KR20080087941A - 저분자량 히알우론산을 함유하는 피부주름개선 및각질제거용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저분자량 히알우론산을 함유하는 조성물에 관한 것으로 본 발명의 분자량 100,000이하로 제조된 저분자량 히알우론산은 생체흡수가 용이하여 섭취시 피부의 주름개선, 보습력 증진, 탄력증진 및 각질제거효과가 우수하여 피부개선효과를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

저분자량 히알우론산, 주름개선, 보습, 탄력증진, 각질제거

Description

저분자량 히알우론산을 함유하는 피부주름개선 및 각질제거용 조성물{A composition containing the low molecular weight hyaluronic acid for improving skin wrinkles and skin peeling}

도 1은 히알우론산의 경구투여후 혈액내 시간대별 방사선량 변화를 나타낸 도이고,

도 2는 화상분석에 의한 히알우론산 투여에 의한 피부주름개선효과를 나타낸 도이며,

도 3은 시험제품 및 대조제품 섭취후 피부주름 개선율(%)을 방문 주수별로 나타낸 도이고,

도 4는 시험제품 및 대조제품의 피부 보습효능을 비교한 도이며,

도 5는 시험제품 및 대조제품 섭취후 보습 개선율(%)을 나타낸 도이고,

도 6은 시험제품 및 대조제품의 피부 탄력 효능을 비교한 도이며,

도 7은 제품 섭취 후 대조제품 대비 시험제품의 피부 탄력 개선율(%)을 나타낸 도이고,

도 8은 시험제품 및 대조제품의 피부 각질제거 효능비교를 방문 주수별로 정리한 도이며,

도 9는 시험제품 및 대조제품 섭취후 개선율(%)를 방문 주수별로 정리한 도이다.

본 발명은 저분자량 히알우론산을 함유하는 피부주름개선 및 각질제거용 조성물에 관한 것이다.

히알우론산은 반복단위인 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 (1-3)과 (1-4)로 번갈아 결합되어 있는 선형고분자로 의료용으로는 안과수술시 눈조직 보호제, 관절염 치료제, 외상피복제, 수술융착방지제 등과 화장품용으로는 보습, 피부보호제로 주로 사용되어 왔다.

최근에는 이러한 히알우론산의 물리적 특성 외에도 피부 등 인체조직에서 구조체로서의 기능, 생리활성물질로서의 기능에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며 사용 용도도 화장품, 의약품에서 건강기능식품으로까지 확대되고 있는 추세이다.

히알우론산은 사람을 비롯한 포유동물의 피부, 연골, 혈관, 뇌 등의 조직의 세포외 매트릭스 성분으로 광범위하게 존재하고 있고, 림프, 혈청 등의 체액 중에도 포함되어 있는 등 전신에 분포되어 있다. 예를 들어 피부에는 총 히알우론산의 절반 이상이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 성인의 혈청에는 항시 10~100μg/L의 히알우론산이 존재하고 그 대사회전속도는 0.3~1.0g/min/kg, 반감기는약 2일이다. 생체내에는 다양한 종류의 히알우론산 결합단백질이 존재하며, 조직중에서 이러한 결합분자에 다른 매트릭스분자가 결합하여 거대한 세포외 매트릭스(Extracellular matrix)를 형성하고 있다. 이러한 세포외 매트릭스는 발생과 재생과정상의 기관과 조직, 창상을 받은 조직 등 활발한 대사변화와 세포증식이 보이는 부위와 연골, 눈 초자체, 뇌간질 등 조직구조 자체가 기능에 직결되는 부위에서 많이 관찰된다.

이러한 조직구조체로서의 역할 뿐 아니라 최근의 많은 연구에서는 생리활성물질로서의 히알우론산의 기능에 관한 연구가 많이 진행되고 있는데, 히알우론산의 생리활성을 정리하면 첫번째는 조직에 특이적인 삼투압, 투명도, 점탄성, 선택적 물질투과성, 세포외 매트릭스를 구성, 유지하는 것이고, 두번째는 히알우론산 결합단백질과의 다양한 형태의 상호작용에 의해 세포외 신호전달에 관여하는 것이다. 히알우론산은 발생과정에서 형태형성과 창상치유 등에 있어 세포의 접착성 및 증식성, 운동성 등의 세포동태의 조정에 적극적인 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(King SR,Hickerson WL, proctor KG. benificial actions of exogenous hyaluronic acid on wound healing. Surg. 109, p 76,1991).

