KR20090080941A - 전기천공법을 이용한 백신접종 및 부스팅을 사용하여 면역 반응을 강화시키는 방법들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역 반응을 강화시키는 방법에 관한 것으로서,

상기 방법은 면역 반응의 강화를 유도하기 위해서 여러 조직에 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 예를 들어 피부에 프라이밍 백신접종을 첫째로 투여하고, 이후에 근육에 부스트 백신접종을 투여함으로써 2개의 별개 환자 조직에서 백신접종 및 부스팅 경로에 의해 면역 반응이 강화되며, 이러한 경우에 프라이임 및 부스팅, 즉 백신 조성물의 투여는 항원성 제제를 동시에 전기천공법을 이용하여 전달하여 실행하는 것이 바람직한 것을 특징으로 한다.

Description

전기천공법을 이용한 백신접종 및 부스팅을 사용하여 면역 반응을 강화시키는 방법들{METHODS OF ENHANCING IMMUNE RESPONSE USING ELECTROPORATION-ASSISTED VACCINATION AND BOOSTING}

본 발명은 백신 및 이의 투여에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 포유류의 제1 면역 반응성 조직에 항원성 제제를 일차 투여하고, 이후에 상기 포유류의 제2 신체 조직에 부스트(boost) 투여를 1회 이상 제공함으로써 포유류에서의 면역 반응을 유도 및 강화시키는 방법에 관한 것으로서, 1회 이상의 상기 프라임(prime) 및 부스트 투여는 전기천공법에 의해 도움을 받는다.

하기의 상세한 설명은 본 발명을 이해하기 위해서 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 임의의 이러한 정보를 종래 문헌으로 하거나 또는 현재 청구하는 본 발명과 관련이 있는 것으로 하는 것을 허가하지 않으며, 또는 명확하거나 또는 암시적으로 참조하는 임의의 출판물도 종래 문헌으로 허가하지 않는다.

백신접종 분야에서 백신의 투여는 주사기 및 주사바늘로 피하 또는 근육내(IM) 조직에 주입하는 것이 통상적이다. 종래 실행에서 백신의 최초 투여 이후 에는 통상적으로 최초 투여로부터 2 내지 6 주 후에 단지 1회 또는 여러회 제1 주입과 같은 동일한 방법을 사용하여 투여하는 1회 이상의 부스팅(boosting) 주입을 실행한다. 몇몇 경우에 제2 부스트 투여는 흔히 제1 간격[즉 백신 및 제1 부스트 백신접종의 최초 또는 "프라이밍(priming)" 투여 사이의 시간] 보다는 더 긴 제2 간격을 두고 가한다. 상기 간격 중에 면역 시스템은 예를 들면 백신의 항원성 성분(들)에 대한 항체의 발생[소위 "체액성(humoral)" 면역이라고 함] 및/또는 세포독성 T 림프구와 관련이 있는 세포성 면역 반응의 유도에 의해서 반응하는 것이 통상적이다. 항체 제조에 있어서 항체 역가 수준은 부스팅 후 약 4 내지 8 주에 최대 역가에 도달하는 것이 통상적이다.

여러 질병으로 면역 시스템의 부스팅은 특정 암의 발병 또는 감염과 싸우기 위한 준비 상태로 인체를 유지하기 위해 필수적이다. 그러나 단일 조직 타입에서의 부스팅은 항상 최적의 면역 반응을 제공하지는 않는다. 여러 인자가 면역 반응의 품질에 영향을 주는데 예를 들면 몇몇 항원은 강한 면역 반응을 유도하지 않는 반면에 다른 항원은 강한 면역 반응 및 염증 또는 때때로 조절 면역 반응을 유도할 수 있다. 다양한 항원성 제제에 면역 시스템 반응의 변이성은 백신 개발에서 주요한 관심이다. 동일 종류 중 및 여러 종류의 포유류 및 조류 병원균(예를 들면 HIV, SARS, H5N1 등)의 잠재적인 신속한 유행 및 발달에 의해 퍼지는 가능한 위험 뿐만 아니라 생물학적인 무기로서 사용되는 고 악성 변종의 병원균의 가능성 및 생물무기 테러의 출현으로 큰 집단에서 지속적인 방법으로 강하고 넓은 면역 반응의 신속한 유도를 위해 제공할 수 있는 방법으로 백식화 집단의 방법론을 제공하는 것 이 당업에서 요구된다.

본 발명은 미리 선택한 조직에서 조성물의 프라이밍 및 부스팅의 전기천공법을 이용한 투여 방법(electroporation-assisted administration)을 포함하는 표적 항원에 면역 반응을 강화시키기 위한 방법을 제공함으로써 상기 방법으로 백신접종 분야를 앞당긴다.

