KR20070116868A

KR20070116868A - ３９데스메톡시라파마이신 및 그 유사체의 의학적 용도

Info

Publication number: KR20070116868A
Application number: KR1020077023041A
Authority: KR
Inventors: 로즈 마리 쉐리단; 밍치앙 장; 매튜 알란 그레고리
Original assignee: 바이오티카 테크놀로지 리미티드
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2007-12-11
Also published as: EP1896018A2; WO2006095173A2; NO20074661L; WO2006095173A3; CA2599547A1; AU2006221774A1

Abstract

본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 의학적 용도에 관한 것이다.

라파마이신

Description

３９데스메톡시라파마이신 및 그 유사체의 의학적 용도{Medical uses of 39-desmethoxyrapamycin and analogues thereof}

라파마이신(시롤리무스)(도 1)은 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) NRRL 5491에 의해 생성되고(Sehgal et al ., 1975; Vezina et al ., 1975; 미국특허 제3,929,992호; 미국특허 제3,993,749호), 파이프콜릭산(pipecolic acid) 락톤에 연결된 1,2,3-트리카르보닐 모이어티를 갖는, 친유성 매크로라이드(macrolide)이다(Paiva et al ., 1991). 본원 발명의 목적을 위해, 라파마이신은 Findlay et al . (1980) 또는 Chemical Abstracts(제11판, Cumulative Index, 1982-1986 p60719CS)의 번호 붙이기 약정보다는 오히려 McAlpine et al . (1991)의 번호 붙이기 약정에 의해 기술된다.

라파마이신은 넓은 생물학적 활성 스펙트럼으로 인하여 유효한 치료적 가치를 갖고 있다(Huang et al ., 2003). 상기 화합물은 세포 생존과 증식을 매개하는 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K)/Akt(단백질 키나제 B) 신호 전달 경로의 세린-트레오닌 키나제 하향(downstream)인, 라파마이신의 포유 동물 표적(mammalian target of rapamycin, mTOR)의 강력한 억제제이다. 이러한 억제 활성은 라파마이신이 이뮤노필린(immunophiiin) FK506 결합 단백질 12(FKBP12)와 결합한 후에 수득된다(Dumont, F. J. and Q. X. Su, 1995). T 세포에서, 라파마이신은 IL-2 수용 체로부터의 신호 보냄과 뒤이어 T 세포의 자가증식을 억제하여, 면역 억제를 한다. 라파마이신은 이식편 거부 반응(graft rejection)을 예방하기 위하여 기관 이식 환자의 치료를 위한 면역 억제제로서 판매되고 있다(Huang et al ., 2003). 면역 억제뿐만 아니라, 라파마이신은 수많은 질환, 예를 들면 암, 재협착과 같은 심장혈관 질환, 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 자가면역성 장애(autoimmune disease), 류마티즘성 관절염, 진균 감염 및 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 헌팅톤 무도병과 같은 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)의 치료에서 강력한 치료 용도를 갖는다.

다양한 질병 상태에서 라파마이신의 유용함에도 불구하고, 라파마이신은 다수의 주요 문제점을 갖고 있다. 첫째로, 이것은 화합물을 세포 외부로 펌프로 퍼내어 라파마이신에 의한 세포막 투과를 좋지 못하게 만드는, 세포막 배출 펌프 P-당단백질(P-glycoprotein, P-gp)의 기질이다(LaPlante et al ., 2002, Crowe et al., 1999). 이것은 투여한 후 화합물의 좋지 못한 흡수를 유도한다. 또한, 암 세포의 다 약제 내성(multi-drug resistance)의 주요 메카니즘은 세포막 배출 펌프를 경유하므로, 라파마이신은 다 약제 내성(multi-drug resistance, MDR) 암 세포에 대해서는 덜 효과적이다. 둘째로, 라파마이신은 시토크롬 P450 효소에 의해 광범위하게 대사된다(Lampen et al ., 1998). 간장에서 첫 번째 통과할 때 손실이 많고, 이것은 또한 라파마이신의 낮은 경구 생체 이용가능성(bioavailability)의 원인이 되기도 한다. 라파마이신의 낮은 생체 이용가능성에서 CYP3A4와 P-gp의 역할은 CYP3A4 및/또는 P-gp 억제제의 투여가 CYP3A4-트랜스펙션된 Caco-2 세포로부터 라파마이신의 배출을 감소시켰고(Cummins et al ., 2004), CYP3A4 억제제의 투여가 라파마이신의 소장 대사를 감소시켰다는(Lampen et al ., 1998) 것을 입증한 연구에서 확인되었다. 라파마이신의 낮은 경구 생체 이용가능성은 개별적인 개인 간에 상당한 변화성을 유발시켜 임상 적용시 일관되지 못한 치료 결과와 어려움을 만들게 한다(Kuhn et al ., 2001 , Crowe et al ., 1999).

따라서, P-gp의 기질이 아니고 대사상으로 더 안정할 수 있어 개선된 생체 이용가능성을 가질 수 있는, 신규 라파마이신-유사 화합물의 개발을 위한 필요성이 있어 왔다. 이러한 화합물은 항암제로서 사용될 때, MDR 암 세포, 특히 P-gp-발현하는(P-gp-expressing) 암 세포에 대해 보다 나은 효능을 가질 수 있다.

분자의 화학적으로 이용가능한 부위를 사용한, 상당한 범위의 합성된 라파마이신 유사체가 보고되었다. 하기 화합물의 설명은 도 1에서 기술된 라파마이신 분자의 번호 붙이기 시스템에 적합하도록 하였다. 유도체화 또는 치환을 위한 분자 내에 있는 화학적으로 이용가능한 부위로는 C40 및 C28 히드록시기(예를 들면, 미국특허 제5,665,772호; 미국특허 제5,362,718호), C39 및 C16 메톡시기(예를 들면, WO 제96/41807호; 미국특허 제5,728,710호), C32, C26 및 C9 케토기(예를 들면, 미국특허 제5,378,836호; 미국특허 제5,138,051호; 미국특허 제5,665,772호)를 포함한다. 트리엔을 목적으로 하여, C17, C19 및/또는 C21에서 수소화반응은 항균 활성을 보유하지만, 비교적 낮은 면역 억제를 산출하였다(예를 들면, 미국특허 제5,391,730호; 미국특허 제5,023,262호). 분자 안정성에 대한 상당한 개선(예를 들면, C32, C40 및/또는 C28에서 옥심의 형성, 미국특허 제5,563,145호, 미국특허 제 5,446,048호), 대사 공격(metabolic attack)에 대한 저항성에 대한 상당한 개선(예를 들면, 미국특허 제5,912,253호), 생체 이용가능성에 대한 상당한 개선(예를 들면, 미국특허 제5,221,670호; 미국특허 제5,955,457호; WO 제98/04279호) 및 프로드럭의 생성(예를 들면, 미국특허 제6,015,815호; 미국특허 제5,432,183호)이 유도체화를 통해 달성되었다.

임상 개발 중에 있는 가장 발전된 라파마이신 유사체 두 가지는 면역 억제 약리 효과를 보여주는 라파마이신의 반-합성 유사체인 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신(RAD001, Certican, 에베롤리무스(everolimus))(Sedrani, R. et al ., 1998; Kirchner et al ., 2000;미국특허 제5,665,772호)과 생체 외(in vitro)에서 세포 성장을 억제하고 생체 내(in vivo)에서 종양 성장을 억제하는 라파마이신의 에스테르인 40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐옥시]라파마이신인 CCI-779 (Wyeth-Ayerst)(Yu et al ., 2001)가 있다. CCI-779는 현재 잠재적인 항암성 약물로서 다양한 임상 시도 중에 있다. 재발성 다형성 아교모세포증(glioblastoma multiforme)이 있는 환자에 대한 CCI-779 단계 II 연구에 관한 최근의 공개 문헌(Chang, et al., 2005)은 이러한 환자들에서 이 약물의 낮은 효능은 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)에서 CCI-779의 좋지 못한 투과 때문일 수 있다고 제안하고 있다. RAD001의 약동력학을 조사한 연구는 라파마이신과 마찬가지로, RAD001이 P-gp의 기질임을 보여주고 있다(Crowe et al ., 1999, LaPlante et al ., 2002).

라파마이신과의 밀접한 구조적 유사성에도 불구하고, 본원 발명의 화합물은 놀랄만할 정도로 다른 약리학 프로파일을 보여준다. 구체적으로, 이들은 상당히 증가된 세포막 투과성과 라파마이신에 비해 감소된 배출을 보여주었고, 이들은 P-gp의 기질이 아니었다. 또한, 39-데스메톡시라파마이신은 라파마이신보다, 다 약제 내성이고 P-gp-발현하는 암 세포 주에 대해 보다 강력한 활성을 보여주었다. 라파마이신과 비교될 때, 39-데스메톡시라파마이신은 NCI 60 세포주 패널(cell line panel)에 대해 상당히 다른 억제 프로파일을 보여준다.

또한, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 임상 중에 있는 선도적 유도체에 비해, 상당히 다른 약동력학 프로파일을 보여주었다. 예상외로, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 혈액 뇌 장벽을 통과하는 증가된 능력을 보여주었고 따라서 뇌에서 개선된 이용가능성을 입증하였다.

따라서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 의학적 용도를 제공하고, 이러한 라파마이신 유사체는 상당히 변경된 약동력학, 혈액 뇌 장벽을 통과하는 개선된 능력, 개선된 대사 안정성(metabolic stability), 개선된 세포막 투과성, 감소된 배출율 및 라파마이신과는 상이한 종양 세포 억제 프로파일을 갖고 있다. 이러한 화합물은 의약에서, 구체적으로는 암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염, 조직이식 거부 반응(transplantation rejection), 이식 편대 숙주 질병(graft vs. host disease), 자가면역성 장애(autoimmune disorder), 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료를 위해 유용하다. 본원 발명은 특히 암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다.

라파마이신은 자기 소모(autophagy)를 촉진한다고 입증되었다(Raught et al., 2001 ). 약화된 자기 소모 또는 자기 소모의 조절 장애는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 무도병 및 광우병(크로이츠펠트-야콥병을 포함함)을 포함하는 수많은 질환과 관련되어 있고, 이것은 이 경로의 조작이 이러한 질환에 있어 도움이 될 수 있음을 제안한다. 최근의 생체 외 연구는 라파마이신의 투여가 트랜스펙션된 COS-7 세포에서 폴리(Q) 및 폴리(A) 확장과 관련되는 응집체의 출현과 세포 사멸을 감소시킬 수 있음을 입증하였다(Ravikumar et al ., 2002). 따라서, 라파마이신이 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있다면, 이러한 결과는 헌팅톤 무도병 및 다른 관련 질환의 치료를 위한 적절한 후보 물질을 만들 수 있음을 나타낸다. 이것은 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있는 라파마이신 유사체의 개발을 위한 필요성이 있음을 제안한다.

미세소관-관련된 단백질 타우(tau)의 과다 인산화반응(hyperphosphorylation)과 이후 세포내 "병변(tangle)"을 생성하는 불용성의 쌍으로 된 나선형 필라멘트로의 응집은 알츠하이머 질환의 전형적인 특징 중 하나이고, 이러한 신경섬유성 병인(neurofibrillary pathology)의 축적과 관련된 신경 세포의 사멸은 인지 저하(cognitive decline)와 밀접하게 관련되어 있다. An et al. (2003)에 의한 최근의 연구는 활성화된 p70 S6 키나제는 알츠하이머 환자의 뇌에서 신경 섬유성 병인과 동시에 분포되어 있고 특히 활성화된 p70 S6 키나제는 병변이 성장하기 전에 신경에서 두드러지게 증가되었음을 입증하였다(An et al ., 2003). 황화 아연의 투여가 p70 S6 키나제의 활성화, 및 정상이고 과다 인산화된 타우의 전체적인 증가된 수준을 만든 생체 외 분석에서, 라파마이신의 세포 전처리는 p70 S6 키나제의 활성이 3배 감소하였고, 정상이고 과다 인산화된 타우의 전체적인 증가된 수준이 상당히 감소하였음을 보여주었다. 따라서, 이러한 결과는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체가 작용 부위에 도달할 수 있다면, 이러한 화합물의 투여가 알츠하이머 질환의 신경섬유성 병인을 감소시키는데 도움이 될 수 있음을 나타낸다.

또한, 라파마이신이 다수의 생체 외 및 생체 내 모델에서 신경돌기 증식(neuritic outgrowth)과 신경 생존을 증가시킨다고 보고되었으며(Avramut and Achim, 2002), 이것은 라파마이신과 그의 유사체가 신경 재생이 상당한 치료적 도움이 될 수 있는 질환을 치료할 때 유용할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이러한 유용성은 화합물이 작용 부위에 도달할 수 있음에 의존하므로, 혈액 뇌 장벽을 통과하는 개선된 능력을 갖는 라파마이신 유사체는 특히 바람직할 것이다.

본원 발명은 구체적으로는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서, 면역 억제의 유도 또는 유지, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염, 조직 이식 거부 반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 신경퇴행성 상태, 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환의 치료를 위한, 의약에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 신규하고 놀랄만한 용도, 구체적으로는 39-데스메톡신의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본원 발명은 암과 B-세포 악성 종양의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 본원 발명은 신경계 질환(neurological disorder) 또는 신경퇴행성 질환의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 보다 바람직한 실시 형태에서, 본원 발명은 뇌 종양의 치료에서, 구체적으로는 다형성 아교모세포증의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 본원 발명의 특정 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다.

발명의 요약

본원 발명은 구체적으로 암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부 반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 신경퇴행성 상태, 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환의 치료, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염의 치료에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 의학적 용도 특히 39-데스메톡시라파마이신의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본원 발명은 암과 B-세포 악성 종양의 치료를 위한 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 암과 B-세포 악성 종양의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도에 관한 것이다. 또한, 본원 발명은 뇌 종양(들) 또는 신경퇴행성 상태의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 뇌 종양(들) 또는 신경퇴행성 상태의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 또한, 본원 발명은 구체적으로 신경퇴행성 상태의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본원 발명은 신경퇴행성 상태의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다.

정의

관사 "하나의(a)"와 "하나의( an )"는 관사의 문법적 객체들 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하도록 본원 명세서에서 사용되었다. 예를 들면, "하나의 유사체"는 한 개의 유사체 또는 한 개 이상의 유사체를 의미한다.

용어 " 자가면역성 장애(들)"가 사용될 때, 이것은 제한 없이 계통성 홍반성 낭창(systemic lupus erythrematosis, SLE), 류마티즘성 관절염, 중증 근무력증 및 다발성 경화증(multiple sclerosis)을 포함한다.

용어 "염증성 질환"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 제한 없이 건선, 피부염, 습진, 지루, 염증성 장 질환(궤양성 대장염과 크론씨병을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아님), 폐 염증(pulmonary inflammation)(천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 급성 호흡 곤란 증, 및 기관지염을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아님), 류마티즘성 관절염 및 눈 포도막염(eye uveitis)을 포함한다.

용어 "암"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 피부 또는 신체 기관, 예를 들면 제한 없이, 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 뇌, 위 또는 장(bowel)에 있는 세포의 악성의 또는 양성의 성장을 지칭한다. 암은 인접하고 있는 조직으로 스며들어 멀리 떨어져 있는 기관, 예를 들면 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 퍼져나가는(전이되는) 경향이 있다. 용어 암이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 제한되지는 않지만, 흑색종, 림프종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종, 및 비만세포종과 같은 전이 종양 세포 형태와, 제한되지는 않지만 직장 암, 전립선암, 작은 세포 폐암(small cell lung cancer)과 작지 않은 세포 폐암(non-small cell lung cancer), 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 아교모세포종, 원발성 간암(primary liver cancer), 및 난소암과 같은 조직 종양의 형태 모두를 포함한다. 또한, 상기 용어는 구체적으로 하기에서 보다 완전하게 기술되는 바와 같이 뇌 종양(들)을 포함한다.

용어 "뇌 종양(들)"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 뇌에서 세포의 악성 또는 양성 성장을 지칭하고, 이것은 원발성 종양과 이차적인(전이성) 종양을 포함한다. 원발성 뇌 종양은 제한되지 않지만, 신경교종(예를 들면, 다형성 아교모세포종, 성상세포종(astrocytoma), 뇌 줄기 신경아교종(brain stem glioma), 뇌실막세포종 및 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma)), 속질모세포종(medulloblastoma), 수막종, 신경초종(또는 청각신경 종양), 두개인두종(craniopharyngioma), 뇌의 배아세포 종양(germ cell tumor of the brain)(예를 들면, 배아종(germinoma)) 또는 송과 부위 종양(pineal region tumor)을 포함한다. 용어 " 뇌 암 "은 또한 상기 질환의 세트를 기술하는데 사용되고, 이 용어들은 본원 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

용어 "B-세포 악성 종양"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia, CLL), 다발성 골수종, 및 비호즈킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)을 포함하는 질환의 무리를 포함한다. 이들은 혈액 및 혈액 형성 기관의 종양 질환이다. 이들은 골수와 면역 시스템의 기능 장애를 일으키고, 이로 인해 숙주가 감염 및 출혈에 매우 민감하도록 만든다.

