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KR20080000613A - 과안정화된 ｃ-ｍｅｔ의 조절을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

과안정화된 ｃ-ｍｅｔ의 조절을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20080000613A
KR20080000613A KR1020077024503A KR20077024503A KR20080000613A KR 20080000613 A KR20080000613 A KR 20080000613A KR 1020077024503 A KR1020077024503 A KR 1020077024503A KR 20077024503 A KR20077024503 A KR 20077024503A KR 20080000613 A KR20080000613 A KR 20080000613A
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KR
South Korea
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met
antibody
antagonist
ser
leu
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Ceased
Application number
KR1020077024503A
Other languages
English (en)
Inventor
모니카 콩-벨트란
디넬리 엠. 위크라마싱헤
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37053941&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20080000613(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20080000613A publication Critical patent/KR20080000613A/ko
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Abstract

본 발명은 특히 과안정화된 c-met 단백질을 억제함으로써 HGF/c-met 신호전달 경로를 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
과안정화된 c-met 단백질, HGF/c-met 신호전달 경로, 엑손 14, 스플라이싱

Description

과안정화된 Ｃ-ＭＥＴ의 조절을 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING HYPERSTABILZED C-MET}
관련 출원
본 출원은 그 내용이 본원에 참고로 도입된 2005년 3월 25일자로 출원된 가출원 제60/665,482호에 대해 35 USC 119(e) 하의 우선권을 주장하는, 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 비-가출원이다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HGF/c-met 신호전달 경로의 조절자, 및 상기 조절자의 용도에 관한 것이다.
HGF는 다수의 상이한 세포 유형에 대한 분열촉진, 운동촉진(motogenic) 및 형태형성 활성을 갖는 중간엽-유래된 다면발현성 인자이다. HGF 효과는 특이적 티로신 키나제인 c-met를 통해 매개되며, 비정상적 HGF 및 c-met 발현은 다양한 종양에서 빈번히 관찰된다. 예를 들어, 문헌 [Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59]; [Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867]을 참조한다. HGF/c-Met 신호전달 경로의 조절은 종양 진행 및 전이에 관련된다. 예를 들어 문헌 [Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300]을 참조한다.
HGF는 Met 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 세포외 도메인에 결합하며, 세포 산포, 증식 및 생존과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절한다. HGF-Met 신호전달은 특히 근육 전구 세포의 이동, 및 간 및 신경계의 발생에서 정상적인 배 발생에 필수적이다. (문헌 [Bladt et al., Nature (1995), 376, 768-771]; [Hamanoue et al., Faseb J (2000), 14, 399-406]; [Maina et al., Cell (1996), 87, 531-542]; [Schmidt et al., Nature (1995), 373, 699-702]; [Uehara et al., Nature (1995), 373, 702-705]). Met 및 HGF 넉아웃 마우스의 발생 표현형은 매우 유사하며, 이는 HGF가 Met 수용체에 대한 동족체 리간드임을 시사한다 ([Schmidt et al., 1995, 상기 문헌]; [Uehara et al., 1995, 상기 문헌]). HGF-Met는 또한 간 재생, 혈관신생 및 상처 치유에 있어서 역할을 한다 (문헌 [Bussolino et al., J Cell Biol (1992), 119, 629-641]; [Matsumoto and Nakamura, Exs (1993), 65, 225-249]; [Nusrat et al., J Clin Invest (1994) 93, 2056-2065]). 전구체 Met 수용체는 디술피드 결합에 의해 연결된 세포외 α 서브유닛 및 막 스패닝 β 서브유닛으로 단백질분해성 절단된다. (문헌 [Tempest et al., Br J Cancer (1988), 58, 3-7]). β 서브유닛은 세포질 키나제 도메인을 함유하며, C-말단에 적응자 단백질이 결합하고 신호전달을 개시하는 다중-기질 도킹 부위를 갖는다 (문헌 [Bardelli et al., Oncogene (1997), 15, 3103-3111]; [Nguyen et al., J Biol Chem (1997), 272, 20811-20819]; [Pelicci et al., Oncogene (1995), 10, 1631-1638]; [Ponzetto et al., Cell (1994), 77, 261-271]; [Weidner et al., Nature (1996), 384, 173-176]). HGF 결합시, Met의 활성화는 각각 Gab1 및 Grb2/Sos 매개된 PI3-키나제 및 Ras/MAPK 활성화를 통해, 티로신 인산화 및 하류 신호전달을 유발하여, 세포 운동 및 증식을 유도한다 (문헌 [Furge et al., Oncogene (2000), 19, 5582-5589]; [Hartmann et al., J. Biol Chem (1994), 269, 21936-21939]; [Ponzetto et al., J Biol Chem (1996), 271, 14119-14123]; [Royal and Park, J Biol Chem (1995), 270, 27780-27787]).
Met는 카르시노겐-처리된 골육종 세포주에서 형질전환되는 것으로 나타났다 (문헌 [Cooper et al., Nature (1984), 311, 29-33]; [Park et al., Cell (1986), 45, 895-904]). Met 과발현 또는 유전자-증폭은 다양한 인간 암에서 관찰되었다. 예를 들어, Met 단백질은 결장직장암에서 5배 이상 과발현되며, 간 전이에서 유전자-증폭되는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Di Renzo et al., Clin Cancer Res (1995), 1, 147-154]; [Liu et al., Oncogene (1992), 7, 181-185]). Met 단백질은 또한 경구 편평 세포 암종, 간세포 암종, 신장 세포 암종, 유방 암종 및 폐 암종에서 과발현되는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Jin et al., Cancer (1997), 79, 749-760]; [Morello et al., J Cell Physiol (2001), 189, 285-290]; [Natali et al., Int J Cancer (1996), 69, 212-217]; [Olivero et al., Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868]; [Suzuki et al., Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868]). 또한, mRNA의 과발현은 간세포 암종, 위 암종 및 결장직장 암종에서 관찰되었다 (문헌 [Boix et al., Hepatology (1994), 19, 88-91]; [Kuniyasu et al., Int J Cancer (1993), 55, 72-75]; [Liu et al., Oncogene (1992), 7, 181-185]).
Met의 키나제 도메인 내의 다수의 돌연변이는 구조적 수용체 활성화를 유발하는 신장 유도 암종에서 발견되었다 (문헌 [Olivero et al., Int J Cancer (1999), 82, 640-643]; [Schmidt et al., Nat Genet (1997), 16, 68-73]; [Schmidt et al., Oncogene (1999), 18, 2343-2350]). 상기 활성화 돌연변이는 구조적 Met 티로신 인산화를 부여하며, MAPK 활성화, 병소 형성 및 종양형성을 초래한다 (문헌 [Jeffers et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1997), 94, 11445-11450]). 또한, 상기 돌연변이는 세포 운동 및 침습을 증가시킨다 (문헌 [Giordano et al., Faseb J (2000), 14, 399-406]; [Lorenzato et al., Cancer Res (2002), 62, 7025-7030]). 형질전환된 세포에서의 HGF-의존성 Met 활성화는 증가된 운동, 산포 및 이동을 매개하여, 결국 침습성 종양 성장 및 전이를 유발한다 (문헌 [Jeffers et al., Mol Cell Biol (1996), 16, 1115-1125]; [Meiners et al., Oncogene (1998), 16, 9-20]).
Met는 수용체 활성화, 형태변화 및 침습을 유도하는 다른 단백질과 상호작용하는 것으로 나타났다. 신생물 세포에서, Met는 라미닌과 같은 세포외 매트릭스 (ECM) 성분에 대한 수용체인 α6β4 인테그린과 상호작용하여 HGF-의존성 침습성 성장을 촉진하는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Trusolino et al., Cell (2001), 107, 643-654]). 또한, Met의 세포외 도메인은 세마포린 족의 구성원인 플렉신 B1과 상호작용하여 침습성 성장을 증가시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Giordano et al., Nat Cell Biol (2002), 4, 720-724]). 또한, 종양형성 및 전이에 관련되는 CD44v6은 Met 및 HGF와 복합체를 형성하여 Met 수용체 활성화를 초래하는 것으로 또한 보고되어 있다 (문헌 [Orian-Rousseau et al., Genes Dev (2002), 16, 3074-3086]).
Met는 Ron 및 Sea를 포함하는 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 하위족의 구성원이다 (문헌 [Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13, 41-59]). Met의 세포외 도메인 구조의 예측은 세마포린 및 플렉신과의 공유된 상동성을 시사한다. Met의 N-말단은 모든 세마포린 및 플렉신에서 보존된 대략 500개 아미노산의 Sema 도메인을 함유한다. 세마포린 및 플렉신은 신경 발생에 있어서 그의 역할이 처음 기재된 분비 및 막-결합 단백질의 거대 족에 속한다 (문헌 [Van Vactor and Lorenz, Curr Bio (1999), 19, R201-204]). 그러나, 보다 최근에, 세마포린 과발현은 종양 침습 및 전이와 상호관련되었다. 플렉신, 세마포린 및 인테그린에서 발견된 시스테인-풍부 PSI 도메인 (Met 관련된 서열 도메인으로도 지칭됨)은 Sema 도메인에 인접하여 있고, 그 뒤에 플렉신 및 전사 인자에서 발견되는 이뮤노글로불린-유사 영역인 4개의 IPT 반복부에 이어진다. 최근의 연구는 Met Sema 도메인이 HGF 및 헤파린 결합에 충분함을 시사한다 (문헌 [Gherardi et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2003), 100(21): 12039-44]).
상기 설명된 바와 같이, Met 수용체 티로신 키나제는 그의 동족체 리간드 HGF에 의해 활성화되며, 수용체 인산화는 MAPK, PI-3 키나제 및 PLC-γ의 하류 경로를 활성화시킨다 (1, 2). 키나제 도메인 내의 Y1234/Y1235의 인산화는 Met 키나제 활성화에 중요한 반면, 다중기질 도킹 부위에서 Y1349 및 Y1356은 하류 신호전 달 경로의 활성화를 매개하는 src 상동성-2 (SH2), 포스포티로신 결합 (PTB), 및 Met 결합 도메인 (MBD) 단백질의 결합에 중요하다 (3 내지 5). 추가의 막근접 인산화 부위인 Y1003은 CbI E3-리가제의 티로신 키나제 결합 (TBK) 도메인에의 결합에 대해 널리 특성화되었다 (6, 7). Cb1 결합은 엔도필린-매개된 수용체 세포내이입, 편재화, 및 후속의 수용체 분해를 유도하는 것으로 보고되어 있다 (8). 이러한 수용체 하향조절 메카니즘은 또한 유사한 Cb1 결합 부위를 갖는 EGFR 족에서 이전에 기재되었다 (9 내지 11).
Met 및 HGF의 조절곤란은 다양한 종양에서 보고되었다. 리간드-유도된 Met 활성화는 몇몇 암에서 관찰되었다. 상승된 혈청 및 종양내 HGF는 폐암, 유방암 및 다발성 골수종에서 관찰된다 (12 내지 15). Met 및/또는 HGF의 과발현, Met 증폭 또는 돌연변이는 결장직장암, 폐암, 위암 및 신장암과 같은 다양한 암에서 보고되었으며, 리간드-비의존성 수용체 활성화를 유도하는 것으로 여겨진다 (2, 16). 또한, 간 마우스 모델에서의 Met의 유도성 과발현은 간세포 암종을 유발하며, 이는 수용체 과발현이 리간드 비의존성 종양형성을 유도함을 입증한다 (17). 암에서의 Met에 관련된 가장 주목할 만한 증거는 가족성 및 산발성 신장 유두 암종 (RPC) 환자에서 보고되어 있다. 수용체의 구조적 활성화를 유발하는 Met의 키나제 도메인 내의 돌연변이는 RPC에서 생식세포 계열 및 체세포성 돌연변이로서 확인되었다 (18). 트랜스제닉 마우스 모델에서의 상기 돌연변이의 도입은 종양형성 및 전이를 유발한다 (19).
Met 키나제 도메인의 역할이 상세히 조사되었지만, 키나제 도메인 이외의 Met 도메인은 거의 특성화되어 있지 않다. 사실, 다양한 종양학적 상태의 병인과 관련됨에도 불구하고, HGF/-c-met 경로는 치료학적으로 표적화하기 어려운 경로였다. 이에 관한 연구는 단일 종양 유형이 다수의 유전적 아형으로 이루어지며 HGF/c-met의 이상이 이러한 종양 유형의 일부만을 구성할 수 있다는 사실에 의해 상당 부분 지연되었다. 폐암과 같은, 치료가 어렵고 유전학적 및 조직학적으로 다양한 암에 대해 문제는 특히 심하다. 따라서, HGF/c-met 경로의 억제에 가장 잘 반응할 수 있는 암의 정확한 확인 방법에 대한 요구가 크다는 것은 명백하다. 본원에 제공된 본 발명은 이러한 요구를 충족시키며 다른 이점을 제공한다.
특허 출원 및 공개를 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 도입된다.
본 발명은 특정 인간 종양이 세포내에서 감소된 속도의 하향-조절을 나타내지만 여전히 세포 신호전달이 가능한, 돌연변이된 c-met 단백질을 발현한다는 신규한 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 상기 "과안정화된" c-met 단백질은 야생형 c-met에 비해 증가된 발암 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 본원에 나타난 바와 같이, 상기 종양은 항-c-met 억제제에 의해 억제될 수 있다. 과안정화된 c-met 활성의 억제는 다수의 치료적 이점을 제공한다. 예를 들어, 상기 c-met 돌연변이체는 특히 발암성이기 때문에, 그의 표적화된 억제는 상기 돌연변이체에 의해 유도되는 종양형성을 감소시킬 것으로 예상된다. 더욱이, c-met는 정상 세포를 비롯한 많은 세포 유형에서 발견되기 때문에, 종양-특이적 c-met 돌연변이체를 특이적으로 표적화하는 능력은 예를 들어 c-met 억제 요법의 부작용을 감소시키는데 있어서 특히 유익할 것이다. 본 발명은 본원에 기재된 발견에 기초하며, 과안정화된 c-met를 갖는 종양의 표적화 및/또는 치료에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 과안정화된 c-met에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 제공한다. 일 실시양태에서, 물질은 과안정화된 c-met와 관련된 생물학적 활성에 대한 억제 활성을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 물질은 과안정화된 c-met에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 물질은 과안정화된 c-met에 결합하며, c-met 활성을 억제한다. 일 실시양태에서, 물질은 c-met 활성을 실질적으로 억제하지 않으면서 과안정화된 c-met에 결합한다. 상기 물질은 예를 들어 치료제를 과안정화된 c-met를 발현하는 세포에 표적화하기 위한 분자로서와 같은, 다양한 용도가 있다. 치료제는 본원에 기재된 임의의 작용제, 예를 들어 독소를 포함한다. 물질은 항체-약물 컨쥬게이션 및 융합 폴리펩티드의 형태를 비롯한 임의의 적합한 형태일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 과안정화된 c-met 단백질과 관련된 HGF/c-met 신호전달을 붕괴시키는 c-met 길항제를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 인간 과안정화된 c-met 폴리펩티드의 c-met 신호전달 활성을 억제하는 길항제를 제공하며, 과안정화된 c-met 폴리펩티드는 세포 내에서의 그의 분해 속도가 야생형 c-met에 비해 감소되도록 엑손 14의 적어도 일부의 결실을 포함하고, 과안정화된 c-met 폴리펩티드는 c-met 신호전달 활성을 갖는다.
본 발명의 길항제는 본원에 기재된 바와 같이 과안정화된 c-met 분자의 활성을 특이적으로 억제할 수 있는 임의의 형태일 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 항체를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 c-met의 엑손 13 및 엑손 15의 프레임내 스플라이싱에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일 실시양태에서, 엑손 14의 적어도 일부는 상기 프레임내 스플라이싱의 결과로서 결실된다. 또다른 측면에서, 본 발명의 길항제는 압타머를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 압타머는 c-met의 엑손 13 및 엑손 15의 프레임내 스플라이싱에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일 실시양태에서, 엑손 14의 적어도 일부는 상기 프레임내 스플라이싱의 결과로서 결실된다. 일 측면에서, 본 발명의 길항제는 엑손 13이 엑손 15에 스플라이싱된 c-met의 스플라이스 변이체를 코딩하는 핵산 분자로부터의 발현을 선호적으로/선택적으로 억제하는 억제성 RNA를 포함한다. 일 실시양태에서, 핵산은 엑손 14의 적어도 일부가 변이체 스플라이싱의 결과로서 결실된 과안정화된 c-met를 코딩한다. 일 측면에서, 본 발명은 엑손 13이 엑손 15에 스플라이싱된 c-met의 스플라이스 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 선호적으로/선택적으로 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 길항제를 제공한다. 일 실시양태에서, 핵산 분자는 엑손 14의 적어도 일부가 변이체 스플라이싱의 결과로서 결실된 과안정화된 c-met를 코딩한다.
c-met 활성의 억제는, 과안정화된 c-met의 생물학적 활성이 세포에서 감소되는 한, 당업계에 공지된 임의의 다수의 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제에 의한 c-met 활성의 억제는 과안정화된 c-met 단백질의 세포성 분해의 증대를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 길항제에 의한 c-met 활성의 억제는 과안정화된 c-met 단백질의 인산화의 억제를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 길항제에 의한 c-met 활성의 억제는 과안정화된 c-met에 의한 HGF/c-met 신호전달 경로의 구성원의 인산화의 억제를 포함한다. 본 발명의 길항제에 의한 c-met 활성의 억제는 또한 세포 내의 과안정화된 c-met 폴리펩티드의 수준의 감소에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제에 의한 c-met 활성의 억제는 과안정화된 c-met 단백질의 발현, 예를 들어 과안정화된 c-met 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터의 전사 및/또는 번역의 억제를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 길항제에 의한 c-met 활성의 억제는 세포 내의 과안정화된 c-met에 특이적으로 결합하는 분자 (예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트)에 결합된 세포독소와 관련된 세포 사멸을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중-특이적 항체 또는 단일쇄 항체이다. 본 발명의 방법에 사용되는 길항제는 예를 들어 마이탄시노이드 또는 칼리케아미신을 비롯한 독소, 항생제, 방사성 동위원소, 핵산분해 효소 등과 같은 성장 억제제 또는 세포독성제에 임의로 컨쥬게이션될 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 화학요법제가 또한 대상체에 투여된다.
