 람다 경쇄는 중쇄와 쌍을 이룬 경우 항원 인식을 초래하지 않았다. 중화 항체 중쇄 및 경쇄의 조합은 하기 표 12에 기술한다.

표 19는 상기 표 12에 나타낸 중화 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR에 대한, 첨부된 서열 목록의 서열번호를 요약한다.

실시예 4: 재조합체 항체의 발현 및 정제

클로닝된 항-hCMV 항체의 추가의 특성화는 이들의 발현 및 후속적인 정제를 요구하였다. 46개의 재조합체 항체(Ab-01 내지 Ab-46)를 CHO 세포(DSMZ, 독일 브라운슈바이크 소재)의 일시적인 형질감염에 의해 발현시켰다. 요약하면, 세포를 세포 배양 디쉬(dish)(직경 10 cm; 제조원: Greiner Bio-One, GmbH)내로 2.2 x 10⁶ 세포/디쉬의 밀도에서 2% FCS(제조원: Sigma)를 함유하는 SF-IMDM 배지(제조원: Invitrogen) 속에 종균접종(seeding)하였다. 24시간 후, 형질감염 혼합물을 1ml의 MEM(제조원: PAA Laboratories)을 디쉬당 6.45㎍의 중쇄용 발현 플라스미드, 6.45㎍의 경쇄용 발현 벡터, 및 12.9μl의 MATra 형질감염 시약(제조원: IBA GmbH, 도일 괴팅겐 소재)와 혼합시켜 제조하였다. 당해 형질감염 혼합물을 20분 동안 실온에서 항온처리하였다. 종균접종된 세포의 배지를 10ml의 MEM으로 교환하고 형질감염 혼합물을 세포에 적가하였다. 후속적으로, 배양 디쉬를 자기 플레이트(제조원: IBA GmbH) 상에서 15분 동안 항온처리하였다. 이후에 배지를 통기시키고 초 저 수준의 소 IgG(제조원: Lonza)를 함유하는 2% FCS가 들어있는 10ml의 SF-IMDM 배지를 세포에 가하였다. 24시간 후, 배지를 재생시켰다. 추가로 2일 후, 배지를 재생시키고 재조합체 항체를 함유하는 상층액을 244g에서 5분 동안 원심분리하여 수거하였다. 3일 후, 조건화된 세포 배양 상층액을 원심분리에 의해 다시 수거하고, 투명한, 항체-함유 상층액을 혼주(pooling)하였다.

비바셀(Vivacell) 70 한외여과 장치(MWCO 10kDa; 제조원: Sartorius Stedim Biotech)를 사용하여 1,000g 및 20℃에서 1시간 동안 원심분리하여 조건화된 세포 배양물 상층액을 100배 농축시켰다. 재조합체 항체의 정제를 위해, 단백질 A HP 스핀 트랩 컬럼(Spin Trap column)(제조원: GE Healthcare)을 결합 완충액(50mM 트리스-HCl, 150mM NaCl, pH7.5)으로 평형화시키고 300μl의 농축물을 로딩(loading)하였다. 컬럼을 뚜껑으로 밀봉하고 실온에서 앤드-오버-앤드(end-over-end) 혼합기 상에서 항온처리하였다. 1시간 후, 회전 컬럼을 1분 동안 150g에서 원심분리하였다. 컬럼을 400μl의 결합 완충액으로 세척하고 150g에서 1분 동안 원심분리한 후, 로딩 공정을 전체 농축물이 로딩될 때까지 추가로 3회 반복하였다. 최종 로딩 단계 후, 컬럼을 400μl의 결합 완충액을 적용하고 150g에서 1분 동안 원심분리하여 4회 세척하였다. 결합된 재조합체 항체를 회전 컬럼으로부터 200μl의 용출 완충액(100mM 글리신/HCl, pH 2.5)을 첨가하고 150g에서 1분 동안 원삼분리하여 용출시켰다. 용출물을 즉시 30μl의 중화 완충액(1M 트리스-HCl, pH9.0)으로 중화하였다. 완충액은 결합된 용출물을 PBS로 예비-평형화시키고 후속적으로 150g에서 2분 동안 원심분리함으로써 교환하였다. 정제된 재조합체 항체를 단백질 로빈 튜브(protein LoBind tube)(에펜도르프) 속에 4℃에서 추가의 특성화 연구를 위한 공정까지 저장하였다.

생산된 항체 배양물 상층액을 ELISA 또는 비아코어(Biacore)에 의해 실시예 1 및 5에 기술된 바와 같이 gB 인식에 대해 분석하였다. IgG-농도를 실시예 2 및 5에서 설명한 바와 같이 측정한 후, gB-특이적인 배양물 상층액을 중화 활성에 대해 원시 섬유모세포 HFF를 사용하는 실시예 2(루시퍼라제 검정)에 기술된 바와 같은 루시퍼라제 검정을 사용하여 분석하였다. 효율적인 50%-중화 활성을 나타내는 7개의 항-hCMV 항체를 추가의 실험을 위해 선택하였다(참조: 하기 표 13).

결과는 3개의 별도 검정의 평균값을 반영한다. 검정들 사이의 편차는 10 내지 20% 범위내였다. ^*Ohlin et al., (1993); ^◈Cytotect(생물시험)은 HCMV 초면역 IgG의 혼주물(pool)이다.

4개의 재조합체 항체 Ab-47 내지 Ab-50의 발현을 위해, 문헌(참조: Tiller et al., 상기 언급)에 따른 방법을 수행하였다. 요약하면, HEK 293T 세포(DSMZ, 독일 부라운슈바이크 소재)를 75cm² 플라스크(제조원: Greiner Bio-One, GmbH) 속에서 표준 조건하에 10% 열-불활성화된 FCS(제조원: PAN Biotech GmbH), 350㎍/ml의 L-글루타민(제조원: Merck) 및 100㎍/ml의 젠타마이신(제조원: SERVA Electrophoresis GmbH)이 보충된 DMEM 배지(제조원: GibcoBRL) 속에서 배양하였다. 기하급수적으로 성장하는 293T 세포의 일시적인 형질감염은 CaPO₄ 침전에 의해 80% 세포 합치율에서 수행하였다. 동일한 양(각각 12.5 내지 20μg)의 중쇄 및 상응하는 경쇄 발현 벡터 DNA를 1ml의 멸균 수 속에서 혼합하고 2.5M CaCl₂를 적가하여 250mM의 농도가 되도록 하였다. 동일한 용적의 2xHEPES-완충된 염수를 칼슘-DNA 용액과 느린 와동하에서 혼합하고 실온에서 1분(실온에서 1분 + 37℃에서 1분) 동안 항온처리하여 침전물을 형성시켰다. 침전 혼합물을 배양 디쉬에 균일하게 분포시켰다. 세포를 10ml의 PBS로 6 내지 8시간 후 세척하고 6 내지 7일 동안 15ml의 DMEM 속에서 배양한 후 상층액을 수거하였다.

배양 상층액을 실시예 1에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 gB 인식에 대해 분석하였다 IgG-농도를 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 측정한 후에, gB-특이적인 배양 상층액을 중화 활성에 대해 루시퍼라제 검정(실시예 2에 기술된 바와 같음)으로 원심 섬유모세포 HFF를 사용하여 분석하였다. HEK-293T 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 50% 중화 활성을 하기 표 14에 나타낸다:

실시예 5: 항- hCMV 항체의 특성화

5.1:현탁액 배열 기술(Luminex ^® )을 사용한 hCMV 항체의 정량화

사람 IgG를 함유하는 세포 배양 상층액을 검정 완충액(제조원: Roche, 제품 번호 1112589) 속에서 희석시키고 희석물을 96-반 웰 플레이트(제조원: Corning, 제품 번호 3 884) 속에서 2회 평가하였다. 요약하면, 25μl의 시료를 암실(20℃, 650rpm)에서 항-사람 IgG-Fc-특이적인 것(제조원: Caltag, 제품 번호 H10500)으로 아민 커플링시켜 로딩하는 1200 루미넥스-COOH-비드를 함유하는 5μl와 함께 1시간 동안 항온처하였다. 표준 곡선은 25μl의 1:3 일련의 희석물(0.08 - 60ng/ml)의 크롬퓨어(ChromPure) 사람 IgG 전체 분자(제조원: Jackson Immuno-Research, 미국 제품 번호 009-000-003)을 2회 사용하여 생성시켰다. 검출은 R-PE(5㎍/ml; JIR 제품 번호 109-116-098)로 표지시킨 30μl의 항-사람 IgG-Fc-특이적인 것을 첨가하여 수행하고 1시간 동안 추가로 항온처리하였다. 이후에 플레이트를 판독하고 세팅: 100 개 비드, 50μl의 시료 크기를 사용하는 Luminex^® 200 장치(제조원: Millipore)를 사용하여 분석하였다.

5.2: 현탁액 배열 기술을 사용한 gB 단백질(hCMV)의 정량화

gB (hCMV)를 함유하는 세포 배양 상층액을 검정 완충액(Roche 제품 번호 1112589) 속에서 희석시키고 희석물을 96-웰 여과기 플레이트(Millipore 제품번호 MABVN 1250) 속에서 3회 평가하였다. 요약하면, 25μl의 시료를 암실(20℃, 650rpm)에서 1.5시간 동안 내부에서 이미 확인한 사람-항-hCMV-IgG 항체 V_H3/65-Vκ1/19, 중화되지 않지만, 매우 고 친화성인 hCMV 특이적인 항체와 아민 커플링시켜 로딩한 1500 루미넥스-COOH-비드를 함유하는 5μl와 함께 항온처리하였다. 표준 곡선을 25μl의 1:3의 일련 희석물(6-1458ng/ml)의 gB을 3회 사용하여 생성시켰다. 플레이트를 진공 매니폴드(manifold)를 사용하여 2회(100μl PBS/웰) 세척하고 검출을 위해 50μl의 바이오티닐화된 항-hCMV-IgG 항체 ITC52(5㎍/ml; 내부에서 생성; 참조: Ohlin et al., 1993)을 추가로 1.5시간 동안 가하였다. 2회의 세척 단계(각각 100μl의 PBS 사용) 후 50μl의 R-PE(제조원: Invitrogen, 제품 번호 A2660)로 표지시킨 1.2㎍/ml 뉴트라비딘을 30분 동안 가한 후 플레이트를 판독하고 Luminex^® 200 장치(셋팅: 100개 비드, 40μl의 시료 크기)를 사용하여 분석하였다.

5.3: 비아코어( Biacore )

단백질-단백질 상호작용을 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 Biacore^® T100 장치(제조원: Biacore, GE Healthcare, 뮌헨 소재)를 사용하여 Biacore^®T100 조절 소프트웨어 v 2.0.1로 분석하였다. 모든 상호작용을 25℃에서 1 x DPBS 속에서 P20(0.05%)으로 분석하였다. 각각의 결합 상호작용을 적어도 2회 분석하였다. hCMV gB 단백질을 CM5 센서 칩(카복시메틸화된 덱스트란 매트릭스, 제조원: GE Healthcare)의 유동셀에 표준 아민-커플링 과정을 통해 커플링하였다. 카복시메틸화된 덱스트란 매트릭스를 0.4 M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(EDC) 및 0.1M N-하이드록시석신이미드(NHS)를 사용하여 제조업자(GE Healthcare)의 지시에 따라 활성화시켰다. 2개의 유동셀을 활성화시키고 gB 단백질을 10mM 아세트산나트륨, pH 5.0을 사용하여 50μg/ml로 희석시키고 5μl/분의 유동 속도에서 결합 실험(5,000 공명 단위) 또는 역학 실험(2,000 공명 단위)용 커플링의 적절한 수준이 달성될 때까지 주입하였다. 미반응성 그룹을 1M 에탄올아민-HCl, pH 8.5의 주입으로 불활성화시켰다. 대조군 유동셀을 오브알부민(제조원: Imject, Pierce, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 로트 JF124260)을 사용하여 pH 4.0에서 상응하게 제조하였다. 결합 실험 전에, 유동셀을 이동 완충액(running buffer)으로 완전 세척하였다.

결합 분석을 위해 항-gB-특이적인 항체를 함유하는 세포 배양 상층액을 SF-IMDM 2% 초 저 IgG로 희석시킴으로?써 2.5㎍/ml IgG로 조절하고 90초 동안 PBS 속에서 0.02% BSA 및 0.05% 트윈 20과 함께 10μl/분에서 주입하였다. 90초의 해리 시간 후, 결합 안정성을 Biacore^® T100 평가 소프트웨어 버젼 2.0.1을 사용하여 플롯팅하였다.

역학적 분석을 위해, 양성 대조군으로서 항체 Ab-02, Ab-04, Ab-11, Ab-14, Ab-28, Ab-42 및 ITC88의 Fab 단편을 제조업자(Pierce, Thermo Fisher Scientific)의 표준 프로토콜에 따라 고정된 파파인을 사용하여 단백질 A-정제된 사람 IgG로부터 제조하였다. 절단 생성물을 SDS-PAGE에 의해 은 염색 및 Luminex^® 비드 배열 Fab/Fc 검출에 의해 확인하였다. 역학적 분석을 위해, 유동 속도를 70μl/분으로 상승시키고 3개의 블랭크 곡선(0 농도)를 각각의 이동내로 도입하였다. 표면을 10mM 글리신/HCl으로 pH 2.0에서 재생시켰다. 결합 곡선을 Biacore^® T100 평가 소프트웨어 버젼 2.0.1을 사용하여 R_max의 국제 핏트를 사용하는 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델을 적용시켜 평가하였다.

실시예 6: 상이한 hCMV gB-유전형의 중화

HCMV 실험실 균주 및 임상 분리물을 몇가지 gB 유전형(참조: Chou and Dennison, 1991)으로 분류하였다. 항-HCMV 항체의 50%-중화 활성을 판독물로서 간접적인 면역형광성을 사용하는 추가의 상이한 hCMV gB-유전형을 사용하여 측정하였다. 바이러스 균주 Towne, AD169 및 임상 분리물 Altu를 gB-유전형 1, gB-유전형 2 및 gB-유전형 3 각각으로 분류하였다. 모든 바이러스 균주를 사람 포피 섬유모세포(HFF) 위에서 표준 과정으로 증식시키고, 바이러스 상층액내 감염성의 역가를 문헌[참조: Mahy & Kangro (1996)]에 기술된 방법으로 측정하였다. 간접적인 면역형광성 검정을 문헌[참조: Andreoni et al. (1989)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 6개의 단클론 항체(항체 Ab-04, Ab-11, Ab-14, Ab-19, Ab-28 및 Ab-42)의 2-배 일련 희석물을 적정된 양의 각각의 HCMV gB-유전형(300 pfu)와 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 바이러스-항체 혼합물을 96-웰 미세플레이트 속에 합치로 성장시킨 HFF 배양물에 가하였다. 모든 시료를 3회 시험하였다. 바이러스 상층액을 HFF로부터 제거하고, 4시간 동안 37℃에서 항온처리한 후 완전 배지로 교체하였다. 다른 16시간 내지 20시간의 항온처리 기간 후, 세포를 세척하고 에탄올로 고정시켰다. 감염된 세포를 hCMV 및 Cy3-접합된 항-마우스 IgG 제2 항체(제조원: Jackson ImmunoResearch, 미국 소재)의 주요 이미디에이트-얼리(immediate-early: IE) 단백질, UL123에 대해 특이적인 단클론 항체 p63-27을 사용하여 염색하였다. 완전 세척한 후, IE-양성 핵을 형광 현미경하에 계수하고 중화 퍼센트를 다음과 같이 계산하였다:

중화% = 100 x (V₀ - V_n)/V₀(여기서, V_n은 바이러스 및 항체를 함유하는 웰내 IE-양성 핵의 수이고, V₀는 바이러스만으로 항온처리한 웰내 IE-양성 핵의 수이다). 일반적으로, 감염 투여량을 조절하여 웰당 1000개 감염된 세포가 생산되도록 하였다. 하기 표 16은 상이한 gB-유전형을 나타내는 hCMV 상의 각종 재조합체 항체의 50%-중화 활성을 요약한다. 시험한 단클론 항체는 비교가능한 효능으로 hCMV gB-유전형 1, 2 및 3을 중화시키는 것으로 밝혀졌다.

