KR20090031568A

KR20090031568A - 생리활성 폴리펩티드 또는 단백질 내포 고분자 폴리머 미셀및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20090031568A
Application number: KR1020097000829A
Authority: KR
Inventors: 미호 오우치; 미츠노리 하라다; 유코 아마노; 야스키 가토
Original assignee: 나노캬리아 가부시키가이샤
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2007-04-25
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2027-04-25
Also published as: EP2042184B1; CN101489574A; CA2658082A1; US8147868B2; BRPI0714718B1; JP5294858B2; BRPI0714718A2; CA2658082C; US20090291130A1; IL196565A0; EP2042184A1; JPWO2008010341A1; WO2008010341A1; EP2042184A4; KR101363498B1

Abstract

본 발명은, 생리활성 폴리펩티드 또는 단백질이 내포되고, 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 이루어지는 블록 코폴리머 유래인, 고분자 미셀 조성물을 제공한다.

폴리펩티드, 생리활성

Description

생리활성 폴리펩티드 또는 단백질 내포 고분자 폴리머 미셀 및 그 제조방법{PHYSIOLOGICALLY ACTIVE POLYPEPTIDE, POLYMER MICELLE HAVING PROTEIN ENCLOSED THEREIN, AND PROCESS FOR PRODUCTION OF THE POLYMER MICELLE}

본 발명은, 생리활성 폴리펩티드 또는 단백질을 고함량으로 함유하고, 생체투여가 가능하며 생체내에서 안정적인 고분자 미셀(micelle) 및 그 제조방법에 관한 것이다.

유전자 조작기술의 진보에 따라 많은 생리활성 폴리펩티드 및 단백질이 세포배양법으로 안정적으로 공급할 수 있게 되어, 질병의 치료나 예방에도 활용되고 있다. 하지만, 이 폴리펩티드들은 일반적으로 생체내에서 효소분해, 대사 등이 매우 빠르게 이루어지기 때문에, 반감기가 짧고, 약제로서 투여하였을 경우에는 충분한 효과를 얻을 수 없는 경우가 많다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 지금까지 고분자에 의한 수식이나 서방성(slow release) 제제 등 수많은 연구가 이루어져 왔다.

예를 들어, 현재 임상에서 사용되고 있는 고분자 수식기술로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG)화를 들 수 있다. 인터페론(interferon) 등에 있어서, 생체내의 반감기를 연장하고, 효과의 지속화를 어느 정도 달성하였다. 실제로 투여횟수를 줄여서 환자의 부담을 줄이고 있는데, 이 고분자 수식 단백질들은 일반적으로 수식에 의해 활성이 떨어지고, 수식부위 및 수식율을 양호한 재현성으로 조절하기가 어렵다는 문제점이 있다.

이어서, 서방화 기술로서는 마이크로 캡슐이 현재 임상에서 사용되고 있다. 이 기술은 생체내에서 분해되는 폴리유산 또는 폴리유산·글리콜산 공중합체를 기제(基劑)로 사용하여 약물을 미립자 안에 밀봉함으로써 달성하는 것이다. 하지만, 입자직경은 일반적으로 마이크로미터의 영역으므로 정맥내 투여에는 적합하지 못하다. 이 마이크로 캡슐의 입자직경을 나노 사이즈까지 줄이고, 또한 표면수식에 의해 정맥내 투여후의 간장이나 비장 등의 세망내피계(細網內皮系)로의 혼입을 억제하였다는 보고도 있다(Adv. Drug Deliv. Rev. 17, 31-48(1995)). 하지만, 이 방법들에서 얻어지는 입자직경은 적어도 수백 나노미터이며(Int. J. Pharm. 149, 43-49 (1997)), 또한 표면수식이 번거롭고, 장기분포를 양호한 재현성으로 조절하는 것도 어렵다는 문제점이 있다.

인지질을 사용하는 리포솜도 현재 임상에서 사용되고 있는 서방화 기술의 예라고 할 수 있다(Pharm. Tech. Japan 19, 99-110(2003)). 리포솜의 이점은, 인지질이 생체성분 때문에 독성이나 항원성이 낮다는 것, 지질조성을 바꿈으로써 수용성 약물, 지용성 약물, 고분자, 단백질, 핵산 등의 많은 생리활성 물질을 밀봉할 수 있다는 점이다. 하지만, 이 리포솜들은 약물의 보유율이 반드시 충분하다고는 할 수 없다. 즉, 단위 리포솜 약제 안에 밀봉할 수 있는 약물량이 충분하지 않고, 현재로서는 더욱 효율적인 방법이 요구되고 있다. 더구나, 생체내에서의 안정성이 충분하지 않고, 공업적인 제조가 어렵다는 등의 문제점이 아직 충분히 해결되지 않았 다.

이 문제점들을 해결하기 위하여, 현재 임상에서 검토되고 있는 서방화 기술로서 고분자 미셀을 들 수 있다(Br. J. Cancer 93, 678-697 (2005), Br. J. Cancer 92, 1240-1246 (2005)). 고분자 미셀은 친수성 고분자와 소수성 고분자로 이루어지는 블록 코폴리머(block copolymer)를 이용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 수중에서 소수성 세그먼트를 코어로 한 미셀을 형성하기 때문에, 고분자 미셀은 지용성 약물의 내포화·가용화 및 서방화에 대하여 뛰어난 성질을 가진다(일본특허 제2777530호 공보).

이와 같은 고분자 미셀을 수용성 약물의 내포화 및 서방화에 적응하기 위하여 여러가지 검토가 이루어지고 있다. 예를 들어, 수용성 화합물인 아드리아마이신(adriamycin)의 고분자 미셀로의 밀봉에 관해서는, 소수성 고분자의 측쇄에 약물을 화학적으로 결합시킴으로써 밀봉시키는 방법이 제안되고 있다(일본특허 제2694923호 공보). 또한, 다른 방법으로서, 하전성(荷電性) 성질을 가지는 약물 예를 들어, 양전하를 가지는 염기성 펩티드 등에 대해서는, 블록 코폴리머 내의 소수성 세그먼트의 측쇄에 음전하를 가지는 관능기를 도입하거나(일본특허 제2690276호 공보), 혹은 폴리유산 또는 폴리유산 글리콜산 등의 카르복시기를 가지는 생분해성 고분자를 공존시킴으로써(WO2005/023230), 고분자 미셀과 펩티드 사이에 정전기적 상호작용을 유도하여 효율적으로 밀봉하는 방법이 개시되어 있다. 하지만, 분자량이 큰 수용성 약물, 특히 단백질이나 폴리펩티드에 응용할 수 있는 것은 아니다. 상기 일본특허 제2690276호 공보는 그 실시예에서 단백질을 미셀에 내포시키는 예 를 나타내고 있는데, 미셀은 소수성 부분을 가지지 않고 전하만으로 형성되어 있어서 미셀 자체의 안정성이 약하고, 실제로 생체내에 투여하였을 경우, 바로 붕괴될 것이다.

고분자 전해질을 내포하는 미셀의 안정화 방법으로서, 친수성 세그먼트 및 하전성 세그먼트(charged segment)를 포함하는 블록 코폴리머와 고분자 전해질로 형성되는 코어 쉘(core-shell) 구조의 폴리이온 복합미셀(polyion-complex micell)에 관한 것으로, 코어부를 형성하는 하전성 세그먼트에 적어도 1개의 티올기를 담지시키고, 그 하전성 세그먼트 사이에서 그것들에게 담지시킨 티올기를 통한 디설파이드 결합(disulfide-bonding)의 가교안정을 형성시키는 것에 의한 안정화 방법이 개시되어 있다(일본특허공개 2001-146556호 공보). 하지만, 실제 사용시에는, 정맥내 주사에 의한 투여후의 희석이나 혈청 단백질과의 상호작용에 의해 미셀이 해리되어 버리는 것이나, 분자내에 SS결합 가지는 단백질과의 상호작용이 예측되어, 해당 단백질의 활성손실이나 미셀의 불안정화가 일어나기 때문에, 광범위한 단백질이나 폴리펩티드에 적응할 수 있는 것은 아니다.

상기와 같이, 생리활성 폴리펩티드 및 단백질에 의한 치료효과를 높이기 위해서는, 생리활성 폴리펩티드 및 단백질을 안정적이고 효율적으로 내포시키고, 제어된 속도로 유리(遊離)할 수 있는 고분자 미셀이 필요하며, 면역응답이 경미하고 광범위한 생리활성 폴리펩티드 및 단백질에 응용할 수 있는 것은 현재로서는 아직 얻지 못하였다.

또한, 지금까지 제안된 하기 기술들에서는, 생리활성 폴리펩티드 및 단백질 에 의한 치료효과를 높이기 위하여 상술한 사양을 만족시키려고 시도하였지만, 모든 것을 성공하지는 못하였다.

(a) 일본특허공표 2004-525939호 공보는, 폴리아미노산의 블록과 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 폴리알킬렌글리콜 타입의 친수 폴리머의 블록을 베이스로 하는 나노 입자의 콜로이드 현탁액에 관한 것이다. 약물(단백질이나 폴리펩티드)의 나노입자화가 약물의 나노입자로의 흡착에 근거하고 있기 때문에, 나노입자 표면에 단백질이나 폴리펩티드가 존재하게 된다. 즉, 생체내에서는 소화효소 등의 공격에 의해 나노입자 표면의 단백질 등은 비교적 빠르게 분해되고, 활성을 잃게 되는 것으로 생각된다. 더구나, 내포시키는 단백질이나 폴리펩티드의 등전점(等電點)을 고려하여 나노입자를 형성하고 있는 것은 아니기 때문에, 유리가 비교적 빠르게 일어날 것이며, 지속적인 효과는 기대할 수 없다.

(b) 유럽특허공보 EP1084172B1호는, 콜레스테롤 존재하에서 팔미토일폴리L리신폴리에틸렌글리콜이나 팔미토일폴리L오르니틴폴리에틸렌글리콜을 사용한, 특히 핵산의 운반(delivery)에 관한 것이다. 이 기술에서 얻어지는 미립자의 입자직경은 적어도 수백 나노미터이며, 정맥내 투여 후에 세망내피계에 빠르게 집적되어 버리기 때문에, 지속적인 효과를 기대하기는 어렵다.

(c) 일본특허공개 평11-269097호 공보는, 소수성 세그먼트로서 생체내 분해성 폴리머를, 친수성 세그먼트로서 폴리아미노산을 가지는 블록 코폴리머를 기제로 하는, 장기(臟器) 지향성 및 서방능력 등의 기능을 가지는 미립자에 관한 것이다. 친수성 세그먼트에 생체내 분해성 폴리아미노산을 사용하는 점이 특징인데, 폴리에 틸렌글리콜과 비교하여 면역원성이 높고, 정맥내 투여후의 혈청 단백질과의 상호작용도 증가하는 것이 예상되어, 이 미립자의 혈중체류성은 단축되고, 장기간에 걸친 효과는 기대할 수 없다.