위와 같은 최근의 연구들은 히알우론산이 보습 및 구조체로서의 역할 뿐만 아니라 세포내외의 신호전달 체계에서 중요한 역할을 하고 있는 것을 보여주고 있다.

피부세포의 히알우론산은 나이가 들어감에 따라 감소하며 따라서 탄력성과 유연성도 감소하여 피부가 거칠어지고 미세한 주름들이 나타나게 된다. 현재까지 히알우론산은 보습제로 화장품에 사용되어 피부수분을 유지시키고 거친 피부를 향상시키는 목적으로 사용되어 왔다. 그러나 인간의 피부는 인체를 외부적 요인들로부터 보호하는 기능이 있기 때문에 고분자인 히알우론산이 피부에 직접 투과되기는 어려우며, 따라서 히알우론산을 함유하는 화장품은 피부외적으로 보습성을 유지시켜 피부를 보호하는 역할을 할뿐 피부내부에서의 효과를 보기는 어렵다.

최근 위에서 열거한 히알우론산의 효능을 기반으로 경구섭취에 의한 히알우론산의 체내 흡수를 통해 피부미용, 관절보호 등 히알우론산의 효능을 인체에 적용시키려는 연구 및 개발이 진행되고 있으며 이에 관한 공지내용은 아래에 기술한 바와 같다.

일본특허 P2001-229808호 및 미국특허 USP 6,566,346호에서는 닭벼슬로부터 추출, 정제한 분자량 750,000~1,200,000의 히알우론산의 섭취에 의해 피부의 건조예방, 수분유지, 부드러움 등의 피부기능을 증진시키는 방법과 피부개선용 식품조성물에 관한 내용을 기술하고 있다.

일본특허 제2787254호에서는 단백질 분해효소를 사용하여 닭벼슬에서 히알우론산과 단백질이 혼합 추출, 배합되어진 뮤코다당류 제조에 관한 기술을 개시하고 있다.

상기 기술한 내용들에서 사용된 히알우론산은 닭벼슬 추출물에 혼재된 히알우론산이거나, 닭벼슬로부터 정제된 히알우론산을 사용하였다. 닭벼슬에는 히알우론산 이외에 콘드로이틴 설페이트, 단백질 등이 혼재되어 있어 히알우론산의 고순도 분리, 정제가 어렵고 조류독감 등 동물성 병원균의 잔존 우려가 있으며, 불순물 혼재시 냄새 및 색상으로 인해 식품으로 섭취하기 곤란한 면이 있다. 히알우론산의 피부기능을 증진시키는 방법에 관하여 실시한 임상효능 결과에 대하여는 분자량 750,000~1,200,000의 비교적 고분자 히알우론산을 사용하고 체내 흡수율에 관한 구체적인 근거가 없으며, 효능평가시 수분측정기(corneometer)를 이용한 보습효과의 측정을 제외하고는 모두 피부과 의사의 주관적 판단에 근거한 것으로 과학적 평가가 이루어지지 않았다.

국내의 경우 최근 한국특허 10-2005-0018588호 및 10-2005-0048778호에서 히알우론산 및 콘드로이틴을 주성분으로 사용하여 보습 등의 미용효과와, 여러 부인성 질환 및 관절염 예방과 노화방지 등의 효과가 있는 식품의 제조방법에 관하여 기술하고 있으나 그 내용이 구체적이지 않고 효능시험시 설문지 조사 등 주관적인 판단기준에 근거하고 있다.

상기에서 기술한 바와 같이 히알우론산은 인체의 구성성분으로 존재하는 천연고분자로 피부에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 경구섭취를 통해 고분자인 히알우론산을 체내 흡수시켜 피부기능을 증진시키기 위한 적절한 방법과 구체적인 효능 및 근거가 부족하여 현재까지 식품용 히알우론산의 응용은 미흡한 실정이다.