실시예 7: 재조합체 항체의 내피, 상피 및 수지 세포내로 hCMV 도입의 중화

앞서의 실시예에서 기술된 중화 검정을 모두 표적 세포로서 섬유모세포를 사용하여 수행하였다. 앞서 확인된 중화 재조합체 항체가 내피, 상피 및 수지 세포의 감염을 또한 중화시킬 수 있는지를 시험하기 위하여, 향내피(endotheliotropic) 및 향상피성(epitheliotropic) HCMV 분리체 TB40E(독일 튀닝겐 대학의 바이러스 및 바이러스 질병 전염병학 기관의 Christian Sinzger 박사로부터의 일반적인 선물)을 이용하였다. TB40E를 HFF 속에서 증식시키고 바이러스 상층액 중 감염성의 역가를 문헌[참조: Mahy & Kangro (1996)]에 기술된 바와 같이 측정하였다. 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 EGM-2MV-키트로 보충된 내피 세포 세포 기저 배지 EBM-2(제조원: Lonza, 벨기에 베르비에르스 소재) 속에서 배양하고 실험을 위해 4 내지 7회 계대배양에서 사용하였다. 사람 ARPE-19 망막 색소 내피 세포(ATCC CRL-2302)를 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium): 2.5mM 글루타민, 15mM 헤페스 완충액(Hepes buffer), 피리독신 HCl, 55mg/l 피루브산나트륨, 10% 태아 송아지 혈청(열-불활성화됨), 100IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신(제조원: PAN-Biotech, 독일 아이덴바흐 소재)이 보충된 영양 혼합물 F12, 1:1 혼합물 속에서 증식시켰다. 원시 수지 세포 (DC)를 다음과 같이 분리하였다. HCMV-혈청음성 혈액 공여자의 정제된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 2mM 글루타민, 10mM 헤페스 완충액, 100IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지 속에서 자가 혈청(2% v/v, 열-불활성화된)의 존재하에서 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 기간 후, 부착되지 않은 세포를 세포 배양 배지로 세척하고 IL-4 (25U/ml) 및 GM-CSF (800U/ml)(제조원: CellGenix Technologie Transfer GmbH, 독일 프라이부르크 소재)를 분리 후 2일째 및 4일째에 첨가한 후 DC내로 분화된 단핵구를 부착시켜 제거하였다. 6일째에, 중화 검정을, 항체 및 바이러스를 1시간 동안 37℃에서 위에서 기술한 바와 같이 항온처리하여 수행하였다. DC의 형질감염은 500-배 더 높은 양의 바이러스 입자를 필요로 한다. 항체-바이러스 혼합물을 DC에 가한 후 12시간의 다른 항온처리 기간을 수행하였다. 고정시키고 빙-냉 메탄올로 침투 후 감염된 세포를 HCMV 및 FITC-접합된 항-마우스 IgG 제2 항체(제조원: Jackson ImmunoResearch, 펜실바이나 웨스트 그로브 소재)의 주요 이미디에이트-얼리(IE) 단백질, UL123에 대해 특이적인 단클론 항체 E13(제조원: Morphosys AbD GmbH, 독일 뒤셀도르프 소재)을 사용하여 염색하였다. 형광성 활성화된 세포 분류(FACS)를 판독물로 사용하였다. FlowJo 5.7.2.(제조원: Tree Star Inc., 올랜드주 애쉬랜드 소재) 및 그래프 파드 프리즘(Graph Pad Prism) 4(제조원: GraphPad Software, Inc., 캘리포니아주 라 졸라 소재)을 분석에 사용하였다. 결과를 표 17a 및 17b에 요약한다.

내피 및 상피 세포를 사용한 중화 검정을 실시예 6에 기술된 바와 같이 판독으로서 간접적인 면역형광성 검정을 사용하여 수행하나; 이러한 방법에 대한 다음 변형을 수행하였다: HUVEC를 EGM-2MV-키트로 보충된 EBM-2 속에서 hFGF-B의 부재하에 1시간 동안 37℃에서 항온처리한 후 감염시켰다. 이는 감염에 있어서 억제 효과를 나타낸 FGF-관련된 헤파린을 제거하는 것이 필수적이었다. 또한, 10-배 더 높은 양의 바이러스 입자(3000 pfu)를 HUVEC 및 ARPE의 감염 둘다에 적용시켰다.

시험한 모든 항체는 HFF의 중화에 대해 비교가능한 효능으로 내피, 상피 및 수지 세포의 감염을 중화시키는 것으로 관측되었다(참조: 하기 표 17a 및 17b).

실시예 8: hCMV 중화 항체의 에피토프 특성화

8.1 신규한 항-hCMV 항체의 비아코어에 의한 에피토프-결합 경쟁 검정

에피토프 경쟁 분석을 위해, 항체 Ab-02(18'900 RU), Ab-04 (16'800 RU) 및 Ab-28 (18'300 RU)를 CM5 센서 칩의 유동셀에 표준 아민-커플링을 통해 커플링하였다. 대조군 유동셀을 비가역적 사람 IgG₁ 항체(12'500 RU)를 사용하여 상응하게 제조하였다. 결합 실험 전에, 유동셀을 이동 완충액으로 완전히 세척하였다. hCMV gB 단백질을 고정된 항-gB 항체 상에 180초 동안 5μl/분의 유동 속도에서 대략 13㎍/ml gB를 함유한 안정한 gB-생산 CHO 세포주 6-H5(로트 080527 KS)의 상층액으로부터 포획하였다. 제2 참조 항체 ITC48(gB 에피토프 AD-1을 인식함), ITC52(gB 에피토프 AD-1을 인식함) 및 ITC88(에피토프 gB AD-2를 인식함)을 1000nM의 농도에서 적용하였다. 결합을 PBS 속에서 0.02% BSA 및 0.05% 트윈 20을 사용하여 30μl/분의 유동 속도로 분석하였다. 표면을 10mM 글리신으로 pH 1.8에서 재생하였다. 결합 곡선을 Biacore^® T100 평가 소프트웨어 버젼 2.0.1을 사용하여 평가하였다. 결과는 하기 표 18에 요약되어 있으며 여기서 '+'는, 제2 결합 항체가 고정된 포획 항체로서 동시에 gB 단백질에 결합할 수 있었음을 나타낸다.

참조 항체는 시험한 항체로서 동시에 gB 단백질에 효율적으로 결합할 수 있으므로, 시험한 항체(고정된 포획 항체 Ab-02, Ab-04 및 Ab-28) 모두는 ITC48, ITC52, ITC88 참조 항체에 의해 인식된 gB 에피토프 AD-1 및 AD-2의 외부에 있는 gB 에피토프에 결합하는 것으로 여겨진다.

8.2 신규한 항-hCMV 항체에 의해 인식된 에피토프의 분석

본 발명의 항체가 gB, 항원성 도메인-1 (AD-1) 및 항원성 도메인-2 (AD-2) 상에서 공지된 항원성 도메인을 인식하는지의 여부를 추가로 시험하기 위하여, ELISA를 수행하였다. 당해 목적을 위해, AD-1(원핵세포 발현된 융합 단백질) 및 AD-2(합성 펩타이드, pep90, 아미노산 서열: NETIYNTTLKYGDVVGV (서열번호: 197), 참조: Meyer et al., 1992) 둘다를 1㎍/ml로 ELISA 플레이트 위에서 피복하였다. 웰당 50μl의 희석되지 않은 상층액을 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. ELISA를 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. ELISA 분석은, 본 발명의 항체가 AD-1- 또는 AD-2-특이적이어서, 실시예 8.1의 비아코어 경쟁 검정을 확인함을 나타낸다.

본 발명의 항체에 의해 인식된 에피토프를 양성적으로 확인하기 위하여, gB의 아미노산 100-447번을 암호화하는 포유동물 발현 벡터를 작제하였다. 당해 영역은 AD-1과 AD-2 gB 에피토프 사이의 모든 아미노산을 포함한다. 당해 발현 작제물을 사용한 Cos-7 세포의 일시적인 형질감염을 Lipofectamine^TM 2000(제조원: Invitrogen, 독일 칼를스루헤 소재)로 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 형질감염 후 48시간 째에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 고정시키고 냉 메탄올로 침투시켰다. PBS로 세척한 후, 세포를 원시 항체(시험한 항체 또는 대조군 항체)로 45분 동안 37℃에서 습윤 대기 속에서 항온처리하였다. 다른 세척 단계 후, 슬라이드를 FITC-접합된 항-사람 IgG 또는 FITC-접합된 항-마우스 IgG(제조원: Jackson ImmunoResearch, 미국 소재)과 함께 45분 동안 37℃에서 습윤 대기 속에서 항온처리하였다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후, 커버슬립을 설치 배지(mounting medium) VECTASHIELD^®(제조원: LINARIS GmbH, 독일 베르타임-베팅겐 소재)를 함유하는 DAPI를 사용하여 적용시켰다.

항체 결합을 형광 현미경(Axioplan 2, 제조원: Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena)으로 문서화하였다. 재조합체, 중화 단클론 항체 Ab-02, Ab-04, Ab-28은 아미노산 100-447를 포함하는 트렁케이트된(truncated) gB 단백질(AD169; 서열번호: 239)과 특이적으로 반응하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 재조합체, 중화 단클론 항체 Ab-02, Ab-04, Ab-28의 항체-결합 도메인은 gB의 아미노산 100 내지 447번(gB 균주 AD169의 번호매김; 서열번호: 239)에 의해 암호화된 영역내에 위치하는 것으로 양성적으로 확인되었다. 이는, 본 발명의 단클론 항체 Ab-01 내지 Ab-46이 gB 단백질의 신규 항원성 에피토프와 반응하며 선행 분야에서 이미 확인된 사람 단클론 항체에 의해 인식된 gB 단백질의 공지된 AD-1 및 AD-2 에피토프와는 반응하지 않음을 입증한다.

8.3: 항-hCMV 항체를 사용한 경쟁 ELISA

gB 단백질에 대한 결합에 대해 항-hCMV 항체 대 항-hCMV 항체 Ab-50의 수 사이의 잠재적인 경쟁을 측정하기 위해, ELISA를 실시예 1에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 항체 Ab-47, Ab-48, Ab-49, C23(대조군), ITC52 (AD-1 특이적인), ITC88 (AD-2 특이적인), 89-104 (gH 특이적인) 또는 89-109 (gH 특이적인)의 연속 희석물을 PBS/2% FCS 속에서 고정 농도의 Ab-50(0.5ng/웰; '항체 혼합물'로 명명함)과 함께 96-웰 플레이트 속에서 예비-항온처리하여 어떠한 시험한 항체에 의한 gB의 미성숙 결합도 방지하였다. 또한, 웰당 5ng의 농도에서 Ab-50 만의 5개 웰을 제조하여 잠재적으로 경쟁하는 항체없이 Ab-50의 OD₄₅₀을 측정하였다. 96-웰 ELISA-플레이트(제조원: Nunc)를 25ng/웰의 gB 단백질로 중탄산염 완충액, pH9.6 속에서 16 시간 동안 4℃에서 피복하였다. gB-피복된 플레이트를 0.1% 트윈(ELISA 세척 완충액)이 보충된 PBS로 3회 세척하고 2시간 동안 PBS/2% FCS(ELISA 완충액)으로 차단하고 다시 ELISA 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이후에, 플레이트를 PBS/2% FCS 속에 희석된 50μl 항체 혼합물과 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 추가의 세척 단계 후, Ab-50의 결합을 퍼옥시다제와 커플링된 항-λ-특이적인 제2 항체(antibodies-online.com)를 사용하여 나타내었다. 1시간의 항온처리 기간 후, 결합되지 않은 제2 항체를 세척하여 제거하고 효소 활성을 테트라메틸벤지딘(TMB) 시약을 사용하여 100μl/웰의 농도(TMB 퍼옥시다제 기질과 퍼옥시다제 용액 B의 1:1 혼합물)(제조원: KPL, Inc., 미국)에서 측정하였다. 5분 동안 실온에서 항온처리한 후, 반응을 100μl의 1M 인산/웰로 정지시켰다. 흡광도(광학 밀도(OD))를 450nm에서 Emax 미세플레이트 판독기를 사용하여 검출하고 소프트웨어 소프트막스(software Softmax) Pro 3.0(제조원: Molecular Devices, 미국)을 분석에 사용하였다.

경쟁이 시험한 항체와 Ab-50 사이에 존재한 경우, Ab-50 단독과 비교하여 각각의 항체 혼합물에서 OD₄₅₀ 시그날의 감소가 관측되었다. 또한, gB ELISA를 동일한 IgG-농도에서 수행하여 gB에 대해 시험한 모든 항체의 결합을 가시화하였다. 여기서 검출은 퍼옥시다제와 커플링된 Fcγ 단편-특이적인 제2 항체(제조원: Jackson ImmunoResearch, USA)를 사용하여 수행하였다. 결과는 도 4에 나타내며, Ab-50이 gB 단백질에 대한 결합에 대해 항체 Ab-47 및 Ab-49와 경쟁함을 입증한다. Ab-48과 Ab-50 사이에 경쟁은 관측되지 않았다(도 4a). 또한, gB 단백질에 대한 결합에 대한 경쟁은 Ab-50과 항체 ITC52(AD-1 특이적인), ITC88(AD-2 특이적인), 89-104 (gH 특이적인), 89-109 (gH 특이적인) 사이에서 관측되지 않았으며(도 4b), 이는, Ab-50이 이들 항체보다 hCMV 상의 상이한 에피토프를 인식함으로써 gB 단백질 위의 AD-1 또는 AD-2에 결합하지 않음을 나타낸다.

실시예 9: hCMV gB의 구조적 모델

현재 hCMV gB 단백질에 대해 이용가능한 구조적 정보가 존재하지 않으므로, HSV-1 gB의 결정 구조를 기초로 HCMV gB 균주 AD169(서열번호: 239)의 엑토도메인(ectodomain)의 삼합체 구조의 3차원 모델을 생성하였으며, 이는 주로 융합후 구조를 나타내는 것으로 보인다(참조: Heldwein et al., 2006). hCMV gB 융합후 구조의 당해 모델은 HSV-1 gB의 주형 구조(참조: Heldwein et al., ibid)를 사용한 서열 정렬을 기초로, 프로그램 MODELLER(참조: Eswar et al., 2006)를 사용한 표준 상동성 모델화 과정으로 생성되었다.

