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KR20050042134A - Ｂ형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 ｌ-ｆｍａｕ를사용한 병용 치료 - Google Patents

Ｂ형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 ｌ-ｆｍａｕ를사용한 병용 치료 Download PDF

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KR20050042134A
KR20050042134A KR1020057000769A KR20057000769A KR20050042134A KR 20050042134 A KR20050042134 A KR 20050042134A KR 1020057000769 A KR1020057000769 A KR 1020057000769A KR 20057000769 A KR20057000769 A KR 20057000769A KR 20050042134 A KR20050042134 A KR 20050042134A
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dna
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virus
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KR1020057000769A
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퓨어맨필립에이
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길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명의 FTC와 병용 및/또는 교대 및 인터페론 알파 또는 인터페론 감마와 같은 인터페론과 병용 및/또는 교대하여 투여된 L-FMAU는 인간에게 B형 간염 바이러스에 대한 우수한 치료효과를 나타낸다.

Description

Ｂ형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 Ｌ-ＦＭＡＵ를 사용한 병용 치료{COMBINATION THERAPIES WITH L-FMAU FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS B VIRUS INFECTION}
본 출원은 2002년 7월 15일에 출원된 미국 특허 출원 제60/396,117호를 우선권 주장하였다.
본 발명은 유효량의 L-FMAU, FTC 및 인터페론의 투여를 포함하는, 숙주에 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
유효한 백신의 존재에도 불구하고, B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 400백만의 만성 보균자를 포함하는 전세계에 걸친 주된 공중 건강 문제로 남아있다. 이들 감염된 환자는 간경화 및 간세포성 암으로 진행될 위험에 노출되어 있다(Lee, W. M. 1997, N. Engl. J. Med. 337: 1733-1745). 현재, 미국에는 혈액 및 체액의 접촉에 의해 매년 20만명의 사람이 새로 감염되며, 약 1백 25만명의 만성 B형 간염 보균자가 있다고 믿어진다.
B형 간염 바이러스("HBV")는 인간 암의 원인으로서 담배에 이어 2위이다. HBV가 암을 유발하는 기전이 알려져 있지 않지만, 직접적으로 암의 발생을 촉발하거나, 간접적으로 만성 염증, 간경화 및 감염에 관련된 세포 퇴화를 통한 암의 발생을 촉발할 수 있는 것으로 가정되고 있다.
HBV에 감염된 인간의 수는 유행성의 수준에 이르렀다. 감염된 사실을 모른는 숙주에 2~6개월간 잠복기후에, HBV 감염은 복통, 황달, 특정 효소의 증가된 혈액농도를 나타내는 급성 간염 및 간손상을 유발할 수 있다. HBV는 빠른 진행성의 전격성 간염을 유발할 수 있어, 간의 대분분을 파괴하여 치명적인 질환의 형태에 이를 수 있다. 환자는 급성 바이러스 간염으로부터 일반적으로 회복할 수 있다. 그러나, 어떤 환자는 고 수준의 바이러스 항원이 만성 감염을 유발하는 연장된 또는 무기간동안 혈액내에 유지된다. 만성 감염은 만성으로 지속되는 간염을 유발할 수 있다. 만성 지속성 HBV에 감염된 환자는 대부분 개발도상국에 존재한다. 만성 지속성 간염은 피로, 간의 경화 및 간세포성 암, 1차 간암을 유발할 수 있다. 서양의 산업화 국가에서는 HBV 감염에 대한 고 위험군은 HBV 보균자 또는 그의 혈액 샘플과의 접촉을 포함한다. HBV의 역학은 사실 후천성 면역 결핍 증후군의 그것과 매우 유사하고, HBV 감염은 AIDS 또는 HIV-관련된 감염을 갖는 환자에 일반적이다. 그러나, HBV는 HIV보다 전염성이다.
최근에, 만성 HBV 감염의 치료를 위해 FDA에 의해 인가된 오직 3가지 약물이 있다: 인터페론 알파, 3TC(Epivir, 라미부딘) 및 아데포버 디피복실(Hepserao Gilead Sciences 사).
HBV에 대해 FDA 인가된 약물
약물 명 약물 종류 회사 FDA 상태
Intro A(인터페론 α-2b) 인터페론 Schering-Plough FDA 허가됨
3TC(lamivudine; Epivir-HBV) 뉴클레오사이드 유사체 GlaxoSmithKline FDA 허가됨
아데포버 디피복실 뉴클레오사이드 유사체 Gilead Sciences FDA 허가됨
인터페론 알파
제조된 형태의 인터페론이 B형 간염의 치료에 사용된다. 상기 치료는 약 4개월동안의 주사에 의한 인터페론의 투여를 포함한다.
모든 환자가 인터페론에 반응하지 않으며, 때때로 재치료도 필요하다. 임상연구에서 주사로 A(인터페론 알파-2b, 재조합체, Schering Corporation)를 사용하여 B형 간염을 치료한 환자중 오직 45% 만이 시간에 걸쳐 그의 혈액내에 B형 간염 바이러스가 발견되지 않았다. 또한 많은 환자에 있어 심각한 유행성 감기 유사 증상, 체중 감소 및 에너지와 스테미나 결핍을 유발하는 인터페론 치료를 견디는 것을 힘들어 한다.
3TC
3TC(Epivir, lamivudine)로도 알려진 BCH-189(2',3'-디데옥시-3'-티아실티딘)의 (-)-에난티오머는 HIV 및 HBV 양자에 대해 활성을 갖는 항바이러스제이다. HIV 및 HBV가 복제하기 위해 필요한 역전사효소의 생산을 막는 것에 의해 작용하는 뉴클레오사이드 유사체 역전사효소저해제(NRTI)로 불리는 약물의 종류에 속한다. 3TC는 원래는 HIV를 치료하기 위해 개발되었으나, 연구자들은 3TC가 B형 간염 바이러스에도 작용하는 것을 발견하였다. 1998년 12월에 미국 FDA는 B형 간염 바이러스 감염의 치료에 대한 Epivir HBV를 인가하였다.
비록 3TC가 HBV 복제를 효과적으로 저해하지만, 3TC 치료 동안의 바이러스 제거의 느린 동력학(Nowak, M., S. Bonhoeffer 등 1996. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93:4398-4402) 및 자발성 바이러스 게놈의 가변성은 역전사효소(RT) 도메인에 영향을 주는 돌연변이를 유발하는 약물-내성 돌연변이를 일으킨다(Mason, W. S., J. Cullen 등 1998. Virology 245: 18-32. Nafa, S., S. Ahmed 등 2000. Hepatology 32: 1078-1088 ; Melegari, M., P. P. Scaglioni, 및 J. R. Wands. 1998 Hepatology 27: 628-633.; Seigneres, B., C. Pichoud 등 2000. J. Infect. Dis. 181:1221-1233). 치료된 환자의 약 50%가 3TC의 치료 3년 후에 바이러스 내성이 발생하였다(Leung, N.W., C.L.Lai 등 2001. Hepatology 22:1527-1532). 뉴클레오사이드 유사체의 내성은 HBV RT의, 주목하게는 촉매부위내의 YMDD내의 아미노산 서열의 변경을 일으키는 중합효소 유전자의 핵산 서열내의 치환과 관련이 있다. 대부분의 공통 중합효소 변이체는 rtL180M-플러스-M204V 변경이고(HBV 약물내성 변이체에 대한 최근의 유전형-독립 명명법에 따른)(Stuyver, L.J., S.A. Locarninni 등 2001, Hepatology 33: 751-757), 촉매 부위(rtM 240V)내의 돌연변이는 촉매 부위 변이체에 대한 고 복제 능력을 제공하는 RT의 B 도메인(rtL 180M)내의 보상적 돌연변이와 관련이 있다
아데포버 디피복실(Hepsera)
2002년 9월 20일 미국 FDA는 만성 B형 간염의 치료를 위해 아데포버 디피복실을 인가하였다. HEPSERA™은 아데포버의 디에스테르 전구약물인, 아데포버 디피복실의 상표명이다. 아데포버는 천연 기질 데옥시아데노신 트리포스페이트와 경쟁함에 의해, 바이러스 DNA내에 삽입된 후에 DNA 쇄의 종료를 유발함에 의해 B형 간염 바이러스(HBV) DNA 중합효소를 저해하는 아데노신 모노포스페이트의 어사이클릭 뉴클레오타이드 유사체이다. 아데포버 디피복실의 화학명은 9-[2-[bis[(피발로일옥시)메톡시]포스피닐]메톡시]] 아데닌이다. 아데포버 세포 키에니즈에 의해 활성 대사물인 아데포버 디포스페이트로 인산화된다. 참조, 예컨대, 미국 특허 제5,641,763호 및 제5,142,051호, 명칭: 피리미딘 및 퓨린 염기의 N-포스포닐메톡시알킬 유도체 및 항바이러스 활성을 갖는 치료적 조성물.
(-)-FTC
β-L-FTC((β-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티오란, 엠트리바; 엠트리시타빈)은 HIV의 치료 및 B형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 인간의 임상적 치료를 위해 인가되었다. 상기 화합물은 우드척 및 오리 모델에서 B형 간염 바이러스에 대한 강한 활성은 나타낸다(Aguesse-Germon, S., S. -H, Liu 등 Afatimicrob. Agents Chefnother. 1998, 42, 369-376; Seigneres, B., C. Pichoud 등 2000). HBV의 우드척 모델에서, FTC는 바이러스 복제는 저해하나, 바이러스 제거는 유도하지 않는 것으로 확인되었다(Cullen, J. M., S. L. Smith 등 AnKzcro. Agents Chemother. 1997, 41, 2076-2082; Korba, B. E., R. F. Schinazi, P. 등 Antimicrob. Agents Clzemother. 2000, 44, 1757-60).
L-FMAU
L-FMAU(clevudine)는 HBV 감염의 인비트로 모델(효소적 분석 및 조직 배양 실험) 뿐만 아니라, 우드척 및 오리와 같은 B형 간염 감염의 실험적으로 감염된 동물 모델을 기초한 B형 간염 바이러스 감염의 치료에 대한 다른 유망한 후보물질이다(Aguesse-Germon, S., S. -H, Liu 등 Antimicrob. Agents Chenaother. 1998, 42, 369-376; Seigneres, B., C. Pichoud 등, 2000). 우드척 모델에서, L-FMAU는 다수의 감염된 간세포를 크게 감소시키는 것을 나타내었다(Zhu, Y., T. 야모모토 등, J. Virol, 2001, 75, 311-22). Yung Chi Cheng, Chung K. Chu 등은 1994년에 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-β-L-아라비노푸라노실)-티민(L-FMAU)이 B형 간염 바이러스 및 Epstein Barr 바이러스에 대해 우수한 활성을 나타낸다고 보고하였다. 참조, 미국특허 제5,587,362; 5,567,688; 5,565,438 및 5,808,040호 및 WO 98/20595호. WO 01/72294호는 델타형 간염 감염의 치료를 위한 2'-데옥시-2'-플루오로-β-L-아라비노푸라노실 티민(L-FMAU)의 용도를 개시하였다.
인터페론
인터페론은 면역계를 조절하고, 다른 세포 기능을 조절하기 위한 생체에서 천연적으로 제조되는 단백질이다. 인터페론의 주된 종류는, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가 및 인터페론 타우이다. 인터페론은 인비보에서 안정성을 증가하기 위해 변경될 수 있고, 이러한 변경은 페질레이션(pegylation), 또는 분자의 안정성을 증가시키기 위한 다른 수단을 포함한다.
인터페론의 인터페론 알파 종류의 예는 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, PEG화된 인터페론 알파-2a, PEG화된 인터페론 알파-2b ROFERON??-A(인터페론 알파-2a), PEGASYS??(PEG화된 인터페론 알파-2a), INTRON??A(인터페론 알파-2b), PEG-INTRON??(PEG화된 인터페론 알파-2b), 컨센서스 인터페론, 인터뮨사의 INFERGEN(인터페론알파콘-1), 비라겐사의 OMNIFERON(천연 인터페론), 휴먼 게놈 사이언스사의 ALBUFERON, 아마릴로 바이오사이언스사의 경구 인터페론 알파 및 수퍼페론(천연 인간 멀티-서브타입 IFN-알파, 제네트롤사)을 포함한다.
인터페론의 다른 종류는 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 타우, 인터페론 오메가, 아데스-세로노사의 REBIF(인터페론 베타-1a), 바이오메디신사의 오메가 인터페론, 인터뮨사의 인터페론감마-1b, 및 HuFeron(인간 IFN-베타, Genetrol사)를 포함한다.
병용 치료
바이러스 복제의 저지 및 바이러스-내성 돌연변이의 생성을 더 효과적으로 하기 위해, 인간 면역 결핍 바이러스에 나타난 것과 같이(Chow, Y. K., M. S. Hirsch 등 1993. Nature 361: 650-654; Snyder, S., D. Z. D'Argenio 등 2000. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1051-1058. Villahermosa, M. L. 등. 1997. Biochemistry 36: 13223-13231), 크로스 내성 돌연변이의 선택을 예방할 수 있는 병용 치료에 기초한 항바이러스 정책의 개발이 중요하다(Zoulim, F. 2001. Antivir. Chez.Chemother. 12(Suppl. 1) : 131-142), 다수의 실험 모델을 사용하여 만성 헤파아데노바이러스 감염의 치료를 위한 중합효소 저해제의 병용의 항바이러스 효과에 대한 조사에 수개의 연구가 집중되어 있다(Korba 등 2000, Antivir, Res. 45: 19-32; Colledge, D., S. Locarnini, 및 T.Shaw. 1997. Hepatology 26: 216-225; Colledge 등 2000. Antimicrob. Agents Chemother. 44:551-560). B형 간염 감염의 병용치료의 개발은 만성 B형 간염 감염의 치명성을 추가적으로 감소시키기 위한 필요한 정책의 하나이다.
오리의 B형 간염 감염 모델에서 어떤 피리미딘 및 퓨린 뉴클레오사이드 병용의 효과가 Seigneres 등에 의해 측정되었다(Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47(6): 1842-1852(2003). 암독소버(DAPD), 엠트리시타빈((-)-FTC) 및 클레부딘(L-FMAU)의 병용은 증가된 항바이러스 효과를 나타낸다.
B형 간염 감염의 치료는 또한 Lok 및 McMahon AASLD Practice Guidlines, pp 1225-1241(2001)에 기술되어 있고, 인터페론의 치료를 포함한다. 우드척 간염 바이러스(WHV)에 만성으로 감염된 이스턴 우드척을 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-β-L-아라비노푸라노실)-티민(L-FMAU) 및 WHV 표면 항원 백신의 항바이러스 효과를 연구하기 위해 HBV 감염의 모델로 사용하였다. L-FMAU 및 백신의 병용에 관련된 체액성 및 세포성 면역은 자기-제한적 WHV 감염에서 관찰된 것과 유사하였다(Menne etal., J. Virology, 76(11): 5305-5314(2002)).
Jacquard 등은 재조합 인터페론 감마의 아데노바이러스 운반과 함께 L-FMAU 및 FTC을 사용하여 만성 B형 간염의 다중 약물 치료의 연구를 발표하였다(Jacquard 등, "GBV 감염의 우드척 모델에서 인터페론 감마의 아데노바이러스 매개된 운반을 이용한 클레부딘 및 엠트리시타빈의 병용 및 측정", Boston AASLD 미팅에서 제시된 포스터, Nov. 2-5,2002. 참고 Asilomar 미팅 "B형 간염 바이러스의 분자생물학" Sept 29-Oct 3,2002.) 상기 연구에서 인터페론은 L-FMAU 및 FTC의 효과를 증가시키지 않는다고 제시하였지만, 상기 연구는 우드척내의 우드척 간염 바이러스에 제한되며, 인간내의 인간 B형 간염과는 관련이 없다.
University of Georgia Research Foundation 및 Yale University의 미국 특허 제5,808,040호는 L-FMAU가 FTC, 3TC, 카보버, 아시클러보, 인터페론, AZT, DDI(2',3'-디데옥시이노신), DDC(2',3'-디데옥시시티딘), L-DDC, L-F-DDC, 및 D4T과 병용할 수 있음을 개시하였다.
WO 00/25797로 공개된 PCT/US99/25673는 인간에서 HBV 감염의 치료를 위한 상기 조합을 사용한 병용 및 방법 및 관련 질환에 대해 개시하였다. 특히 상기 조성물은 상승적 유효량의 β-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC) 및 하나의 펜시클러버(2-아미노-1,9-디히드로-9-[4-히드록시-3-(히드록시메틸)부틸]-6H-퓨린-6-온, "PCV"라고도 함), 팜시클러버, 또는 9-[2-(포스포노메톡시)에틸] 아데닌(PMEA, Bis-POM-PMEA 또는 BP-PMEA라고도 함)을 포함한다. 다르게는 상기 조성물은 상승적 유효량의 2'-플루오로-5-메틸-p-1-아라비노푸라노릴우리딘(L-FMAU) 및 하나의 펜시클로버, 9-[2-(포스포노-메톡시)에틸] 아데닌(PMEA) 또는 DAPD와 같은 β-D-1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드를 포함한다. 다르게는, 상기 조성물은 상승적 유효량의 DAPD, 및 PMEA와 같은 β-D-1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드를 포함한다.