일반적으로, 유효한 c-met 길항제는 HGF와 같은 리간드의 과안정화된 c-met에의 결합을 간섭하는 c-met 억제제를 포함한다. 예를 들어, c-met 억제제는 HGF의 c-met에의 결합이 억제되도록 과안정화된 c-met에 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 길항제 항체는 키메라 항체, 예를 들어 이종 비-인간, 인간 또는 인간화 서열 (예를 들어, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)에 이식된 비-인간 공여자로부터의 항원 결합 서열을 포함하는 항체이다. 일 실시양태에서, 비-인간 공여자는 마우스이다. 일 실시양태에서, 항원 결합 서열은 합성적으로, 예를 들어 돌연변이유발 (예를 들어, 파지 제시 스크리닝 등)에 의해 수득된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 키메라 항체는 뮤린 V 영역 및 인간 C 영역을 갖는다. 일 실시양태에서, 뮤린 경쇄 V 영역은 인간 카파 경쇄에 융합된다. 일 실시양태에서, 뮤린 중쇄 V 영역은 인간 IgG1 C 영역에 융합된다. 일 실시양태에서, 항원 결합 서열은 경쇄 및/또는 중쇄의 하나 이상, 2개 이상 또는 모든 3개의 CDR을 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 서열은 중쇄 CDR3을 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 서열은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 수탁 번호 ATCC EDB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체의 CDR의 일부 또는 전부 및/또는 가변 도메인 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 서열은 하이브리도마 세포주 1A3.3.13 또는 5D5.11.6에 의해 생산된 모노클로날 항체의 중쇄의 적어도 CDR3을 포함한다. 본 발명의 인간화 항체는 FR에서의 아미노산 치환 및 이식된 CDR에서의 변화를 갖는 친화도 성숙 돌연변이를 갖는 것을 포함한다. CDR 또는 FR에서의 치환된 아미노산은 공여자 또는 수여자 항체에 존재하는 것에 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 증진된 CDC 및/또는 ACDD 기능 및 B-세포 사멸을 비롯한 개선된 효과기 기능을 유발하는 Fc 영역에서의 아미노산 잔기의 변화를 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 항체는 안정성을 개선시키는 특정 변화를 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 생체내에서 증대된 ADCC 기능을 갖는 푸코스 결핍 변이체를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체 단편은 SYWLH (서열 1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (서열 2) 및 YGSYVSPLDY (서열 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 2개 이상, 또는 모든 3개의 CDR 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항원 결합 팔을 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 팔은 아미노산 서열 SYWLH를 갖는 중쇄 CDR-H1을 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 팔은 아미노산 서열 MIDPSNSDTRFNPNFKD를 갖는 중쇄 CDR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 팔은 아미노산 서열 YGSYVSPLDY를 갖는 중쇄 CDR-H3을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 KSSQSLLYTSSQKNYLA (서열 4), WASTRES (서열 5) 및 QQYYAYPWT (서열 6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 2개 이상, 또는 모든 3개의 CDR 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항원 결합 팔을 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 팔은 아미노산 서열 KSSQSLLYTSSQKNYLA를 갖는 중쇄 CDR-L1을 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 팔은 아미노산 서열 WASTRES를 갖는 중쇄 CDR-L2를 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 결합 팔은 아미노산 서열 QQYYAYPWT를 갖는 중쇄 CDR-L3을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 단편은 SYWLH (서열 1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (서열 2) 및 YGSYVSPLDY (서열 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 2개 이상, 또는 모든 3개의 CDR 서열을 포함하는 중쇄, 및 KSSQSLLYTSSQKNYLA (서열 4), WASTRES (서열 5) 및 QQYYAYPWT (서열 6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 2개 이상, 또는 모든 3개의 CDR 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항원 결합 팔을 포함한다.
본 발명은 인간 c-met에 결합하는 인간화 길항제 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 항체는 생체내에서 인간 과안정화된 HGF/c-met 활성을 억제하는데 유효하고, 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 수탁 번호 ATCC HB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체의 적어도 CDR3 서열, 및 실질적으로 인간 컨센서스 서열 (예를 들어, 실질적으로 인간 중쇄 아군 III (VHIII)의 인간 컨센서스 프레임워크 (FR) 잔기)을 중쇄 가변 영역 (VH)에 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 수탁 번호 ATCC HB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체의 중쇄 CDR1 서열 및/또는 CDR2 서열을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 수탁 번호 ATCC HB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체의 경쇄 CDR1 서열, CDR2 서열 및/또는 CDR3 서열과 실질적으로 인간 경쇄 κ 아군 I (VκI)의 인간 컨센서스 프레임워크 (FR) 잔기를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열
Figure 112007076213617-PCT00001
을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 팔을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열
Figure 112007076213617-PCT00002
을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 팔을 포함한다.
다른 예에서, 리간드 (예를 들어, HGF)의 c-met에의 결합을 간섭하지 않는 c-met 길항제를 갖는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met 상의 리간드 (예를 들어, HGF) 결합 부위에 결합하지 않는다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met에의 리간드 (예를 들어, HGF) 결합을 실질적으로 억제하지 않는다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met에의 결합을 위한 리간드 (예를 들어, HGF)와 실질적으로 경쟁하지 않는다. 일 예에서, 본 발명의 길항제는 하나 이상의 다른 길항제와 함께 사용될 수 있으며, 길항제는 HGF/c-met 축 내에서 상이한 프로세스 및/또는 기능에서 표적화된다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 수탁 번호 ATCC HB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체의 Fab 단편과 같은 또다른 c-met 길항제가 결합하는 에피토프와 별개의 c-met 상의 에피토프에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 수탁 번호 ATCC HB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체의 Fab 단편과 별개이다 (즉, 그것이 아니다). 일 실시양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 수탁 번호 ATCC HB-11894 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 HB-11895 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체의 c-met 결합 서열을 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met 활성을 억제하지만, c-met의 야생형 막근접 도메인에 결합하지 않는다.
본 발명의 c-met 길항제의 일 실시양태에서, 길항제의 c-met에의 결합은 HGF에 의한 c-met 활성화를 억제한다. 본 발명의 c-met 길항제의 일 실시양태에서, 세포 내의 길항제의 c-met에의 결합은 세포의 증식, 산포, 형태형성 및/또는 운동을 억제한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 세포 내의 과안정화된 c-met에 결합하며, 이는 세포 사멸을 초래한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 길항제는 본원에 기재된 바와 같은 독소에 결합된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드), 항체, 항체 단편, 압타머, 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드), 억제성 RNA, 또는 이들의 조합이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 본원에 기재된 바와 같은 스크리닝 또는 확인 방법에 의해 수득된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 c-met 길항제의 스크리닝 또는 확인 방법을 제공한다. 일 예에서, 상기 방법은 후보 물질을 과안정화된 c-met의 적어도 일부를 포함하는 표적 분자와 접촉시킴으로써, 상기 표적 분자에 특이적으로 결합하는 물질이 (c-met 길항제로서) 선택되는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 선택된 후보 물질이 과안정화된 c-met의 돌연변이된 영역에 특이적으로 결합하는지를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 표적 분자가 폴리펩티드를 포함할 경우, 선택된 후보 물질은 과안정화된 c-met의 돌연변이된 위치 (또는 영역)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 것이다. 또다른 예에서, 표적 분자가 과안정화된 c-met의 적어도 일부를 코딩하는 핵산을 포함할 경우, 선택된 후보 물질은 과안정화된 c-met를 코딩하는 핵산으로부터의 과안정화된 c-met 단백질의 발현을 특이적으로 억제할 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 선택된 물질을 과안정화된 c-met를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 세포 내의 c-met 활성의 억제가 평가된다 (예를 들어, 하류 c-met 신호전달 (예를 들어, MAPK 인산화)이 검출되거나 정량화된다). c-met 신호전달 활성의 억제는 당업계에 공지된 다양한 방식으로, 그리고 당업계에 공지된 임의의 다양한 범주에 기초하여 평가될 수 있으며, 그 중 일부는 본원에 보다 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, c-met 신호전달 활성의 억제는 c-met 활성화의 양의 감소의 의해 표시될 수 있으며, 이는 다시 예를 들어 세포 내의 c-met-관련된 세포 신호전달의 양에 의해 표시될 수 있다. 세포 신호전달은 다양한 방법에 의해, 그리고 당업계에 공지된 다양한 범주에 기초하여 평가될 수 있으며, 그 중 일부는 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, HGF/c-met 경로에서 세포 신호전달의 발생은 신호전달 경로에서 표적 분자의 인산화의 변화의 형태로 생물학적으로 나타날 수 있다. 따라서, 예를 들어, HGF/c-met 경로에서 하나 이상의 공지된 인산화 표적과 관련된 단백질 인산화의 양이 측정될 수 있다. 이러한 인산화 표적의 예로는 c-met 자체 및 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAPK)를 들 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 본 발명의 길항제 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 담체는 제약상 허용가능하다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 c-met 길항제를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드)이거나 이를 포함하는 c-met 길항제를 코딩한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 항체 또는 그의 단편이거나 이를 포함하는 c-met 길항제를 코딩한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 압타머이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 억제성 RNA (예를 들어, 소 간섭 RNA)이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 임의의 유형, 예를 들어, 발현 벡터와 같은 재조합 벡터일 수 있다. 임의의 다양한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)이다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유동물 세포이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 길항제의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항체 (또는 그의 단편)이거나 이를 포함하는 c-met 길항제의 제조 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 항체 (또는 그의 단편)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 항체를 회수하는 것을 포함한다. 또다른 예에서, 본 발명은 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드)이거나 이를 포함하는 c-met 길항제의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드)를 회수하는 것을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 용기; 및 상기 용기 내에 함유된, 1종 이상의 본 발명의 c-met 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 제조품을 제공한다. 일 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 길항제를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하며, 이는 일부 실시양태에서 제약상 허용가능하다. 일 실시양태에서, 본 발명의 제조품은 조성물 (예를 들어, 길항제)을 대상체에게 투여하기 위한 지시서를 추가로 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 본 발명의 c-met 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 일 실시양태에서, 완충제는 제약상 허용가능하다. 일 실시양태에서, 길항제를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하며, 이는 일부 실시양태에서 제약상 허용가능하다. 일 실시양태에서, 키트는 조성물 (예를 들어, 길항제)을 대상체에게 투여하기 위한 지시서를 추가로 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예를 들어, 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련된 장애와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 c-met 길항제의 용도를 제공한다. c-met 길항제는 항체, 항체 단편, 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드), 핵산 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드, 억제성 RNA), 압타머, 또는 이들의 조합을 비롯한 본원에 기재된 임의의 형태일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예를 들어, 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련된 장애와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예를 들어, 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련된 장애와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예를 들어, 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련된 장애와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예를 들어, 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련된 장애와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 제조품의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예를 들어, 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련된 장애와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 키트의 용도를 제공한다.
본 발명은 c-met의 지연된 하향-조절과 관련된 HGF/c-met 신호전달 축의 조절곤란과 관련된 질환 상태의 조절에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. HGF/c-met 신호전달 경로는 예를 들어 세포 증식 및 혈관신생을 비롯한 다수의 생물학적 및 생리학적 기능에 관여한다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 과안정화된 c-met를 표적화하는 길항제를 대상체에게 투여함으로써 HGF/c-met 신호전달을 조절하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 길항제를 대상체에게 투여함으로써 종양을 치료하는, 대상체에서의 종양의 치료 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 종양이 과안정화된 c-met를 포함하는지가 측정된다. 일 실시양태에서, 종양이 엑손 14의 적어도 일부의 결실을 포함하는 돌연변이체 c-met를 포함하는지가 측정된다.
본 발명의 방법의 일 실시양태에서, 본 발명의 c-met 억제제는 수용체 단백질 분해를 증가시키고/거나 증대시키는 작용제와 함께 투여된다.
일 측면에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 유효량의 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시킴으로써 c-met 활성화와 관련된 세포 증식을 억제하는, c-met 활성화된 세포 증식의 억제 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 대상체에게 투여함으로써 상태를 치료하는, 대상체에서의 c-met 활성화의 조절곤란과 관련된 병리학적 상태의 치료 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 세포를 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시킴으로써 상기 세포의 성장의 억제를 유발하는 것을 포함하는, c-met 또는 간세포 성장 인자를 발현하는 세포의 성장의 억제 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 세포는 (측분비 효과를 통해) 상이한 세포에 의해 발현된 HGF에 의해 접촉된다.
일 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 포유동물에게 투여함으로써 상기 포유동물을 유효하게 치료하는 것을 포함하는, c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘다를 발현하는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유동물의 치료적 처치 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 세포는 (측분비 효과를 통해) 상이한 세포에 의해 발현된 HGF에 의해 접촉된다.
일 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 대상체에게 투여함으로써 세포 증식성 장애를 유효하게 치료 또는 예방하는 것을 포함하는, c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘다의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 증식성 장애는 암이다.
일 측면에서, 본 발명은 세포를 유효량의 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시킴으로써 상기 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 상기 세포의 성장이 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘다의 성장 가능화 효과에 적어도 부분적으로 의존하는 세포의 성장의 억제 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 세포는 (측분비 효과를 통해) 상이한 세포에 의해 발현된 HGF에 의해 접촉된다.
일 측면에서, 본 발명은 세포를 유효량의 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시킴으로써 상기 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 상기 세포의 성장이 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘다의 성장 가능화 효과에 적어도 부분적으로 의존하는 포유동물에서의 종양의 치료적 처치 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 세포는 (측분비 효과를 통해) 상이한 세포에 의해 발현된 HGF에 의해 접촉된다.
본 발명의 방법은 예를 들어 HGF/c-met 신호전달 경로의 조절곤란과 관련된 세포 및/또는 조직의 임의의 적합한 병리학적 상태에 작용하는데 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 유방암 세포, 결장직장암 세포, 폐암 세포, (예를 들어, 갑성선의) 유두 암종 세포, 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 중추 신경계암 세포, 골육종 세포, 신장 암종 세포, 간세포 암종 세포, 방광암 세포, 전립선암 세포, 위 암종 세포, 두경부 편평 암종 세포, 림프종 세포, 흑색종 세포 및 백혈병 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명에서 표적화되는 세포는 과다증식성 및/또는 과다형성 세포이다. 일 실시양태에서, 본 발명에서 표적화되는 세포는 형성이상 세포이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 전이성 세포이다.
본 발명의 방법은 추가의 치료 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 방법은 표적화된 세포 및/또는 조직 (예를 들어, 암 세포)를 방사선 치료 및/또는 화학요법제에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, c-met 활성화는 그의 조절곤란이 다수의 병리학적 상태를 유발하는 중요한 생물학적 과정이다. 따라서, 본 발명의 방법의 일 실시양태에서, 표적화되는 세포 (예를 들어, 암 세포)는 c-met의 활성화가 동일한 조직 기원의 정상 세포에 비해 증대된 것이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 세포의 사멸을 유발한다. 예를 들어, 본 발명의 길항제와의 접촉은 c-met 경로를 통한 신호에 대한 세포의 불능을 초래할 수 있으며, 이는 세포 사멸 또는 세포 성장의 억제를 초래한다. 또다른 예에서, 본 발명의 길항제는 과안정화된 c-met를 발현하는 세포에 결합된 독소를 표적화한다.
c-met 활성화 (따라서, 신호전달)의 조절곤란은 예를 들어 HGF (c-met의 동족체 리간드) 및/또는 c-met 자체의 과발현 (지연된 하향-조절/분해, 증가된 발현 수준 등에 기인함)을 비롯한 다수의 세포성 변화로부터 초래될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 둘다가 동일한 조직 기원의 정상 세포에 비해 세포 (예를 들어, 암 세포)에 의해 보다 풍부하게 발현된 세포를 표적화하는 것을 포함한다. c-met 발현 세포는 다양한 공급원으로부터의 HGF에 의해, 즉 자가분비 또는 측분비 방식으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 일 실시양태에서, 표적화된 세포는 상이한 세포에서/에 의해 발현된 간세포 성장 인자에 의해 (예를 들어, 측분비 효과를 통해) 접촉/결합된다. 상기 상이한 세포는 표적화된 세포에 비해 동일한 것이거나 상이한 조직 기원의 것일 수 있다. 일 실시양태에서, 표적화된 세포는 표적화된 세포 자체에 의해 발현된 HGF에 의해 (예를 들어, 자가분비 효과/루프에 의해) 접촉/결합된다. C-met 활성화 및/또는 신호전달은 또한 리간드 비의존성으로 일어날 수 있다. 본 발명의 방법의 일 실시양태에서, 표적화된 세포 내의 c-met 활성화는 리간드 비의존성으로 일어난다.
본 발명의 방법의 일 실시양태에서, 방법은 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 돌연변이를 검출함으로써) 종양 세포가 과안정화된 c-met를 포함하는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1은 Met의 엑손 14에 플랭킹된 예시적인 인트론성 돌연변이를 나타낸다. 인트론/엑손 구조에 관한 상응하는 핵산 (NM_000245) 결실 및/또는 점 돌연변이 (밝은 회색 문자)를 나타내는 Met 엑손 14의 개략도. (A) H596, 폐암 세포주. (B) pat. 14, 환자 14 폐 종양 표본. (C) pat. 16, 환자 16 폐 종양 표본. 참고로, 종양 H596에서, (A)에서 +1로 표시된 위치에서 G에서 T로의 점 돌연변이가 있다. 종양 환자 14에서, (B)에서 -27 내지 -6으로 표시된 위치로부터의 서열의 결실이 있다. 종양 환자 16에서, (C)에서 3195 내지 +7로 표시된 위치로부터 서열의 결실이 있다.
도 2. 과안정화된 c-met의 지연된 하향 조절은 Met 및 MAPK의 활성화와 관련된다. (A) Met 구조물 및 Cb1-flag와 공동-형질감염된 293 세포를 V5 또는 Cb1 항체로 면역침전시킨 후 (IP), Vt, flag, 또는 P-tyr 항체로 면역블롯팅시켰다 (IB). (B) 293 세포를 Met 구조물로 형질감염시킨 후, 내인성 Cb1의 IP를 수행하였다. V5 항체로의 면역블롯팅은 내인성 Cb1으로 Met WT는 나타났지만, Met ΔEx14 공동-IP는 나타나지 않았다. 막을 벗기고, Y1003, YY1234/1235, Y1349 또는 Y1365 포스포-특이적 항체로 리프로빙하였다. (C) 293 세포의 일시적 형질감염으로부터의 용해물을 V5 항체로 면역침전시키고, 유비퀴틴 항체로 면역블롯팅하여 유비퀴틴화된 Met를 검출하였다. 막을 벗기고, V5 항체로 리프로빙하여 Met의 존재를 검출하였 다. 용해물을 flag 또는 액틴 항체로 프로빙하여 등가 발현에 대한 Cb1-flag 또는 액틴을 검출하였다. (D) 293 세포를 지시된 구조물로 형질감염시키고, 10 ㎍/mL 시클로헥시미드로 처리하였다. 용해물을 V5 항체 또는 액틴으로 프로빙하였다. (E) 혈청-고갈된 폐암 세포주를 50 ng/mL rhuHGF로 10분 동안 자극시킨 후, 세정하고, 혈청-무함유 배지로 복귀시켰다. 용해물을 지시된 시간에 수집하고, P-Met (Y1230/Y1234/Y1235), Met, P-MAPK, MAPK, P-Akt 또는 Akt로 면역블롯팅하였다. (F) Rat 1A 안정한 클론을 혈청-고갈시키고, 작동제성 Met 모노클로날 항체 3D6 (5 ㎍/mL)로 10분 동안 처리하고, PBS로 세정하고, 혈청-무함유 배지에 복귀시켰다. 지시된 시간에, 용해물을 수득하고, P-MAPK, MAPK, P-Akt 또는 Akt에 대해 면역블롯팅하였다.