(d) 미국특허 제6090925호는, 내포시키고자 하는 저분자 화합물이나 펩티드의 수용액에 대하여, 폴리에틸렌글리콜과 폴리비닐피롤리돈의 초산 또는 인산 등의 완충액을 첨가하고, 그 완충액의 pH 부근에 등전점을 가지는 혈청 알부민 등의 고분자를 공존시켜서, 가열-냉각공정에 의해 마이크로 미립자를 형성시키는 방법을 개시한다. 70℃ 정도의 가열공정이 포함되기 때문에, 열에 불안정한 단백질 등에는 적응이 어려울 것으로 생각된다.

생리활성 폴리펩티드 및 단백질은 염기성으로 한정되지 않고, 예를 들어, 인터페론α, G-CSF, 인슐린 등의 등전점이 약산성에서 중성인 것이 많이 존재한다. 이와 같이 광범위한 생리활성 단백질이나 펩티드류에도 응용가능하고, 안정적이고 효율적으로 내포할 수 있으며, 제어된 속도로 유리할 수 있는 고분자 미셀 조성물은 아직 얻지 못하였다. 본 발명의 목적은 이와 같은 사양을 만족하는 블록 코폴리머 조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 상기한 현재상태에 감안하여 예의 연구를 한 결과, 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 친수성 세그먼트와, 산성 아미노산, 그 소수성 유도체 및 산성 아미노산과 그 소수성 유도체의 혼합물로부터 선택되는 폴리아미노산으로 이루어지는 소수성 세그먼트를 가지는 블록 코폴리머를 사용함으로써, 생리활성 폴리펩티트 및 단백질을 효율적으로 고분자 미셀에 내포시키는 것을 발견하였다. 더욱이, 고분자 미셀을 조제할 때의 pH를 생리활성 폴리펩티드 및 단백질의 등전점을 고려하여 조정함으로써, 보다 효율적으로 내포시키는데 성공하였다. 그리고, 본 발명자들은, 이 방법은 산성 또는 염기성에 상관없이 많은 생리활성 폴리펩티드 및 단백질에 적응가능하고, 사용하는 블록 코폴리머를 대체하여 그 소수성 세그먼트와 폴리펩티드 또는 단백질의 소수성 상호작용도 관여시킴으로써, 약물의 내포율 그리고 방출속도를 조정할 수 있는 것, 특히 블록 코폴리머 내의 소수성 측쇄의 구조가 약물 유리속도에 크게 관여하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하는데 이르렀다.

본 발명은 아래의 형태를 포함한다.

[1] 생리활성 폴리펩티드 또는 단백질이 내포된 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 친수성 세그먼트와, 산성 아미노산, 그 소수성 유도체 및 산성 아미노산과 그 소수성 유도체의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리아미노산으로 이루어지는 소수성 세그먼트를 가지는 블록 코폴리머로 이루어지는 고분자 미셀 조성물.

[2] 상기 산성 아미노산의 소수성 유도체가 산성 아미노산 알킬에스테르 또는 산성 아미노산 알킬아미드인 [1]에 기재된 조성물.

[3] 상기 산성 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루타민산인 [1]에 기재된 조성물.

[4] 블록 코폴리머가 하기 화학식 1 또는 화학식 2인 [1]에 기재된 조성물.

[화학식 1]

또는

[화학식 2]

상기 각 식 중, R₁ 및 R₃은 각각 독립적으로 수소원자 또는 보호되어 있어도 되는 관능기가 치환된 또는 치환되지 않은 저급 알킬기를 나타내고, R₂는 소수원자, 포화 또는 불포화의 C₁~C₂₉ 지방족 카르보닐기 또는 아릴카르보닐기를 나타내며, R₄는 수산기, 포화 또는 불포화의 C₁~C₃₀ 지방족 옥시기 또는 아릴-저급 알킬옥시기를 나타내고, R₅는 -O- 또는 -NH-를 나타내며, R₆은 수소원자, 페닐기, -(CH₂)₄-페닐기, 치환되지 않았거나 또는 아미노기 또는 카르복시기로 치환된 C₄~C₁₆ 알킬기, 또는 벤질기를 나타내고, R₇은 메틸렌기를 나타내며, n은 10~2500의 정수이고, x는 10~300이 되는 정수이며, m은 0~300이 되는 정수이고(단, m이 존재하는 경우, (COCHNH)의 유닛과 (COR₇CHNH)의 유닛은 랜덤(random)하게 존재하고, R₆은 1개의 블록 코폴리머 내의 각 아미노산 유닛에서 임의로 선택가능하고, 랜덤하게 존재하는데, R₆이 수소원자인 경우에는 R₆ 전체의 60% 이하임), y는 1 또는 2의 정수를 나타내고, L₁은 -NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, -CH₂-, -O-Z-S-Z- 및 -OCO-Z-NH-(여기서, Z는 독립적으로 C₁~C₆ 알킬렌기임)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결기를 나타내고, L₂는 -OCO-Z-CO- 및 -NHCO-Z-CO-(여기서, Z는 C₁~C₆ 알킬렌기임)로부터 선택되는 연결기를 나타낸다.

[5] 상기 블록 코폴리머가 폴리아미노산 측쇄의 에스테르화 또는 아미드화율 40~100%인 [4]에 기재된 조성물.

[6] 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 등전점(pI)이 3~11.5인 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 고분자 미셀 조성물의 조제방법으로서, 상기 블록 코폴리머와 상기 생리활성 폴리펩티드 및 단백질을 혼합하고, 해당 생리활성 폴리펩티드 및 단백질의 등전점(pI)과는 다른 pH로 해당 혼합액의 pH를 조정함으로써 해당 블록 코폴리머로 구성되는 미셀의 소수성 코어영역에 해당 생리활성 폴리펩티드 또는 단백질을 내포시키는 공정을 포함하여 이루어지고,

여기서 해당 생리활성 폴리펩티드 및 단백질의 pI, 해당 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트 안의 산성 아미노산 및/또는 그 유도체의 등전점(pI') 및 상기 pI와는 다른 pH는,

pI＞pH＞pI'

의 관계에 있고, 따라서 해당 pH에서 해당 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트는 음으로 대전하고, 해당 생리활성 폴리펩티드 및 단백질은 양으로 대전하는 것을 특징으로 하는 방법.

[8] 상기 pH가 상기 수용성 고분자 약물의 pI로부터 1 이상 떨어져 있는 [7]에 기재된 방법.

본 발명에 의해 생리활성 폴리펩티드 및 단백질이라는 고분자양의 약물을 고분자 미셀 안에 효율적으로 내포시킬 수 있고, 게다가 그 유리속도도 조절할 수 있다는 이점을 누릴 수 있다.

도 1은 각종 IgG 내포 고분자 미셀로부터의 IgG의 유리율의 경시적 변화를 나타낸다.

도 2는 각종 인터페론-α 내포 고분자 미셀을 생체내에 투여한 후의 인터페론-α의 혈장중 농도의 경시적 변화를 나타낸다.

도 3은 FITC 표지 리조티움 내포 고분자 미셀 또는 FITC 표지 리조티움 용액을 쥐에게 정맥내 투여한 후의 혈장중 농도의 경시변화를 나타낸다.

도 4는 인터페론-α 내포 고분자 미셀 또는 인터페론-α 용액을 쥐에게 정맥내 투여한 후의 혈장중 농도의 경시변화를 나타낸다.

도 5는 인터페론-α 내포 고분자 미셀 또는 인터페론-α 용액을 쥐에게 정맥 내 투여한 후의 혈장중 농도의 경시변화를 나타낸다.

도 6은 사람 과립구 콜로니 자극인자 내포 고분자 미셀, 또는 사람 과립구 콜로니 자극인자 용액을 쥐에게 정맥내 투여한 후의 혈장중 농도의 경시변화를 나타낸다.

도 7은 사람 과립구 콜로니 자극인자 내포 고분자 미셀, 또는 사람 과립구 콜로니 자극인자 용액을 쥐에게 정맥내 투여한 후의 혈장중 농도의 경시변화를 나타낸다.

본 발명의 하나의 바람직한 형태에서는, 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 친수성 세그먼트와, 산성 아미노산, 그 소수성 유도체 및 산성 아미노산과 그 소수성 유도체의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리아미노산으로 이루어지는 소수성 세그먼트를 가지는 블록 코폴리머를 이용함으로써, 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 효율적으로 고분자 미셀에 내포시킬 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 형태에서는, 내포시키고자 하는 생리활성 폴리펩티드 및 단백질의 등전점(pI)에 따라 고분자 미셀 조제시의 pH를 조정함으로써, 고분자 미셀을 형성하는 블록 코폴리머로 구성되는 해당 미셀의 소수성 코어영역에 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 보다 효율적으로 내포시킬 수 있다.

생리활성 폴리펩티드나 단백질을 폴리머 미셀 안에 보다 효율적으로 내포시키기 위해서는, 고분자 미셀 조제시의 pH를 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 pI와는 다른 값으로 조정하는 것이 바람직하다. 고분자 미셀 조제시의 pH는, 그 생리활 성 폴리펩티드나 단백질이 변성하지 않는 한 해당 생리활성 폴리펩티드 및 단백질의 pI와 떨어져 있는 것이 바람직하고, 구체적으로는 1 이상 떨어져 있는 것이 바람직하다. 또한, 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 보다 효율적으로 내포시키기 위해서는, 고분자 미셀 조제시의 pH에 있어서, 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트, 즉 폴리머 미셀의 코어를 형성하는 부분과 생리활성 폴리펩티드나 단백질은 반대 대전을 띠고 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 고분자 미셀 조제시의 pH에 있어서, 생리활성 폴리펩티드나 단백질은 양전하를 띠고 있을 경우, 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트는 음전하를 띠고 있는 것이 바람직하고, 생리활성 폴리펩티드나 단백질이 음전하를 띠고 있을 경우, 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트는 양전하를 띠고 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 바람직한 형태에 있어서, 예를 들어 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 pI, 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트 안의 산성 아미노산 및/또는 그 유도체의 등전점(pI') 및 고분자 미셀 조제시의 pH가,

pI＞pH＞pI'

의 관계에 있을 때, 그 pH에 있어서 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트는 음으로 대전하고, 또한 해당 생리활성 폴리펩티드나 단백질은 양으로 대전하게 된다. 한편, 산성 아미노산인 아스파라긴산, 글루타민산의 등전점은 각각 2.77과 3.22이다.