PCT 공개특허 제WO98/23285는 예방적 또는 치료적 함량의 펜시클로버(또는 팜시클로버와같은 그의 생전구체) 및 알파-인터페론를 환자에 투여하는 것을 포함하는 인간 또는 동물 환자에서 B형 간염 바이러스 감염의 치료 또는 예방방법을 개시한다.
에모리 유니버시티에 의한 미국 특허 제5,990,093호 및 국제특허공개 WO 95/07086 및 WO 96/40164호는 β-L-2',3'-디데옥시아데노신과 병용 또는 교대로 2-히드록시-메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란; 2-히드록시메틸-5-(시토신-1-일)-1,3-옥사티올란; 2'-플루오로-5-요오도-아라비노실우라실(FIAU); 2'-플루오로-5-에틸-아라비노실우라실(FEAU), 카보버, 또는 인터페론을 투여하는 것을 포함하는 HBV의 치료 방법을 개시한다.
미국 특허 제5,703,058호, 5,905,070, 및 6,232,300호 및 국제특허공개 WO 96/22778는 HIV 또는 HBV를 위한(5-카복시미도 또는 5-플루오로)-(2',3'-불포화된 또는 3'-변형된) 피리미딘 뉴클레오사이드를 개시한다. 특히, 상기 특허 및 국제특허공개는 하나 이상의 2-히드록시-메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 2-히드록시메틸-5-(시토신-1-일)-1,3-옥사티올란; 9->4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐-1-일-구아닌(카보버), 9-(2-히드록시-에톡시)메틸-구아닌(아시클로버), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시시티딘(DDC),(-)-2'-플루오로-5-메틸-베타-1-ARA우리딘(L-(-)-FMAU) 및 2',3'-디데히드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T)와 병용하여(5-카복시미도 또는 5-플루오로)-(2',3'-불포화 또는 3'-변형된) 피리미딘 뉴클레오사이드를 포함하는 HIV 또는 HBV를 치료하는 병용 치료법을 개시한다.
B형 간염 치료 및 병용 치료에서 진보가 이루어지고 있지만, 숙주에 있는 인간 B형 간염 바이러스를 최적의 실질적으로 감소 또는 제거하기 위해 효과적인 병용법은 아직 알려져 있지 않다. 어떤 B형 간염 약물 및 병용이 추가적인 치료에 의해 증가시킬 수 있는 반면, 다른 경우에는 추가적인 치료는 추가적인 이득을 제공하지 못하고, 환자의 복지를 실질적으로 저해할 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 보건 프로바이더는 그가 최적의 환자 치료를 진행할 수 있기 위해서는 B형 간염 치료의 병용에 대한 이익에 대한 정보가 필요하다.
B형 간염 바이러스가 전세계에 걸쳐 유행성 수준에 도달하고, 종종 감염된 환자에 치명적인 영향을 주는 사실에 비추어, 숙주에 적은 독성을 갖고, 바이러스에 감염된 인간의 치료를 위한 신규 유효한 약제학적 방법, 용도 및 병용제의 제공이 몹시 필요하다.
또한 만성 B형 간염의 치료는 약물 내성 바이러스 균주의 발전을 유발하는 감염된 간세포를 제거하는 장기간의 뉴클레오사이드 유사체의 투여를 필요로 한다. 약물 내성 돌연변이의 선택때문에, 만성 B형 간염의 치료의 새로운 전략이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 HBV에 감염된 인간 환자 또는 다른 숙주의 치료용 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 HBV의 약물 내성 균주의 감염을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
FTC와 병용 및/또는 교대 및 인터페론 알파 또는 인터페론 감마와 같은 인터페론과 병용 및/또는 교대로 투여된 L-FMAU는 인간에서 B형 간염 바이러스에 대해 우수한 치료를 제공한다. 일 구체예에서, 인터페론은 일반적으로 정맥 또는 동맥내로 직접 단백질의 형태로 투여된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 인터페론은 숙주에 의해 발현되는 핵산, 유전자 또는 유전자 단편의 형태로 투여된다. 인터페론 핵산은 숙주에 "네이티드(naked)", 즉, 벡터없이, 또는 다르게는 제한되지는 않지만, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 백터를 경유하여 운반될 수 있다.
바람직한 구체예에서, β-L-FTC 및 L-FMAU는 그의 반대 β-D-에난티오머가 적어도 90% 없다. 보다 바람직한 구체예에서, β-L-FTC 및 L-FMAU는 독립적으로 그의 반대 β-D-에난티오머가 적어도 95%, 98% 또는 99% 없다.
일 구체예에서, 인터페론은 인터페론 알파, 임의로 PEG화된(pegylated) 인터페론 알파이다. 다른 구체예에서, 인터페론 알파는 제한되지는 않지만, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, PEG화된 인터페론 알파-2a, PEG화된 인터페론 알파-2b ROFERON??-A(인터페론 알파-2a, Roche), PEGASYS??(PEG화된 인터페론 알파-2a, Roche), INTRON??A(인터페론 알파-2b, Schering Corporation), PEG-INTRON??(PEG화된 인터페론 알파-2b, Schering Corporation), 컨센서스 인터페론, 인터뮨사의 INFERGEN(인터페론알파콘-1), 비라겐사의 OMNIFERON(천연 인터페론), 휴먼 게놈 사이언스사의 ALBUFERON, 아마릴로 바이오사이언스사의 경구 인터페론 알파 및 수퍼페론(천연 인간 멀티-서브타입 IFN-알파, 제네트롤사)을 포함한다. 다른 구체예에서, 인터페론은 인터페론 감마이다. 또 다른 구체예에서, 인터페론은 인터페론 베타, 인터페론 오메가 또는 인터페론 타우이다. 다른 구체예에서, 인터페론은 제한되지는 않지만, 아레스-세로노사의 REBIF(인터페론 베타-1a), 바이오메디신사의 오메가 인터페론, 인터뮨사의 인터페론감마-1b, 및 HuFeron(인간 IFN-베타, Genetrol사)를 포함한다.
다르게는 숙주에, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에 HBV 감염의 치료 및/또는 예방용 조성물 방법은, TH1 사이토카인과 같은 면역조절제 및 특히 상기한 인터페론과 같은 인터페론과 병용 및/또는 교대로, 임의의 약제학적으로 허용되는 담체중에, 유효량의 하기 화학식의 β-L-뉴클레오사이드, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
(여기서, R1은 H, 알킬, 아릴, 아실, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 포함하는 포스페이트, 포스포리피드를 포함하는 안정화 포스페이트, 또는 에테르-리피드이고,
R2 및 R3은 독립적으로 수소, 알킬 또는(시클로프로필과 같은) 시클로알킬이다.)
과 병용및/또는 교대로, 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제중에, 하기 화학식의 β-L-뉴클레오사이드, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
(여기서, R은 H, 알킬, 아릴, 아실, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 포함하는 포스페이트, 포스포리피드를 포함하는 안정화된 포스페이트 부분, 또는 에티르-리피드이다.)
을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일구체예에서, 인터페론은 단백질의 형태로 운반된다. 다른 구체예에서, 인터페론은 숙주에 의해 발현되는 핵산, 유전자 또는 유전자 단편의 형태로 투여된다. 본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인터페론 핵산은 숙주에 "네이티드", 즉, 벡터없이, 또는 다르게는 제한되지는 않지만, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 백터를 경유하여 운반될 수 있다.
일반적으로 교대 치료시에, 유효량의 각각 약물이 병용 치료에 있어서, 연속적으로 투여되거나, 유효량의 2개 이상의 약물이 함께 투여된다. 용량은 각각 약물의 흡수, 생체분배, 대사 및 배출율과 같은 인자 및 공지된 다른 인자에 의존한다. 용량 값이 또한 치료될 질환의 심각성에 따라 변화할 수 있다는 것이 주목된다. 또한 어떤 특정 주체에 대한, 특정 용량 섭생 및 스케쥴은 개인의 필요 및 조성물의 개인적 투여 또는 투여를 관리하는 사람의 프로적 판단에 따라 시간에 걸쳐 변경하여야 한다는 것이 이해될 것이다. 적합한 용량 범위의 예는 과학 문헌 및 Physicians Desk Reference에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 기술한 다른 화합물의 적합한 용량 범위의 많은 예는 공개된 문헌에서 발견되며, 공지의 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 상기 용량 범위는 목적하는 결과를 달성하기 위한 필요에 따라 변경할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 운반에 적합한 우드척 인터페론 감마를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 비제한적 예를 나타낸다. 코팅 영역이 나타나고 한정되었다.
도 2는 대표적 우드척을 얻기위한, 우드척 인터페론 감마(Ad IFN)를 발현하는 아데노바이러스 벡터 또는 그린 형광 단백질(Ad GFP)을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 주입 또는 주입없는 1-(2-플루오로-5-메틸-β-L-아라비노실) 우라실(L-FMAU), 및 0-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC)의 치료 영역의 비제한적 도식을 나타낸다.
도 3은 우드척 인터페론 감마(AdIFN)를 발현하는 아데노바이러스 벡터의 다른 용량(pfu)과 함께, 우드척의 주입 전 및 후에, 시간(일)에 걸쳐 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)의 바이러스 DNA(copies/ml)의 함량을 나타낸 그래프를 나타낸다. 화살표는 인큐베이션 시간 및 생검시간을 나타낸다. 왼쪽 Y 축상에서, 시간에 대해 플롯한 실시예 3에 기술된 내인성 중합효소 어세이(EPA, dpm/ml)에 의해 측정된 바이러스 플러스 스트랜드 DNA의 함량을 나타낸다.
도 4는 우드척 인터페론 감마(Ad IFN GFP)를 발현하기 위한 완전한 아데노바이러스 벡터의 3 x 109 pfu로 우드척을 주사하기 전 및 후의 시간(일)에 걸친 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)의 바이러스 DNA(copies/ml)의 함량을 나타낸 2개의 그래프를 나타낸다. 화살표는 인큐베이션 시간 및 생검시간을 나타낸다. 왼쪽 Y 축상에서, 시간에 대해 플롯한 실시예 3에 기술된 내인성 중합효소 어세이(EPA, dpm/ml)에 의해 측정된 바이러스 플러스 스트랜드 DNA의 함량을 나타낸다.
도 5는 그린 형광 단백질(Ad GFP)를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터(상부 2개 그래프)의 3 x 109 pfu 또는 비처리 콘트롤(하부 그래프)로 우드척을 주사하기 전 및 후의 시간(일)에 걸친 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)의 바이러스 DNA(copies/ml)의 함량을 나타낸 3개의 그래프를 나타낸다. 화살표는 인큐베이션 시간 및 생검시간을 나타낸다. 왼쪽 Y 축상에서, 시간에 대해 플롯한 실시예 3에 기술된 내인성 중합효소 어세이(EPA, dpm/ml)에 의해 측정된 바이러스 플러스 스트랜드 DNA의 함량을 나타낸다. 데이타는 실시예 5에서 구체적으로 기재된다.
도 6은 우드척 인터페론 감마(Ad IFN GFP)를 발현하기 위한 완전 아데노바이러스 벡터, 그린 형광 단백질(Ad GFP)을 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터을 주사한, 또는 비처리된 우드척으로부터 처리전 1개월(M-1) 및 주사5일후(D5)에 채취한 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)으로 주사한 우드척의 간 생검에서 발견된 바이러스 DNA를 분석한 서던 블롯의 카피이다. 바닥 블롯은 DNA(CCC) DNA의 공유적으로 폐환된 바이러스 형태이다. 그래프 밑의 수는 D5/M-1에서 퍼센트의 DNA 비율을 증명한다.
도 7은 실시예 6에서 기술한 우드척 인터페론 감마(Ad IFN)를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터의 주입 또는 주입 없이, 1-(2-플루오로-5-메틸-p-1-아라비노실) 우라실(L-FMAU), 및 β-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 엠트리바; 엠트리시타빈(FTC)으로 동물을 처리하는 동안 및 처리후의 시간(일)에 걸친 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)의 바이러스 농도(copies/ml)의 그래프를 나타낸다. 결과는 실시예 3에 기술된 도트 블롯 어세이를 사용하여 얻었다.
도 8은 실시예 6에서 나타낸 우드척 인터페론 감마(Ad IFN)를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터 또는 그린 형광 단백질(Ad GFP)를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터를 주사한 동물을 처리하는 동안 및 처리후의 시간(일)에 걸친 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)의 바이러스 농도(copies/ml)의 그래프를 나타낸다. 결과는 실시예 3에 기술된 도트 블롯 어세이를 사용하여 얻었다. Ad IFN 단독으로 처리된 콘트롤 우드척은 바이러스혈증에서 유의한 편차가 없었다.
도 9는 실시예 6에 기술된 비처리 동물에서 시간(일)에 걸친 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)의 바이러스 농도(copies/ml)의 그래프를 나타낸다. 결과는 실시예 3에 기술된 도트 블롯 어세이를 사용하여 얻어졌다.
도 10은 실시예 3에 기술된 실시간 PCR을 사용하여 측정된, 우드척 인터페론 감마(IFN)를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터의 주사하거나 주사 없이, 1-(2-플루오로-5-메틸-p-1-아라비노실) 우라실(L-FMAU), 및 β-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 엠트리바; 엠트리시타빈(FTC)으로 동물을 처리하는 동안 및 처리후의 시간(일)에 걸친 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)의 바이러스 로드(copies/ml)의 3개의 그래프이다.
도 11은 1-(2-플루오로-5-메틸-p-1-아라비노실) 우라실(L-FMAU), β-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 엠트리바; 엠트리시타빈(FTC), 우드척 인터페론 감마(Ad IFN)를 발현하기 위한 완전 아데노바이러스 벡터, 그린 형광 단백질(Ad GFP)을 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터를 처리한 또는 비처리된 우드척으로부터 치료후 바로(TO), 처리전 1개월(M1) 및 처리 2개월(M2)에 채취한 우드척 B형 간염 바이러스(WHV)으로 주사한 우드척의 간 생검에서 발견된 바이러스 DNA를 분석한 서던 블롯의 카피이다. 바닥 블롯은 DNA(CCC) DNA의 공유적으로 폐환된 바이러스 형태이다. 그래프 밑의 수는 D5/M-1에서 퍼센트의 DNA 비율을 증명한다.
도 12는 바이러스 고갈을 나타내는, 1-(2-플루오로-5-메틸-p-1-아라비노실) 우라실(L-FMAU),β-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 엠트리바; 엠트리시타빈(FTC), 또는 우드척 인터페론 감마(IFN)를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터로 처리된 동물에서 우드척 B형 간염 바이러스(WHV) 바이러스 DNA의 퍼센트 및 DNA(CCC) DNA의 공유적으로 폐환된 바이러스 형태를 나타낸 그래프이다. MO는 치료후 직후에 채취한 샘플을 나타내고, M1는 치료후 1개월에 채취한 샘플을 나타내고, M2는 치료후 2개월에 채취한 샘플을 나타낸다.
도 13은 바이러스 고갈을 나타내는, 1-(2-플루오로-5-메틸-p-1-아라비노실) 우라실(L-FMAU), 및 β-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 엠트리바; 엠트리시타빈(FTC)로 처리된 동물에서 우드척 B형 간염 바이러스(WHV) 바이러스 DNA의 퍼센트 및 DNA(CCC) DNA의 공유적으로 폐환된 바이러스 형태를 나타낸 그래프이다. TO는 치료후 직후에 채취한 샘플을 나타내고, M1는 치료후 1개월에 채취한 샘플을 나타내고, M2는 치료후 2개월에 채취한 샘플을 나타낸다.
도 14는 우드척 인터페론 감마(AdIFN)를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터, 그린 형광 단백질(Ad GFP)을 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터의 주사로 처리한 또는 비처리한 동물에서 우드척 B형 간염 바이러스(WHV) 바이러스 DNA의 퍼센트 및 DNA(CCC) DNA의 공유적으로 폐환된 바이러스 형태를 나타낸 그래프이다. TO는 치료후 직후에 채취한 샘플을 나타내고, M1는 치료후 1개월에 채취한 샘플을 나타내고, M2는 치료후 2개월에 채취한 샘플을 나타낸다.
도 15는 1-(2-플루오로-5-메틸-p-1-아라비노실) 우라실(L-FMAU), β-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 엠트리바; 엠트리시타빈(FTC), 우드척 인터페론 감마(Ad IFN)를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터, 그린 형광 단백질(Ad GFP)을 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터의 주사로 처리된 후, 또는 비처리 콘트롤의 실시예 2에 기술된 염증 활성(Metavir score)의 양을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 상세한 설명
FTC와 병용 및/또는 교대 및 인터페론 알파 또는 인터페론 감마와 같은 인터페론과 병용 및/또는 교대로 투여된 L-FMAU는 인간에서 B형 간염 바이러스에 대해 우수한 치료를 제공한다. 일 구체예에서, 인터페론은 일반적으로 정맥 또는 동맥내로 직접 단백질의 형태로 투여된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 인터페론은 숙주에 의해 발현되는 핵산, 유전자 또는 유전자 단편의 형태로 투여된다. 인터페론 핵산은 숙주에 "네이티드(네이키드)", 즉, 벡터없이, 또는 다르게는 제한되지는 않지만, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 백터를 경유하여 운반될 수 있다.