용어 "혈관 질환"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 제한 없이 과증식성(hyperproliferative) 혈관 질환(예를 들면, 재협착과 혈관 폐색증(vascular occlusion)), 혈관 이식편 죽상 동맥 경화증(graft vascular atherosclerosis), 심장혈관 질환, 뇌혈관 질환 및 말초 혈관 질환(예를 들면, 심장 동맥 질환, 동맥경화증, 죽상 동맥 경화증, 비죽종성(nonatheromatous) 동맥 경화증 또는 혈관 벽 손상)을 포함한다. 또한, 이것은 눈에 있는 혈관의 신생 또는 증식을 포함하는 질환, 특히 맥락막 혈관 신생을 포함하는 질환을 지칭하는데 사용된다.

용어 "신경 재생"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 신경 세포 성장의 촉진을 지칭하고, 신경돌기 증식과 신경 세포의 기능상 회복을 포함한다. 신경 재생이 유효한 치료상 도움이 될 수 있는 질환과 질병으로는 제한 없이, 물리적 손상(예를 들면, 척수 손상 또는 외상성 신경증, 좌골 또는 안면 신경 병변 또는 손상), 또는 질병 상태(예를 들면, 당뇨병)에 의해 유발되었는지에 관계없이, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 무도병, 근위축성 측색 경화증, 3차 신경통, 설인 신경통, 안면 신경 마비, 근육성 이양증, 발작, 진행성 근위축증, 진행성 구형 유전성 근육 위축증(progressive bulbar inherited muscular atrophy), 경추 굳음증(cervical spondylosis), 갈리안 바레 증후군(Gullain-Barre syndrome), 치매, 말초 신경병증(peripheral neuropathies) 및 말초 신경 손상을 포함한다.

용어 "신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태"가 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 신경퇴행성 상태(들), 뇌 종양(들), 뇌의 감염 또는 염증, 및 죽음 또는 신경 또는 신경 교세포 또는 조직의 기능 장애를 일으킬 수 있는 다른 상태를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

용어 "신경퇴행성 상태(들)"가 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 무도병, 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), (눈인두의) 근육성이영양증(muscular dystrophy)(눈인두의 근육성이영양증을 포함), 다발성 경화증, 광우병(예를 들면, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease)(CJD)을 포함), 픽병, 루이 소체 치매(또는 루이 소체 질환) 및/또는 운동 신경원성 질환을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

용어 "혈액 뇌 장벽을 통과하는 의약을 필요로 하는 중추 신경에 영향을 미치는 의학적 상태"가 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태, 및 신경 세포의 의약 사용이 효과적인 치료를 위해 요구되는 소정의 기타 상태를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

용어 "섬유성 질환"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 세포외 기질(extracellular matrix)의 과다 생성과 관련되는 질환을 지칭하고, (제한 없이) 사르코이도시스(sarcoidosis), 켈로이드(keloid), 사구체 신염, 말기 신질환, 간 섬유종(경화증, 알코올성 간 질환 및 지방성 간염(steato-hepatitis)을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아님), 만성 이식 신장병(chronic graft nephropathy), 수술 협착, 혈관병증, 심장 섬유증(cardiac fibrosis), 폐 섬유증(특발성 폐 섬유증과 잠재성 섬유화 폐포염(cryptogenic fibrosing alveolitis)을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아님), 황반 변성, 망막과 유리체의 망막병증, 및 화학치료 또는 방사선으로-유도된 섬유증을 포함한다.

용어 "이식 편대 숙주 질병"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 동종이계(allogeneic) 줄기 세포/골수 이식 후에 관찰되는 합병증을 지칭한다. 이것은 공여자에게서 나온 감염과-싸우는(infection-fighting) 세포가 환자의 신체를 서로 다른 것으로 또는 이종이라고 인식할 때 일어나게 된다. 그런 다음, 이러한 감염과-싸우는 세포는 이들이 감염을 공격하는 것처럼 환자의 신체에 있는 조직을 공격하게 된다. GvHD는 이식한 후 처음 100일 이내에 일어날 때 급성으로 분류되고, 이식하고 100일 이상이 지난 후에 일어나면 만성이라고 분류된다. 통상적으로, 관련되는 조직으로는 간, 위장관, 및 피부를 포함한다. 만성 이식 편대 숙주 질병은 줄기 세포/골수를 이식한 후 환자 중 대략 10-40 퍼센트에서 일어난다.

용어 "생체 이용가능성"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 투여한 후 약물 또는 기타 물질이 흡수되거나 또는 생물학적 활성 부위에서 이용가능하게 되는 정도 또는 비율을 지칭한다. 이러한 특징은 화합물의 용해도, 소화관에서 흡수 비율, 단백질 결합 정도 및 대사 등을 포함하는 수많은 요소에 의존한다. 당해 분야의 당업자에게 익숙한 생체 이용가능성을 위한 다양한 테스트가 본원 명세서에서 기술되어 있다(또한, Trepanier et al ., 1998, Gallant-Haidner et al ., 2000을 참조한다).

용어 "하나 이상의 기존 항암제(들)에 저항성이 있는 암 또는 B-세포 악성 종양"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 하나 이상의 통상적으로 사용되는 치료가 효과가 없는 암 또는 B-세포 악성 종양을 지칭한다. 이러한 암은 정상 세포 대응물(counterpart)(즉, 동일한 기원의 성장 조절된 세포)가 세포 독성, 세포 사멸 또는 세포 정지(즉, 분열하지 않는 상태)의 징후를 보여주는 하나 이상의 종양제의 투여 이후에 생존할 수 있음을 특징으로 한다. 구체적으로, 이것은 MDR 암 또는 B-세포 악성 종양을 포함하고, 구체적인 예는 높은 수준의 P-gp를 발현하는 암 및 B-세포 악성 종양이다. 이러한 저항성이 있는 암 또는 B-세포 악성 종양을 확인하는 것은 의사 또는 기타 유사한 당업자의 능력 및 보통의 활동 범위 내에 있다.

용어 "39- 데스메톡시라파마이신 유사체"가 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 하기 식 (I)에 따른 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭하는데:

상기에서, R₁은 (H,H) 또는 =0를 나타내고, 및 R₂와 R₃은 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH₃을 나타낸다. 또한, 이 화합물은 "본원 발명의 화합물"로 지칭되고, 이 용어는 본원 출원에서 상호 교환적으로 사용된다.

본원 출원에서, 용어 "39- 데스메톡시라파마이신 유사체"는 39-데스메톡시라파마이신 그 자체를 포함한다.

용어 "39- 데스메톡시라파마이신 "이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 R₁이 =O를 나타내고 R₂와 R₃이 각각 OCH₃를 나타내는, 상기 식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.

39-데스메톡시라파마이신 유사체의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 무기산 또는 유기산 또는 염기로부터 생성되는 통상적인 염뿐만 아니라 4차 암모늄 산 부가염을 포함한다. 적절한 산 염의 보다 구체적인 예로는 염산염, 브롬화 수소산염, 황산염, 인산염, 질산염, 과염소산염, 푸마르산염, 아세트산염, 프로피온산염, 숙신산염, 글리콜산염, 포름산염, 젖산염, 말레산염, 타르타르산염, 시트르산염, 팔모익산(palmoic acid) 염, 말론산염, 히드록시말레산염, 페닐아세트산염, 글루탐산염, 벤조산염, 살리실산염, 푸마르산염, 톨루엔술폰산염, 메탄술폰산염, 나프탈렌-2-술폰산염, 벤젠술폰산염, 히드록시나프토익산염, 요오드화 수소산염, 말산염, 스테로익산(steroic acid) 염, 타닌산 염 및 그 등가물을 포함한다. 옥살산과 같은 기타 산들은 그 자체로는 약제학적으로 허용가능하지 않지만, 본원 발명의 화합물과 그들의 약제학적으로 허용가능한 염을 얻을 때 중간체로서 유용한 염의 제조에서 유용할 수 있다. 적절한 염기 염의 보다 구체적인 예로는 소듐, 리튬, 포타슘, 마그네슘, 알루미늄, 칼슘, 아연, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민 및 프로카인 염을 포함한다. 본원 발명에 따른 화합물에 대한 하기의 언급에는 39-데스메톡시라파마이신 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염 모두를 포함한다.

발명의 상세한 설명

본원 발명은 의약에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도, 구체적으로는 암, B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부 반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 신경퇴행성 상태, 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환의 치료, 신경 재생의 촉진, 신경계 질환 또는 신경퇴행성 상태의 치료 또는 진균 감염의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본원 발명은 신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태의 치료에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태의 치료에서, 39-데스메톡시라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태의 치료에서, 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다.

또한, 본원 발명은 혈액 뇌 장벽을 통과하는 의약을 필요로 하는 중추 신경에 영향을 미치는 의학적 상태 즉, 혈액 뇌 장벽이 화합물의 전달을 방해하는 의학적 상태의 치료에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체 즉, 증가된 혈액 뇌 장벽 투과성을 갖는 라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 혈액 뇌 장벽이 화합물의 전달을 방해하는 중추 신경계에 영향을 미치는 의학적 상태의 치료에서, 39-데스메톡시라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 혈액 뇌 장벽이 화합물의 전달을 방해하는 중추 신경계에 영향을 미치는 의학적 상태의 치료에서, 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다.

특정 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의, 암과 B-세포 악성 종양의 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신의, 암과 B-세포 악성 종양의 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의, 암과 B-세포 악성 종양의 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 본원 발명은 구체적으로 뇌 종양(들)의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 또한, 본원 발명은 뇌 종양(들)의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 뇌 종양(들)의 치료에서, 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본원 발명은 다형성 아교모세포종의 치료에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 다형성 아교모세포종의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 다형성 아교모세포종의 치료에서 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다.

또한, 본원 발명은 신경퇴행성 상태의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 신경퇴행성 상태의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 신경퇴행성 상태의 치료에서 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 구체적으로, 신경퇴행성 상태는 알츠하이머 질환, 다발성 경화증 및 헌팅톤 무도병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 본원 발명은 알츠하이머 질환의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 알츠하이머 질환의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 알츠하이머 질환의 치료에서 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 다발성 경화증의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 다발성 경화증의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 다발성 경화증의 치료에서, 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 택일적인 실시 형태에서, 본원 발명은 헌팅톤 무도병의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 헌팅톤 무도병의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 헌팅톤 무도병의 치료에서 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다.

택일적인 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체, 구체적으로는 39-데스메톡시라파마이신, 또는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료 방법, 면역 억제의 유도 또는 유지 및 신경 재생의 촉진 방법, 진균 간염, 조직이식 거부 반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 신경퇴행성 상태, 염증성 질환, 혈관 질환 또는 섬유성 질환의 치료 방법을 제공한다. 구체적으로, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신을 투여하는 단계를 포함하는, 신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체를 투여하는 단계를 포함하는, 신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태의 치료 방법을 제공한다. 또한, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체 즉, 증가된 혈액 뇌 장벽 투과성을 갖는 라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여함으로써, 혈액 뇌 장벽이 화합물의 전달을 방해하는 중추 신경계에 영향을 미치는 의학적 상태의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다.

바람직하게는, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 바람직한 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌 종양(들)의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다.

또 다른 바람직한 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 상태의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 구체적으로, 신경퇴행성 상태는 알츠하이머 질환, 다발성 경화증 및 헌팅톤 무도병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 하나의 실시 형태에서 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머 질환의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 택일적인 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 헌팅톤 무도병의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다.

또한, 본원 발명은 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료, 또는 면역 억제의 유도 또는 유지, 신경 재생의 촉진, 진균 감염, 조직이식 거부 반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 신경퇴행성 상태, 염증성 질환, 혈관 질환 또는 섬유성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본원 발명은 신경 손상 또는 질환으로 인한 의학적 상태의 치료를 위한 의약 제조에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다.

또한, 본원 발명은 혈액 뇌 장벽이 화합물의 전달을 방해하는 중추 신경계에 영향을 미치는 의학적 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체 즉, 증가된 혈관 뇌 장벽 투과성을 갖는 라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다.

또한, 본원 발명은 뇌 종양(들)의 치료를 위한 의약 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 다형성 아교모세포종의 치료를 위한 의약의 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다.

또한, 구체적으로, 본원 발명은 신경퇴행성 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 구체적으로, 신경퇴행성 상태는 알츠하이머 질환, 다발성 경화증 및 헌팅톤 무도병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 본원 발명은 알츠하이머 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 다발성 경화증의 치료를 위한 의약의 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 택일적인 실시 형태에서, 본원 발명은 헌팅톤 무도병의 치료를 위한 의약의 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다.

39-데스메톡시라파마이신 유사체는 WO 제04/007709호에서 기술된 방법을 사용하여 만들어진 구조적으로 밀접한 라파마이신 유사체이다. 그러나, 이들은 예를 들면, 39-데스메톡시라파마이신 및 이와 관련된 유사체의 NCI 60 세포주 패널의 COMPARE 분석에 의해 보여지는 바와 같이, 라파마이신과는 상이한 활성 스펙트럼을 보여준다(하기 표 1을 참조한다). COMPARE 분석은 Pearson 분석을 사용하여 NCI 60-세포주 패널에서 두 개 화합물의 활성을 비교하여 이 두 개 화합물의 활성 스펙트럼이 얼마나 유사한지를 보여주는 상관 계수를 산출하고, 이것은 이들의 작용 메카니즘이 어떻게 관련되어 있는지를 나타낼 수 있다. 특정 실시예로서, 라파마이신과 39-데스메톡시라파마이신의 Pearson 상관 계수(Pearson coefficient)는 0.614이고, 이것은 라파마이신과 CCI-779(라파마이신의 40-히드록시 에스테르 유도체)의 Pearson 상관 계수인 0.86과 비교되어야 한다(Dancey, 2002). 따라서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 비교될 때 상이한 활성 스펙트럼을 갖고 있음이 발견될 수 있다.

<표 1>

다 약제 내성(Multi-Drug Resistance, MDR)은 암과 B-세포 악성 종양의 치료에서 중요한 문제이다. 이것은 많은 암에서 약제 내성의 개발 뒤에 있는 주요한 이유이다(Persidis A, 1999). 최초로 작용했던 약물은 일정시간이 지난 후에 전체적으로 효능이 없게 된다. MDR은 아데노신 트리포스페이트 결합하는 카세트(cassette) 트랜스포터(transporter)(ABC 트랜스포터)의 증가된 수준, 특히 P-당단백질(P-glycoprotein, P-gp)을 코딩하는 MDR1 유전자 또는 MRP1을 코딩하는 MRP1 유전자 발현의 증가와 관련되어 있다. MDR1 유전자의 발현 수준은 다양한 암-유래된(cancer-derived) 세포 주에서 광범위하게 변화하고, 소정의 세포주에서는 검출될 수 없는 반면에, 다른 세포주에서는 표준 대조군에 비해 10배 또는 100배까지 증가된 발현을 보여줄 수 있다.

라파마이신과 39-데스메톡시라파마이신 사이의 활성 스펙트럭의 지시된 소정 차이점은 39-데스메톡시라파마이신 유사체가 P-gp의 기질이 아니기 때문인 것으로 설명될 수 있다. 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 비교될 때 Caco-2 세포로부터 감소된 배출을 가졌고 39-데스메톡시라파마이신은 생체 외 P-gp 기질 분석에서 P-gp의 기질이 아닌 것으로 판명되었다(본원 명세서에서 실시예를 참조한다).

따라서, 본원 발명의 또 다른 실시 형태는 하나 이상의 기존 항암제(들)에 저항성이 있는 암 또는 B-세포 악성 종양, 즉 MDR 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 P-gp-발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 또 다른 보다 바람직한 실시 형태에서, 본원 발명은 매우 P-gp 발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다. 구체적으로, 매우 P-gp를 발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양은 대조군 수준에 비하여 2배, 5배, 20배, 25배, 50배, 또는 100배 증가된 발현을 가질 수 있다. 상기 용도에 대한 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 상기 용도에 대한 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 적절한 대조군은 P-gp를 발현하지 않는 세포이고, 이들은 P-gp의 낮은 발현 수준을 가지고 있거나 또는 낮은 MDR 기능을 가지고 있으며, 당해 분야의 당업자는 그러한 세포주를 인식하거나 또는 확인할 수 있다: 예를 들면(그러나, 이들에 제한되는 것은 아님), 적절한 세포주로는 다음을 포함한다: MDA435/LCC6, SBC-3/CDDP, MCF7, NCI-H23, NCI-H522, A549/ATCC, EKVX, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, HOP-18, HOP-92, LXFL 529, DMS 114, DMS 273, HT29, HCC-2998, HCT-116, COLO 205, KM12, KM20L2, MDA-MB-231/ATCC, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T-47D, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, IGROV1, SK-OV-3, K-562, MOLT-4, HL-60(TB), RPMI-8226, SR, SN12C, RXF-631, 786-0, TK-10, LOX IMVI, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, M14, UACC-62, UACC-257, PC-3, DU-145, SNB-19, SNB-75, SNB-78, U251 , SF-268, SF-539, XF 498.