발명의 요약

하나의 측면에서 본 발명은 피부 및/또는 근육 조직에 백신 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 상기 관점의 몇몇 실시양태에서 본 발명은 백신 조성물의 투여를 위한 투여 계획(dosing regimens)을 포함하며, 최초 볼루스(bolus)를 하나의 조직 타입(예를 들면 근육, 피부, 피하 공간, 점막, 비강내 또는 폐로의 흡입)에 투여하고, 부스팅 투여(들)는 상이한 또는 제2 조직 타입으로 전달한다. 특정의 바람직한 실시양태에서 최초 프라이밍 볼루스는 피부에 투여하고, 부스트 볼루스는 근육 조직에 투여한다. 대안적인 실시양태에서 최초 볼루스는 근육에 투여할 수 있으며, 1회 이상의 부스팅 투여는 피부 조직으로 가할 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 하루 이상으로 분리하여 각각 2회 이상의 투여에 의해 투여되는 백신 조성물을 전달하는 것에 전기천공법(EP)을 사용하는 것에 관한 것이다. 전기천공법은 특정 타입의 조직 내의 세포에 물질을 가하기에 적당한 임의의 적당한 전기천공 장치에 의해서 제공할 수 있다. 예를 들면 피부 조직 세포에 물질을 투여하기 위한 전기천공 장치는 비-침입성 전극을 사용하여 피부를 통하거나 또는 근육을 통해 전기천공할 수 있는 성능을 갖는 임의의 장치 또는 대안적으로 피부(피내 또는 피부층), 점막 또는 근육과 같은 전기천공되는 조직에 직접 삽입하는 전극으로 조직을 전기천공할 수 있는 주사바늘-유사 전극을 갖는 장치를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 백신을 투여하는 전기천공법을 사용한 방법으로 동일한 양 및 품질의 면역원을 전기천공하지 않고 관찰될 것으로서 기대하거나 또는 하나의 조직 타입에만 관찰되는 이후의 투여로 기대할 수 있는 면역 반응과 비교해서 강화된 면역 반응을 야기할 수 있는 것에 관한 것이다.

또 다른 추가 측면에서 본 발명은 약해지거나 또는 비활성화된 박테리아 또는 바이러스; 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 형태의 항원으로 구성되는 백신을 전기천공법을 이용하여 투여하는 방법, 또는 대안적으로는 1개 이상의 항원을 암호화하는 핵산(또는 다수의 핵산 종류), 특히 인체 조직에 투여 후 및 상기 조직내의 세포에 의해 취해진 후에 암호화된 항원(들)의 발현을 지시할 수 있는 핵산의 전기천공법을 이용한 투여 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 체액성 및/또는 세포성(즉 T 세포) 면역 반응 둘 다를 유도하기 위한 성능을 유도하고, 더 신속하고 더 강한 면역 반응을 제공하는 것이다.

상기 및 다른 측면 및 실시양태는 하기의 도면, 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위를 참조하면 좀더 명확해 질 것이다.

도 1은 선택된 조직의 토끼에서 인간 IgG를 암호화하는 DNA 플라즈미드로 EP 및 주입 후 토끼 항-인간 IgG 항체 역가 결과를 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 평균 표준 오차를 나타낸다.

도 2A 및 B는 Balb/c 마우스의 여러 코호트에서 간염 B 표면 항원에 항체 생성 결과를 나타내는 그래프이다. 나타낸 것과 같이 전기천공법과 결합한 근육에서의 추적 조사 부스트 6일 후와 피부에서의 최초 접종으로 역가 수준이 강화되었다.