도 3. Met 막근접 결실을 갖는 세포주에서의 증대된 리간드-의존성 증식 가능성. (A) NSCLC 세포주의 패널에서의 HGF-자극된 성장을 50 ng/mL rhuHGF의 존재 또는 부재하에서 72시간 배양 후 측정하였다. 결과는 최소 3회의 별개 실험으로부터 측정된 바와 같은 자극 지수 (SI)로서 표시된다. (B) 피하로 접종된 Rat 1A 안정한 세포주 발현 벡터, Met WT, Met ΔEx14의 성장 곡선, 각각의 경우 누드 마우스에서 HGF 작동제 항체 (3D6)의 존재 또는 부재하에서.
도 4. 항-Met mAb를 갖는 H596 세포, OA-5D5에서의 리간드-의존성 Met 신호전달 및 성장의 억제. (A) 혈청-고갈된 H226 또는 H596 세포를 지시된 농도에서 30분 동안 OA-5D5와 함께 인큐베이션한 후, 1000 ng/mL rhuHGF로 15분 동안 자극시켰다. 용해물을 수득하고, P-Met (Y1234/Y1235), Met, P-Akt, Akt, P-MAPK 또는 MAPK에 대해 면역블롯팅하였다. (B) 세포를 지시된 농도에서 50 ng/mL rhuHGF의 존재 또는 부재하에서 OA-5D5 또는 대조군으로 처리하고, 세포 생존성을 72시간 후 측정하였다.
도 5. Rat 1A 안정한 Met 세포주에서의 포스포-키나제 대 키나제 비율의 정량화. P-MAPK:MAPK (좌측) 및 P-Akt:Akt (우측)은 이차 항체에 컨쥬게이션된 알렉사플루오르(AlexaFluor)680 및 IRDye800을 검출하는 오딧세이(Odyssey) 적외선 스캐너를 이용하여 정량화되었다.
도 6. OA-5D5로 처리된 H596 및 H226에서의 포스포-키나제 대 키나제 비율의 정량화. 각각의 세포주에 대한 P-Met:Met, P-Akt:Akt, 또는 P-MAPK:MAPK의 비율은 이차 항체에 컨쥬게이션된 알렉사플루오르680 및 IRDye800을 검출하는 오딧세이 적외선 스캐너를 이용하여 정량화되었다.
도 7은 인간 c-met 엑손 14의 스플라이싱을 조절할 것으로 예상되는 예시적인 시스-작용 스플라이싱 요소를 나타낸다. 상기 요소 내의 하나 이상의 위치에서의 돌연변이는 엑손 14의 야생형 스플라이싱에 대해 부정적 효과를 가질 것으로 예상된다.
도 8은 RefSeq. NM_000245에 기초한 야생형 인간 c-met 단백질 서열을 나타낸다.
도 9는 실시예에서 지칭된 OA-5D5 항체에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 형태
본 발명은 HGF/c-met 신호전달 경로의 억제제 (특히, 과안정화된 c-met의 억제제)를 확인하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 제조품, 및 이러한 억제제의 사용 방법을 제공한다.
상기 방법, 조성물, 키트 및 제조품의 상세사항은 본원에 제공된다.
일반적인 기술
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면 당업자의 범위 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; ["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
정의
본원에서 사용된 "과안정화된 c-met"라는 용어 및 그의 변형어는 야생형 c-met의 속도보다 검출가능하게 느린 속도로 분해된/하향-조절된 천연-발생 돌연변이체 인간 c-met를 지칭한다. 예를 들어 하기 실시예에 기재된 것을 비롯한 야생형 c-met와 과안정화된 c-met 사이의 분해/하향-조절 속도의 비교 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 일 예에서, 지연된 분해/하향-조절은 세포 내의 수용체 단백질의 정량화에 기초하여 평가된다. 또다른 예에서, 지연된 분해/하향-조절은 c-met에 결합하는 Cb1과 관련된 c-met 부위 내의 돌연변이의 검출에 기초하여 측정된다. 일 예에서, 돌연변이는 c-met 유비퀴틴화 (예를 들어, c-met 엑손 14) 및 수용체 단백질 분해/하향-조절과 관련된 c-met 부위 내에 있다. 상기 돌연변이는 야생형 c-met보다 낮은 속도로 분해된/하향-조절된 돌연변이된 c-met 단백질의 발현을 초래하는 임의의 형태로 발생될 수 있으며, 돌연변이된 c-met 단백질은 야생형 c-met-관련된 활성 (예를 들어, MAPK와 같은 하류 분자의 활성화, 세포 증식의 자극, 및/또는 종양형성 사건의 유도)이 가능하다. 예를 들어, 상기 돌연변이는 수용체 단백질 분해/하향-조절과 관련된 엑손 14의 적어도 일부가 결실된 기능성 프레임내 c-met 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것을 포함한다. 돌연변이의 예시적인 예는 도 1 및 7에 나타내어진 스플라이싱 요소에서 발견되는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 세포 내의 본 발명의 과안정화된 c-met 단백질의 존재는 세포 내의 유사한 양의 야생형 c-met 단백질에 비해 HGF/c-met 경로의 하류 분자의 연장된 및/또는 증가된 인산화와 관련된다.
본원에서 사용된 "벡터"라는 용어는 이것이 결합될 수 있는 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 가지 종류는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또다른 종류는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 그에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현의 지정을 가능하게 한다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이기 때문에 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 호환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기재일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조합 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 성분과의 컨쥬게이션에 의해서와 같이 중합 후 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형으로는 예를 들어 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드가 유사체로 치환되는 "캡", 예를 들어 비하전된 결합 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에 스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)을 갖는 것들 및 하전된 결합 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-리신 등)과 같은 펜던트 잔기를 함유하는 것들, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)을 갖는 것들, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬레이터를 함유하는 것들, 변형된 결합 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것들과 같은 뉴클레오티드 변형, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 들 수 있다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어 표준 보호기에 의해 보호된, 또는 추가의 뉴클레오티드에의 추가의 결합을 만들기 위해 활성화된 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체될 수 있거나, 고체 또는 반-고체 지지체에 컨쥬게이션될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 탄소 원자수 1 내지 20의 아민 또는 유기 캡핑기 잔기로 인산화되거나 치환될 수 있다. 다른 히드록실은 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 크실로스 또는 릴록스, 피라노스 당, 파라노스 당, 세도헵툴로스, 아크릴산 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 비롯한, 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 별도의 연결기로 대체될 수 있다. 상기 별도의 연결기로는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이 트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 에테르 (-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜을 임의로 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C임)인 실시양태를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 선행 기재는 RNA 및 DNA를 비롯한 본원에서 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용된 "올리고뉴크레오티드"는 반드시 그럴 필요는 없지만 일반적으로 길이가 약 200 뉴클레오티드 미만인, 짧은 일반적으로 단일 가닥인, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. "올리고뉴크레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 상호 배타적이다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 대해서 동일하고 완전하게 적용가능하다.
본원에서 사용된 "간세포 성장 인자" 또는 "HGF"라는 용어는 달리 지시되지 않는다면, 그러한 과정이 일어나는 것을 허용하는 조건하에서 HGF/c-met 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 임의의 천연 또는 변이체 (천연이든 합성이든) HGF 폴리펩티드를 지칭한다. "야생형 HGF"라는 용어는 일반적으로 천연 발생 HGF 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. "야생형 HGF 서열"이라는 용어는 일반적으로 천연 발생 HGF에서 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. C-met는 HGF 세포내 신호전달이 생물학적으로 달성되는 HGF에 대한 공지된 수용체이다. RefSeq NM_000245에 기초한 야생형 인간 c-met 단백질 서열은 도 8에 나타나 있다.
본원에서 사용된 "스플라이스 부위", "스플라이스 연접부", "분기점", "폴리피리미딘 구역"이라는 용어는 포유동물, 특히 인간 RNA 스플라이싱의 내용에서 당업게에 공지된 의미를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Pagani & Baralle, Nature Reviews: Genetics (2004), 5:389-396], 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다. 편리한 참조를 위해, c-met RNA 스플라이싱 요소에 대한 서열의 일 실시양태는 도 7에 예시적으로 설명되어 있다.
본원에서 사용된 "숙주 세포" (또는 "재조합 숙주 세포")라는 용어는 재조합 플라스미드 또는 벡터와 같은, 유전적으로 변경되었거나, 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해 유전적으로 변경될 수 있는 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 후손도 지칭하는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경 영향에 기인하여 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에, 이러한 후손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용된 "숙주 세포"라는 용어의 범위 내에 포함된다.
"항체" (Ab) 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이적 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 이뮤노글로불린은 항체 및 일반적으로 항원 특이성이 없는 다른 항체-유사 분자 둘다를 포함한다. 후자의 종류의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로 및 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.
"항체" 및 "이뮤노글로불린"이라는 용어는 가장 넓은 의미에서 호환적으로 사용되며, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 비손상 모노클로날 항체), 폴리 클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 그들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하며, 또한 (본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같은) 특정 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙된 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 비손상 항체의 일부만을 포함하며, 상기 부분은 바람직하게는 비손상 항체에 존재할 경우 상기 부분과 통상적으로 관련되는 하나 이상의, 바람직하게는 대부분 또는 모든 기능을 보유한다. 일 실시양태에서, 항체 단편은 비손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하며, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 것은 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합과 같은, 비손상 항체에 존재할 경우 Fc 영역과 통상적으로 관련되는 하나 이상의 생물학적 기능을 보유한다. 일 실시양태에서, 항체 단편은 생체내 반감기가 비손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔(arm)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 경우 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 및/또는 형태 구조적으로 한정된 루프에서 초가변인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. "HVR" 또는 "HV"라는 용어에 선행하는 "HC" 및 "LC"라는 문자는 각각 중쇄 및 경쇄의 HVR 또는 HV를 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함한다: VH에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에 3개 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용중이며, 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 변이성을 기초로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Protenis of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아(Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내며, 옥스포드 몰리큘러(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 각각의 상기 초가변 영역으로부터의 잔기를 하기에 나타낸다.
Figure 112007076213617-PCT00003
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 상기 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변성인 부분이며, 항원-결합 부위를 함유한다.
본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체의 집 단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단에 포함되는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원에 대해 지정된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제조물에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지정된다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 및 그들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역으로부터의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수여자 항체)이다. 일부의 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형이 이루어져 항체 성능을 추가로 개량 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-인간 이뮤노글로불린의 그것과 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것인, 실질적으로 모든 하나 이상의, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 사항에 대해서는 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 하기 검토 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 인간 항체 제조 기술을 이용하여 제조된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"친화도 성숙된" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해, 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 초래하는 하나 이상의 그의 CDR/HVR에서 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. CDR/HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"Fc 영역"이라는 용어는 비손상 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Fc 영역의 카르복실-말단에 대해 대략 위치 Cys226에서, 또는 대략 위치 Pro230으로부터의 아미노산 잔기로부터 신장되는 것으로 정의된다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 본원에서 "Fc 영역 쇄"는 Fc 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄 중 하나를 의미한다.
본원에서 사용된 "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211 , I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소, 또는 박테리아, 진균, 식 물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체를 포함한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)(등록상표) 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히신; 베툴린산; 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN(등록상표)) 포함), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)(등록상표)), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류트레로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케 아미신 감마 II 및 칼리케아미신 오메가 II (예를 들어 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 디네미신 A를 비롯한 디네미신; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 크로모포르 및 관련 크로모프로테인 에네디인 항생제 크로모포르), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)(등록상표), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (독실(DOXIL)(등록상표) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)(등록상표)), 테가푸르 (우프토랄(UFTORAL)(등록상표)), 카페시타빈 (크셀로다(XELODA)(등록상표)), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플룩수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항- 아드레날린제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 루니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체 (미국 오레곤주 유진에 소재하는 JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)(등록상표), 필데신(FILDESIN)(등록상표)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)(등록상표)), 알부민-유전자조작된 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)(상표명)), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)(등록상표)); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 플라티눔 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)(등록상표)), 플라티눔; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)(등록상표)), 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)(등록상표)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소메라제 억 제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 임의의 상기 것들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 것들의 2종 이상의 조합, 예를 들어 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN(상표명))을 사용한 치료 처방의 약어 폴폭스(FOLFOX)를 들 수 있다.
또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하며 종종 전신 또는 전체-신체 치료의 형태인 항-호르몬제가 포함된다. 이는 호르몬 자체일 수 있다. 그 예로는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)(등록상표) 타목시펜 포함), 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)(등록상표)), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 테옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)(등록상표)); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 에스트로겐 수용체 길항제, 예를 들어 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)(등록상표)); 난소를 저해하거나 막는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 아고니스트, 예를 들어 류프롤리드 아세테이트 (루프론(LUPRON)(등록상표) 및 엘리가르드(ELIGARD)(등록상표)), 고세릴린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 다른 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아 미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (메가스(MEGASE)(등록상표)), 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)(등록상표)), 포르메스타니, 파드로졸, 보로졸 (리비소르(RIVISOR)(등록상표)), 레트로졸 (페마라(FEMARA)(등록상표)), 및 아나스트로졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)(등록상표))을 들 수 있다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의에는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)(등록상표) 또는 오스타크(OSTAC)(등록상표)), 에티드로네이트 (예를 들어, 디드로칼(DIDROCAL)(등록상표)), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)(등록상표)), 알렌드로네이트 (포사막스(FOSAMAX)(등록상표)), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)(등록상표)), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)(등록상표)), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)(등록상표)); 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴크레오티드; 특히 비정상적 세포 증식과 관련된 신호전달 경로에서 유전자 발현을 억제하는 것들, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 빈카, 예를 들어 테라토프(THERATOPE)(등록상표) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)(등록상표) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)(등록상표) 백신, 및 백시드(VAXID)(등록상표) 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)(등록상표)), rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표)); 라파티니브 디토실레이트 (ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소-분자 억제제 (GW572016으로도 공지됨)); COX-2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브 (셀레브렉스(CELEBREX)(등록상표)); 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1- 일) 벤젠술폰아미드; 및 임의의 상기 것들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 이러한 차단은 임의의 수단에 의해, 예를 들어 수용체에 대한 리간드 결합과 같은 단백질-단백질 상호작용을 간섭함으로써 일어날 수 있다. 일 실시양태에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
"암" 및 "암성"이라는 용어는 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예로는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예로는 편평세포암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막의 암, 간세포암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 질암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 두경부암을 들 수 있다.
본원에서 사용된 "치료"라는 용어는 치료될 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적인 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리증상의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 예 후의 개선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 질환 또는 장애의 발달을 지연시키려는 시도에 유용하다.
"유효량"은 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량으로 및 시간 동안 유효한 양을 지칭한다. 치료제의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 유익한 효과가 치료제의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량으로 및 시간 동안 유효한 효과를 지칭한다. 전형적이지만 필수적이지는 않게, 예방학적 투여량은 질환 이전 또는 질환의 초기 단계에 대상체에 사용되며, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법
A. c-met 길항제 항체
일 실시양태에서, 본 발명은 치료제 및/또는 진단제로서의 본원에서 용도를 발견할 수 있는 c-met 길항제 항체를 제공한다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 헤테로컨쥬게이트 항체를 포함한다. 항체의 생성, 확인, 특성화, 변형 및 제조의 측면은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2005/0042216호의 단락 522 내지 563, 604 내지 608, 및 617 내지 688에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 수립되어 있다.
본원에 개시된 c-met 길항제 항체는 표적 세포/조직에의 전달에 적합한 임의 의 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 항체는 이뮤노리포좀으로서 제제화될 수 있다. "리포좀"은 포유동물에게 약물을 전달하는데 유용한 다양한 종류의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 이루어진 작은 소포이다. 리포좀의 성분은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형성으로 배열된다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 1997년 10월 23일자로 공개된 WO 97/38731에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 증대된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하는 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 컨쥬게이션될 수 있다. 화학요법제는 리포좀 내에 임의로 함유된다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)]을 참조한다.
B. c-met 길항제 폴리펩티드
일 측면에서, 본 발명의 c-met 길항제는 폴리펩티드를 포함한다. 일 실시양태에서, 길항제 폴리펩티드는 세포 내의 과안정화된 c-met 단백질에 결합하고/거나 이를 길항한다. 일 실시양태에서, 폴리펩티드는 과안정화된 c-met에 바람직하게는 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드는 공지된 펩티드 합성 방법론을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 재조합 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 일 실시양태에서, c-met 길항제 폴리펩티드는 길이가 약 5 아미노산 이상, 대안적으로 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 아미노산 이상, 또는 그 이상이며, 이러한 폴리펩티드는 과안정화된 c-met 활성을 억제할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대한 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있음을 유념해야 한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,556,762호, 제5,750,373호, 제4,708,871호, 제4,833,092호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,689호, 제5,663,143호; PCT 공개 WO 84/03506 및 WO 84/03564; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth.. 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)]; [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378]; [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol. 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363]; 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
박테리오파지 (파지) 제시는 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리의 구성원(들)을 확인하는 거대 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝할 수 있게 하는 널리 공지된 기술이다. 파지 제시는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상의 외피 단백질에의 융합 단백질로서 제시되는 기술이다 (문헌 [Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386]). 파지 제시의 유용성은 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체 (또는 무작위로 클로닝된 cDNA)의 거대 라이브러리가 높은 친화도로 표적 분자에 결합하는 서열에 대해 급속하고 효과적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상의 펩티드의 제시 (문헌 [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378]) 또는 단백질의 제시 (문헌 [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363]) 라이브러리는 특이적 결합 특성을 갖는 것에 대해 수 백만의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드의 스크리닝에 사용되었다 (문헌 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol. 2:668]). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리의 분류는 다수의 변 이체의 구축 및 증식을 위한 전략, 표적 수용체를 이용한 친화도 정제를 위한 절차, 및 결합 풍부화의 결과 평가의 수단을 필요로 한다 (미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,689호 및 제5,663,143호).