바람직한 구체예에서, β-L-FTC 및 L-FMAU는 그의 반대 β-D-에난티오머가 적어도 90% 없다. 보다 바람직한 구체예에서, β-L-FTC 및 L-FMAU는 독립적으로 그의 반대 β-D-에난티오머가 적어도 95%, 98% 또는 99% 없다.
바람직한 구체예에서, 면역 조절제는 인터페론이다. 일 구체예에서, 인터페론은 인터페론 알파, 임의로 PEG화된(pegylated) 인터페론 알파이다. 다른 구체예에서, 인터페론 알파는 제한되지는 않지만, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, PEG화된 인터페론 알파-2a, PEG화된 인터페론 알파-2b ROFERON??-A(인터페론 알파-2a, Roche), PEGASYS??(PEG화된 인터페론 알파-2a, Roche), INTRON??A(인터페론 알파-2b, Schering Corporation), PEG-INTRON??(PEG화된 인터페론 알파-2b, Schering Corporation), 컨센서스 인터페론, 인터뮨사의 INFERGEN(인터페론알파콘-1), 비라겐사의 OMNIFERON(천연 인터페론), 휴먼 게놈 사이언스사의 ALBUFERON, 아마릴로 바이오사이언스사의 경구 인터페론 알파 및 수퍼페론(천연 인간 멀티-서브타입 IFN-알파, 제네트롤사)을 포함한다. 다른 구체예에서, 인터페론은 인터페론 감마이다. 또 다른 구체예에서, 인터페론은 인터페론 베타, 인터페론 오메가 또는 인터페론 타우이다. 다른 구체예에서, 인터페론은 제한되지는 않지만, 아레스-세로노사의 REBIF(인터페론 베타-1a), 바이오메디신사의 오메가 인터페론, 인터뮨사의 인터페론감마-1b, 및 HuFeron(인간 IFN-베타, Genetrol사)를 포함한다.
다르게는 숙주에, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에 HBV 감염의 치료 및/또는 예방용 조성물 방법은, TH1 사이토카인과 같은 면역조절제 및 특히 상기한 인터페론과 같은 인터페론과 병용 및/또는 교대로, 임의의 약제학적으로 허용되는 담체중에, 유효량의 하기 화학식의 β-L-뉴클레오사이드, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
(여기서, R1은 H, 알킬, 아릴, 아실, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 포함하는 포스페이트, 포스포리피드를 포함하는 안정화 포스페이트, 또는 에테르-리피드이고,
R2 및 R3은 독립적으로 수소, 알킬 또는(시클로프로필과 같은) 시클로알킬이다.)
과 병용및/또는 교대로, 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제중에, 하기 화학식의 β-L-뉴클레오사이드, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
(여기서, R은 H, 알킬, 아릴, 아실, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 포함하는 포스페이트, 포스포리피드를 포함하는 안정화된 포스페이트 부분, 또는 에티르-리피드이다.)
을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일구체예에서, 인터페론은 단백질의 형태로 운반된다. 다른 구체예에서, 인터페론은 숙주에 의해 발현되는 핵산, 유전자 또는 유전자 단편의 형태로 투여된다. 본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인터페론 핵산은 숙주에 "네이티드(네이키드)", 즉, 벡터없이, 또는 다르게는 제한되지는 않지만, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 백터를 경유하여 운반될 수 있다.
일반적으로 교대 치료시에, 유효량의 각각 약물이 병용 치료에 있어서, 연속적으로 투여되거나, 유효량의 2개 이상의 약물이 함께 투여된다. 용량은 각각 약물의 흡수, 생체분배, 대사 및 배출율과 같은 인자 및 공지된 다른 인자에 의존한다. 용량 값이 또한 치료될 질환의 심각성에 따라 변화할 수 있다는 것이 주목된다. 또한 어떤 특정 주체에 대한, 특정 용량 섭생 및 스케쥴은 개인의 필요 및 조성물의 개인적 투여 또는 투여를 관리하는 사람의 프로적 판단에 따라 시간에 걸쳐 변경하여야 한다는 것이 이해될 것이다. 적합한 용량 범위의 예는 과학 문헌 및 Physicians Desk Reference에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 기술한 다른 화합물의 적합한 용량 범위의 많은 예는 공개된 문헌에서 발견되며, 공지의 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 상기 용량 범위는 목적하는 결과를 달성하기 위한 필요에 따라 변경할 수 있다.
I. 정의
본 원에서 사용되는, 용어 "알킬"은, 다르게 특정되지 않는 한, 포화된 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭인 일차, 이차 또는 삼차의 전형적으로 C1 내지 C10 탄화수소를 의미하고, 구체적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 사이클로프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 사이클로헥실메틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸 및 2,3-디메틸부틸을 포함한다. 상기 용어는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹 둘 다를 포함한다. 알킬 그룹이 치환될 수 있는 부분은, 예를 들어 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용되는 [Greene, et al., Protective groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sjons, Second Edition, 1991]에 교시된 바대로, 당업자들에게 공지된 바와 같이, 보호되지 않거나, 또는 필요한 경우 보호되는 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트 및 포스포네이트로 구성된 그룹중에서 선택된다.
본 원에서 사용되는, 용어 "저급 알킬"은, 다르게 특정되지 않는 한, 치환 및 비치환된 형태 둘 다를 포함하는, C1 내지 C4의 포화된 직쇄, 측쇄, 또는 적절한 경우, 사이클릭(예를 들면, 사이클로프로필) 알킬 그룹을 의미한다. 본 출원에서 다르게 특정되지 않는 한, 알킬이 적합한 부분인 경우, 저급 알킬이 바람직하다. 유사하게, 알킬 또는 저급 알킬이 적합한 부분인 경우, 비치환된 알킬 또는 저급 알킬이 바람직하다.
본 원에서 사용되는, 용어 "아릴"은, 다르게 특정되지 않는 한, 페닐, 비페닐 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐을 의미한다. 이 용어는 치환되거나 비치환된 부분 둘 다를 포함한다. 아릴 그룹은, 예를 들어 [Greene, et al., Protective groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sjons, Second Edition, 1991]에 교시된 바대로, 당업자들에게 공지된 바와 같이, 보호되지 않거나, 또는 필요한 경우 보호되는 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트 및 포스포네이트로 구성된 그룹중에서 선택된 하나 이상의 부분에 의해 치환될 수 있다.
용어 "아실"은 에스테르 그룹의 비카보닐 부분이 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 알킬 또는 저급 알킬, 메톡시메틸을 포함하는 알콕시알킬, 벤질을 포함하는 아르알킬, 페녹시메틸과 같은 아릴옥시알킬, 할로겐(예: F, Cl, Br 또는 I), C1 내지 C4 알킬 또는 C1 내지 C4 알콕시에 의해 임의로 치환된 페닐을 포함한 아릴, 메탄설포닐을 포함하는 알킬 또는 아르알킬 설포닐과 같은 셀포네이트 에스테르, 모노, 디 또는 트리포스페이트 에스테르, 트리틸 또는 모노메톡시트리틸, 치환된 벤질, 트리알킬실릴(예: 디메틸-t-부틸실릴) 및 디페닐메틸실릴중에서 선택되는 카복실산 에스테르를 의미한다. 에스테르중의 아릴 그룹이 페닐 그룹을 포함하는 것이 가장 좋다. 용어 "저급 아실"은 비카보닐 부분이 저급 알킬인 아실 그룹을 의미한다.
용어 "실질적으로 순수한 형태"는 본 명세서를 통해 화합물의 단일 에난티오머를 약 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상으로 포함하는 화합물을 기술하기 위하여 사용된다. 특정 배위(L 또는 D)의 뉴클레오사이드가 본 명세서에서 언급될 때, 뉴클레오사이드는 달리 언급되지 않는 한 뉴클레오사이드는 실질적으로 순수한 형태로 투여되는 것으로 가정된다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역조절제"는 면역반응을 직접 또는 간접적으로 조절하는 케모카인 또는 사이토카인을 말한다. 면역조절제의 비제한적인 예는 TH1 사이토카인, 및 특히, 인터페론, 인터페론-α, 정제된 인터페론-α, 인터페론-α2a, 인터페론-α2b, 인터페론-β, 인터페론-γ, 컨센서스 인터페론, 페질레이트된 인터페론, 페질레이트된 인터페론-α, 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자, 인터루킨, 인터루킨-2, 및 인터루킨-12를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 면역조절제는 인터페론이고, 보다 바람직하게는 인터페론-γ이다.
본 원에서 사용되는 용어 "숙주"는 세포주 및 동물, 및 바람직하게 인간을 포함하여 바이러스가 복제할 수 있는 단세포 또는 다세포 유기체를 의미한다. 또한, 숙주는 바이러스 게놈의 일부를 운반할 수 있고, 그의 복제 또는 작용은 본 발명의 화합물에 의해 변화될 수 있다. 용어 숙주는 특히 감염된 세포, 바이러스 게놈 전체 또는 일부에 의해 형질감염된 세포 및 동물, 특히, 영장류(침팬지 포함) 및 인간을 의미한다. 본 발명의 대부분의 동물 적용예에 있어, 숙주는 인간 환자이다. 그러나, 특별한 지시가 있는 경우 본 발명에 의해 수의학적 적용(예: 침팬지에서 원숭이 면역결핍 바이러스)도 명확하게 기대된다.
II. 약제학적으로 허용되는 염 및 프로드럭
화합물이 안정한 비독성 산 또는 염기 염을 형성하기에 충분히 염기성 또는 산성인 경우 화합물을 약제학적으로 허용되는 염으로 투여하는 것이 적절할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 산과 함께 형성된 유기산 부가염이며, 이는 생리학적으로 허용되는 음이온을 형성하고, 예로서 토실레이트, 메탄설포네이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, α-케토글루타레이트, 및 α-글리세로포스페이트가 있다. 설페이트, 나이트레이트, 바이카보네이트, 및 카보네이트 염을 포함한 적합한 무기 염이 또한 형성될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염은 당 업계에 널리 공지된 표준 방법을 사용하여, 예를 들면, 아민과 같은 충분한 염기성 화합물을 적합한 산과 반응시켜 생리학적으로 허용되는 음이온을 형성함으로써 수득할 수 있다. 카복실산의 알칼리 금속(예: 소듐, 포타슘 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속(예: 칼슘) 염이 또한 제조될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 프로드럭"은, 예를 들어 숙주에서 대사되어 예컨대 가수분해 또는 산화되어 본 발명의 화합물을 형성하는 화합물을 의미한다. 프로드럭의 전형적인 예는 활성 화합물의 작용 부위상에 생물학적으로 불안정한 보호 그룹을 갖는 화합물을 포함한다. 프로드럭은 산화, 환원, 아민화, 탈아민화, 하이드록실화, 탈하이드록실화, 가수분해, 탈가수분해, 알킬화, 탈알킬화, 아실화, 탈아실화, 포스포릴화, 탈포스포릴화하여 활성 화합물을 생성할 수 있는 화합물을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기 염기 및 산으로부터 유도된 것을 포함한다. 적합한 염은 약학 분야에 공지된 다수의 다른 산중에서 알칼리 금속, 예를 들어 포타슘 및 소듐, 알칼리 토금속, 예를 들어 칼슘 및 마그네슘으로부터 유도된 것을 포함한다. 본 발명의 화합물은 항바이러스 활성을 보유하거나, 이러한 활성을 나타내는 화합물로 대사된다.
본 원에 기술된 모든 뉴클레오사이드는 뉴클레오사이드의 활성, 생체이용율, 안정성을 증가시키거나 다르게는 성질을 변화시키기 위하여 프로드럭으로서 투여될 수 있다. 다수의 뉴클레오타이드 프로드럭 리간드가 공지되어 있다. 일반적으로, 화합물의 하이드록실 그룹, 또는 뉴클레오사이드의 모노, 디 또는 트리포스페이트의 알킬화, 아실화 또는 다른 친유성 변형이 뉴클레오타이드의 안정성을 증가시킬 것이다. 포스페이트 부위상의 하나 이상의 수소를 대체할 수 있는 치환체 그룹의 예로 알킬, 아릴, 스테로이드, 당을 포함하는 카보하이드레이트, 1,2-디아실글리세롤 및 알콜이 있다. 다수가 [R. Jones and N. Bischofberger, Antiviral Research, 27(1995) 1-17]에 기재되어 있다. 목적하는 효과를 얻기 위하여 이들중 어느 것을 개시된 뉴클레오사이드와 배합하여 사용할 수 있다.
병용 또는 교대 치료에 사용하기 위해 본 원에 개시된 화합물은 아실화된 프로프럭으로서 투여될 수 있으며, 여기에서, 용어 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부분이 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 알킬 또는 저급 알킬, 메톡시메틸을 포함하는 알콕시알킬, 벤질을 포함하는 아르알킬, 페녹시메틸과 같은 아릴옥시알킬, 할로겐, C1 내지 C4 알킬 또는 C1 내지 C4 알콕시에 의해 임의로 치환된 페닐을 포함한 아릴, 메탄설포닐을 포함하는 알킬 또는 아르알킬 설포닐과 같은 셀포네이트 에스테르, 모노, 디 또는 트리포스페이트 에스테르, 트리틸 또는 모노메톡시트리틸, 치환된 벤질 및 트리알킬실릴(예: 디메틸-t-부틸실릴) 중에서 선택되는 카복실산 에스테르를 의미한다.
활성 뉴클레오사이드 또는 다른 하이드록실 함유 화합물은 또한 본 원에 참고로 인용되는 하기 문헌에 기술된 바와 같이 에테르 리피드(및 특히 뉴클레오사이드에 대한 5'-에테르 리피드 또는 5'-포스포에테르 리피드)로서 제공될 수 있다: Kucera, L. S., N. Iyer 등 AIDS Res. Hum. Retro 바이러스es. 6: 491-501; Piantadosi, C., J. Marasco C. J. 등 J. Med. Chenu. 34: 1408.1414 ; 숙주eller, K. Y., D. D. Richman 등 Antimicrob. Agents Chenzotlaer. 36: 2025.2029 ; 숙주etler, K. Y., L. M. Stuhmiller 등 J. Biol.Chem. 265: 61127.
바람직하게는 뉴클레오사이드 또는 친유성 제제의 5'-OH 위치에서 뉴클레오사이드, 또는 다른 하이드록실 또는 아민 함유 화합물에 공유적으로 도입될 수 있는 적합한 친유성 치환체를 개시하고 있는 미국 특허의 비한정적인 예로는 모두 다 본 원에 참고로 인용되는 미국 특허 제 5,149,794호(Sep. 22, 1992, Yatvin et al.); 5,194,654호(Mar. 16, 1993, 숙주etler et al., 5,223,263호(June 29, 1993, 숙주etler et al.); 5,256,641호(Oct. 26, 1993, Yatvin et al.); 5,411,947호(May 2, 1995, 숙주etler et al.); 5,463,092호(Oct. 31, 1995, 숙주etler et al.); 5,543,389호(Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); 5,543,390호(Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); 5,543,391호(Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); 및 5,554,728호(Sep. 10, 1996; Basava et al.)가 포함된다. 본 발명의 뉴클레오사이드 또는 친유성 제제에 부착될 수 있는 친유성 치환체를 기술하고 있는 외국 특허 출원에는 WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4 및 WO 91/19721이 포함된다.
뉴클레오타이드 프로드럭의 비한정적인 예가 하기 문헌에 기재되어 있다: Ho, D.H.W.(1973) Cancer Res. 33,2816-2820 ; Holy, A.(1993) Isopolarphosphorous-modified nucleotide analogues, "In : De Clercq(Ed.), Advances in Antiviral
유용한 포스페이트 프로드럭 그룹의 한 예는 S-아실-2-티오에틸 그룹이며, 이는 "SATE"로도 언급된다.
III. 약제학적 조성물
HBV에 의해 야기되는 효과로부터 고생하는 숙주 또는 B형 간염 바이러스에 노출된 숙주, 특히 인간은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함거나, 독립적으로 상기한 모든 인터페론을 포함하는 TH1 사이토카인과 같은 면역조절제와 병용 및/또는 교대로 유효량의 L-FMAU 및 β-L-FTC를 환자에 투여함에 의해 치료할 수 있다. 활성 물질은 액체 또는 고체 형태로 하여 적절한 경로, 예를 들어 경구, 비경구, 장내, 정맥내, 피내, 경피, 국소, 비강내, 직장내로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 치료 환자에서 심각한 독성 효과를 야기함이 없이 생체내에서 바이러스 복제, 특히 HBV 복제를 억제하기에 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 환자에게 전달하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제중에 포함된다. "억제량" 이란, 예를 들어 본 원에 개시된 바와 같은 분석에 의해 측정된 바, 억제 효과를 나타내기에 충분한 활성 성분의 양을 의미한다.
상기 언급된 모든 증상에 바람직한 화합물의 투여량은 1일 수여자 체중 1 ㎏당 약 1 내지 50 ㎎, 바람직하게는 1 내지 20 ㎎, 보다 일반적으로는 0.1 내지 약 100 ㎎일 것이다. 약제학적으로 허용되는 유도체의 유효한 투여량 범위는 전달되는 모 뉴클레오사이드의 중량에 기준해 산출될 수 있다. 유도체가 그 자체로 활성을 나타낸다면, 유효량은 유도체의 중량을 사용하여 상기와 같이 평가될 수 있거나, 당업자들에 알려진 다른 수단으로 평가될 수 있다.