도 3A 및 B는 Balb/c 마우스의 여러 코호트에서 간염 B 표면 항원에 항체 생성 결과를 나타낸 그래프이다. 나타낸 것과 같이 결과로서 도 2A 및 B에서 수득된 결과를 확인하였다. 특히 최초 접종 20일 후에 조차도 전기천공법과 결합한 근육내 부스팅으로 항체 역가가 강화되었다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 일반적으로 백신 조성물을 2회 이상의 투여로 연장하여 투여하는 병원균, 감염성 제제 및 다른 질환 상태(예를 들면 암)에 백신을 전기천공법을 이용하여 전달하는 방법에 관한 것이다. 그러나 상기는 1개 이상의 세포, 바람직하게는 하기 조직 각각에 백신 조성물을 직접 전달하기 위해 전기천공법을 이용하면서, 예를 들면 피부 조직인 제1 조직으로 최초 볼루스를 전달한 이후에 제2의 상이한 조직, 예를 들어 근육 조직으로 부스팅하여, 포유류에서 강화된 면역 반응을 제공하는 본 발명의 인지를 기본으로 한다고 말한다. 실제로 몇몇 바람직한 실시양 태에서 최초 또는 프라이밍, 투여는 동시에 전기천공된[즉 항원(들)(또는 항원-암호화 핵산(들))의 전달 전, 전달과 동시 또는 전달 이후에 전기천공하여 항원(들)(또는 핵산(들))의 업테이크가 강화된] 근육 조직에 1회 이상의 이후에 수반되는 "부스팅" 투여를 가하면서 피부 조직에 특정 질병 또는 질환 치료를 위한 항원성 제제(들)의 전기천공법을 이용한 전달을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서 프라이밍으로 이후의 부스팅은 피부 조직에서 행하고, 근육에 최초 볼루스를 투여함과 동시에 EP를 행해 선택적으로 실행한다.

EP를 이용한 백신 전달에 있어서 백신은 다양한 타입의 전극를 포함하는 전기천공 장치를 사용하여 조직으로 전달될 수 있다. 예를 들면 피부 조직, 예를 들면 각질층, 진피 및 피하층 조직의 전기천공법에 관해서 전기천공 장치는 미국 특허 제6,009,345호, 제5,968,006호 및 제6,972,013호에 기재된 것과 같이 구불구불한 전극 및 고리형 전극과 같은 비침입성 전극을 이용할 수 있다. 추가적으로 PCT 출원 WO02/072781에 기재된 것과 같은 비침입성 포인트 전극 및 미국 특허 제5,439,440호에 기재된 캘리퍼스 전극을 사용할 수도 있다. 관련된 바람직한 실시양태에서 백신은 "피부를 통한 전기천공"에 의해서 각질층의 표면를 통해 및 더 깊은 피부 조직으로 항원을 전달하기 위해 전기천공 펄스 또는 펄스 트래인을 사용하는 것과 같이 피부 표면에 국소적인 적용을 통해 백신을 전달할 수 있으며, 반면에 다른 바람직한 실시양태에서 예를 들면 구불구불한 전극, 고리형 전극 또는 포인트 전극의 임의의 적당한 전극 구성을 사용하여 전기천공 펄스 또는 펄스 트래인을 피부 조직에 동시에 제공하는 것과 결합하여, 주사바늘과 주사기, 주사바늘이 없는 제트 주입 장치, 예컨대 Biojector, 피부 패치 전달 시스템 또는 임의의 다른 적당한 접근법을 사용하여 피부 조직에 (예를 들면 피하 또는 피부층으로) 백신을 투여한다.

피부 조직으로의 백신접종은 또한 침입성 전극, 예컨대 주사바늘 유사 전극, 미세전극 또는 제트 주입 장치로부터 배출되는 전도성 유동상 제트에 의해 형성되는 전극을 사용하여 실행시킬 수 있다. 몇몇 상기 실시양태에서 주사바늘 유사 전극은 또한 인체 조직으로 항원성 물질을 전달하기 위해 사용할 수 있는 홀로우 주사바늘(hollow needle)을 포함할 수도 있다. 피부 투여에 관해서 백신 조성물은 예컨대 분리 피하 주사바늘, 제트 주입기, 또는 전극 그 자체를 통해서 예를 들면 피부 조직에 피하층으로 주입한 후에 1개 이상의 전기천공 펄스로 전극를 펄스화할 수 있다.

근육 조직에 백신 조성물을 투여하는 것과 관련하여 선택적으로 백신을 전달할 수 있는 통상적인 주사바늘 타입 전극을 주사바늘 및 주사기 또는 제트 주입에 의해서 근육에 백신을 전달하는 것과 동시에(흔히 이후에 전달함) 펄스화한다.

본 발명의 방법에 사용하는 주사바늘 전극은 이들의 전문이 참고문헌으로서 여기에 혼입된 미국 특허 제5,273,525호, 제6,110,161호, 제6,261,281호, 제6,958,060호, PCT 출원 WO01/85202 및 WO2007/095140에 기재된 것과 같이 또는 상기에서 언급한 특허에서 기재한 것을 포함하는, 계획된 목적에 맞게 조정된 임의의 적당한 주사바늘 전극을 포함할 수 있다.