본 발명의 하나의 바람직한 형태에 따르면, 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 pI를 특정할 수 있으면, 상기 조건에 적합한 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트의 선정 및 고분자 미셀 조제시의 pH 결정을 적절히 할 수 있게 되어, 광범위한 pI를 가지는 여러가지 생리활성 폴리펩티드나 단백질에 적용할 수 있다. 예를 들어, pI가 염기성측에 있는 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 내포시키고자 하는 경우, 소수성 세그먼트 안의 산성 아미노산 및/또는 그 유도체의 pI'가 해당 pI보다 산성측에 있는 블록 폴리머를 선정하고, 또한 그 pI값과 pI'값의 사이에 있는 pH를 적절히 선정하며, 그 pH로 미셀형성을 함으로써 내포를 효율적으로 할 수 있다. 반대로, pI가 산성측에 있는 약물을 내포시키고자 하는 경우에는, 상기 pI'가 해당 pI보다 더욱 산성측 또는 더욱 염기성측에 있는 블록 폴리머를 선정하고, 또한 해당 pI값과 pI'값의 사이에 있는 pH를 적절히 선정하며, 그 pH로 미셀형성을 함으로써 내포를 효율적으로 할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트는 중성역 예를 들어, pH 5~8의 범위에서 음전하를 가지는 관능기를 가지는 것이다. 이와 같은 블록 코폴리머를 이용함으로써, 미셀 형성시의 pH로서 이러한 중성역의 pH를 선정하는 것이 가능해지고, 내포할 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 극단적인 산성 또는 알칼리성으로 하지 않아도 되게 된다.

고분자 미셀 조제시의 pH, 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 pI 및 소수성 세그먼트 안의 산성 아미노산 및/또는 그 유도체의 pI'를 고려하는 경우, 고분자 미셀로의 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 내포는, 고분자 미셀을 형성하는 블록 코폴리머와 내포할 생리활성 폴리펩티드나 단백질과 수성 혼합물을 준비하고, 그 혼합물의 pH를 상술한 바와 같이 해당 약물의 pI 및 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트 안의 산성 아미노산 및/또는 그 유도체의 pI'에 근거하여 적절히 선정한 pH로 조정함으로써 실시할 수 있다.

하나의 바람직한 형태에서는, 블록 코폴리머를 적당한 유기용매 예를 들어, 디클로로메탄, 클로로포름, 디에틸에테르, 디부틸에테르, 초산에틸, 초산부틸 등의 비수혼화성 유기용매, 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 이소프로필알코올, 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드, 디메틸아세토아미드, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라히드로푸란 등의 수혼화성 유기용매 또는 이것들의 혼합용매에 용해한다. 임의로 이 용액을 풍건(風乾) 예를 들어, 질소기류 분위기하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 필요하다면 감압하에서 말려 굳힘으로써 유기용매를 제거하여도 된다. 이와 같이 하여 처리한 블록 코폴리머에 내포할 수용성 고분자 약물의 수성용액을 첨가하여 혼합한다. 마지막으로, 이 혼합액의 pH를 천천히 원하는 pH로 조정하고, 고분자 미셀을 형성하면서 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 내포시킨다.

고분자 미셀은 예를 들어, 상기 블록 코폴리머와 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 혼합액을 교반함으로써 형성할 수 있다. 바람직하게는, 고분자 미셀은 초음파와 같은 에너지를 가하여 형성한다. 초음파를 사용하는 경우, 예를 들어 바이오 디스럽터(니혼세이키 제품)를 사용하여 레벨 4에서 빙냉(ice cooling)하면서 실시할 수 있다. 조사시간은 생리활성 폴리펩티드나 단백질이 변성하지 않는 한 특별히 한정되지 않는데, 1초 간헐, 5초~10분간, 바람직하게는 5초~2분간 조사함으로써 실시할 수 있다.

또한, 다른 바람직한 형태에서는, 건조상태의 블록 코폴리머를 모르타르(mortar) 등에 의해 균일한 분체로 하고, 그것에 분말의 생리활성 폴리펩티드나 단백질 또는 소량의 용액에 용해한 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 첨가한 후에 부드럽게 혼합하며, 적합한 완충액을 첨가하여 2시간에서 24시간 교반하고, 초음파 처리함으로써도 실시할 수 있다.

더욱이, 다른 바람직한 형태에서는, 맨처음에 빈 미셀을 조제한 후에 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 첨가하여 교반 또는 가만히 두는 것 만으로 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 내포한 고분자 미셀을 조제할 수 있다. 구체적으로는, 블록 코폴리머에 적합한 완충액을 첨가하고, 상술한 바와 같이 초음파 처리하여 빈 미셀을 조제하며, 그것에 동일한 완충액으로 용해한 생리활성 폴리펩티드나 단백질, 또는 해당 완충액으로 희석한 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 첨가하여, 교반기(stirrer)로 차분히 교반하거나 가만히 둠으로써 실시할 수도 있다. 이 때 교반하거나 또는 가만히 두는 시간은 2시간에서 24시간이 바람직하고, 온도는 4℃에서 30℃, 특히 바람직하게는 4℃이다. 이 방법에서는, 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 초음파 처리하지 않아도 되기 때문에, 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 안정성이라는 관점에서 유리하다. 어느 경우에나 적합한 완충액이란, 상술한 pI와 pH의 관계를 만족하는 것인 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 따라 폴리머 미셀에 효율적으로 내포할 수 있는 생리활성 폴리펩티드나 단백질은 특별히 한정되지 않지만, 수용성이며, 1,500 이상의 분자량, 바람직하게는 2,000 이상의 분자량을 가지는 생리활성 폴리펩티드나 단백질이 바람직하다. 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 예로서는 인터페론α, 인터페론β, 인터페론γ, 에리스로포이에틴(erythropoietin), G-CSF, 성장호르몬, 인터로이킨류, 종양괴사인자, 과립구·마크로파지 콜로니 자극인자, 마크로파지 콜로니 자극 인자, 간세포 증식인자, TGF-β 슈퍼패밀리, EGF, FGF, IGF-I 등을 들 수 있다. 또한, 그 활성이 손상되지 않는 한, 예시한 상기 단백질의 유도체 예를 들어, 1개 이상의 아미노산을 치환, 부가, 삭제한 것이 포함되는 것은 말할 필요도 없다.

생리활성 폴리펩티드나 단백질은 특히 유전자 재조합(DNA recombination)으로 생산하였을 경우, 같은 단백질이어도 당사슬의 유무나 고차구조에 의해 그 등전점이 다르다. 따라서, 고분자 미셀 조제시의 pH, 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 pI, 및 소수성 세그먼트 안의 산성 아미노산 및/또는 그 유도체의 pI'를 고려하여 고분자 미셀을 조제하는 경우, 등전점 전기영동 등에 의해 내포시킬 단백질 등의 등전점을 구하고 나서 내포시킬 때의 pH를 결정하는 것이 바람직하다.

미셀화를 위하여 사용하는 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 양은 특별히 제한되지 않는데, 일반적으로는 블록 코폴리머에 대한 수용성 고분자 약물의 중량으로서 0.01~50, 바람직하게는 0.1~10 중량부%가 사용된다.

본 발명의 약물내포 폴리머 미셀을 형성하는데 사용할 수 있는 폴리머는, 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 친수성 세그먼트와, 산성 아미노산, 그 소수성 유도체 및 산성 아미노산과 그 소수성 유도체의 혼합물로부터 선택되는 폴리아미노산으로 이루어지는 소수성 세그먼트로 이루어지는 블록 코폴리머이고, 하나의 형태로서 전하를 띠는 관능기를 가지는 소수성 세그먼트를 들 수 있다. '전하를 띠는 관능기를 가지는 소수성 세그먼트'란, 블록 코폴리머로 이루어지는 폴리머 미셀의 코어를 형성하기 위하여 필요한 소수성을 그 세그먼트 전체로서 가지고 있으며, 그 소수성은 그 세그먼트 안에 임의로 존재하는 그 소수성 부분에 기인하고, 또한 그 세그먼 트 안에 음전하를 가지는 부분도 존재하는 영역을 의미한다.

본 발명에 따른 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트는 소수성 상호작용에 의해 내포할 고분자 약물을 확실하게 보유할 수 있고, 소수성 세그먼트에 전하를 가지는 경우에는, 정전기적 상호작용에 의해서도 고분자 약물을 보유할 수 있게 된다. 또한, 본 발명자는 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트 안의 소수기의 구조에 의해, 내포된 생리활성 폴리펩티드나 단백질과 블록 코폴리머와의 소수적 상호작용을 억제하고, 방출속도를 조절할 수 있는 것도 발견하였다. 특히, 이론에 구속되려는 것은 아니지만, 이후의 실시예에서도 실증되고 있는 바와 같이, 미셀을 형성하는 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트에 도입된 소수기의 구조가 벤질이나 페닐과 같은 평면적 구조를 가지는 경우보다, 알킬기와 같은 선형 구조를 가지는 편이, 생리활성 폴리펩티드나 단백질이 확실하게 미셀 코어 안에 보유되기 때문에, 장시간에 걸쳐 서방될 것이다. 바꾸어 말하면, 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트에 도입된 소수기의 구조를 조절함으로써, 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 방출속도를 바꾸는 것이 가능해진다. 예를 들어, 약물의 방출속도를 빠르게 조절하고자 하는 경우, 벤질이나 페닐과 같은 평면적 구조를 가지는 소수기의 도입율을 높이면 되고, 약물의 방출속도를 느리게 조절하고자 하는 경우에는, 알킬기와 같은 선형구조를 가지는 소수기의 도입율을 높이면 된다. 또한, 중간적인 방출속도를 원하는 경우에는, 벤질이나 페닐과 같은 평면적 구조를 가지는 소수기와 알킬기와 같은 선형구조를 가지는 소수기의 도입율의 비율을 바꿈으로써 방출속도를 적절히 조절할 수 있다.

본 발명에서 유용한 블록 코폴리머의 구체적인 예에는 다음과 같은 것이 포 함된다.

한정되지는 않지만, 친수성 세그먼트는 폴리(에틸렌글리콜)[또는 폴리(에틸렌옥시드)]로 이루어지고, 다당류, 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(비닐알코올), 폴리(아크릴아미드), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(메타크릴산), 폴리(메타크릴산 에스테르), 폴리(아크릴산 에스테르), 폴리아미노산 혹은 이들의 유도체 유래의 세그먼트를 임의로 포함하고 있어도 된다. 여기서 다당류로서는, 풀루란, 덱스트란, 프룩탄, 갈락탄 등을 들 수 있다.