화합물은 편리하게는 단위 복용형당 활성 성분을 7 내지 3,000 ㎎, 바람직하게는 70 내지 1,400 ㎎ 함유하나 이로만 한정되지 않는 적합한 복용형으로 단위 투여될 수 있다. 50 내지 1,000 ㎎의 경구 복용량이 일반적으로 편리하다.
이상적으로, 활성 성분의 배합물이 바람직하긴 하지만, 적어도 하나의 활성 성분은 약 0.2 내지 70 mM, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mM의 활성 화합물의 피크 혈장 농도를 이루도록 투여되어야 한다. 이것은 예를 들어 임의로 염수중의 활성 성분의 0.1 내지 10% 용액을 정맥내 주사하거나. 활성 성분의 거환제를 투여함으로써 달성할 수 있다.
약물 조성물중 활성 화합물의 농도는 약물의 흡수율, 분포, 대사 및 분비율 뿐만 아니라 당업자들에 알려진 다른 요인들에 따라 달라질 것이다. 투여량은 또한 경감시키고자 하는 증상의 중증도에 따라 변할 것이다. 특정 대상체, 특정 투여 요법이 개개인의 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 지시하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본 원에 예시된 농도 범위는 단지 예시적인 목적으로 기술되었으며 청구된 조성물의 실시 또는 영역을 제한할 의도는 아닌 것으로 이해되어야 한다. 활성 성분은 한번에 투여될 수 있거나, 다수의 보다 적은 양으로 나누어 다양한 시간 간격으로 투여될 수 있다.
FTC 및 L-FMAU의 바람직한 투여 경로는 경구에 의한 것이다. 경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함할 것이다. 이들은 젤라틴 캅셀에 포함되거나, 정제로 타정될 수 있다. 경구적 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제내에 함침되어 정제, 구내정(troches) 또는 캅셀제로 사용될 수 있다. 약제학적으로 상용적인 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다.
정제, 환제, 캅셀제, 구내정 등이 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들어 미정질 셀룰로즈, 트라가칸트검 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분 또는 락토스, 붕해제, 예를 들어 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes); 활제, 예를 들어 콜로이드성 이산화규소; 감미료, 예를 들어 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향. 복용 단위형이 캅셀제인 경우, 이는 상기 타입의 물질 이외에, 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 또한, 복용 단위형은 복용형의 물리적 형태를 변경시키는 다양한 다른 물질, 예를 들자면 당 코팅, 셸락(shellac) 또는 다른 장용제를 함유할 수 있다.
화합물은 엘릭시스, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검 등의 성분으로 투여될 수 있다. 시럽은 활성 화합물 이외에도 감미료로서 수크로스, 특정 방부제, 염료, 착색제 및 향미제를 함유할 수 있다.
화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 유도체 또는 염은 또한 목적하는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질 또는 목적하는 작용을 보충하는 물질, 예를 들어 항생제, 항진균제, 항염증제, 프로테아제 저해제 또는 상기에 상세히 설명된 다른 뉴클레오사이드 또는 비뉴클레오사이드 항바이러스제와 혼합될 수 있다. 비경구, 피내, 경피 또는 국소 적용용으로 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분들을 함유할 수 있다: 멸균 희석액, 예를 들어 주사용수, 식염액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예를 들어 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성을 조정하기 위한 제제, 예를 들어 염화나트륨 또는 덱스트로즈. 비경구 제제는 앰풀, 일회용 시린지 또는 유리나 플라스틱으로 만들어진 다중복용 바이얼내에 도입될 수 있다.
정맥내로 투여되는 경우, 바람직한 담체는 생리염수 또는 포스페이트 완충염수(PBS)이다.
비강내 에어졸 또는 흡입에 의해 투여되는 경우, 이들 조성물은 제약 업계에 잘 알려진 기술에 따라 제조되며, 벤질 알콜 또는 다른 적합한 방부제, 생체이용률을 높이기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 업계에 알려진 다른 가용 또는 분산제를 사용하여 염용액으로 제조될 수 있다.
좌제의 형태로 직장내 투여되는 경우, 조성물은 약제를 적합한 비개시 부형제, 예를 들어 상온에서 고체이나 직장강에서 액화 및/또는 용해되어 약물을 방출하는 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜의 합성 글리세라이드 에스테르와 혼합하여 제조될 수 있다.
바람직한 구체예로, 활성 화합물은 서방성 제제와 같이 화합물이 체내로부터 신속히 제거되는 것을 보호할 담체(임플란트 및 마이크로캅셀화 전달 시스템을 포함)와 함께 제조된다. 생분해가능한 생체상용성 폴리머, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 방법은 당업자들에게 자명할 것이다. 이들 물질은 또한 Alza Corporation으로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
리포좀 현탁액(바이러스성 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포의 표적 리포좀 포함)이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 바람직하다. 이들은, 예를 들어 본 원에 참고로 인용되는 미국 특허 제 4,522,811호에 기술된 바와 같이 당업자들에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제제는 적절한 리피드(들)(예: 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린 및 콜레스테롤)를 유기 용매에 용해시킨 후, 이를 증발시켜 용기의 표면상에 건조된 리피드의 박막을 제공함으로써 제조될 수 있다. 그후, 활성 화합물 또는 그의 모노포스페이트, 디포스페이트 및/또는 트리포스페이트의 수용액을 용기내에 도입한다. 이어서, 용기를 손으로 흔들어 용기면으로부터 리피드 물질을 유리시키고 리피드 응집물을 분산시켜 리포좀 현탁액을 형성한다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 다른 화합물을 포함하는, 하나 이상의 다른 항바이러스, 항-HIV, 항-HBV, 항-HCV 또는 항-간장제 또는 인터페론, 항암제, 항증식제 또는 항박테리아제와 병용 및/또는 교대로 투여될 수 있다. 본 발명의 어떤 화합물은 다른 화합물의 대사, 이화, 또는 불활성화를 감소시킴에 의해 본 발명에 따른 어떤 약물의 생물학적 활성을 증기시키는 데 효과적일 수 있고, 예컨대, 의도된 효과를 위한 공동 투여된다.
일반적으로 교대 치료시에, 유효량의 각각 약물이 병용 치료에 있어서, 연속적으로 투여되거나, 유효량의 2개 이상의 약물이 함께 투여된다. 용량은 각각 약물의 흡수, 생체분배, 대사 및 배출율과 같은 인자 및 공지된 다른 인자에 의존한다. 용량 값이 또한 치료될 질환의 심각성에 따라 변화할 수 있다는 것이 주목된다. 또한 어떤 특정 주체에 대한, 특정 용량 섭생 및 스케쥴은 개인의 필요 및 조성물의 개인적 투여 또는 투여를 관리하는 사람의 프로적 판단에 따라 시간에 걸쳐 변경하여야 한다는 것이 이해될 것이다. 적합한 용량 범위의 예는 과학 문헌 및 Physicians Desk Reference에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 기술한 다른 화합물의 적합한 용량 범위의 많은 예는 공개된 문헌에서 발견되며, 공지의 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
상기 용량 범위는 목적하는 결과를 달성하기 위한 필요에 따라 변경할 수 있다.
IV. 유전자 치료
본 발명의 다른 면은 HBV를 치료하기 위해 다른 작용방법 및/또는 상승 효과를 갖는 2개 이상의 항-HBV 약물과 병용 및/또는 교대하여 면역조절제을 운반하기 위한 인비보 유전자 치료 방법의 사용이다. 유전자 치료방법은 프로모터 및/또는 표적 조직에 의해 발현을 위해 필요한 모든 다른 유전적 요소에 효과적으로 결합할 수 있는 면역조절제의 발현을 증가시키기 위해, 숙주, 예컨대, 동물, 특히, 인간에 핵산(DNA, RNA, 및 안티센스 DNA 또는 RNA) 서열의 도입에 관련된다. 상기 유전자 치료 및 운반기술 및 방법은 공지이다. 참조, WO 90/11092, WO 98/11779; 미국 특허 제5,693, 622, 5,705, 151,5, 580,859 ; Tabata H. 등 (1997) Cardiovasc. Res. 35 β): 470-479, Chao J 등 (1997) Pharmacol. Res. 35(6): 517-522, Wolff J. A.(1997)Neuromuscul. Disord. 7(5): 314-318, Schwartz B. 등 (1996) 유전자 Ther. 3(5): 405-411,Tsurumi Y. 등 (1996) Circulation 94(12): 3281-3290.
유전자 치료 방법에서 사용된 폴리펩타이드 벡터 작제물은 바람직하게 숙주 게놈내에 합성되지 않거나, 복제를 허가하는 서열을 포함하지 않는 작제물이다. 모든 공지의 강력한 프로모터가 DNA의 발현을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
폴리펩타이드 작제물은 동물의 세포에 주입할 수 있는 물질을 운반하는 모든 방법에 의해 운반될 수 있고, 예컨대, 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간, 창자)의 간질성 공간에 주입된다. 폴리펩타이드 작제물은 약제학적으로 허용되는 액체 또는 수성 담체내에 운반될 수 있다.
폴리펩타이드작제물은 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위장, 창자, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선, 및 결합조직을 포함하는 동물내의 조직내의 간질성 공간내에 운반될 수 있다. 조직의 간질성 공간은 세포내 액체, 기관 조직의 망상 섬유중의 뮤코폴리사카라이드 매트릭스, 혈관 또는 챔버의 벽의 탄성 섬유, 섬유성 조직의 콜라겐 섬유, 또는 연결 조직 초성화 근육세포내의 또는 뼈의 구멍내의 같은 조직을 포함한다. 이것은 순환하는 혈장 또는 림프 채널의 림프액에 의해 점유되는 공간과 유사하다. 이들 세포를 포함하는 조직내로 주사함에 의해 편리하게 운반될 수 있다. 이들은 바람직하게 지속성, 분화된 비분할 세포로 분할되고 발현되나, 비록 운반 및 발현이 예컨대, 혈액 또는 피부 섬유모세포의 간세포와 같은 비분화되거나 아직 완전히 분화되지 못한 세포에서 달성될 수도 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 면역조절제를 발현하도록 유전공학적으로 조작된 세포를 환자에 인비보 투여할 수 있다. 이같은 세포는 환자 또는 MHC 적합성 도너로부터 얻을 수 있고, 제한되지는 않지만, 섬유모세포, 골수세포, 골세포(예, 림프구), 지방 세포, 근세포, 내피 세포 등을 포함한다. 상기 세포는 면역조절제의 폴리펩타이드의 코팅 서열을 도입하기 위한 재조합 DNA 기술 또는 다르게는(바이러스 벡터, 및 바람직하게 세포 게놈내로 트랜스유전자를 통합하는 벡터를 사용한) 형질도입 또는 제한되지는 않지만, 플라스미스 코스미드, YAC, 네이키드 DNA, 일렉트로포레이션, 리포좀 등을 포함하는 형질감염 방법을 사용하여 인비트로 유전공학적으로 조작한다. 면역조절제의 코팅 서열은 발현, 및 바람직하게 분비를 달성하기 위해 강한 구조성 또는 유도성 프로모터 또는 프로모터/인헨서의 조절하에서 둘 수 있다. 면역조절제를 발현 및 바람직하게는 분비하는 조작된 세포는 환자에 전신적으로, 예컨대, 순환 또는 복막내에 주입할 수 있다.
다르게는, 세포는 매트릭스내로 도입 및 신체내에 이식할 수 있고, 예컨대, 유전공학적으로 조작된 내피 세포는 림프성 또는 맥관 이식의 일부로서 이식될 수 있다(참조, 예컨대, Anderson 등 미국 특허 제5,399,349호; 및 Mulligan & Wilson, 미국 특허 제5,460, 959).
투여된 세포가 자가유대 또는 비-MHC 적합성 세포일 때, 이들은 도입된 세포에 대해 숙주 면역 반응의 발달을 방지하는 공지의 기술을 사용하여 투여할 수 있다. 예컨대, 즉각적인 세포외 환경에 구성의 변경을 허가하면서, 세포는 캡슐화된 형태로 도입될 수 있고, 도입된 세포는 숙주 면역계에 의한 인식으로부터 허여되지 않는다.
면역조절제의 발현을 위한 핵산, 유전자 또는 그의 유전자 단편을 포함하는 감염성 바이러스 입자가 혈질도입될 수 있는 진핵세포는 제한되지는 않지만, 백혈구, 과립구, 단핵세포, 대식세포, 림프구(T-림프구 및 B-림프구 포함)와 같은 1차 유핵성 혈액 세포와 같은 1차 세포, 분화전능성의 간세포, 종양 침투성 임파구(TIL 세포), 골수 세포, 내피 세포, 상피 세포, 각질 세포, 간세포, 간세포 전구세포를 포함하는 간세포, 간세포 전구세포를 포함하는 간세포, 섬유모세포, 간엽 세포, 중피세포, 및 실질성 세포를 포함한다.
일 구체예에서, 세포는 특정 위치를 목표로 할 수 있고, 이로서 세포는 그 위치에서 치료적으로 기능한다. 다르게는 세포는 특정위치를 표적화하지 않는 세포일 수 있고, 이같은 세포는 전신적 치료적으로 기능한다.
예컨대, 숙주 세포에 도입에 의한 HBV의 치료에서, 환자로부터 제거되고 배양으로 전개된 혈액 세포, 면역조절제를 코팅하는 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 감염성 바이러스 입자와 같은 형질도입된 세포가 사용될 수 있다. 세포는 목적하는 유전자를 포함하는 감염성 바이러스 입자로 형질도입하기 전 또는 후에 전개될 수 있다. 이와 같이, 조작은 예컨대, 환자 신체에서 면역조절제를 생산할 수 있는 형질전환된 세포를 환자내에 주사하는 방법으로 수행된다.
형질도입된 세포에 의해 운반되는 유전자 또는 핵산은 특히 면역조절제를 위한 서열을 포함하지만, 세포의 치료적 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 증진하는 모든 서열을 또한 포함할 수 있다. 형질도입된 세포에 의해 운반된 유전자는 또한 통상 갖고 있지 않는, 치료적 효과를 나타내기 위해 형질도입된 세포를 허용하는 서열, 혈우병의 치료에서 유용한 혈액 응고 인자를 코팅하고 있는 유전자 같은 것을 포함할 수 있다. 유전자는 치료적 효과를 갖는 하나 이상의 생산물을 코팅할 수 있다. 적합한 유전자 또는 핵산의 예는, TNF와 같은 사이토카인, 인터루킨류(인터루킨 1-14), 인터페론류(알파, 베타, 감마-인터페론), T-세포 수용체 단백질 및 면역글로불린과 같은 항체의 항원결합 도메인을 위한 Fc 수용체를 암호화하는 것을 포함한다. 적합한 유전자의 추가적인 예는 세포를 세포가 일반적으로 표적화하지 않는 신체내의 부위에 표적화하기 위해 변경된 유전자를 포함하고, 그 위치에서 세포의 치료적 특성의 사용을 가능하게 한다. 예컨대, TIL 세포와 같은 혈액 세포는 세포내에 모노클로날 항체의 Fab 부분의 도입에 의해 변경될 수 있고, 따라서, 세포가 선택된 항원의 인식을 가능하게 한다.
핵산을 세포에 운반하기 위해, 반드시 필요한 것은 아니지만 "벡터"라고 알려진 담체를 사용하는 것이 일반적이다. 유전자 치료에 사용되는 벡터의 대부분의 형태는 바이러스이다. 과학자들은 이들의 세포의 DNA에 들어갈 수 있는 특유한 능력을 갖고 있기 때문에 바이러스를 사용한다. 유전자 치료에서 벡터로서 사용된 바이러스는 유전공학적으로 불능으로 한다; 이들은 자신을 재생할 수 없다. 대부분의 유전자 치료 임상적 시도는 목적하는 유전자를 운반하는 마우스 레트로바이러스에 의존한다. 벡터로서 사용되는 다른 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함한다.
예컨대, 환자로부터 세포를 제거하여, 실험실에서 기른다. 세포는 목적하는 유전자를 운반하는 바이러스에 노출된다. 바이러스는 세포내에 들어가고, 목적하는 유전자는 세포의 DNA의 일부가 된다. 세포는 실험실에서 자라고, 다시 환자로 돌아간다. 이런 형태의 유전자 치료를 엑스비보(ex vivo)라고 하며, 이것은 "몸 밖"을 의미한다. 세포가 환자의 몸체밖으로 나올 때, 유전자는 환자의 세포내에 이동한다. 다른 연구에서, 벡터 또는 리포좀(지방성 입자)은 환자 몸체에서 세포로 목적하는 유전자를 운반하기 위해 사용한다. 유전자가 환자 몸체 내부에서 세포로 이동하기 때문에, 이런 형태의 유전자 치료를 인비보라고 한다.