감사하게도 본 발명은 제1 조직(예를 들면 피부 조직)에서의 최초 백신접종 이후에 제2 조직(예를 들면 근육 조직)에서의 1회 이상의 부스팅에 의해서 강화된 면역 반응을 제공한다. 실제로 복수의 부스트 투여와 관련된 실시양태에서 제2 또는 이후의 부스트는 제1 부스트 적량을 투여하는 곳이 아닌 다른 조직 타입에 투여할 수 있다. 특정 이론으로 경계를 짖는 것을 원하지 않으면서 피부로의 백신접종이 전달된 항원성 제제(들)의 면역 진행에 영향을 줄 수 있는 비교적 높은 농도의 수지상 세포를 제공하는 반면에 근육에서의 부스팅은 항원이 세포상 반응을 제공하는 세포에서 처리되도록 하는 근육 구획에서 항원(들)이 비교적 장 기간 존재하도록 하기 때문에 피부 조직에서의 프라이밍과 근육에서의 부수팅과 관련된 방법에 의해서 적어도 일부분은 강화된 면역 반응이 유도된다고 생각된다. 따라서 1개 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 항원 종을 암호화하는 1개 이상의 핵산 종의 전달로 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원(들)의 장 기간 발현을 강화시켜 면역 시스템의 세포성 및 체액성 암(arms)에 발현된 항원(들)이 비교적 장 기간 노출되도록 한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서 투여 방법은 적당한 날수로 프라임으로부터 부스트 접종원의 타이밍에 간격을 두는 것을 포함한다. 물론 프라이밍과 부스팅 사이(및 2회 이상의 투여를 계획하거나 또는 목적할 시의 이후의 부스트들 사이)의 특정한 간격은 용이하게 결정할 수 있으며, 유도되는 목적 면역 반응, 전달되는 항원(들), 프라임과 부스트 조성물이 전달되는 조직 타입, 전달되는 조성물의 타입[예를 들면 각각의 경우에 펩티드-함유 조성물, 각각의 경우에 항원-암호화 핵산, 하나의 경우(예를 들면 프라이밍에 있어서)에 펩티드 및 또 다른 경우(예를 들면 부스팅에 있어서)에 펩티드를 암호화하는 핵산], EP를 프라이밍, 부스팅, 또는 프 라이밍 및 부스팅과 결합하여 사용할 지의 여부, 조성물을 투여해야 하는 환자의 나이와 건강상태 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 수반하는 도 1에서 나타낸 것과 같이 피부 및 근육 둘 다에 동시에 투여하는 것은 면역 시스템이 피부에서의 프라이밍 접종과 반응하도록 효과적인 기간으로 프라이밍과 부스팅 사이의 타이밍에 간격을 두는 것 보다 덜 최적이다. 바람직한 실시양태에서는 백신 프라임 볼루스의 투여는 1일과 약 4-7주 사이로 부스트 볼루스로부터 알맞게 간격을 둔다. 특정의 바람직한 실시양태에서 프라임과 부스트 볼루스 사이의 시간 간격은 1일과 7, 14, 20, 30, 35, 40, 45, 50 및 54일 사이일 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서 간격은 2일, 6일 또는 20일일 수 있다. 다수의 부스트 적량을 투여하는 경우 이후의 부수트들 사이의 간격은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 몇몇 바람직한 부스트 사이 간격은 1주, 2-4주, 1-3개월, 4, 5, 6, 8 및 10개월, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 및 20년을 포함한다.