택일적인 실시 형태에서, 본원 발명은 MDR 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 사용하기 위한 의약의 제조에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 P-gp-발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 사용하기 위한 의약의 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 또 다른 보다 바람직한 실시 형태에서, 본원 발명은 매우 P-gp 발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 사용하기 위한 의약의 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도를 제공한다. 특히, 특히 매우 P-gp를 발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양은 대조군의 수준에 비하여 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배 또는 100배 증가된 발현을 가질 수 있다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 적절한 대조군은 상기에서 기술되어 있다.

시료에서 P-gp의 발현 수준을 결정하는 방법은 본원 명세서에서 추가로 논의된다.

따라서, 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, P-gp-발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신이다. 또 다른 실시 형태에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체이다. 특정 암 형태에서 P-당단백질(P-gp)의 발현 수준은 이들에 제한되는 것은 아니지만, 실시간 RT-PCR(Szakacs et al ., 2004; Stein et al ., 2002; Langmann et al ., 2003, Alvarez et al ., 1995, Boyd et al ., 1995)에 의해, 면역 조직 화학에 의해(Stein et al ., 2002) 또는 마이크로어레이를 사용하는 것을(Lee et al ., 2003) 포함하는 기법을 사용하여 당해 분야의 당업자에 의해 측정될 수 있다. 다른 적절한 방법이 당해 분야의 당업자에게 알려져 있고, 이러한 방법은 단지 실시예에서 제공되고 있을 것이다.

39-데스메톡시라파마이신은 본원 명세서의 실시예에서 보여지는 바와 같이 라파마이신과 비교될 때 증가된 대사 안정성을 보여준다. 이미 다수의 논문들은 라파마이신에 있는 39-메톡시기가 라파마이신을 39-O-데스메틸라파마이신으로 전환시키기 위한 대사 공격(metabolic attack)의 주요 부위임을 확인하였다(Trepanier et al ., 1998). 라파마이신의 주요 대사 산물은 모체 화합물과 비교될 때 상당히 감소된 활성을 갖고 있다(Gallant-Haidner et al ., 2000, Trepanier et al ., 1998). 대조적으로, 39-데스메톡시라파마이신은 대사 공격을 받는 가장 유효한 부위가 더 이상 유효하지 않아서, 화합물의 안정성을 증가시키게 된다(실시예를 참조한다). 라파마이신 모체 화합물에 대해 39-데스메톡시라파마이신의 보다 높은 또는 동등한 역가(potency)와 연결되어, 이것은 보다 긴 반감기를 본원 발명의 화합물에게 제공한다. 또한, 이것은 라파마이신에 비해 39-데스메톡시라파마이신의 놀랄만한 장점이 된다.

상기 기술된 39-데스메톡시라파마이신의 특징(39-데스메톡시라파마이신은 P-gp의 기질이 아니고, 증가된 대사 안정을 가지며, P-gp을 통한 감소된 배출을 갖는다)은 39-데스메톡시라파마이신이 모체 화합물인 라파마이신에 비해 개선된 생체 이용가능성을 갖고 있음을 나타낸다. 따라서, 본원 발명은 의약에서, 구체적으로 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서, 개선된 대사 안정성, 개선된 세포막 투과성 및 전혀 다른 암 세포 억제 프로파일을 갖는 라파마이신 유사체인, 39-데스메톡시라파마이신의 용도를 제공한다.

또한, 본원 발명은 약제학적으로 허용가능한 캐리어(carrier)와 함께, 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 39-데스메톡시라파마이신을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가적으로 다른 39-데스메톡시라파마이신 유사체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 정맥 주사를 위해 특별하게 제제화된 상기 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 제공한다.

라파마이신 및 CCI-779 및 RAD001와 같은 임상 시도 중에 있거나 또는 임상 시도 중에 있어 온 관련 화합물은 좋지 못한 대사 안정성, 좋지 못한 투과성, P-gp를 통한 높은 수준의 배출 및 좋지 못한 생체 이용가능성을 포함하는, 좋지못한 약리학적 프로파일을 갖고 있다. 본원 발명은 라파마이신과 비교될 때 개선된 약제학적 특징을 갖는 39-데스메톡시라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.

또한, 본원 발명의 놀랄만한 실시 형태는 39-데스메톡시라파마이신 유사체가 기존의 라파마이신 유사체와 비교될 때 현저하게 상이한 약동력학 프로파일을 나타낸다는 것이다. 구체적으로, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 증가된 혈액 뇌 장벽 투과성을 보여주었고 따라서, 이러한 화합물은 주어진 혈액 수준에서 관련된 유사체에 비교될 때 보다 높은 노출이 뇌에서 발견되었다.

약동력학에서 이러한 차이점은 전적으로 예상하지 못했던 것이고, 종래 기술 어디에서 제안되지 않은 것이다. 신경퇴행성 상태와 뇌 종양을 포함하는 질환을 위해 현재 이용가능한 치료법이 갖는 공지된 불리한 점이 약물을 작용 부위에 도달하도록 하는 도전적인 과제가 된다(Pardridge, 2005를 참조한다). 또한, 이것은 기존의 라파마이신 유사체가 치료법에서 사용될 때 갖게 되는 문제점인 것으로 보고되었고, 구체적으로는 다형성 아교모세포종의 치료에서 CCI-779의 효능을 조사한 연구는 비록 전신 농도가 적절하였다고 하더라도, 혈액 뇌 장벽이 약물을 종양으로 전달하는데 있어 장벽으로 작용하였다고 결론내렸다(Chang, 2005). 따라서, 본원 발명은 개선된 혈액 뇌 장벽 투과성을 가진 라파마이신 유사체를 최초로 개시하였고, 따라서, 뇌 종양과 신경퇴행성 상태를 치료하기 위해 상당한 유용성을 갖는 라파마이신 유사체를 최초로 개시하였다.

상기 기술된 본원 발명의 소정 실시 형태에서 사용하기 위한 바람직한 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 9번, 16번 또는 27번 위치 중 어느 하나에서 라파마이신과 추가적으로 다른 유사체를 포함하고 즉, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신 그 자체가 아닌 것이 바람직하다. 또한, 바람직한 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 다음을 포함한다:

상기에서

39-데스메톡시라파마이신 유사체는 27번 위치에서 히드록시기를 가지고 즉, R₃가 OH를 나타내고;

39-데스메톡시라파마이신 유사체는 27번 위치에서 수소를 가지고 즉, R₃가 OH를 나타내고; 또는

39-데스메톡시라파마이신 유사체는 16번 위치에서 히드록시를 가지고 즉, R₂는 OH를 나타낸다.

당해 분야의 당업자는 당해 분야의 당업자에게 알려져 있는 생체 내 방법 및 생체 외 방법을 사용하여, 본원 발명 화합물의 약동력학과 생체 이용가능성을 결정할 수 있을 것이며, 상기 방법으로는 하기에서 기술된 것과 Gallant-Haidner et al., 2000 및 Trepanier et al ., 1998 및 본원 명세서의 참조 문헌에서 기술된 것을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 화합물의 생체 이용가능성은 수많은 요소(예를 들면, 수 용해도, 세포막 투과성, 단백질 결합 정도 및 대사 및 안정성)에 의해 결정되고, 이들 각각은 하기에서 기술된 생체 외 테스트에 의해 결정될 수 있고, 이러한 요소들 중 하나 이상의 개선이 화합물의 생체 이용가능성의 개선을 이끌 수 있음은 당해 분야의 당업자들에 의해 인식되고 있을 것이다. 택일적으로, 39-데스메톡시라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 생체이용가능성은 하기에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이 또는 본원 명세서의 실시예에서 기술된 생체 내 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

생체 내 분석

또한, 생체 내 분석이 39-데스메톡시라파마이신과 같은 화합물의 생체 이용가능성을 측정하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 화합물은 테스트 동물(예를 들면, 마우스 또는 랫트)에게 복막속으로(i.p.) 또는 정맥내로(i.v.) 및 경구로(p.o.) 두 개의 방법으로 투여되고, 정기적인 간격으로 혈액 샘플이 채취되어 약물의 혈장 농도가 시간에 따라 어떻게 변화하는지를 조사하게 된다. 시간에 따른 혈장 농도의 시간 추세가 사용되어 표준 모델을 사용하여 화합물의 절대적인 생체 이용가능성을 퍼센트로 계산할 수 있다. 통상적인 프로토콜의 예는 하기에서 기술되어 있다.

마우스에게 39-데스메톡시라파마이신 3 mg/kg을 i.v.로 또는 39-데스메톡시라파마이신 10 mg/kg을 p.o.로 투여한다. 혈액 샘플이 5분, 15분, 1시간, 4시간, 및 24시간 간격에서 채취되고, 시료에서의 39-데스메톡시라파마이신의 농도가 HPLC를 통해 결정된다. 그런 다음, 혈장 또는 전체 혈액 농도의 시간-추세가 사용되어 혈장 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC-이것은 대순환에 도달하는 변하지 않은 약물의 전체량과 직접적으로 비례한다), 최대(피크) 혈장 약물 농도, 최대 혈장 또는 혈액 약물 농도가 일어나는 시간(피크 시간)과 같은 핵심적인 파라미터를 도출해내는데 사용될 수 있고, 생체 이용가능성의 정확한 결정에서 사용되는 추가적인 요소는 화합물의 최종 반감기(terminal half life), 전체 채내 소실(total body clearance), 안정-상태의 분배 부피 및 F％를 포함한다. 그런 다음, 이러한 파라미터들은 비-구획적인(non-compartmental) 또는 구획적인(compartmental) 방법에 의해 분석되어 계산된 퍼세트 생체 이용가능성을 제공하고, 이러한 방법의 형태의 예로서 Gallant-Haidner et al., 2000 및 Trepanier et al ., 1998 및 본원 명세서의 참조 문헌을 참고한다.

39-데스메톡시라파마이신의 효능은 본원 명세서에서 기술되어 있고 당해 분야의 당업자에게 알려져 있는 신경퇴행성 질병을 위한 생체 내 모델에서 테스트될 수 있다. 이러한 모델로는 알츠하이머 질환을 위해서는 - 인간의 가족성 알츠하이머 질환(familial Alzheimer's disease, FAD) p-아밀로이드 전구체(p-amyloid precursor, APP)를 발현하는 동물, 인간의 야생형 APP를 초과 발현하는 동물, p-아밀로이드 1-42(pA)를 초과 발현하는 동물, FAD 프레세닐린-1(presenillin-1, PS-1)(예를 들면, German and Eisch, 2004)를 발현하는 동물을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 다발성 경화증을 위해서는 - 실험상의 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 모델(Bradl, 2003과 실시예 7을 참조한다). 파킨슨 질환을 위해서는 - 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP) 모델 또는 6-히드록시도파민(6-OHDA) 모델(예를 들면, Emborg, 2004; Schober A. 2004를 참조한다). 헌팅톤 무도병을 위해서는, 매우 확장된 CAG 반복(repeat)을 마우스 세균 주로 나르는 인간 헌팅톤 질환(Huntington's disease, HD) 유전자의 엑손 1의 주입에 의해 생성되는 R6 라인 모델(R6 lines model)(Sathasivam et al ., 1999) 및 다른 것들(Hersch and Ferrante, 2004을 참조한다)을 포함하는 다수 개의 모델이 있다.

상기 언급된 본원 발명의 화합물 또는 그의 제제는 소정의 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있고, 예를 들지만 제한 없이 이들은 비경구로, 경구로, 국소로(볼 부위, 혀 밑, 또는 경피를 포함), 의료 장치를 통해(예를 들면, 스텐트), 흡입에 의해 또는 주사를 통해(피하 또는 근육내) 투여될 수 있다. 치료는 일정 시간에 걸쳐 단일 투여 또는 복수회의 투여로 구성될 수 있다.

39-데스메톡시라파마이신 유사체는 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 하나 이상의 허용가능한 캐리어와 함께, 약제학적 제제로서 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 캐리어(들)는 본원 발명의 화합물과 양립가능하다는 의미에서 "허용되어야만" 하고, 그 복용자에게 해로워서는 않 된다. 적절한 캐리어의 예가 하기에서 보다 상세하게 기술되어 있다.

39-데스메톡시라파마이신 유사체는 단독으로 또는 다른 치료제와 병행하여 투여될 수 있고, 두 개(또는 그 이상) 물질의 동시-투여는 각각이 사용되는 것에 비해 상당히 더 낮은 투여량을 허용하고, 따라서 관찰되는 부작용을 감소시킨다. 라파마이신과 함께 일어날 때 P450 효소의 기질인 약물과 병행하여 사용될 때 약물-약물 상호작용을 덜 초래할 것 같다는 점에서, 39-데스메톡시라파마이신의 증가된 대사 안정성은 라파마이신을 능가하는 추가적인 장점을 갖고 있다(Lampen et al ., 1998).

따라서, 하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부 반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애 또는 염증성 질환의 치료를 위한 또 다른 치료제와 동시에 투여되고, 바람직한 제제로는 예를 들면, 아자티오프린(azathioprine), 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, FK506, 미코페놀레이트 모페틸(Mycophenolate Mofetil), OKT-3 및 ATG를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

택일적인 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료를 위해 또 다른 치료제와 함께 동시-투여되는데, 바람직한 제제로는 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프리니손(prenisone), 블레오마이신, 시클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 파클리탁셀, 도세탁셀(docetaxel), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜( toremifene), 메게스트롤(megestrol) 아세테이트, 아나스트로졸(anastrozole), 고세렐린(goserelin), 항-HER2 모노클로날 항체(anti-HER2 monoclonal antibody)(예를 들면, Herceptin^TM), 카페시타빈, 랄록시펜 히드로클로라이드, EGFR 억제제(예를 들면, Iressa^®, Tarceva^TM, Erbitux^TM), VEGF 억제제(예를 들면, Avastin^TM), 프로테아좀 억제제(예를 들면, Velcade^TM), Glivec^® 또는 hsp90 억제제(예를 들면, 17-AAG)를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 39-데스메톡시라파마이신은 방사선 치료 또는 외과 수술을 포함하는 다른 치료법과 병행하여 투여될 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 혈관 질환의 치료를 위해 또 다른 치료제와 함께 동시-투여되고, 바람직한 제제로는 ACE 억제제, 안지오텐신 II 수용체 안타고니스트, 피브르산(fibric acid) 유도체, HMG-CoA 환원효소 억제제, 베타 아드레날린성 차단제(beta adrenergic blocking agent), 칼슘 채널 차단제, 항산화제, 항응고제 및 혈소판 억제제(platelet inhibitor)(예를 들면, Plavix^TM)를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 신경 재생의 촉진을 위해 또 다른 치료제와 함께 동시-투여되고, 바람직한 제제로는 신경영양성 인자 예를 들면 신경 성장 인자, 신경교세포 유래 성장 인자, 뇌 유래 성장 인자, 섬모 신경영양성 인자 및 뉴로트로핀(neurotrophin) 3을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 진균 감염의 치료를 위해 또 다른 치료제와 동시-투여되고; 바람직한 제제로는 암포테리신 B, 플루시토신, 에치노칸딘(echinocandin)(예를 들면, 카스포푼진(caspofungin), 아니둘라푼진(anidulafungin) 또는 미타푼진(micafungin)), 그리세오풀빈, 이미다졸 또는 트리아졸 항진균제(예를 들면, 클로트리마졸, 미코나졸, 케토코나졸, 에코나졸, 부토코나졸, 옥시코나졸, 테르코나졸(terconazole), 이트라코나졸, 플루코나졸 또는 보리코나졸)을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 알츠하이머 질환의 치료를 위한 또 다른 제제와 함께 동시-투여되는데; 바람직한 제제로는 콜린에스테라제 억제제 예를 들면 도네페질(donepezil), 리파스티그민(rivastigmine), 및 갈란타민(galantamine); N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체 안타고니스트(antagonist) 예를 들면 메만틴(Memantine)을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 다발성 경화증의 치료를 위한 또 다른 제제와 함께 동시-투여되는데; 바람직한 제제로는 인터페론 베타-1b, 인터페론 베타-1a, 글라티라머(glatiramer), 마이토잔트론(mitoxantrone), 시클로포스파미드, 코르티코스테로이드(예를 들면, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 덱사메타손)를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

당업자들에게 명백한 바와 같이, 동시-투여에는 치료 방법의 일 부분으로서 환자에게 두 개 이상의 치료제를 전달하는 소정의 방법이 포함된다. 두 개 이상의 제제가 단일한 제제에서 동시에 투여될 수 있지만, 이것이 필수적인 것은 아니다. 제제는 다른 제제로 및 다른 횟수로 투여될 수 있다.

