KR20020070125A - 재조합 ｈｃｖ ｎｓ5ｂ 단백질, 및 그의 제조방법 및용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus; HCV) NS5B 단백질의 C-말단으로부터 24 개의 아미노산이 결실된, RNA-의존적 RNA 중합효소 활성을 갖는 수용성의 재조합 NS5B 단백질을 숙주세포내에서 발현, 분리 및 정제하고, 인 비트로 분석 시스템(in vitroassay system)을 확립하여 그의 활성 및 활성화 조건을 분석하고 그의 주형이 되는 3'-X RNA의 변형체 및 그의 활성을 측정하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 NS5B 단백질을 HCV의 인 비트로 세포 배양(in vitrocell culture) 및 동물 모델이 없는 현재 상황하에서 항바이러스제 개발에 유용한 HTS(High-Throughput Screening) 분석에 적용하여, 천연물 또는 비천연물 유래의 라이브러리를 대규모로 고속 스크리닝할 수 있다.
Description
본 발명은 재조합 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus; 이하, "HCV"라 함) NS5B 단백질, 및 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HCV NS5B 단백질의 C-말단(Carboxy-terminal)으로부터 24 개의 아미노산이 결실된, RNA-의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase; 이하 "RdRp"라 함) 활성을 갖는 수용성의 재조합 NS5B 단백질, 그를 암호화하는 유전자, 그의 발현, 분리 및 정제, 인 비트로 분석 시스템(in vitroassay system)을 확립하여 상기 재조합 NS5B 단백질의 활성 및 활성화 조건 분석, 그의 주형인 3'-X RNA의 각 변형체의 활성 측정, 및 HCV 증식 억제제로 사용가능한 후보물질의 스크리닝(screening)에 관한 것이다.
HCV는 비-A형 또는 비-B형 간염을 유발하는 것으로 알려진 간염의 주요원인 바이러스로서, 인체에 침입하여 급·만성 간염을 일으킬 뿐만 아니라 간경화 또는 간암으로의 이행에도 관여하는 것으로 보고되어 있다(Alter, H. J. 등, 1989,N. Eng. J. Med.321: 1494-1500). WHO는 현재 전세계 인구의 약 3%가 HCV에 의해 감염되어 있는 것으로 추정하고 있으며, 특히 아프리카, 일본 및 한국에서는 전체 인구의 1.5∼2%가 만성 보균자인 것으로 알려져 있다. HCV 감염에 의한 간염이 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus; 이하, "HBV"라 함) 감염에 의한 간염과 구별되는 주요한 특징은 만성간염의 가능성이 HBV 감염에 의한 간염에 비하여 훨씬 높다는 것이다. 즉, HCV에 의한 비-A형 또는 비-B형 간염의 약 50%는 만성간염으로 진전되고, 약 20%는 간경변 또는 간암으로까지 진전되는 것으로 알려져 있다(Dienstag, J. L., 1986,Semin. Liver. Dis.6: 67-81). HCV의 만성적인 감염을 효과적으로 치료하기 위한 보편적인 치료법은 아직 개발되어 있지 않다. 다만, 거의 유일한 방법으로서 인터페론-알파(interferon-alpha)의 단독투여 또는 리바비린(ribavirin)과의 복합투여가 시행되고 있다. 그러나, 최근 들어 인터페론 내성을 갖는 HCV에 대해서는 효과가 없는 것으로 확인되고 있어 새로운 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
이러한 HCV는 플라비바이러스(flavivirus family)에 속하고 약 9,600 염기로 이루어진 양성 가닥(positive strand) RNA 형태의 유전자를 가지고 있으며, 단일의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 3,010∼3,033 개의 아미노산으로 이루어지는 다단백질(polyprotein)을 생산한다(Choo, Q. L. 등, 1989,Science244: 359-362; Choo, Q. L. 등, 1991,PNAS88: 2451-2455). HCV는 단백질 합성에 중요한 약 340 nt이내의 5'-비번역 부위(untranslated region; 이하 "UTR"이라 함)를 갖는다. 한편, 3'-UTR은 짧은 가변 부위-폴리피리미딘 트랙트-98 nt의 보존 부위로 구성되어 있으며, 이 98 nt는 다양한 HCV에서 잘 보존되어 있다. HCV의 다단백질은 N-말단으로부터 코어-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B의 순서로 구성되어 있다. 즉, 다단백질의 N-말단측에 바이러스의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)와 외피(envelope)의 구성요소인 구조단백질(코어, E1 및 E2)이 존재하고, 그의 C-말단측에는 HCV의 증식에 필수적인 비구조단백질(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B)이 위치하고 있다. 이러한 전구체 다단백질에 세포내 시그날 펩티다제(signal peptidase)와 바이러스에 존재하는 단백질 분해효소인 비구조단백질 2-3(NS2-3) 및 비구조단백질 3(NS3)이 작용하여 상기 다단백질의 특정 부위를 절단함으로써, 9 개의 숙성된 바이러스 단백질이 생산된다. 구체적으로, 코어-E1-E2-p7-NS2는 숙주세포의 프로테아제에 의해 절단되고, NS2-NS3는 NS2와 NS3의 1/3로 구성된 메탈로프로테아제(metalloprotease)에 의해 자가절단(autocleavage)되며, 그후 나머지 부분은 NS3 세린 프로테아제에 의해 가공(processing)된다(Hijikata 등, 1991,PNAS88: 5547-5551; Bartenschlarger 등, 1994,J. Virol.68: 5045-5055; Grakoui 등, 1993,J. Virol.67: 1385-1395; Tomei 등, 1993,J. Virol.67: 4017-4026).