따라서 이에 본 발명자들은, 생체흡수율은 증진시키는 저분자량 히알우론산을 제조하는 방법을 제공하고, 본 발명의 방법으로 제조된 히알우론산을 유효성분으로 함유하는 조성물의 주름개선, 보습, 탄력증진 및 각질제거효과가 지금까지 알려진 기타 조성물보타 훨씬 우수한 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 주름개선 및 각질제거효과를 갖는 저분자량 히알우론산을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부의 주름개선 및 각질제거효과를 갖는 저분자량 히알우론산을 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 제공한다.

상기 저분자량 히알우론산의 분자량은 1,000 내지 100,000달톤, 바람직하게는 30,000 내지 80,000 달톤임을 특징으로 하는 약학조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 저분자량 히알우론산은 미생물 발효액으로부터의 평균분자량 500,000 내지 2,000,000 달톤의 고분자량 히알우론산에 산처리 용매를 첨가후 유기용매로 반복 침전하여 히알우론산을 저분자화하는 제조공정을 통하여 제조된것임을 특징으로 하는 약학조성물을 제공한다.

상기 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 아세토니트릴 또는 아세톤, 바람직하게는 에탄올임을 특징으로 한다.

상기 산처리 용매는 염산, 황산, 질산, 인산, 구연산, 초산, 아스코프브산, 젖산, 사과산 및 주석산으로부터 선택된 하나이상의 용매를 사용함을 특징으로 한다.

이하 본 발명은 상세히 설명한다.

본 발명은 히알우론산 생성능이 있는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스균을 배양한 액을 여과하여 균체를 제거하고 농축한 후 에탄올로 침전하여 고분자 히알우론산을 제조하는 제 1단계; 상기 제 1단계에서 제조된 알콜침전물 형태 또는 건조된 분말형태의 히알우론산 분말을 50 내지 90% 에탄올에 고르게 분산시킨 후 무기산 또는 유기산을 첨가하여 pH를 1 내지 4가 되도록 조절하는 제 2단계; 상기 제 2단계의 용액을 에탄올 침전을 반복하고 원심탈수에 의해 침전물을 회수한 후 진공건조하여 저분자 히알우론산을 수득하는 제 3단계의 공정을 포함하는 저분자량 히알우론산을 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 제공한다.

상기의 제조방법으로 제조된 저분자 히알우론산은 함량 95%이상, 단백질 함량 0.1%이하로 고순도로 정제되었음을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 히알우론산은 상기 제 2단계에서 50 내지 90%의 알콜에 분산시켜 히알우론산이 용해되지 않고 분산된 형태로 존재하게 만들어 이후 알코올 침전이 용이하고 불순물을 쉽게 제거할 수 있게 함을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기제법으로 얻어진 저분자량 히알우론산을 유효성분으로 함유하는 피부의 주름개선 및 각질제거용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용 액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 20 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 공정에서 얻어지는 저분자량 히알우론산을 유효성분으로 함유하는 피부의 주름개선 및 각질제거용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 피부의 주름개선, 보습유지, 탄력증진 및 각질제거 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 염산을 이용한 저분자 히알우론산의 제조

하기문헌에 기재된 방법에 따라 고분자 히알우론산을 제조하였다(국내특허 제1992-0009494호: 신규 스트렙토코커스속 미생물 및 이를 이용한 고분자량의 히아론산 제조방법, 국내특허: 제1997-0126427호:히아론산의 정제 방법)

상기의 정제된 히알우론산나트륨 분말 또는 알코올침전물을 에탄올 60~80%에 넣고 교반하여 고르게 분산시킨다. 이액을 교반하면서 1N 염산을 서서히 첨가하여 pH가 1~4가 되도록 한다. 이 액을 방치하면 저분자화된 히알우론산이 침전되는데 상등액은 버리고 여기에 에탄올을 첨가하여 같은 과정을 반복한다. 이렇게 해서 얻어진 침전물을 진공건조하여 얻은 히알우론산 분말의 특성을 하기 표 1에 나타내었다. 히알우론산나트륨의 pH는 중성이며, 회분은 15~20%이며, 회분시험법은 식품공전 회분시험법에 따라 시행하였고 분자량은 비스코텍(Viscotek)사의 GPC 시스템을 사용하여 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide) 표준품을 사용하여 측정하였다.