바이러스 벡터가 몸체내로 유전자를 운반하기 위해 사용될 때, 이들은 의도된 세포보다 변경될 수 있다. 다른 위험은 새로운 유전자가 DNA의 틀린 위치에 들어가서, 암이나 다른 손상을 일으킬 수 있다는 것이다. 또한 DNA가 직접적으로 주입되거나, 리포좀 운반계를 이용할 때, DNA가 유전하는 변경을 생산하는 생식세포내로 도입될 수 기회가 있다.
다른 관심은 이동된 유전자가 위험한 미싱 단백질을 많이 생산하기 위한 "과발현"될 가능성을 포함한다; 바이러스 벡터는 염증 또는 면역 반응을 일으킬 수 있고, 바이러스는 환자로부터 다른 개인 또는 환경내로 전달될 수 있다.
많은 벡터가 공지이다. 모든 공지의 벡터가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 벡터는 특정 유전자 운반을 위한 특정 세포 형태를 목표로 할 수 있다.
아데노바이러스 벡터
모든 아데노바이러스 벡터가 면역조절제의 발현 및/또는 분비를 위해 세포 및/또는 세포주의 감염시키기 위해 사용할 수 있다. 아데노바이러스는 선형성 이중나선 DNA 게놈을 포함하는 비엔벨로프성 바이러스이다. 아데노바이러스의 40개 이상의 혈청형 균주가 있고, 대부분은 인간에게 양성 호흡관 감염을 일으키고, 서브그룹 C 혈청형 2 또는 5은 벡터로 주로 사용된다. 라이프 사이클은 숙주 게놈내로 결합함을 포함하지 않는 것이 일반적이며, 이들은 숙주 세포의 핵에 에피좀성 요소로서 복제되고, 따라서, 이들은 삽입성 변이유발의 유험성이 없다. 야생형 아데노바이러스 게놈은 약 35 kb이고, 30 kb까지 외래 DNA로 대체될 수 있다(Smith, 1995, Verma 및 Somia, 1997). 조절기능 및 구조 단백질을 암호화하는 지발성 전사체를 갖는 4개의 초기 전사 유니트가 있다(El, E2, E3 및 E4). 원체 벡터는 불활성화된 E1 또는 E3 유전자를 갖고, 미싱 유전자는 헬퍼 바이러스, 플라스미드에 의해 트랜스내로 도입되거나 헬퍼 세포 게놈내로 통합된다(human fetal kidney cells, line 293, Graham, F. L., Smiley, J., Ruβell, W. L. 및 Nairn, R.(1997). General Virology 36: 59-72.). 2차 세대 벡터는 추가적으로 E2a 온도 민감성 돌연변이를 사용하거나(Engelhardt, J. F., Litsky, L., 및 Wilson, J. M.(1994). Human Gene Therapy 5: 1217-1229.), E4 결실된다(Armentano, D., Zabner, J. 등 (1997). Journal of Virology 71: 2408-2416.). 대부분의 최근 "내용없는(gutless)" 벡터는 오직 반전된 말단 반복체(ITRs) 및 트랜스유전자 주변의 패킹 서열을 포함하고, 모든 필요한 바이러스 유전자는 헬퍼 바이러스에 의해 트랜스에서 제공된다(Chen, H., Mack, L. M., Kelly, R. 등 (1997). Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 94: 1645-1650.).
아데노바이러스 벡터는 인비트로 및 인비보레서 형질도입된 표적 세포에서 매우 효과적이고, 고 역가로 생산될 수 있다(> 1011/mL). El 결핍 벡터를 사용하여 래트 뇌에서 지속적으로 트랜스유전자 발현을 나타낸 것(Geddes, B. J., Harding, T. C., Lightman, S. L. 및 Uney, J. B.(1997). Nature Medicine 3: 1402-1404.)을 제외하고, 원체 벡터로부터 트랜스유전자의 인비보 발현은 일과성이다(Verma, I. M. 및 Somia, N.(1997). Gene therapy-promises, problems and prospects. Nature 389: 239-242.). 정맥내 주사후에, 90%의 투입된 벡터는 간에서 비면역 매개된 기전에 의해서 파괴된다(Worgall, S., Wolff, G., FalckPedersen, E. 및 Crystal R. G.(1997). Human Gene Therapy 8: 37-44.). 또한 MHC 종류 I 제한된 면역계는 바이러스 감염된 세포를 제거하기 위해 CD8+ CTL 및 IFN-알파를 분비하기 위해 CD4+ 세포를 사용하고, 항-아데노바이러스 항체 생성한다(Yang, Y. 및 Wilson, J. M.(1995). Journal of Immunology 155: 2561-2563). 아데노바이러스 벡터의 변경은 어떤 CTL 에피토프를 제거할 수 있지만, 인신된 에피토프는 숙주 MHC 일배체형과 다르다(Sparer, T. E., Wynn, S. G., Clark등 (1997). Journal of Virology 71: 2277-2284. Jooβ, K.,Ertl, H. C.J. 및 Wilson, J. M.(1998). Journal of Virology 72: 2945-2954.). 파괴되지 않고 상기 세포에 잔류하는 벡터는 불활성화된 프로모터를 갖고(Armentano, D., Zabner, J. 등 (1997). Journal of Virology 71: 2408-2416.), 존속하는 항체는 벡터의 이후 투여를 예방한다.
일과성 면역억제 치료를 포함하는 면역 반응을 피하기 위한 접근은 트랜스유전자 발현의 지속 및 2차 유전자 이동의 달성에 성공적이다(Jooss, K., Yang, Y. 및 Wilson, J. M.(1996). Human Gene Therapy 7: 1555-1566. Kay, M. A., Meuse, L. 등 (1997). Proceedings of tlte National Academy of Sciences of the U.S.A. 94: 4686-4691). 더 적은 간섭자 방법은 숙주 UV 불활성화된 벡터의 주입에 의해 경구 내성을 유발한다(Kagami, H., Atkinson, J. C. 등 (1998). Human Gene Therapy 9: 305-313.). 그러나, 숙주보다 벡터를 조작하는 것이 바람직하다. 비록 오직 복제 손상 벡터가 사용되지만, 바이러스 단백질은 면역계에 존재하는 매우 낮은 수준으로 발현한다. 바이러스 코팅 서열을 포함하지 않는 "gutless" 벡터에 완료된, 매우 적은 유전자를 포함하는 벡터의 개발은 간 조직에서 지속성 생체 내의 트랜스유전자 발현을 가져왔다(Schiedner, G., Morral, N. 등 (1998). Nature Genetics 18: 180-183.). 다수가 분해되고, 면역계에 존재하는, 아데노바이러스 단백질내에 포장된 많은 함량의 DNA의 초기 운반은 임상적 시도에서 계속 문제점을 일으킬 수 있다. 또한 인간 집단은 MHC 일배체형에 관해 이질적이고, 집단의 일부는 아데노바이러스 균주에 이미 노출되었다(Gahry-Sdard, H., Molinier-Frenkel, V. 등 (1997). Journal of Clinical Investigation 100: 2218-2226.)
최근까지, 숙주 세포를 표적화한 아데노바이러스의 기전은 아직도 이해되지 않고 있다. 따라서, 조직 특이적 발현은 예컨대, 미오신 경쇄 1 프로모터와 같은 세포성 프로모터/인헨서(Shi, Q., Wang, Y. and Worton, R.(1997). Human Gene Therapy 8: 403-410) 및 평활근 세포 SM22a 프로모토(Kim, S., Lin, H. 등 (1997) Journal of Clinical Investigatin 100: 1006-1014), 또는 국소부위로의 직접적 운반(Rome, J.J., Shayani, V. 등 (1994), Human Gene Therapy 5: 1249-1258)을 사용함으로써 가능하다. 아데노바이러스 입자의 흡수는 MHC 유형I 분자(Hong, S.S., Karayan, L., 등 (19970. EMBO Journal 16: 2294-2306) 및 콕사키바이러스-아데노바이러스 수용체(Bergelson, J.M. Cunningham J.A., 등 (1997) Science 275: 1320-1323)를 포함하는 세포 수용체(들)과 아데노바이러스내의 섬유 코트 단백질의 초기 상호작용을 포함하는 두단계 과정을 나타낸다. 아데노바이러스의 펜톤 염기 단백질은 수용체 매개된 세포내이입을 경유하여 인터날리제이션(interalisation)을 허가하기 위해 그후 세표 표면 헤테로다이머의 인테그린 패밀리와 결합한다(Wickham T.,J., Mathias, P. 등 (1993). Cell 73: 309-319). 대부분은 세포는 아데노바이러스 섬유 코트 단백질을 위한 1차 수용체를 발현하지만, 인터날리제이션은 선택적이다(Harris, J, D and Lemoine, N. R.(1996). Trends in Genetices 12: 400-404). 바이러스 흡수를 증가시키는 방법은 한 인테그린을 발현하기 위해 표적 세포를 자극을 포함하고(Davision, E., Diaz, R.M 등 (19997). Journal of Virology 71: 6204-6207), 아데노바이러스에 대한 표적 세포 유형에 대한 특이정을 갖는 항체의 컨쥬게이션을 포함한다(Wickham, T.J. Lee, G,M 등 (1997b). Journal of Virology 71: 7663-7669. Goldman, C.K., Rogers, B.E., 등 (1997) Candcer Research 57: 1447-1451). 비록 항체의 사용이 벡터 생선 어려움 및 보상계를 활성화할 잠재적 위험을 증가시킨다. 섬유 코트 단백질내로 수용체 결합 모티프를 도입함에 의해, Wickham 등 (Wickham, T. J., Tzeun, E. 등 (1997a) Journal of Virology 71: 8221-8229)은 손상된 내피세포나 평활근 세포에 의해 발현된 인테그린 또는 다수의 세포 형태에 의해 발현되는 헤파린 설페이트 수용체와 결합하기 위해 바이러스가 방향을 수정할 수 있다.
모든 아데노-관련된 바이러스 벡터는 면역조절제를 발현 및/또는 분비하기 위해 감염된 세포 및/또는 세포주를 사용할 수 있다. 아데노-연관 바이러스(AAV)는 비병원성 인간 바르보바이러스로서, 증식하기 위해, 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스에 의존한다. 이들은 고 빈도로 숙주 게놈(19q 13-qter)의 특정 부위내로 결합된 헬퍼 바이러스 없이 분열 및 비분열세포를 감염시킬 수 있다(Kotin, R.M. Siniscalco M. 등 (1990). Proceedings of the Natinal Academy of Sciences of the U.S.A. 87: 2211-2215). 야생형 게놈은 바이러스 복제, 구조 유전자 발현 및 숙주 게놈내로 통합를 조절하는 단백질을 코딩하는 rep 및 캡시드 구조 단백질을 코드하는 cap의 두개의 유전자로 구성된 단일나선 DNA 분자이다. 게놈의 말단에는 프로모터를 포함하는 145bp의 말단반복(TR)이 있다.
벡터로서 사용할 때, rep 및 cap 유전자는 트랜스유전자 및 그의 관련 조절 서열에 의해 치환된다. 삽입의 총 길이는 야생형 게놈의 길이인 4.7 kb를 초과할 수 없다(Smith, A. E.(1995). Annual Review of Microbiology 49:807-838.). 재조합 벡터의 생산은 rep 및 cap이 헬퍼 바이러스 유전자 생산물(아데노바이러스 게놈으로부터 Ela, Elb, E2a, E4 및 VA RNA)과 함께 트랜스내에 제공되는 것을 필요로 한다. 통상의 방법은 아데노바이러스에 감염된 293 세포내로 벡터를 위한 하나 및 rep 및 cap을 위한 하나, 즉 두개의 플라스미드를 동시 감염시키는 것이다(Samulski, R. J., Chang, L., 및 Shenk, T.(1989). Journal of Virology 63: 3822-3828.). 그러나 이 방법은 귀찮고, 낮은 수율( < 104 입자/ml)을 나타내고, 아데노바이러스 및 야생형 AAV가 오염될 가능성이 높다. 낮은 수율의 하나의 원인은 아데노바이러스 복제상의 rep 유전자 생성물의 저해 효과이다(Vincent, K. A, Piraino, S. T. 및 Wadsworth, S. C.(1997). Journal of Virology 71:1897-1905.). 최근 프로토콜은 모든 아데노바이러스 구조 유전자를 제거하고, rep 내성 플라스미드를 사용하거나(Xiao, X., Li, J. 및 Samulski, R. J.(1998) Journal of Virology 72: 2224-2232.), 감염후 성숙 바이러스에 대한 rep 발현 플라스미드와 컨쥬게이션 하여 사용한다.(Fisher, K. J., Kelley, W. M, Burda, J. F. 및 Wilson, J. M.(1996) Human Gene Therapy 7: 2079-2087.).
rep의 부존재할 때, AAV 벡터는 단일 프로바이러스 또는 머리에서 코니 콘카타머로서 무작위로 통합만을 하며, 한편 말단 반복은 약간 분쇄되었다(Rutledge, E. A. 및 Ruβell, D. W.(1997). Journal of Virology 71: 8429-8436.). AAV 벡터에 대한 관심은 지연성 트랜스유전자 발현을 허가하는 숙주 게놈내로 이들의 통합때문이다. 트랜스유전자가 다른 종으로부터 유래되지 않을 때, 지속된 발현을 갖고, 유전자는 혈관 상피세포(Maeda, Y., Ikeda, U. 등 (1997). Cardiovascular Research 35: 514-521.), 가로무늬근(Fisher, K. J., Jooβ, K. 등 (1997). Nature Medicine 3 : 306-316. Herzog, R. W. 등 (1997). Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 94: 5804-5809.) 및 간세포(Snyder, R. O., Miao, C. H. 등 (1997). Nature Genetics 16: 270-275.)내로 전달된다고 보고되었다. AAV 캡시드에 대한 중화 항제는 감지가능할 수 있지만, 벡터의 재투여를 예방할 수 없거나, 프로모터 활성을 정지시킨다. 바이러스 캡시드의 단순성 때문에, 면역 반응을 침묵할 가능성이 있다. AAV 항체가 인간 집단에도 존재하므로, 이것은 추가적인 연구가 필요하다. 국소화한 벡터 운반에 의한 것 보다 특정 세포 유형을 표적하하기 위한 시도는 없다.
특히, 아데노-연관 벡터는 본 명세서의 참조로 삽입된 미국 특허 제5,693, 531호에 개시되었고, AAVp5네오; pSV--갈락토시데이즈; TRF169; LZ11; pSP72; pSP72nLacZ; pAdRSV4; pAdRSVnLacZ; AAVrnLac; SV40; p블루스크립트SK; pSV40 오리 AAV1; 및 pKMT11을 포함한다.
레트로바이러스 벡터
모든 레트로바이러스 벡터가 면역조절제를 발현 및/또는 분비하기 위해 세포 및/또는 세포주를 감염시키시 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스는 게놈으로서 단일 나선 RNA 분자를 포함하는 엔벨로프된 바이러스의 종류이다. 감염후에, 바이러스 게놈은 숙주 게놈내로 통합되는 이중 나선 DNA내로 역전사되고, 단백질을 발현한다. 바이러스 게놈은 약 10kb이고, 적어도 3개의 유전자: gag(코어 단백질을 코팅), pol(역전사효소를 코팅) 및 env(바이러스 엔벨로프 단백질을 코팅). 게놈의 각각의 말단에는 프로모터/인헨서 부위를 포함하는 긴 말단 반복(LTR) 및 통합과 관련된 서열이 있다. 또한 바이러스 DNA(psi)의 포장 및 env 유전자내로 RNA 접착 부위를 위해 필요한 서열이 있다. 어떤 레트로바이러스는 돌연변이화 될 때 암을 유발할 수 있지만, 벡터 생성에서 제거되는 원종양유전자를 포함한다. 레트로바이러스는 또한 세포 원종양유전자의 근처에 통합 및 LTR로부터 부적절한 발현의 유도 또는 종양 억제 유전자의 붕괴에 의해 세포를 변형할 수 있다. 그렇지만 삽입 돌연변이라 불리는 이 현상은 레트로바이러스를 벡터로 사용할 때 비록 매우 적게 발생한다.
레트로바이러스 벡터는 마우스 모델에서 벡터 개발을 가능하게 하는 마우스 세포 및 인간 치료를 가능하게 하는 인간 세포 양자에서 감염을 가능하게 하는 암포트로픽(amphotrophic) 바이러스인 Moloney 쥐 백혈병 바이러스(Mo-MLV)에 주로 기초한다. 바이러스 유전자(gag, pol 및 env)는 관심있는 트랜스유전자로 대체되고, 포장된 세포에서 플라스미드를 발현한다. 비필수 유전자가 포장 서열(psi)을 결힙하고 있기 때문에, 이들은 비리온 입자를 포함하지 않는다. 적합한 레트로바이러스의 복제를 생성하는 재조합을 방지하기 위해, 벡터 백본과 일치하는 모든 영역은 제거되고, 비필수 유전자는 적어도 2개의 전자 단위를 발현해야만 한다(Markowitz, D., Goff, S. 및 Bank, A.(1988). A safe packaging line for gene transfer: separating virus genes on two different plasmids. Journal of Virology 62: 1120-1124.). 또한 복제 적합한 레트로바이러스는 낮은 빈도로 일어난다.