이중 NS5B는 RNA 바이러스의 RdRp에서 잘 보존된 GDD 모티프(modif)를 가지고 있고, 양성 가닥으로부터 복제된 음성 가닥(minus strand)을 주형으로 사용하는 바이러스 유전자 복제의 주요 요소이다. NS5B는 HCV RNA에 대한 특이성(specificity)이 없으며 호모폴리머 RNA 주형(homopolymeric RNA template)에 프라이머-의존적(primer-dependent) 또는 비의존적(primer-independent) 합성을 수행할 수 있는 것으로 보고되어 있다(Behren, S. E. 등, 1996,EMBO. J.15: 12-22; Luo. G. 등, 2000,J. Virol.74: 851-863). NS5B의 인 비트로 연구결과는 재조합 단백질을 사용하여 얻어진 것이다. 예를들면, 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터계를 이용하여 곤충세포에서 재조합 NS5B를 발현시켜 NS5B가 RdRp활성을 갖는 것을 밝혔다(Behrens, S. E. 등, 1996,EMBO. J.15: 12-22). 또한, 대장균에서 GST(glutathione-S-transferase) 융합을 이용하여 NS5B를 봉입체(inclusion body) 형태로 발현하였으며(Yuan, Z. H. 등, 1997, BBRC 232: 231-235), 나아가 NS5B의 수용해도를 증가시키기 위하여 NS5B의 C-말단에 위치하는 높은 소수성을 갖는 21 개의 아미노산이 결실된 재조합 NS5B를 GST와 융합하고, 30 ℃에서 대장균을 배양하여 융합 단백질을 수용성 형태로 발현하여 분리한 바 있다(Yamacita, T. 등, 1998,J. Biol. Chem.273: 15479-15486). 또 다르게는, NS5B를 직접 발현하여 봉입체 형태로 얻은후 리폴딩(refolding)하여 활성 단백질을 얻거나 극히 소량의 수용성 단백질을 분리하는 방법이 알려져 있다(Al, R. H. 등, 1998,Virus Res.53: 141-149; Ferrari, E. 등, 1999,J. Virol.73: 1649-1654). 그러나, 탁월한 RdRp 활성을 나타내는 고순도의 수용성 재조합 NS5B 단백질을 발현, 분리 및 정제할 수 있는 방법은 아직 개발되지 않았다.
본 발명자들은 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 NS5B 유전자를 클로닝하고 C-말단으로부터 24 개의 아미노산을 결실시켰다(이하, "NS5Bt"라 함). 또한, NS5Bt의 C-말단 하류에 히스티딘 택(tag)을 포함하게 하는 발현벡터를 이용하여 이 유전자를 대장균내에서 수용성 형태로 발현시키고, 이를 고순도로 분리 및 정제하여 탁월한 RdRp 활성을 갖는 수용성의 단백질을 얻을 수 있었다. 나아가, 본 발명자들은 이 단백질을 이용하여 인 비트로 분석 시스템을 구축하고 RdRp 활성에 대한 저해제와 기질 유사체의 영향을 확인하였다. 뿐만 아니라, 이 단백질의 주형이 되는 3'-X RNA의 각 변형체의 염기 서열 및 활성을 분석하였다. 이러한 결과들은 HCV 감염에 대한 치료제 개발에 있어서, 항바이러스제의 HTS(High-Throughput Screening) 분석에 유용하게 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 얻어진 RdRp 활성을 나타내는 수용성의 재조합 NS5B 단백질, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 재조합 단백질을 발현시키는 발현벡터, 상기 발현벡터를 이용하여 융합 HCV 복제효소를 제조하는 방법, 및 상기 효소를 이용하여 높은 정확도로 HCV 복제효소의 활성 및 활성화 조건을 분석하는 방법, HCV 복제효소의 주형이 되는 3'-X RNA의 각 변형체의 활성을 측정하는 방법 및 RdRp 활성에 대한 저해제 또는 기질 유사체의 영향을 분석함으로써 높은 민감도와 특이도로 항바이러스제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 발현벡터 pET21b-NS5Bt로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pET21b-NS5Bt의 전기영동 결과를 나타내는 도면;
도 2a 및 2b는 본 발명에 따른 재조합 NS5B 단백질의 DNA 및 아미노산 서열과 NS5B 단백질의 공지된 DNA 및 아미노산 서열을 비교 분석한 결과를 나타내는 도면;
도 3a 내지 3e는 본 발명에 따른 재조합 NS5B 단백질의 정제 모식도, 및 정제된 재조합 NS5B 단백질의 순도 및 활성 분석을 위한 전기영동 결과를 나타내는 도면;
도 4는 본 발명에 따른 재조합 NS5B 단백질에 대한 RNA-의존적 RNA 중합효소 활성에 대한 저해제 및 기질 유사체의 영향 분석을 위한 전기영동 결과를 나타내는 도면;
도 5a 내지 5d는 본 발명에 따른 재조합 NS5B 단백질의 인 비트로 분석 시스템의 단계도 및 활성화 조건 분석을 위한 전기영동 결과를 나타내는 도면; 및,
도 6a 및 6b는 본 발명에 따른 재조합 NS5B 단백질의 주형 3'-X RNA의 각 변형체의 염기 서열 및 그의 활성을 비교 분석하기 위한 전기영동 결과를 나타내는 도면.