대부분의 파지 제시 방법은 필라멘트성 파지를 사용했지만, 람다 파지 제시 시스템 (WO 95/34683; 미국 특허 제5,627,024호), T4 파지 제시 시스템 (문헌 [Ren et al., Gene. 215:439 (1998)]; [Zhu et al.. Cancer Research. 58(15):3209-3214 (1998)]; [Jiang et al., Infection & Immunity. 65(11):4770-4777 (1997)]; [Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997)]; [Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996)]; [Efimov et al., Virus Genes. 10:173 (1995)]) 및 T7 파지 제시 시스템 (문헌 [Smith and Scott, Methods in Enzymology. 217:228-257 (1993)]; 미국 특허 제5,766,905호)이 또한 공지되어 있다.
염기성 파지 제시 개념의 많은 다른 개선 및 변형법이 현재 개발되었다. 상기 개선은 선택된 표적 분자에 결합하는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하고 목적하는 특성에 대해 상기 단백질을 스크리닝하는 가능성을 갖는 기능성 단백질을 제시하는 제시 시스템의 능력을 증대시킨다.
파지 제시 반응에 대한 조합적 반응 장치가 개발되었으며 (WO 98/14277), 파지 제시 라이브러리는 이분자 상호작용 (WO 98/20169; WO 98/20159) 및 속박된 나선 펩티드의 특성 (WO 98/20036)을 분석하고 제어하는데 사용되었다. WO 97/35196에는, 파지 제시 라이브러리를, 리간드가 표적 분자에 결합하는 하나의 용액 및 친화도 리간드가 표적 분자에 결합하지 않는 제2 용액과 접촉시켜 결합 리간드를 선 택적으로 단리하는, 친화도 리간드의 단리 방법이 기재되어 있다. WO 97/46251에는 무작위 파지 제시 라이브러리를 친화도 정제된 항체로 바이오패닝한 후, 마이크로플레이트 웰을 이용하여 고 친화도 결합 파지를 단리하는 마이크로패닝 과정을 수행하는 방법이 기재되어 있다. 친화도 태그로서 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 사용이 또한 보고되었다 (문헌 [Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]). WO 97/47314에는 파지 제시 라이브러리일 수 있는 조합적 라이브러리를 이용하여 효소 특이성을 구별하는 기질 제거 라이브러리의 용도가 기재되어 있다. 파지 제시를 이용한 세정제에 사용하기에 적합한 효소의 선택 방법은 WO 97/09446호에 기재되어 있다. 추가의 특이적 결합 단백질의 선택 방법은 미국 특허 제5,498,538호, 제5,432,018호, 및 WO 98/15833에 기재되어 있다.
펩티드 라이브러리의 생성 및 상기 라이브러리의 스크리닝 방법은 또한 미국 특허 제5,723,286호, 제5,432,018호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,498,530호, 제5,770,434호, 제5,734,018호, 제5,698,426호, 제5,763,192호, 및 제5,723,323호에 개시되어 있다.
길항제 폴리펩티드의 생성, 확인, 특성화, 변형 및 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2005/0042216호의 단락 606 내지 608, 614 내지 688에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 수립되어 있다. 일 실시양태에서, 과안정화된 c-met 활성의 길항을 위한 폴리펩티드는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 엑손 14의 적어도 일부의 결실을 포함하는 돌연변이체 c-met 막근접 서열을 포함하는 표적 항원에 기초하여 스크리닝함으로써, 과안정화된 c-met 단백질에 기초하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원은 c-met의 엑손 13 및 15의 프레임내 스플라이싱을 초래하는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
C. 이뮤노컨쥬게이트
또다른 측면에서, 본 발명은 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성컨쥬게이트)와 같은 세포독성제에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는, 이뮤노컨쥬게이트 또는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 제공한다.
암 치료시 세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 컨쥬게이트를 사용하게 되면 (문헌 [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 제4,975,278호), 이론적으로는 상기 약물 부분을 종양에 표적화 전달할 수 있고 종양 내에 약물이 세포내 축적되게 할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 컨쥬게이션시키지 않은 채로 전신 투여하게 되면, 제거하고자 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해서도 허용가능하지 않은 수준의 독성이 야기될 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, "in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506]). 따라서, 최소 독성을 나타내면서 최대 효능을 나타내고자 하였다. 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 둘다가 이들 전략에 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87]). 이들 방법에 사용된 약물로는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 들 수 있다 ([Rowland et al., (1986)] 상기 문헌]. 항체-독소 컨쥬게이트에 사용된 독소로는 박테리아 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 (문헌 [Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19):1573-1581]; [Mandler et al (2000) Bioorganic ＆ Med. Chem. Letters 10: 1025-1028]; [Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791]), 마이탄시노이드 [EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 [Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928]; [Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342])을 들 수 있다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 메카니즘에 의해 자신의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 발휘할 수 있다. 몇몇 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 컨쥬게이션될 때 불활성화되거나 덜 활성을 나타내는 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN)(등록상표) (이브리투모마브 티욱세탄, 바이오젠/이덱(Biogen/Idec))은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에 발견된 CD20 항원에 대해 지정된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소로 구성된 항체-방사성 동위원소 컨쥬게이트이다 (문헌 [Wiseman et al (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al (2002) Blood 99 (12):4336-42]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69]). 제발린이 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL)에 대항한 활성을 지니고 있긴 하지만, 이를 투여하게 되면 대부분의 환자에게서 중증의 혈구감소증이 장기간 나타난다. 칼리케아미신과 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체-약물 컨쥬게이트인 밀로타르그(MYLOTARG)(상표명) (겜투주마브 오조가미신; 와이어스 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의해 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위한 것으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25 (7):686]; 미국 특허 제4970198호; 제5079233호; 제5585089호; 제5606040호; 제5693762호; 제5739116호; 제5767285호; 제5773001호). 디술피드 링커 SPP를 통하여 마이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 huC242 항체로 구성된 항체-약물 컨쥬게이트인 칸투주마브 메르탄신 (이뮤노젠, 인크.(Immunogen, Inc.))을 대상으로 하여, CanAg를 발현하는 암, 예를 들어 결장암, 췌장암, 위암 등을 치료하기 위한 제II상 시험이 진행되고 있다. MLN-2704 (밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.), BZL 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노젠, 인크.)는 마이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체 약물 컨쥬게이트로서, 현재 전립선 종양의 잠재적 치료를 위해 개발 중이다. 아우리스타틴 펩티드인 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)을 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 특이적임) 및 cAClO (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 특이적임) (문헌 [Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784])에 컨쥬게이션시켰고, 이는 치료제 개발 중에 있다.
이러한 이뮤노컨쥬게이트를 생성시키는데 유용한 화학요법제가 상기 언급되었다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모노르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 각종 방사성핵종이 방사성컨쥬게이션된 합체 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예에는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re가 포함된다. 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 컨쥬게이트를 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면 역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사뉴클레오티드를 항체에 컨쥬게이션시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다. WO 94/11026을 참조한다.
항체와 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 마이탄시노이드, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 지닌 이들 독소의 유도체의 컨쥬게이트가 또한 본원에 고려된다.
마이탄신 및 마이탄시노이드
일부 실시양태에서, 이뮤노컨쥬게이트는 하나 이상의 마이탄시노이드 분자에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체를 포함한다.
마이탄시노이드는 튜불린 중합 반응을 억제함으로써 작용하는 핵분열 억제제이다. 마이탄신은 동아프리카산 관목 마이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 분리하였다 (미국 특허 제3,896,111호). 연속해서, 특정 미생물이 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르를 생성시키는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 마이탄시놀 및 그의 유사체 및 유사체가, 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호에 보고되었다.
마이탄시노이드 약물 잔기는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의한 제조에 상대적으로 접근가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 컨쥬게이션되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체 약물 컨쥬게이트에서 매력적인 약물 잔기이다.
마이탄시노이드 약물 잔기의 예시적인 예로는 DM1; DM3; 및 DM4를 들 수 있다. 마이탄시노이드를 함유하는 이뮤노컨쥬게이트, 그의 제조 방법, 및 그의 치료적 용도는 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0425 235 B1에 개시되어 있으며, 이의 개시사항은 본원에 특별히 참고로 도입된다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]은 인간 결장직장암에 대해 지정된 모노클로날 항체 C242에 결합된 마이탄시노이드 설계된 DM1을 포함하는 이뮤노컨쥬게이트를 기재하였다. 컨쥬게이트는 배양된 결장암 세포에 대해 매우 세포독성인 것으로 나타났으며, 생체내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 나타내었다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 마이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7, 또는 또HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 컨쥬게이션된 이뮤노컨쥬게이트가 기재되어 있다. TA.1-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성은 세포당 3 x 105개 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관내에서 시험되었다. 약물 컨쥬게이트는 항체 분 자당 마이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있는, 유리 마이탄시노이드 약물과 유사한 세포독성의 정도를 달성하였다. A7-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타내었다. 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체 또는 마이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않고 마이탄시노이드 분자에 항체를 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 (그의 개시사항은 본원에 특별히 참고로 도입됨)를 참조한다. 항체 분자당 컨쥬게이션된 평균 3 내지 4개의 마이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증대시키는 효능을 나타내지만, 독소/항체의 심지어 하나의 분자라도 네이키드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증대시킬 것으로 예상된다. 마이탄시노이드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 마이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 및 상기에 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 마이탄시노이드는 마이탄시놀, 및 방향족 고리 또는 마이탄시놀 분자의 다른 위치에서 변형된 마이탄시놀 유사체, 예를 들어 다양한 마이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 또는 유럽 특허 0 425 235 B1, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)], 및 2004년 10월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/960,602호 (그의 개시사항은 본원에 특별히 참고로 도입됨)에 개시된 것을 비롯한, 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 제조를 위한 당업계에 공지된 많은 연결기가 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 2004년 10월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/960,602호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결기는 상기-확인된 특허에 개시된 바와 같은 디술피드기, 티오에테르기, 산 불안정성 기, 광불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기, 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하며, 디술피드 및 티오에테르기가 바람직하다. 추가의 연결기는 본원에 기재되어 있으며 예시되어 있다.
항체와 마이탄시노이드의 컨쥬게이트는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 디술피드 결합을 제공하는데 특히 바람직한 커플링제로는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 들 수 있다.
특히 바람직한 커플링제로는 디술피드 결합을 제공하는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 들 수 있다.
링커는 연결물 종류에 따라서 각종 위치에서 마이탄시노이드 분자에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 에스테르 결합은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시킴으로써 형성시킬 수 있다. 이러한 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형시킨 C-14 위치, 히드록실기로 변형시킨 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 연쇄가 마이탄시놀 또는 마이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
아우리스타틴 및 돌로스타틴
일부 실시양태에서, 이뮤노컨쥬게이트는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩티드성 유사체 및 유도체, 아우리스타틴에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체를 포함한다 (미국 특허 제5635483호; 제5780588호). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 간섭하며 (문헌 [Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]) 항암 (미국 특허 제5663149호) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 잔기는 펩티드성 약물 잔기의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 2004년 11월 5일자로 출원된, 발명의 명칭이 "리간드에 컨쥬게이션될 수 있는 모노메틸발린 화합물"인 미국 제10/983,340호 (그의 개시사항은 그 전문이 특별히 참고로 도입됨)에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 잔기를 포함한다. 예시적인 아우리스타틴 실시양태는 MMAE 및 MMAF이다. 추가의 예시적인 실시양태는 MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분 (본원에 추가로 기재됨) Ab-MC-vc-PAB-MMAF, Ab-MC-vc-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE 및 Ab-MC-MMAF를 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기초 약물 잔기는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 지질상 합성 방법 (문헌 [E. Schroder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 잔기는 미국 특허 제5635483호; 미국 특허 제5780588호; 문헌 [Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drag Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863]에 따라 제조될 수 있다. 또한, 문헌 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 2004년 11월 5일자로 출원된, 발명의 명칭이 "리간드에 컨쥬게이션될 수 있는 모노메틸발린"인 미국 제10/983,340호 (그 전문이 본원에 참고로 도입됨) (예를 들어, 링커, 및 링커에 컨쥬게이션된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸발린 화합물의 제조 방법이 개시됨)을 참조한다.
칼리케아미신
다른 실시양태에서, 이뮤노컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체를 포함한다. 칼리케아미신 족의 항생제는 이중 가닥 DNA 절단물을 피코몰 이하 농도로 생성시킬 수 있다. 칼리케아미신 족의 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관해서는 미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 제5,877,296호 (아메리칸 시아나미드 캄파니(American Cyanamid Company))를 참고할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Hinman et al., Cancer Research, 53: 3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research, 58: 2925-2928 (1998)]; 및 전술된 아메리칸 시아나미드의 미국 특허들). 항체와 컨쥬게이션될 수 있는 또다른 항종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA 둘 다는 세포내 작용 부위를 갖고 있고 혈장 막을 용이하게 교차하지 않는다. 따라서, 항체 매개된 내재화를 통한 이들 작용제의 세포성 섭취는 그들의 세포독성 효과를 상당히 증대시킨다.
다른 세포독성제
본 발명의 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 다른 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호, 제5,770,710호에 기재된 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 작용제의 군, 뿐만 아니라 에스페라미신 (미국 특허 제5,877,296호)을 들 수 있다.
사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모노르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 특정 항체와, 핵산분해 활성을 지닌 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 이뮤노컨쥬게이트를 추가로 고려한다.
종양을 선택적으로 파괴시키기 위해, 항체가 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 각종 방사성 동위원소가 방사성컨쥬게이션된 항체 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 컨쥬게이트를 검출용으로 사용하는 경우에는, 컨쥬게이트가 섬광조영 연구를 위해서는 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함할 수 있거나, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로서 공지되기도 함)를 위해서는 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 기타 표지를 공지된 방식으로 컨쥬게이트에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 수소 대신, 예를 들어 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111 등의 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 요오도겐(IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 기타 방법이 상세히 기재되어 있다.
다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 [예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 컨쥬게이트를 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사성뉴클레오티드를 항체에 컨쥬게이션시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다. WO 94/11026을 참조한다. 이러한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시켜 주는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특별히, 가교제 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (미국 일리노이주 로크포드에 소재하는 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.))을 사용하여 제조된 ADC를 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]을 참조한다.
항체 약물 컨쥬게이트의 제조
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)에서는, 항체(Ab)를 하나 이상의 약물 부분 (D), 예를 들어 항체당 약 1 내지 약 20개 약물 부분에 링커 (L)를 통하여 컨쥬게이션시킨다. 화학식 I의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵기를 이가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 Ab-L을 형성시킨 다음, 이 를 약물 부분 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 부분의 친핵기를 이가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵기와 반응시키는 방법.
Ab-(L-D)p
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 이루어질 수 있다. 예시적인 링커 성분으로는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 ("SIAB")를 들 수 있다. 추가의 링커 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 일부는 본원에 기재되어 있다. 또한, 2004년 11월 5일자로 출원된, 발명의 명칭이 "리간드에 컨쥬게이션될 수 있는 모노메틸발린"인 미국 제10/983,340호 (그의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입됨)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분으로는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 들 수 있다. 예시적인 디펩티드로는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌- 페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 들 수 있다. 예시적인 트리펩티드로는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 들 수 있다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연 발생, 뿐만 아니라 소수 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-관련된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위해 그의 선택성에서 설계되고 최적화될 수 있다. 예시적인 링커 성분 구조는 하기에 나타나 있다 (여기서, 물결형 선은 ADC의 다른 성분에의 공유 부착 부위를 나타냄).
Figure 112007076213617-PCT00004
추가의 예시적인 링커 성분 및 약어는 하기를 포함한다 (여기서, 항체 (Ab) 및 링커가 표시되며, p는 1 내지 약 8임).
Figure 112007076213617-PCT00005
항체 상의 친핵기로는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체가 당화된다)를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원 가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체를 환원제, 예를 들어 DTT (디티오트레이톨)로 처리함으로써 링커 시약과의 컨쥬게이션을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 이로써, 각 시스테인 브릿지는 이론적으로, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민을 티올로 전환시켜 주는 리신과 2-아미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)의 반응을 통하여 부가의 친핵기를 항체 내로 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-반응성 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다.
링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 부분을 도입하도록 항체를 변형시킴으로써 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트를 또한 생성시킬 수 있다. 당화 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 부분의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 이로써 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 수소화붕소 시약에 의해 환원시켜 안정한 아민 결합을 형성시킬 수 있다. 한 양태에서는, 당화 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적당한 기와 반응할 수 있는 단백질 내에 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 생성될 수 있다 (문헌 [Hermanson, Bioconjugate Techniques]). 또다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 [Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146]; US 5362852). 이러한 알데히드는 약물 부분 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 약물 부분 상의 친핵기로는 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
대안적으로, 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 일정 길이의 DNA는 컨쥬게이트의 목적하는 특성을 파괴시키지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 격리되거나 또는 서로 인접해 있는 컨쥬게이트의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 컨쥬게이션시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 다음, 청소제를 사용하여 결합되지 않은 컨쥬게이트를 순환물로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)와 컨쥬게이션되는 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
항체 (Ab)-MC-MMAE는 하기와 같이 본원에 제공된 임의의 항체와 MC-MMAE의 컨쥬게이션에 의해 제조될 수 있다. pH 8.0의 50O mM 붕산나트륨 및 500 mM 염화나트륨에 용해된 항체를 과량의 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 처리한다. 37℃에서 약 30분 동안 인큐베이션한 후, 완충액을 세파덱스(Sephadex) G25 수지 상에서의 용출에 의해 교환하고, 1 mM DTPA를 갖는 PBS로 용리한다. 용액의 280 nm에서의 흡광도로부터의 환원된 항체 농도, 및 DTNB (위스콘신주 밀워키에 소재하는 알드리치(Aldrich))와 반응시키고, 412 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 티올 농도를 측정함으로써, 티올/Ab 값을 조사한다. PBS에 용해된 환원된 항체를 얼음 상에서 냉각시킨다. DMSO에 용해된 약물 링커 시약인 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 즉 MC-MMAE를 아세토니트릴 및 물로 공지된 농도로 희석하고, PBS 중 냉각된 환원된 항체 2H9에 첨가한다. 1시간 후, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응을 켄칭하고, 임의의 미반응된 항체 티올기를 캡핑한다. 반응 혼합물을 원심분리 한외여과에 의해 농축하고, 2H9-MC-MMAE를 정제하고, PBS 중 G25 수지를 통해 용출시켜 탈염화하고, 멸균 조건하에서 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 저장을 위해 동결한다.
항체-MC-MMAF는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 본원에 제공된 임의의 항체와 MC-MMAF의 컨쥬게이션에 의해 제조될 수 있다.
항체-MC-val-cit-PAB-MMAE는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 본원에 제공된 임의의 항체와 MC-val-cit-PAB-MMAE의 컨쥬게이션에 의해 제조된다.