상기에서 기재한 것과 같이 본 발명의 백신은 다른 것 중에서도 1개 이상의 항원성 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드에 프로모터, 바람직하게는 유도성 또는 조직-특이적 프로모터에 의해 제어 또는 조절되는 발현을 암호화하는 유전자계 백신을 포함할 수 있다. 몇몇 바람직한 상기 실시양태에서 볼루스는 각각 프라임과 부스트에 있어서 피부 및 근육 조직 둘 다에 미리 결정한 간격에 따라 전달한다. 그러나 본 발명은 또한 프라이밍 볼루스가 바람직하게는 피부로 투여되고, 부스트 접종은 근육으로 전달되도록 프라임과 부스트 접종 둘 다를 동시에 투여하는 것을 계획한다. 이러한 부류의 특정 바람직한 실시양태에서 근육으로 전달되는 백신 조성 물은 노출 시에 유도될 수 있거나 또는 유도제와 함께 실시가능한 유도성 프로모터의 제어하에서 항원을 암호화하는 핵산을 포함한다. 따라서 선택된 시간에 예컨대 예를 들면 동시에 프라이밍 및 부스팅 한 후 1 내지 14일 사이에 근육 조직에 전달되는 핵산에 의해 암호화되는 유전자 발현이 유도되어 특정 항원에 면역 반응성을 유도 또는 강화시키고, 원하는 항원의 발현을 유도할 수 있다. 또 다른 대안적인 실시양태에서 프라이밍에 사용하는 백신 조성물은 부스트 조성물이 항원 자체를 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함할 수 있는 반면에 항원성 펩티드를 암호화하는 발현가능한 핵산을 포함할 수 있다. 현재 상기 실시양태에서 1개 이상의 백신 조성물(프라이밍 또는 부스팅에 사용되는 조성물)은 동일한 항원의 상이한 형태를 포함할 수 있다; 예를 들면 조성물들 중 하나는 단일 항원성 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드 종을 포함할 수 있는 반면에 조성물들 중의 다른 것은 동일한 항원성 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드 종의 발현을 지시할 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 또한 프라임 및/또는 부스트 조성물은 임의의 적당한 유전자 전달 매체(예를 들면 DNA 또는 RAN 바이러스, 바이러스 게놈, "누드(naked)" DNA 벡터, 플라즈미드 또는 도입되는 세포의 게놈에 통합되는 경향을 보이지 않는 다른 유전자 인자, (균질성 재조합, 랜덤 삽입 등에 의해) 통합되는 벡터 또는 이의 부분, 펩티드, 단백질, 또는 폴리펩티드 종, 및/또는 면역 반응을 목적하는 임의의 특정 지시에 의해 도안된 유기 분자 칵테일을 포함할 수 있다.

본 발명의 특정의 대표적이며 비제한적인 실시예에 관해서 피부 조직에 백신 조성물의 투여한 후 근육에 부스팅하는 실험(둘 다의 경우에 전기천공법을 사용함) 을 면역 반응의 강화를 위해 기재하였다.

실시예 1

화이트 뉴질랜드 래빗(n=4)의 3개 코호트에 총 인간 IgG 단백질을 암호화하는 DNA로 백신접종하였다. 백신접종은 하기 코호트 1-3과 같이 투여하였다:

1) 0일: 단지 근육에만 주입

2) 0일: 피부 접종; 7일: 근육 주입, 각각은 전기천공법으로

3) 0일: 피부 및 근육 둘 다에 백신접종

피부 전기천공에 있어서는 캘리퍼스 전극(9 mm × 9 mm)을 갖는 BTX ECM 820 및 근육 조직에서의 주입과 전기천공이 가능한 트윈 주입/전극을 갖는 Elgen 1000(Inovio AS, Oslo, Norway) 장치를 사용하여 전기천공법을 실행하였다. 피부 및 근육 투여 둘다에 있어서 전계는 각각 백신 용액의 피내 또는 근육내 주입 후에 적용시켰다. 피부에 있어서 백신접종은 IgG-암호화 DNA 용액 30 ㎍/30 ㎕를 토끼 척추 피부에 주입하기 위해 28G 주사바늘을 사용하는 것을 포함한다. 근육에 있어서 접종은 200 ㎕ DNA/주사바늘 = 400 ㎕/주입 부위 또는 20 ㎍/400 ㎕ hIgG를 사용하여 토끼 대퇴근에서의 i.m. 접종으로 구성된다.

전기천공 조건:

근육: 250 mA, 20 ms, 2 펄스, 100 ms 간격(10Hz), 2-주사바늘 배열, 21 G 주사바늘, 두개의 주사바늘 전극 사이의 2 mm 간격, 200 ㎕/주사바늘, 1 cm 총 삽 입 깊이, 0.7 cm 주입 깊이

피부: 100 V/mm, 10 ms, 5 펄스, 1 s 간격, 30 ㎕/부위

도 1에서 나타낸 것과 같이 토끼에서 인간 IgG에 대항하여 유도된 항체 역가는 백신접종을 근육에 단독으로 실행하거나 또는 일차 접종으로서 단지 피부 및 근육에서 실행하는 것과는 반대로 피부 및 근육 각각에서 프라이밍 및 부스팅을 실행하는 경우에 놀랄만하게 매우 높았다. 따라서 본 실험은 항원성 제제를 상이한 조직에 알맞게 간격을 두어 투여(spaced-in-time administration)하면 상기 항원성 제제에 면역 반응을 강화시킬 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 방법은 상기 제제에 대항하는 항체의 순환을 더 신속하고 더 높게 존재하도록 한다.