필수 영역은 5' 및 3'LTRs, 및 5'LTR의 하류에 있는 포장 서열을 포함한다. 트랜스유전자 발현은 5'LTR내의 프로모터/인헨서 영역에 의해, 또는 교대 바이러스(예, 사이토메가로바이러스, 라우스 살코마 바이러스) 또는 세포성(예, 베타 액틴, 티로신) 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 돌연변이성 분석은 전체 gag 코딩 서열 및 가까운 상류 부분까지를 바이러스 포장 또는 트랜스유전자 발현의 영향없이 제거할 수 있다는 것을 보여준다(Kim, S. H., Yu, S. S. 등 (1998). Journal of Virology 72: 994-1004.). 그러나, 트랜스유전자 출발 코돈의 정확한 위치 및 5'LTR의 작은 변경은 트랜스유전자 발현에 영향을 미친다(Rivire,I., Brose, K. 및 Mulligan, R. C.(1995). Proceedings of the National Academy of Sciences of t7ze U.S.A. 92: 6733-6737.). 변형된 세포의 동정을 돕기위해, 선택성 표지, 예컨대, 네오마이신 및 베타 칼락토시데이즈를 포함시킬 수 있고, 트랜스유전자 발현을 내부 리보솜 부위의 첨가에 의해 향상시킬 수 있다(Saleh, M.(1997). Human Gene Therapy 8: 979-983.). 레트로바이러스 벡터의 가능한 운반 능력은 약 7.5 kb이고(Verma,I. M. 및 Somia, N.(1997). Nature 389: 239-242.), 만일 cDNA가 사용된다면, 어떤 유전자에 대해서는 너무 작다.
레트로바이러스 엔벨로프는 표적 세포 범주를 결정하기 위해 특정 세포성 단백질과 반응한다. 유전자 또는 그의 생산물의 변경은 세포 범주의 조절의 성공적인 수단으로 입증되었다. 그러나, 연구는 엔벨로프 단백질 및 세포 수용체사이의 결합 부위의 직접적 변경을 포함하며, 이 연구에서는 바이러스 입자의 계속적인 인터날리제이션을 방해하는 경향을 나타내었다(Harris, J. D. 및 Lemoine, N. R.(1996). Trends in Genetics 12: 400-404.). env 유전자의 일부를 에리트로포이에틴 단백질(EPO)으로부터의 150개의 코돈으로 치환함에 의해, Kasahara 등 (Kasahara, N., Dozy, A. M. 및 Kan, Y. W.(1994). Science 266: 1374-1376.)은 고 친화성을 갖는 세포를 부담하는 EPO 수용체를 표적화할 수 있었다. 스트렙토바딘 브리지를 통한 2차 세포 특이적 항체에 대한 친화성을 갖는 바이러스 입자와 항체의 커플화는 바이러스의 흡수를 촉진하지만, 인터날리제이션은 바이러스 분해를 유발할 수 있다(Roux, P., Jeanteur, P., 및 Piechaczyk, M.(1989). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 9079-9083.). Neda 등 (Neda, H., Wu, C. H., 및 Wu. G. Y.(1991) The Journal of Biological Chenaistry 266 : 14143-14146.)은 아시아글리코단백질 수용체를 발현하는 세포, 주로, 간세포에 의한 흡수를 발생하는 락토오즈로 바이러스 입자를 처리하였다. 그 결과, 엔도솜 막과 바이러스 엔벨로프의 융합을 허여하는 엔도솜의 산화에 기인할 수 있는 바이러스 트랜스유전자 발현에 유효하였다.
바이러스는 그의 친화성이 다르므로, env 유전자를 슈도타이핑이라고 알려진 공지기술에 의해 다른 바이러스의 유전자로 치환함에 의해, 숙주 범주를 확대할 수 있다. 수포성 구내염 바이러스 G 단백질은 벡터에서 유래된 Mo-MLV내에 포함될 수 있고(Burns, J. C., Matsubara, T. 등 (1994). Developmental Biology 165:285-289.), 원심분리에 의해 정제할때 보다 안정하다. 최근에 Qing(Qing, K., Bachelot, T., Mukherjee, P. 등 (1997). Journal of Virology 71: 5663-5667.)은 레트로바이러스 엔벨로프 단백질에 대한 세포성 수용체를 발현하는(하기 참조) 아데노-관련 벡터로 수용체 세포를 1차 표적화함에 의해 수많은 세포주에 형질도입을 증가시켰다.
레트로바이러스 융합 및 바이러스 유전자의 발현에서 표적 세포가 분열되어야만 하는 것이 필요한다. 이것은 인비보 또는 엑스비보에서 증식성 세포에 대한 유전자 치료를 제한하며, 따라서, 세포는 세포는 복제를 자극하기 위해 처리된 신체로부터 이탈한 후, 환자에 되돌아오기 전에, 레트로바이러스 벡터로 형질도입된다. 고 바이러스 역가 및 성장 인자에 노출되기 때문에, 엑스비보에서 세포는 고 효율적으로 형질도입될 수 있다(Glimm, H., Kiem, H. P. 등 (1997). Human Gene Therapy 8: 2079-2086.). 또한 엑스비보에서, 처리된 종양 세포는 종양 덩이와 관련이 있고, 직접적으로 종양파괴 효과를 나타낼 수 있다(Oldfield, E. H. 및 Ram, Z.(1995). Human Gene Therapy 6: 55-85.; Abdel-Wahab, Z., Weltz, C. 등 (1997). Cancer 80 : 401-412.).
렌티바이러스는 증식성 및 비증식성 세포 양자를 감염할 수 있는 레트로바이러스의 서브클래스이다. 이들은 단순한 레트로바이러스보다 보다 복잡하며, 추가적인 6개의 단백질, tat, rev, vpr, vpu, nef 및 vif를 포함한다. 최근 포장 세포주는 트랜스에서 구조 및 조절 유전자를 제공하는 슈도타입 env 유전자, 트랜스유전자 작제물에 대한 별개의 플라스미드를 갖는다(Naldini, L., Blmer, U. 등 (1996). Science 272: 263-267.). 초기의 마커 유전자를 사용한 결과는 근육, 간 및 신경 조직에서 연장된 인비보 발현을 나타내었다(Blmer, U., Naldini, L. 등 (1997). Journal of Virology 71: 6641-6649.; Miyoshi, H., Takahashi, M., Gage, F. H. 및 Verma, 1. M.(1997). Proceedingsof the National Academy of Sciences of the U.S.A. 94: 10319-10323.; Kafri, T., Blmer, U. 등 (1997). Nature Genetics 17: 314-317). 흥미롭게는, 상기 트랜스유전자는 MoMLV 벡터에서 불활성화되지 않는 때와는 다르게 의도적으로 조작된 사이토메가로바이러스 프로모터에 의해 유도된다. 식염수 콘트롤의 크기와 동일한 벡터 주사에 대한 제한된 염증 반응에 기인한 것일 것이다(Blmer, U., Naldini, L., Kafri, T., Trono, D., Verma, 1. M. 및 Gage, F. H.(1997). Journal of Virology 71: 6641-6649).
사용된 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유도되고, 비필수 조절 유전자의 일부가 제거할 목적으로 안정성에 대해 평가된다. vpr 및 vif의 돌연변이는 근육 또는 간세포 아닌 감소된 효능을 갖는 뉴론을 감염시킬 수 있다(Blmer, U., Naldini, L., Kafri, T., Trono, D., Verma, I. M. 및 Gage, F. H.(1997). Journal of Virology 71: 6641-6649; Kafri, T., Blmer, U. 등 (1997). Nature Genetics 17: 314-317.).
특정 구체예에서, 레트로바이러스 벡터 spLXIN, pSIR, pLXSH, pLNCX, pLAPSN, pFB 및 pFB-Neo가 사용된다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터
모든 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터가 면역조절제를 발현 및/또는 분비하기 위해 세포 및/또는 세포주를 감염시키시 위해 사용될 수 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 형태 1(HSV-1)은 인간 신경자극성 바이러스이고, 따라서, 신경계에 유전자를 전달하기 위한 벡터로서 HSV-1을 사용하는데 관심이 증가하고 있다. 야생형 HSV-1 바이러스는 뉴론을 감염시키고, 용균성 라이프 사이클로 진행하거나, 잠복기로 핵내 에피좀으로 지속할 수 있다. 잠재적으로 감염된 뉴론은 정상적으로 기능하고, 면역계에 의해 거부되지 않는다. 하지만, 잠재적 바이러스는 대부분 사일런트하게 전사되고, 뉴론은 잠복기동안 기능할 수 있는 특정 프로모터를 갖는다. 그러나, HSV-1에 대한 항체는 인간 집단에 일반적이지만, 헤르페스 감염의 복합증, 예컨대, 뇌염은 매우 드물다.
바이러스 게놈은 152 kb의 선형 이중나선 DNA 분자이다. 내부 반복 서열(IRL 및 IRS)에 의해 양자의 방향으로 연결된 길고 짧은(UL 및 US라 함) 두개의 특징적 영역이 있다. 81개 까지의 유전자가 있고(Marconi,P., Krisky, D. 등 (1996). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93: 11319-11320.), 이중 절반까지의 유전자가 세포 배양에서 성장에 필수적이지 않다. 일단 비필수 유전자가 결실되면, 40-50 kb의 외래 DNA는 바이러스내로 수용될 수 있다(Glorioso, J. C., DeLuca, N. A. 및 Fink, D. J(1995). Annual Review of Microbiology 49 : 675-710.). HSV-1 유전자의 3개의 주된 종류가 동정되고, 이는 즉각 초기(IE 또는 알파) 유전자, 초기(E 또는 베타) 유전자 및 말기(L 또는 감마) 유전자이다.
감수성 세포에서 감염후에, 용균성 복제는 유전자 전사의 일시적 동격의 서열에 의해 조절된다. Vmw65(외피 구조 단백질)은 초기 유전자의 생산을 허여하는 상호활성화 인자인 즉각 초기 유전자(IP0, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP477)를 활성화한다. 초기 유전자는 뉴클레오타이드 대사 및 DNA 복제를 위한 유전자를 암호화한다. 말기 유전자는 초기 유전자에 의해 활성화되고, 구조 단백질을 코드한다. 전체 사이클은 10h 이하로 소요되고, 비가역적으로 세포는 치사한다.
잠재성의 확립을 이끄는 분자 현상은 충분히 알려지지 않았다. 잠복기동안의 유전자 발현은 게놈의 IRL 부위에 위치한 잠복기 관련성 전사체(LAT)에 의해 유도된다. 2개의 LAT(2.0 및 1.5kb)가 IE 유전자 ICPO의 역방향으로 전자된다. LAT는 잠복기로부터 HSV-1의 불활성화(Steiner, I., Spivack, J. G. 등 (1989). EMBO Journal 8 : 505-511.) 및 잠복기의 확립의 역할을 한다(Sawtell, N. M. 및 Thompson, R. L.(1992) Journal of Virology 66: 2157-2169.). LAT의 발현을 유도하는 2개의 잠복기 활성 프로모터가 확인되었고(Marconi, P., Krisky, D. 등.(1996). Proceedings of the National Acadenzy of Sciences USA 93: 11319-11320.), 벡터 트랜스유전자 발현에 유용함이 입증되었다.
두개의 기본적인 접근이 HSV-1 벡터 즉, 암플리콘 및 재조합 HSV-1 바이러스의 생산에 사용되었다. 암플리콘은 col E1 ori(대장균 오리진의 복제), OriS(HSV-1 오리진의 복제), HSV-1 포장 서열, 즉각 초기 프로모터 및 선택성 마커의 조절하의 트랜스유전자를 포함하는 박테리아에서 생산된 플라스미드이다(Federoff, H. J., Geschwind, M. D., Geller, A.I. 및 Keβler, J. A.(1992). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 89: 1636-1640.). 암플리콘은 트랜스에서 모든 미싱 구조 및 조절 유전자를 제공하는 헬퍼 바이러스(온도 감수성 돌연변이)를 포함하는 세포주로 감염된다. 바이러스 입자를 포함하는 헬퍼 및 암플리콘은 수용체로 운반된다. 최근, 암플리콘은 플라스미드 에피좀성 유지를 위한 서열에서 유도된 Epstein-Barr 바이러스를 포함다(Wang, S. 및 Vos, J.(1996). Journal ofVirology 70: 8422-8430.).
재조합 바이러스는 트랜스에 제공되는 하나의 즉각 초기 유전자 예컨대, ICP4의 결실에 의해 복제 결실로 만들 수 있다. 비록 적은 병원성 이지만, 뇌조직에서 직접적으로 트랜스유전자 발현을 할 수 있고, 이들은 배양에서 뉴론에 유해하다(Marconi, P., Krisky, D. 등.(1996). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93: 11319-11320.). 다수의 즉각-초기 유전자의 결핍은 실질적으로 세포 독성을 감소시키고, 또한 야생형 잠재적 바이러스에서 침묵하는 프로모터로부터 발현을 허여한다. 상기 프로모터는 장기간 유전자 발현을 이끄는데 유용할 수 있다.
복제-조건부 돌연변이는 특정 세포주에서만 복제할 수 있다. 관용적 세포주는 모두 증식성이고, 바이러스 결핍을 위한 보체에 대한 세포성 효소를 제공한다. 돌연변이는 티미딘 키네이즈 (During, M. J., Naegele, J. R., OMalley, K. L. 및 Geller, A. 1.(1994). Science 266 : 1399-1403.), 리보뉴클레이즈 리덕네이즈(Kramm, C. M., Chase, M. 등 (1997). Hiiniaii Gene Therapy 8: 2057-2068.), UTPase, 또는 신경독성 인자 g34.5(Kesari, S., Randazzo, B. P. 등 (1995). Laboratory Investigation 73: 636-648.)를 포함한다.
비바이러스 벡터
바이러스 벡터는 모두 약간의 면역반응을 유도하고, 안성정에 있어 위험성을 가질 수 있다(예컨대, 삽입 돌연변이 및 독성 문제). 또한 이들의 능력은 제한적이고, 큰 규모 생산이 달성하기 어려울 수 있다. 따라서, 본 발명의 일구체예에서는, 유전자 전달의 비바이러스 방법이 사용되고, 이는 오직 적은 수의 단백질이 필요하고, 실제로 무한의 능력을 갖고, 감염성 및 돌연변이 가능성도 없고, 약제학적 기술을 사용하여 대량 생산이 가능하다. 비-바이러스 DNA 전달은 3가지 방법, 즉, 네이키드 DNA, 리포좀 및 분자 컨쥬게이트가 있다. .
네이키드 핵산
네이키드 DNA 또는 핵산은 면역조절제를 숙주에 운반하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 플라스미드의 형태로 근육세로내로 직접적으로 주사(Wolff, J. A., Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A. 및 Felgner P. L.(1990). Science 247: 1465-1468.) 또는 조직내로 충격을 가하는 금 입자에 부착(Cheng, L., Ziegelhoffer, P. R. 및 Yang, N. S.(1993). Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 90: 4455-4459.)되는 방법에 의해 운반될 수 있다. 용어 "네이키드" 핵산, DNA 또는 RNA는 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제제, 리포펙틴 또는 침전성 제제를 포함하는, 세포내로 도입을 돕거나, 촉진하는 모든 운반성 비히클로부터 유리된 서열을 말한다. 비록 매우 효율적이지는 않지만, 이들은 인비보에서 지속된 낮은 수준의 발현을 나타낼 수 있다. 다른 유전자 치료 기술과는 달리, 네이키드 핵산 서열을 표적 세포내로 도입하는 주된 이득은 세포내의 면역조절제 합성의 일시적 성질이다. 비-복제성 DNA 서열은 6개월까지 목적하는 면역조절제의 생산을 제공하기 위해 세포에 도입될 수 있다고 연구되었다. 이 방법의 단순성 및 지속된 발현은 DNA 백신의 개발을 유도한다. 통상의 약독화 및 단백질에 기초한 백신에 비하여, 이들은 예컨대, 상대적으로 저렴한 모체 항체에 기인한 미리 존재하는 면역에 영향이 없고, 단일 플라스미드 상에 다수의 병원성 항체를 운반할 수 있다(Manickan, E., Karem, K. L., 및 Rouse, B. T.(1997). Critical Reviews in Immunology 17: 139-154.). DNA 백신은 백신이 존재하지 않는, 예, HIV(Lekutis, C., Shiver, J. W., Liu, M. A., 및 Letvin, L. N.(1997). The Journal of Inan uyzology 158: 4471-4477.) 또는 최근 백신이 충분히 유효하지 않는, 예, 인플루엔자(Macklin, M. D., McCabe, D. 등 (1998) Journal of Virology 72: 1491-1496.)에서 이들 병원균에 대해 개발되었다. 고 보존된 유전자를 사용함에 의해, Ulmer 등 (Ulmer, J. B., Donnelly, J. J. 등 (1993). science 254: 1745-1749.)은 2개의 혈청학적으로 구별되는 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 마우스를 면역화하였다. 그러나 대부분의 경우, DNA 백신은 존재하는 백신보다 효과적이지 않았다(Macklin, M. D., McCabe, D. 등 (1998) Journal of Virology 72: 1491-1496.). 면역 반응의 급성 형태는 적절한 사이토카인을 코팅하는 유전자의 공동-혈질전환에 의해 조절될 수 있고(Xiang, Z. 및 Ertl, H. C.(1995). Immunity 2: 129-135.), 이 방법은 부적합한 면역 반응의 방향시정에 유효함이 증명되었다(Manickan, E., Karem, K. L., 및 Rouse, B. T.(1997). Critical Reviews in Immunology 17: 139-154.). 네이키드 DNA의 다른 용도는 암의 면역강화(하기 참조, Corr. M., Tighe, H., Lee. D., Dudler, J. 등 (1997). The Journal of Laboratory Investigation 159: 4999-5004.), 췌장 인슐린 기능의 손상(Goldfine. 1. D., German, M. S., Tseng, H. 등 (1997). Nature Biotechnology 15: 1378-1382.), 및 결맥관 발달의 자극(Takeshita, S., Tsurumi, Y. 등 (1996) Laboratory Investigation 75: 487-501.)을 포함한다. 근육조직에서 유전자 생성물의 발현은 콜라게네이즈, 파파베린의 공동 투여에 의해 증가시킬 수 있다(Budker, V. Zhang G., Danko, I., Williams, P. and Wolff, J. (1998). Gene Therapy 5: 272-276). 근육 특이적 프로모토용(Skarli, M., Kiri, A., 등 (1998) Gene Therapy 5; 514-520) 및 다른 인트라유전자 조절 서열, 예컨대, 폴리 A 및 전사 말단 서열(Hartikka, J., Sawdey, M, 등 (1996) Human Gene Therapy 7: 1205-1217)의 사용이 트랜스 유전자의 발현을 증가시킨다.