항체-MC-val-cit-PAB-MMAF는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 본원에 제공된 임의의 항체와 MC-val-cit-PAB-MMAF의 컨쥬게이션에 의해 제조된다.
항체-SMCC-DM1은 하기와 같이 본원에 제공된 임의의 항체와 SMCC-DM1의 컨쥬게이션에 의해 제조된다. 정제된 항체를 (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC, 피어스 바이오테크놀로지, 인크(Pierce Biotechnology, Inc))로 유도체화시켜 SMCC 링커를 도입한다. 구체적으로, 항체를 pH 6.5의 5O mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA 20 mg/mL에서 7.5 몰 당량의 SMCC (DMSO 중 20 mM, 6.7 mg/mL)로 처리한다. 주위 온도에서 아르곤하에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 6.5의 5O mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA로 평형화된 세파덱스 G25 컬럼을 통해 여과한다. 항체 함유 분획을 풀링하고, 분석한다.
이렇게 제조된 항체-SMCC를 pH 6.5의 5O mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA로 최종 농도 약 10 mg/mL로 희석하고, 디메틸아세트아미드 중 DM1의 10 mM 용액으로 처리한다. 반응물을 주위 온도에서 아르곤하에서 16.5시간 동안 교반한다. 컨쥬게이션 반응 혼합물을 pH 6.5의 1 x PBS를 갖는 세파덱스 G25 겔 여과 컬럼 (1.5 x 4.9 cm)을 통해 여과한다. DM1 약물 대 항체 비율 (p)은 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 바와 같이 약 2 내지 5일 수 있다.
Ab-SPP-DM1은 하기와 같이 본원에 제공된 임의의 항체와 SPP-DM1의 컨쥬게이션에 의해 제조된다. 정제된 항체를 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트로 유도체화시켜 디티오피리딜기를 도입한다. NaCl (50 mM) 및 EDTA (1 mM)를 함 유하는 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.5) 44.7 mL 중 항체 (376.0 mg, 8 mg/mL)를 SPP (2.3 mL 에탄올 중 5.3 몰 당량)로 처리한다. 주위 온도에서 아르곤하에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 반응 혼합물을 35 mM 시트르산나트륨, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA로 평형화된 세파덱스 G25 컬럼을 통해 겔 여과한다. 항체 함유 분획을 풀링하고, 분석한다. 항체의 변형 정도를 상기 기재된 바와 같이 측정한다.
항체-SPP-Py (약 10 μM의 방출가능한 2-티오피리딘기)를 pH 6.5의 상기 35 mM 시트르산나트륨 완충액으로 최종 농도 약 2.5 mg/mL로 희석한다. 그 후, 3.0 mM 디메틸아세트아미드 (DMA, 최종 반응 혼합물 중 3％ v/v) 중 DM1 (1.7 당량, 17 μM)을 항체 용액에 첨가한다. 반응을 주위 온도에서 아르곤하에서 약 20시간 동안 진행시킨다. 반응물을 pH 6.5의 35 mM 시트르산나트륨, 154 mM NaCl으로 평형화된 세파크릴(Sephacryl) S300 겔 여과 컬럼 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) 상에 로딩한다. 유속은 약 5.0 mL/분일 수 있으며, 65개 분획 (각각 20.0 mL)이 수집된다. 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 분자당 결합된 DM1 약물 분자의 수 (p')를 측정하며, 이는 2H9 항체당 약 2 내지 4 DM1 약물 잔기일 수 있다.
항체-BMPEO-DM1은 하기와 같이 본원에 제공된 임의의 항체와 BMPEO-DM1의 컨쥬게이션에 의해 제조된다. 항체를 비스-말레이미도 시약 BM(PEO)4 (피어스 케미칼(Pierce Chemical))에 의해 변형시켜, 항체의 표면 상의 미반응된 말레이미도기를 이탈시킨다. 이는 BM(PEO)4를 50％ 에탄올/물 혼합물에 10 mM의 농도로 용해시키고, 10배 몰 과량을 인산염 완충 염수 중 항체를 함유하는 용액에 대략 1.6 mg/mL (10 마이크로몰)의 농도로 첨가하고, 이를 1시간 동안 반응시켜 항체-링커 중간체인 2H9-BMPEO를 형성함으로써 달성될 수 있다. 과량의 BM(PEO)4를 150 mM NaCl 완충액을 갖는 pH 6의 30 mM 시트레이트에서의 겔 여과 (하이트랩(HiTrap) 컬럼, 파마시아(Pharmacia))에 의해 제거한다. 대략 10배 몰 과량의 DM1을 디메틸 아세트아미드 (DMA)에 용해시키고, 2H9-BMPEO 중간체에 첨가한다. 디메틸 포름아미드 (DMF)를 또한 사용하여 약물 잔기 시약을 용해시킬 수 있다. 반응 혼합물을 밤새 반응시킨 후, PBS 상으로의 겔 여과 또는 투석으로 미반응된 DM1을 제거한다. PBS 중 S200 컬럼 상의 겔 여과를 이용하여 고분자량 응집체를 제거하고, 정제된 2H9-BMPEO-DM1을 제공한다.
D. 핵산을 포함하는 c-met 길항제
일 측면에서, 본 발명의 c-met 길항제는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 핵산 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 억제성/간섭 RNA (예를 들어, 소 억제성/간섭 RNA (siRNA)), 또는 압타머를 포함할 수 있다. 상기 핵산 조절자의 스크리닝, 확인 및 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, siRNA는 소분자 또는 항체와 같은 전통적인 길항제가 실패한 유전자 발현의 조절이 가능한 것으로 입증되었다 (문헌 [Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)]). 시험관내 합성되면, 길이가 30 뉴클레오티드 미만 (예를 들어, 약 15 내지 25, 17 내지 20, 18 내지 20, 19 내지 20, 또는 21 내지 23 뉴클레오티드)인 이중 가닥 RNA는 간섭 RNA (iRNA)로서 작용할 수 있으며, 유전자 발현을 특이적으로 억제할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Fire A., Trends in Genetics (1999), 391:806-810]; 미국 특허 출원 제09/821832호, 제09/215257호; 미국 특허 제6,506,559호; PCT/US01/10188; 유럽 출원 제00126325호 참조). 상기 iRNA는 그의 표적 RNA의 분해를 매개함으로써 적어도 부분적으로 작용하는 것으로 믿어진다. 그러나, 이는 길이가 30 뉴클레오티드 미만이기 때문에, 이는 세포 항바이러스 방어 메카니즘을 촉발하지 않는다. 이러한 메카니즘은 인테퍼론 생성, 및 숙주 세포 단백질 합성의 일반적인 정지를 포함한다. 실제로, siRNA를 합성한 후 DNA 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터를 형질감염시키고, siRNA를 높은 수준으로 발현하도록 할 수 있다. siRNA 발현의 높은 수준은 세포에서 생성되는 단백질의 양을 "넉다운" 또는 유의하게 감소시키는데 사용되며, 따라서, 이는 단백질의 과발현이 병리학적 장애와 관련되는 것으로 믿어지는 세포적 환경에 유용하다.
압타머는 과안정화된 c-met 단백질과 같은 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 분자이다. 압터머의 생성 및 치료적 용도는 당업계에 널리 수립되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,475,096호, 및 연령-관련된 황반 퇴행의 치료를 위한 마쿠젠(Macugen)(등록상표) (뉴욕에 소재하는 아이테크(Eyetech))의 치료적 효능을 참조한다.
안티-센스 기술은 당업계에 널리 수립되어 있다. 상기 기술에 관한 추가의 상세사항은 하기에 제공된다.
E. 제약 제제
본 발명에 따라 사용되는 c-met 길항제의 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 c-met 길항제를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 조성물을 혼합함으로써 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]) 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류; 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 트윈(TWEEN)(상표명), 플루로닉스(PLURONICS)(상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 들 수 있다.
본원의 제제는 또한 치료될 특정 증상에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적인 영향을 주지 않는 보충적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도되는 목적에 유효한 양으로 조합물 내에 존재한다. 예를 들어, c-met 길항제 이외에, 추가의 조절자, 예를 들어 과안정화된 c-met 단백질 상의 상이한 에피토프에 결합하는 제2 항체, 또는 일부 다른 표적에 대한 항체를 하나의 제제에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제, 항-호르몬제 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도되는 목적에 유효한 양으로 조합물에 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서, 또는 매크로에멀젼에서, 코아세르베이션 기술에 의해, 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방형 제제는 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 매트릭스가 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태인 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 루프론 데포(LUPRON DEPOT)(상표명) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 들 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
F. 본 발명의 c-met 길항제를 사용한 치료
본 발명의 c-met 길항제는 다양한 비-치료적 적용을 갖는다. 길항제는 과안정화된 c-met-발현 질환의 스테이징 또는 검출 (예를 들어, 방사성영상)에 유용할 수 있다. 항체, 올리고펩티드 및 압타머는 또한 세포로부터의 과안정화된 c-met의 침전 또는 면역침전, 시험관내 과안정화된 c-met의 검출 및 정량, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯, 및 세포의 집단에서의 세포성 사건의 조절에 유용할 수 있다.
현재, 암의 단계에 따라, 암 치료는 하기 치료 중 하나 또는 조합을 포함한다: 암성 조직을 제거하는 수술, 방사선 요법 및 화학요법. c-met 길항제를 포함하는 요법은 화학요법의 독성 및 부작용에 잘 견디지 못하는 노인 환자, 및 방사성 요법이 제한된 유용성을 갖는 전이성 질환에 특히 바람직할 수 있다. 치료적 적용을 위해, c-met 길항제는 단독으로, 또는 예를 들어 호르몬, 항안지오겐, 또는 방사성표지된 화합물과의, 또는 수술, 냉동요법 및/또는 방사성요법과의 조합 요법으로 사용될 수 있다. c-met 길항제는 다른 형태의 통상적인 요법과 함께, 예비- 또는 후-통상적인 요법과 연속적으로 투여될 수 있다. 탁소테레(등록상표) (도세탁셀), 탁솔(등록상표) (파클리탁셀), 에스트라무스틴 및 미토크산트론과 같은 화학요법 약물은 암 치료에, 특히 매우 위험한 환자에 사용된다. c-met 길항제는 일반적으로 치료적 유효 투여량의 화학요법제와 함께 투여될 것이다. 또다른 실시양태에서, c-met 길항제는 화학요법제, 예를 들어 파클리탁셀로부터 초래되는 부작용을 감소시키는 화학요법과 함께 투여된다. 문헌 [The Physicians' Desk Reference (PDR)]에는 다양한 암의 치료에 사용된 상기 작용제의 투여량이 개시되어 있다. 치료적으로 유효한 상기 상술된 화학요법제의 투여량 처방 및 투여량은 치료될 특정 암, 질환의 정도, 및 당업자인 의사에게 익숙한 다른 인자에 의존할 것이며, 의사에 의해 결정될 수 있다.
c-met 길항제는 예를 들어 볼루스로서 정맥내 투여와 같은 공지된 방법에 따라, 또는 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 윤활막내, 수막강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.
다른 치료 처방은 c-met 길항제의 투여와 조합될 수 있다. 조합된 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 이용한 공동-투여, 및 임의의 순서의 연속적 투여를 포함하며, 바람직하게는 활성제 둘다 (또는 전부)가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 있다. 바람직하게는, 이러한 조합된 요법은 상승적 치료 효과 및/또는 원하지 않는 부작용의 감소를 초래한다.
또한, c-met 길항제의 투여를, 특정 병리학적 상태와 관련된 또다른 항원에 대해 지정된 치료제의 투여와 조합하는 것이 바람직할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 치료적 처치 방법은 상이한 화학요법제의 칵테일의 공동-투여를 비롯한, c-met 길항제 분자 및 1종 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제의 조합된 투여를 포함한다. 화학요법제로는 에스트라무스틴 포스페이 트, 프레드니무스틴, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 시클로포스파미드, 히드록시우레아 및 히드록시우레아탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라시클린 항생제를 들 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여량 스케줄은 제조자의 지시서에 따라, 또는 당업자에 의해 경험적으로 결정된 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여량 스케줄은 또한 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다.
c-met 길항제는 항-호르몬 화합물; 예를 들어, 항-에스트로겐 화합물, 예를 들어 타목시펜; 항-프로게스테론, 예를 들어 오나프리스톤 (EP 616 812 참조); 또는 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드와, 이러한 분자에 대해 공지된 투여량으로 조합될 수 있다. 치료될 암이 안드로겐 비의존성 암일 경우, 환자는 항-안드로겐 요법에 이전에 적용되었을 수 있고, 암이 안드로겐 비의존성이 된 후, c-met 길항제가 환자에게 투여될 수 있다.
때때로, 또한 (요법과 관련된 심근 부전을 예방하거나 감소시키기 위해) 심장보호제, 또는 1종 이상의 사이토킨을 환자에게 공동-투여하는 것이 유익할 수 있다. 상기 치료 처방 이외에, 환자는 c-met 길항제 요법 전에, 동시에, 또는 후에, 암 세포의 외과적 제거 및/또는 방사선 요법에 적용될 수 있다. 임의의 상기 공동-투여되는 작용제에 적합한 투여량은 본원에 사용되는 것이며, 작용제 및 c-met 길항제의 조합된 작용 (상승작용)에 기인하여 감소될 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 투여량 및 투여 방식은 공지된 범주에 따라 의사에 의해 선택될 것이다. c-met 길항제의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료될 질환의 종류, 질환의 중증도 및 과정, c-met 길항제가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상적 내력, 및 c-met 길항제에 대한 반응성, 및 참여하는 의사의 결정에 의존할 것이다. c-met 길항제는 적합하게는 1회로, 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 일 실시양태에서, c-met 길항제는 정맥내 주입 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 질환의 종류 및 중증도에 따라, 예를 들어 하나 이상의 개별 투여에 의해서든, 연속 주입에 의해서든, 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg 체중 (예를 들어, 약 0.1 내지 15 mg/kg/투여량)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 투여량 처방은 c-met 길항제 항체의 약 4 mg/kg의 초기 로딩 투여량을 투여한 후, 약 2 mg/kg의 주 1회 유지 투여량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 투여량 처방도 유용할 수 있다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg, 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 상태에 따라, 치료는 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 유지된다. 상기 요법의 진행은 통상적인 방법 및 분석에 의해, 그리고 의사 또는 다른 당업자에게 공지된 범주에 기초하여 용이하게 모니터링될 수 있다.
환자에게 폴리펩티드 조절자 (예를 들어, 폴리펩티드, 항체 등)를 투여하는 것과 별개로, 본 발명은 유전자 요법에 의한 조절자의 투여를 고려한다. 이러한 c-met 길항제를 포함하는/코딩하는 핵산의 투여는 "치료적 유효량의 c-met 길항제를 투여하는" 발현에 의해 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성하는 유전자 요법의 용도에 관한, 1996년 3월 14일자로 공개된 WO 96/07321을 참조한다.
핵산 (임의로, 벡터에 함유됨)을 환자 세포 내로 도입하는, 생체내 및 생체외의 2가지 주요한 접근법이 있다. 생체내 전달을 위해, 핵산은 통상적으로 c-met 길항제가 요구되는 부위에서 환자에게 직접적으로 주사된다. 생체외 치료를 위해, 환자의 세포를 제거하고, 핵산을 상기 단리된 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 직접적으로 투여하거나, 또는 예를 들어 환자에게 이식된 다공성 막 내에 캡슐화시킨다 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 핵산을 생존가능한 세포 내로 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 기술은 핵산이 의도되는 숙주의 세포 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 배양된 세포 내로 전달되는지 여부에 따라 다양하다. 포유동물 세포 내로의 핵산의 시험관내 전달에 적합한 기술은 리포좀의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 친전 방법 등을 포함한다. 유전자의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
일 실시양태에서, 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 I 바이러스, 또는 아데노-관련된 바이러스) 및 지질-기초 시스템 (유전자의 지질-매개된 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Choi임)을 사용한 형질감염을 포함한다. 현재 공지된 제조 및 유전자 요법 프로토콜의 검토를 위해, 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한, WO 93/25673 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다.
본 발명의 c-met 길항제 항체는 본원에서 "항체"의 정의에 포함되는 여러가 지 형태일 수 있다. 따라서, 항체는 전장 또는 비손상 항체, 항체 단편, 천연 서열 항체 또는 아미노산 변이체, 인간화, 키메라 또는 융합 항체, 및 그의 기능적 단편을 포함한다.
본 발명은 c-met 길항제 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 조성물은 화학요법제를 비롯한 세포독성제 또는 성장 억제제와 같은 다른 치료제와 조합된 c-met 길항제를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 c-met 길항제 및 담체를 포함하는 제제를 제공한다. 일 실시양태에서, 제제는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 치료 제제이다.
G. 제조품 및 키트
본 발명의 또다른 실시양태는 c-met 길항제를 이용한 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 제조품은 용기, 및 상기 용기 상에 또는 그와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 들 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 상태의 치료에 유효한 조성물을 가지며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 1종 이상의 활성제는 본 발명의 c-met 길항제이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 특정 장애를 치료하는데 유용함을 지시한다. 또한, 제조품은 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 비롯한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적에 유용한 키트가 또한 제공된다. 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 과안정화된 c-met의 시험관내 검출 및 정량화를 위한 본 발명의 c-met 길항제를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조품에 대해, 키트는 용기, 및 용기 상에 또는 용기에 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 용기는 1종 이상의 본 발명의 c-met 길항제를 포함하는 조성물을 갖는다. 예를 들어 희석제 및 완충제, 대조군 항체를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물의 설명, 뿐만 아니라 의도되는 시험관내 또는 검출 용도를 위한 지시서를 제공할 수 있다.
H. 폴리펩티드, 핵산 및 항체-특이적 형태를 포함하는 c-met 길항제 및 적용
일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 내인성 과안정화된 c-met-코딩 핵산에 결합할 수 있는 단일-가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 과안정화된 c-met DNA의 코딩 영역의 적어도 단편을 포함한다. 이러한 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14 내지 30개 뉴클레오티드를 포함한다. 소정 단백질을 코딩하는 cDNA 서열에 기초하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력은 예를 들어 문헌 [Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988)] 및 [van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988)]에 기재되어 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에의 결합은 이중나선의 증대된 분해, 전사 또는 번역의 미성숙 종결을 비롯한 몇몇 수단 중 하나에 의해, 또는 다른 수단에 의해, 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중나선의 형성을 초래한다. 이러한 방법은 본 발명에 포함된다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 과안정화된 c-met 단백질의 발현을 차단하는데 사용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 골격 (또는 WO 91/06629에 기재된 것과 같은 다른 당 결합)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이러한 당 결합은 내인성 뉴클레아제에 내성이 있다. 이러한 내성 당 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정하지만 (즉, 효소적 분해를 제한할 수 있지만), 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.