제제는 단일 투여 제형으로 손쉽게 제시될 수 있고, 약학 분야에서 잘 알려져 있는 소정의 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법으로는 한 개 이상의 부수적인 성분을 구성하는 캐리어와 함께, 활성 성분(본원 발명의 화합물)의 회합(association)을 초래하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 액체형 캐리어 또는 미세하게 나누어진 고체형 캐리어 또는 이들 모두와 함께, 활성 성분의 회합을 균일하게 및 직접적으로 초래함으로써, 그런 다음, 필요하다면, 제품으로 형태를 만듬으로써 제조된다.

39-데스메톡시라파마이신 유사체는 보통 활성 성분을 포함하는 약제학적 제제의 제형으로, 선택적으로는 독성이 없고 유기성 또는 무기성인 산 또는 염기 부가염의 제형으로, 약제학적으로 허용가능한 투여 제형으로, 정맥 내로, 경구로 또는 소정의 비경구 경로에 의해 투여될 것이다. 질환 및 치료될 환자뿐만 아니라, 투여 경로에 의존하여, 조성물은 투여량을 변화시키면서 투여될 수 있다.

주사가능한 용도를 위해 적절한 본원 발명의 약제학적 조성물은 멸균된 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 또한, 조성물은 이러한 멸균된 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 멸균된 분말의 제형으로 될 수 있다. 모든 경우에서, 최종 상태의 주사가능한 제형은 멸균되어야만 하고 쉽게 주사가능함(syringability)을 위해 효율적으로 유동성이 있어야만 한다.

약제학적 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야만 하고; 따라서, 바람직하게는 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야만 한다. 캐리어는 용매 또는 분산 매질(dispersion medium)이 될 수 있고, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체형 폴리에틸렌 글리콜), 식물성 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다.

예를 들면, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 경구로, 볼 내로, 또는 혀 밑으로, 감미제 또는 착색제를 포함할 수 있는 정제, 캡슐, 밑씨(ovule), 엘릭시르, 액제 또는 현탁제의 제형으로, 즉시 방출성(immediate-release), 지연 방출성(delayed-release) 또는 제어 방출성(controlled-release) 적용을 위해 투여될 수 있다.

경구 투여를 위해 적절한 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용액 또는 현탁제는 또한 부형제 예를 들면 N,N-디메틸아세트아미드, 분산제 예를 들면 폴르소르베이트 80, 계면 활성제, 및 가용화제 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 포살 50 PG(Phosal 50 PG)(포스파티딜콜린, 대두 지방산, 에탄올, 모노/디글리세라이드, 프로필렌 글리콜 및 아스코르빌 팔미테이트로 구성됨)를 포함할 수 있다.

이러한 정제는 미세결정 셀룰로오스, 락토오스(예를 들면, 락토오스 일수화물, 또는 무수 락토오스), 소듐 시트레이트, 칼슘 카보네이트, 2가 염기성(dibasic) 칼슘 포스페이트 및 글리신, 부틸화된 히드록시톨루엔(E321), 크로스포비돈, 하이프로멜로스, 스타치(바람직하게는 콘, 포테이토 또는 타피오카 스타치), 소듐 스타치 글리콜레이트, 크로스카르멜로스 소듐 및 소정의 복합체 실리케이트와 같은 붕해제, 및 폴리피닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시-프로필셀룰로오스(HPC), 마크로골 8000, 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 결합제(granulation binder)를 포함할 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트(behenate) 및 탈크와 같은 윤활제가 포함될 수 있다.

또한, 유사한 형태의 고형 조성물이 젤라틴 캡슐에서 충진 물질로 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 바람직한 부형제는 락토오스, 스타치, 셀룰로오스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁제 및/또는 엘릭시르를 위해서, 본원 발명의 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 또는 염료와 함께, 유화제 및/또는 현탁제와 함께, 및 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제와 함께, 및 이들의 배합물과 함께 혼합될 수 있다.

정제는 선택적으로는 한 개 이상의 부수적인 성분과 함께, 압착 또는 몰딩(moulding)에 의해 제조될 수 있다. 압착된 정제는 선택적으로는 결합제(예를 들면, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸셀룰로오스), 윤활제, 비활성 희석제, 방부제, 붕해제(예를 들면, 소듐 스타치 글리콜레이트, 가교 결합된 폴리돈, 가교 결합된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스), 표면-활성 또는 분산제와 함께 혼합시켜, 분말 또는 과립과 같은 자유롭게-유동하는 제형으로 된 활성 성분을 적절한 기계에서 압착함으로써 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 습윤 상태로 된 분말형 화합물과 비활성 액체형 희석제의 혼합물을 적절한 기계에서 몰딩함으로써 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로는 코팅되거나 또는 겹으로 될(scored) 수 있고, 제제화되어, 본원 명세서에서의 활성 성분의 서 방출 또는 제어 방출을 제공할 수 있고, 예를 들면, 다양한 비율로 히드록시프로필메틸셀룰로오스를 사용하여 바람직한 방출 프로파일을 제공할 수 있다.

경구 투여를 위해 적절한, 본원 발명에 따른 제제는 각각 미리 정해진 함량의 활성 성분을 포함하는, 캡슐, 교갑(cachet) 또는 정제와 같은 분리된 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비-수성 액체 상태의 액제 또는 현탁제로서; 또는 수중유(oil-in-water) 액체형 에멀젼 또는 유중수(water-in-oil) 액체형 에멀젼으로서 제시될 수 있다. 또한, 활성 성분은 큰 환약(bolus), 연약(electuary), 또는 페이스트(paste)로서 제시될 수 있다.

입 국소 투여를 위해 적절한 제제는 감미된 성분, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거컨스에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 젤라틴과 글리세린, 또는 수크로스와 아카시아와 같은 비활성 성분에 활성 성분을 포함하는 향정(pastille); 및 적절한 액체형 캐리어에 활성 성분을 포함하는 구강-세척액을 포함한다.

상기에서 특별히 언급된 성분들뿐만 아니라, 본원 발명의 제제는 해결하고자 하는 제제의 형태를 고려하여 당해 분야에서 통상적인 기타 물질을 포함할 수 있고, 예를 들면, 경구 투여를 위해 적절한 제제로는 감미제를 포함할 수 있다.

국소 투여를 위해 개조된 약제학적 조성물은 연고, 크림, 현탁제, 로션, 분말, 액제, 페이스트, 겔, 약물이 스며든 드레싱, 스프레이, 에어로졸 또는 오일, 경피용 장치, 살포용 분말, 및 그 등가물로서 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 활성 성분을 포함하여, 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 이들은 또한 방부제, 약물 침투를 도와주는 용매, 크림 또는 연고에서는 연화제(emollient), 및 로션을 위해서는 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은, 양립가능한 통상적인 캐리어와 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 캐리어는 조성물 중 약 1％ 내지 약 98％까지 존재할 수 있다. 더 일반적으로는, 이들은 조성물의 약 80％까지 형성할 것이다. 단지 설명으로서만, 크림 또는 연고는 화합물의 약 5-10 중량％를 포함하는, 충분한 양의 친수성 물질과 물과 혼합함으로써, 목표로 하는 일관성을 갖는 크림 또는 연고를 생산하는 충분한 함량으로 제조된다.

경피 투여를 위해 개조된 약제학적 조성물은 연장된 시간 동안 복용자의 표피와 직접적으로 접촉하도록 하는 분리된 패치로 제시될 수 있다. 예를 들면, 활성 성분은 이온토포레시스(iontophoresis)에 의해 패치로부터 전달될 수 있다.

외부 조직, 예를 들면 입과 피부에 적용하기 위해서, 조성물은 바람직하게는 국소용 연고 또는 크림으로 적용된다. 연고로 제제화될 때, 활성 성분은 파라핀성(paraffinic) 또는 수-혼화성(water-miscible) 연고 성분과 함께 사용될 수 있다.

택일적으로, 활성 성분은 수중유 크림 성분 또는 유중수 성분과 함께 크림으로 제제화될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 유동성 단위 투여 제형(fluid unit dosage form)은 활성 성분과 멸균된 비히클(vehicle)을 사용하여 제조되고, 비히클로는 예를 들면, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 물이 바람직하다. 사용된 비히클과 농도에 의존하여, 활성 성분은 비히클 내에서 현탁되거나 또는 용해될 수 있다. 액제를 제조할 때, 활성 성분은 적절한 바이알 또는 앰풀에 채우고 밀봉하기 전에 주사용 물에 용해되고 여과로 멸균될 수 있다.

유리하게는, 국소 마취제, 방부제 및 완충제와 같은 제제가 비히클에 용해될 수 있다. 안정성을 높이기 위해, 조성물은 바이알에 채워진 후 동결될 수 있고 물은 진공 하에서 제거될 수 있다. 그런 다음, 건조 상태의 동결 건조된 분말은 바이알에서 밀봉되고, 주사용 물을 수반한 바이알이 공급되어, 사용하기 전에 액체를 재구성할 수 있다.

비경구용 현탁제는 활성 성분이 비히클에서 용해되는 대신에 현탁되고 여과에 의해 멸균이 수행될 수 없다는 것을 제외하고는, 액제와 실질적으로 동일한 방식으로 제조된다. 활성 성분은 멸균된 비히클에 현탁하기 전에, 에틸렌 옥시드에 노출시킴으로써 멸균될 수 있다. 유리하게는, 계면 활성제 또는 습윤제가 조성물에 포함되어 활성 성분의 균일한 분배를 용이하게 한다.

또한, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 당해 분야에서 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시 형태에서, 본원 발명의 조성물은 미국특허 제5,399,163호; 미국특허 제5,383,851호; 미국특허 제5,312,335호; 미국특허 제5,064,413호; 미국특허 제4,941,880호; 미국특허 제4,790,824호; 또는 미국특허 제4,596,556호에서 개시된 장치와 같은, 바늘이 없는 피하 주사 장치를 가지고 투여될 수 있다. 본원 발명에서 유용한 잘-알려져 있는 임플란트와 모듈(module)의 예로는 다음을 포함한다: 제어된 속도에서 약물을 분산시키기 위한 매몰식 미세-주입 펌프를 개시하고 있는 미국특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하고 있는 미국특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도에서 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하고 있는 미국특허 제4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위한 변동 가능한 흐름 매몰식 주입 장치를 개시하고 있는 미국특허 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획을 갖는 삼투압식 약물 전달 시스템을 개시하고 있는 미국특허 제4,447,224호; 삼투압식 약물 전달 시스템을 개시하고 있는 미국특허 제4,475,196호. 특정 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 약물 방출 스텐트, 예를 들면 WO 제01/87263호와 관련된 공개 출원에서 개시된 것과 상응하는 것 또는 Perin (Perin, EC, 2005)에 의해 기술된 것과 상응하는 것을 사용하여 투여될 수 있다. 기타 많은 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당해 분야의 당업자에게 알려져 있다.

본원 발명의 화합물이 투여될 투여량은 특정 화합물, 관련되는 질환, 객체, 및 질환의 성질과 심각성, 및 객체의 신체적 조건, 및 선택된 투여 경로에 따라서 변화할 것이다. 적절한 투여량은 당해 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

조성물은 투여 방법에 의존하여, 본원 발명의 화합물 0.1 중량％부터, 바람직하게는 5-60 중량％, 더 바람직하게는 10-30 중량％를 포함할 수 있다.

본원 발명 화합물의 개별적인 투여 제형의 최적 함량 및 투여 간격은 치료될 상태의 성질 및 정도, 투여 제형, 경로 및 부위, 및 치료될 특정 객체의 나이와 상태에 의해 결정될 것이고, 의사는 궁극적으로 사용될 적절한 투여 제형을 결정할 것이라는 것은 당해 분야의 당업자에 의해 인식될 것이다. 이러한 투여 제형은 적절할 만큼 자주 반복될 수 있다. 부작용이 생긴다면, 보통의 임상 연습에 따라서, 투여 제형의 함량 및/또는 빈도가 변경되거나 또는 감소될 수 있다.

도 1: 라파마이신의 구조를 보여준다.

도 2: 39-데스메톡시라파마이신의 분열 경로(fragmentation pathway)를 보여준다.

도 3: 39-데스메톡시라파마이신과 라파마이신의 mTOR 억제 활성을 간략하게 보여주는 웨스턴 블롯을 보여준다.

도 4: 정상 세포주(A와 B) 또는 매우 P-gp 발현하는 세포주(C와 D)에서 파클리탁셀(A와 C)과 39-데스메톡시라파마이신(B와 D)의 모든 테스트 농도에서 ％T/C 값

도 5: A- 라파마이신과 39-데스메톡시라파마이신의 한 번의 i.v. 또는 p.o. 투여 이후에 뇌 조직 또는 혈액 샘플에서 0 내지 24시간의 전체적인 곡선 아래의 면적(Area under the Curve, AUC)을 보여준다.

B - 한 번의 i.v. 투여 이후에 시간에 따라 뇌 조직에서 검출된 39-데스메톡시라파마이신과 라파마이신의 수준(level)을 보여준다.

도 6: A - 예방 계획 하에서 EAE 모델에서의 질병 진행을 보여준다. 제공된 값은 비히클 군 또는 처리된 군으로부터 나온 평균값이다.

B - 치료 계획 하에서 EAE 모델에서의 질병 진행을 보여준다. 제공된 값은 비히클 군 또는 처리된 군으로부터 나온 평균값이다.

도 7: 그래프는 U87-MG 세포의 정위 방법의(stereotaxic) 주입에 의해 신경교종을 유도한 후에 마우스의 상대적인 생존 ％를 나타낸다. 채워진 다이아몬드는 처리되지 않은 군을 나타내고, 채워진 사각형은 비히클 처리된 군을 나타내고, 개방된 원은 39-데스메톡시라파마이신 처리된 군을 나타낸다.

재료와 방법

재료

달리 나타내지 않는다면, 하기 실시예에서 사용되는 모든 시약을 상업적인 공급원으로부터 얻었다.

배양

에스 히그로스코피쿠스(S. hygroscopicus) MG2-10 [IJMNOQLhis](WO 제04/007709호; Gregory et al ., 2004)을 배지 1 아가 플레이트(하기를 참조한다)에서 28℃에서 유지하였다. 배지 1에서 성장시킨 후에, 세포 스톡(spore stock)을 제조하였고, 증류수에 넣은 20％ w/v 글리세롤; 10％ w/v 락토오스에서 유지하였고, -80℃에서 보관하였다. 250 ml 플라스크에서, 동결시킨 스톡 0.1 ml를 50 ml 배지 2(하기를 참조한다)에 접종함으로써, 생장 배양균(vegetative culture)을 제조하였다. 배양균을 36 내지 48시간 동안 28℃에서, 300 rpm에서 배양하였다.

생성 방법:

생장 배양균을 배지 3에 2.5-5％ v/v로 접종하였다. 6-7일 동안, 26℃에서, 300rpm에서 배양을 수행하였다.

주입 절차:

접종한 지 24-48시간 후에, 시클로헥산 카르복시산의 주입/첨가를 수행하였고, 달리 기술하지 않는다면, 1-2 mM 최종 농도로 주입하였다.

배지 1:

그런 다음, 배지를 121℃, 20분에서 오토클레이브시켜 멸균하였다.

배지 2: RapV7 시드 배지(seed medium)

멸균한 후에, 배지 각각 7 mL에 40％ 글루코스 0.16 mL를 첨가한다.

배지 3: MD6 배지(발효 배지)

멸균하기 전에, 시그마 α-아밀라제(BAN 250) 0.4 mL를 배지 1 L에 첨가하였다.

배지를 20분 동안 121℃에서 멸균하였다.

멸균한 후에, 멸균한 40％ 프룩토오스 0.35 ml와 L-라이신(물에서 140 mg/mL, 여과로 멸균됨) 0.10 ml를 각각 7ml에 첨가하였다.

배지 4: RapV7a 시드 배지

그런 다음, 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브시켜 멸균하였다.

배지 5: MD6/5-1 배지(발효 배지)

배지를 30분 동안 121℃에서 멸균하였다.

멸균한 후에, 1 L당 프룩토오스 15g을 첨가하였다.

48시간 후에, L-라이신 0.5 g/L를 첨가하였다.

분석 방법

방법 A

주입 부피: 0.005-0.1 mL(감도에 의존하여 요구됨).

이동상 A: 순수한 물에서 0.01％ 포름산

이동상 B: 아세토니트릴에서 0.01％ 포름산

흐름 속도: 1ml/분의 이동상으로 실시하고, Agilent "Spherisorb" "Rapid Resolution" cartridges SB C8, 3 미크론, 30 mm x 2.1 mm에서 HPLC를 수행하였다.