한편, 전체적으로 소수성 세그먼트로서는, 산성 아미노산 특히, 폴리(아스파라긴산) 및/또는 그 유도체, 폴리(글루타민산) 및/또는 그 유도체를 들 수 있다. 구체적으로는, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 폴리(β-벤질아스파르테이트), 폴리(β-벤질아스파르테이트-코-아스파라긴산), 폴리(β-알킬아스파르테이트), 폴리(β-알킬아스파르테이트-코-아스파라긴산), 폴리(β-알릴아스파르테이트), 폴리(β-알릴아스파르테이트-코-아스파라긴산), 폴리(β-알릴아스파르테이트), 폴리(β-아랄킬아스파르테이트-코-아스파라긴산), 폴리(β-아랄킬아스파르테이트), 폴리(γ-벤질글루타메이트), 폴리(γ-벤질글루타메이트-코-글루타민산), 폴리(γ-알킬글루타메이트), 폴리(γ-알킬글루타메이트-코-글루타민산), 폴리(γ-아랄킬글루타메이트), 폴리(γ-아랄킬글루타메이트-코-글루타민산), 폴리(β-알킬아스파르타미드-코-아스파라긴산), 폴리(γ-아랄킬글루타미드-코-글루타민산) 등의 폴리(산성 아미노산 유도체)를 들 수 있다.

소수성 세그먼트는 소수성 측쇄를 가짐으로써 소수성을 띤다. 이러한 소수성 측쇄의 예로서는 벤질기, 페닐기, 알킬기 예를 들어, 치환되지 않은 또는 아미노산 또는 카르복시기로 치환된 C₄~C₁₆ 알킬기, -(CH₂)₄-페닐기 및 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다. 상술한 바와 같이, 폴리(아미노산 유도체) 세그먼트에 도입되는 소수성 측쇄의 구조에 의해 내포되는 약물의 유리속도가 조절되기 때문에, 빠른 유리속도를 원하는 경우, 소수성 측쇄는 페닐 또는 벤질기가 바람직하고, 또한 느린 유리속도를 원하는 경우에는, 소수성 측쇄는 알킬 예를 들어, C₄~C₁₆ 알킬기가 바람직하다.

이와 같은 폴리(아미노산 유도체) 세그먼트는, 그 자체로 공지되어 있는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 벤질에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리글루타민산 벤질에스테르로 조제할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 벤질에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리글루타민산 벤질에스테르의 조제는 한쪽 말단이 보호되고, 다른 한쪽 말단이 아미노기인 폴리에틸렌글리콜 예를 들어, MeO-PEG-CH₂CH₂CH₂-NH₂를 개시제로 하여, 탈수된 유기용매 안에서 N-카르복시-β-벤질-L-아스파르테이트(BLA-NCA) 혹은 N-카르복시-γ-벤질-L-글루타메이트(BLG-NCA)를 원하는 중합도(아미노산 유닛의 수)가 되도록 첨가하여 반응시킴으로써 얻을 수 있다.

상기에서 얻어진 블록 코폴리머의 말단을 아세틸클로라이드 또는 무수초산에 의해 아세틸화한 후, 알칼리 가수분해에 의해 벤질기를 제거하여 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 또는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리글루타민산으로 하고, 그 후 유기용매 안에서 원하는 에스테르화율이 되도록 벤질알코올을 첨가하고, 축합제 예를 들어, N-N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N-N'-디이소프로필카르보디이미드(DIPCI)의 존재하에서 반응시킴으로써, 부분적으로 벤질에스테르를 가지는 블록 코폴리머를 얻을 수 있다.

또한 예를 들어, 벤질알코올 대신에 1-옥탄올을 반응시키면, 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 옥틸에스테르, 폴리에틸렌글리콜-코-폴리글루타민산 옥틸에스테르가 얻어지고, 마찬가지로 1-도데칸올을 사용하면, 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 도데실에스테르를, 1-헥사데칸올을 사용하면, 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 헥사데실에스테르를 각각 얻을 수 있다.

또한, 아미드 결합에 의해 소수성 측쇄를 도입하는 경우에는, 상술한 바와 같이, 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 벤질에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리글루타민산 벤질에스테르를 아세틸화한 후, 알칼리 가수분해에 의해 벤질기를 제거한 카르복시기에 아미노기를 가지는 소수성 측쇄를 반응시키거나, 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 벤질에스테르와 1급 아민을 가지는 화합물을 반응시켜서, 가아민분해(aminolysis)를 이용하여 에스테르 결합으로부터 아미노 결합으로 변환하여 도입할 수 있다.

또한, 먼저, 원하는 아미드화율이 되도록 유기용매 안에서 1-옥틸아민 등을 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 벤질에스테르에 첨가하여 일정 시간 반응시킨 후, 미변환 벤질에스테르에 대하여 크게 과잉된 양의 1,8-디아미노옥탄 등을 더함으로써, 소수성기의 말단이 아미노기로 치환된 소수성 측쇄와 아미노기로 치환되 지 않은 소수성 측쇄가 혼재하는 폴리(아미노산 유도체) 세그먼트로 할 수도 있다. 에스테르화 또는 아미드화의 비율은 아미노산 유닛의 수 전체에 대하여 40~100%이다. 아스파라긴산, 글루타민산은 어느 광학활성형이거나, 그것들의 혼합물일 수 있다. 이상의 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트는 그 자체로 공지되어 있는 연결기 예를 들어, 에스테르 결합, 아미드 결합, 이미노기, 탄소-탄소결합, 에테르 결합 등을 통하여 연결될 수 있다.

특히, 제조가 쉽고, 본 발명에서 적절히 사용할 수 있는 블록 코폴리머로서는, 하기의 화학식 1 및 화학식 2로 나타낼 수 있는 것을 들 수 있다.

[화학식 1]

또는

[화학식 2]

상기 각 식 중, R₁ 및 R₃은 각각 독립적으로 수소원자 또는 보호되어 있어도 되는 관능기가 치환된 또는 치환되지 않은 저급 알킬기를 나타내고, R₂는 소수원자, 포화 또는 불포화의 C₁~C₂₉ 지방족 카르보닐기 또는 아릴카르보닐기를 나타내며, R₄는 수산기, 포화 또는 불포화의 C₁~C₃₀ 지방족 옥시기 또는 아릴-저급 알킬옥시기를 나타내고, R₅는 -O- 또는 -NH-를 나타내며, R₆은 수소원자, 페닐기, -(CH₂)₄-페닐기, 치환되지 않은 또는 아미노기 또는 카르복시기로 치환된 C₄~C₁₆ 알킬기, 또는 벤질기를 나타내고, R₇은 메틸렌기를 나타내며, n은 10~2500의 정수이고, x는 10~300이 되는 정수이며, m은 0~300이 되는 정수이고(단, m이 존재하는 경우, (COCHNH)의 유닛과 (COR₇CHNH)의 유닛은 랜덤하게 존재하고, R₆은 1개의 블록 코폴리머 내의 각 아미노산 유닛에서 임의로 선택가능하고, 랜덤하게 존재하는데, R₆이 수소원자인 경우에는 R₆ 전체의 60% 이하임), y는 1 또는 2의 정수를 나타내고, L₁은 -NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, -CH₂-, -O-Z-S-Z- 및 -OCO-Z-NH-(여기서, Z는 독립적으로 C₁~C₆ 알킬렌기임)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결기를 나타내고, L₂는 -OCO-Z-CO- 및 -NHCO-Z-CO-(여기서, Z는 C₁~C₆ 알킬렌기임)로부터 선택되는 연결기를 나타낸다.

보호되어 있어도 되는 관능기로서는, 히드록실기, 아세탈, 케탈, 알데히드, 당잔기, 말레이미드기, 카르복시기, 아미노기, 티올기, 활성 에스테르 등을 들 수 있다. R₁ 및 R₃가 보호되고 있어도 되는 관능기가 치환한 저급 알킬기를 나타내는 경우의 친수성 세그먼트는, 예를 들어 WO 96/33233, WO 96/32434, WO 97/06202에 기재된 방법을 따를 수 있다. 저급 알킬이란, 탄소수가 예를 들어 7개 이하, 바람직하게는 4개 이하인 직쇄 또는 분기쇄 알킬기를 의미하고, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸기 등이 포함된다.

미셀은 예를 들어, 블록 코폴리머와 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 상술한 바와 같이 적합한 완충액으로 용해하여 교반함으로써 형성할 수 있다. 바람직하게는, 빈 미셀은 초음파와 같은 에너지를 가하여 형성한다. 초음파를 사용하는 경우, 예를 들어 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품)를 사용하여 레벨 4에서 빙냉하면서 할 수 있다. 조사시간은 생리활성 폴리펩티드나 단백질이 변성하지 않는 한 특별히 한정되지 않는데, 1초 간헐, 5초~10분간, 바람직하게는 5초~2분간 조사함으로써 실시할 수 있다. 또한, 다른 방법으로서는, 건조상태의 블록 코폴리머를 모르타르 등에 의해 균일한 분체로 하고, 그것에 분말의 생리활성 폴리펩티드나 단백질, 또는 소량의 용액에 용해한 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 첨가한 후에 부드럽게 혼합하여, 적합한 완충액을 첨가하여 2시간에서 24시간, 4℃에서 교반하고, 빙냉하면서 초음파 처리함으로써도 실시할 수 있다.

더욱 다른 방법으로는, 블록 코폴리머에 적합한 완충액을 첨가하고, 상술한 바와 같이 초음파 처리하여 빈 미셀을 조제하고, 그것에 동일한 완충액에 용해한 생리활성 폴리펩티드나 단백질, 또는 해당 완충액으로 희석한 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 첨가하고, 교반기로 차분히 교반하거나 가만히 둠으로써 실시할 수 있다. 이 때 교반하거나 또는 가만히 두는 시간은 2시간에서 5일이 바람직하고, 온도 는 4℃에서 30℃, 특히 바람직하게는 4℃이다. 이 방법에서는, 생리활성 폴리펩티드나 단백질을 초음파 처리하지 않아도 되기 때문에, 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 안정성이라는 관점에서 유리하다. 어느 경우에나 적합한 완충액이란, 상술한 pI와 pH의 관계를 만족하는 것인 것이 바람직하다.

이렇게 하여 제조한 생리활성 폴리펩티드나 단백질 내포 고분자 미셀에 대하여, 그 입자직경은 생체에 투여할 수 있는 크기이면 특별히 한정되지 않는데, 10㎛ 이하가 바람직하고, 5㎛ 이하인 것이 보다 바람직하다. 특히, 정맥내 투여에 사용하는 경우에는, 500nm 이하인 것이 바람직하고, 300nm 이하인 것이 보다 바람직하다. 필요하다면, 생리활성 폴리펩티드나 단백질 내포 고분자 미셀을 함유하는 수성 용액을 원하는 구멍직경의 친수성 필터로 여과한다.