제조시 pH	pH (0.1%)	회분(%)	분자량
pH 4	3.6	3.57	131,300
pH 3	3.31	2.26	101,000
pH 2	3.14	1.18	79,000

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 제조시 pH를 낮출수록 제조된 히알우론산의 분자량이 감소하는 것을 볼 수 있다. pH가 낮아지고 회분이 낮아지는 것으로 보아 히알우론산나트륨의 나트륨 이온이 수소이온으로 치환되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 황산을 이용한 저분자 히알우론산의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 저분자 히알우론산을 제조하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

제조시 pH	pH (0.1%)	회분(%)	분자량
pH 4	3.5	2.58	114,300
pH 3	3.31	1.92	98,400
pH 2	3.15	1.2	75,700

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 황산을 사용하였을시, 상기 실시예 1에 기재된 염산을 사용하였을때와 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 3. 유기산을 이용한 저분자 히알우론산의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 각종 유기산을 사용하여 저분자 히알우론산을 제조하였으며, 이 때 pH는 2.0으로 하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

유기산	pH (0.1%)	회분 (%)	분자량
옥살산(oxalic acid)	3.19	14.4	94,300
타르타르산(Tartaric acid)	3.4	5.5	144,800
아세테이트(Acetate)	3.5	5.2	150,400
젖산(Lactic acid)	3.25	3.3	106,300
구연산(citric acid)	3.18	1.5	82,500

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 구연산을 사용하는 것이 가장 효율적임을 알 수 있었다.

실시예 4. 구연산(Citric acid)를 사용한 산성 히알우론산의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 구연산을 사용하여 저분자 히알우론산을 제조하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

제조시 pH	pH (0.1%)	회분(%)	분자량
pH 3.0	3.22	3.50	112,200
pH 2.5	3.15	2.50	102,500
pH 2.0	3.10	2.10	83,000

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 고분자량 히알우론산의 산처리에 의해 분자량을 감소시킬 수 있었으며, 분말 또는 침전물의 사용으로 정제과정을 원활하게 수행할 수 있었다.

참고예 1. 저분자 히알우론산의 생체흡수율

저분자 히알우론산의 체내흡수율을 알아보기 위해 충남대 의약품개발연구소에서 ³H이 함입되어 제조된 ³H-히알우론산 (³H-HA, Mw 80,000, 방사선량 76,600DPM/mg)을 SD(Sprague Dawley)계 웅성쥐에 경구투여한 후 시간별로 채취한 혈액의 방사선량을 액체 섬광 계측기(Liquid Scintillation Counter, TRI-CARB 1600TR, Packard Instrument, USA)를 이용하여 방사선량 변화를 측정하였다. 투여된 시료의 총방사선량은 5,807,600 dpm 이었으며 경구투여 후 시간경과에 따른 혈중 방사선량의 변화를 하기 표 5 및 도 1에 나타내었다.

경구 투여후 혈액 내 시간별 방사선량

시간(hr)	방사선량 (DPM/ml)
	Mw.80,000	Mw.1,200,000
0	0 ± 0	0 ± 0
1	0 ± 0	0 ± 0
3	507 ± 45	237 ± 24
6	7,967 ± 2,780	907 ± 103
12	32,707 ± 5,139	2,247 ± 1,437
24	43,487 ± 8,731	3,107 ± 1,556
48	9,347 ± 5,969	2,087 ± 1,640
96		967 ± 1,162

실험결과, 경구 투여 후 초기 약 3시간 까지는 혈중 방사선량의 변화가 거의 없었고, 6시간 경과 이후 급격히 증가하여 24시간 전후에서 최대를 이루고 그 이후 줄어드는 것을 관찰하였다. 일반적으로 흰쥐의 체중에 약 7.4% 에 해당하는 무게가 총혈액량으로 알려져 있으며 총혈액량으로 환산한 혈액시료의 방사선량과 투여된 시료의 총방사선량을 비교하여 보면 12시간과 24시간에서 각각 투여량의 6.25%, 8.31% 가 흡수 되어진 것을 알 수 있었으며 이것은 특정 시간에서의 혈중농도이므로 실제로는 이 농도 이상의 HA가 흡수되어진 것으로 판단된다(도 1참조).