0분에는 5％ B에서 2.5분에는 95％ B로, 4분까지 95％ B를 유지하고, 다음 사이클까지 5％ B로 되돌아오도록 하는, 농도 선형 구배를 사용하였다. 254 nm 에서 UV 흡광도 및/또는 Micromasss Quattro- Micro 장비를 사용하는 질량 분광학 전자 분사 이온화(양의 값 또는 음의 값)에 의해 검출하였다.

방법 B

주입 부피: 0.02 mL.

이동상 A: 아세토니트릴(100 mL), 트리플루오로아세트산(1 mL), 1M 암모늄 아세테이트(10 mL)와 함께 탈 이온수로 1L까지 채움.

이동상 B: 탈이온수(100 mL), 트리플루오로아세트산(1 mL), 1M 암모늄 아세테이트(10 mL)와 함께 아세토니트릴로 1L까지 채움.

흐름 속도 : 1 mL/분

의 이동상으로 실시하고, 50℃에서 유지하였고, 3 미크론 BDS C18 Hypersil (ThermoHypersil-Keystone Ltd) 컬럼, 150 x 4.6 mm에서 HPLC를 수행하였다.

55 ％ B - 95 ％ B의 농도 선형 구배를 10분에 걸쳐 사용하였고, 그 다음에 95％ B로 2분 동안 유지하였고, 0.5분에 걸쳐 55％ B로 만들었고, 추가로 55％ B로 2분 동안 유지하였다. 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 화합물을 검출하였다.

방법 C

HPLC 시스템은 Agilent HP1100을 포함하였고,

이동상 A: 탈이온수.

이동상 B: 아세토니트릴.

흐름 속도: 1 mL/분의 이동상에서 실시하고, 40℃에서 유지하였고, 3 미크론 BDS C18 Hypersil (ThermoHypersil-Keystone Ltd) 컬럼, 150 x 4.6 mm에서 수행하였다.

상기 시스템은 Bruker Daltonics Esquire3000 전자 분사 질량 분광기와 연결되어 있다. 500 내지 1000 달톤의 스캔 범위에 걸쳐, 양의 음의 스위칭(Positive negative switching)을 사용하였다. 55 ％ B - 95 ％ B의 농도 선형 구배를 10분에 걸쳐 사용하였고, 그 다음에 95％ B로 2분 동안 유지하였고, 0.5분에 걸쳐 55％ B로 만들었고, 추가로 55％ B로 2분 동안 유지하였다.

항암 활성의 생체 외( in vitro ) 생물 검정( bioassay )

단일층 증식 분석에서 화합물의 12개의 인간 종양 세포주에서의 항암 활성의 생체 외 평가는 Oncotest Testing Facility, Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg에서 수행하였다. 선택된 12개의 세포주의 특 징을 하기 표 2에서 요약한다.

<표 2> 테스트 세포주

Roth et al ., 1999에 의해 기술된 바에 따라, 온코테스트(Oncotest) 세포 주를 인간 종양 이종이식으로부터 만들었다. 공여체 이종이식의 기원은 Fiebig et al., 1999에 의해 기술되어 있다. 다른 세포주들은 NCI (H460, SF-268, OVCAR-3, DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-468)로부터 얻거나 또는 DSMZ, Braunschweig, 독일 (LNCAP)로부터 구입하였다.

달리 특정하지 않는다면, 모든 세포주를 37℃에서 가습된 분위기(95％ 공기, 5％ CO₂)에서, RPMI 1640 배지, 10％ 송아지 혈청(fetal calf serum), 및 0.1 mg/mL 젠타마이신을 포함하는 '혼합-준비가 된(ready-mix)' 배지(PAA, Coibe, 독일)에서 길렀다.

단일층 분석 - 프로토콜 1:

변형된 프로피디윰 요오드(propidium iodide) 분석을 사용하여, 12개 인간 종양 세포주의 성장에서 테스트 화합물(들)의 영향을 평가하였다(Dengler et al ., (1995)).

간단하게는, 트립신처리에 의해 기하급수적인 단계의 배양으로부터 세포를 수확하였고, 계수하였고, 세포주에 의존하는 세포 농도로(5-10,000 살아있는 세포/웰) 96-웰 바닥이-평면인(flat-bottomed) 마이크로티터 플레이트에 플레이트하였다. 세포가 다시 기하급수적인 성장을 하도록 24시간이 지나 회수한 후에, 배양 배지(플레이트 당 6개의 대조군 웰) 또는 39-데스메톡시라파마이신을 포함하는 배양 배지 0.01 mL를 웰에 첨가하였다. 각각의 농도를 3배수로 플레이트하였다. 39-데스메톡시라파마이신을 두 개의 농도로 적용하였다(0.001 μM과 0.01 μM). 4일 동안 연속적으로 노출한 다음, 39-데스메톡시라파마이신을 포함한 또는 포함하지 않는 세포 배양 배지를 수성 프로피디윰 요오드(PI) 용액(7 mg/L) 0.2 mL로 대체하였다. 살아있는 세포의 비율을 측정하기 위하여, 플레이트를 동결시킴으로써 세포를 투과시켰다. 플레이트를 녹인 후에, Cytofluor 4000 마이크로플레이트 해독기(여기(勵起) 530 nm, 방출 620 nm)를 사용하여 형광을 측정하여, 살아있는 세포의 전체 개수에 대한 직접적인 관계를 얻는다.

성장 억제를 처리된 군/대조군 x 100 (％ T/C)로 표시하였다. 활성이 있는 화합물의 경우, 화합물 농도 대 세포 생존도(cell viability)를 플롯팅함으로써 IC₅₀과 IC₇₀ 값을 평가하였다.

단일층 분석 - 프로토콜 2:

국립암연구소(NCI) 암 스크리닝 패널의 인간 종양 세포주를 우태아혈청 5％ 및 L-글루타민 2 mM을 포함하는 RPM1 1640 배지에서 길렀다(Boyd and Paull, 1995). 개별적인 세포 주가 두 배가 되는 시간에 따라 5,000 내지 40,000 세포/웰 범위의 플레이트 밀도(plating density)에서 0.1 mL에 96 웰 마이크로티터 플레이트로 세포를 접종하였다. 세포를 접종한 후에, 실험할 약물을 첨가하기 전에, 마이크로티터 플레이트를 37℃, 5％ CO₂, 95％ 공기 및 100％ 상대 습도에서 24시간 동안 배양하였다.

24시간 후에, 각각의 세포 주에 대해 두 개의 플레이트를 트리클로로아세트산(TCA)으로 인 시투(in situ)로 고정하여, 약물 첨가 시점에 각각의 세포주의 세포 개체수의 측정값(Tz)을 나타내도록 하였다. 실험할 약물을 디메틸 술폭시드에서 400 배의 목표로 하는 최종 최대 테스트 농도로 녹였고 사용하기 전에 동결 상태로 보관하였다. 약물을 첨가할 시점에, 동결시킨 농축액의 분취물을 녹였고 0.05 mg/mL 젠타마이신을 포함하는 완전한 배지를 가지고 목표로 하는 최종 최대 테스트 농도의 두 배까지 희석하였다. 추가적으로 4배, 10배 또는 1/2 로그 계단식 희석(serial dilution)으로 전체적으로는 5개의 약물 농도와 대조군을 제공하도록 만들었다. 이러한 다양한 약물 희석액 중 0.1 mL의 분취물을 이미 배지 0.1 mL을 포함하는 적절한 마이크로티터 웰에 첨가하였고, 그 결과 필요한 최종 약물 농 도가 되도록 하였다.

약물을 첨가한 다음, 플레이트를 37℃, 5％ CO₂, 95％ 공기 및 100％ 상대 습도 하에서 추가로 48시간 동안 배양하였다. 붙어 있는 세포를 위해서는, 차가운 TCA를 첨가함으로써 분석을 종결하였다. 세포를 차가운 50％(w/v) TCA(최종 농도, 10％ TCA)를 약하게 첨가함으로써 세포를 인 시투로 고정시켰고, 60분 동안 4℃에서 배양하였다. 상등액을 버렸고, 플레이트를 수돗물로 5회 수세하였고, 공기로 건조시켰다. 1％ 아세트산에서 0.4％(w/v)로 된 술포르호다민 B(Sulforhodamine B, SRB) 용액(0.1 mL)을 각각의 웰에 첨가하였고, 플레이트를 10분 동안 실온에서 배양하였다. 염색한 후에, 결합되지 않은 염료를 1％ 아세트산으로 5회 수세함으로써 제거하였고, 플레이트를 공기 중에서 건조시켰다. 이후, 결합된 염색약을 10 mM 트리즈마(trizma) 염기로 녹였고, 515 nm 파장에서 자동화된 플레이트 판독기에서 흡광도를 읽었다. 현탁 상태의 세포의 경우, 80％ TCA(최종 농도, 16％ TCA) 0.05 mL를 약하게 첨가함으로써 웰의 바닥에 정착된 세포들을 고정함으로써 분석을 종결하였다는 것을 제외하고는, 방법은 동일하였다. 7개의 흡광도 측정값[(시간이 0일 때(Tz), 대조군 성장(C), 및 5개 농도 수준의 약물 존재시 테스트군의 성장(Ti)]을 사용하여, 각각의 약물 농도 수준에서 성장 퍼세트(percentage growth)를 계산하였다. 성장 억제 퍼센트(Percentage growth inhibition)를 하기와 같이 계산한다.

Ti≥Tz인 농도에서는 [(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100

Ti＜Tz인 농도에서는 [(Ti-Tz)/Tz] x 100

각각의 실험 물질에 대해 3개의 투여량 반응 파라미터를 계산하였다. [(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100 = 50으로부터 50％ 성장 억제(GI50)를 계산하였고, 이것은 약물과 배양시키는 동안 대조군 세포의 순전한 단백질 증가(SRB 염색에 의해 측정됨)에 있어서 50％ 감소시킨 약물 농도이다. 전체적인 성장 억제를 만드는 약물 농도(TGI)는 Ti = Tz로부터 계산하였다. 처리한 다음 세포의 순전한 감소를 나타내는 LC50(시작할 시점과 비교할 때, 약물 처리가 끝날 무렵 측정된 단백질에서 50％ 감소를 만드는 약물의 농도)을 [(Ti- Tz)/Tz] x 100 = -50으로부터 계산하였다.

60개 세포주 패널 내에 있는 다 약제 내성 세포주는 로다민 B 배출(Lee et al., 1994)과 mdr-1의 mRNA의 PCR 검출(Alvarez et al ., 1995)에 의해 확인된 바와 같이 NCI에 의해 높은 P-gp를 포함하는 세포주로서 확인되었다.

약동력학 분석-프로토콜 1:

0.15M NaCl에 4％ 에탄올, 5％ 트윈-20, 5％ 폴리에틸렌글리콜 400을 포함하는 비히클에, 테스트 화합물을 제조하였다. 10 mg/kg p.o. 또는 3 mg/kg i.v.의 단일 투여량을 암컷 CD1 마우스 그룹에 투여하였다(시점당 각각의 화합물에 대해 3 마리의 마우스). 0분, 4분, 15분, 1시간, 4시간 및 24시간 때에, 마우스 그룹을 죽였고, 추가적인 분석을 위해 각각의 마우스로부터 혈액과 뇌를 포집하였다.

뇌 시료를 액체형 질소에서 스냅(snap) 동결시켰고, -20℃에서 보관하였다. 각각의 동물의 전체 혈액 중 최소 0.2ml를 항응고제인 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)을 포함하는 시험관에 포집하였고, 완전히 혼합하였고, -20℃에서 보관하 였다.

약동력학 분석-프로토콜 2:

투여할 용액을 제조하기 위해, 5 mg 시료 화합물을 100㎕ 에탄올에 녹여, 50 mg/mL의 화합물 용액을 만들었다. 그런 다음, 0.15 M NaCl(0.9% w/v 식염수) 약 2.4 ml, 5% v/v 트윈 20, 및 5% v/v PEG 400(최종 에탄올 농도 4% v/v)을 첨가함으로써, 용액을 2 mg/mL까지 희석하였다.

10mg/kg p.o 또는 2mg/kg i.v. 농도에서 테스트 화합물 10 mg/kg p.o. 또는 2 mg/kg i.v.의 단일 투여량을 3마리의 암컷 BaIb C 마우스 그룹에게 투여하였다. 5분, 15분, 60분, 4시간, 8시간 및 24시간이 될 때, 그룹을 죽였고, 약 0.2 ml로 전체 혈액 시료를 EDTA에서 메워 최종 농도가 0.5mM이 되도록 하였고, 또한 뇌를 제거하였다. 전체 혈액과 뇌 모두를 액체형 질소에서 스냅 동결시켰고, 분석하기 위해 고체형 이산화탄소에서 운반할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

약동력학 연구 시료의 분석

ASI Limited(St George's Hospital Medical School, London)에 의해 분석을 수행하였다. 제공된 혈액과 뇌 시료에 있는 시료 화합물의 농도를 MS 검출이 가능한 HPLC로 결정하였다. 시료 화합물이 없는 대조군 혈액 시료를 Harlan Sera-Lab Limited(Loughborough, England)으로부터 수득하였다. 시간이 0일 때 뇌 시료를 시료 화합물이 없는 뇌 시료로서 제공받았다.

뇌 시료의 제조:

각각의 뇌의 한쪽 반구를 5 mL 물로 균질화하였다.

시료의 추출:

마우스 뇌 또는 혈액의 대조군 또는 테스트 시료(0.05 mL), 내부 표준 용액(0.1 mL), 5% 황화 아연 용액(0.5 mL), 및 아세톤(0.5 mL)을 2 mL 폴리프로필렌 시험관(Sarstedt Limited, Beaumont Leys, Leicester, UK)에 피펫으로 넣었고, 그런 다음 얻은 내용물을 최소 5분 동안 혼합하였다(IKA-Vibrax-VXR mixer, Merck (BDH) Limited, Poole Dorset, UK). 그런 다음, 상기 시험관을 최소 2분 동안 미세원침관(microfuge tube)에서 원심분리하였다. 얻은 용매층을 소듐 히드록시드(0.1 M, 0.1 mL)와 메틸-터트-부틸 에테르(MTBE, 2 mL)를 포함하는 4.5 mL 프로필렌 튜브에 옮겼다. 그런 다음, 상기 튜브를 최소 5분 동안 섞었고(IKA-Vibrax-VXR mixer), 그런 다음 3500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 용매층을 4.5 mL 원뿔형 폴리프로필렌 튜브에 옮겼고, SpeedVac^®에 넣었고, 용매를 증류시켜 건조시켰다.

얻은 건조된 추출액을 0.15 mL 80% 메탄올로 재구성하였고 최소 5분 동안 혼합하였고(IKA-Vibrax-VXR mixer), 3500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 추출액을 자동 샘플러 튜브(auto sampler tube)(NLG Analytical, Adelphi Mill, Bollington, Cheshire, UK)로 옮겼고, 실온으로 고정된 자동-샘플러 쟁반에 놓았다. 각각의 추출액 중 0.03 mL 분취물이 분석 컬럼에 주입되도록 자동-샘플러를 프로그램 짜 놓았다.

실시예 1: 발효 및 시료 화합물의 분리

1.1. 발효와 39- 데스메톡시라파마이신의 분리

하기에서 기술하는 바와 같이, 에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 배양균을 기르고 시클로헥산카르복시산(CHCA)을 주입함으로써 39-데스메톡시라파마이신을 제조하였다.

rapI, rapJ, rapM, rapN, rapO, rapQ 및 rapL 유전자를 포함하는 플라스미드를 WO 제2004/007709호에서 기술된 MG2-10 염색약에 주입함으로써, 에스 히그로스코피쿠스(S. hygroscopicus) MG2-10 [IJMNOQLhis]를 만들었다. 얻은 유전자 카세트를 5' 인-프레임(in-frame) 히스티딘 태그를 포함하는 상기 rapL 유전자와 함께 작제하였다. WO 제2004/007709호에서 기술된 바와 같이, 또한 상기 플라스미드는 이동 기원(origin of transfer), 및 외부 접합체(exconjugant)의 접합과 선택에 의한 MG2-10의 형질 전환을 위한 아프라마이신(apramycin) 저항성 마커(resistance marker), 및 염색체로 부위-특이적 인터그레이션(integration))을 위해 phiBTI 부착 부위(attachment site)를 포함하였다. 이러한 유전자 각각의 분리, 및 포스트-PKS(post-PKS) 유전자의 배합을 포함하는 유전자 카세트의 작제를 위해 사용된 방법은 WO 제2004/007709호에서 기술된 바에 따라 수행하였다.