실시예 2

본 실시예에서 전기천공법의 부가된 이점으로 피부로의 프라이밍 및 제2 조직, 예컨대 근육으로의 부스팅의 놀랄만한 이점은 (BALB/c) 마우스 면역 모델을 사용하여 확인하였으며, 상기 모델로 ELISA로 측정한 항원-특이적 항-IgG1 및 항-IgG2a 항체 역가를 연구하였다. 항-IgG1 및 항-IgG2a 항체 둘 다를 사용하여 본 발명에 따른 면역화 처방 계획으로 염증 세포-중재 면역성(또한 TH1 반응이라고 함)과 관련된 반응 뿐만 아니라 조절 체액성 면역성(또한 TH2 반응이라고 함)과 관련된 반응도 강화시킨다는 것을 확인하였다.

제1 실험에서 Balb/c 마우스(n=7)의 5개 코호트에 마우스 대퇴근의 근육 조직 또는 피부(진피)에 간염 B 표면 항원(g-Wiz-HBsAg)(Aldevron LLC, Fargo, ND, USA)을 암호화하는 플라즈미드 DNA(pDNA) 30 ㎍/ 30 ㎕로 백신접종한 후 전기천공 하였다. 전기천공법은 피부에서는 BTX ECM 820을 사용하고, 근육에서는 Elgen 100 장치(Inovio Biomedical Corp, San Diego)를 사용하여 적용시켰다.

근육 처리에 있어서 전기천공법은 50 V 및 전류 제한으로 250 mA, 5 펄스, 20 ms 펄스 길이, 100 ms 간격을 사용하여 실행하였다. 피부(진피) 조직에 있어서 전기천공법은 하기 파라미터에서 캘리퍼스 전극을 사용하여 실행하였다: 3 펄스, 10 ms 펄스 길이, 150 V/mm, 펄스 사이의 간격은 1 s 간격.

코호트 1에는 피부(피내) 조직에 0일에 프라이밍 접종을 실행했다(S0).

코호트 2에는 근육에 0일에 프라이밍 접종을 실행했다(M0).

코호트 3에는 피부(피내) 및 근육 둘 다 0일에 프라이밍 접종을 실행했다(S0M0).

코호트 4에는 피부(진피)에는 0일에 프라이밍 접종을 한 후 근육에는 2일에 부스팅을 하였다(S0M2).

코호트 5에는 피부(진피)에는 0일에 프라이밍 접종을 한 후 근육에는 6일에 부스팅을 하였다(S0M6).

혈청 항-HBs 특이적 면역 반응은 ELISA로 측정하였다. (A) 기하 평균 항-HBs IgG1 항체 종점 역가(± 표준 오차)는 여러 시간의 시점에 측정하였다(제1 면역화 후 14, 21, 28 및 42일). 42일에 통계적으로 유의한 차이가 기록되었으며, ^*p<0.05이다. (B) 기하 평균 항-HBs IgG2a 종점 역가(± 표준 오차)는 여러 시간의 시점에 측정하였다. 42일에 또한 통계적으로 유의한 차이가 기록되었으며, ^*p<0.05 이다.

상기 공정의 결과는 도 2A 및 B에 나타냈다. 명확하게 지적한 것과 같이 상기 백신접종 처방 계획은 질환 표적 항원, 예를 들면 간염 B 항원에 대항하는 강화된 역가를 제공한다. 상기의 처방 계획으로 체액성 뿐만 아니라 세포성 반응 둘 다가 강화된다. 예를 들면 도 2A에서는 항-HBs IgG1 항체 역가(체액성)를 나타내며, 도 2B에서는 항-HBs IgG2a(세포성)의 면역 반응을 나타낸다. 놀랍게도 2개의 상이한 조직 또는 대안적으로 하나의 조직 타입 또는 또 다른, 예를 들면 피부 및 근육, 또는 피부 또는 근육으로 동일한 시간에 접종하면 전기천공법을 사용하여 피부에 프라이밍한 후 근육에 부스팅을 하는 것으로 구성되는 접종 처방 계획을 사용하는 경우 보다 더 낮은 역가가 나타난다. 또 놀라운 것은 강화된 효과는 프라임 및 부스트 접종을 분리하여 2일로 하지 않는 한 관찰되지 않는다.