일반적으로 단분자 물질인 경우에는 경구투여 후 2~4시간 정도에서 혈중농도가 최대에 이르는 것으로 알려져 있으나, 본 실험에서는 경구투여 후 3시간 이후부터 혈중 방사선량이 급격히 증가하기 시작하여 24시간을 전후로 혈중 최대농도가 나타났다. 이러한 결과를 해석하여 보면, 첫째, 상대적으로 HA가 고분자 물질이기 때문에 장점막에서 흡수가 지연 되었을 가능성이 있으며, 두 번째로는 흡수된 HA가 대사과정을 거치면서 장기나 조직생성에 이용된 후 서서히 배출 되므로 체내에서 장시간 머무르는 것으로 사료된다.

상기한 결과는 분자량 80,000의 저분자 히알우론산도 일반적인 단분자 물질에 비해 체내 흡수에 걸리는 시간이 지연되며, 히알우론산의 원활한 체내흡수를 위해서는 저분자량화가 필수적임을 알 수 있었다.

참고예 2. 저분자 히알우론산의 임상효과실험 준비

본 발명의 저분자 히알우론산의 피부개선 효과를 알아보기 위하여 하기한 방법으로 임상시험을 진행하였다. 사용한 저분자 히알우론산은 상기 실시예 1의 ㈜바이오랜드에서 생산된 히알우론산 (제품명 : 히아론-에프에이 ; Lot No. FNH 1050615)을 사용하였다.

2-1. 평가 제품 및 제품 성상

가. 시험제품(Original) : 60mg의 히알우론산과 140mg의 결정셀룰로오스를 함유하는 하드캡슐.

나. 대조제품(Placebo) : 200mg의 결정셀룰로오스를 함유하는 하드캡슐

2-2. 피험자

일차로 모집된 총 70명의 지원자중에서 전술한 선정기준에 의해 본 실험에 적합하다고 판정된 52명을 대상으로 (주)바이오랜드의 히알우론산의 피부에 대한 주름개선, 보습효능, 탄력증진, 각질제거 효과 및 안전성을 평가하였으며 중도 탈락자 4명을 제외한 최종 피험자는 48명이었다. A그룹 26명은 시험제품(히알우론산)을, B그룹 26명은 대조제품을 매일 아침과 저녁에 매회 2정씩 섭취하게 하였다(섭취량 240mg/1일).

실험예 1. 수분측정기(Corneometer)를 이용한 피부 보습량 평가

항온 항습실에서 30분 경과 후 얼굴 볼(Cheek) 부위를 수분측정기(Corneometer, CM825 Courage & Khazaka, Germany)로 시험부위인 볼부위를 5회 측정하고, 최대 최소를 제외한 3개의 측정치의 평균을 하였다. 피부 보습량이 높아지면 측정값이 높고 낮아지면 측정값이 낮아진다.

실험결과를 표 6, 도 4 및 도 5에 나타내었다.

섭취 후 시험제품과 대조제품 간의 통계값

	결과(p value)
섭취 4주후	0.09113
섭취 8주후	0.02606*
*Independent T-test(p value <0.05)

인체시험 제품 섭취 8주후 시험제품이 대조제품에 비해 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)가 보이므로, 시험제품이 대조제품에 비해 피부 보습 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 2. 피부탄력도 측정기(Cutometer)를 이용한 피부 탄력 평가

지속적인 음압으로 측정시간 동안 프로브(probe)속으로 피부가 빨려들어간 뒤 음압이 제거 되면 피부는 원래의 모습으로 돌아가는 원리를 이용하여 탄력을 측정하는 장비인 피부 탄력도 측정기(Cutometer MPA580, Courage and Khazaka, K㎝ln, Germany)를 사용하여 피부 탄력을 측정하였으며, 측정방법은 기기에 연결된 2 mm 직경의 프로브(probe)를 제모된 피부에 밀착시키고 비침습적인 방법으로 측정하였다.

R5 = Ur/Ue순수 탄력 (net elasticity)

(1에 가까울수록 더욱 탄성적인 곡선이 형성됨)

실험결과는 표 7, 도 6 및 도 7에 나타내었다.