액체 배양

에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 생장 배양균을 재료와 방법에서 기술한 바에 따라 배양하였다. 50 mL 튜브에서 7 mL 배지 3으로, 생성 배양균(production culture)을 생장 배양균과 함께 0.5 mL로 접종하였다. 7일 동안, 26℃에서, 300 rpm에서 배양을 수행하였다. 30분 동안 흔들면서 1:1 아세토니트릴 로 시료 1 밀리리터를 추출하였고, 10분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하였고, 분석 방법 B(재료와 방법을 참고한다)에 따라 분석하였고 정량하였다. 분석 방법 C(재료와 방법을 참고한다)를 사용하여 질량 분광계에 의해 생성물의 확인을 결정하였다.

하기 규명하에 논의된 분석 데이타에 기초하여, 관찰된 라파마이신 유사체는 목표로 하는 39-데스메톡시라파마이신인 것으로 제안되었다.

발효

에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 배지 4에서의 일차적인 생장 배양균을 본질적으로 재료와 방법에서 기술한 바에 따라 배양하였다. 배지 4에서의 2차적인 생장 배양균을 10％ v/v로, 28℃에서, 250rpm에서, 24시간 동안 접종하였다. 20 L 발효기에서, 생장 배양균을 배지 5(재료와 방법을 참고한다)에 5％ v/v로 접종하였다. 6일 동안, 26℃에서, 0.5 vvm에서 배양을 수행하였다. 임펠라 팁(impeller tip) 속도를 1.18 ms^-1의 최소 팁 속도, 2.75 ms^-1의 최대 팁 속도로 변경함으로써, ≥ 30％ 용존 산소를 유지하였다. 접종한 후 24시간과 48시간이 될 때, 시클로헥산카르복시산을 주입하여 최종 농도 2 mM를 제공하였다.

추출과 정제

발효 배양액(30 L)을 동일 부피의 메탄올과 2시간 동안 교반하였고 그런 다음 원심분리하여(10 분, 3500 rpm) 세포를 펠렛으로 만들었다. 상층액을 Diaion^® HP20 레진(43 g/L)과 함께 1시간 동안 교반하였고 그런 다음 여과하였다. 레진을 아세톤을 가지고 배치식으로(batchwise) 수세하여 라파마이신 유사체를 빼내었고, 용매를 진공에서 제거하였다. 그런 다음, 수성 농축물을 물 2 L로 희석하였고, 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 x 2 L). 용매를 진공에서 제거하여 갈색 오일(20.5 g)을 얻었다.

추출액을 아세톤에 녹였고, 실리카에서 물을 제거하였고, 실리카 컬럼(6 x 6.5 cm 직경)에 적용하였고, 아세톤/헥산의 단계적인 농도 구배(20％ - 40％)로 용리하였다. 라파마이신 유사체를 포함하는 분획을 모았고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 얻은 잔여물(2.6 g)을 추가적으로 Sephadex LH20에서 10:10:1 클로로포름/헵탄/에탄올로 용리하는 크로마토그래피하였다(3개의 배치에서). 반 정도 정제된 라파마이신 유사체(1.7 g)를 Gilson HPLC를 사용하고, 65％ 아세토니트릴/물로 21 mL/분으로 Phenomenex 21.2 x 250 mm Luna 5 ㎛ C18 BDS 컬럼으로 용리하는 역상 (C18) 프렙 HPLC에 의해 정제하였다. 가장 순수한 분획(분석 HPLC에 의해 확인함, 방법 B)을 합하였고, 용매를 진공 하에서 제거하여, 39-데스메톡시라파마이신(563 mg)을 얻었다.

규명

39-데스메톡시라파마이신의 ¹H NMR 스펙트럼은 표준 물질(P. Lowden, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 1997)의 스펙트럼과 동일하였다.

배양 추출물의 LCMS와 LCMSⁿ 분석은 라파마이신 유사체의 m/z 비율이 라파마이신의 비율보다 30 원자 질량 단위가 낮음을 보여주었고, 이것은 메톡시기가 없음 과 일치한다. 관찰된 이온: [M-H]^- 882.3, [M+NH₄]⁺ 901.4, [M+Na]⁺ 906.2, [M+K]⁺ 922.2. 소듐 부가물의 분열(fragmentation)은 이미 확인된 분열 경로와 일치하는, 39-데스메톡시라파마이신의 예상되었던 이온을 제공하였다(도 2)(J. A. Reather, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 2000). 이러한 질량 분광 분열 데이타는 시클로헥실 모이어티를 포함하는 단편 C28-C42에서 메톡시기의 손실이 일어나는, 신규 라파마이신 유사체의 영역을 좁혀 준다.

이러한 질량 분광 분열 데이타는 전적으로 39-데스메톡시라파마이신의 구조와 일치한다.

1.2. 발효 및 27-O- 데스메틸 -39- 데스메톡시라파마이신의 분리

하기에서 기술하는 바와 같이, 에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 배양균을 기르고 시클로헥산카르복시산(CHCA)을 주입함으로써 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신을 제조하였다.

rapJ, rapM, rapN, rapO, 및 rapL 유전자를 포함하는 플라스미드를 WO 제2004/007709호에서 기술된 MG2-10 변종에 주입함으로써, 에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]를 만들었다. 얻은 유전자 카세트를 5' 인-프레임(in-frame) 히스티딘 태그를 포함하는 상기 rapL 유전자와 함께 작제하였다. WO 제2004/007709호에서 기술된 바와 같이, 또한 상기 플라스미드는 이동 기원(origin of transfer), 및 외부 접합체(exconjugant)의 접합과 선택에 의한 MG2-10의 형질 전환을 위한 아프라마이신(apramycin) 저항성 마커(resistance marker), 및 염색체 로 부위-특이적 인터그레이션(integration))을 위해 phiBTI 부착 부위(attachment site)를 포함하였다. 이러한 유전자 각각의 분리, 및 포스트-PKS 유전자의 배합을 포함하는 유전자 카세트의 작제를 위해 사용된 방법을 WO 제2004/007709호에서 기술된 바에 따라 수행하였다.

액체 배양

에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 생장 배양균을 재료와 방법에서 기술한 바에 따라 배양하였다. 50 mL 튜브에서 7 mL 배지 3으로, 생성 배양균을 생장 배양균과 함께 0.5 mL로 접종하였다. 7일 동안, 26℃에서, 300 rpm에서 배양을 수행하였다. 30분 동안 흔들면서 1:1 아세토니트릴로 시료 1 밀리리터를 추출하였고, 10분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하였고, 분석 방법 B(재료와 방법을 참고한다)에 따라 분석하였고 정량하였다. 분석 방법 C(재료와 방법을 참고한다)를 사용하여 질량 분광계에 의해 생성물의 확인을 결정하였다.

하기 규명하에 논의된 분석 데이타에 기초하면, 관찰된 라파마이신 유사체는 목표로 하는 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신인 것으로 제안되었다.

발효

에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 배지 2에서의 일차적인 생장 배양균을 본질적으로 재료와 방법에서 기술한 바에 따라 배양하였다. 배지 2에서의 2차적인 생장 배양균을 10％ v/v로, 28℃에서, 250rpm에서, 24시간 동안 접종하였다. 20 L 발효기에서, 생장 배양균을 배지 5(재료와 방법을 참고한다)에 10％ v/v로 접종하였다. 6일 동안, 26℃에서, 0.75 vvm에서 배양을 수행하였다. 임펠 라 팁(impeller tip) 속도를 1.18 ms^-1의 최소 팁 속도, 2.75 ms^-1의 최대 팁 속도로 변경함으로써, ≥ 30％ 용존 산소를 유지하였다. 접종한 후 24시간과 48시간이 될 때, 시클로헥산카르복시산을 주입하여 최종 농도 2 mM가 되도록 하였다.

추출과 정제

발효 배양액(15 L)을 동일 부피의 메탄올과 2시간 동안 교반하였고 그런 다음 원심분리하여(10 분, 3500 rpm) 세포를 펠렛으로 만들었다. 상층액을 Diaion^® HP20 레진(43 g/L)과 함께 1시간 동안 교반하였고 그런 다음 여과하였다. 레진을 아세톤을 가지고 배치식으로(batchwise) 수세하여 라파마이신 유사체를 빼내었고, 용매를 진공에서 제거하였다. 그런 다음, 수성 농축물을 물 2 L로 희석하였고, EtOAc로 추출하였다(3 x 2 L). 용매를 진공에서 제거하여 갈색 오일(12 g)을 얻었다.

추출액을 아세톤에 녹였고, 실리카에서 물을 제거하였고, 실리카 컬럼(4 x 6.5 cm 직경)에 적용하였고, 아세톤/헥산의 단계적인 농도 구배(20％ - 40％)로 용리하였다. 라파마이신 유사체를 포함하는 분획을 모았고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 얻은 잔여물(0.203 g)을 Gilson HPLC를 사용하고, 65％ 아세토니트릴/물로 21 mL/분으로 Phenomenex 21.2 x 250 mm Luna 5 ㎛ C18 BDS 컬럼으로 용리하는 역상 (C18) 프렙 HPLC에 의해 정제하였다. 가장 순수한 분획(분석 HPLC에 의해 확인함, 방법 B)을 합하였고, 용매를 진공 하에서 제거하여, 잔여물(25.8 mg)을 얻었다. 얻은 잔여물을 Gilson HPLC를 사용하고, 60％ 아세토니트릴/물로 1 mL/분으 로 Hypersil 4.6 x 150 mm 3 ㎛ C18 BDS 컬럼으로 용리하는 역상 (C18) 프렙 HPLC에 의해 정제하였다. 가장 순수한 분획(분석 HPLC에 의해 확인함, 방법 B)을 합하였고, 용매를 진공 하에서 제거하여, 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신(19.9 mg)을 얻었다.

규명

하기 표 3에서 보여지는 바와 같이, ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신의 구조 및 지정값과 일치하였다.

<표 3>: 500 MHz ¹H-NMR과 125 MHz ¹³C-NMR로 CDCl₃에서 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신의 NMR 결과.

＊값은 ¹³C-NMR 스펙트럼에서 다른 ¹³C-값과 비교될 때 두 배의 인테그레이션(integration)을 보여주었다.

＊입체화학을 결정하지 못하였는데, 더 많은 NMR 실험을 필요로 하므로(1D 및 2D NOESY와 같은 것), 메틸렌의 축 방향(axial)과 측면 방향(axial)의 ¹H의 이러한 값이 지정되지 않았다.

배양 추출물의 LCMS와 LCMSⁿ 분석은 라파마이신 유사체의 m/z 비율이 라파마이신의 비율보다 44 원자 질량 단위가 낮음을 보여주었고, 이것은 메틸기와 메틸시기가 없음과 일치한다. 관찰된 이온: [M-H] 868.7, [M+NH₄]⁺ 887.8, [M+Na]⁺ 892.8. 소듐 부가물의 분열(fragmentation)은 이미 확인된 분열 경로와 일치하는, 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신의 예상되었던 이온을 제공하였다(도 2)(J. A. Reather, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 2000). 이러한 질량 분광 분열 데이타는 시클로헥실 모이어티를 포함하는 단편 C28-C42에서 메톡시기의 손실이 일어나는 라파마이신 유사체의 영역을 좁혀 주고, 단편 C15-C27에서 O-메틸 의 손실이 일어나는 라파마이신 유사체의 영역을 좁혀 준다.

이러한 질량 분광 분열 데이타는 전적으로 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신의 구조와 일치한다.

1.3. 발효 및 16-O- 데스메틸 -27-O- 데스메틸 -39- 데스메톡시라파마이신의 분리

하기에서 기술하는 바와 같이, 에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 배양균을 기르고 시클로헥산카르복시산(CHCA)을 주입함으로써 16-O-데스메틸-27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신을 제조하였다.

rapI, rapJ, rapN, rapO, 및 rapL 유전자를 포함하는 플라스미드를 WO 제2004/007709호에서 기술된 MG2-10 변종에 주입함으로써, 에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]를 만들었다. 얻은 유전자 카세트를 5' 인-프레임(in-frame) 히스티딘 태그를 포함하는 상기 rapL 유전자와 함께 작제하였다. WO 제2004/007709호에서 기술된 바와 같이, 또한 상기 플라스미드는 이동 기원, 및 외부 접합체의 접합과 선택에 의한 MG2-10의 형질 전환을 위한 아프라마이신 저항성 마커, 및 염색체로 부위-특이적 인터그레이션을 위해 phiBTI 부착 부위를 포함하였다. 이러한 유전자 각각의 분리, 및 포스트-PKS 유전자의 배합을 포함하는 유전자 카세트의 작제를 위해 사용된 방법을 WO 제2004/007709호에서 기술된 바에 따라 수행하였다.

액체 배양

에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 생장 배양균을 재료와 방법에서 기술한 바에 따라 배양하였다. 50 mL 튜브에서 7 mL 배지 3으로, 생성 배양균 을 생장 배양균과 함께 0.5 mL로 접종하였다. 7일 동안, 26℃에서, 300 rpm에서 배양을 수행하였다. 30분 동안 흔들면서 1:1 아세토니트릴로 시료 1 밀리리터를 추출하였고, 10분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하였고, 분석 방법 B(재료와 방법을 참고한다)에 따라 분석하였고 정량하였다. 분석 방법 C(재료와 방법을 참고한다)를 사용하여 질량 분광계에 의해 생성물의 확인을 결정하였다. 분석 방법 C(재료와 방법을 참고한다)를 사용하여 질량 분광계에 의해 생성물의 확인을 결정하였다.

하기 규명하에 논의된 분석 데이타에 기초하면, 관찰된 라파마이신 유사체는 목표로 하는 16-O-데스메틸-27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신인 것으로 제안되었다.

발효

에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 배지 2에서의 일차적인 생장 배양균을 본질적으로 재료와 방법에서 기술한 바에 따라 3일 동안 배양하였다. 배지 2에서의 2차적인 생장 배양균을 10％ v/v로, 28℃에서, 250rpm에서, 48시간 동안 접종하였고, 3차적인 배양균을 10％ v/v로, 28℃에서, 250rpm에서, 24시간 동안 접종하였다. 3 x 7 L 발효기에서, 생장 배양균을 배지 5(재료와 방법을 참고한다)에 10％ v/v로 접종하였다. 6일 동안, 26℃에서, 0.75 vvm에서 배양을 수행하였다. 임펠라 팁(impeller tip) 속도를 0.94 ms^-1의 최소 팁 속도, 1.88 ms^-1의 최대 팁 속도로 변경함으로써, ≥ 30％ 용존 산소를 유지하였다. 접종한 후 24시간이 될 때, 시클로헥산카르복시산을 주입하여 최종 농도 1 mM가 되도록 하였다. L-라이신을 t=0에서 주입하였다.

추출과 정제

발효 배양액(12 L)을 동일 부피의 메탄올과 2시간 동안 교반하였고 그런 다음 원심분리하여(10 분, 3500 rpm) 세포를 펠렛으로 만들었다. 상층액을 Diaion^® HP20 레진(43 g/L)과 함께 1시간 동안 교반하였고 그런 다음 여과하였다. 레진을 아세톤을 가지고 배치식으로(batchwise) 수세하여 라파마이신 유사체를 빼내었고, 용매를 진공에서 제거하였다. 그런 다음, 수성 농축물을 물 2 L로 희석하였고, EtOAc로 추출하였다(3 x 2 L). 용매를 진공에서 제거하여 갈색 오일(8.75 g)을 얻었다.

추출액을 아세톤에 녹였고, 실리카에서 물을 제거하였고, 실리카 컬럼(4 x 6.5 cm 직경)에 적용하였고, 아세톤/헥산의 단계적인 농도 구배(20％ - 40％)로 용리하였다. 라파마이신 유사체를 포함하는 분획을 모았고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 얻은 잔여물(0.488 g)을 Sephadex LH20에서 10:10:1 클로로포름/헵탄/에탄올로 용리하면서 추가로 크로마토그래피하였다(3회의 배치로). 라파마이신 유사체를 포함하는 분획을 모았고 진공 하에서 용매를 제거하였다. 반 정제된 라파마이신 유사체(162 mg)을 Gilson HPLC를 사용하고, 65％ 아세토니트릴/물로 21 mL/분으로 Phenomenex 21.2 x 250 mm Luna 5 ㎛ C18 BDS 컬럼으로 용리하는 역상 (C18) 프렙 HPLC에 의해 정제하였다. 가장 순수한 분획(분석 HPLC에 의해 확인함, 방법 B)을 합하였고, 용매를 진공 하에서 제거하여, 16-O-데스메틸-27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신(44.7 mg)을 얻었다.