본 발명에 따른 생리활성 폴리펩티드나 단백질 내포 고분자 미셀을 생체내에 투여하는 경우에 그 투여 루트는 상관없는데, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 관절내 투여, 복강내 투여, 안내 투여 등을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 형태의 하나로서, 각종 당류 및/또는 각종 폴리에틸렌글리콜(마크로골;macrogol)을 균제거 여과전의 약물 내포 폴리머 미셀 수용액(또는 수성 용액)에 더하는 공정을 더욱 포함하여 이루어지는 방법에 의해 제조할 수 있다. 한정되지는 않지만, 사용할 수 있는 당류로서는 말토스, 트레할로스, 자일리톨, 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 락토스, 만니톨 및 덱스트린 등을 들 수 있고, 사용할 수 있는 폴리에틸렌글리콜로서는 분자량이 약 1000~약 35000으로서, 예를 들어 마크로골 1000, 1540, 4000, 6000, 20000 및 35000 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 생리활성 폴리펩티드나 단백질 내포 고분자 미셀 제제는, 내포시킨 생리활성 폴리펩티드나 단백질의 안정성에 영향을 미치지 않는 한 동결건조할 수도 있다. 동결건조하였을 경우에는, 건조제제를 물 또는 수성용액을 이용하여 생리활성 폴리펩티드나 단백질 내포 고분자 미셀함유 용액에 재용해 또는 재구성한다.

동결건조하는 경우, 동결건조전의 용액에 당류를 그 최종농도가 0.1~15%(w/v)가 되도록 더하여도 되고, 또는 폴리에틸렌글리콜을 그 최종농도가 0.5~10%(w/v)가 되도록 더하여도 된다. 통상, 블록 코폴리머와 당류 또는 폴리에틸렌글리콜의 비율은 각각 중량으로 1:1~1:10 또는 1:0.5~1:10이다.

바람직한 형태에서 친수성 세그먼트의 말단에 타겟능력을 가지는 분자를 결합할 수 있는 관능기를 가지고 있어도 된다. 타겟능력을 가지는 분자를 결합할 수 있는 관능기로서는 특별히 한정되지 않지만, 히드록실기, 아세탈기, 케탈기, 알데히드기, 카르복시기, 말레이미드기, 아미노기, 티올기 및 활성 에스테르기 등을 들 수 있고, 관능기는 보호되어 있어도 된다. 타켓능력을 가지는 분자로서는, 특별히 한정되지는 않지만, 리간드, 항체 또는 그 기능 단편(斷片), 단백질, 펩티드 등을 들 수 있다. 관능기에 타겟능력을 가지는 분자를 결합시키는 경우에는, 이 분자의 구조에 따라 적절히 선택되며, 공지의 방법으로 결합시킬 수 있다.

이하, 비교예, 실시예를 나타내어, 본 발명을 구체적으로 나타낸다.

이하에서는 예를 들어, 블록 코폴리머의 PEG 사슬의 평균분자량 12,000, 폴리아미노산 사슬의 평균이 40잔기, 폴리아미노산 측쇄로의 벤질에스테르의 도입율 이 약 65%인 경우, 블록 코폴리머 뒤에 12-40(65)라고 표기하고, 마찬가지로 옥틸에스테르 등의 도입율이 약 65%인 경우에도 12-40(65)라고 표기한다. 한편, 약 65%란, 62~68% 정도를 의미한다.

(실시예)

1) 내포율 측정

실시예 1 (사람 IgG 내포 미셀의 조제 1)

블록 코폴리머에는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 벤질에스테르(이하, PEG-PBLA라고 함. 본 폴리머에서 벤질에스테르가 도입되지 않은 아스파라긴산 잔기는, 화학식 1 중 R₅가 -O-, R₆이 수소원자임. 이하, 마찬가지. 또한, 아래의 모든 블록 코폴리머는 화학식 1의 R₁이 CH₃, L₁이

, R₂가 COCH₃임)를 사용하였다. 유리병 안에 10mg의 PEG-PBLA 12-50(65)를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 1mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, 정제 사람 IgG(MP BIOMEDICALS사 제품)(pI 약 8) 20mM 인산 완충용액(pH 6, 16.5mg/mL)을 62μL 첨가하고, 4℃에서 가볍게 교반하면서 20mM 인산 완충액(pH 6) 또는 20mM TAPS 완충액(pH 8) 1.93mL를 서서히 더하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여 빙냉하에서 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL-4B: ~2Φ×30cm)하였다. 회수한 각 파편(용리액: 20mM 인산 완충액(pH 7.4), 유속 1.0mL/min, 파편 부피: 1mL) 안의 IgG 농도를 BCA Protein Assay(PIERCE사 제품)에 의해 결정하였다. 내포율은 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 pH 6으로 조제하였을 때 94%이었다. 한편, pH 8로 조제하였을 때 41%이었다. 이 결과는, 내포 단백질의 등전점으로부터 떨어진 pH 조건하에서 미셀을 조제하는 편이, 등전점 가까이에서 조제하는 것보다 단백질과 PEG-PBLA 12-50(65)의 정전기적 상호작용에 근거하여 효율적으로 단백질이 내포되는 것을 나타내고 있다.

실시예 2 (사람 IgG 내포 미셀의 조제 2)

블록 코폴리머에는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리글루타민산 벤질에스테르(이하, PEG-PBLG라고 함. 본 폴리머에서 벤질에스테르가 도입되지 않은 글루타민산 잔기는 화학식 1 중 R₅가 -O-, R₆이 수소원자임. 이하, 마찬가지)를 사용하였다. 유리병 안에 10mg의 PEG-PBLG 12-40(65)를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 1mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, 정제 사람 IgG(MP BIOMEDICALS사 제품)(pI 약 8) 인산 완충용액(pH 6, 16.5mg/mL)을 62μL 첨가하고, 4℃에서 가볍게 교반하면서 20mM 인산 완충액(pH 6) 또는 20mM TAPS 완충액(pH 8)을 1.938mL 더하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL-4B: ~2Φ×30cm)하였다. 회수한 각 파편(용리액: 20mM 인산 완충액(pH 7.4), 유속 1.0mL/min, 파편 부피: 1mL) 안의 IgG 농도를 BCA Protein Assay(PIERCE사 제품)에 의해 결정하였다. 내포율은 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 pH 6으로 조제하였을 때 83%이었다. 한편, pH 8로 조제하였을 때 63%이었다. 이 결과는, 내포 단백질의 등전점으로부터 떨어진 pH 조건하에서 미셀을 조제하는 편이, 등전점 가까이에서 조제하는 것보다 단백질과 PEG-PBLG 12-40(65)의 정전기적 상호작용에 근거하여 효율적으로 단백질이 내포되는 것을 나타내고 있다.

실시예 3 (사람 IgG 내포 미셀의 조제 3)

블록 코폴리머에는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 옥틸에스테르(이하, PEG-POLA라고 함. 본 폴리머에서 옥틸에스테르가 도입되지 않은 아스파라긴산 잔기 화학식 1 중, R₅가 -O-, R₆이 수소원자임. 이하, 마찬가지)를 사용하였다. 유리병 안에 10mg의 PEG-POLA 12-40(65)를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 1mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, 정제 사람 IgG(MP BIOMEDICALS사 제품)(pI 약 8) 20mM 인산 완충용액(pH 6, 16.5mg/mL)을 62μL 첨가하고, 4℃에서 가 볍게 교반하면서 20mM 인산 완충액(pH 6) 또는 20mM TAPS 완충액(pH 8) 1.938mL를 서서히 더하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여 빙냉하에서 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL-4B: ~2Φ×30cm)하였다. 회수한 각 파편(용리액: 20mM 인산 완충액(pH 7.4), 유속 1.0mL/min, 파편 부피: 1mL) 안의 IgG 농도를 아미노산 분석(Waters사 제품, AccQ Tag(일본상표)법)에 의해 결정하였다. 내포율은 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 pH 6으로 조제하였을 때 97%이었다. 한편, pH 8로 조제하였을 때 24%이었다. 이 결과는, 내포 단백질의 등전점으로부터 떨어진 pH 조건하에서 미셀을 조제하는 편이, 등전점 가까이에서 조제하는 것보다 단백질과 PEG-POLA 12-40(65)의 정전기적 상호작용에 근거하여 효율적으로 단백질이 내포되는 것을 나타내고 있다.

비교예 1 (사람 IgG 내포 미셀의 조제 4)

유리병 안에 10mg의 PEG-PBLA 12-50(100)을 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 1mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, 정제 사람 IgG(MP BIOMEDICALS사 제품)(pI 약 8) 20mM 인산 완충용액(pH 6, 16.5mg/mL)을 62μL 첨가 하고, 4℃에서 가볍게 교반하면서 20mM 인산 완충액(pH 6) 또는 20mM TAPS 완충액(pH 8) 1.938mL를 서서히 더하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여 빙냉하에서 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL-4B: ~2Φ×30cm)하였다. 회수한 각 파편(용리액: 20mM 인산 완충액(pH 7.4), 유속 1.0mL/min, 파편 부피: 1mL) 안의 IgG 농도를 BCA Protein Assay(PIERCE사 제품)에 의해 결정하였다. 내포율은 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 pH 6으로 조제하였을 때 22%이었다. 한편, pH 8로 조제하였을 때 65%이었다. 이 결과는, 카르복시기를 가지지 않은 PEG-PBLA 12-50(100)을 이용할 때, 내포 단백질의 등전점으로부터 떨어진 pH 조건하에서 미셀을 조제하여도, 정전기적 상호작용이 관여하지 않고, 효율적으로 단백질을 내포시키는 것은 어렵다는 것을 나타내고 있다. 등전점 부근에서 조제하는 편이 소수적 상호작용에 근거하여 단백질이 내포되는 것을 나타내고 있다.