섭취 후 시험제품 및 대조제품 간의 통계값

	결과(p value)
섭취 4주후	0.09632
섭취 8주후	0.03617*
*Independent T-test(p value)

인체시험 제품 섭취 8주후 시험제품이 대조제품에 비해 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)가 보이므로, 시험제품이 대조제품에 비해 피부 탄력 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 3. 미세주름측정기(Visioscan)를 이용한 피부 각질량 평가

각질제거효과는 코르네오픽스(Corneofix, Courage & Khazaka, Germany)을 이용하여 시험부위인 볼에서 각질을 체취하였다. 측정 부위의 크기는 2" x 2" 넓이로 하였다. 미세주름측정기(Visioscan, VC98 Courage & Khazaka, Germany)로 영상을 촬영하고 분석하여 측정값 D.I(Desquamation Index)을 기록하였다.

피부 각질량이 높아지면 측정값이 높고 낮아지면 측정값이 낮아진다.

실험결과를 표 8, 도 8 및 도 9에 나타내었다.

섭취 후 시험제품 및 대조제품 간의 통계값

	결과(p value)
섭취 4주후	0.46757
섭취 8주후	0.01614*
*Independent T-test(p value <0.05)

인체시험 제품 섭취 8주후 시험제품이 대조제품에 비해 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)가 보이므로, 시험제품이 대조제품에 비해 피부 각질제거 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 4. 전문의에 의한 육안평가

인체시험 섭취 2주전, 섭취 직전, 섭취 4주후, 섭취 8주후, 섭취종료 2주후에 연구소에 방문한 피험자들을 대상으로 눈가의 주름 정도를 전체적인 광손상 점수(global photodamage score)에 근거하여 두 명의 피부과 전문의(KNS, MTK)가 평가하였다.

주차별 육안평가시 주름이 개선된 피험자

주차별	섭취 4주후	섭취 8주후
시험제품	1	6
대조제품	0	1

실험결과, 상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 제품 섭취 8주후 전문의에 의한 육안평가에서 개선된 피험자수에서 시험제품(6명)이 대조제품(1)에 비해 약 6배 정도 더 많았으며 이를 통해 시험제품이 주름개선에 도움을 주는 제품으로 판단되었다.

실험예 5. 모사판제작과 CCD 카메라시스템을 이용한 화상분석 결과

피험자들을 대상으로 눈가의 총주름양을 모사판제작과 CCD 카메라시스템을 이용한 화상분석으로 측정하였다. 시험제품과 대조제품의 모사판제작과 CCD 카메라 시스템을 이용한 화상분석에 의한 효능 비교를 방문 주수별로 정리하여 표 10, 도 2 및 도 3에 나타내었다.

섭취 후 시험제품과 대조제품 간의 통계값

	결과(p value)
섭취 4주후	0.33628
섭취 8주후	0.02131*
*Independent T-test(p value <0.05)

실험결과, 피부주름개선율은 대조제품과 비교하여 방문주수별로 증가하는 것을 확인하여, 본 발명의 조성물이 우수한 주름개선효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 피부자극 평가 결과

연구자 평가 결과로, 이학적 검사상 시험제품 섭취 후 홍반이나 발진 등 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis)이나 자극성 접촉 피부염(irritant contact dermatitis)의 이상소견은 관찰되지 않았다.

피부과 전문의에 의한 의학적 검사와는 별도로, 피험자들을 대상으로 한 설문조사에서 제품 섭취시 별다른 이상반응이 보고되지 않았으므로 본 인체시험에 섭취된 히알우론산은 섭취 후 피부에 자극이 없는 안전한 기제이며, 또한 섭취시 신체 및 소화기관에서 안전한 제품이라고 판단 수 있었다.

실험예 7, 혈액검사

시험제품과 대조제품 그룹에서 저하와 상승이 보였으나 정상 범위 내였다.