네이키드 폴리펩타이드의 주사에 있어, DNA 또는 RNA의 유효 용량은 약 0.05g/kg체중 내지 약 50g/kg체중의 범위일 수 있다. 바람직하게는 상기 용량은 약 0.005mg/kg 내지 약 20g/kg, 보다 바람직하게는 약 0.05mg/kg 내지 약 5g/kg의 범위일 수 있다. 물론, 통상의 당업자은 상기 용량을 주사의 조직 부위에 따라 적절히 변화시킬 수 있다. 핵산 서열의 적합하고 유효한 용량은 통상의 당업자에게 쉽게 결정될 수 있고, 치료될 질환 및 투여 경로에 따라 의존할 수 있다. 투여 경로는 주사와 같은 비경구 경로, 조직의 간질간 공간, 또는 특히 폐나 기관지로 운반을 위한 에어로졸 제제의 흡입, 인후 또는 코의 점막이다. 또한 네이키드 폴리펍타이드 작제물은 처리에 사용되는 카테터로 혈관성형술동안 동맥으로 운반될 수 있다.
면역조절제는 또한 리포좀 제제로 운반될 수 있고(예컨대, Felgner, P. L. 등 (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: 126-139 및 Abdallah B 등 (1995) Biol. Cell 85(1):1-7), 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀은 액성 용액의 분획을 포접할 수 있는 지질 2중층이다. DNA는 양이온성 리포좀의 외부 표면에(전하의 덕택으로) 자연적으로 결합할 수 있고, 이들 리포좀은 세포막과 상호작용한다(Felgner, J. H., Kumar, R. 등 (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 2550-2561.). 인비트로에서 90%이하의 특성 세포주는 형질전환될 수 있다. 다른 양이온성 리포좀에 소량의 음이온성 지질을 포함함에 의해, DNA는 리포좀의 배부 표면으로 도입될 수 있고, 이와 같이 효소적 분해로부터 보호된다(Crespo et al, 1996, cited in Alio, S. F.(1997). Biochemical Pharmacology 54: 9-13). 엔도좀으로서 세포내로 도입을 촉진시키기 위해, 표적 단백질은 리포좀에 포함될 수 있다, 예컨대, 항-MHC항체(Wang, C., and Huang, L.(1987). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 7851-7855), 트랜스페린(Stavridis, J.C., Deliconstantinos, G., 등 (1986), Experimental Cell Research 164: 568-572). 및 센다이 바이러스 또는 그의 F 단백질(Dzau, J.V., Mann, M, J, Morishita, R. and Kaneda, Y.(1996). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93: 11421-11425). 센다이 바이러스는 세포질내로 엔도좀으로부터 회피하기 위한 플라스미드 DNA를 허여하고, 이와 같이, 분해를 피한다. DNA 결합 단백질(28 kDa 고 이동성 그룹 1 단백질)의 봉입은 핵으로 플라스미드를 가지고 옴으로써 전사를 증가시킨다(Dzau 등, 1997, Am J Cardiol, 1997, Nov, 6; 80(9A); 33I-39I).
분자 컨쥬게이트는 단백질과 DNA 결합 시약이 부착하는 합성 리간드로 구성된다. 세포로의 운반은 리보좀에서의 기술과 유사한 기술을 사용하여 증가시킬 수 있다. 표적 단백질은 아시아로글리코단백질(Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R, and Birnstiel, M.L.,(1997) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88" 4255-4259), 트랜스페린(Wu, C.H., Wilson, J.M. and Wu., G.Y.(1989). Journal of Biological Chemistry 264; 16985-16987.), 중합체성 IgA(Ferkol, T., Kaetzel, C, S, and Davis, P.B.(1993). Journal of Clinical Investigation 92: 2394-2400) 및 아데노바이러스(Madon, J. and Blum, H. E.(1996)을 포함한다. 트랜스유전자의 발현은 일과성인 경향이 있고, 엔도좀/리소좀 분해에 의해 제한된다.
본 발명의 예시적이고 비제한적 예들이 이하 제공된다ㅏ. 이들 예로 본 발명의 범위가 제한됨을 의도하지 않는다.
예
본 명세서에서 사용된 하기 약어는 하기를 언급한 것을 의미한다.
Ad IFN : 우드척 인터페론 감마를 발현하는 아데노바이러스 벡터
Ad RFP : 아데노바이러스 벡터 without 우드척 인터페론 감마 유전자
CCC DNA : DNA의 공유적으로 폐환된 바이러스 형태
DNA : 데옥시리보핵산
FTC : 5-플루오로-1-(2R,5S)-1,3-옥사티오란-5-일] 시토신
GFP : 그린 형광 단백질
HBV : B형 간염 바이러스
IFN : 인터페론
L-FMAU : 1-(2-플루오로-5-메틸-β,L-아라비노푸라노실) 티민
M1, M2 : 치료를 시작한 각각 1월 또는 2월
PCNA : 증식성 세포 핵성 항원
PCR : 중합효소 체인 반응
Pfu : 플라크 형성 유니트
RFP : 레드 형광 단백질
RI : 복제 중간체
RT : 역전사
TUNEL : 최종 데옥시뉴클레오타이딜 트렌스퍼레이즈(TdT)-매개 dUTP 단락-말단 표지화 어세이
WHV: 우드척 B형 간염 바이러스
실시예 1
L-FMAU 및 β-L-FTC의 투여
일반적으로 β-L-FTC는 Cullen 등에 의해 이미 기술된 프로토콜에 따라 투여되었다(Cullen 등 Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 41, 2076-2082). 특히 β-L-FTC는 30mg/kg으로 복강내로 주사되었다.
L-FMAU를 사용한 실험에서, 화합물은 Peek 등 및 Zhu 등에 의해 기술된 농도로 복강 투여에 의해 투여되었다(Peek 등 Hepatology 2001,33, 254-66)(Zhu 등 J.Virol. 2001,75, 311-22)(10 mg/kg).
동물
우드척 B형 간염 바이러스 감염 모델은 만성 B형 간염을 갖는 인간에서 관찰되는 바이러스 감염의 병력을 모사하기 때문에 항바이러스 평가에 유용한 모델이다. 수개의 연구를 통해 신규한 뉴클레오사이드 유사체의 특히 항바이러스 효능 및 독성과 관련된 연구에서 이 동물 모델이 사용하기 적절한 것으로 나타났다.
대략 1세의 WHV로 만성 감염된 12마리의 캡티브-본 우드척(Marmotta donax)을 생체내 실험에 사용하였다. 이 처리 프로토콜은 2000년 6월부터 12월까지 수행하였다.
아데노바이러스을 주사했을 때, 아데노바이러스 주사후 10일간은 매일, 그 이후로는 1주에 2회씩 혈액 샘플을 채취하였다. 추가로 이 샘플을 하기 기술하는 바와 같은 바이러스 마커에 대하여 평가하였다.
인터페론 유전자 전달 시스템(Dr. Naβal, Freiburg, Germany)
아데노바이러스 벡터는 He 등 (He, T. C. 등 Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1998, 95, 2509-14)에 의해 기술된 방법에 따라 수득하였다. 아데노바이러스 벡터는 E1 및 E3 영역이 결실되어 있기 때문에 복제 불능이었다. SV40 프로모터의 조절하에 eCFP 유전자 리포터에 결합된 CMV 프로모터의 조절하에 프리-IFN 감마 유전자(aa 1-143)에 대한 코딩 카세트를 포함하는 재조합 카세트를 원(original) E1 영역(454-3500)에 삽입하였다(도 1). 활성 우드척 IFN 감마 생산 효능은 VSV 감염으로부터 우드척 세포주 WCH17의 보호로 평가하였다.
pSV40-eCFP 카세트만을 포함하는 동일한 아데노벡터를 대조군으로서 사용하였따. 간을 표적으로하여 정맥 주사에 의해 아데노바이러스 벡터를 투여하였다. 벡터는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)에 희석되어 3x107 내지 3x1011 pfu/동물의 농도로 투여되었다.
실시예 2
L-FMAU + β-L-FTC + Ad IFN의 평가
WHV로 실험상 감염된 18마리의 우드척(Marmota monax)은 Northeastern Wildlife(South Plymouth, N. Y.)로부터 구입하였다. 우드척은 만성 감염되었고 생체내 실험에 사용하였다.
β-L-FTC(30 mg/kg) 및 L-FMAU(10 mg/kg)을 복강내 투여하였다. 처음 1주간은 매일 주사하고, 그 후 7주간은 이틀에 한번 주사하였다.
SV40 프로모터의 조절하에 eRFPnuc 유전자 리포터에 결합된 CMV 프로모터의 조절하에 우드척 인터페론 감마(IFN) 유전자의 신규한 재조합 카세트를 아데노바이러스 벡터(Ad IFN)의 원 E1 영역에 삽입하였다. pSV40-조절 eGFPnuc만을 포함하는 동일한 아데노바이러스 벡터를 대조군(AdGFP)(Dr. Michael Nassal 제공(University of Freiburg, Germany))으로서 사용하였다.
이 실험을 위해 우드척 인터페론 감마를 발현시키는 재조합 아데노바이러스 벡터를 3x1010 pfu/동물로 2회(4주째 및 8주째)에 걸쳐 정맥 주사하였다. 바이러스 접종은 2001년 8월 Amherst, MA, USA에서 개최된 HBV 미팅에서 제시된 사전 연구에서 확인되었다(참조 도 2).
치료하는 동안 혈액 샘플을 이틀에 한번, 및 Ad IFN의 매 주사 후 5일간 매일 채취하였다. 약물을 중단한 후 바이러스 부하량이 증가하기 시작할 때까지 이틀에 한번, 이어서 1주에 한번, 이어서 한달에 1번 혈액 샘플을 채취하였다.
실시예 3
간 생검
치료 전(TO), 치료시 2회(M1, M2) 및 약물 중단후 4개월째(M3) 일반적인 마취하에 복식절제술(laparatomy)후 외과적 간 생검을 시행하였다. 매 아데노바이러스 주사후 4일째 치료중(on-treatment) 생검을 수행하였다. 바이러스 DNA 분석을 위해 각 샘플 일부를 -80℃에 저장하였다. 또다른 부분은 포르말린에 고정시키고 간 조직 구도 및 면역염색을 위해 파라핀에 함몰시켰다. 남은 부분은 전자현미경 연구를 위해 1% 오스미움테트록시드에 고정시켰다(TO 및 M2). 또한, 수술하는 동안 육안으로 간을 평가하였다.
간내 바이러스 DNA 합성 분석
감염된 우드척으로부터의 간내 바이러스 DNA를 간 생검시 채취하였다. 1OmM Tris-HCl(pH 7.5), 10 mM EDTA에서 균질화시킨 후 간 샘플을 2부, 바이러스 DNA를 분리(프로테아제 K 분해 후, 페놀-클로로포름 추출 이어허, 에탄올 침전)하기 위한 것 및 비-단백질 공유 결합된 폐 환상(CCC) 바이러스 DNA를 분리(단백질 결합 DNA의 SDS-KCl 침전 후, 페놀-클로로포름 추출 이어서 에탄올 침전)하기 위한 것으로 나누었다. 서던 블롯 분석에 사용되는 각 샘플에서 DNA 양을 표준화하기 위하여 DNA 농도를 UV 농도 분석에 의해 측정하고 아가로스 겔을 통해 전기 영동시킨 후 앞서 측량된 DNA와 비교하였다. 총 DNA 또는 CCC DNA 시료에 상응하는 5μg의 핵산을 1.2% 아가로스 겔을 통해 전기영동시키고 블랏팅에 의해 나일론 막에 알칼리성으로 이동시키고 바이러스 DNA를 상기 기술한 바와 같이 특이 혼성화에 의해 검출하였다.
간의 조직학적 분석
포르말린에 고정된 간 생검 조직 절편을 헤마토실린-에오신-사프란(HES) 염료로 염색하고 광학 현미경으로 검사하였다. 간세포 괴사(호산성 소체) 정도, 문맥로 및 소엽내간극의 염증 수준, 및 섬유화 단계를 Metavir 스코어(Hepatology. 1994; 20(1 Pt1) : 15-20)를 사용하여 반측량적으로 평가하였다. 간 생검 절편을 지방증, 세관 증식, 간세포 형성이상, 및 간세포암종에 대하여 평가하였다.
간의 조직학저 조사를 통해 비처리 동물에서는 경미한 염증 활성이 관찰된 반면, Ad IFN 또는 Ad GFP 벡터를 받은 양 그룹에서는 유사한 간염의 급성적인 악화 징후가 밝혀졌다.
주사전 및 폴리클로날 항 WHV 항체를 주사한 후 D5일째 수득한 간 생검 조직 절편상에서 시행된 면역염색 연구는 우드척 A37 및 A36에서 감염된 간세포의 수가 현저히 감소되었음을 나타내었다.
실시예 4
바이러스혈증 분석
도트 블롯 어세이
바이러스혈증을 우드척 B형 간염 바이러스(WHV) DNA의 측량 검출을 통해 평가하였다. WHV DNA를 High Pure PCR 주형 DNA 추출용 키트(Roche daignostics)를 사용항 혈청으로부터 채취하고 50㎕의 혈청에 상응하는 샘플을 WHV DNA 표준의 일련의 희석액으로 막(Biodyne B, 0.45μM, Merck Eurolab)에 스팟팅하였다. 고정 단계후, 필터를 32p 표지된 전장 WHV DNA 프로브와 혼성화시켰다. ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 phosphoImager 스캔(Amersham Phannacia Biotech)의 비교 분석을 수행하였다. 에세이 검출 한도는 6.107 카피/mL(200 pg/mL)이었다.
내인성 중합효소 어세이(EPA)
내인성 중합효소 어세이(EPA)에서 바이러스의(+) 스트랜드 DNA의 합성에 대한 AdIPN의 효능을 WHV 입자를 사용하여 측정하였다. 비교를 위해 DNA 의존 DNA 중합효소 저해제, 포스포노포름산(PFA)을 대조군으로서 사용하였다. 내인성 중합효소 활성은 풀린(relaxed) 환상 DNA를 포함하는 완전한 입자내 바이러스의(+) 스트랜드 DNA의 완성과 일치한다. DNA 중합효소 활성과 관련되는 WHV는 50㎕의 부분 정제된 바이러스 입자와(i)dATP,dCTP, dGTP(각각 100㎕) 및 3H-dTTP(0.17μM)을 포함하는 25㎕의 반응 완충액(Tris-HCl 50mM, pH 7.6, MgCl2 40mM, NH4Cl 60mM, NP4 0 0.5%, β-머캅토에탄올 10mM)을 혼합하여 평가하였다. 효소 에세이는 Hantz 등 (HantzO 등 1992 Virology. Sep; 190(1): 193-200)에 기술된 바와 같이 시행하였다. 간단하게, 3시간동안 효소 반응물을 37℃에서 인큐베이션시키고 GF/C 섬유 유리 필터(Whatman)상에 스팟팅하고 클리클로로아세트산 5%으로 철저히 세척하였다. Beckman LS 6000SC 섬광 계수기에서 3H-dTTP의 혼입을 측정하였다. 본 에세이의 검출 한도는 1,000 cpm/mL이었다.
실시간 PCR 어세이(Light Cycler)
바이러스 역가가 너무 낮아서 도트 블롯 혼성화에 의해 용이하게 검출할 수 없을 경우에는 실시간 PCR 기술을 이용하였다(참조 Dandri 등 Hepatology 2000, 32, 139-46). 실시간 PCR은 10 카피수만큼 적은 인간 HBV DNA도 검출할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 바이러스혈증 분석을 마치기 위하여, 실시간 PCR을 사용하여 6x107 카피/ml(200 pg/ml) 이하의 WHV DNA을 검출하였다. 동일한 WHV DNA 표준을 도트 블롯 및 실시간 PCR 어세이 모두에 사용하였다. 도트 블롯 양성 샘플에 대한 PCR 어세이는 측량적으로 유사한 결과를 제공하였다. 본 방법의 검출 하한은 25 WHV 카피/㎕이었다.