비교예 2 (사람 FITC 표지 IgG 내포 미셀의 조제)

블록 코폴리머로는 폴리에틸렌글리콜-폴리아스파라긴산(평균잔기수가 약 50 잔기, 비에스테르화) 블록 공중합체, PEG-PBLA 12-50(65), 또는 PEG-POLA 12-40(65)의 3종류를 사용하였다. 유리병 안에 20mg의 폴리머를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 2mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, FITC 표지 사람 면역 글로블린(FITC-IgG) 인산 완충용액(시그마-알드리치사 제품, 20mg/mL)을 100μL 첨가하고, 4℃에서 가볍게 교반하면서 20mM 인산 완충액(pH 6)을 서서히 1.9mL 더하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여 빙냉하에서 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 초원심(超遠心)(30,000rpm, 1시간, 4℃, 베크만사 제품, MLA-130 로터(rotor))하였다. 침전으로서 회수한 미셀 단편을 20mM 인산 완충액(pH 6)으로 현탁(懸濁)하고, 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL-4B: ~2Φ×30cm)하였다. 회수한 각 파편(용리액: 20mM 인산 완충액(pH 7.4), 유속 1.0mL/min, 파편 부피: 1mL) 안의 FITC-IgG 농도를 플레이트 리더(다이니혼 스미토모 세이야쿠 제품, 파워스캔(일본등록상표) HT)를 이용하여(여기파장: 485nm±20nm, 발광파장: 528nm±20nm) 측정하고, 내포율을 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 폴리에틸렌글리콜-폴리아스파라긴산(평균잔기수가 약 50잔기, 비에스테르화) 블록 공중합체를 이용하였을 경우 6%이었다. 한편, PEG-PBLA 12-50(65) 또는 PEG-POLA 12-40(65)를 이용하였을 경우에는 내포율이 각각 51%, 60%이었다. 이 결과는, 소수성을 가지는 치환기와 하전성을 가지는 기가 공존하고, 전체적으로 소수성 세그먼트로 이루어지는 폴리머를 이용하는 편이 효율적으로 단백질을 내포 할 수 있으며, 내포에는 정전기적 상호작용 이외에 소수성 상호작용 등도 관여하고 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 실시예 1~3의 결과를 합한 상기 결과는, 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트 안의 수소기의 구조가 내포율에는 크게 관여하지 않는 것을 나타내고 있다.

실시예 4 (IFTC 표지 소 혈청 알부민 내포 미셀의 조제)

유리병 안에 40mg의 PEG-PBLA 12-50(65)를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 2mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, FITC 표지 소 혈청 알부민(시그마 알드리치사 제품)(pI 약 5) 수용액(20mg/mL)을 200μL 첨가하고, 4℃에서 가볍게 교반하면서 50mM 구연산 완충액(pH 3.5) 또는 20mM 인산 완충액(pH 6) 3.8mL를 서서히 더하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여 빙냉하에서 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 초원심(30,000rpm, 1시간, 4℃, 베크만사 제품, MLA-130 로터)을 하였다. 상청 안의 FITC 표지 소 혈청 알부민 농도를 플레이트 리더(다이니혼 스미토모 세이야쿠 제품, 파워스캔(일본등록상표) HT)를 이용하여(여기파장: 485nm±20nm, 발광파장: 528nm±20nm) 측정하고, 내포율을 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 pH 3.5로 조제하였을 때 16%이었다. 한편, pH 6으로 조제하였을 때 7%이었다. 이 결과는, 내포 단백질의 등전점으로부터 떨어진 pH 조건하에서 미셀을 조제하는 편이, 등전점 가까이에서 조제하는 것보다 단백질과 PEG-PBLA 12-50(65)의 정전기적 상호작용에 근거하여 효율적으로 단백질이 내포되는 것을 나타내고 있다.

실시예 5 (소 헤모글로빈 내포 미셀의 조제)

유리병 안에 20mg의 PEG-PBLA 12-50(65)를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 2mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, 소 헤모글로빈(시그마 알드리치사 제품)(pI 약 7) 수용액(20mg/mL)을 100μL 첨가하고, 4℃에서 가볍게 교반하면서 20mM 인산 완충액(pH 6.0) 또는 20mM 인산 완충액(pH 7.4) 1.9mL를 서서히 더하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여, 빙냉하에서 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL-4B: ~2Φ×30cm)하였다. 회수한 각 파편(용리액: 20mM 인산 완충액(pH 7.4), 유속 1.0mL/min, 파편 부피: 1mL) 안의 헤모글로빈 농도를 플레이트 리더(다이니혼 스미토모 세이야쿠 제품, 파워스캔(일본등록상표) HT)를 이용하여 측정하였다. 내포율은 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 pH 6.0으로 조제하였을 때 19%이었다. 한편, pH 7.4로 조제하였을 때 10%이었다. 이 결과는, 내포 단백질의 등전점보다 산성 조건하에서 미셀을 조제하는 편이, 등전점보다 알칼리 조건하에서 조제하는 것보다 단백질과 PEG-PBLA 12-50(65)의 정전기적 상호작용에 근거하여 효율적으로 단백질이 내포되는 것을 나타내고 있다.

실시예 6 (재조합형 사람 인터페론-α 내포 미셀의 조제)

유리병 안에 7.0mg의 PEG-PBLA 12-50(65)를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 0.7mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 그것에 재조합형 사람 인터페론-α(pI 약 6.0)의 PBS 용액(IFN-α, PBL Biomedical Laboratories)(0.2mg/mL, 35μL)을 첨가하고, 계속해서 0.1M MES 완충액(pH 5.0)을 2000mL 첨가하였다. 4℃에서 서서히 혼화하여 폴리머를 거의 용해시키고, 이어서 20mM의 MES 완충액(pH 5.0)을 첨가하여 전량을 1.4mL로 하여, 4℃에서 하룻밤 교반하였다. 교반종료후, 초원심(30,000rpm, 1시간, 4℃, 베크만사 제품, MLA-130 로터)하여, 상청 안의 IFN-α 농도를 ELISA 키트(PBL Biomedical Laboratories)로 측정하였다.

한편, 유리병 안에 2.6mg의 PEG-PBLA 12-50(65)를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 0.26mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 그것에 상술한 것과 마찬가지의 재조합형 사람 인터페론-α의 PBS 용액(0.2mg/mL, 12.5μL)을 첨가하고, 계속해서 0.1M TAPS 완충액(pH 8.0)을 100mL 첨가하였다. 4℃에서 서서히 혼화하여 폴리머를 거의 용해시키고, 이어서 20mM의 TAPS 완충액(pH 8.0)을 400μL 첨가하여 4℃에서 하룻밤 교반하였다. 교반 종료후, 초원심(30,000rpm, 1시간, 4℃, 베크만사 제품, MLA-130 로터)하여, 상청 안의 IFN-α 농도를 ELISA 키트(PBL Biomedical Laboratories)로 측정하였다. 각각의 실험 측정값으로부터 아래의 식에 의해 내포율을 구하였다.

내포율은 pH 5.0으로 조제하였을 때 100%이었다. 한편, pH 8.0으로 조제하였을 때 36%이었다. 이 결과는, 내포 단백질의 등전점보다 산성 조건하에서 미셀을 조제하는 편이, 등전점보다 알칼리 조건하에서 조제하는 것보다 단백질과 PEG-PBLA 12-50(65)의 정전기적 상호작용에 근거하여 효율적으로 단백질이 내포되는 것을 나타내고 있다.

실시예 7 (파파인 내포 미셀의 조제)

유리병 안에 20mg의 PEG-PBLA 12-40(65)를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 2mL를 더하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, 파파인(시그마 알드리치사 제품)(pI 약 8.8) 수용액(20mg/mL)을 100μL 첨가하고, 4℃에서 가볍게 교반하면서 20mM 인산 완충액(pH 6.0) 또는 20mM TAPS 완충액(pH 8.0) 1.9mL를 서서히 더하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여, 빙냉하에서 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL- 4B: ~2Φ×30cm)하였다. 회수한 각 파편(용리액: 20mM 인산 완충액(pH 7.4), 유속 1.0mL/min, 파편 부피: 1mL) 안의 파파인 농도를 BCA Protein Assay(PIERCE사 제품)로 측정하였다. 내포율은 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 pH 6.0으로 조제하였을 때 27%이었다. 한편, pH 8.0으로 조제하였을 때 9%이었다. 이 결과는, 내포 단백질의 등전점으로부터 떨어진 pH 조건하에서 미셀을 조제하는 편이, 등전점 가까이에서 조제하는 것보다 단백질과 PEG-PBLA 12-40(65)의 정전기적 상호작용에 근거하여 효율적으로 단백질을 내포할 수 있는 것을 나타내고 있다.

또한, 지금까지의 실시예의 결과는, 본 발명에 근거하여 광범위한 단백질을 효율적으로 고분자 미셀에 내포할 수 있는 것을 나타내고 있다.

2) 미셀로부터의 단백질 유리율 평가

실시예 8 (사람 FITC 표지 IgG 내포 미셀로부터의 유리평가)

블록 코폴리머로는 PEG-PBLA 12-50(65) 또는 PEG-POLA 12-40(50)을 사용하였다. 병에 폴리머를 각각 20mg씩 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 2mL를 첨가하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 1시간 정도 말려 굳혔다. FITC 표지 사람 면역 글로블린(FITC-IgG) (시그마-알드리치사 제품, 20mg/mL)을 100μL 첨가하고, 가볍게 교반하면서 또한 20mM 인산 완충액(pH 6) 3.9mL을 서서히 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤 교반한 후, 바이오 디스 럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 이용하여, 빙냉하에서 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사한 후, 초원심 분리(30,000rpm, 4℃, 1시간)로 미셀을 얻었다. 회수한 미셀을 20mM 인산 완충액(pH 6)으로 현탁하고, 소 혈청 안에 첨가하여[최종 소 혈청 농도: 50%(v/v)], 37℃에서 배양(incubation)하였다. 내포한 FITC-IgG의 유리를 평가하기 위하여, 미리 정해둔 배양시간후에 샘플 1mL를 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL-4B: ~2Φ×30cm)하였다. 회수한 각 파편(용리액: 20mM 인산 완충액(pH 7.4), 유속 1.0mL/min, 파편 부피: 1mL) 안의 FITC-IgG 농도를 플레이트 리더(다이니혼 스미토모 세이야쿠 제품, 파워스캔(일본등록상표) HT)를 이용하여(여기파장: 485nm±20nm, 발광파장: 528nm±20nm) 측정하고, 유리율을 아래의 식으로 구하였다.

(단, 상기 완충액은 20mM 인산 완충액(pH 6)임)

유리율의 경시변화를 도 1에 나타내었다. 이 결과는, 미셀에 내포된 단백질이 혈청 존재하에서도 초기에 버스트(burst)하지 않고, 장시간 서방되는 것을 나타내고 있다. 또한, 유리속도는 소수기의 구조에 의존하는 것을 나타내고 있다. 특히, 이론에 구속되려는 것은 아니지만, 미셀을 형성하는 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트에 도입된 소수기의 구조가, 벤질과 같은 평면적 구조를 가지는 경우보다 알킬기와 같은 선형 구조를 가지는 편이 약물을 확실하게 보유하고, 그 방출이 제어된 상태로 달성되는 것으로 생각된다.