안티센스 결합에 바람직한 유전자내 부위는, 유전자의 오픈 리딩 프레임 (OFR)의 번역 개시/시작 코돈 (5'-AUG/5'-ATG) 또는 종결/정지 코돈 (5'-UAA, 5'-UAG 및 5-UGA/5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA)을 혼입하는 영역을 포함한다. 상기 영역은 번역 개시 또는 종결 코돈으로부터의 양 방향 (즉, 5' 또는 3')에서의 약 25 내지 약 50개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 부분을 지칭한다. 안티센스 결합을 위한 다른 예시적인 영역은 인트론; 엑손; 인트론-엑손 연접부; 번역 개시 코돈과 번역 종결 코돈 사이의 영역인 오픈 리딩 프레임 (ORF) 또는 "코딩 영역"; 5'-5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA의 5'-모스트 잔기에 결합된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함하며, 5' 캡 구조 자체 뿐만 아니라 캡에 인접한 첫번째 50개 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 5' 캡; 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향에 있는 mRNA의 부분이며, 따라서 mRNA의 5' 캡 부위와 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드, 또는 상기 유전자 상의 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 비번역된 영역 (5'UTR); 및 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향에 있는 mRNA의 부분이며, 따라서 mRNA의 번역 종결 코돈과 3' 말단 사이의 뉴클레오티드, 또는 상기 유전자 상의 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 비번역된 영역 (3'UTR)을 포함한다.
과안정화된 c-met 폴리펩티드의 발현을 억제하는데 유용한 안티센스 화합물의 특정 예로는 변형된 골격 또는 비-천연 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드는 골격 내에 인 원자를 보유하는 것, 및 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 명세서의 목적상, 그리고 때때로 당업계에 언급된 바와 같이, 그의 뉴클레오시드간 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 예시적인 변형된 올리고뉴클레오티드 골격으로는 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 예를 들어 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트, 및 통상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 그의 2'-5' 결합된 유사체, 및 3' 대 3', 5' 대 5', 또는 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합이 2' 대 2' 결합인 전환된 극성을 갖는 것들을 들 수 있다. 전환된 극성을 갖는 예시적인 올리고뉴클레오티드는 3'-모스트 뉴클레오티드간 결합에서 단일 3' 대 3' 결합, 즉 비염기성일 수 있는 단일 전환된 뉴클레오시드 잔기 (핵염기는 결실되거나, 그 대신 히드록실기를 가짐)를 포함한다. 다양한 염, 혼합된 염, 및 유리산 형태가 또한 포함된다. 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,194,599호; 제5,565,555호; 제5,527,899호; 제5,721,218호; 제5,672,697호 및 제5,625,050호 (이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 골격의 예는 짧은 쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 짧은 쇄 헤테로방향족 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 결합에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이는 모르폴리노 결합 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 골격; 술피드, 술폭시드 및 술폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 리보아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 술파메이트 골 격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 술포네이트 및 술폰아미드 골격; 아미드 골격을 갖는 것들; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 것들을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 제5,792,608호; 제5,646,269호 및 제5,677,439호 (이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예에서, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 결합, 즉 골격 둘다는 새로운 기로 대체된다. 기본 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 이러한 올리고머성 화합물의 하나인 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵염기는 보유되며, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적 또는 간접적으로 결합된다. RNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호 (이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)를 들 수 있으 나, 이에 제한되지는 않는다. PNA 화합물의 추가의 교시는 문헌 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 발견될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 포스포로티오에이트 골격 및/또는 헤테로원자 골격, 특히 상기 언급된 미국 특허 제5,489,677호에 기재된 바와 같은 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2- [여기서, 천연 포스포디에스테르 골격은 -0-P-O-CH2-로 나타내어짐], 및 상기 언급된 미국 특허 제5,602,240의 아미드 골격을 혼입한다. 추가의 예는 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 치환된 당 잔기를 함유할 수 있다. 예시적인 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: OH; F; O-알킬, S-알킬, 또는 N-알킬; O-알케닐, S-알케닐, 또는 N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치한되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 (여기서, n 및 m은 1 내지 약 10임)가 특히 바람직하다. 다른 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알 카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선시키는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약역학적 특성을 개선시키는 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기. 한 가지 가능한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-0-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 T-MOE로도 공지됨) (문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]), 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 추가의 바람직한 변형은 2'디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 기 (2'-DMAOE로도 공지됨), 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당업계에 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 공지됨), 즉, 2'-0-CH2-O-CH2-N(CH2)를 포함한다.
추가의 변형은 T-히드록실기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 결합됨으로써, 비시클릭 당 잔기를 형성하는, 잠겨진 핵산 (LNA)을 포함한다. 결합은 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 브릿징하는 메틸렌 (-CH2-)n 기 (여기서, n은 1 또는 2임)일 수 있다. LNA 및 그의 제조는 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기재되어 있다.
다른 변형은 2'-메톡시 (2'-0-CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴 (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴 (2'-0-CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포 함한다. 2'-변형은 아라비노 (상부) 위치 또는 리보 (하부) 위치에 있을 수 있다. 하나의 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형은 또한 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 또는 또는 2'-5' 결합된 올리고뉴클레오티드 내의 3' 위치, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신 시클로부틸 잔기와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 제5,792,747호; 및 제5,700,920호 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 도입됨)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 (종종 당업계에서 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "비변형된" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기 아데노신 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예를 들어 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3 또는 -CH2-C≡CH) 우라실 및 시토신, 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 변형된 핵염기는 트리시클릭 피리미딘, 예를 들어 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4- b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예를 들어 치환된 페녹사진 시티딘 (예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 핵염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클로 대체된 것들, 예를 들어 7-데아자아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함한다. 추가의 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것들, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 및 문헌 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들을 포함한다. 특정한 상기 핵염기는 본 발 명의 올리고머성 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6 내지 1.2℃까지 핵산 이중나선 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며 (문헌 [Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 경우 예시적인 염기 치환이다. 변형된 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제3,687,808호, 및 미국 특허 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,645,985호; 제5,830,653호; 제5,763,588호; 제6,005,096호; 제5,681,941호 및 제5,750,692호 (이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 또다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 수송를 증대시키는 하나 이상의 잔기 또는 컨쥬게이트를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결한 것을 포함한다. 본 발명의 화합물은 일급 또는 이급 히드록실기와 같은 관능기에 공유 결합된 컨쥬게이트기를 포함할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트기는 인터칼레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약역학적 특성을 증대시키는 기, 및 올리고머의 약동학적 특성을 증대시키는 기를 포함한다. 전형적인 컨쥬게이트기는 콜레스테롤, 지질, 양이온 지질, 인지질, 양이온성 인지질, 비오틴, 페나진, 엽산, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 약역학적 특성을 증대시키는 기는 올리고머 수송을 개선시키고/거나, 분해에 대한 올리고머 내성을 증대시키고/거나, RNA와의 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 기를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 약동학적 특성을 증대시키는 기는 올리고머 수송, 분포, 대사 또는 배설을 개선시키는 기를 포함한다. 컨쥬게이트 잔기로는 지질 잔기, 예를 들어 콜레스테롤 잔기 (문헌 [Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556]), 콜릭산 (문헌 [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060]), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 (문헌 [Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309]; [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770]), 티오콜레스테롤 (문헌 [Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538]), 지방족 쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (문헌 [Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118]; [Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330]; [Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54]), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654]; [Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 (문헌 [Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973]), 또는 아다만탄 아세트산 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654]), 팔미틸 잔기 (문헌 [Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237]), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 잔기를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 활성 약물 물질, 예를 들어 아스피린, 와르파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요오도벤조산, 플루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 술파 약물, 항박테리아제 또는 항생제에 컨쥬게이션될 수 있다. 올리고뉴클레오티드-약물 컨쥬게이트 및 그의 제조는 미국 특허 출원 제09/334,130호 (1999년 6월 15일자로 출원됨) 및 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제 5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호 (이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
소정 화합물 내의 모든 위치는 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 하나 초과의 상기언급된 변형은 단일 화합물에 또는 심지어 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오시드에 혼입될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 안티센스 화합물을 포함한다. 본 발명의 내용에서, "키메라" 안티센스 화합물 또는 "키메라"는 각각이 하나 이상의 단량체 단위, 즉 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우 뉴클레오티드로 이루어진 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 함유하는 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 수송, 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도를 올리고뉴클레오티드에 부여하도록 올리고뉴클레오티드가 변형된 하나 이상의 영역을 함유한다. 올리고뉴클레오티드의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 기능할 수 있다. 예로서, RNase H는 RNA:DNA 이중나선의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 초래함으로써, 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드의 효능을 크게 증대시킨다. 결과적으로, 필적할만한 결과는 종종 동일한 표적 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드에 비해, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용되는 경우, 보다 짧은 올리고뉴클레오티드에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기 기 재된 바와 같은 2개 이상의 올리고뉴클레오티드의 복합체 구조, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체로서 형성될 수 있다. 예시적인 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 뉴클레아제 내성을 부여하는 하나 이상의 2' 변형된 당 (바람직하게는, 2'-0-(CH2)2-0-CH3), 및 RNase H 활성을 부여하는 4개 이상의 연속성 2'-H 당을 갖는 영역을 혼입한다. 이러한 화합물은 또한 당업계에서 하이브리드 또는 가프머(gapmer)로 지칭되었다. 예시적인 가프머는 4개 이상의 연속성 2'-H 당을 갖는 하나 이상의 영역에 의해 분리된 3'-말단 및 5'-말단에 2' 변형된 당 (바람직하게는, 2'-0-(CH2)2-0-CH3)의 영역을 가지며, 포스포로티오에이트 골격 결합을 혼입할 수 있다. 이러한 하이브리드 구조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 도입됨)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라 사용되는 안티센스 화합물은 편리하게 및 통상적으로 널리 공지된 고상 합성 기술을 통해 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) (캘리포니아주 포스터 시티)를 비롯한 몇몇 판매자에 의해 판매된다. 당업계에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단은 부가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 유사한 기술을 이 용하여 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것은 널리 공지되어 있다. 본 발명의 화합물은 또한 수송, 분포 및/또는 흡수를 보조하기 위한, 예를 들어 리포좀, 수용체 표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제제로서, 다른 분자, 분자 구조, 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 캡슐화되거나, 컨쥬게이션되거나, 다르게는 결합될 수 있다. 이러한 수송, 분포 및/또는 흡수 보조 제제의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,158호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 제5,580,575호; 및 제5,595,756호 (이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예는 WO 90/10048에 기재된 것과 같은, 유기 잔기, 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 증가시키는 다른 잔기, 예를 들어 폴리-(L-리신)에 공유 결합된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 엘리프티신과 같은 인터칼레이팅제, 및 알킬화제 또는 금속 착물은 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착되어, 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변형시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 CaPO4-매개된 DNA 형질감염, 전기천공을 비롯한 임의의 유전자 전달 방법에 의해, 또는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 이용함으로써, 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 예시적인 절차에서, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 적합한 레트로바이러스 벡터 내로 삽입된다. 표적 핵산 서열을 함유하는 세포는 생체내 또는 생체외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉된다. 적합한 레트로바이러스 벡터로는 뮤린 레트로바이러스 M-MuLV로부터 유도된 것, N2 (M-MuLV로부터 유도된 레트로바이러스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C로 명칭화된 이중 카피 벡터 (WO 90/13641 참조)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 WO 91/04753에 기재된 바와 같이, 리간드 결합 분자와의 컨쥬게이트의 형성에 의해, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 리간드 결합 분자로는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 사이토킨, 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 다른 리간드를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 리간드 결합 분자의 컨쥬게이션은 바람직하게는 그의 상응하는 분자 또는 수용체에 결합하는 리간드 결합 분자의 능력을 실질적으로 간섭하지 않거나, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 세포 내로 컨쥬게이션된 형태의 유입을 차단하지 않는다.
대안적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WO 90/10448에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 복합체의 형성에 의해, 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 바람직하게는 내인성 리파제에 의해 세포 내에서 해리된다.
안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 일반적으로 길이가 약 5 뉴클레오티드 이상이며, 대안적으로 길이가 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000 뉴클레오티드 이상이며, 상기 내용에서, "약"이라는 용어는 언급된 뉴클레오티드 서열 길이에, 참조된 길이의 10％를 가감한 것을 의미한다.
안티센스 RNA 및 DNA는 생체내에서 특정 유전자의 발현을 차단하는 치료제로서 사용될 수 있다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포막에 의한 그의 제한된 수송에 의해 유발된 그의 낮은 세포내 농도에도 불구하고, 억제제로서 작용하는 세포 내로 유입될 수 있음이 이미 밝혀졌다 (문헌 [Zamecnik et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986)]). 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 그의 음으로 하전된 포스포디에스테르기를 비하전된 기로 치환함으로써, 그의 흡수 를 증대시키도록 변형될 수 있다.
핵산을 생존가능한 세포 내로 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 기술은 핵산이 의도되는 숙주의 세포 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 배양된 세포 내로 전달되는지 여부에 따라 다양하다. 포유동물 세포 내로의 핵산의 시험관내 전달에 적합한 기술은 리포좀의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 친전 방법 등을 포함한다. 현재 바람직한 생체내 유전자 전달 기술은 바이러스 (전형적으로, 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염, 및 바이러스 외피 단백질-리포좀 매개된 형질감염 (문헌 [Dzau et al.. Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)])을 포함한다. 일부 상황에서, 표적 세포를 표적화하는 작용제, 예를 들어 세포 표면 막 단백질에 대해 특이적인 항체 또는 표적 세포, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용될 경우, 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은, 예를 들어 특정 세포 종류에 대해 향성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환에서 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 세포내 편재화를 표적화하며 세포내 반감기를 증대시키는 단백질은 표적화 및/또는 수송을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입의 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 의해 기재되었다. 유전자 제조 및 유전자 요법 프로토콜의 검토를 위해서는, 문헌 [Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)]을 참조한다.
본 발명의 c-met 길항제 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 유형화에 진단적으로 사용될 수 있으며, 과안정화된 c-met 폴리펩티드는 또다른 조직에 비해 한 조직에서, 바람직하게는 동일한 조직 유형의 정상 조직에 비해 질환에 걸린 조직에서 차등적으로 발현될 수 있다.
본 발명은 과안정화된 c-met를 조절하는 화합물을 확인하는 화합물의 스크리닝 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보에 대한 스크리닝 분석은 과안정화된 c-met 폴리펩티드와 결합되거나 복합체화되는, 또는 다르게는 과안정화된 c-met 폴리펩티드와 다른 세포 단백질의 상호작용을 간섭하는, 예를 들어 과안정화된 세포로부터의 c-met 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 확인하기 위해 설계된다.
분석은 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석, 및 세포-기초 분석을 비롯한, 당업계에 널리 특성화된 다양한 형식으로 수행될 수 있다.
길항제에 대한 모든 분석은 상기 2가지 성분이 상호작용하는데 충분한 조건하에서와 시간 동안, 약물 후보를 과안정화된 c-met 폴리펩티드와 접촉시킨다는 점에서 공통적이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합이며, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 단리되거나 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 과안정화된 c-met 폴리펩티드 또는 약물 후보는 공유 또는 비-공유 부착에 의해 고체상, 예를 들어 미세역가판 상에 고정된다. 비-공유 부착은 일반적으로 고체 표면을 과안정화된 c-met 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 달성된다. 대안적으로, 고정될 과안정화된 c-met 폴리펩티드에 대해 특이적인 고정된 항체, 예를 들어 모노클로날 항체를 사 용하여 이를 고체 표면에 부착할 수 있다. 분석은 검출가능한 표지에 의해 표지화될 수 있는 비-고정된 성분을, 고정된 성분, 예를 들어 부착되는 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 종료될 경우, 비-반응된 성분을 예를 들어 세척에 의해 제거하고, 고체 표면 상에 부착된 복합체를 검출한다. 원래 비-고정된 성분이 검출가능한 표지를 가질 경우, 표면 상에 고정된 표지의 검출은 복합체화가 일어났음을 지시한다. 원래 비-고정된 성분이 표지를 갖지 않을 경우, 복합체화는 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 이용함으로써 검출될 수 있다.
후보 화합물이 과안정화된 c-met 폴리펩티드와 상호작용하지만, 이에 결합하지 않을 경우, 과안정화된 c-met와의 그의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 널리 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 이러한 분석은 가교, 공동-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동-정제와 같은 전통적인 접근법을 포함한다. 또한, 문헌 [Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sd. USA. 89: 5789- 5793 (1991)]에 개시된 바와 같이, 단백질-단백질 상호작용은 필즈(Fields) 및 공동-연구자에 의해 기재된 효모-기초 유전적 시스템을 이용함으로써 모니터링될 수 있다 (문헌 [Fields and Song, Nature (London). 340:245-246 (1989)]; [Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9578- 9582 (1991)]). 효모 GAL4와 같은 많은 전사 활성화제는 2개의 물리적으로 별개의 모듈 도메인으로 이루어지는데, 하나는 DNA-결합 도메인으로서 작용하고, 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로서 기능한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로, "2-하이브리드 시스템"으로 지칭됨)은 이러한 특성의 이점을 가지며, 2가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합된 것이고, 또다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된 것이다. GAL4-활성화된 프로모터의 제어하에서의 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의존한다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 유색 기질로 검출된다. 2-하이브리드 기술을 이용한 2가지 특이적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용의 확인을 위한 완전한 키트 (매치메이커(MATCHMAKER)(상표명))는 클론텍(Clontech)으로부터 시판된다. 상기 시스템은 또한 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 매핑할 뿐만 아니라 상기 상호작용에 중요한 아미노산 잔기를 조준하기 위해 확장될 수 있다.
과안정화된 c-met 및 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 간섭하는 화합물은 하기와 같이 시험될 수 있다: 통상적으로, 과안정화된 c-met 및 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을, 2가지 생성물의 상호작용 및 결합을 가능하게 하는 조건하에서와 시간 동안 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응을 시험 화합물의 부재 또는 존재하에서 가동시킨다. 또한, 양성 대조군으로서 기능하는 위약을 제3 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링한다. 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서가 아니라 대조군 반응(물)에서의 복합체의 형성은, 시험 화합물이 시험 화합 물 및 그의 반응 상대의 상호작용을 간섭함을 지시한다.
길항제에 대해 분석하기 위해, 특정 활성에 대해 스크리닝될 화합물을 과안정화된 c-met를 발현하는 세포에 첨가할 수 있으며, 당해 환성을 억제하는 화합물의 능력은 화합물이 과안정화된 c-met 폴리펩티드에 대한 길항제임을 지시한다. 과안정화된 c-met 폴리펩티드는 방사성활성에 의해서와 같이 표지될 수 있으며, 다라서 세포 상에 존재하는 과안정화된 c-met 폴리펩티드 분자는 잠재적인 길항제의 효능을 측정하는데 사용될 수 있다.