규명

배양 추출물의 LCMS와 LCMSⁿ 분석은 모든 다른 39-데스메톡시 유사체보다 훨씬 일찍 용리하는 신규 라파마이신 유사체가 존재함을 보여주었다. 라파마이신 유사체의 다양한 이온의 m/z 비율이 라파마이신보다 58 원자 질량 단위가 낮음을 보여주었고, 이것은 두 개의 O-메틸기와 한 개의 메톡시기가 없음과 일치한다. 관찰된 이온: [M-H]^- 854.7, [M+NH₄]⁺ 877.8, [M+Na]⁺ 892.7, [M+Na]⁺ 908.8. 소듐 부가물의 분열(fragmentation)은 이미 확인된 분열 경로와 일치하는, 16-0-데스메틸-27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신의 예상되었던 이온을 제공하였다(도 2)(J. A. Reather, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 2000). 이러한 질량 분광 분열 데이타는 시클로헥실 모이어티를 포함하는 단편 C28-C42에서 메톡시기의 손실이 일어나는 라파마이신 유사체의 영역을 좁혀 주고, 단편 C15-C27에서 O-메틸의 손실이 일어나는 라파마이신 유사체의 영역을 좁혀 준다. 이러한 NMR과 질량 분광 분열 데이타는 전적으로 16-O-데스메틸-27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신의 구조와 일치한다.

실시예 2: 항암 활성의 생체 외 평가

39- 데스메톡시라파마이신의 항암 활성의 생체 외 평가

변형된 프로피디윰 요오드(propidium iodide) 분석을 사용하는 상기 일반적 인 방법에서 프로토콜 1로 기술된 바에 따라, 단일층 증식 분석에서 12개의 인간 종양 세포주 패널에 대한 39-데스메톡시라파마이신의 항암 활성의 생체 외 평가를 수행하였다.

그 결과를 하기 표 4에 나타내었고, 각각의 결과는 2회의 반복 실험의 평균을 나타낸다. 표 5는 테스트된 세포 주에 있어서 화합물과 라파마이신의 IC₅₀과 IC₇₀을 보여준다.

<표 4>

<표 5>

39- 데스메톡시라파마이신의 다 약제 내성( MDR ) 선택적 항암 활성의 생체 외 평가

단일층 증식 분석에서 인간 종양 세포주 중 NCI 60 세포주 패널에 대한 39-데스메톡시라파마이신의 선택적 MDR 항암 활성의 생체 외 평가를 SRB에 근거하는 분석을 사용하는, 재료와 방법 중 프로토콜 2에 기술된 바에 따라 수행하였다.

그 결과를 하기 표 6에서 나타낸다.

<표 6> 매우 MDR-나타내는 세포주에 대한 생체 외 활성

한 개의 세포주만을 제외하고는, 39-데스메톡시라파마이신은 라파마이신과 비교할 때, 매우 MDR-나타내는 세포주에 대해 동등하거나 또는 개선된 효능을 갖고 있음을 알 수 있다.

실시예 3: 생체 외 ADME 분석

Caco -2 투과성 분석

24 웰 Corning Costar Transwell 포맷에 있는 집합성 Caco-2 세포(Li, A.P., 1992; Grass, G. M., et al ., 1992, Volpe, D.A., et al ., 2001 )가 In Vitro Technologies Inc.(IVT Inc., Baltimore, Maryland, USA)에 의해 제공되었다. 첨부 챔버(apical chamber)는 0.15 mL 행크의 균형맞춘 완충 용액(Hank's balanced buffer solution, HBBS) pH 7.4, 1 % DMSO, 0.1 mM 루시페르 옐로우(Lucifer Yellow)를 포함하였다. 바닥 챔버(basal chamber)는 0.6 mL HBBS pH 7.4, 1% DMSO를 포함하였다. 대조군과 시료를 가습 배양기에서 37℃에서 배양하였고, 130 rpm에서 1시간 동안 흔들어주었다. 루시페르 옐로우는 세포사이(paracellular)(꽉 뀌는 접합 사이) 경로를 통해서만 투과하고, 루시페르 옐로우의 높은 겉보기 투과도(Apparent Permeability Papp)는 분석하는 동안 세포 손상을 나타내고, 그러한 모든 웰은 제거되었다. 프로파놀올(공지된 트랜스포터 효과가 없는, 좋은 수동적 투과)과 아세부탈올(acebutalol)(P-당단백질에 의한 능동적 배출에 의해 약화된, 좋지 못한 수동적 투과)을 표준 화합물로 사용하였다. 화합물을 첨부 챔버 또는 바닥 챔버에 화합물을 적용함으로써(0.01 mM에서), 일 방향 및 이 방향 포맷에서 테스트할 수 있다. 첨부 챔버 또는 바닥 챔버에 있는 화합물을 HPLC-MS에 의해 분석한다(방법 A, 재료와 방법을 참고한다). 그 결과를 겉보기 투과도, Papp, (nm/s)와 플럭스 비율(Flux Ratio)(A 대 B와 B 대 A에 대하여)로서 표현하였다.

용적 수용체(Volume Acceptor): 0.6 ml (A>B) 및 0.15 ml(B>A)

단일층 면적: 0.33 cm²

△시간: 60분

플럭스 비율의 양의 값은 세포의 첨부 표면(apical surface)으로부터 능동적 배출을 나타낸다.

인간의 간 마이크로좀(Human Liver Microsomal, HLM) 안정성 분석

간 균질 현탁액(homogenate)은 화합물의, CYP450(예를 들면, CYP2C8, CYP2D6, CYP1A, CYP3A4, CYP2E1), 에스테라제, 아미다제, 및 플라빈 모노옥시게나제(FMO)를 포함하는, 단계 I(산화) 효소에 대해 본질적인 약한 정도의 측정값을 제공한다.

테스트 화합물의 반감기(T1/2)는 인간 간 마이크로좀에 대한 노출에서, LC-MS에 의해서 시간에 따른 소멸을 모니터함으로써 결정될 수 있다. 0.001 mM에서 화합물을 0.25 mg/mL 단백질의 인간의 간 마이크로좀 세포 이하의(sub-cellular) 부분 및 보인자로서 포화 수준의 NADPH와 함께 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4에서 40분 동안 37℃에서 배양하였다. 정기적인 간격으로, 단백질을 침전시키고 대사를 중단시키기 위해 아세토니트릴을 테스트 시료에 첨가하였다. 시료를 원심 분리하였고, 분석 방법 A(재료와 방법을 참고한다)를 사용하여 모체 화합물을 위해 분석하였다.

<표 7> 생체 외 ADME 분석 결과

실시예 4: 생체 외 결합 분석

FKBP12

FKBP12는 화학적 변성제인 구안디니윰 히드로클로라이드(GdnHCl)에서 가역적으로 펼쳐지고, 상기 펼쳐짐은 단백질의 본질적인 형광성의 변화에 의해 모니터될 수 있다(Main et al ., 1998). 특이적으로 결합하여 FKBP12의 본래 상태를 안정화시키는 리간드들은 변성 곡선을 이동시켜, 단백질이 화학적 변성제의 보다 높은 농도에서 펼쳐지게 한다(Main et al ., 1999). 안정성의 차이로부터 리간드-결합 상수를 하기의 식 1을 사용하여 결정할 수 있다.

상기에서 △G _app 는 유리된 형태와 리간드-결합 형태 사이의 펼쳐짐의 자유 에너지의 겉보기 차이이고, 은 유리 상태 단백질의 물에서의 펼쳐짐의 자유 에너지이고, [L]은 리간드의 농도이고, K_d는 단백질-리간드 복합체의 해리 상수이 다(Meiering et al ., 1992). 펼쳐짐의 자유 에너지는 하기의 식을 사용하여 펼쳐진 전이 상태(unfolding transition)의 중앙값과 관련될 수 있다.

상기에서 m _D _-N 은 제공된 단백질과 제공된 변성제에 따른 상수이고 이것은 펼쳐짐에서 잔기의 노출 정도의 변화에 비례하고(Tanford 1968과 Tanford 1970), [D]_50％는 펼쳐짐의 중앙값에 상응하는 변성제의 농도이다. 우리는 (같은 리간드 농도에서)라파마이신과 알려져지 않은 리간드에 대한 FKBP12의 안성성의 차이를

로서

으로 정의하고

상기에서 <m _D _-N >은 펼쳐진 전이 상태의 평균 m-값이고, △[D]_50％는 라파마이신-FKBP12 펼쳐진 전이 상태의 중앙값과 알려지지 않은 리간드-FKBP12 복합체의 펼쳐진 전이 상태의 중앙값의 차이이다. [L] > K_d인 조건하에서, △△G _D _-N 은 하기 식 4를 통해 두 개의 화합물의 상대적인 K_d와 관련될 수 있고,

상기에서,

은 라파마이신의 해리 상수이고,

는 알려지지 않은 리간드 X의 해리 상수이다. 따라서,

이 된다.

39-데스메톡시라파마이신의 K_d 결정을 위하여, 각각의 변성 곡선을 맞추어 m _D-N 과 [D]_50％를 위한 값을 산출하고, 이것을 사용하여 평균 m-값, < m _D _-N >, 및 △[D]_50％를 계산할 수 있고, 따라서,

을 계산할 수 있다.

의 문헌적 값인 0.2 nM이 사용된다.

<표 8> 생체 외 FKBP12 결합 분석 결과

mTOR

mTOR 경로의 대리 마커(surrogate marker)와 p70S6 키나제 및 S6의 인산화반응의 수준의 측정을 통하여, mTOR의 억제를 간접적으로 입증하였다(Brunn et al., 1997; Mothe-Satney et al ., 2000; Tee and Proud, 2002; Huang and Houghton, 2002).

HEK293 세포를 FLAG-태그된(tagged) mTOR과 myc-태그된 랩터(Raptor)로 동시 에 트랜스팩션시켰고, 24시간 동안 배양하였고, 그런 다음 혈청을 밤새 주지 않았다. 세포를 100 nM 인슐린으로 촉진하였고 그런 다음 수확하였고, 3회의 동결/녹임 사이클에 의해 세포를 용해하였다. 얻은 용해물을 모았고, 동일한 함량으로 mTOR/랩터 복합체를 위한 FLAG 항체와 함께 면역 침전시켰다(immunoprecipitation). 그런 다음, 면역 침전을 진행시켰다: 화합물(0.00001 내지 0.003 mM)로 처리한 시료를 FKBP12/라파마이신, FKBP12/39-데스메톡시라파마이신 유도체 또는 비히클(DMSO)과 함께 30분 동안 30℃에서 미리 배양하였고, 처리되지 않은 시료를 키나제 완충 용액에서 배양하였다. 그런 다음, 면역 침전을 3 mM ATP, 10 mM Mn² ⁺ 및 기질인 GST-4E-BP1 존재 하에서, 생체 외 키나제 분석을 하였다. 4배의 시료 완충용액으로 반응을 중지시켰고, 그런 다음 15％ SDS-PAGE하였고, PVDF 막으로 습윤 상태로 옮겼고, 그런 다음 포스포-4E-BP1 (T37/46)을 위해 프로브(probe)하였다.

택일적으로는, HEK293 세포를 6 웰 플레이트에 시딩(seeding)하였고, 24시간 동안 미리 배양하였고, 그런 다음 밤새 혈청을 주지 않았다. 세포를 30분 동안 30℃에서 비히클 또는 화합물로 미리 처리하였고, 그런 다음 30분 동안 30℃에서 100 nM 인슐린으로 촉진하였고, 3회의 동결/녹임 사이클에 의해 세포를 용해하였고, 단백질 농도를 분석하였다. 동일한 함량의 단백질을 로딩하였고, SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 습윤 상태로 옮겼고, 그런 다음 포스포-S6 (S235/36) 또는 포스포-p70 S6K (T389)을 위해 프로브하였다.

이 실험의 결과를 도 3에 따라 보여준다.

실시예 5: 생체 외 P- gp 기질 분석

세포주

현재 연구에서 사용된 세포주(MACL MCF7 및 MACL MCF7 ADR)를 모두 미국 국립암센터에서 제공받았다.

일 주일에 1번 또는 2번 세포를 통상적으로 통과시켰다(passaged). 세포를 20회 이하로 통과시키는 동안 배양 상태로 유지하였다. 5 % 송아지 혈청(PAA, Colbe, 독일)과 0.1 % 제타마이신(PAA, Colbe, 독일)을 보충한 RPMI 1640 배지(PAA, Colbe, 독일)에서 가습된 분위기(95% 공기, 5% CO₂)에서 37℃에서 모든 세포를 길렀다.

분석 프로토콜

상기 기술된 프로토콜 1에 기초하여 변형된 프로피디윰 요오드 분석을 사용하여 39-데스메톡시라파마이신의 영향을 평가하였다(Dengler et al ., 1995). 간략하게는, 트립신처리에 의해 기하급수적인 단계의 배양으로부터 세포를 수확하였고, 계수하였고, 5,000 세포/웰의 세포 농도로 96-웰 바닥이-평면인(flat-bottomed) 마이크로티터 플레이트에 플레이트하였다. 세포가 다시 기하급수적인 성장을 하도록 24시간이 지나 회수한 후에, 0.18 mg/mL 또는 0.01 mL 배양 배지의 농도에서 베라파밀(Verapamil) 0.01 ml를 세포에 첨가하여, 웰에서 베라파밀의 최종 농도가 0.01 mg/mL가 되도록 하였다. 이 농도는 이전 실험에서 세포에 대해 비-독성인 것으로 발견되었다. 39-데스메톡시라파마이신, 탁솔을 포함하는 배양 배지 또는 배양 배지 단독(대조군 웰)을 웰 당 0.01 mL로 첨가하였다. 화합물을 0.03 mM에서 10 nM 범위에 이르는 절반 로그 단계(half log step)로 8개의 농도에서 3회 반복적으로 적용하였다. 연속적으로 약물에 3일 동안 노출한 다음, 배지 또는 화합물을 포함하는 배지를 수성 프로피디윰 요오드(PI) 용액(7 mg/L) 0.2 mL로 대체하였다. PI는 물기가 잘 스며들거나 용해된 막만을 통과하므로, 죽은 세포의 DNA는 염색되어 측정되는 반면에, 살아있는 세포는 염색되지 않을 것이다. 살아있는 세포의 비율을 측정하기 위해서, 플레이트를 동결시킴으로써 세포를 투과시켰고, 그 결과 모든 세포의 죽음을 확인하였다. 플레이트를 녹인 후에, Cytofluor 4000 마이크로플레이트 판독기(여기(勵起) 530 nm, 방출 620 nm)를 사용하여 형광을 측정하여, 전체 세포수에 대한 직접적인 관계를 얻었다. 성장 억제를 테스트/대조군 x 100 (％ T/C)로 표시하였다. 양의 대조군(탁솔)이 베라파밀 존재 및 부재 하에 종양 성장 억제에서 이동을 유도하고, 비히클 C처리된 대조군 세포가 >500 형광 강도를 갖는다면, 분석은 가치있는 것으로 고려되었다.

39-데스메톡시라파마이신 테스트 용액의 제조

39-데스메톡시라파마이신의 3.3 mM의 스톡 용액(stock solution)을 DMSO에서 제조하였고 -20℃에서 보관하였다. 그런 다음 상기 스톡 용액을 사용하고자 하는 날 녹였고, 투여하기 전에 및 투여하는 동안에 실온에서 보관하였다. RPMI 1640 배지를 사용하여 희석 단계를 수행하였고, 그 결과 최종 농도의 18배의 용액을 만들었다.

결과

도 4는 정상 세포주(A와 B) 또는 매우 P-gp 발현하는 세포주(C와 D)에서, 파클리탁셀(A와 C)과 39-데스메톡시라파마이신(B와 D)의 모든 테스트 농도에서 %T/C을 입증하는 4개의 그래프를 보여준다. 채워진 다이아몬드는 파클리탁셀 또는 39-데스메톡시라파마이신을 단독으로 투여한 후에 값을 나타내고, 개방된 사각형은 0.01 mg/mL 베라파밀(P-gp 억제제) 존재 하에서 파클리탁셀 또는 39-데스메톡시라파마이신을 투여한 후에 값을 나타낸다.

알려진 P-gp 기질인 파클리탁셀은 P-gp 발현하는 암 세포주 MCF7 ADR을 억제할 때 감소된 역가를 보여주었고, 이러한 감소된 역가는 P-gp 억제제인 베라파밀의 동시 투여에 의해 복원되었다(도 4A와 4C)

39-데스메톡시라파마이신은 베라파밀이 있는 상태 또는 없는 상태에서, P-gp 발현하는 세포주 MCF7 ADR의 성장 증식 곡선의 유효한 이동을 보여주지 않았고(도4B와 4D), 이것은 39-데스메톡시라파마이신이 P-gp의 기질이 아님을 입증한다.

실시예 6 - 약동력학 분석

6.1. 라파마이신과 39- 데스메톡시라파마이신의 PK 분석

상기 기술한 바와 같이, 표준 방법을 사용하는 약동력학 분석을 라파마이신과 39-데스메톡시라파마이신에 대해 수행하였다(각각의 화합물에 대해 사용된 프로토콜을 표 9에서 나타낸다)

Kinetica 4.4 (InnaPhase Corporation)를 사용하고, AUC 계산을 위해서는 비-구획적(non-compartmental) 모델과 수치 적분 방법을 사용하여, 혈액 또는 뇌 조 직에 있는 각각의 화합물의 AUC를 계산하였다.

p.o. 및 i.v. 투여한 이후에, 개개 화합물을 위한 분배 계수(Ri)는 하기에서 보여지는 바에 따라 계산하였다.