않았으며 검사 결과는 표 11에 나타내었다

측정항목	참고치	제품별	섭취 직전	섭취 8주후
Albumin	3.5-5.3	시험제품	4.5±0.2	4.4±0.2
		대조제품	4.6±0.2	4.6±0.3
AST	<38	시험제품	23.6±5.1	22.5±5.1
		대조제품	24.6±6.1	27.8±9.5
ALT	<43	시험제품	14.9±3.5	14.8±3.7
		대조제품	20.0±10.1	20.5±11.7
Total Bilirubin	0.2-1.2	시험제품	0.9±0.1	0.9±0.2
		대조제품	0.9±0.2	0.9±0.2
Total Cholesterol	130-220	시험제품	188.3±25.4	187.0±25.0
		대조제품	192.2±39.6	190.5±29.5
Glucose(Serum)	70-120	시험제품	78.8±8.1	76.6±4.9
		대조제품	82.3±7.3	77.3±5.2
Hemoglobin	F 12-16	시험제품	13.1±0.9	12.7±0.9
		대조제품	12.9±1.6	12.6±1.6
WBC	4.0-10.0	시험제품	5.6±1.1	6.1±1.7
		대조제품	5.7±1.4	5.8±1.5
RBC	F 4.0-5.4	시험제품	4.2±0.2	4.1±0.3
		대조제품	4.4±0.3	4.3±0.3
Platelet	130-400	시험제품	251.7±53.2	244.2±47.7
		대조제품	274.0±73.1	274.9±72.3
MCV	F 79-95	시험제품	91.6±3.2	92.1±3.0
		대조제품	87.5±7.7	87.8±7.7
MCH	F 26-32	시험제품	30.9±1.2	30.8±1.2
		대조제품	29.4±3.2	29.2±3.2
MCHC	30.0-35.0	시험제품	33.7±0.4	33.4±0.6
		대조제품	33.5±0.9	33.2±1.1

48명의 피험자를 대상으로 히알우론산의 피부에 대한 주름개선, 보습효능, 탄력증진, 각질제거 효과 및 안전성에 대하여 12주간 인체시험을 시행하였으며, 총 시험기간은 12주(제품 섭취기간은 8주)로 대조제품과 시험제품을 각각 그룹별로 하루 2차례 섭취하게 하였다 피부과 전문의에 의한 피부자극평가와 피험자에 의한 안전성 설문평가 결과 대조제품과 시험제품 모두 특별한 이상반응은 관찰되지 않았다. 설문조사에서 지적된 몇가지 항목들도 그 정도가 미약하여 저분자 히알우론산에 의한 이상반응은 없는 것으로 판단할 수 있었다. 혈액검사 결과 혈액 검사상 제품 섭취 후 각 그룹에서 두드러진 차이는 다소 발견되었지만, 모두 정상범위 내에서 일어난 것으로 의학적으로 별다른 이상이 관찰되지 않았다. CCD 카메라 시스템을 이용한 모사판 분석, 수분측정기(Corneometer), 피부탄력도 측정기(Cutometer), 미세주름측정기(Visioscan)와 전문의에 의한 육안평가를 총 5회(섭취 2주전, 섭취 직전, 섭취 4주후, 섭취 8주후, 섭취종료 2주후) 시행하였다. 대조제품 사용에 비해 시험제품이 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)가 관찰되었으므로 피부에 대한 주름개선, 보습증진, 탄력증진, 각질제거에 도움을주며 안전성이 우수한 제품으로 관찰되었다. 저분자 히알우론산은 섭취 8주후 제품 섭취전과 비교한 결과 CCD 카메라 시스템을 이용한 모사판 분석, 수분측정기(Corneometer), 피부탄력도 측정기(Cutometer), 미세주름측정기(Visioscan)를 통한 기기적 평가에서 대조제품 섭취에 비해 시험제품이 통계적으로 유의한 수준으로(p<0.05)으로 피부에 대한 주름개선, 보습증진, 탄력증진, 각질제거에 도움을 주는 제품으로 판단되었다. 전문의에 의한 육안평가에서 주름개선이 된 피험자가 대조제품보다 시험제품을 섭취한 피험자에서 약 6배 정도 좋은 주름개선효과를 보이므로 시험제품은 주름개선에 도움을 주는 제품으로 판단되었다. 특히 시험제품과 대조제품의 미세주름 측정기(Visioscan)에 의한 피부 각질제거 효능 비교결과 인체시험 제품 섭취 8주후 시험제품이 대조제품에 비해 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)를 나타내며 , 시험제품이 대조제품에 비해 뛰어난 피부 각질제거 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물 제제의 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 정제의 제조

저분자량 히알우론산 200㎎

갈락토올리고당 200㎎

유당 60㎎

맥아당 140㎎

상기의 성분을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6㎎을 첨가하여 타정기로 타정하였다. 내용물의 최종 중량은 600㎎으로 한다.