잠재적인 과안정화된 c-met 길항제는 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자가, 표적화된 mRNA에 혼성화되고 단백질 번역을 방지함으로써, mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 하는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구조물이다. 안티센스 기술은 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어하는데 사용될 수 있으며, 이들 방법 둘다는 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에의 결합에 기초한다. 예를 들어, 성숙한 과안정화된 c-met 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분은 길이가 약 10 내지 40 염기쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용될 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 영역에 상보적이도록 설계되며 (삼중 나선 - 문헌 [Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979)]; [Cooney et al., Science, 241:456 (1988)]; [Dervan et al., Science. 251:1360 (1991)] 참조), 그에 의해 과안정화된 c-met 폴리펩티드의 전사 및 생성이 방지된다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 mRNA에 생체내에서 혼성화되거나, mRNA 분자의 과안정화된 c-met 폴리펩티드로의 번역을 차단한다 (문헌 [Antisense - Okano, Neurochem., 56:560 (1991)]; [Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)]). 상기 기재된 올리고뉴클레오티드는 또한 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 과안정화된 c-met 폴리펩티드의 생성을 억제하도록, 세포에 전달될 수 있다. 안티센스 DNA가 사용될 경우, 번역-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 내지 +10 위치로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보성 표적 RNA에 대한 서열-특이적 혼성화에 의해 작용한 후, 핵내에서 절단된다. 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지된 기술에 의해 확인될 수 있다. 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994)], 및 PCT 공개 WO 97/33551 (1997년 9월 18일자로 공개됨)을 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중-나선 형성에서 핵산 분자는 단일-가닥화되고 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 염기 조성물은, 이것이 후그스틴(Hoogsteen) 염기-쌍 규칙을 통해 삼중-나선 형성을 촉진시키도록 설계되며, 이는 일반적으로 이중나선의 하나의 가닥 상에 퓨린 또는 피리미딘의 크기조절가능한 스트레치를 필요로 한다. 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 PCT 공개 WO 97/33551, 상기 문헌을 참조한다.
상기 소분자는 임의의 하나 이상의 상기 논의된 스크리닝 분석 및/또는 당업 자에게 널리 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인될 수 있다.
일 실시양태에서, 내재화 항체가 바람직하다. 항체는 특정 특징을 가질 수 있거나, 항체의 세포 내로의 전달을 증대시키는 이러한 특징을 갖도록 변형될 수 있다. 이를 달성하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 또다른 실시양태에서, 항체는 항체를 발현할 수 있는 핵산을 표적 세포 내로 도입함으로써, 표적 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,703,019호; 제6,329,173호; 및 PCT 공개 제2003/077945호를 참조한다. 리포펙션 또는 리포좀은 또한 항체를 세포 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용될 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marasco et al, Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 90:7889-7893 (1993)]을 참조한다.
조절자 폴리펩티드의 표적 세포 내로의 유입은 당업계에 공지된 방법에 의해 증대될 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 또는 안텐나페디아(Antennapedia) 호메오도메인 단백질로부터 유도된 것과 같은 특정 서열은 세포막을 통한 이종 단백질을 직접적으로 효과적으로 수송할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329]을 참조한다.
본 발명의 c-met 길항제 항체는 c-met 활성을 간섭할 수 있는 임의의 항체일 수 있다. 일부 특정 예는
(a) (i) 서열 A1-A17을 포함하는 HVR-L1 (여기서, A1-A17은 KSSQSLLYTSSQKNYLA (서열 1)임),
(ii) 서열 B1-B7을 포함하는 HVR-L2 (여기서, B1-B7은 WASTRES (서열 2)임),
(iii) 서열 C1-C9를 포함하는 HVR-L3 (여기서, C1-C9는 QQYYAYPWT (서열 3)임),
(iv) 서열 D1-D10을 포함하는 HVR-H1 (여기서, D1-D10은 GYTFTSYWLH (서열 4)임),
(v) 서열 E1-E18을 포함하는 HVR-H2 (여기서, E1-E18은 GMIDPSNSDTRFNPNFKD (서열 5)임), 및
(vi) 서열 F1-F11을 포함하는 HVR-H3 (여기서, F1-F11은 XYGSYVSPLDY (서열 6)이고, X는 R이 아님)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 초가변 영역 (HVR) 서열; 및
(b) 하나 이상의 변이체 HVR (여기서, 변이체 HVR 서열은 서열 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로 나타내어진 하나 이상의 잔기의 변형을 포함함)을 포함하는 항-c-met 항체를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L1은 서열 1의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L2는 서열 2의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L3은 서열 3의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H1은 서열 4의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H2는 서열 5의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H3은 서열 6의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, HVR-H3 은 TYGSYVSPLDY (서열 7)를 포함한다. 일 실시양태에서, HVR-H3은 SYGSYVSPLDY (서열 8)를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 서열을 (본원에 기재된 바와 같은 조합으로) 포함하는 본 발명의 항체는 인간화 또는 인간 항체이다.
일 측면에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항체를 제공하며, 각각의 HVR은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어지고, 서열 1은 HVR-L1에 상응하고, 서열 2는 HVR-L2에 상응하고, 서열 3은 HVR-L3에 상응하고, 서열 4는 HVR-H1에 상응하고, 서열 5는 HVR-H2에 상응하고, 서열 6, 7 또는 8은 HVR-H3에 상응한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4, 5 및 7을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR- H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4, 5 및 8을 포함한다.
본 발명의 항체에서 변이체 HVR은 HVR 내의 하나 이상의 잔기의 변형을 가질 수 있다. 일 실시양태에서, HVR-L2 변이체는 하기 위치의 임의의 조합으로 1 내지 5 (1, 2, 3, 4 또는 5)개의 치환을 포함한다: B1 (M 또는 L), B2 (P, T, G 또는 S), B3 (N, G, R 또는 T), B4 (I, N 또는 F), B5 (P, I, L 또는 G), B6 (A, D, T 또는 V) 및 B7 (R, I, M 또는 G). 일 실시양태에서, HVR-H1 변이체는 하기 위치의 임의의 조합으로 1 내지 5 (1, 2, 3, 4 또는 5)개의 치환을 포함한다: D3 (N, P, L, S, A, I), D5 (I, S 또는 Y), D6 (G, D, T, K, R), D7 (F, H, R, S, T 또는 V) 및 D9 (M 또는 V). 일 실시양태에서, HVR-H2 변이체는 하기 위치의 임의의 조합으로 1 내지 4 (1, 2, 3 또는 4)개의 치환을 포함한다: E7 (Y), E9 (I), E10 (T), E14 (T 또는 Q), E15 (D, K, S, T 또는 V), E16 (L), E17 (E, H, N 또는 D) 및 E18 (Y, E 또는 H). 일 실시양태에서, HVR-H3 변이체는 하기 위치의 임의의 조합으로 1 내지 5 (1, 2, 3, 4 또는 5)개의 치환을 포함한다: F1 (T, S), F3 (R, S, H, T, A, K), F4 (G), F6 (R, F, M, T, E, K, A, L, W), F7 (L, I, T, R, K, V), F8 (S, A), F10 (Y, N) 및 F11 (Q, S, H, F). 각각의 위치 뒤의 괄호 안의 문자(들)는 당업자에게 명백할 것인 예시적인 치환 (즉, 대체) 아미노산을 나타내며, 본원에 기재된 내용에서 치환 아미노산으로서의 다른 아미노산의 적합성은 당업계에 공지된 및/또는 본원에 기재된 기술을 이용하여 통상적으로 평가될 수 있다. 일 실시양태에서, HVR-L1은 서열 1의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-H3에서 F1은 T이다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-H3에서 F1은 S이다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-H3에서 F3은 R이다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-H3에서 F3은 S이다. 변이체 HVR-H3에서 F7은 T이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H3을 포함하며, F1은 T 또는 S이고, F3은 R 또는 S이고, F7은 T이다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H3을 포함하며, F1은 T이고, F3은 R이고, F7은 T이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H3을 포함하며, F1은 S이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H3을 포함하며, F1은 T이고, F3은 R이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H3을 포함하며, F1은 S이고, F3은 R이고, F7은 T이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H3을 포함하며, F1은 T이고, F3은 S이고, F7은 T이고, F8은 S이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H3을 포함하며, F1은 T이고, F3은 S이고, F7은 T이고, F8은 A이다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 HVR-H3 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 및 HVR-H2를 추가로 포함하며, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4 및 5로 나타내어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에서 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-L2를 포함하며, B6은 V이다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 HVR-L2 항체는 HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하며, 각각은 순서대로 서열 1, 3, 4, 5 및 6로 나타내어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 HVR-L2 항체는 HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하며, 각각은 순서대로 서열 1, 3, 4, 5 및 7로 나타내어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 HVR-L2 항체는 HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하며, 각각은 순서대로 서열 1, 3, 4, 5 및 8로 나타내어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 하위군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H2를 포함하며, E14는 T이고, E15는 K이고, E17은 E이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변이체 HVR-H2를 포함하며, E17은 E이다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 HVR-H3 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 및 HVR-H3을 추가로 포함하며, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4 및 6로 나타내어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 HVR-H2 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 및 HVR-H3을 추가로 포함하며, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4 및 7로 나타내어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 HVR-H2 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 및 HVR-H3을 추가로 포함하며, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4 및 8로 나타내어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 하위군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료될 특정 증상에 필요에 따라 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적인 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 조성물은 그의 기능을 증대시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 사이토킨, 화학요법제 또는 성장-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도되는 목적에 유효한 양으로 조합물 내에 존재한다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 기재가 주어졌으므로 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다. 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
재료 및 방법
세포 배양
세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC), 암 치료 및 진단 (NCI) 부 종양 저장소, 또는 일본 보건 과학 기구로부터 수득되었다. 293 및 Rat 1A를 제외한 모든 세포주는 10％ FBS (시그마(Sigma)), 페니실린/스트렙토마이신 (지브코(GIBCO)) 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640에 보관되었다. 293 및 Rat 1A 세포는 기재된 바와 같이 보충된 고 글루코스 DMEM에 보관되었다.
플라스미드 및 안정한 세포주
전장 Met WT-V5/His는 이전에 기재되었다 (문헌 [Kong-Beltran et al, 2004]). Met WT-V5/His는 퀵체인지(QuikChange) 부위-지정 돌연변이유발 (스트라타진)을 통해 제조자의 지시서에 따라 이전에 기재된 (문헌 [Peschard et al, 2001]) 프라이머를 이용한 Y1003F 점 돌연변이를 생성하는 주형으로서 기능한다. 엑손 14는 2개의 프라이머 세트를 이용하여 퀵체인지 부위-지정 돌연변이유발을 통해 Met 엑손 14에 플랭킹된 새로운 NheI 제한 부위를 생성한 후, NheI으로 소화시키고, 플라스미드를 재라이게이션시킴으로써 결실되었다. 돌연변이를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. Met 안정성 세포주를 Rat 1A 세포에서 생성하기 위해, pRK5TKneo, Met WT-V5/His, Met Y1003F-V5/His, 또는 Met ΔEx14-V5/His DNA 각각 10 ㎍을 KpnI으로 소화시키고, 정제하였다 (퀴아젠). Rat 1A 세포를 리포펙타민 2000 (인비트로젠)을 통해 제조자의 지시서에 따라 6-웰 플레이트 내에 각각의 DNA 4 ㎍으로 형질감염시켰다. 다음날, 세포를 트립신화하고, 10 cm 플레이트 내로 씨딩하였다. 24시간 후, 500 ㎍/mL G418 (시그마)을 첨가하였다. 선별을 대략 2주 동안 계속한 후, 3D6 항체를 이용한 FACS에 의해 Met-양성 클론을 선별하고 (미국 특허 제6,099,841호 참조) 및 PE 염색하였다. 웰당 하나의 세포를 적하하였다. 확장된 클론을 용해시키고, V5 항체 (인비트로젠)으로 면역블롯팅을 통해 Met에 대해 시험하였다.
면역침전 및 웨스턴 블롯 분석
동결된 조직 표본에서의 단백질 발현 분석을 위해, 조직 (약 100 mg)을 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마), 포스파타제 억제제 칵테일 I 및 II (시그마), 50 mM 플루오르화나트륨, 및 2 mM 나트륨 오르토바나데이트를 함유하는 세포 용해 완충액 (셀 시그날링(Cell Signaling) 200 ㎕에서 폴리트론(Polytron)(등록상표) 균질화기 (키네마티카(Kinematica))를 이용하여 균질화시켰다. 샘플을 4℃에서 1시 간 동안 부드럽게 흔들어 추가로 용해시킨 후, 단백질 A 세파로스 패스트 플로우(Protein A Sepharose Fast Flow) (아머샴(Amersham)) 및 단백질 G 세파로스 패스트 플로우 (아머샴)의 혼합물로 예비안정화시켰다. 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 시약 (바이오래드(BioRad))을 이용하여 측정하였다. 이어서, 단백질 (20 ㎍)을 SDS-PAGE에 의해 용해시키고, 니트로셀룰로스 막에 옮기고, Met (DL-21, 업스테이트(Upstate) 또는 β-액틴 (I-19, 산타 크루즈(Santa Cruz)) 항체로 면역블롯팅하였다. 단백질을 개선된 화학발광 (ECL 플러스, 아머샴)에 의해 육안관찰하였다. 형질감염된 Met 및 Cb1과 관련된 공동면역침전 연구를 위해, 각각의 Met 구조물 3 ㎍ 및 Cbl-flag 3 ㎍을 FuGENE6 (로슈(Roche))을 이용하여 293 세포 내로 형질감염시켰다. 다음날, 세포를 100 ng/mL rhuHGF로 30분 동안 자극시킨 후, 완전 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (로슈) 및 포스파타제 억제제 칵테일 II를 함유하는 1％ NP40 용해 완충액 [50 mM 트리스(Tris) (pH 7.45), 150 mM NaCl, 및 1％ 노니데트(Nonidet) 40]을 이용하여 수거하였다. 세포 데브리스를 원심분리하고, 용해물 1 mg을 4℃에서 밤새 회전시킨 후, 단백질 G 또는 A 비드와 함께 2시간 동안 인큐베이션함으로써, 1.5 ㎕ V5 (인비트로젠) 또는 2 ㎍ Cb1 (C-15, 산타 크루즈) 항체로 면역침전시켰다. 20 mM DTT (시그마)를 함유하는 2X 샘플 완충액 (인비트로젠)을 첨가하고, 샘플을 5분 동안 비등시켰다. 샘플을 4 내지 12％ 트리스-글리신 겔 (인비트로젠) 상에 로딩하고, 0.45 ㎛ 니트로셀룰로스 막 (인비트로젠)에 옮겼다. 막을 5％ 비-지방 우유로 1시간 동안 차단한 후, V5, flag 폴리클로날 (시그마), 또는 P-Tyr (4G10, 업스테이트) 항체로 면역블롯팅하였다. 내인성 Cb1 을 함유하는 결합 연구를 위해, 293 세포를 FuGENE6을 이용하여 10 cm 플레이트당 각각의 DNA 구조물 6 ㎍으로 형질감염시켰다. 다음날, 세포를 100 ng/mL rhuHGF로 30분 동안 자극시킨 후, 수거하였다. 샘플을 2 ㎍ Cb1 또는 1.5 ㎍ V5 항체로 면역침전시킨 후, V5 또는 Cb1 항체로 면역블롯팅하였다. V5 면역침전된 블롯을 리스토어(Restore) 웨스턴 블롯 제거 완충액 (피어스(Pierce))을 이용하여 제거하고, P-Met Y1003 (바이오소스(Biosource)), P-Met Y1234/Y12345 (셀 시그날링), P-Met Y1349 (셀 시그날링), 또는 P-Met 1365 (바이오소스)로 리프로빙하였다. 분해 연구를 위해, 293 세포를 6-웰 플레이트에서 FuGENE6을 이용하여 pRK5TKneo, Met WT-V5/His, Met Y1003F-V5/His, 또는 MetΔExl4-V5/His 돌연변이체 0.25 ㎍로 형질감염시켰다. 다음날, 세포를 10 ㎍/mL 시클로헥시미드 (시그마)로 지시된 시간 동안 처리하였다. 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 막을 V5 또는 액틴 항체로 면역블롯팅하였다.
유비퀴틴화 분석
293 세포를 FuGENE6을 이용하여 필요할 경우 샘플당 총 DNA 6 ㎍을 갖도록 3 ㎍ Met 구조물, 2 ㎍ Cb1-flag, 1 ㎍ HA-유비퀴틴, 및 pRK5TKneo 또는 pFlag5a 빈 벡터로 형질감염시켰다. 다음날, 세포를 25 μM MG-132 (칼바이오켐(Calbiochem))로 4시간 동안 처리한 후, 수거하였다. 세포를 억제제, 25 μM MG-132, 및 10 mM N-에틸말레이미드를 함유하는 1％ NP-40 용해 완충액에 용해시켰다. 용해물 (1 mg)을 1.5 ㎍ V5 항체로 면역침전시키고, 유비퀴틴 (P4D1, 산타 크루즈) 항체로 면역블롯팅한 후, 제거하고, V5 항체로 리프로빙하였다.