이 분석의 결과를 하기 표 9와 도 5에서 요약한다.

<표 9>- 약동력학 데이타 요약

6.2. 라파마이신 , 39- 데스메톡시라파미이신 및 27-O- 데스메틸 -39- 데스메톡시라파마이신의 PK 분석

상기에서 기술된 바에 따라 표준 방법을 사용하여 라파마이신, 39-데스메톡시라파마이신 및 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신을 위한 약동력학 분석을 수행하였다(상기 기술된 프로토콜 1을 사용함).

Kinetica 4.4 (InnaPhase Corporation)를 사용하고, AUC 계산을 위해서는 비-구획적(non-compartmental) 모델과 수치 적분 방법을 사용하여, 혈액 또는 뇌 조직에 있는 각각의 화합물의 AUC를 계산하였다.

i.v. 투여한 이후, 각각의 화합물의 분배 계수(Ri)를 하기에서 보여지는 바에 따라 계산하였다.

<표 10>- 약동력학 데이타

실시예 7 - 다발성 경화증의 실험실적 알러지성 뇌척수염( Experimental Allergic Encephalomyelitis , EAE ) 모델에서 활성

실험실적 알러지성 뇌척수염(EAE)은 중추 신경계(CNS)의 자가 면역성 염증성이고 탈수초성(dernyelinating) 질환이며, 다발성 경화증(MS)을 위한 가장 최적으로 이용가능한 동물 대응물이라고 간주되고 있다. 상기 질환은 유전적으로 민감한 동물에 프로인드 완전 아쥬반트(complete Freund's adjuvant, CFA)에 넣은 전체 척수, 또는 수초 기초 단백질(myelin basic protein, MBP)을 주입함으로서 유도될 수 있다. CNS 손상과 관련되는 항원-특이적 작용기 세포(effector cell)는 CD4+ T 림프구로 제한되는 클래스 II 주요 조직 접합성 복합체(major histocompatibility complex, MHO)이다. 최근, 염증성 반응에서 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 또는 인터페론(IFN)과 같은 시토카인의 역할이 높은 관심을 받고 있다. 항원에 의해 활성화되자마자, T 세포는 EAE의 경우에, CNS 손상에 직접적으로 또는 간접적으로 반응할 수 있는 수 개의 림포카인을 생성한다. EAE의 발병과 관련될 것은 같은 림포카인은 IL-2, IFN-γ, 및 TNF-β이다. IL-2는 T 세포 활성화와 증식에서 중요한 역활을 하는 반면에, IFN-γ는 마크로파지 활성화의 강력한 매개체이다. 또한, IFN-γ는 IN-1과 같은 염증성 시토카인의 생성을 유도한다. TNF, 및 또한 다른 것들 중에서도, CNS 혈관 벽의 내피 세포에서, 및 별아교세포에서 클래스 II MHC 분자의 발현은 뇌염을 유발하는 T 세포의 항원 전달에서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

7.1.- 동물과 면역화 절차

8주령 내지 10주령의 수컷 루이스 랫트(Lewis rat)를 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하고 표준 실험실 조건(비 특이적 병원체가 없음)에서 길렀다. 50 mL 불완전 프로인드 아쥬반트(Freund's incomplete adjuvant, Difco, Detroit, Ml)와 25 mg 기니아 피그 척수 및 1 mg 미코박테리윰 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 변종 H 37 RA (Difco)를 꼬리 기부에 1회 주입함으로써 EAE를 유도하였다.

7.2.- 임상 및 조직학적 기록

면역화한 후 30일까지, 매일 랫트의 체중과 EAE의 임상 징후를 측정함으로써 랫트를 조사하였다. 처리를 모르는 관찰자에 의해 하기의 임상 등급화를 수행하였다: 0 = 질병이 없음, 1 = 꼬리가 축 늘어짐, 2 = 약간 대부전 마비(paraparesis)가 옴, 3 = 심각하게 대부전 마비(paraparesis)가 옴, 4 = 다 죽어가는 상태, 5 = 죽음. 연속적으로 5일 동안 등급 0으로 된 랫트에 대해, 임상 증상이 완전히 사라지고 면역화 전 기간의 운동성을 회복하였을 때, 질환이 없어졌다고 정의하였다.

7.3.- 실험상 처리

예방 계획(prophylactic regime) 및 치료 계획(therapeutic regime) 모두에서 시료 화합물을 다양한 투여량으로 제공하였다(5 또는 15 mg/kg체중). 연구 중 예방 계획 파트를 위해서는, 면역화하기 하루 전에 처리를 시작하였고, 연구 중 치료 계획 파트를 위해서는, 면역화한 후 7일이 될 때 처리를 개시하였다(p.i.). 예방 목적으로 또는 치료 목적으로, 동일한 실험 조건 하에서 처리된 비히클-처리된 랫트를 대조군으로 사용하였다. p.i하고 30일이 될 때까지 일 주일에 6회 매일 p.o.로 처리를 하였다. 시클로포스파미드를 양성 대조군으로 사용하였다.

실험 결과를 도 6과 하기 표 11에 나타낸다. 도 6A는 5 및 15 mg/kg에서 39-데스메톡시라파마이신의 예방 계획의 효과를 보여주고, 도 6B는 5 및 15 mg/kg에서 39-데스메톡시라파마이신의 치료 계획의 효과를 보여준다. 각각의 계획에서, 40 mg/kg 시클로포스파미드의 효과를 양성 대조군으로 보여준다. 두 개의 그래프에서, 각각의 그룹의 중간값를 보여준다. 39-데스메톡시라파마이신은 이 모델에서 시클로포스파미드와 동등한 효능을 갖고 있고, 39-데스메톡시라파마이신은 증상의 심각성을 감소시킬뿐만 아니라 삽화의 지속(duration of the episode)을 감소시킴을 알 수 있다. 7 마리의 비히클-처리된 랫트 중 5마리에 관한 연구를 하는 동안 죽음으로 인하여, 이 그룹의 평균값은 5로 유지되었지만, 두 마리의 살아있는 랫트 모두 결국 28일이 될 무렵 기본 값으로 복귀하였음을 주목해야 한다.

<표 11>

＊-비히클-처리된 대조군과 통계학적으로 다름, p<0.05, Mann Whitney Rank Sum 테스트.

실시예 8 - 누드 마우스에 신경아교종이 같은 자리에 이종이식된( glioma orthotopically xenografted ) 모델에서 39- 데스메톡시라파마이신의 항종양 활성 연구

8.1. 연구 준비

8.1.1 - 시료 제조:

테스트 화합물을 에탄올에 녹였고(0.027 mL/mg 화합물), 얻은 용액이 투명하게 될 때까지 20분 동안 볼텍싱하였다. 얻은 에탄올성 용액을 적절하게 분취하였고, -20℃에서 보관하였다. 그런 다음, 얻은 에탄올성 용액을 비히클을 가지고 정확한 농도로 맞추었다(4% 에탄올, 5% 트윈-20, 0.15 M NaCl에 넣은 5% 폴리에틸렌 글리콜 400, 가능하다면 멸균된 내독소가 없는 성분과 함께 제조함).

8.1.2. - 투여 수단

테스트 물질과 대조군 비히클을 테스트 동물의 꼬리 정맥 안으로 주입함으로써 정맥 내로(IV, 덩어리) 투여하였다. 가장 최근의 마우스 체중에 기초하여, 10 mL/kg의 주입 부피를 사용하였다.

8.1.3. - 암 세포 주

연구에 사용된 세포주는, 44세 코카시안 여성의 등급 III 교아세포종(glioblastoma)으로부터 J. Ponten에 의해 개시된 교아세포종 세포 주인 U87-MG이었다(Poten et al ., 1968).

8.1.4. - 세포주 형성을 위한 세포 배양 조건

종양 세포를 습윤한 분위기(5% CO₂, 95% 공기)에서 37℃에서 단일층으로 길렀다. 배양 배지는 10% 우태아 혈청(참조 DE 14-801 E, Cambrex)을 보충한 2mM L-글루타민을 포함하는 RPM1 1640(참조 BE12-702F, Cambrex)이었다. 세포는 플라스틱 플라스크에 부착되었다. 실험에 사용하기 위해, 칼슘 또는 마그네슘이 없는 행크스 배지(Hanks' medium)(Ref. BE10-543F, Cambrex)에서 트립신-베르센(trypsin-versene)(Ref. BE17-161E, Cambrex)으로 처리하는 5분 동안, 배양중인 플라스크로부터 종양 세포를 떼어내었다. 혈구 계산기에서 세포를 계수하였고, 이들의 생존도를 0.25% 트리판 블루 염색법(trypan blue exclusion)으로 평가하였다.

8.2.- 누드 마우스의 뇌에서 정위 방법의 주입에 의한 교아세포종의 유도

γ-급원(2.5 Gy, Co⁶⁰, INRA BRETENIERE, Dijon)을 몸 전체에 조사한 후에, 24 내지 48시간, DO에서 U87-MG 세포를 마우스에게 정위 방법으로 주입하였다. 종양 세포의 정위 방법에 의한 주입을 위해, 0.9% NaCl 용액에 넣은 케타민(Ketamine5OO^®, 참조 043KET204, Centravet, 프랑스) 100 mg/kg과 실라진(Xylazine)(Rompun^®, Ref 002ROM001, Centravet, 프랑스) 5 mg/kg을 10 mL/kg/주입량으로 복막 속으로 주입하여, 마우스를 마취시켰다. RPMI-1640 배지 0.002 mL에서 재-현탁한 1 x 10⁵ U87-MG 종양 세포를, 마우스의 오른쪽 귓 볼 전면부에 3개의 독립적인 정위 방법 장치(Kopf Instrument, Germany and Stoelting Company, USA)를 사용하여 세포를 정위 방법으로 주입하였다. 상기 세포 현탁액 0.002 mL를 500 nL/분으로 주입하였다.

8.3 - 처리 계획

D7 때에, 마우스의 체중을 재었고, 이들의 개별적인 체중에 따라 마우스를 3개 그룹으로 임의로 나누었다. MRI 영상을 위해, 각각의 처리군에 4마리의 마우스를 추가로 첨가하였다. 각각의 그룹의 평균 체중이 다른 그룹과 통계학적으로 다르지 않도록 그룹을 선택하였다(분산 분석법). 테스트 물질을 하기에서 정한 바와 같이 투여하였다.

8.3.1. 그룹 1의 마우스는 3일 연속으로 테스트 물질 비히클을 매일 IV 주입하는 5회의 사이클을 경험하였다(D7에서 D9, D14에서 D16, D21에서 D23, D28에서 D30, 및 D35에서 D37: (Q1Dx3)x5W). 각각의 사이클은 장 세척하는 4일 기간만큼 나누어져 있다.

8.3.2 그룹 2의 마우스는 D7에서 D9, D14에서 D16, D21에서 D23, D28에서 D30 및 D35에서 D37(Q1Dx3)x5W)로 3일 연속으로 3 mg/kg/주입량으로 39-데스메톡시라파마이신을 매일 IV 주입하는 5회의 사이클을 경험하였다. 각각의 사이클은 장 세척하는 4일 기간만큼 나누어져 있다.

8.3.3. 그룹 3의 마우스는 처리하지 않았다.

처리 계획을 하기 표 12에 요약한다.

<표 12>

8.4.- MRI 분석

뇌의 MRI 분석을 D23과 D37에 수행하였다. 모든 MRI 분석을 Pharmascan magnet (Bruker, Wissembourg)에서 4.7T로 수행하였다. 마우스 전용 크레이들과 38 mm 직경의 원형 코일 안에 이소플루란으로 계속해서 마취시키면서 마우스를 넣었다.

3회 운전 획득(acquisition)한 후에, 터보레어(turboRare) T2 가중된 시퀀스(weighted sequence)를 수행하였다. 획득은 종양을 포함하여 전체 뇌를 포괄하였다. 각각의 슬라이스(slice)에서 종양 주변의 관심 부위(region of interest, ROI)를 손으로 그리고, 모든 표면을 합산함으로써 종양 부피를 측정하였다.

8.5.- 결과

도 7은 43일까지의 각각의 처리 그룹의 생존 그래프를 보여준다.

또한, 결과를 T가 39-데스메톡시라파마이신으로 처리된 동물 중 평균 생존 시간을 나타내고 C가 비히클로 처리된 대조군 동물의 평균 생존 시간을 나타내는 퍼센트(T/C%)로 표현하였다. T/C%를 하기와 같이 계산하였다.

T/C%= [T/C] x 100

또한, MRI 분석을 사용하여 처리 그룹당 계산된 종양 부피의 평균을 계산하였고, 그 결과를 하기 표 13에서 요약한다. 모든 비히클 처리된 동물들은 37일이 될 때까지 죽었기 때문에, 이 단계에서 종양 크기를 비교하는 것은 불가능하였다.

<표 13>

각각의 데이타 점수는 4개의 평균값을 나타낸다.

참조문헌

Claims

신경 손상 또는 질환으로부터 생기는 의학적 상태의 치료를 위한 의약 제조에서, R₁은 (H, H) 또는 =0를 나타내고 R₂와 R₃은 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH₃를 나타내는 하기 화학식 (I)에 따른 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도.
중추 신경계에 영향을 미치는 의학적 상태의 치료를 위한 의약 제조에서, R₁은 (H,H) 또는 =O를 나타내고 R₂와 R₃은 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH₃을 나타내는 하기 화학식 (I)에 따른 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 용도로서, 상기 의학적 상태는 혈액 뇌 장벽을 통과하는 의약을 필요로 하는 것인 용도.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 의학적 상태는 뇌 종양과 신경퇴행성 상태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
제3항에 있어서, 상기 의약은 뇌 종양의 치료를 위한 것인 용도.
제4항에 있어서, 상기 뇌 종양은 다형성 아교모세포종(glioblastoma multiforme)인 것인 용도.
제3항에 있어서, 상기 의약은 신경퇴행성 상태의 치료를 위한 것인 용도.
제6항에 있어서, 상기 신경퇴행성 상태는 알츠하이머 질환인 것인 용도.
제6항에 있어서, 상기 신경퇴행성 상태는 다발성 경화증(multiple sclerosis)인 것인 용도.
암 또는 B-세포 악성 종양의 치료를 위한 의약 제조에서, R₁이 (H,H) 또는 =0를 나타내고 R₂와 R₃이 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH₃을 나타내는 하기 화학식 (I)에 따른 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도로서, 상기 암 또는 B-세포 악성 종양은 하나 이상의 기존 항암제에 저항성이 있는 것인 용도.
제9항에 있어서, 상기 암 또는 B-세포 악성 종양은 P-당단백질(P-glycoprotein)을 발현하는 것인 용도.
제10항에 있어서, 상기 암 또는 B-세포 악성 종양은 P-당단백질의 높은 발현 수준을 갖는 것인 용도.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약은 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 정맥 내로 투여하기 위한 것인 용도.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약은 하나 이상의 다른 치료적 효능제를 더 포함하는 것인 용도.
제3항 내지 제5항 또는 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약은 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료를 위한 것이고, 상기 의약은 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프리니손(prenisone), 블레오마이신, 시클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 파클리탁셀, 도세탁셀(docetaxel), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜(toremifene), 메게스트롤(megestrol) 아세테이트, 아나스트로졸(anastrozole), 고세렐린(goserelin), 항-HER2 모노클로날 항체(anti-HER2 monoclonal antibody)(예를 들면, Herceptin^TM), 카페시타빈, 랄록시펜 히드로클로라이드, EGFR 억제제, VEGF 억제제, 프로테아좀 억제제 및 hsp90 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 더 포함하는 것인 용도.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 39-데스메톡시라파마이신인 것인 용도.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 라파마이신과 9번, 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 추가로 다른 것인 용도.
제16항에 있어서, 상기 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 16번 또는 27번 위치 중 하나 이상에서 라파마이신과 다른 것인 용도.
제16항에 있어서, 상기 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 16번과 27번 위치에서 라파마이신과 다른 것인 용도.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 27번 위치에 히드록시기를 갖는 것인, 즉 R₃가 OH를 나타내는 것인 용도.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 27번 위치에 수소를 갖는 것인, 즉 R₃가 OH를 나타내는 것인 것인 용도.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 16번 위치에 히드록시기를 갖는 것인, 즉 R₂가 OH를 나타내는 것인 용도.
약제학적으로 허용가능한 캐리어와 함께, R₁은 (H, H) 또는 =0를 나타내고 R₂와 R₃은 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH₃를 나타내는 하기 화학식 (I)에 따른 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물.
특히 정맥 내 투여를 위해 제제화된 제23항의 약제학적 조성물.