3마리의 우드척에서 실시간 PCR을 통해 분석된 바이러스 제거 및 리바운드와의 키네틱에 대한 예비 결과를 도 10에 나타낸다. 바이러스 역가는 평균 9 x 104 카피/ml을 나타내면서, 낮은 값은 0.320 pg/ml에 도달하는 것으로 나타났다. 이 기술을 추가로 동물 샘플에 적용시켜 β-L-FTC 단독 또는 면역조절제, 예로서 Ad IFN와의 배합물의 효능을 측정할 수 있다.
실시예 5
접종물 역가 측정
아데노바이러스 벡터 접종물의 항바이러스 효능 및 내성을 측정하기 위하여, 4마리의 동물에 3x107(A33), 3x109(A30) 및 3X1011 pfu(A32 및 A34)의 농도로 Ad-IFN를 정맥 주사하여 투여하였다.
최대 역가의 접종물(3.1011 pfu)은 바이러스 부하량을 현저히 감소시켰지만, 2마리 동물 모두 주사후 2 및 5일째 죽었다(DO 및 사망일 사이에 WHV DNA는 147ng/ml로부터 70 ng/ml, 1067ng/ml로부터 265 ng/ml로 각각 감소하였다). 3x109 pfu 접종물은 6일동안 70ng/ml로부터 대략 30 ng/ml으로 일시적으로 감소시켰다. 최저 접종물은 현저하게 바이러스혈증을 감소시키지 못했다(도 3).
실시예 6
효능 연구: Ad IFN 벡터의 항바이러스 효능 평가
5마리의 우드척(A35, A36, A37, A38, A42)에 3x109 pfu의 완전 Ad IFN 벡터를 투여하였다. 대조군은 2마리의 우드척(A39, A40)으로 구성되고, 이는 3x109 pfu 의 Ad GFP 벡터를 투여받고 1마리의 우드척(A41)은 처리되지 않았다(도 4 및 5).
Ad IFN 처리 그룹에서 아데노바이러스 접종 후 5마리의 처리 동물중 3마리에서 일시적인 WHV DNA 감소가 관찰되었다(A35: 46ng/ml으로부터 20 ng/ml; A37: 76 으로부터 20 ng/ml 및 A42: 20으로부터 5 ng/ml). WHV DNA 결과를 또한 EPA에 의해 평가하였다(도 4 및 5). 간내 WHV DNA의 서던 블랏팅 하이브리제이션을 통해 바이러스 DNA(16으로부터 76%, A42 제외) 및 CCC DNA(2로부터 76%)로 현저히 감소되었음이 나타났다(도 6).
실시예 7
L-FMAU 및 β-L-FTC 평가.
결과, β-L-FTC, L-FMAU, 및 Ad IFN으로 처리된 모든 동물에서 도트 블롯 어세이의 검출 한도 밑으로 대략 4 내지 5 로그 유니트까지 감소된 바이러스혈증의 현저하 감소가 나타났다(도 7). 그러나, 대조군(비처리, Ad GFP) 또는 Ad IFN 만으로 처리된 우드척은 바이러스혈증이 현저히 감소되지 않았다(도 8 및 9).
처리에 의해 유도된 바이러스 부하량의 감소는 현저하게 신속하였다. 바이러스혈증은 치료 시작 후 1 내지 2주째 보다 더 작게 검출할 수 없는 수준( < 6.107/mol)으로 감소하였다.
β-L-FTC, L-FMAU, 및 Ad IFN으로 처리된 동물에서 바이러스혈증은 처리 중단 후에도 다양한 시간동안 억제되었다. 추가로, 처리 동물에서 바이러스 부하량은 처리전 수준으로 돌아가지 않았따. β-L-FTC, L-FMAU, 및 Ad IFN으로 처리된 2마리의 우드척(A52 및 A49)의 바이러스혈증은 28주째(약물 중단후 6개월째) 여전히 검출가능 수준이하였다.
면역조절제와의 병용 치료 결과 바이러스혈증 수준은 신속하고 현저히 감소하였다(2주내 평균 5 log10 감소). 이러한 감소는 β-L-FTC 및 L-FMAU만으로 수득된 결과와 현저히 비교된다. 사전 연구에서 혈청내 바이러스 역가는 동일한 시간 프레임에서 각각 약 56 및 1,000 배 감소하였다. 이러한 관찰을 통해 β-L-FTC 및 L-FMAU의 항바이러스 활성은 면역조절제와 함께 병용될 때 향상된다는 것이 제시되었다. 또한, 항바이러스 효능은 연장된 바이러스 리바운드와 함께 시간에 따라연장되었다. 약물 중단 후 6 내지 7개월째 두마리의 동물(A49 및 A52)의 혈청 샘플에서 바이러스혈증은 도트 블롯 어세이( < 6.107 카피/ml)에서 검출불가능하였다. 이러한 연장 효능은 CCC DNA 수준의 감소와 일치한다(각각 -69% 및 -75%). 치료 중단후 바이러스 복제의 리바운드에서의 연장은 감염 세포에서 존재하는 세포내 CCC DNA 풀의 재증식 및/또는 신규한 간세포의 재감염을 통한 CCC DNA 풀의 재확립에 필요한 시간을 반영한다.
간내 CCC DNA.
간내 바이러스 DNA의 서던 블랏 분석(도11)을 통해 통상 바이러스혈증 패턴과 일치하는 간내 WHV 복제 중간체 수준의 변화가 입증되었다. β-L-FTC, L-FMAU 처리 그룹에서 바이러스 DNA 합성 수준이 현저히 감소된 것으로 관찰되었고, 처리전 수준과 비교하여 간내 바이러스 DNA 중간체 수준은 82 내지 93% 감소하였다(도 12 및 13). CCC DNA 는 MI 및 M2에서 간에 존재하는 반면, 다른 WHV DNA 복제 중간체는 현저히 감소하였다.
또한, CCC DNA는 L-FMAU/β-L-PTC 중복치료(bitherapy)시 24 내지 47%까지 감소하였다. 그러나, 서던 블랏 분석에 의해 입증된 바 간내 바이러스 CCC DNA 제거 후 L-FMAU/β-L-FTC 투여에 의한 WHV 복제 저해는 없었다.
그러나 비처리 우드척에서, 총 또는 CCC DNA는 시간에 따라 각각 +64% 및 + 77%으로 증가하였다(도 14).
Cullen 등 (Cullen 등Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 41, 2076-2082), Zhu 등 (Zhu 등 J.Virol. 2001, 75, 311-22) 및 Peek 등 (Peek 등 Hepatology 2001,33, 254-66)의 결과와 비교하여, IFN 및 L-FMAU와 배합된 β-L-FTC는 현저한 항바이러스 효능을 갖는다. 처리 개시후 1개월째 복제 중간체는 간에서 검출불가능한 수준으로 감소하였다. 대조적으로 간내 CCC DNA 수준은 복제 DNA보다 더욱 낮은 비율로 감소하였다. β-L-FTC 및 L-FMAU의 배합물을 바이러스 CCC DNA 40%를 감소시켰다(DNA 복제 중간체의 경우 98% 감소).(CCC DNA가 평균 10배 감소하였음을 나타낸 Peek 등 (Peek 등 Hepatology 2001,33, 254-66)에 의해 입증된 바와 같이 이 효능은 오직 L-FMAU의 항바이러스 효능에 기인한다. 그러나, 단일 약물, L-FMAU로 처리한 후 8 내지 9개월째, WHV의 약물 내성 균주가 출현하였다(Zhou, T. 등 J.Vison. 2000, 74, 11754-63). β-L-FTC와 배합된 L-FMAU는 약물 내성 균주의 출현을 막을 수 있고 남은 CCC DNA 풀을 소거할 수 있는 장기간의 치료를 가능케할 수 있다.
실시예 8
간내 WHV DNA 합성
병용 치료 결과와 달리, Ad IFN만은 간에서 총바이러스 및 CCC DNA 수준(Ad GFP 그룹의 총 DNA에 대한 + 43%와 비교하여 각각, +44% 및 -6%)에 영향을 주지 못했다(도 15).
실시예 9
재조합 아데노바이러스 벡터의 트랜스덕션의 평가
아데노바이러스에 의해 감염된 간세포의 수를 측정하기 위하여 그린 형광 단백질(GFP)에 대한 시판용 항체로 면역염색을 시행하였다. 그러나, 관찰된 형광은 대조군과 비교할 때 특이적이지 않았고, 이는 간세포의 자연발생적인 형광 또는 담즙 색소에 기인한 것일 수 있다.
실시예 10
조직학적 평가
β-L-FTC 병용 치료로 처리된 동물의 간 생검 절편 검사를 통해 간에서의 소엽 환부를 포함하는 염증이 나타났다. Ad IFN으로 처리된 그룹의 모든 우드척은 염증 활성이 증가하였다(도 15). Metavir score에서 최대 염증 활성은 이 그룹에서 6개의 생검에서 관찰되었다. 비교로 L-FMAU 및 β-L-FTC로 처리되 그룹에서는 유사한 프로파일은 나타나지 않았다. 이 그룹에서 6마리중 단지 3마리만이 염증 활성의 증가를 나타내었다. 대조군, Ad IFN만으로 처리된 그룹에서 조차 Metavir 점수는 시간에 따라 안정적이었다.
실시예 11
바이러스혈증 분석
바이러스혈증이 처리전 값으로 돌아갈 때까지 WHV DNA용 도트 블롯 어세이를 사용하여 바이러스혈증을 분석하고 포토이미저로 측량하였다.
바이러스의 제거가 확인되면, PCR 조건하에 혈청으로부터 추출된 DNA는 도트 블롯 어세이에 의해 검출할 수 없어야 한다(6.107 카피/ml하의 바이러스혈증). 추가로, DNA는 실시간 PCR(Light Cycler) 어세이로 분석하여야 한다. 예에서 실시간 PCR 방법을 특정 프라이머를 사용하여 WHV 검출 DNA에 적용시켰다.
실시예 12
간내 바이러스 바이러스 DNA 합성 분석
처리 후 5개월째 채취한 생검의 간 절편을 서던 블랏 하이브리제이션에 의해 분석하고
실시예 13
WHV 중합효소 유전자 서열화
도피 돌연변이주가 하나의 항바이러스 프로토콜에 의해 선택되는지 여부를 측정하기 위해, PreS 및 RT 부분을 PCR증폭을 한후, 순환 비리온으로부터 게놈 서열을 분석하였다.
WHV DNA는 처리 기간을 말단부터 세포치사 전 최종 점까지 수집된 혈장으로 부터 PCR에 의해 증폭되었다. 혈청으로부터 DNA는 공지된 서열을 참고한, 역전사효소 유전자의 B 및 C 도메인에 상응하는 Taq 중합효소 및 특정 프라이머 쌍(5'-AGATTGGTTGGTGCACTTCT-3(뉴클레오타이드 385~403) 및 5'-ATTGTCAGTGCCCAACA-3'(뉴클레오타이드 1468~1461)을 사용하여, 35 사이클동안 증폭하였다(1분동안 94 ℃, 1분동안 50 ℃ 및 1분동안 72 ℃)
바이러스 DNA가 존재하지 않는 것을 확인하기 위해, 다른 프라이머 쌍을 증폭의 1차 라운드에서 음성적으로 확인된 샘플에서 네스티드 PCR을 위해 사용하였다. 특히 5'-GGATGTATCTGCGGCGTTT-3'(뉴클레오타이드 510~528) 및 5'-CCCAAATCAAGAAAAACAGAACA-3'(뉴클레오타이드 953~931).
실시예 14
현미경에 의한 간 미토콘드리아의 조사
간 생검 절개편을 150 mM의 소듐 카코디레이트 HCl(pH 7.4)중의 1% 오스뮴 테트라옥사이드에 혼합하고, 등급 에탄올로 탈수하고, 메탄올성 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트에 묻고, 병용β-L-FTC 치료의 미토콘드리아 독성을 배제하기 위해 투과 전자현미경으로 분석하였다.
실시예 15
GFP 또는 RFP의 시각화
아데노바이러스 벡터에 의해 감염된 다수의 세포는 적당한 여과기를 사용하는 공초점 현미경 검사에 의해 두께 5마이크로미터의 파라핀제거한 간 조직 절개편의 직접적 관찰에 의해 감찰될 수 있었다.
실시예 16
다수의 WHV-감염된 간세포의 평가
다수의 VHW 감염된 세포는 표면 및 캡시드 단백질을 위한 면역염색법에 의해 측정될 수 있다. 이것을 하기 의해, 두께 5마이크로미터의 파라핀제거한 간 조직 절개편을 WHV 코어 또는 pre-S 단백질에 대한 직접적인 폴리클로날 항체를 포함하는 토까 혈장과 밤새 배양하였다. 상기 절개편은 그후 바이오틴화된 염소 항-토끼 면역글로불린 G과 함깨 배양하였다. 항원-항체 복합체를 스트렙타디빈-호스라디쉬(streptadivin-horseradish) 퍼옥시데이즈를 사용하여 나타내었다. 바이러스 단백질을 발현하는 감염된 간세포의 수의 정량은 간절개편의 대표적 부분에서 수행하였다.
실시예 17
간세포 교체 분석
세포자멸이 진행중인 다수의 간세포는 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-1abeling)방법을 사용하여 측정할 수 있다(Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H. 및 Currie, A. R. 1972 Br. J. Cancer 26: 239-257). 세포 사이클 유사분열이 진행중인 간세포의 수는 PCNA에 대한 면역염색에 의해 측정할 수 있다.
본 발명은 바람직한 구체예를 참고하여 기술하였다. 본 발명의 변형 및 수정은 본 발명에 대한 상기의 상세한 설명으로부터 본 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 이들 모든 변형 및 수정은 본 발명의 범위에 포함됨이 의도된다.

Claims (16)

  1. 독립적으로 임의의 약제학적으로 허용되는 담체내에
    유효량의 β-L-FTC ;
    L-FMAU; 및
    인터페론; 또는
    그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 병용 또는 교대하여 투여하는 것을 포함하는, B형 간염 바이러스에 감염된 인간의 치료 또는 예방 방법.
  2. 제1항에 있어서, β-L-FTC가 실질적으로 순수한 형태인 방법.
  3. 제1항에 있어서, β-L-FTC가 적어도 90중량%의 β-L-이성질체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, β-L-FTC가 적어도 95중량%의 β-L-이성질체인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 인터페론이 인터페론 알파, PEG화된 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, PEG화된 인터페론 알파-2a, PEG화된 인터페론 알파-2b ROFERON??-A(인터페론 알파-2a), PEGASYS??(PEG화된 인터페론 알파-2a), INTRON ??A(인터페론 알파-2b), PEG-INTRON??(PEG화된 인터페론 알파-2b), 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 타우, 인터페론 오메가, 컨센서스 인터페론, INFERGEN(인터페론알파콘-1), OMNIFERON(천연 인터페론), REBIF(인터페론 베타-1a), 오메가 인터페론, 경구 인터페론 알파, 인터페론 감마-1b, 수퍼페론(천연 인간 멀티-서브타입 IFN-알파), 및 HuFeron(인간 IFN-베타)로 구성된 군에서 선택된 방법.
  6. 제5항에 있어서, 인터페론이 인터페론 알파인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 인터페론이 인터페론 감마인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 인터페론이 인터페론 베타인 방법.
  9. 독립적으로 임의의 약제학적으로 허용되는 담체내에
    β-L-FTC ;
    L-FMAU; 및
    인터페론;
    또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 B형 간염 바이러스에 감염된 숙주를 치료하기 위한 병용제로서의 용도.
  10. 제9항에 있어서, β-L-FTC는 실질적으로 순수한 형태인 용도.
  11. 제9항에 있어서, β-L-FTC는 적어도 90중량%의 β-L-이성질체인 용도.
  12. 제9항에 있어서, β-L-FTC가 적어도 95중량%의 β-L-이성질체인 용도.
  13. 제9항에 있어서, 인터페론이 인터페론 알파, PEG화된 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, PEG화된 인터페론 알파-2a, PEG화된 인터페론 알파-2b ROFERON??-A(인터페론 알파-2a), PEGASYS??(PEG화된 인터페론 알파-2a), INTRON ??A(인터페론 알파-2b), PEG-INTRON??(PEG화된 인터페론 알파-2b), 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 타우, 인터페론 오메가, 컨센서스 인터페론, INFERGEN(인터페론알파콘-1), OMNIFERON(천연 인터페론), REBIF(인터페론 베타-1a), 오메가 인터페론, 경구 인터페론 알파, 인터페론 감마-1b, 수퍼페론(천연 인간 멀티-서브타입 IFN-알파), 및 HuFeron(인간 IFN-베타)로 구성된 군에서 선택된 용도.
  14. 제13항에 있어서, 인터페론이 인터페론 알파인 용도.
  15. 제13항에 있어서, 인터페론이 인터페론 감마인 용도.
  16. 제13항에 있어서, 인터페론이 인터페론 베타인 용도.
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