당단백질 B (gB)는 모든 헤르페스 바이러스 엔벨로프 당단백질의 가장 보존된 단백질이며, HSV-1 및 HCMV gB의 단백질 서열은 28% 동질성 및 40% 유사성을 공유한다. hCMV gB 단량체는 906개 아미노산(gB 균주 AD169; 서열번호: 239)로 이루어지며, 이중 대부분의 전체 엑토도메인(잔기 Tyr₈₉ 내지 Val₇₀0)은 모델에 포함된다(도 3). HSV-1 gB 구조를 기초로 앞서 정의된, 개개 도메인 I 내지 V는 HCMV gB의 동질성 모델로부터 명확하게 확인될 수 있다. 도메인 I(Dom I)(Ile₁₃₃ 내지 Thr₃₄₃)는 삽합체 계면의 일부를 구성하며 막에 근접하게 위치한다. 불연속 Dom II는 잔기 Leu₁₂₁ 내지 Asn₁₃₂ 및 Cys₃₄₄ 내지 Ser₄₃₈을 구성한다(도 3). 잔기 Val₃₀₆ 내지 Glu₃₁₇ 및 Leu₄₃₉ 내지 His₄₆₈을 포함하는 굴곡성 루프는 모델에 포함되지 않는데, 이는 이들이 HSV-1 gB의 주형 구조내에서 분해되지 않기 때문이다. Dom III는 3개의 불연속 분절, Ser₉₅ 내지 Cys₁₁₁, Asn₄₇₇ 내지 Ser₅₄₉, 및 Leu₆₃₈ 내지 Ser₆₄₆을 포함한다(도 3). HSV-1 gB와 유사하게, 이의 긴 α 나선은 다른 단량체로부터의 각각의 분절과 함께, 삼합체의 계면을 형성한다. Dom IV(Tyr₈₉ 내지 Cys₉₄ 및 Cys₅₅₀ 내지 Asp₆₃₇)는 분자의 상부에 위치하며 AD-1 에피토프를 함유하는 반면, Dom V (Met₆₄₇ 내지 Asp₆₉₈)은 세포외 부분과 막관통 나선 사이에 브릿지된 성분을 나타낸다. HCMV gB 단량체의 전체 구조 및 또한 삼합체내 소단위의 배열은 서열 유사성의 정도로부터 예측되는 바와 같이, HSV-1 gB의 것과 고도로 유사한 것으로 제안된다.

HSV-1 gB 결정 구조는 이미 존재하는 HSV-1(참조: Heldwein et al., ibid) 및 EBV(참조: Backovic et al., 2009)로부터의 gB-단백질의 2개의 결정 구조와 같이 모델화 연구를 위한 주형으로 선택하였다. 이들 단백질 둘다는 30%의 서열 동질성을 나타내며 고도의 유사한 3차 구조를 나타낸다. 공지된 구조의 이들 2개의 단백질에 대한 hCMV gB의 서열 동질성은 28 내지 33%이며, hCMV gB가 또한 동일한 3-차원 폴딩을 공유함을 강력하게 제안한다. HSV-1 gB는, 결정 구조의 분해가 EBV gB의 것보다 유의적으로 우수하므로, 모델화 주형으로서 선택되었다. HCMV gB의 생성된 모델은 우수한 국소 기하학을 나타내는 것으로 밝혀졌으며 입체적 충돌은 검출되지 않았다. 또한, 시스테인의 쌍은 이황화물-결합 거리내에 위치하며, 포괄적인 구조적 특징뿐만 아니라, 국소 구조적 세부사항이 당해 모델에 의해 정확하게 반영되었음을 나타낸다. 당해 모델은 또한 단일의 연속 펩타이드 쇄로서 Dom II의 발현을 허용한 작제물의 설계를 위한 기준을 제공한다. 원시 아미노산 서열내에서 불연속성인 당해 도메인의 경우, 5개의 잔기 링커를 설계하여 하기 실시예 10에 기술된 바와 같이 도메인의 2개 부위를 연결시켰다.

실시예 10: 사람 혈청에 의한 hCMV gB 단백질 인식

항체 결합에 대한 Dom I 및 Dom II를 시험하기 위하여, 진핵 세포내에서 도메인의 합성을 허용하는 발현 플라스미드를 작제하였다. 둘다의 경우에서 클로닝 전략은 검출을 용이하도록 하기 위해, 각각의 펩타이드의 아미노 말단에서 HA-에피토프 태그의 부착을 포함하였다.

실시예 10.1: hCMV gB 단백질 Dom II의 발현 및 사람 혈청에 의한 인식

hCMV gB의 구조적 모델을 기초로, 재조합적으로 발현된 gB Dom II가 천연 형질감염 동안 면역원성일 수 있는지를 분석하였다. 당해 목적을 위해 진핵세포 발현 벡터를 작제하였으며 이는 포유동물 세포내에서 Dom II의 발현을 허용하였다. Dom II는 gB 균주 AD169(서열번호: 239)의 아미노산 121-132번 및 아미노산 344-438번 에 의해 생성된 불연속 에피토프이다. Dom II를 발현시키기 위해, gB-특이적인 잔기 121-132번 및 344-438번을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 굴곡성의 5개 아미노산 링커(Ile-Ala-Gly-Ser-Gly; 서열번호: 319)를 암호화하는 뉴클레오타이드 길이로 연결하였다. 당해 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터 pcUL132sigHA, 즉, hCMV의 엔벨로프 당단백질 gpUL132의 정확한 시그날 서열(아미노산 1-27번; 서열번호: 320; 참조: Spaderna et al., 2005)에 이어, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)-에피토프 태그(YPYDVPDYA; 서열번호: 321)를 함유하는 pcDNA3.1-계 벡터내로 삽입하였다. 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 Dom II를 HA-tag 서열의 하부에 제한 부위 EcoRI 및 XbaI을 사용하여 삽입하였다. 플라스미드로부터 정확한 단백질 발현은 HA-태그된 Dom II 융합 단백질을 생성하며, 이는 세망세포질 및 골지통과(trans-golgi) 네트워크를 통해 소송됨으로써 글리코실화에 의해 적절히 변형된다. 링커-커플링된 불연속 Dom II에 대한 암호화 영역은 화학적으로 합성되었다(제조원: GeneArt, 독일 레겐스부르크).

항체 인식용 Dom II 펩타이드를 분석하기 위해, Dom II를 Cos7 세포내에서 일시적으로 발현시키고 무작위적으로 선택된 hCMV-혈청양성 공여자로부터의 13개의 혈청을 사용하여 간접적인 면역형광성에 있어서의 반응성에 대해 분석하였다. 24-웰 플레이트내 유리 커버슬립위에서 성장시킨 Cos7 세포를 0.8μg의 Dom II를 암호화하는 발현 플라스미드로 리포펙타민(제조원: Invitrogen, 독일 카를스루헤 소재)을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 고정시키고 빙-냉 메탄올로 침투시켰다. 이후에 환자 혈청을 원시 항체로서 가하였다. 결합되지 않은 혈청 항체를 PBS를 사용한 3회 세척으로 제거하였다. 사람 혈청으로부터 원시 항체의 결합은 FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트)와 접합된 적절한 제2 항체(제조원: Dako, 독일 함부르크 소재)로 검출하였다. 세포 핵의 역염색은 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로 수행하였다. 영상을 비시트론 시스템스 전하-커플링된 장치 카메라(Visitron Systems charge-coupled device camera)(독일 푸크하임 소재)가 장착된 짜이스 악시오플란 2 형광 현미경(Zeiss Axioplan 2 fluorescence microscope)을 사용하여 수집하였다. 영상을 메타뷰 소프트웨어(MetaView software) 및 아도브 포토샵(Adobe Photoshop)을 사용하여 가공하였다. 항체: 대조군: gB-특이적인 사람 단클론 항체 C23 (TI-23; 참조: Meyer et al., 1990), gN-특이적인 쥐 단클론 항체 14-16A(참조: Mach et al., 2000), 및 gH-특이적인 쥐 단클론 항체 SA4(참조: Urban et al., 1992), 쥐 항-HA(제조원: Sigma Aldrich, 독일 스타인하임 소재), 및 쥐 항-GST (BIOZOL, 독일 에칭 소재). 총 gB (아미노산 1-906번)를 발현하는 플라스미드를 추가의 대조군으로 제공하였다. 혈청 중 모든 것이 전체 gB와 양성 반응을 나타내었지만, 13개 혈청 중 단지 4개만이 Dom II에 대해 양성으로 염색되었다. 이는, Dom II가 천연의 hCMV 감염 동안 항체를 유도하는데 관여함을 입증한다.

사람 혈청의 거대 패널 상에서 gB Dom II에 대해 지시된 항체를 함유하는 환자 혈청의 빈도를 시험하고 이를 gB, AD-1 및 AD-2의 공지된 항원성 도메인에 대한 항체를 함유하는 혈청의 빈도와 비교하기 위해, Dom II 암호화 서열을 GST-융합 단백질로서 세균적으로 발현시키고, 정제하여 ELISA에 사용하였다. 이. 콜라이(E. coli)내에서 Dom II-GST(글루타티온-S-트랜스퍼라제)의 발현을 위한 플라스미드를 발현 벡터 pGEX-6P-1(제조원: Pharmacia Biotech, 독일 프라이부르크 소재)을 사용하여 생성시켰다. 플라스미드 DNA를 사용하여 GST 융합 단백질의 발현을 위해 이. 콜라이 DH10B을 형질전환시켰다. 각각의 융합 단백질을 유도시키고 가용성 형태의 단백질을 이. 콜라이 분해물로부터 제조업자의 지시에 따라 정제하였다. 친화성 매트릭스를 제조하기 위해, 2.6mg의 정제된 Dom II-GST 융합 단백질을 커플링 완충액에 대해 투석하고, 아미노링크 플러스 커플링 수지(AminoLink Plus Coupling Resin)(제조원: Thermo Fisher Scientific, 미국 록크포드 소재)에 제조업자의 지시에 따라서 접합시켰다. PBS로 1:3 (v/v)으로 희석시킨, 4ml의 hCMV 초면역 글로불린 제제를 2ml의 항원-커플링된 비드위에 통과시킨 후, PBS로 완전 세척하였다. 결합된 IgG를 0.2M 글리신-HCl, pH 3.0을 사용하여 1ml 분획으로 용출시키고 분획을 PBS에 대해 투석하였다. 총 IgG 농도를 ELISA로 측정하였다. 요약하면, 폴리스티렌 96-웰 플레이트를 100ng의 Fcγ-특이적인 아피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-사람 IgG(제조원: Jackson Immuno Research, 미국 웨스트 그로브 소재)으로 0.5M 탄산염 완충액, pH 9.6 속에서 밤새 4℃로 피복하였다. 50μl의 용적의 용출된 분획의 일련의 log₂ 희석물을 가하고 결합된 IgG를 Fcγ-특이적인, 폴리클로날 퍼옥시다제-접합된 염소 F(ab)₂-단편 항-사람 IgG(제조원: Jackson Immuno Research, 미국 웨스트 그로브 소재)를 사용하여 검출하였다. 공지된 농도의 사람 IgG 제제(제조원: Jackson Immuno Research, 미국 웨스트 그로브 소재)를 표준물로 사용하였다.

Dom II-GST 융합 단백질의 순도는 단백질의 꼬마지에 염색에 이은 PAGE로부터 평가된 것으로서 >90%이었다. 시판되는 시험으로 측정한 것으로서 hCMV 혈청 양성 개인으로부터의 총 80개의 무작위로 선택된 혈청을 분석하였다. hCMV 음성 공여체로부터의 10개 혈청을 음성 대조군으로서 보존하였다. hCMV-혈청양성 개인으로부터의 혈청 패널내에서 gB에 대한 개개 반응성은 100%이었으며, 당해 단백질의 고 면역원성을 강조한다(도 5). 본 발명자들의 앞서의 관측에 따라서, gB의 AD-1과의 양성 반응은 또한 100%이었다. 혈청 중의 57%는 AD-2에 대한 항체를 함유하였다(참조: Schoppel et al., 1996). Dom II 융합 단백질은 혈청 중 94%로 인식되었다. 따라서, Dom II는 gB의 다른 고도의 면역원성 도메인을 나타낸다. 원핵세포 발현된 융합 단백질은 항원으로 사용될 수 있으므로, 이는, 단백질 글리코실화가 항체 결합에 필수적이지 않음을 제안할 수 있다. Dom II 결합 항체의 분석을 위하여 초기 사용된 면역형광성 분석과 ELISA 사이의 인식 빈도에 있어서 차이는 검정의 상이한 민감성에 기인할 수 있다. gB의 명명법에 있어서 일관성을 위해서, Dom II를 AD-4로 지정하였다.

실시예 10.2: HA 태그를 가진 hCMV gB 단백질 Dom I의 발현 및 사람 혈청에 의한 인식

Dom I을 발현시키기 위하여, gB 균주 AD169(서열번호: 239)의 아미노산 132-343번을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발혐 벡터 pcUL132sigHA(상기 기술됨)내로 삽입시켜 벡터 pcAD-5를 생성하였다. 항체 인식을 위한 Dom I 펩타이드를 분석하기 위해, Dom I을 Cos7 세포 내에서 일시적으로 발현시키고 상기 실시예 10.1에 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 간접적인 면역형광성에 의한 반응성에 대해 분석하였다.

사람 혈청 중 Dom I 특이적인 항체를 포획 ELISA에서 측정하였다. 재조합체 항체 생산을 위해, 75cm² 플라스크내에서 293T 세포를 20μg의 플라스미드 pcAD-5 DNA로 인산칼슘 침전에 의해 형질감염시켰다 플라스크를 6일 동안 항온처리한 후 세포 및 이들의 상층액을 수거하였다. 포획-ELISA를 위해, ELISA 플레이트를 상기 실시에 8.3에 기술된 바와 같이, 125ng/웰의 마우스 항-HA 단클론 항체(제조원: Sigma)로 피복하고, 세척하며, 차단시키고, 다시 세척한 후, 형질감염된 293T 세포(HA-태그된 Dom I 함유)의 상층액과 함께 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이후에, 플레이트를 세정하고 사람 혈청과 1:50의 희석으로 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 결합되지 않은 항체를 세척에 의해 제거하고 퍼옥시다제-접합된 항-사람 또는 항-마우스 IgG(제조원: Dako, 독일 함부르크 소재)를 적절한 희석으로 1시간 동안 가하였다. 이후에, 플레이트를 세척하고 퍼옥시다제 기질 용액 B(제조원: KPL, Inc., 미국 소재) 속에서 1;1로 희석시킨 TMB 퍼옥시다제 기질 100μl를 5분 동안 가하였다. 반응을 100μl의 1M H₃PO₄를 가하여 중지시키고 OD₄₅₀을 Emax 미세플레이트 판독기(제조원: Eurofins MWG Operon, 독일 에베르스베르크 소재)를 사용하여 측정하였다. 플레이트를 상기 실시예 10.1에서 기술한 바와 같이 세척하고 현상하였다. 모든 항체를 PBS 속에서 2% FCS를 사용하여 희석시켰다. 간접적인 면역형광성으로 분석한 항체 결합은, 시험한 4개의 항체(Ab-47. Ab-48, Ab-49 및 Ab-50)가 Dom I-특이적인 펩타이드와 반응성이었음을 입증하였다(결과는 나타내지 않음).