실시예 9 (인터페론-α 정맥내 투여 시험)

블록 코폴리머로는 PEG-PBLA 12-50(65) 또는 PEG-POLA 12-40(50)을 사용하였다. 병에 10mg의 폴리머를 정밀계량하여 넣고, 디클로로메탄 1mL를 첨가하여 용해하였다. 그 용액을 질소기류하에서 필름형상으로 말려 굳히고, 더욱이 감압하에서 3시간 정도 말려 굳혔다. 여기에, 재결합형 사람 인터페론-α PBS 용액(IFN-α, PBL Biomedical Laboratories)(0.2mg/mL, 46μL)을 더하고, 계속해서 0.2M MES 완충액(pH 5.0) 200μL를 첨가하였다. 4℃에서 천천히 교반하여 폴리머를 거의 용해시키고, 이어서 20mM MES 완충액(pH 5.0)을 첨가하여 전량을 2mL로 하여, 4℃에서 만 하루 교반하였다. 샘플을 초원심(30,000rpm, 1시간, 4℃, 베크만사 제품, MLA-130 로터)하고, 내포되지 않은 IFN-α를 제거하여 미셀을 침전으로서 회수하였다. 이 미셀을 5% 글루코오스 수용액으로 현탁하고, 아래의 동물시험에 사용하였다.

6주된 위스터(Wistar)계 수컷 쥐를 1군 2마리로 구분하고, 상기 실험액을 1×10⁶ IU/kg의 투여량이 되도록 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여하고 나서 5분, 1시간, 3시간, 6시간, 9시간 및 24시간 후에 목 정맥으로부터 헤파린을 코팅한 주사기(syringe)를 이용하여 약 0.2mL를 채혈하였다. 바로, 13800rpm, 4℃에서 원심분리하여(EF-1300, ECO-Fuge(일본상표), 토미세이코 제품) 혈장을 회수하고, 분석까지 -30℃에서 보존하였다. 사람 인터페론-α ELISA 키트(PBL Biomedical Laboratories)를 사용하여 혈장중 농도를 측정하였다.

측정결과를 도 2에 나타내었다. 미셀화에 의해 혈장중 농도의 체류성이 향상 되었다. 또한, 논 컴파트먼트 모델(non compartment model)에 따라 계산한 약물 동태 파라미터를 아래 표 1에 나타낸다.

표 1

약물동태 파라미터	0.9% NaCl 용액	PEG-POLA 12-40(65) 미셀	PEG-PBLA 12-50(65) 미셀
AUC_inf(% dose/mL·h)	0.20	7.0	3.5
T_1/2(h)	0.11	10.4	1.3
Cl(mL/h/body)	491	14.4	28.9
MRT_inf(h)	0.2	3.2	0.4
Vss(mL/body)	81	46	12

미셀화에 의해 AUC는 17배에서 35배 증가하였다. 이 결과는, 단백질 내포 미셀이 혈중에서도 초기에 버스트하지 않고 장기간에 걸쳐 혈중에 체류하는 것을 나타내고 있다. 또한, 생체 내에서의 단백질 유리속도는, 생체 밖(in vitro)에서의 결과와 마찬가지로 소수기의 구조에 의존하는 것을 나타내고 있다.

실시예 10 (FITC 표지 리조티움 내포 미셀의 쥐 정맥내 투여시험)

1) 리조티움의 FITC 표지화

리조티움(알의 흰자위 유래)(시그마 알드리치사 제품) 100mg을 100mM 붕소 완충액(pH 8.5) 2mL에 용해한 후, FITC(PIERCE사 제품)의 50mg/mL DMSO 용액 170μL를 첨가하였다. 실온에서 1시간 교반한 후, 겔여과(GE 헬스케어 바이오 사이언스 제품, PD-10)(용리액: 20mM 인산 나트륨 완충액 pH 7.4)로 미반응 FITC를 제거하였다. 또한 물에 대하여 4℃에서 투석한 후, 다시 한번 겔여과(시그마-알드리치사, Sepharose(일본등록상표) CL-4B)(용리액: 20mM 인산 나트륨 완충액 pH 7.4)로 정제하였다.

2) FITC 표지 리조티움 내포 미셀의 조제와 쥐 PK 시험

40mg의 블록 코폴리머, PEG-POLA 12-40(65)를 유리병 안에 정밀계량하여 넣고, FITC 표지 리조티움 4mg(29.2mg/mL, 137㎕), 계속해서 20mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.0) 500μL를 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤 교반한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 사용하고, 빙냉하 약 10초 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 조사하였다. 초원심(80,000rpm, 1시간, 4℃, 베크만사 제품, MLA-80 로터)에 의해, 침전으로서 회수한 미셀 단편을 20mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4)/5% 글루코오스에 현탁한 후, 같은 초원심 조작으로 세정하고, 다시 동일한 완충액에 현탁한 후에 아래의 쥐 투여시험에 사용하였다.

6주된 위스터계 수컷 쥐를 1군 3마리로 구분하고, 상기 실험액을 10mg/kg의 FITC 표지 리조티움 투여량이 되도록 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여하고 나서 5분, 1시간, 3시간, 6시간, 9시간 및 24시간 후에 목 정맥으로부터 헤파린을 코팅한 주사기를 이용하여 약 0.2mL를 채혈하였다. 바로, 4℃에서 원심분리하여(EF-1300, ECO-Fuge(일본상표), 토미세이코 제품) 혈장을 회수하고, 분석까지 -30℃에서 보존하였다. FITC 표지 리조티움 용액(20mM 인산 나트륨 완충액 pH 7.4/5% 글루코오스)도 마찬가지로 실험하였다. 아래의 HPLC 조건으로 혈장중 농도를 측정하였다.

시스템: Waters Alliance System

컬럼: Tosoh TSK-gel Super SW3000(4.6Φ×300mm) (30℃)

이동상: 20mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4)

유속: 0.25mL/min

검출: 형광(Ex: 492nm, Em: 520nm)

투여 부피: 10μL

측정결과를 도 3에 나타내었다. 용액투여의 경우와 비교하여 미셀화에 의해 AUC는 약 15배 증가하였다. 이 결과는, 미셀에 내포된 단백질이 혈중에서도 초기에 버스트하지 않고 장기간에 걸쳐 혈중에 체류하는 것을 나타내고 있다.

실시예 11 (인터페론-α 내포 미셀의 정맥 투여시험 2)

블록 코폴리머로는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 도데실에스테르(이하, PEG-PDLA라고 함, 본 폴리머는 도데실에스테르가 도입되지 않은 아스파라긴산 잔기는, 화학식 1 중 R₅가 -O-, R₆이 수소원자임. 이하, 동일), 또는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 헥사데실에스테르(이하, PEG-PHLA라고 함. 한편, 헥사데실에스테르가 도입되지 않은 아스파라긴산 잔기는, 화학식 중 R₅가 -O-, R₆이 수소원자임. 이하, 동일)를 사용하였다. 유리병 안에 200mg의 PEG-PDLA 12-40(65) 또는 PEG-PHLA 12-40(65)를 정밀계량하여 넣고, 20mM MES 완충액(pH 5.0) 10mL를 더하여 4℃에서 강하게 하룻밤 동안 교반하였다. 폴리머 분산액을 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 사용하여 빙냉하에서 약 15분 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 처리하고, 20mg/mL의 폴리머 농도가 되도록 빈 미셀 용액을 얻었다. 마이크로 튜브(이에다 카가쿠 제품)에 빈 미셀 용액 0.65mL를 옮기고, 여기에 재결합형 사람 인터페론-α PBS 용액(IFN-α, PBL Biomedical Laboratories) 65μL와 0.1M MES 완충액(pH 5.0) 50μL를 더하여 가볍게 피펫팅(pipetting)한 후, 4℃에서 4일 동안 놓아두었다. 한외여과 유닛[밀리포어 제품, 아미콘(일본등록상표) 울트라-4(분획 분자량: 100,000)]으로 5% 글루코오스 용액으로 세정·농축하고, 아래의 동물시험에 사용하였다.

6주된 위스터계 쥐를 1군 3마리로 구분하고, 상기 실험액을 1×10⁶ IU/kg의 투여량이 되도록 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여하고 나서 5분, 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간 후에 목 정맥으로부터 헤파린을 코팅한 주사기를 이용하여 약 0.2mL를 채혈하였다. 바로, 13,800rpm, 4℃에서 원심분리하여(EF-1300, ECO-Fuge(일본상표), 토미세이코 제품) 혈장을 회수하고, 분석까지 -30℃에서 보존하였다. 사람 인터페론-α ELISA 키트(PBL Biomedical Laboratories)를 사용하여, 혈장중 농도를 측정하였다.

인터페론-α 내포 고분자 미셀을 생체투여한 후의 인터페론-α 혈장중 농도의 경시변화를 도 4에 나타내었다. 미셀화에 의해 AUC가 PEG-PDLA 12-40(65)를 사용한 경우에는 32배, PEG-PHLA 12-40(65)를 사용한 경우에는 27배 증가하였다.

실시예 12 (인터페론-α 내포 미셀의 정맥 투여시험 3)

블록 코폴리머로는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리글루타민산 옥틸에스테르(이하, PEG-POLG라고 함, 본 폴리머는 옥틸에스테르가 도입되지 않은 글루타민산 잔기는, 화학식 1 중 R₅가 -O-, R₆이 수소원자임. 이하, 동일)를 사용하였다. 유리병 안에 150mg의 PEG-POLG 12-40(65)를 정밀계량하여 넣고, 20mM MES 완충액(pH 5.0) 5mL를 더하여 4℃에서 강하게 하룻밤 동안 교반하였다. 폴리머 분산액을 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 사용하여 빙냉하에서 약 15분 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 처리하고, 30mg/mL의 폴리머 농도가 되도록 빈 미셀 용액을 얻었다. 크라이오 바이얼(이에다 카가쿠 제품)에 빈 미셀 용액 0.6mL를 옮기고, 여기에 재결합형 사람 인터페론-α 용액(IFN-α, PBL Biomedical Laboratories) 90μL와 0.1M MES 완충액(pH 5.0) 110μL를 더하여 가볍게 피펫팅한 후, 4℃에서 3일 동안 놓아두었다. 마이크로 튜브에 400μL를 나누어 주입하고, 20mM MES 완충액(pH 5.0)을 더하여 500μL로 한 후, 한외여과 유닛[밀리포어 제품, 아미콘(일본등록상표) 울트라-4(분획 분자량: 100,000)]으로 5% 글루코오스 용액으로 세정·농축하고, 아래의 동물시험에 사용하였다.

6주된 위스터계 쥐를 1군 2마리로 구분하고, 상기 실험액을 1×10⁶ IU/kg의 투여량이 되도록 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여하고 나서 5분, 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간 후에 목 정맥으로부터 헤파린을 코팅한 주사기를 이용하여 약 0.2mL를 채혈하였다. 바로, 13,800rpm, 4℃에서 원심분리하여(EF-1300, ECO-Fuge(일본상표), 토미세이코 제품) 혈장을 회수하고, 분석까지 -30℃에서 보존하였다. 사람 인터페론-α ELISA 키트(PBL Biomedical Laboratories)를 사용하여 혈장중 농도를 측정하였다.