추가의 결과로 근육과 같은 두번째 조직에서의 부스팅은 여기서 20일 만큼까지 제1 접종으로부터 연기할 수 있으며, 전기천공법에 의해 피부(진피) 조직에서의 프라이밍 및 근육 조직에서의 부스팅 둘 다를 포함하는 면역화 처방 계획에 있어서 면역 효과를 강화시킨다는 것을 확인하였다. 특이적으로 Balb/c 마우스(n=7 각 코호트)의 5개 코호트에 플라즈미드 g-Wiz-HBsAg(Aldevron LLC, Fargo, ND) 30 ㎍/30 ㎕를 마우스 대퇴근의 피부(진피) 또는 근육 조직에 접종한 후 전기천공하였다. 근육 처치에 있어서 전기천공법은 전류 제한 250 mA, 5 펄스, 20 ms 펄스 길이, 펄스 사이 100 ms 간격이며, 50 V에서의 펄싱 파라미터 설정된 Elgen 1000 트윈 주입기(Inovio Biomedical Corp, San Diego)를 사용하여 실행하였다. 피부/진피 조직 처치에 있어서 전기천공법은 캘리퍼스 전극 및 3 펄스, 10 ms 펄스 길이, 150 V/mm, 1 s 간격을 포함하는 펄스 파라미터를 사용하여 실행하였다.

코호트 1에는 피부(피내) 조직에 0일에 접종을 실행했다(S0).

코호트 2에는 피부(피내)에 0일에 접종 한 후 다시 20일에 피부에 부스팅하였다(S0S20).

코호트 3에는 근육에 0일에 접종한 후 다시 근육에 20일에 부스팅하였다(M0M20).

코호트 4에는 피부(피내)에 0일에 접종을 한 후 근육에 20일에 부스팅을 하였다(S0M20).

코호트 5에는 근육에 0일에 접종을 한 후 피부(피내)에 20일에 부스팅을 하였다(M0S20).

본 실험으로부터의 결과는 도 3A 및 B에 나타냈다. 특이적으로 혈청 항-HBs 특이적 면역 반응은 ELISA로 측정하였다. 도 3A에서 기하 평균 항-HBs IgG1 항체(체액성 반응) 종점 역가(± 표준 오차)는 제1 백신접종 28일 및 42일 후에 나타났다. 42일에 통계적으로 유의한 차이가 ^*p<0.05와 같이 나타났다. 도 3B에서 기하 평균 항-HBs IgG2a 반응(세포성), 종점 역가 ± 표준 오차가 나타났다. 42일에 또한 통계적으로 유의한 차이(^*p<0.05)가 나타났다. 이러한 결과로부터 1개의 조직 타입에서의 백신을 환자에게 프라이밍하고, 제2 조직 타입에 부스팅하는 것에 뚜렷한 이점이 있다는 것이 명확하게 나타났다. 특히 바람직한 측면에서 피부/진피 조 직에 전기천공법을 경유하여 프라이밍하고 전기천공법을 경유하여 근육에 부스팅하는 이점이 확인되었다. 추가로 제1 접종 이후 2일 이상, 바람직하게는 6 및/또는 7일, 및 대안적으로 바람직하게는 7일 후, 예컨대 20일의 부스팅으로부터 알맞게 연기된 후의 부스팅의 이점이 관찰되었다.

여기서 개시하고 청구하는 모든 조성물 및 방법은 본 상세한 설명을 고려하여 과도한 실험없이 만들고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태를 이용하여 기재한 반면에 당업에 통상의 지식을 가진 자들은 조성물 및 방법에 변화를 줄 수 있으며, 본 발명의 범주 및 정신을 벗어나지 않으면서 여기에 기재된 방법의 연속 공정 및 공정에 변화를 줄 수 있을 것이다. 보다 특히 기재된 실시양태는 실례적으로서 모든 측면을 기재하였으며, 이에 제한하지 않는다. 당업에 통상의 지식을 가진 자들에게는 명백한 모든 유사한 치환 및 변환은 첨부된 청구항으로 규정하는 본 발명의 정신 및 범주 내에서 가능할 것이다.

상세한 설명에서 언급한 모든 특허, 특허 출원 및 출판물은 본 발명에 관한 당업에 통상의 지식을 가진 자들의 수준을 나타낸다. 주장하는 우선권 또는 또 다른 이점을 포함하는 모든 특허, 특허 출원 및 출판물은 각 개개 출판물이 특이적 및 개별적으로 여기에 혼입된 것으로 나타냈다면 동일한 내용이 참고문헌으로 여기에 혼입되었다.

여기서 기재한 본 발명은 여기서 기재한 특이적이지 않은 임의의 인자(들)의 부재로 실행될 수 있다. 따라서 예를 들면 "포함하는(comprising)", "필수적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "구성되는(consisting of)"이라는 용어 는 다른 두개의 용어와 서로 대체할 수 있을 것이다. 사용하는 용어 및 표현은 서술적인 용어로서 사용하였으며, 이에 제한하지는 않고, 이러한 용어 및 표현을 전체 또는 이의 부분에서 기재하고 나타낸 특징의 임의의 균등물을 제외하는 것을 의미하지만 청구하는 본 발명의 범주내에 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명이 바람직한 실시양태 및 선택적 특성에 의해 특이적으로 기재되어 있지만 여기에 기재된 개념의 변형 및 변화는 당업에 통상의 지식을 가진 자들에 의해 가능하며, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구항에서 규정하는 본 발명의 범주내에 있어야 한다.