Dom I이 중화 항체에 대한 신규 표적으로서 확인되었으므로, 4명의 개인으로부터의 클로날 항체 상층액을 재-시험하여 hCMV-감염된 개인에서 Dom I 특이적인 항체의 전체 빈도에 대한 정보를 수득하였다. Dom I 특이적인 기억 B 세포의 빈도는 상이한 공여자 중에서 가변성이나; 시험한 Dom I 항체 중 100%(6/6)가 중화 활성을 나타내었다(결과는 나타내지 않음).

Dom I 항체의 인식 빈도에 있어서의 정보를 수득하기 위해, 항체 반응성을 Dom I에 대해 보다 큰 혈청 패널의 hCMV-감염된 개인에서 측정하고 공지된 항원성 도메인과 비교하였다. 상기 실시예 10.1에 기술된 바와 같이, hCMV 혈청양성 개인으로부터의 80개의 무작위 선택된 혈청 전체를 분석하였다(도 5). 따라서, Dom I은 혈청중 57%로 인식되었으므로, 당해 도메인이 감염 동안 고 빈도로 항체를 유도하는 gB 단백질상의 항원성 도메인을 나탸냄을 지적한다.

gB 항원성 도메인의 명명법에 있어서 일관성을 위해, Dom I을 AD-5로 지정하였다.

실시예 11: 사람 혈청중 AD-4(Dom II) 항체 역가와 중화능 사이의 상관관계

문헌의 데이타는, gB가 천연 감염 동안 중화 항체의 유도와 관련하여 우성 항원 중 하나임을 지지하며 항-gB 역가와 중화능 사이의 상관관계가 보고되어 있다(참조: Marshall et al., 1992). 이러한 상관관계가 다수의 상이한 에피토프에 대해 지시된 다양한 상이한 항체 특이성에 있는지 또는 제한된 수의 도메인이 관여하는지는 명확하지 않다. Ad-4 (Dom II) 특이적인 항체가 제공된 혈청의 전체 중화능에 유의적으로 기여하는지를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 혈청 패널내 중화 역가를 측정하고 이를 재조합체 gB, AD-1, AD-2 및 AD-4 각각에 대해 ELISA 역가와 관련시켰다. 단백질을 0.5M 탄산나트륨 완충액, pH 9.6, 또는 6M 우레아 속에서 25ng 내지 200ng(항원에 의존) 사이로 희석시키고 50μl를 사용하여 미세역가 플레이트를 밤새 4℃에서 피복시켰다. 모든 후속적인 단계는 실온에서 수행하였다. 반응 웰을 0.1% 트윈 20이 보충된 PBS로 세정하고 2시간 동안 2% FCS를 함유하는 PBS로 차단시켰다. 플레이트를 0.1% 트윈 20이 보충된 PBS로 다시 세정하고 단클론 항체, 사람 혈청, 폴리클로날 용출된 항체 분획 또는 마우스 혈청(50μl/웰)과 함께 2시간 동안 항온처리하였다. 결합되지 않은 항체를 세척으로 제거하고 퍼옥시다제-접합된 항-사람 또는 항-마우스 IgG(제조원: Dako, 독일 함부르크 소재)를 적절한 희석에서 1시간 동안 가하였다. 플레이트를 세척하고 퍼옥시다제 기질 용액 B(제조원: KPL, Inc., 미국 소재) 속에 1:1로 희석된, 테트라메틸벤지딘(TMB) 퍼옥시다제 기질 100μl를 5분 동안 가하였다. 반응을 100μl의 1M H₃PO₄ 를 가하여 중지시키고 OD₄₅₀을 Emax 미세플레이트 판독기(제조원: Eurofins MWG Operon, 독일 에베르스베르크 소재)를 사용하여 측정하였다. 모든 항체의 희석은 PBS 속에서 2% FCS를 사용하여 수행하였다. gB 융합 단백질을 포함하는 모든 분석에서, 각각의 원핵세포 융합 파트너를 평행하게 분석하고 광학 밀도를 gB-융합 단백질을 사용하여 수득한 값으로부터 감하였다.

앞서 보고한 바와 같이, ELISA에 있어서 gB의 인식과 중화능 사이에 상관관계가 존재한다(참조: Marshall et al., ibid). 분석은 또한 중화능과 AD-1 및 AD-4(Dom II)에 대한 항체 결합 역가 사이에 통계적으로 유의적인 상관관계를 나타내나 AD-2에 대해서는 그렇지 않다(도 6).

실시예 12: AD-4(Dom II)은 천연 감염동안 바이러스 중화 항체를 유도한다.

AD-4가 천연 감염 동안 바이러스 중화 항체를 유도하는지의 의문을 보다 상세히 시험하기 위해 본 발명자들은 2개의 시도를 사용하였다. 첫째로, 본 발명자들은 혼주된 사람 IgG 제제로부터 폴리클로날 항-AD-4 항체를 정제된 AD-4-GST (Dom II-GST) 융합 단백질을 친화성 매트릭스로 사용하여 분리하였다. 예측한 바와 같이, 혼주된 사람 IgG 제제는 간접적인 면역형광성 분석에 이은 Cos-7 세포내에서 각각의 당단백질 복합체의 일시적인 발현시 다수의 상이한 hCMV-특이적인 엔벨로프 당단백질과 반응성인 항체를 함유하였다.

둘째로, 본 발명자들은 AD-4에 대한 결합에 대해 본 발명에서 기재한 gB-특이적인 사람 단클론 항체를 시험하였다. 재조합체 항체 모두는 Cos7 세포내에서 일시적으로 발현된 AD-4 단백질을 사용한 간접적인 면역형광성에서 AD-4에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, AD-4는 본 발명에 기재된 사람 단클론 항체에 의해 인식된 구조적 에피토프를 나타낸다.

AD-4-특이적인 항체의 분리를 위한 매트릭스를 제조하기 위하여, 2.6mg의 정제된 AD-4-GST 융합 단백질을 세파로즈에 공유결합으로 커플링시키고 4ml의 사람 IgG 제제로부터 AD-4-특이적인 IgG를 친화성 정제하였다. 총 127μg의 IgG를 수득하였다. ELISA 시험은, 친화성 정제된 IgG 분획(E3)이 AD-4 및 gB에 대해 특이적인 결합을 나타내지만 AD-1 및 AD-2에 대해서는 그렇지 않음을 입증하였다(도 7a). hCMV에서 추가의 중화-관련 항원에 대해 지시된 항체에 의한 친화성 정제된 AD-4 항체의 오염을 추가로 배제시키기 위하여, 본 발명자들은 gH 또는 gM/gN 복합체; 천연 감염 동안 중화 항체를 유도하는 것으로 알려진 바이러스 엔벨로프 단백질(참조: Shimamura et al., 2006; Urban et al., 1996)을 일시적으로 발현하는 Cos7 세포를 사용하여 간접적인 면역형광성 분석을 수행하였다. 정제된 폴리클로날 항-AD-4 IgG 분획은 비-gB 엔벨로프 복합체에 대해 특이적인 검출가능한 항체를 함유하지 않았다. 또한, IgG 분획은 IgM을 함유하지 않았다(나타내지 않음), 친화성 정제된 IgG 제제(E3)를 이후에 중화 검정에서 시험하였다. 바이러스 감염성의 50% 중화가 본 발명에 기재된 잠재적인 gB-특이적인 사람 단클론 항체의 범위내인 대략 0.2μg/ml의 IgG 농도에서 달성되었다(도 7b). 비교시, 친화성 정제된 IgG 분획이 기원하는 원래의 혈청 혼주물은 대략 200μg/ml IgG에서 도입 바이러스의 50% 중화를 나타내었다(도 7b). 요약하면, 이들 데이타는, AD-4가 gB의 고도로 면역원성인 도메인을 나타낼 뿐 아니라 또한 바이러스 중화 항체의 표적임을 나타낸다.

실시예 13: 사람 재조합체 항체 결합의 특이성

13.1: AD-4에 대한 사람 재조합체 항체 결합의 양호한 특이성

AD-4의 크기(>100 아미노산)는 수개의 항체 결합 에피토프를 지닐 정도로 충분히 크다. 중화 및 비-중화 항체에 의해 결합될 수 있는 에피토프의 밀접한 근접성이 gB의 AD-1 및 AD-2의 경우 발견되었으며 효과적인 바이러스 중화를 피하기 위한 메카니즘으로 암시되어 왔다. 따라서, AD-4내에서 잠재적인 에피토프에 대한 추가의 정보를 수득하는 것이 흥미로운 것이었다. 아미노 말단 끝에서 아미노산 121-132번의 제거 또는 카복시 말단 끝에서 마지막 5개 아미노산의 제거에 의해 짧아진 AD-4에 대한 초기 시도는 완전한 항체 결합의 손실을 초래하였으며, 이는, 전체 도메인만이 항체 결합 구조를 형성할 수 있음을 나타낸다. AD-4내에서 잠재적으로 중요한 항체 접촉 잔기를 확인하기 위해, AD-4 돌연변이체 펩타이드를 발현한 진핵세포 발현 플라스미드의 수(n=17)를 작제하였으며, 이들 각각에서 2개의 근접한 표면 노출된 잔기는 알라닌으로 교환되었다(도 8). 잔기의 표면 노출은 실시예 9에 기술된 바와 같이 hCMV gB 모델로부터 확인되었다.

사람 단클론 항체 Ab-11, Ab-14, 및 Ab-28을 간접적인 면역형광성에 이은, 각각의 돌연변이체 AD-4 단백질의 일시적인 발현에서 시험하는 경우, 인식의 2개 양식이 발견되었다. 항체 Ab-28은 모든 AD-4 돌연변이체 단백질에 결합한 반면, 나머지 항체는, 라이신 잔기 378 및 379번이 알라닌으로 교환된 돌연변이체를 인식하지 않았다. 이는, AD-4가 본 명세서에 기재된 재조합체 사람 단클론 항체에 의해 인식됨을 입증한다.

또한, 이들 데이타는, AD-4내 디-라이신 서열(K378K379)이 중요한 항체 결합 부위를 나타냄을 지적한다. 그러나, 간접적인 면역형광성에서 수득된 시그날은 정량하기 어려우며, AD-4G 돌연변이체 펩타이드를 사용한 반응의 결여가 검정의 검출 한계 이하의 항체의 감소된 결합을 단지 반영할 가능성이 존재하였다. 따라서, 보다 더 정량적인 데이타를 수득하고 간접적인 면역형광성에 의해 수득된 결과를 확인하기 위해, AD-4 돌연변이체 단백질 중 5개를 GST-융합 단백질로서 발현시키고, 정제하고 ELISA에서 사용하였다. GST-융합 단백질의 순도는 모든 펩타이드를 도 5에서 상기 나타낸 야생형 AD-4에 대해 비교가능하였다. AD-4G (K378K379) 돌연변이체 외에, 융합 단백질은 입체적으로 근접한 잔기, 및 가장 먼게 위치한 돌연변이체 AD-4L (N405T406)에 영향을 미치는 AD-4H (Q380E381), AD-4E (E359D362) 및 AD-4I (N383S385)를 포함하였다. ELISA에 의해 수득된 결과는 면역형광성 데이타와 일치하였다. AD-4G를 제외하고, 돌연변이체 단백질은 비교가능한 효능을 가진 단클론 항체에 의해 인식되었다. 그러나, AD-4G는 항체 Ab-28에 의해서만 인식되었다(도 9a). 흥미롭게도, 친화성 정제된 IgG 분획은 모든 AD-4 융합 단백질과 유사한 반응성을 나타내었으며, 이는, 항체 중 대부분이 AD-4G 골연변이와 독립적으로 결합하였음을 나타내었다(도 9b). 친화성 정제된 IgG 제제는 공지되지 않은 수의 공여자의 혈청 혼주물로부터 기원하였으므로, AD-4 에피토프의 인식에 있어서 개개 차이는 평균으로 예측될 수 있다.

잠재적인 AD-4 에피토프 특이성의 추가 정보를 수득하기 위해, 본 발명자는 378 및 379번 위치에서 2개의 라이신이 또한 개개 사람 혈청내 존재하는 항체와의 반응성에 대해 중요한 잔기인지를 시험하였다. 당해 목적을 위해, 5개의 AD-4 돌연변이체 펩타이드를 상기한 바와 같이 동일한 혈청 패널로 시험하고 각각의 혈청에 대해 최저 및 최고 흡광도 값 사이에서 몫을 계산하였다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 대부분의 혈청은 1 내지 5배의 낮은 최대 차이를 생성하는 유사한 효능으로 5개의 AD-4 펩타이드를 인식하였다. 그러나, 5개의 혈청은 10 내지 100배의 범위내에서 최대 차이를 나타내었다. 흥미롭게도, 차이는 1개의 예외와 함께 돌연변이체 단백질 AD-4G의 감소된 인식에 기인하였다. 최고의 최대 차이를 가진 혈청은 돌연변이체 단백질 AD-4H (Q380E381)에 대한 감소된 결합을 나타내었으며, 이는 AD-4의 3D 모델에서 AD-4G(K378K379)내 디-라이신 모티프에 매우 근접하게 위치한다. 따라서, 비록 약간의 혈청의 결합이 대부분 378과 381번 사이의 원래의 gB 펩타이드 서열에 대해 거의 완전한 의존성을 나타내었다고 하더라도, 개개 사람 혈청에 의한 AD-4의 인식은 당해 서열과 크게 독립적인 정도이다. 당해 결과는, AD-4G 돌연변이체 단백질을 항원으로 사용하여 친화성 정제한 IgG 분획이 AD-4 돌연변이체 단백질의 ELISA에서 유사한 인식 양식 및 AD-4 야생형에서 정제된 IgG와 비교가능한 중화 역가를 가진 발견과 일치하였다.

13.2: AD-5(Dom I)에 대한 사람 재조합체 항체의 양호한 특이성

상기 실시예 13.1에 기술된 것들과 유사한 실험은 AD-5 (Dom I)을 사용하여 수행할 수 없는데, 그 이유는, AD-4와는 대조적으로, AD-5는 원핵세포 발현 후 정확하게 폴딩되지 않으므로 친화성 정제용 항원이 생성될 수 없기 때문이다. 그러나, 2개의 도메인내로 AD-5를 소분리한 후, 이를 항체 인식에 대해 시험하는 것은 가능하였다. 구조적 정보를 기초로 하여, AD-5를 소도메인 1(AD-5-S1)으로 분리하였으며, 이는 gB 단백질 AD169(서열번호: 239)의 아미노산 133-144번 및 251-343번을 포함하는 소도메인 1 (AD-5-S1) 및 gB 단백질 AD169(서열번호: 239)의 아미노산 140-255번을 포함하는 소도메인 2(AD-5-S2)로 나누었다.