세포 신호전달 및 억제 연구
H226, H596, H358, 또는 Rat 1A-Met 안정성 클론에서 연장된 신호전달을 조사하기 위해, 세포를 PBS로 세정한 후, 0.5％ BSA, 2 mM 글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 또는 DMEM 배지에서 1시간 동안 혈청-고갈시켰다. rhuHGF 또는 작동제성 항-Met 모노클로날 항체인 3D6 (제넨테크)을 혈청-무함유 배지에 10분 동안 첨가하였다. 그 후, 세포의 단층을 PBS로 세정하고, 지시된 시간에서 추출될 때까지 혈청-무함유 배지와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 PBS로 1회 세정하고, 1X DTT (인비트로젠)를 함유하는 1X SDS 샘플 완충액으로 용해시키고, 간단히 초음파처리하고, 5분 동안 비등시켰다. Met 수용체 억제를 분석하기 위해, 항-Met 5D5 항체를 갖는 혈청-고갈된 세포를 지시된 농도에서 30분 동안 혈청-무함유 배지에 첨가하였다. 그 후, 세포를 100 ng/mL rhuHGF로 15분 동안 (Met 활성화 분석을 위해) 또는 30분 동안 (Akt 및 MAPK 분석을 위해) 자극시키고, DTT를 함유하는 1X SDS 샘플 완충액으로 용해시켰다. 비등된 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, P-Met (Y1230/Y1234/Y1235, 바이오소스), P-Met (Y1234/Y1235), Met (DL-21), P-MAPK (E10, 셀 시그날링), P-MAPK (셀 시그날링), P-Akt (587F11, 셀 시그날링), 또는 Akt (셀 시그날링)로 면역블롯팅하였다. 사용된 이차 항체는 항-토끼-알렉사플루오로680 컨쥬게이션되거나 (몰리큘라 프로브(Molecular Probe), 항-마우스-IRDye800 컨쥬게이되었다 (로크랜드 이뮤노케미칼스(Rockland Immunochemicals)). 니트로셀룰로스 막 상으로 옮겨진 단백질을 오딧세이(Odyssey) (리코어(LiCor))를 제조자의 권고된 웨스턴 블롯팅 지시서에 따라 적 외선 스캔에 의해 검출한 후, 정량화하였다. 세포 생존성 분석을 위해, 세포를 0.5％ FBS를 함유하는 RPMI (분석 배지)에서 96-웰 플레이트에 웰당 약 1 x 104개 세포로 밤새 3회 플레이팅한 후, 50 ng/mL rhuHGF를 함유하는 분석 배지로 자극시켰다. rhuHGF가 없는 분석 배지를 비자극된 웰에 첨가하였다. 72시간 후, 세포 생존성을 셀타이터-글로(Celltiter-Glo) 발광 세포 생존성 분석 (프로메가(Promega))를 이용하여 측정하였다. HGF-자극된 배양물의 평균 세포 생존성 단위를 비자극된 배양물의 평균 세포 생존성 단위로 나누어서, 자극 지수를 측정하였다. 평균 자극 지수는 3회의 개별 실험의 최소값으로부터 측정하였다. 성장 억제 분석을 HGF 자극의 시간에 첨가된 OA-5D5 또는 대조군 Ig로 유사한 방식으로 수행하였다.
생체내 이종이식 모델
암컷 무흉선 누드 마우스 (찰스 리버(Charles River), 홀리스터)를 Met WT, Met Y1003F, Met ΔEx14를 발현하는 Rat 1A 안정성 세포주, 또는 벡터 대조군의 풀 (5백만개 세포/마우스, n=5)로 피하 접종하였다. 인간 Met만을 인식하는 항-Met 3D6 작동제 항체 10 mg/kg을 Met 수용체 자극을 위해 복막내로 매주 1회 투여하였다. 종양을 디지털 캘리퍼스를 이용하여 매주 2회 측정하고, 종양 부피를 하기 방정식을 이용하여 계산하였다: 종양 부피 (㎣) = (π/6)(A)(B)(B). A = 가장 긴 폭; B = 가장 짧은 폭.
결과 및 논의
본 발명자들은 원발성 종양을 나타내는 폐 및 결장 종양 표본, 종양 세포주, 및 원발성 종양 이종이식 모델의 패널로부터의 Met의 모든 코딩 엑손을 시퀀싱하였다. 본 발명자들의 시퀀싱 수행으로, 본 발명자들은 엑손 14에 플랭킹된 인트론성 영역에서 원발성 폐 종양 표본에서의 체세포성 이종접합성 돌연변이를 확인하였다 (도 1). 상기 돌연변이는 동일한 개체로부터의 비-신생물 폐 조직에서 종양-특이적이거나, 확인되지 않았다 (데이타는 도시되지 않음). 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포주인 H596에서, 본 발명자들은 3p 스플라이스 공여자 부위에서 동종접합성 점 돌연변이를 확인하였다. 디뉴클레오티드 스플라이스 부위 컨센서스 및 엑손 14의 상류 폴리피리미딘 구역 내의 돌연변이의 존재는, 엑손 13 및 엑손 15가 상에 잔류한다는 관찰과 조합으로, 엑손 14가 결실된 잠재적인 Met 전사체가 여전히 기능성 Met 단백질을 생성할 수 있음을 시사하였다. 이에 초점을 맞추기 위해, 본 발명자들은 먼저 돌연변이체 종양 및 세포주로부터 Met RNA의 RT-PCR 증폭을 수행하였다. 모든 상기 인트론성 돌연변이는 야생형에 비해 보다 짧은 길이의 전사체를 초래하였으며, 이는 엑손 14의 결실과 일치한다 (데이타는 도시되지 않음). 본 발명자들은 또한 RT-PCR 생성물을 시퀀싱함으로써 엑손 14의 부재를 확인하였으며, 본 발명자들의 결과는 Met의 아미노산 L964 내지 D1010을 제거하는 프레임내 결실을 나타내었다. 흥미롭게도, 수용체의 돌연변이체 형태는 종양 샘플이 엑손 14 결실에 대해 이종접합성임에도 불구하고 가장 우세하게 발현된 형태이며 (데이타는 도시되지 않음), 이는 변이체 전사체의 차등적인 발현을 나타낸다. 이는 말단절단된 Met 단백질의 우세한 발현을 입증하는 웨스턴 블롯팅에 의해 추가로 확인되었다. 상기 인트론성 돌연변이를 갖는 표본은 시퀀싱된 관련된 엑손에서 K-ras, B-ras, EGFR 및 HER2에 대해 야생형이었다 (데이타는 도시되지 않음). 이와 함께, 상기 결과는 상기 Met 인트론성 돌연변이의 우세한 성질을 나타낸다. 흥미롭게도, 엑손 14가 결실된 Met의 스플라이스 변이체는 정상 마우스 조직에서 이전에 보고되었지만, 종양형성에 대한 기능적 결과는 명백하지 않았다 (20, 21). 그러나, 본 발명자들은 시험된 임의의 정상 인간 폐 표본에서 상기 스플라이스 변이체의 발현을 검출하지 않았다 (데이타는 도시되지 않음). 정상 인간 조직에서 상기 스플라이스 변이체의 결실은 이전에 논의된 바와 같이 추가로 구현되었다 (21). 엑손 14가 결실된 스플라이스 변이체를 포함하는 cDNA는 원발성 인간 NSCLC 표본에서 보고되었지만, 스플라이싱 결함을 매개하는데 있어서의 체세포성 돌연변이유발의 역할은 평가되지 않았으며, 존재할 경우 발현될 수 있는 임의의 돌연변이체 c-met의 기능적 결과도 평가되지 않았다 (22). 스플라이스 변이체를 포함하는 핵산이 암 세포에서 통상적이지 않기 때문에, 보고된 스플라이스 변이체의 기능적 관련성은 공지되지 않았다.
Met의 막근접 도메인 (L964-D1010) 내의 엑손 14의 47개의 아미노산 결실은 Cb1 결합 및 활성화된 수용체의 하류 조절에 필요한 Y1003 인산화 부위를 제거한다. 이전의 연구는 Y1003F 돌연변이가 Cb1 결합을 제거하며, Met 활성화를 유지함을 밝혀내었다 (6). 본 발명자들은 먼저 공동면역침전 연구에 의해, 종양-관련된 돌연변이체 Met의 Cb1 결합의 소실을 확인하였다. Cb1-flag를 갖는 상기 Met 구조물을 293 세포 내로 형질감염시킴으로써, 293 세포를 야생형 Met (Met WT), 돌연변이체 Met Y1003F (Met Y1003F), 및 엑손 14 결실된 Met (Met ΔEx14)로 형질감염시 켰다. 본 발명자들은 WT Met에 비해 Met ΔEx14에의 Cb1 결합이 감소되었음을 관찰하였으며 (도 2A), Met Y1003F에의 Cb1 결합의 소실을 확인하였다 (6). Met WT 및 Met 돌연변이체에 의한 Cb1 티로신 인산화는 동등하였으며, 이는 Met 돌연변이가 전체 Cb1 인산화를 변경하지 않았음을 지시한다. 본 발명자들의 데이타는 또한 Met WT가 내인성 Cb1과 공동면역침전되지만, Met ΔEx14와는 공동면역침전되지 않음을 지시하였으며 (도 2B), 이는 Met 및 Cb1의 관찰된 공동-발현과 일치한다. 또한, 본 발명자들은 Met 수용체 활성화에 필요한 티로신 인산화 부위를 조사하였다. 본 발명자들의 데이타는 Y1234/Y1235, Y1349, 및 Y1365의 인산화가 Met WT 및 Met ΔEx14 둘다에서 유지됨을 지시한다 (도 2B). 예상된 바와 같이, Met WT와 대조적으로 Met ΔEx14에서 Y1003 인산화의 소실이 관찰되었다 (도 2B). Cb1 E3-리가제 활성이 수용체의 유비퀴틴-매개된 분해를 용이하게 하는 것으로 보고되어 있기 때문에 (6, 8), 유비퀴틴화 분석을 Met WT, Met Y1003F 및 Met ΔEx14로 형질감염된 세포 상에서 수행하였다. Met ΔEx14 및 Met Y1003F 둘다는 Cb1의 존재하에서 Met WT에 비해 약화된 유비퀴틴화를 나타낸다 (도 2C). 본 발명자들은 Y1234/Y1235의 인산화가 모든 Met 구조물에서 유지되며, 포스포-Y1003은 상기와 같이 돌연변이체에서 결실되었음을 확인하였다 (데이타는 도시되지 않음). 흥미롭게도, 덜 프로세싱된 Met WT는 돌연변이체에 비해 Cb1 공동-발현 또는 Met WT 단독의 발현으로 검출되었다 (도 2C). 상기 관찰은 Cb1에 결합하는 Met WT가 Met ΔEx14과 대조적으로 차등적으로 유비퀴틴화되고 분해됨을 시사한다 (6, 24). Met ΔEx14의 감소된 유비퀴틴화가 수용체 하향 조절을 유발하는지 여부를 측정하기 위해, 세포를 Met 구조물로 형질감염시키고, 시클로헥시미드로 처리하여 새로운 단백질 합성을 차단하였다. Met ΔEx14는 Met WT에 비해 시간 경과에 따라 지연된 수용체 하향 조절을 나타내었다 (도 2D). Met Y1003F 돌연변이체는 유사한 결과를 나타내었다 (데이타는 도시되지 않음). 유의하게, 엑손 14 스플라이스 변이체를 갖는 원발성 종양은 전사 수준에서 Met의 동등한 수준을 발현함에도 불구하고, 환자-적합화된 정상 인접 폐 조직 및 Met 야생형 선암종에 비해, Met 단백질의 상승된 수준을 나타내었다 (데이타는 도시되지 않음). 또한, 상기 엑손 14-결실된 환자 종양에서의 Met 발현의 면역조직화학 분석은 모든 신생물 세포에서 강력한 막성 발현을 나타내었으며, 반대로, Met WT 및 정상 인접 조직을 갖는 종양에서는 산발성 Met 발현이 관찰된다 (데이타는 도시되지 않음).
Met ΔEx14의 감소된 하향 조절이 HGF 자극시 하류 세포 신호전달에 영향을 주는지 여부를 측정하기 위해, Met, Akt, 및 MAPK 인산화 수준을 엑손 14 결실을 갖는 NSCLC 종양 세포주 또는 Met WT (H226 및 H358)에서 조사하였다. H596 세포는 HGF 자극후 3시간까지 포스포-Met 및 포스포-MAPK 수준 둘다가 유지된 반면, Met WT 수용체를 발현한 H226 및 H358 세포주 둘다는 시간 경과에 따라 인산화의 지속적인 소실을 나타내었다 (도 2E). 흥미롭게도, 포스포-Akt 수준은 HGF에 반응하는 초기 활성화에도 불구하고, 시간 경과에 따라 지속되지 않았다. Stat3 및 Stat5의 인산화를 또한 조사하였지만, 상승된 활성화를 나타내지 않았다 (데이타는 도시되지 않음). 상기 종양 세포주는 상이한 유전적 배경으로부터 유도되었기 때문에, 본 발명자들은 비교용으로 빈 벡터, Met WT, 및 Met ΔEx14로 Rat 1A 세포에 서 안정한 세포주를 생성하였다. Rat 1A Met ΔEx14는 재조합 인간 수용체 단독을 활성화시키는 Met 작동제 3D6으로 자극시 Met WT에 비해 연장된 MAPK 인산화를 입증하였지만, Akt 활성화는 그렇지 않았으며 (25) (도 2F, 5), 이는 NSCLC 종양 세포주로부터 수득된 데이타를 보강한다.
지속된 Met 및 MAPK 신호전달의 결과는 28개의 추가의 NSCLC 세포주의 패널의 내용에서, 엑손 14 결실된 Met를 갖는 H596 세포의 HGF-매개된 증식에서 조사되었다 (도 3A). H596 세포는 NSCLC 세포주의 상기 패널에서 HGF 자극시 가장 큰 증식 가능성을 일관되게 나타내었다. 더욱이, Met 결실의 생체내 성장을 평가하기 위해, 마우스를 Rat 1A Met ΔEx14 안정성 세포주로 접종하고, 종양을 형성하는 능력에 대해 Rat 1A Met WT와 비교하였다. Met WT에 비해 Met ΔEx14 및 Met Y1003F Rat 1A 세포 둘다에서 증가된 세포 증식이 관찰되었다 (데이타는 도시되지 않음). 3D6으로 자극시, Rat 1A Met ΔEx14 세포는 Rat 1A Met WT에 비해 매우 종양형성성이었으며, 보다 큰 종양이 발달되었다 (도 3B). 상기 결과는 엑손 14 결실된 Met에 대한 증대된 발암 역할과 일치한다.
Met 길항제가 Met 결실을 갖는 종양 세포를 억제하는지 여부를 측정하기 위해, H596 세포를 공지된 항-c-met 억제제 (항-Met OA-5D5 (26)로도 공지됨)로 처리하였다. 항-Met OA-5D5는 3개의 이뮤노글로불린 폴리펩티드 - 가변 도메인 서열을 포함하는 비손상 경쇄 및 중쇄 (도 9에 나타냄), 및 전장 중쇄의 Fc 부분과 이량체화된 Fc 부분을 포함하는 N-말단 절단된 중쇄를 포함하는 항체이다. 항-Met OA-5D5의 구축 및 생성은 또한 PCT 특허 출원 제PCT/US2004/042619호 (2004년 12월 17일 자로 출원됨)에 기재되어 있다. Met 및 MAPK 인산화는 항-Met OA-5D5의 첨가에 따라 투여량-의존성 방식으로 감소되었다 (도 4A, 6). 또한, OA-5D5로 H596 세포를 처리하면 세포 증식의 투여량-의존성 억제가 리간드-의존성 방식으로 초래된다 (도 4B). 상기 결과는 Met 길항제로 과안정화된 c-met (예를 들어, 막근접의 결실을 나타내는 돌연변이체 c-met)를 발현하는 암을 표적화하는 것을 포함하는 치료 접근법을 뒷받침한다.
종양 세포에서의 비정상적 스플라이싱의 고유한 성질에도 불구하고, 종양-관련된 스플라이스 변이체가, 사실상 세포내에서 보다 느리게 분해되며 증가된 발암 활성을 나타내는 돌연변이체 수용체 단백질을 코딩한다는 것은 다소 예상되지 않는다. 본 발명자들의 데이타는 예를 들어 체세포성 돌연변이유발에 의해 유도된 스플라이싱 사건이 종양에 의해 발암 유전자 생성물을 활성화시키는데 이용됨을 강력히 시사한다. 본 연구에서, 스플라이세오좀의 집합에 차등적으로 영향을 주며 엑손 14를 선택적으로 배제하는 다양한 종류의 인트론성 돌연변이의 확인은 Met에서의 이러한 돌연변이유발 사건의 증거를 강조한다. 흥미롭게도, 막근접 도메인 내의 결실 및 삽입은 명백히 수용체 형태 및 키나제 도메인의 활성화를 변경시킴으로써 특정 수용체 티로신 키나제의 활성화에 있어서 역할을 한다 (문헌 [Hubbard, S Nature Rev Mol Cell Bio, 5:464, 2004]). KTT (문헌 [Hirota et al Science 279:577, 1998]) 및 PDGFRα (문헌 [Heinrich, MC. et al Science 299:708, 2003])의 막근접 결실은 위장관 기질 종양에서 확인되었으며; 막근접 내의 내부 탠덤 반복은 급성 골수양 백혈병에서 FLT3을 활성화시킨다 (문헌 [Nakao, M et al Leukemia 10:1911, 1996]). 그러나, 본원의 막근접 결실에 대한 본 발명자들의 확인은 수용체 하향 조절을 지연시키고, 따라서 암 세포에서 유의하게 증대된 안정성을 갖는 돌연변이체 c-met 단백질을 초래하는 Met 활성화의 완전히 상이한 메카니즘을 특성화한다. 상기 데이타는 수용체 하향 조절을 유도하는 돌연변이가 발암성 활성화를 유발하고 종양 발달을 유도할 수 있음을 시사한다.
참고문헌의 부분적 목록
Figure 112007076213617-PCT00006
<110> GENENTECH, INC. 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Claims (12)

  1. 과안정화된 c-met 폴리펩티드가, 그의 분해가 야생형 c-met에 비해 감소되도록 엑손 14의 적어도 일부의 결실을 포함하며, 과안정화된 c-met 폴리펩티드가 c-met 신호전달 활성을 갖는, 인간 과안정화된 c-met 폴리펩티드의 c-met 신호전달 활성을 억제하는 길항제.
  2. 제1항에 있어서, 길항제가 인간 c-met의 엑손 13 및 엑손 15의 프레임내 스플라이싱에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 항체인 길항제.
  3. 제1항에 있어서, 과안정화된 c-met 폴리펩티드의 엑손 14의 적어도 일부가 결실된 것인 길항제.
  4. 제1항에 있어서, 길항제가, 엑손 13이 엑손 15에 스플라이싱된 c-met의 스플라이스 변이체를 코딩하는 핵산 분자로부터의 발현을 선호적으로 억제하는 억제성 RNA인 길항제.
  5. 제1항에 있어서, 길항제에 의한 c-met 신호전달 활성의 억제가 과안정화된 c-met 단백질의 세포성 분해의 증대를 포함하는 것인 길항제.
  6. 제1항에 있어서, 길항제가 독소에 결합된 것인 길항제.
  7. 제1항에 있어서, 길항제가 야생형 c-met 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는 것인 길항제.
  8. 제1항에 있어서, 길항제가 야생형 c-met 폴리펩티드 활성을 실질적으로 억제하지 않는 것인 길항제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 길항제를 대상체에게 투여함으로써 종양을 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서의 종양의 치료 방법.
  10. 제9항에 있어서, 종양이 과안정화된 c-met를 포함하는지가 측정되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 종양이 엑손 14의 적어도 일부의 결실을 포함하는 돌연변이체 c-met를 포함하는지가 측정되는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 방법이 길항제를 수용체 단백질 분해를 유도하는 작용제와 함께 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
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