본 발명은 특허가능한 공정 및 방법과 관련이 있다. 임의의 특허가능 기계, 제조 물품, 물질 조성물과 본 발명에 따른 "특허가능(patentable)" 공정 또는 방법은 대상 물질이 실행한 분석이 그 당시 특허성에 있어서 요구되는 법정 요구사항 모두를 만족하는 것을 의미한다. 예를 들면 신규성, 비-명확성 등과 관련하여 더 최근의 연구로 첨부된 청구항 중 1개 이상이 신규성, 비명확성 등을 부정하는 1개 이상의 실시양태를 포함한다고 밝힌다면 상기 청구항(들)은 "특허가능" 실시양태로 규정하는 것에 의해 제한을 받으며, 특이적으로 비특허가능 실시양태(들)는 제외될 것이다. 또한 여기서 첨부하는 청구항은 이들의 유효성을 보존할 뿐만 아니라 더 넓은 정당한 범주를 제공하는 것으로 해석할 것이다. 또한 특허성에 있어서 법적인 요구사항 중 1개 이상이 보정되거나 또는 특허성에 있어서의 특정 법정 요구사항이 이 시간 부터 만족하는지의 여부를 평가하는 표준이 변화한다면 본 출원은 첨부된 청구항 중 1개 이상의 유효성이 문제되는 시간에 특허로서 출원 또는 발급되 며, 청구항은 (1) 이들의 유효성을 보존하고, (2) 이러한 환경하에서 더 넓은 정당한 해석을 제공하는 쪽으로 해석될 것이다.

Claims (18)

1. 포유류에서의 면역 반응의 강화 방법으로서,

   상기 포유류의 제1 조직 전달(delivery) 부위에 첫번째로 백신 조성물의 제1 볼루스(bolus)를 투여하는 단계, 이후에 두번째로 상기 포유류의 제2 조직 전달 부위에 상기 백신 조성물의 부스트(boost) 볼루스를 투여하는 단계를 포함하며,

   상기 부스트 전달을 상기 첫번째 투여 후 2 내지 10일 사이에 상기 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 제1 볼루스 및 부스트 볼루스 투여는 제1 볼루스 및/또는 부스트 볼루스 투여 이전, 동시 또는 이후에 1회 이상의 전기천공 전기 펄스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서,

   상기 포유류는 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2 항에 있어서,

   상기 백신 조성물은 폴리펩티드 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 2 항에 있어서,

   상기 백신 조성물은 항원을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 항원은 상기 포유류에서 상기 핵산으로부터 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서,

   상기 제1 조직 전달 부위는 피부, 진피 및 피하층 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서,

   상기 제2 조직 전달 부위는 근육, 가로무늬근 및 평활근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서,

   상기 제1 조직 부위로의 조성물의 투여는 상기 제2 조직 부위로의 조성물의 투여로부터 2일 및 30일 사이로 알맞게 간격을 두는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 포유류를 면역화하는 방법으로서,

    상기 포유류 상의 제1 조직 투여 부위에 첫번째로 1개 이상의 백신 조성물의 제1 볼루스를 전달한 후에 상기 포유류 상의 제2 조직 투여 부위에 두번째로 1개 이상의 부스터 백신 조성물 볼루스를 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서,

    상기 제1 볼루스 및 부스트 볼루스의 투여는 제1 볼루스 및 부스트 볼루스 투여 이전, 동시 또는 이후에 1회 이상의 전기천공 전기 펄스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서,

    상기 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 11 항에 있어서,

    상기 포유류는 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 10 항에 있어서,

    상기 백신 조성물은 폴리펩티드 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 10 항에 있어서,

    상기 백신 조성물은 항원을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 항원은 상기 포유류에서 상기 핵산으로부터 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 10 항에 있어서,

    상기 제1 조직 투여 부위는 피부, 진피 및 피하층 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 10 항에 있어서,

    상기 제2 조직 투여 부위는 근육, 가로무늬근 및 평활근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 10 항에 있어서,

    상기 제1 조직 부위로의 조성물의 투여는 상기 제2 조직 부위로의 조성물의 투여로부터 3일 내지 4주 사이로 알맞게 간격을 두는 것을 특징으로 하는 방법.

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