본 발명에 기술된 AD-5 항체가 이들 소도메인을 인식하는지를 측정하기 위해, 포획 ELISA를 실시예 10.2에 기술된 바와 같이 수행하였으며, 여기서 293T 세포를 소도메인 AD-5-S1 및 AD-5-S2, 및 AD-4 + AD-5로 형질감염시켰다. 재조합체 AD-5 항체 Ab-47 내지 Ab-50를 환자 혈청보다는 검출에 사용하였다. 수행된 간접적인 면역형광성의 결과는, 항체 Ab-47 및 Ab-50이 AD-5-S1을 인식함을 나타내었다(결과는 나타내지 않음). 포획 ELISA로부터의 결과는 도 11에 나타내며, 이들은, 항체 Ab-47 내지 Ab-50 모두가 gB AD-4 + AD-5를 인식하고 항체 Ab-47, Ab-49 및 Ab-50이 gB AD-5 및 특히 AD-5-S1을 인식함을 나타낸다. 항체 Ab-47 내지 Ab-50 중 어느 것도 gB AD-5-S2를 인식하지 않았다. 따라서, 이들 결과로부터, 항체 Ab-47, Ab-49 및 Ab-50은 AD-5-S1내에 위치하는 gB 단백질 상의 에피토프, 즉, gB 단백질(균주 AD169; 서열번호: 239)의 아미노산 133-144번 및 251-343번내의 에피토프를 인식한다고 유추할 수 있다.

실시예 14: hCMV gB의 전융합 구조의 모델

HSV-1 gB에 따라 모델화된 hCMV gB의 구조내에서, AD-4는 분자의 중간의 혹(hump)에 위치한다. 디-라이신 모티프는 표면에 용이하게 접근가능하다. 3D 공간내 AD-4 결합 항체의 배향에서 데이타 부재시, 당해 단백질 구조내 항체 결합은 이웃하는 단백질과 gB의 상호작용에 영향을 미칠 수 있는 것으로 예측될 수 있다. hCMV를 포함하는 다수의 헤르페스 바이러스의 경우, gB는 추가의 엔벨로프 당단백질과 상호작용하여 융합 공정동안 적절히 기능할 필요가 있는 것으로 알려져 있다(참조: Avitabile et al., 2009; Patrone et al., 2007). 그러나, 가장 가능하게는, HSV-1 gB는 융합후 구조를 나타낸다. 이러한 추측은 융합후(postfusion) 및 융합전(prefusion) 구조 둘다 이용가능한 VSV-G에 대한 HSV-1 gB의 구조적 상동성에 기초한다(참조: Roche et al., 2006 & 2007). 융합전 형태는 비리온에서 우세한 반면 융합후 형태는 일부, 아직 확인되지 않은, 세포 구획에서 주로 존재하는 것으로 사료된다. AD-4-특이적인 항체는 gB의 세포 및 바이러스 형태에 결합하므로, gB 구조들 둘다를 명백히 인식할 수 있다. VSV-G의 경우 융합전 및 융합후 형태는 개개 단백질 도메인의 강력한 구조적 재배열을 나타내므로, 본 발명자들은 HCMV gB의 융합전 형태를 모델화하여 융합전 삽합체내 AD-4의 잠재적인 국재화 및 항체 결합에 중요한 잔기의 위치에 대한 추가의 통찰력을 수득하였다.

단일의 hCMV gB 도메인 I, II, III 및 IV는 융합후 모델로부터 취하였으며 VSV-G의 융합전 구조(참조: Roche et al., 2007) 위에 멀티프렙 알고리즘(MultiProt algorithm)(참조: Shatsky et al., 2004)을 사용하여 겹쳐놓았다. HCMV gB 도메인 V 및 도메인 III의 잔기 Leu469 내지 Arg496는, 이들이 구형이 아니며 VSV-G 주형내에 동등한 구조가 존재하지 않으므로 배제시켰다. 개개의 피트(fitted)된 도메인들 사이의 연결 루프를 모드루프(ModLoop)(참조: Fiser et al., 2003)로 모델화하였다. 삼합제 융합전 모델은 VSV-G 융합전 기하학을 적용시켜 수득하였다.

hCMV gB의 융합후 구조가 HSV-gB의 동종 결정 구조를 기초로 용이하게 모델화될 수 있다고 해도, 당해 계열의 분자의 융합전 구조에 대해 여전히 이용가능한 실험적 구조 정보는 존재하지 않는다. VSV-G의 2개 구조로부터, 개개 단백질 도메인이 이들의 폴딩을 유지하지만 도메인의 상대적인 배열은 융합전과 융합후 상태 사이의 이전시 현저히 변화함이 알려져 있다. 항체 결합에 중요한 융합전 삼합체내 AD-4의 잠재적인 국재화 및 잔기의 위치에 대한 추가의 통찰력을 수득하기 위해, hCMV gB 융합전 구조의 이론적 모델을 생성하였다. 당해 목적에 대해, 개개 도메인 폴딩을 융합후 모델로부터 수득하고 VSV-G로부터의 당단백질 G의 융합전 구조로부터 도메인 배열에 대한 정보를 사용하였다(참조: Roche et al., ibid). 수득되는 모델은 입체적 충돌을 나타내지 않으며 연결 서열은 당해 대안적인 기하학에서 도메인을 연결하기에 충분히 길어서, 당해 도메인 배열이 hCMV gB에서 구조적으로 실현가능함을 제안한다. hCMV gB 융합전 구조의 도메인 배열은 각각의 융합후 결정 구조를 기초로 생성된 EBV gB 융합전 구조의 이전 모델의 것과 고도로 유사하다(참조: Backovic et al., 2009).

hCMV gB의 융합전 및 융합후 구조 사이의 주요 차이는 단백질의 정점 부분(apical part)의 조성에서 발견된다. 융합 후 구조에서 당해 영역은 도메인 IV에 의해 형성되며, 여기서 AD-1이 위치한다. 대조적으로, 융합전 모델에서 Dom II/AD-4는 분자의 상부에, Dom II/AD-4의 정점 표면상의 중심 위치에 위치하는 디-라이신 모티프(Lys378, Lys379)와 함께 위치한다. 따라서, gB의 융합전 형태에 대한 결합된 IgG 분자의 부분 조직화는 융합후 형태와는 상이한 것으로 여겨지며 표적 세포의 성분에 대한 gB의 결합을 방해할 수 있다. 비-gB 분자와의 상호작용의 차단과는 별도로, Dom II/AD-4에 결합된 IgG 분자는 또한 적절한 기능에 필수적일 수 있는 단백질내 구조적 변화를 속박할 수 있다.

실시예 15: 사람 혈청의 존재하에서 중화 검정

임상 셋팅에서, 본 발명의 항체는 정맥내 주입에 의해 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여될 수 있다. 따라서, 항체 기능이 사람 혈청내 항체의 존재에 의해 손상받을 가능성을 배제시킬 필요가 있다. 3개의 상이한 유형의 혈청을 시험하였다: hCMV-특이적인 항체에 대해 음성인 혈청, hCMV-특이적인 항체 및 Intratect^®(제조원: Biotest AG)에 대해 양성인 혈청, CMV-특이적인 항체가 풍부한 hCMV 혈청 제제. 첫째로 각각의 분석된 혈청의 IgG 농도 및 50% 중화 활성을 적정으로 측정하였다. 요약하면, ELISA 플레이트를 항 사람 IgG, Fcγ 단편-특이적인 캐칭 항체(catching antibody)(제조원: Jackson ImmunoResearch, 미국 소재)로 피복하엿다. ELISA 완충액 속에서 혈청의 2-배의 일련 희석물을 공지된 농도의 IgG 표준(제조원: Jackson ImmunoResearch, 미국 소재)와 비교하였다. IgG-농도는 ELISA 소프트웨어 소프트막스 Pro 3.0(제조원: Molecular Devices, 미국 캘리포니아 서니베일 소재)를 사용하여 계산하였다. 혈청의 50% 중화 활성은 실시예 2에서 위에 기술된 바와 같은 루시퍼라제-계 중화 검정을 수행함으로써 측정하였다.

다음에, 실시예 2에서 앞서 기술한 바와 같은 경쟁적 중화 검정에서, 항체 Ab-28를 연마하여 이것이 고정 농도의 혈청의 첨가 전에 50% 중화 마크를 교차할 수 있도록 하였다. hCMV-특이적인 항체 및 Intratect^®에 대해 양성 또는 음성인 혈청을 연마된 Ab-28에 이들의 각각의 50%-중화 활성 주변의 고정 농도에서 가하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 혈청 항체에 의해 Ab-28 중화능의 억제는 나타나지 않았다. hCMV-음성 혈청을 연마된 Ab-28에 첨가한 후, 곡선은 Ab-28 단독의 곡선과 동일한 것으로 보였다. 당해 결과는, Ab-28의 중화능에 손상을 줄 수 있는 사람 혈청내 비특이적인 시약이 존재하지 않음을 나타낸다. hCMV-양성 혈청 또는 Intratect^®을 Ab-28에 가한 경우, Ab-28 및 혈청 중화 활성 둘다의 향상이 관측되었다. 혈청 중화 활성은 Ab-28의 존재하에서 약 20 내지 40%까지 증가하였으며, Ab-28의 중화능은 hCMV 양성 혈청 또는 Intratect^®의 첨가 후 약 15% 까지 증가하였다.

실시예 16: 흡착 후 중화 검정

본 발명의 항체가 세포내로 조기 단계의 바이러스 침투를 차단할 수 있는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 흡착 후 중화 검정을 수행하였다. 중화 검정의 방법은 실시예 2에 기술된 것과 유사하였으나; 초기에 HFF 및 루시퍼라제를 발현하는 hCMV를 1시간 동안 4℃에서 항온처리하여 바이러스 흡착만을 허용하였으마 바이러스- 및 세포 막의 융합을 허용하지 않았다. 당해 흡착 기간 후, 흡착되지 않은 바이러스를 1xPBS로 세척 제거하였다. 항체를 150㎍/ml 내지 5㎍/ml의 매우 높은 IgG-농도로 별도의 플레이트 속에서 적정한 후 예비-흡착된 바이러스-세포 혼합물에 가하였다. 항체 Ab-02, Ab-28, Ab-04 및 대조군 항체 C23(T123; 일본 소재의 Teijin Pharma Limited의 선물)를 당해 실험에 사용하고 각각의 항체를 30, 80 또는 120분 동안 4℃에서 예비-흡착된 바이러스-세포 혼합물과 함께 항온처리하였다. AD-2-특이적인 항체 C23은 세포내로 바이러스 침투를 억제하는 것으로 밝혀졌다(참조: Ohizumi et al., 1992). 30, 80 또는 120분의 항온처리 기간 후, 플레이트를 1회 이상 세척한 후 48시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이 시점으로부터, 검정을 실시예 2에서와 같이 지속하였다. 결과는 도 13에 나타내며 다음과 같이 요약한다. 30분의 항온처리 기간 후, 적어도 100㎍/ml의 각각의 항체가 바이러스 감염성의 50% 감소를 달성하는데 요구되었다. 한편, C23은 30분의 항온처리 후 5㎍/ml의 매우 낮은 농도에서 조차 바이러스 침투을 억제하는 것으로 나타났다. 80분 후, 단지 20㎍/ml의 Ab-02 및 Ab-28이 50% 중화를 위해 요구되었다. 그러나, Ab-04의 경우, 55㎍/ml가 바이러스 감염성을 50%까지 중화시키는데 필요하였다. 대조군 항체 C23의 80분 곡선은 예측된 결과를 나타내지 않았다. 당해 항체는 보다 긴 항온처리 기간 후 더 우수하지 않은 경우, 적어도 양호할 수 있는 것으로 예측될 수 있다. 또한, 평균의 표준 오차는 80분 항온처리 기간에서 C23에 대해 매우 분산되었으므로, 당해 시점은 결과로부터 배제하였다. 120분 동안 항체와 예비-흡착된 바이러스를 항온처리한 경우, 단지 약 5-15㎍/ml의 각각의 항체 또는 C23이 바이러스 감염의 50% 감소에 필요하였다. 결론적으로, 항체 Ab-02, Ab-28 및 Ab-04는 이미 흡착된 바이러스의 세포내로의 침투를 방지할 수 있다.

실시예 17: 다른 gB-특이적인 항체를 사용한 경쟁적인 중화 검정

중화 항체와 비-중화 항체 사이의 gB-에피토프 결합에 대한 경쟁은 AD-1-특이적인 항체에 대해 보고되어 있다(참조: Ohlin et al., 1993). 본 발명의 항체와 다른 gB-특이적인 항체 사이의 가능한 경쟁적 또는 심지어 상승적 효과를 시험하기 위해, 경쟁적 중화 검정을 수행하여 본 발명의 항체의 중화 활성에 있어서 AD-1 (ITC52) 및 AD-2-특이적인 (ITC88) 항체의 효과를 측정하였다. 이를 수행하기 위해, 하나의 항체를 적정하고 다른 항체를 이의 50%-중화 활성 주변의 고정 농도에서 가하였다. 이들 경쟁적 중화 검정은 각각의 항체: Ab-11, Ab-14, Ab-19, Ab-28, Ab-04, Ab-42로 수행하였다. 2개의 상이한 시도를 비교함으로써 시험 항체를 적정하고 ITC52 또는 ITC88을 고정 농도에서 가하거나 ITC-항체를 연마하고 시험 항체를 고정 농도에서 가하였다. ITC52는 비-중화 항체이므로, 이는 3㎍/ml의 농도에서 가하였으며, 동일한 농도에서 중화 항체 ITC88를 가하였다. 시험한 다른 항체는 유사하게 행동하므로, Ab-28에 대한 데이타 만을 나타낸다. 또한, 대안적인 시도가 비교가능한 결과를 나타내었으므로, 고정 농도에서 Ab-28을 남기고 ITC-항체를 적정하는, 단지 하나의 시도만을 나타낸다(도 14).

결과는, 고 농도의 AD-1-특이적인 항체 ITC52의 존재하에서 Ab-28의 중화 활성의 약간의 손상이 존재함을 나타낸다. 당해 효과는 시험한 각각의 항체에 대해 관측되었으며 추가의 독립된 실험에서 재생되었다(데이타는 나타나지 않음). 그러나, 고 농도의 ITC52은 ITC88의 중화 활성을 감소시키지 않는 것으로 여겨진다. Ab-28 및 ITC88은 둘다 개선된 중화 활성을 생성하였다. 이는 특히 혼합된 경우와는 반대로 ITC88 만의 제2 데이타 점에서 특히 가시적이다. Ab-28의 존재하에서 ITC88의 중화 활성의 40% 증가는 Ab-28을 사용한 당해 시점에서 관측되며 또한 자체에 의해서보다는 ITC88을 사용하여 대략 15%의 중화에 있어서의 증가를 나타낸다.