제제예 2. 산제의 제조

저분자량 히알우론산 25mg

DDB 50mg

유당 30mg

전분 20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 긴밀히 혼합하고 폴리에틸린이 코팅된 포에 충진하고 씰링하여 산제를 제조하였다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

저분자량 히알우론산 80㎎

대두유 180㎎

팜유 2㎎

식물성 경화유 8㎎

황납 4㎎

레시틴 6㎎

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법에 따라 1캡슐당 400㎎씩 충진하여 연질캅셀을 제조하였다.

제제예 4. 현탁제의 제조

저분자량 히알우론산 500mg

이성화당 10g

설탕 30mg

나트륨 CMC 100mg

레몬향 적량

정제수 적량 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조방법에 따라 현탁제를 제조하고 100ml 용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.

제제예 5. 과립제의 제조

저분자 히알우론산 450㎎

전분 550㎎

상기의 성분을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다. 내용물의 최종 중량은 1g으로 한다.

제제예 6. 주사제의 제조

저분자량 히알우론산 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다

제제예 7. 건강식품의 제조

저분자량 히알우론산 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 8. 건강 음료의 제조

저분자량 히알우론산 100 ㎎

포도당 10 g

구연산 0.6g

액상 올리고당 25g

상기의 성분을 혼합한 후 정제수 300㎖를 가하여 각 병에 200㎖씩 되게 충진한다. 병에 충진한 후 130℃에서 4∼5 초간 살균하여 음료를 제조하였다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 9. 캬라멜 제형의 제조

저분자 히알우론산 200㎎

옥수수 시럽 1.8g

탈지우유 0.5g

대두 레시틴 0.5g

버터 0.6g

식물성 경화유 0.4g

설탕 1.4g

마가린 0.58g

식염 20㎎

상기 성분을 혼합하여 캬라멜 성형을 하였다. 내용물의 최종중량은 6g으로 한다.

상기와 같이, 본 발명의 분자량 100,000이하의 저분자량 히알우론산을 함유하는 조성물은 생체흡수가 용이하여 섭취시 피부의 주름개선, 보습력증진, 탄력증진 및 각질제거효과가 우수하여 피부개선을 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (8)

1. 저분자량 히알우론산을 유효성분으로 함유하는 피부의 주름개선 및 각질제거용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 저분자량 히알우론산의 분자량은 1,000 내지 100,000달톤임을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 저분자량 히알우론산은 미생물 발효액으로부터의 평균분자량 500,000 달톤 내지 2,000,000 달톤의 고분자량 히알우론산에 산처리 용매를 첨가후 유기용매로 반복 침전하여 히알우론산을 저분자화하는 제조공정을 통하여 제조된것임을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 제 3항에 있어서, 히알우론산 생성능이 있는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스균을 배양한 액을 여과하여 균체를 제거하고 농축한 후 에탄올로 침전하여 고분자 히알우론산을 제조하는 제 1단계; 상기 제 1단계에서 제조된 알콜침전물 형태 또는 건조된 분말형태의 히알우론산 분말을 50 내지 90% 에탄올에 고르게 분산시킨 후 무기산 또는 유기산을 첨가하여 pH를 1 내지 4가 되도록 조절하는 제 2단계; 상기 제 2단계의 용액을 유기용매로 침전을 반복하고 원심탈수에 의해 침전물을 회수한 후 진공건조하여 저분자 히알우론산을 수득하는 제 3단계의 공정을 포함하는 저분자량 히알우론산을 유효성분으로 함유하는 약학조성물.
5. 제 3항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 아세토니트릴 또는 아세톤인 약학조성물.
6. 제 3항에 있어서, 상기 산처리 용매는 염산, 황산, 질산, 인산, 구연산, 초산, 아스코프브산, 젖산, 사과산 및 주석산으로부터 선택된 하나이상의 용매를 사용함을 특징으로 하는 약학조성물.
7. 저분자량 히알우론산을 유효성분으로 함유하는 피부의 주름개선 및 각질제거용 건강기능식품.
8. 제 7항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.

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