인터페론-α 내포 고분자 미셀을 생체 투여한 후의 인터페론-α 혈장중 농도의 경시변화를 도 5에 나타내었다. 미셀화에 의해 AUC는 57배 증가하였다.

실시예 13 (멜리틴(melittin) 내포 미셀의 조제)

블록 코폴리머로는 PEG-POLA 12-40(65) 또는 PEG-POLG 12-40(65)를 사용하였 다. 유리병 안에 폴리머를 150mg 정밀계량하여 넣고, 20mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4) 5mL를 더하여 4℃에서 강하게 교반하였다. 폴리머 분산액을 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 사용하여 빙냉하에서 약 15분 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 처리하고, 30mg/mL의 폴리머 농도가 되도록 빈 미셀 용액을 얻었다. 20mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4)을 더하여 10mg/mL(1mL)로 조정하고, 염기성 폴리펩티드인 멜리틴(시그마 알드리치사 제품)(1mg)을 더하여, 4℃하에서 하룻밤 동안 놓아둔 후, 겔여과(GE 헬스케어 바이오 사이언스 제품, Sepharose(일본등록상표) CL-4B : 1Φ×30cm)하였다. 회수한 파편(용리액: 20mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4), 유속: 1.0mL/min, 파편부피: 1mL) 안의 멜리틴 농도를 BCA Protein Assay(PIERCE사 제품)로 측정하였다. 내포율은 아래의 식으로 구하였다.

내포율은 PEG-POLA 12-40(65)에서 71%, PEG-POLG 12-40(65)에서 48%이었다. 이 결과는, 분자량이 약 2,800인 폴리펩티드를 효율적으로 내포할 수 있는 것을 나타내고 있다.

실시예 14 (사람 과립구 콜로니 자극인자 내포 미셀의 쥐 정맥내 투여시험 1)

블록 코폴리머로는 폴리에틸렌글리콜-코-폴리아스파라긴산 옥틸아미드(이하, PEG-PONLA라고 함. 이 폴리머는 화학식 1 중 R₅가 -NH-, R₆이 옥틸기인 아미노산 잔 기를 50% 가지고, R₅가 -NH-, R₆이 아미노기로 치환된 옥틸기인 아미노산 잔기를 50% 가짐. 이하, 동일)를 사용하였다. 유리병 안에 30mg의 PEG-PONLA 12-40(50)을 정밀계량하여 넣고, 5% 글루코오스 함유 20mM 인산 완충액(pH 7.4)을 2mL 더한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 사용하여 빙냉하에서 약 10분 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 처리하여, 빈 미셀을 조제하였다. 여기에, 재결합형 사람 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF, Green Cross사 제품)(pI 약 6.0)(300㎍/mL, 1mL)를 더하여 4℃에서 만 하루 놓아두었다. 그 후, 한외여과 유닛[밀리포어 제품, 아미콘(일본등록상표) 울트라-4(분획 분자량: 100,000)]에 의해 내포되지 않았던 G-CSF를 제거하고, 아래의 동물실험용 미셀로 하였다.

6주된 위스터계 수컷 쥐를 1군 3마리(용액은 1군 6마리)로 구분하고, 상기 실험액을 100㎍/kg의 투여량이 되도록 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여하고 나서 5분, 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간 후에 목 정맥으로부터 헤파린을 코팅한 주사기를 이용하여 약 0.2mL를 채혈하였다. 바로, 13,800rpm, 4℃에서 원심분리하여(EF-1300, ECO-Fuge(일본상표), 토미세이코 제품) 혈장을 회수하고, 분석까지 -30℃에서 보존하였다. RayBio(일본등록상표) Human G-CSF ELISA 키트(RayBiotech inc 제품)를 사용하여 혈장중 농도를 측정하였다.

측정결과를 도 6에, 논 컴파트먼트 모델(non compartment model)에 따라 계산한 약물 동태 파라미터를 표 2에 나타낸다. 미셀화에 의해 AUC가 3배 증가하고, 반감기는 2배 연장되었다.

표 2 : 사람 과립구 콜로니 자극인자 내포 고분자 미셀, 또는 사람 과립구 콜로니 자극인자 용액을 쥐에게 정맥내 투여하였을 때의 약물 동태 파라미터를 나타낸다.

약물동태 파라미터	용액	PEG-PONLA 12-40(50) 미셀
AUC_inf(% dose/mL·h)	7.4	22
T_1/2(h)	2.6	4.1
Cl(mL/h/body)	13	4.4
MRT_inf(h)	1.9	2.8
Vss(mL/body)	25	13

실시예 15 (사람 과립구 콜로니 자극인자 내포 미셀의 쥐 정맥내 투여시험 2)

블록 코폴리머로는 PEG-POLG를 사용하였다. 유리병 안에 30mg의 PEG-POLG 12-40(65)를 정밀계량하여 넣고, 20mM MES 완충액(pH 5.0)을 2mL 더한 후, 바이오 디스럽터(니혼세이키 세이사쿠쇼 제품, High Power Unit)를 사용하여 빙냉하에서 약 10분 동안(1초 간헐, 출력: 낮음) 초음파 처리하여, 빈 미셀을 조제하였다. 여기에, 재결합형 사람 G-CSF 용액(Green Cross사 제품)(300㎍/mL, 1mL)를 더하여 4℃에서 만 하루 놓아두었다. 그 후, 한외여과 유닛[밀리포어 제품, 아미콘(일본등록상표) 울트라-4(분획 분자량: 100,000)]에 의해, 내포되지 않았던 G-CSF를 제거하고, 5% 글루코오스 함유 20mM 인산 완충액(pH 7.4)으로 희석하여, 동물실험용 미셀로 하였다. 미셀은 실시예 12와 마찬가지로, G-CSF로서 100㎍/mL의 투여량으로 쥐에게 정맥내 투여하였다. 마찬가지로 채혈하여 혈장중 농도를 측정하였다.

측정결과를 도 7에, 논 컴파트먼트 모델(non compartment model)에 따라 계 산한 약물 동태 파라미터를 표 3에 나타낸다. 미셀화에 의해 AUC는 15배 증가하고, 반감기는 5배 연장되며, 투여 120 시간 후에도 혈장중 농도를 검출할 수 있었다. 이 결과는, 단백질 내포 미셀이 혈중에서도 초기 버스트하지 않고, 장기간에 걸쳐 혈중에 체류하는 것을 나타내고 있다.

표 3 : 사람 과립구 콜로니 자극인자 내포 고분자 미셀, 또는 사람 과립구 콜로니 자극인자 용액을 쥐에게 정맥내 투여하였을 때의 약물 동태 파라미터를 나타낸다.

약물동태 파라미터	용액	PEG-POLG 12-40(65) 미셀
AUC_inf(% dose/ml·h)	7.4	111
T_1/2(h)	2.6	14
Cl(ml/h/body)	13	0.90
MRT_inf(h)	1.9	12
Vss(ml/body)	25	11

지금까지의 본 발명의 설명은 실시와 설명을 위한 예시적인 것으로, 본 발명의 개념 및 범위를 이탈하지 않고 여러가지로 개량할 수 있다는 것을 알아야 할 것이다. 따라서, 청구의 범위는, 그와 같은 모든 개량을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서 안에 포함되어 있음.

Claims

단백질 또는 폴리펩티드가 내포되고, 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 친수성 세그먼트와, 산성 아미노산, 그 소수성 유도체 및 산성 아미노산과 그 소수성 유도체의 혼합물로부터 선택되는 폴리아미노산으로 이루어지는 소수성 세그먼트를 가지는 블록 코폴리머를 함유하는 고분자 미셀 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 산성 아미노산의 소수성 유도체가 산성 아미노산 알킬에스테르 또는 산성 아미노산 알킬아미드인 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 산성 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루타민산인 조성물.
제 1 항에 있어서,

블록 코폴리머가 하기 화학식 1 또는 화학식 2인 조성물:

[화학식 1]

또는

[화학식 2]

[상기 각 식 중, R₁ 및 R₃은 각각 독립적으로 수소원자 또는 보호되어 있어도 되는 관능기가 치환된 또는 치환되지 않은 저급 알킬기를 나타내고, R₂는 소수원자, 포화 또는 불포화의 C₁~C₂₉ 지방족 카르보닐기 또는 아릴카르보닐기를 나타내며, R₄는 수산기, 포화 또는 불포화의 C₁~C₃₀ 지방족 옥시기 또는 아릴-저급 알킬옥시기를 나타내고, R₅는 -O- 또는 -NH-를 나타내며, R₆은 수소원자, 페닐기, -(CH₂)₄-페닐기, 치환되지 않은 또는 아미노기 또는 카르복시기로 치환된 C₄~C₁₆ 알킬기, 또는 벤질기를 나타내고, R₇은 메틸렌기를 나타내며, n은 10~2500의 정수이고, x는 10~300이 되는 정수이며, m은 0~300이 되는 정수이고(단, m이 존재하는 경우, (COCHNH)의 유닛과 (COR₇CHNH)의 유닛은 랜덤하게 존재하고, R₆은 1개의 블록 코폴리머 내의 각 아미노산 유닛에서 임의로 선택가능하고, 랜덤하게 존재하는데, R₆이 수소원자인 경우에는 R₆ 전체의 60% 이하임), y는 1 또는 2의 정수를 나타내고, L₁은 -NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, -CH₂-, -O-Z-S-Z- 및 -OCO-Z-NH-(여기서, Z는 독립적으로 C₁~C₆ 알킬렌기임)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결기를 나타내고, L₂는 -OCO-Z-CO- 및 -NHCO-Z-CO-(여기서, Z는 C₁~C₆ 알킬렌기임)로부터 선택되는 연결기를 나타낸다]
제 4 항에 있어서,

상기 블록 코폴리머가 폴리아미노산 측쇄의 에스테르화 또는 아미드화율 40~100%인 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단백질 또는 폴리펩티드의 등전점(pI)이 3~11.5인 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 고분자 미셀 조성물의 조제방법으로서, 상기 블록 코폴리머와 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 혼합하고, 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 등전점(pI)과는 다른 pH로 상기 혼합액의 pH를 조정함으 로써 상기 블록 코폴리머로 구성되는 미셀의 소수성 코어영역에 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 내포시키는 공정을 포함하여 이루어지고,

여기서 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 pI, 상기 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트 안의 산성 아미노산 및/또는 그 유도체의 등전점(pI') 및 상기 pI와는 다른 pH는,

pI＞pH＞pI'

의 관계에 있고, 따라서 상기 pH에서 상기 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트는 음으로 대전하고, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 양으로 대전하거나, 또는

pI'＞pH＞pI

의 관계에 있고, 따라서 상기 pH에서 상기 블록 코폴리머의 소수성 세그먼트는 양으로 대전하고, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 음으로 대전하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서,

상기 pH가 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 pI로부터 1 이상 떨어져 있는 방법.