상이한 AD-4-특이적인 항체와 AD-1 또는 AD-2-특이적인 항체 사이의 잠재적인 억제, 첨가 또는 상승적 효과를 분석하는 상기 실험 외에, 본 발명자들은 또한 유사한 효과가 AD-4(Dom II)와 AD-5 (Dom I)-특이적인 항체 사이에서 관측될 수 있는지를 시험하였다. Ab-28 (AD-4-특이적인)을 Ab-50 또는 Ab-49 (AD-5-특이적인)와 제1의 웰 속에서 50:50의 비로 혼합하고 루시퍼라제를 발현하는 hCMV를 첨가하기 전에 1:2의 일련 희석으로 지속하였다. 이들 항체 혼합물의 중화 활성을 각각의 항체의 단일 적정과 비교하였다(도 15). AD-4-특이적인 항체와 AD-5-특이적인 항체 사이의 약간의 추가의 효과 만이 억제성 또는 상승적 효과가 관측되지 않은 것과 함께 관측되었다. 당해 실험을 비교가능한 결과와 함께 2회 추가의 시기에 반복하였다(데이타는 나타내지 않음).

[

서열

결합 멤버의 V_H 도메인, V_L 도메인 및 CDR 서열을 첨부된 서열 목록에 나타내며, 여기서 서열번호는 다음과 같이 상응한다:

1 SM5-1 V_H 뉴클레오타이드

2 SM5-1 V_H 아미노산

3 SM5-1 V_H CDR 1 aa

4 SM5-1 V_H CDR 2 aa

5 SM5-1 V_H CDR 3 aa

6 SM4-10 V_H 뉴클레오타이드

7 SM4-10 V_H 아미노산

8 SM4-10 V_H CDR 1 aa

9 SM4-10 V_H CDR 2 aa

10 SM4-10 V_H CDR 3 aa

11 SM6-5 V_H 뉴클레오타이드

12 SM6-5 V_H 아미노산

13 SM6-5 V_H CDR 1 aa

14 SM6-5 V_H CDR 2 aa

15 SM6-5 V_H CDR 3 aa

16 SM1-6 VH 뉴클레오타이드

17 SM1-6 VH 아미노산

18 SM1-6 VH CDR 1 aa

19 SM1-6 VH CDR 2 aa

20 SM1-6 VH CDR 3 aa

21 SM3-1 VH 뉴클레오타이드

22 SM3-1 VH 아미노산

23 SM3-1 VH CDR 1 aa

24 SM3-1 VH CDR 2 aa

25 SM3-1 VH CDR 3 aa

26 SM11-17 VH 뉴클레오타이드

27 SM11-17 VH 아미노산

28 SM11-17 VH CDR 1 aa

29 SM11-17 VH CDR 2 aa

30 SM11-17 VH CDR 3 aa

31 SM11-21 VH 뉴클레오타이드

32 SM11-21 VH 아미노산

33 SM11-21 VH CDR 1 aa

34 SM11-21 VH CDR 2 aa

35 SM11-21 VH CDR 3 aa

36 SM6-11 VH 뉴클레오타이드

37 SM6-11 VH 아미노산

38 SM6-11 VH CDR 1 aa

39 SM6-11 VH CDR 2 aa

40 SM6-11 VH CDR 3 aa

41 SM4-3 VH 뉴클레오타이드

42 SM4-3 VH 아미노산

43 SM4-3 VH CDR 1 aa

44 SM4-3 VH CDR 2 aa

45 SM4-3 VH CDR 3 aa

46 SM5-3 VH 뉴클레오타이드

47 SM5-3 VH 아미노산

48 SM5-3 VH CDR 1 aa

49 SM5-3 VH CDR 2 aa

50 SM5-3 VH CDR 3 aa

51 SM5-9 VH 뉴클레오타이드

52 SM5-9 VH 아미노산

53 SM5-9 VH CDR 1 aa

54 SM5-9 VH CDR 2 aa

55 SM5-9 VH CDR 3 aa

56 SM1-7 VH 뉴클레오타이드

57 SM1-7 VH 아미노산

58 SM1-7 VH CDR 1 aa

59 SM1-7 VH CDR 2 aa

60 SM1-7 VH CDR 3 aa

61 SM1-8 VH 뉴클레오타이드

62 SM1-8 VH 아미노산

63 SM1-8 VH CDR 1 aa

64 SM1-8 VH CDR 2 aa

65 SM1-8 VH CDR 3 aa

66 SM3-4 VH 뉴클레오타이드

67 SM3-4 VH 아미노산

68 SM3-4 VH CDR 1 aa

69 SM3-4 VH CDR 2 aa

70 SM3-4 VH CDR 3 aa

71 SM6-23 VH 뉴클레오타이드

72 SM6-23 VH 아미노산

73 SM6-23 VH CDR 1 aa

74 SM6-23 VH CDR 2 aa

75 SM6-23 VH CDR 3 aa

76 SM11-18 VH 뉴클레오타이드

77 SM11-18 VH 아미노산

78 SM11-18 VH CDR 1 aa

79 SM11-18 VH CDR 2 aa

80 SM11-18 VH CDR 3 aa

81 SM11-19 VH 뉴클레오타이드

82 SM11-19 VH 아미노산

83 SM11-19 VH CDR 1 aa

84 SM11-19 VH CDR 2 aa

85 SM11-19 VH CDR 3 aa

86 SM11-20 VH 뉴클레오타이드

87 SM11-20 VH 아미노산

88 SM11-20 VH CDR 1 aa

89 SM11-20 VH CDR 2 aa

90 SM11-20 VH CDR 3 aa

91 SM5-1 VL 뉴클레오타이드

92 SM5-1 VL 아미노산

93 SM5-1 VL CDR 1 aa

94 SM5-1 VL CDR 2 aa

95 SM5-1 VL CDR 3 aa

96 SM4-10 VL 뉴클레오타이드

97 SM4-10 VL 아미노산

98 SM4-10 VL CDR 1 aa

99 SM4-10 VL CDR 2 aa

100 SM4-10 VL CDR 3 aa

101 SM6-5 VL 뉴클레오타이드

102 SM6-5 VL 아미노산

103 SM6-5 VL CDR 1 aa

104 SM6-5 VL CDR 2 aa

105 SM6-5 VL CDR 3 aa

106 SM1-6 VL 뉴클레오타이드

107 SM1-6 VL 아미노산

108 SM1-6 VL CDR 1 aa

109 SM1-6 VL CDR 2 aa

110 SM1-6 VL CDR 3 aa

111 SM3-1 VL 뉴클레오타이드

112 SM3-1 VL 아미노산

113 SM3-1 VL CDR 1 aa

114 SM3-1 VL CDR 2 aa

115 SM3-1 VL CDR 3 aa

116 SM5-6 VL 뉴클레오타이드

117 SM5-6 VL 아미노산

118 SM5-6 VL CDR 1 aa

119 SM5-6 VL CDR 2 aa

120 SM5-6 VL CDR 3 aa

121 SM6-48 VH 뉴클레오타이드

122 SM6-48 VH 아미노산

123 SM6-48 VH CDR 1 aa

124 SM6-48 VH CDR 2 aa

125 SM6-48 VH CDR 3 aa

126 SM4-3 VL 뉴클레오타이드

127 SM4-3 VL 아미노산

128 SM4-3 VL CDR 1 aa

129 SM4-3 VL CDR 2 aa

130 SM4-3 VL CDR 3 aa

131 SM5-9 VL 뉴클레오타이드

132 SM5-9 VL 아미노산

133 SM5-9 VL CDR 1 aa

134 SM5-9 VL CDR 2 aa

135 SM5-9 VL CDR 3 aa

136 SM4-12 VL 뉴클레오타이드

137 SM4-12 VL 아미노산

138 SM4-12 VL CDR 1 aa

139 SM4-12 VL CDR 2 aa

140 SM4-12 VL CDR 3 aa

141 SM5-5 VL 뉴클레오타이드

142 SM5-5 VL 아미노산

143 SM5-5 VL CDR 1 aa

144 SM5-5 VL CDR 2 aa

145 SM5-5 VL CDR 3 aa

146 SM3-2 VL 뉴클레오타이드

147 SM3-2 VL 아미노산

148 SM3-2 VL CDR 1 aa

149 SM3-2 VL CDR 2 aa

150 SM3-2 VL CDR 3 aa

151 SM3-4 VL 뉴클레오타이드

152 SM3-4 VL 아미노산

153 SM3-4 VL CDR 1 aa

154 SM3-4 VL CDR 2 aa

155 SM3-4 VL CDR 3 aa

156 SM4-1 VL 뉴클레오타이드

157 SM4-1 VL 아미노산

158 SM4-1 VL CDR 1 aa

159 SM4-1 VL CDR 2 aa

160 SM4-1 VL CDR 3 aa

161 SM4-5 VL 뉴클레오타이드

162 SM4-5 VL 아미노산

163 SM4-5 VL CDR 1 aa

164 SM4-5 VL CDR 2 aa

165 SM4-5 VL CDR 3 aa

166 SM4-7 VL 뉴클레오타이드

167 SM4-7 VL 아미노산

168 SM4-7 VL CDR 1 aa

169 SM4-7 VL CDR 2 aa

170 SM4-7 VL CDR 3 aa

171 SM6-6 VL 뉴클레오타이드

172 SM6-6 VL 아미노산

173 SM6-6 VL CDR 1 aa

174 SM6-6 VL CDR 2 aa

175 SM6-6 VL CDR 3 aa

176 SM6-51 VL 뉴클레오타이드

177 SM6-51 VL 아미노산

178 SM6-51 VL CDR 1 aa

179 SM6-51 VL CDR 2 aa

180 SM6-51 VL CDR 3 aa

181 VH FWR1

182 VH FWR3

183 VH FWR3 (^*02,^*03,^*04)

184 VH FWR4 (^*01)

185 VL FWR1

186 VL FWR2

187 VL FWR3

188 IGHJ6^*02 aa

189 IGHJ3^*02 aa

190 IGHJ5^*01 aa

191 IGHJ5^*02 aa

192 IGLJ1^*01 aa

193 IGLJ2^*01 aa

194 IGLJ3^*01 aa

195 IGLG3^*02 aa

196 프라이머 179-Je

197 합성 펩타이드

198 프라이머 074-Je

199 프라이머 075-Je

200 프라이머 076-Je

201 프라이머 150-Je

202 프라이머 151-Je

203 프라이머 077-Je

204 프라이머 078-Je

205 프라이머 007-Je

206 프라이머 152-Je

207 프라이머 153-Je

208 프라이머 066-Je

209 프라이머 067-Je

210 프라이머 068-Je

211 프라이머 069-Je

212 프라이머 070-Je

213 프라이머 258-Je

214 프라이머 259-Je

215 프라이머 260-Je

216 프라이머 261-Je

217 프라이머 262-Je

218 프라이머 263-Je

219 프라이머 264-Je

220 프라이머 265-Je

221 프라이머 266-Je

222 프라이머 267-Je

223 프라이머 84-B

224 프라이머 155-Je

225 프라이머 85-B

226 프라이머 161-Je

227 프라이머 162-Je

228 프라이머 154-Je

229 프라이머 001-Je

230 프라이머 158-Je

231 프라이머 003-Je

232 프라이머 159-Je

233 프라이머 156-Je

234 프라이머 157-Je

235 프라이머 062-Je

236 프라이머 063-Je

237 프라이머 065-Je

238 프라이머 064-Je

239 gB 균주 AD169

240 gB 균주 Towne

241 SM10 V_H 뉴클레오타이드

242 SM10 V_H 아미노산

243 SM10 V_H CDR 1 aa

244 SM10 V_H CDR 2 aa

245 SM10 V_H CDR 3 aa

246 SM12 V_H 뉴클레오타이드

247 SM12 V_H 아미노산

248 SM12 V_H CDR 1 aa

249 SM12 V_H CDR 2 aa

250 SM12 V_H CDR 3 aa

251 2C2 V_H 뉴클레오타이드

252 2C2 V_H 아미노산

253 2C2 V_H CDR 1 aa

254 2C2 V_H CDR 2 aa

255 2C2 V_H CDR 3 aa

256 1G2 V_H 뉴클레오타이드

257 1G2 VHV_H 아미노산

258 1G2 V_H CDR 1 aa

259 1G2 V_H CDR 2 aa

260 1G2 V_H CDR 3 aa

261 SM10 V_L 뉴클레오타이드

262 SM10 V_L 아미노산

263 SM10 V_L CDR 1 aa

264 SM10 V_L CDR 2 aa

265 SM10 V_L CDR 3 aa

266 SM12 V_L 뉴클레오타이드

267 SM12 V_L 아미노산

268 SM12 V_L CDR 1 aa

269 SM12 V_L CDR 2 aa

270 SM12 V_L CDR 3 aa

271 2C2 V_L 뉴클레오타이드

272 2C2 V_L 아미노산

273 2C2 V_L CDR 1 aa

274 2C2 V_L CDR 2 aa

275 2C2 V_L CDR 3 aa

276 1G2 V_L 뉴클레오타이드

277 1G2 V_L 아미노산

278 1G2 V_L CDR 1 aa

279 1G2 V_L CDR 2 aa

280 1G2 V_L CDR 3 aa

281 IGHV4-39 FWR1

282 IGHV4-39 FWR2

283 IGHV4-39 FWR3

284 IGHV4-59 FWR1

285 IGHV4-59 FWR2

286 IGHV4-59 FWR3

287 IGKV2D-28 FWR1

288 IGKV2D-28 FWR2

289 IGKV2D-28 FWR3

290 IGKV1D-33 FWR1

291 IGKV1D-33 FWR2

292 IGKV1D-33 FWR3

293 IGLV1-47 FW1

294 IGLV1-47 FW2

295 IGLV1-47 FW3

296 프라이머 5'Ig L VH 4/6

297 프라이머 5'Ig L Vκ 1/2

298 프라이머 5'Ig L Vλ 3

299 프라이머 5'Ig L Vλ 1

300 프라이머 3'Ig Cγ CH 1

301 프라이머 3'Ig Cκ 543

302 프라이머 3'Ig Cλ 쇄

303 프라이머 5'Ig AgeI VH4

304 프라이머 5'Ig AgeI Vκ 2-24

305 프라이머 5'Ig AgeI Vκ 2-28

306 프라이머 5'Ig AgeI Vλ 3

307 프라이머 5'Ig AgeI Vκ 1-5

308 프라이머 5'Ig AgeI VH 4-39

309 프라이머 5'Ig AgeI Vλ 1

310 프라이머 3'Ig Sall JH

311 프라이머 3'Ig BsiWI Jκ 2

312 프라이머 3'Ig Sall JH 6

313 프라이머 3'Ig Bsi WIJκ 1/4

314 프라이머 3'Ig XhoI Cλ

315 프라이머 5' 부재

316 프라이머 3'IgG 내부

317 프라이머 3'Cκ494

318 프라이머 3'Cλ

319 합성 링커

320 gpUL132 시그날 서열

321 HA 에피토프 태그

참고문헌

상기 어느 곳에서든지 인용된 것들을 포함하는, 본 명세서의 어느 곳에서 인용된 문헌 모두는 이의 전문이 참조로 및 모든 목적을 위해 본 명세서에 결합된다.

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ccaggctcag atctgacgac acggccgtat attactgtgc gagagatggg 300 gctaaaacgg tgactacctt cggaatgtct ttgttgtact actacgacgt tatggacatc 360 tggggccaag ggacaatggt caccgtctct agc 393 <210> 77 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gln Val Gln Leu Met Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Cys Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Lys Thr Val Thr Thr Phe Gly Met Ser Leu Leu 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Asp Val Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Gly Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Cys Ile Asn Pro Asn Ser Gly 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tgtcctggta ccagcaactc 120 ccaggtgcag cccccaaact cctcatcttt gacaataata agcgaccctc agggactcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggtcatcac cggactccag 240 acaggggacg aggccgatta ttactgcgga acaccggata gaagcctgag tgtggtattc 300 ggcggaggga ccaaggtcac cgtcctag 328 <210> 132 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Gln Ser Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Met Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Thr Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Val Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Pro Asp Arg Ser Leu 85 90 95 Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 133 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 134 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens 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cctcatttat gacaataata agcgaccccc agggattcct 180 gaccgattct ctggttccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgca acatgggata gaagcctgag tgtggtattc 300 ggcggaggga ccaaggtcac cgtcctag 328 <210> 147 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Ser Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Arg Ser Leu 85 90 95 Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 148 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Pro 1 5 <210> 150 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<210> 202 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 151-Je <400> 202 cacctgcagg tcagggccaa ggtt 24 <210> 203 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 077-Je <400> 203 ctgaagcttc catggacatg agggtccccg ctcagctcc 39 <210> 204 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 078-Je <400> 204 ctgaggcttc catgaggctc cctgctcagc tcctggggct g 41 <210> 205 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 007-Je <400> 205 ctgaagcttc catggaagcc ccagcgcagc ttctcttcct c 41 <210> 206 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 152-Je <400> 206 ctgaagcttc catggtgttg cagacccagg tcttcatttc tc 42 <210> 207 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 153-Je <400> 207 ctgaagcttc catggggtcc caggttcacc tcctcagctt cc 42 <210> 208 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 066-Je <400> 208 tagagcgctt gatttccacc ttggtccctt gg 32 <210> 209 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 067-Je <400> 209 tagagcgctt gatctccagc ttggtcccct gg 32 <210> 210 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 068-Je <400> 210 tagagcgctt gatatccact ttggtcccag gg 32 <210> 211 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 069-Je <400> 211 tagagcgctt gatctccacc ttggtccctc cg 32 <210> 212 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 070-Je <400> 212 tagagcgctt aatctccagt cgtgtccctt gg 32 <210> 213 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 258-Je <400> 213 caggactcag gacaatctcc agc 23 <210> 214 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 259-Je <400> 214 yyycsggacg tcyycacc 18 <210> 215 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 260-Je <400> 215 atctgggggk ctyycrcc 18 <210> 216 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 261-Je <400> 216 gataagcttc catggcctgs tcccctctcc tcctcac 37 <210> 217 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 262-Je <400> 217 gataagcttc catggcctgg gctctgctcc tcctc 35 <210> 218 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 263-Je <400> 218 gataagcttc catggcctgg acccctctcc tsctc 35 <210> 219 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 264-Je <400> 219 gagcctagga cggtgacctt ggtccc 26 <210> 220 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 265-Je <400> 220 gagcctagga tgatcagctg ggttcctcc 29 <210> 221 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 266-Je <400> 221 gagcctagga cggtcagctc gctcccctc 29 <210> 222 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 267-Je <400> 222 gagcctaggg cggtcagctg ggtgcctcc 29 <210> 223 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 84-B <400> 223 ccctgagagc acagytcctc acc 23 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 155-Je <400> 224 agtgactcct gtgcmccacc 20 <210> 225 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 85-B <400> 225 gcactgaaca cagaggcatc a 21 <210> 226 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 161-Je <400> 226 cmtggayctc mtgyrcraga ac 22 <210> 227 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 162-Je <400> 227 agggcttcat tttctgtcct ccaccatc 28 <210> 228 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 154-Je <400> 228 gggcagtcac cagagctcca gaca 24 <210> 229 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 001-Je <400> 229 ctgaagcttc catggactgg acctggagga tcctcttctt g 41 <210> 230 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 158-Je <400> 230 ctgaagcttc catggacaca ctttgctcca cgctcctg 38 <210> 231 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 003-Je <400> 231 ctgaagcttc catggagttt gggctgagct gggttttcct tg 42 <210> 232 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 159-Je <400> 232 ctgaagcttc catgaaacac ctgtggttct tcctcctsct gg 42 <210> 233 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 156-Je <400> 233 ctgaagcttc catggggtca accgccatcc tcgccctcct cc 42 <210> 234 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 157-Je <400> 234 ctgaagcttc catgtctgtc tccttcctca tcttcctgcc cg 42 <210> 235 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 062-Je <400> 235 tagagcgctg gagacggtga ccagggttcc ctgg 34 <210> 236 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 063-Je <400> 236 tagagcgctg gagacagtga ccagggtgcc acg 33 <210> 237 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 065-Je <400> 237 tagagcgcta gagacggtga ccattgtccc ttgg 34 <210> 238 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 064-Je <400> 238 tagagcgctg gagacggtga ccgtggtgcc ttttt 35 <210> 239 <211> 906 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 239 Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile 1 5 10 15 Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser 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300 gcctatgact tttgggttcg tggggtgtcc tggatcgccc cctggggccc gggaattttg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 242 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 242 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Val Gly 20 25 30 Asp Ser Tyr Trp Gly Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Ser Ile Tyr Phe Thr Gly Thr Thr Leu Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Pro Pro Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Asn Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg His Ala Tyr Asp Phe Trp Val Arg Gly Val Ser Trp Ile 100 105 110 Ala Pro Trp Gly Pro Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 243 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 243 Val Gly Asp Ser Tyr Trp Gly 1 5 <210> 244 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 244 Ser Ile Tyr Phe Thr Gly Thr Thr Leu Tyr Asn Pro Ser Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 245 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 245 His Ala Tyr Asp Phe Trp Val Arg Gly Val Ser Trp Ile Ala Pro 1 5 10 15 <210> 246 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 246 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatgagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattggatat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agacgtgcgt 300 agcagcagcc ctccagtcta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 247 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Met Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Val Arg Ser Ser Ser Pro Pro Val Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 248 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 249 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 250 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 250 Asp Val Arg Ser Ser Ser Pro Pro Val Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 251 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 251 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccggga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 atctgcactg tctctggtgc ccccattagg agttactact ggagctggat ccggcagtcc 120 ccaggaaggg gactggagta cattgggtgt atcaacacca atgggaggtc caactacaac 180 ccctccctca ggggtcgagt caccatatca gtggactcgt cccagaatca gttctccctg 240 acggtcagct ctctgaccgc agcggacacg gccgtgtatt actgtgcgac tgcaagccaa 300 caccgctacg attctttgac tggctcttat cgctattatc cctatgtaat ggacgtctgg 360 ggccgcggga ccacggtcac cgtttcctca 390 <210> 252 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 252 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Ala Pro Ile Arg Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Asn Thr Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Gln Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Thr Val Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Ala Ser Gln His Arg Tyr Asp Ser Leu Thr Gly Ser Tyr Arg Tyr 100 105 110 Tyr Pro Tyr Val Met Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 253 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 254 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Cys Ile Asn Thr Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Gly 1 5 10 15 <210> 255 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 Ala Ser Gln His Arg Tyr Asp Ser Leu Thr Gly Ser Tyr Arg Tyr Tyr 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Asp Val 20 <210> 256 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 256 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tgtctggtgc ctccatcgac aggagtactt actactgggg ctggatccgc 120 cagcccccag ggaagggcct ggaatggatt gcaaatatct attataatgg gagggccgtc 180 tacagcccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaatcagttc 240 tccctgaagg tgaggtctct gaccgccgca gacacggctg tgtattattg tgcgacccgg 300 tggaattatt tcttcgactt tgactattgg ggccggggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 360 <210> 257 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 257 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Asp Arg Ser 20 25 30 Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Ala Asn Ile Tyr Tyr Asn Gly Arg Ala Val Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Val Arg Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Thr Arg Trp Asn Tyr Phe Phe Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 258 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 258 Arg Ser Thr Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 259 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Asn Ile Tyr Tyr Asn Gly Arg Ala Val Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 260 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 260 Arg Trp Asn Tyr Phe Phe Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 261 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 261 gatattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gaccctcctg catagtaatg gaaacaatta tttggattgg 120 tacctacaga agccagggca gtctccgcaa ctcctgatct attatgcttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggttcaggca catctttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg gggctgaaga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaatctccg 300 ctcactttcg gcggagggac caagctggag atcaaa 336 <210> 262 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 262 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Gly Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 263 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 263 Arg Ser Ser Gln Thr Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 264 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 264 Tyr Ala Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 265 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 265 Met Gln Ala Leu Gln Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 266 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 266 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggattaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactcct 300 cggacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336 <210> 267 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 267 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Leu Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 268 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 268 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 269 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 269 Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 270 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 270 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 271 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 271 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtatgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagg aagtctttaa attggtatca gaagaaagta 120 gggatagccc ctaaagtcct gatctacgac gcatccaatt tggaaacagg cgtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacacat tttaccttca ccatcggcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacatatta ctgtcaacat tacgataatt ttccgcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 272 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 272 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Lys Lys Val Gly Ile Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Phe Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Phe Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 273 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 273 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 274 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 274 Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 275 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 Gln His Tyr Asp Asn Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 276 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 276 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagttc caacatcgaa actaattatg tatcctggta ccagcagttc 120 ccaggaacgg cccccaagct cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgagta ttactgtgga acgtgggatg acaattcctg ggtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 277 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 277 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Thr Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asp Asn Ser 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 278 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 278 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Thr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 279 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 279 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 280 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 280 Gly Thr Trp Asp Asp Asn Ser Trp Val 1 5 <210> 281 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 281 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser 20 25 30 <210> 282 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 282 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 283 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 283 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 284 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 284 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30 <210> 285 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 285 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 286 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 286 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 287 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 287 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 288 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 288 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 289 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 289 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 290 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 290 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 291 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 291 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 292 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 292 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 293 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 293 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 294 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 294 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 295 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 295 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 296 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig L VH 4/6 <400> 296 cccagatggg tcctgtccca ggtgcag 27 <210> 297 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig L V kappa 1/2 <400> 297 atgaggstcc cygctcagct gctg 24 <210> 298 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig L V lambda 3 <400> 298 gctctgtgac ctcctatgag ctg 23 <210> 299 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig L V lambda 1 <400> 299 ggtcctgggc ccagtctgtg ctg 23 <210> 300 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'Ig C gamma CH 1 <400> 300 ggaaggtgtg cacgccgctg gtc 23 <210> 301 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'Ig C kappa 543 <400> 301 gtttctcgta gtctgctttg ctca 24 <210> 302 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'Ig C lambda chain <400> 302 caccagtgtg gccttgttgg cttg 24 <210> 303 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig AgeI VH4 <400> 303 ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tgcaggag 38 <210> 304 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig AgeI V kappa 2-24 <400> 304 ctgcaaccgg tgtacatggg gatattgtga tgacccaga 39 <210> 305 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig AgeI V kappa 2-28 <400> 305 ctgcaaccgg tgtacatggg gatattgtga tgactcagtc 40 <210> 306 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig AgeI V lambda 3 <400> 306 ctgctaccgg ttctgtgacc tcctatgagc tgacwcag 38 <210> 307 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig AgeI V kappa 1-5 <400> 307 ctgcaaccgg tgtacattct gacatccaga tgacccagtc 40 <210> 308 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig AgeI VH 4-39 <400> 308 ctgcaaccgg tgtacattcc cagctgcagc tgcaggag 38 <210> 309 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Ig AgeI V lambda 1 <400> 309 ctgctaccgg ttcctgggcc cagtctgtgc tgackcag 38 <210> 310 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'Ig Sall JH <400> 310 tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc ag 32 <210> 311 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'Ig BsiWI J kappa 2 <400> 311 gccaccgtac gtttgatctc cagcttggtc 30 <210> 312 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'Ig Sall JH 6 <400> 312 tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc gtg 33 <210> 313 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'Ig Bsi WIJ kappa 1/4 <400> 313 gccaccgtac gtttgatytc caccttggtc 30 <210> 314 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'Ig XhoI C lambda <400> 314 ctcctcactc gagggyggga acagagtg 28 <210> 315 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5'Absense <400> 315 gcttcgttag aacgcggcta c 21 <210> 316 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'IgG internal <400> 316 gttcggggaa gtagtccttg ac 22 <210> 317 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'C kappa 494 <400> 317 gtgctgtcct tgctgtcctg ct 22 <210> 318 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3'C lambda <400> 318 caccagtgtg gccttgttgg cttg 24 <210> 319 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 319 Ile Ala Gly Ser Gly 1 5 <210> 320 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320 Met Pro Ala Pro Arg Gly Leu Leu Arg Ala Thr Phe Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Ala Phe Gly Leu Leu Leu His Ile Asp Phe Ser 20 25 <210> 321 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag <400> 321 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5

Claims

잔기 번호는 서열번호 239의 전장(full length) gB 스트레인 AD169 아미노산 서열에 따라 정의되고, 잔기 100에서 447 내의 영역에서 hCMV gB 단백질에 결합하는 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) gB 단백질에 대한 분리된 결합 멤버(binding member).
표면 플라스몬 공명에 의해 정해진 1nM 이하의 KD로 hCMV gB 단백질에 결합하는 분리된 결합 멤버.
제2항에 있어서, 상기 KD는 0.5nM 이하인 결합 멤버.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 KD는 0.1nM 이하인 결합 멤버.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 hCMV gB 단백질의 항원 도메인 1(AD-1) 또는 항원 도메인 2(AD-2)에 결합하지 않는 결합 멤버.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버의 hCMV 임상 분리주(clinical isolate)의 50% 중화에 필요한 농도는, 인간 표피 파이브로블라스트의 hCMV 감염의 중화를 위한 중화 분석에서 10μg/ml 또는 그 미만인 것인 분리된 결합 멤버.
CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 hCMV에 대한 분리된 결합 멤버로, 상기 CDRs 세트는 CDRs 세트로부터 22 또는 그 보다 적은 수의 아미노산 변이를 가지고, 상기 CDRs 세트에서,
HCDRl은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고;
HCDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고;
HCDR3는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고;
LCDRl은 서열번호 93의 아미노산 서열을 가지고;
LCDR2는 서열번호 94의 아미노산 서열을 가지고; 그리고
LCDR3는 서열번호 95의 아미노산 서열을 가지고, 상기 결합 멤버는 표면 플라스몬 공명에 의해 정해진 50nM 이하의 KD를 가지는, hCMV에 대한 분리된 결합 멤버.
CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 CDRs 세트는 CDRs 세트로부터 22 또는 그 보다 적은 수의 아미노산 변이를 가지고 상기 CDRs 세트에서,
HCDRl는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고;
HCDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고;
HCDR3는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고;
LCDRl는 서열번호 93의 아미노산 서열을 가지고;
LCDR2는 서열번호 94의 아미노산 서열을 가지고; 그리고
LCDR3는 서열번호 95의 아미노산 서열을 가지는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 hCMV에 대한 분리된 결합 멤버.
제7항 또는 제8항에 있어서 상기 결합 멤버는 HCDR1을 포함하고, 상기 HCDR1에서,
Kabat 잔기 31 은 Asp 또는 Gly;
Kabat 잔기 32는 His, Phe 또는 Tyr;
Kabat 잔기 33은 Tyr;
Kabat 잔기 34는 Met, Ile 또는 Leu; 그리고
Kabat 잔기 35는 Val 또는 Asn인, 결합 멤버.
제9항에 있어서, 상기 HCDR1은 서열번호 3인 결합 멤버.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 HCDR2를 포함하고, 상기 HCDR2에서,
Kabat 잔기 50은 Trp, Ser 또는 Cys;
Kabat 잔기 53는 Gln, Asn 또는 His;
Kabat 잔기 54는 Ser 또는 Thr;
Kabat 잔기 58은 Gly, Lys, Asn 또는 His;
Kabat 잔기 60 은 Gly 또는 Ala; 그리고
Kabat 잔기 64 는 Gln 또는 Arg인 결합 멤버.
제 11항에 있어서, 상기 HCDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 결합 멤버.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 HCDR3를 포함하고, 상기 HCDR3에서,
Kabat 잔기 99는 Thr 또는 Ala;
Kabat 잔기 100는 Val 또는 Met;
Kabat 잔기 100A는 Ser 또는 Thr
Kabat 잔기 100B는 Asn 또는 Thr;
Kabat 잔기 100C는 Ser 또는 Phe;
Kabat 잔기 100E는 Leu, Met 또는 Ala;
Kabat 잔기 100F는 Ser 또는 Gly;
Kabat 잔기 100K는 His 또는 Tyr;
Kabat 잔기 100L는 Asn, Ser 또는 Asp;
Kabat 잔기 100M는 Arg, Val 또는 Ile;
Kabat 잔기 100N는 Leu 또는 Met;
Kabat 잔기 101는 Asp 또는 Gly; 그리고
Kabat 잔기 102는 Ala, Val 또는 Ile인, 결합 멤버.
제13항에 있어서 상기 HCDR3는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 결합 멤버.
제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, LCDR1에서 상기 Kabat 잔기 26은 Ser 또는 Asn이고 또는 LCDR1에서 Kabat 잔기 27은 Ser 또는 Arg인 결합 멤버.
제15항에 있어서, 상기 LCDRl은 서열번호 93인 결합 멤버.
제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, LCDR2에서 상기 Kabat 잔기 56은 Ser 또는 Pro인 결합 멤버.
제17항에 있어서, 상기 LCDR2는 서열번호 94인 결합 멤버.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 LCDR3 를 포함하고, 상기 LCDR3에서,
Kabat 잔기 89는 Gly 또는 Ala;
Kabat 잔기 91은 Pro 또는 Trp;
Kabat 잔기 93은 Arg 또는 Ser;
Kabat 잔기 94는 Ser 또는 Asp;
Kabat 잔기 95a는 Ser, Gly 또는 Ala;
Kabat 잔기 96은 Val 또는 Tyr; 그리고
Kabat 잔기 97는 Ile 또는 Val인 결합 멤버.
제 19항에 있어서, 상기 결합 멤버는 서열번호 95의 아미노산 서열을 가지는 LCDR3를 포함하는 것인 결합 멤버.
HCDR3, LCDR3 및/또는 항체 Ab-01에서 Ab-46 중 어느 하나의 CDRs 세트를 포함하는 hCMV gB 단백질에 대한 분리된 결합 멤버.
제21항에 있어서, 상기 결합 멤버는 잔기 121에서 132 및 344에서 438 내의 영역에서 hCMV gB 단백질에 결합하고, 잔기 번호는 서열번호 239의 전장(full length) gB 스트레인 AD169 아미노산 서열에 따라 정의되는 것인, 분리된 결합 멤버.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 CDRs 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고, 상기 CDRs 세트에서,
HCDRl는 서열번호 3이고;
HCDR2는 서열번호 4이고;
HCDR3는 서열번호 5이고;
LCDRl는 서열번호 93이고;
LCDR2는 서열번호 94이고; 그리고
LCDR3는 서열번호 95인, 결합 멤버.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 VH 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고 상기 VH 도메인은 서열번호 2의 VH 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 VL 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고 상기 VL 도메인은 서열번호 92의 VL 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 분리된 항체 분자.
서열번호 2와 적어도 90% 동일한 V_H 도메인 아미노산 서열과 서열번호 92와 적어도 90% 동일한 V_L 도메인 아미노산 서열을 포함하는 hCMV gB 단백질에 결합하는 분리된 항체 분자.
HCDR3, LCDR3 및/또는 항체 Ab-47에서 Ab-50 중 어느 하나의 CDRs 세트를 포함하는 hCMV gB 단백질에 대한 분리된 결합 멤버.
제28항에 있어서, 상기 결합 멤버는 잔기 133에서 343 내의 영역에서 hCMV gB 단백질에 결합하고, 잔기 번호는 서열번호 239의 전장(full length) gB 스트레인 AD169 아미노산 서열에 따라 정의되는 것인, 분리된 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 CDRs: HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고 상기 CDRs 세트에서,
HCDRl는 서열번호 243이고;
HCDR2는 서열번호 244이고;
HCDR3는 서열번호 245이고;
LCDRl는 서열번호 263이고;
LCDR2는 서열번호 264이고; 그리고
LCDR3는 서열번호 265인 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 CDRs: HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고 상기 CDRs 세트에서,
HCDRl는 서열번호 248이고;
HCDR2는 서열번호 249이고;
HCDR3는 서열번호 250이고;
LCDRl는 서열번호 268이고;
LCDR2는 서열번호 269이고; 그리고
LCDR3는 서열번호 270인 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 CDRs: HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고 상기 CDRs 세트에서,
HCDRl는 서열번호 253이고;
HCDR2는 서열번호 254이고;
HCDR3는 서열번호 255이고;
LCDRl는 서열번호 273이고;
LCDR2는 서열번호 274이고; 그리고
LCDR3는 서열번호 275인 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 CDRs: HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 및 LCDR3를 포함하고 상기 CDRs 세트에서,
HCDRl는 서열번호 258이고;
HCDR2는 서열번호 259이고;
HCDR3는 서열번호 260이고;
LCDRl는 서열번호 278이고;
LCDR2는 서열번호 279이고; 그리고
LCDR3는 서열번호 280인 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항에서 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 V_H 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 V_H 도메인은 서열번호 242의 V_H 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항, 제29항 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 V_H 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 V_H 도메인은 서열번호 247의 V_H 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항, 제29 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 V_H 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 V_H 도메인은 서열번호 252의 V_H 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항, 제29및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 V_H 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 V_H 도메인은 서열번호 257의 V_H 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항에서 제30항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 V_L 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 V_L 도메인은 서열번호 262의 V_L 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항, 제29항, 제31항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 V_L 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 V_L 도메인은 서열번호 267의 V_L 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항, 제29항, 제32항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 V_L 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 V_L 도메인은 서열번호 272의 V_L 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
제1항 내지 제6항, 제 28항, 제29항, 제33항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 멤버는 항체 V_L 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 V_L 도메인은 서열번호 277의 V_L 도메인 아미노산 서열을 가지는 것인, 결합 멤버.
서열번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 분리된 항체 분자.
서열번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 분리된 항체 분자.
서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 분리된 항체 분자.
서열번호 257의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 277의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 분리된 항체 분자.
서열번호 242와 적어도 90% 동일한 V_H 도메인 아미노산 서열과 서열번호 262와 적어도 90% 동일한 V_L 도메인 아미노산 서열을 포함하는 hCMV gB 단백질에 결합하는 분리된 항체 분자.
서열번호 247과 적어도 90% 동일한 VH 도메인 아미노산 서열과 서열번호 267과 적어도 90% 동일한 V_L 도메인 아미노산 서열을 포함하는 hCMV gB 단백질에 결합하는 분리된 항체 분자.
서열번호 252와 적어도 90% 동일한 VH 도메인 아미노산 서열과 서열번호 272와 적어도 90% 동일한 V_L 도메인 아미노산 서열을 포함하는 hCMV gB 단백질에 결합하는 분리된 항체 분자.
서열번호 257과 적어도 90% 동일한 V_H 도메인 아미노산 서열과 서열번호 277과 적어도 90% 동일한 V_L 도메인 아미노산 서열을 포함하는 hCMV gB 단백질에 결합하는 분리된 항체 분자.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 분리된 항체 분자 또는 결합 멤버를 가지고 hCMV gB 단백질에 결합하기 위해 경쟁하는 결합 멤버 또는 항체 분자.
제26항, 제27항, 제42항에서 제50항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자로, 상기 항체 분자는 IgG인 항체 분자.
제 24항, 제26항, 제27항, 제34항에서 제37항 및 제42항에서 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 분리된 VH 도메인.
제 25항에서 제27항 및 제38항에서 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 분리된 VL 도메인.
제1항 내지 제25항 및 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 분리된 결합 멤버, 또는 제26항, 제27항 및 제42항에서 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자 및 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제25항 및 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 분리된 결합 멤버, 또는 제26항, 제27항 및 제42항에서 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 포함하고, 치료(therapy)에 의해 인간 또는 동물체의 치료(treatment) 방법으로 사용하기 위한, 조성물.
제55항에 있어서, 상기 조성물은 hCMV 연관 질환을 치료하기 위해 사용하는 것인 조성물.
제1항 내지 제25항 및 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 분리된 결합 멤버, 또는 제26항, 제27항 및 제42항에서 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 포함하고, hCMV 연관 질환 치료에 사용하기 위한 조성물.
제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 질환은 hCMV 감염인 조성물.
제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 hCMV gB, gH, gL, UL128, UL130 및/또는 UL131A 단백질에 결합하는 결합 멤버 또는 항체 분자를 더 포함하는, 조성물.
제1항에서 제25항 및 제28항에서 제41항 중 어느 한 항에 따른 결합 멤버, 또는 제26항, 제27항 및 제42항에서 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 개체
제60항에 있어서, 상기 개체는 임산부, 신생아, 이식을 받은 자(transplant recipient) 또는 HIV에 감염된 개체인, 방법.
제1항에서 제25항 및 제28항에서 제41항 중 어느 한 항에 따른 결합 멤버, 제52항에 따른 V_H 도메인, 제53항에 따른 V_L 도메인, 또는 제26항, 제27항 및 제42항에서 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 암호화(encoding)하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
제62항에 따른 핵산 분자를 이용하여 인 비트로 형질감염 또는 형질 전환된(in vitro transfected or transduced) 숙주세포.
결합 멤버, 항체 분자 또는 항체 V_H 또는 V_L 도메인 생산 조건 하에서 제63항에 따른 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 결합 멤버, 항체 분자 또는 항체 V_H 또는 V_L 도메인 생산 방법.
제64항에 있어서, 상기 방법은 상기 결합 멤버, 항체 분자, V_H 도메인 또는 V_L 도메인을 분리 및/또는 정제하는 방법을 더 포함하는 방법.
제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 방법은 상기 결합 결합 멤버, 항체 분자, V_H 도메인 또는 V_L 도메인을 적어도 하나의 첨가 성분을 포함하는 조성물로 제제화(formulation)하는 것을 더 포함하는 방법.
HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 부모 V_H 도메인의 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환 또는 부가에 의해 제공하고, 상기 부모 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 표 19에 나타난 HCDRs 세트이고, 부모 V_H 도메인의 아미노산 서열 변이를 나타내는 V_H 도메인이고, 그리고 선택적으로 하나 또는 그 이상의 V_H/V_L 조합물을 제공하기 위하여 VH 도메인이 하나 또는 그 이상의 V_L 도메인에 결합하고; hCMV에 대한 항체 항원 결합 도메인을 확인하기 위해, 부모 VH 도메인 또는 V_H/V_L 조합 또는 조합물의 아미노산 변이를 가지는 V_H 도메인을 테스트하는; 것을 포함하는, hCMV에 대한 항체 항원-결합 부위를 생산하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 V_L 도메인은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 부모 V_L 도메인의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 제공되고, 상기 부모 V_L 도메인은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 표 19에 나타난 CDRs의 V_L 세트이고 부모 V_L 도메인의 아미노산 서열 변이가 나타난 하나 또는 그 이상의 V_L 도메인을 생산하는 것인 방법.
제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 부모 V_H 도메인의 아미노산 서열 변이인 V_H 도메인은 CDR 돌연변이발생(mutagenesis)에 의해 제공되는 것인 방법.
제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 IgG, scFv, Fab 또는 이중특이성 항체 분자 또는 다중특이성 항체 분자 성분으로서 항체 항원-결합 도메인을 생산하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
V_H 도메인을 암호화하는 출발(starting) 핵산 또는 V_H 도메인을 암호화하는 출발 핵산 레퍼토리를 제공하고, 상기 V_H 도메인 또는 V_H 도메인들은 대체될 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 또는 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 영역이 없는 것을 포함하고; 상기 출발 핵산 또는 출발 핵산 레퍼토리를, 표 19에 기재된 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3의 아미노산 서열의 돌연변이에 생산되거나 암호화하는 도너(donor) 핵산 또는 도너 핵산들과 결합시켜서 상기 도너 핵산 또는 도너 핵산들이 개시 핵산 또는 개시 핵산의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 속으로 삽입됨으로써 V_H 도메인을 암호화하는 핵산들의 생산물 레퍼토리를 제공하고; 상기 생산물 레퍼토리를 발현시켜서 V_H 도메인 생산물을 생산하고; 선택적으로 V_H 도메인 생산물을 하나 또는 그 이상의 V_L 도메인과 결합시키고; hCMV에 대한 결합 멤버를 선택하고, 상기 결합 멤버는 VH 도메인 생산물과 선택적으로 V_L 도메인을 포함하고; 그리고 상기 결합 멤버 또는 이를 암호화하는 핵산을 회수하는(recovering) 것을 포함하는, hCMV에 결합하는 결합 멤버의 생산 방법.
제71항에 있어서, 상기 도너 핵산은 상기 HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 HCDR3의 돌연변이에 의해 생산되는 방법.
제72항에 있어서, 상기 방법은 핵산의 무작위 돌연변이에 의한 도너 핵산을 제공하는 것을 포함하는 방법.
제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 회수된 결합 멤버 내에 포함된 V_H 도메인 생산물을 항체 불변 영역에 부착하는 것을 더 포함하는 방법.
제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 V_H 도메인 및 V_L 도메인 생산물을포함하는 IgG, scFv, Fab 또는 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체를 제공하는 것을 포함하는 방법.
제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 hCMV에 결합하는 항체 항원-결합 도메인 또는 결합 멤버를, hCMV 중화 능력을 알아보기 위해 테스트하는 것을 더 포함하는 방법.
제76항에 있어서, 상기 방법은 hCMV에 결합하고 hCMV를 중화하는 항체 분자를 포함하는 결합 멤버를 얻는 것인 방법.
피험자 또는 샘플에, 제1항 내지 제25항 및 제28항에서 제41항 중 어느 한 항의 결합 멤버, 또는 제26항, 제27항 및 제42항에서 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 약 0.1에서 약 5.0 μg/ml의 농도에서 적어도 50%로 hCMV 감염을 감소시키기에 충분한 양으로, 투여하는 것을 포함하는, 피험자 또는 샘플에서 hCMV를 중화하는 방법.