첫째, 본 발명은 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 얻어진 RdRp 활성을 나타내는 수용성의 NS5B 재조합 단백질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 NS5B 재조합 단백질은 수용해도를 증가시키기 위하여 NS5B의 높은 소수성을 나타내는 C-말단의 24 개의 아미노산이 결실된 것을 특징으로 한다. 상기 단백질은 바람직하게는317G318D319D,220D225D, 및283G287T291N으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 이상의 모티프가 보존된 것이며, 보다 바람직하게는 서열번호 8에 기재된 아미노산서열을 갖는 것이다.
둘째, 본 발명은 상기 재조합 NS5B 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 유전자는 예를들어, 서열번호 7에 기재된 염기 서열을 갖는 것이다.
셋째, 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 발현벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 발현벡터는 예를들어, 융합 HCV 복제효소를 대장균내에서 생산하는 것이다. 이러한 발현벡터는 융합 HCV 복제효소의 정제를 용이하게 하기 위하여, NS5B의 C-말단 하류에 히스티딘 택을 포함하게 하는 것이 바람직하며, 이 경우 상기 융합 HCV 복제효소는 NS5B의 C-말단 하류에 히스티딘을 포함하는 것이 된다. 보다 구체적으로, 상기 발현벡터는 pET21b-NS5Bt이다.
넷째, 본 발명은 상기 발현벡터, 예를들어 pET21b-NS5Bt로 형질전환된 원핵세포, 특히 대장균, 보다 특히 대장균 BL21(DE3)/pET21b-NS5Bt(수탁번호: 제KCTC 10167BP호)에 관한 것이다.
다섯째, 본 발명은 상기 원핵세포를 배양하여 재조합 NS5B 단백질의 발현을 유도하고 조세포 용출액을 얻은후, 그로부터 재조합 NS5B 단백질을 분리 정제하는 것을 포함하는 재조합 NS5B 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에서는, 재조합 NS5B 단백질을 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 1 차 정제한후, 헤파린 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피로 2 차 정제하는 것이 바람직하다.
여섯째, 본 발명은 HCV 복제효소로서 상기 재조합 NS5B 단백질 및 HCV 복제효소의 주형으로서 3'-X RNA를 사용하여 겔 전기영동 분석(gel electrophoresis analysis)을 수행하거나, HCV 복제효소로서 상기 재조합 NS5B 단백질 및 HCV 복제효소의 주형으로서 호모폴리머 RNA(homopolymeric RNA)를 사용하여 필터 결합 분석(filter binding assay)을 수행하는 것을 포함하는, HCV 복제효소의 활성 및 활성화 조건 분석방법에 관한 것이다.
일곱째, 본 발명은 HCV 복제효소로서 상기 재조합 NS5B 단백질 및 HCV 복제효소의 주형으로서 3'-X RNA의 변형체를 사용하는 것을 포함하는, 3'-X RNA의 변형체의 활성 측정방법을 제공한다.
여덟째, 본 발명은 서열번호 9에 기재된 염기 서열을 갖는 재조합 NS5B 단백질의 주형 3'-X RNA를 제공한다.
아홉째, 본 발명은 상기 재조합 NS5B 단백질에 대한 RdRp 활성 저해제 또는 기질 유사체의 후보물질의 영향을 분석하는 것을 포함하는, HCV 증식 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에서는, DEAE 필터로 코팅된 멀티웰 플레이트상에서 필터 결합 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 동위원소로서 5,6-3H-UTP를 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 얻어진 RdRp활성을 나타내는 수용성의 재조합 NS5B 단백질을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에서는 융합 HCV 복제효소의 유전자를 얻기 위하여, 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 분리해낸HCV의 DNA 클론으로부터 유래한 HCV 유전자를 주형으로 이용하고, 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 갖는 프라이머(primer)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행한다. 상기 한국인 HCV 유전자는 유전자형분석(genotyping) 결과 1b 형에 해당하는 것으로 밝혀졌다. 이때 서열번호 1의 프라이머는 클로닝의 편의를 위하여NheI 제한효소 인지 부위를 포함하는 33 개의 염기로 구성된 NS5BF(NheI)으로서, NS5B의 아미노산 서열 1∼8을 암호화하는 염기 서열을 포함한다. 서열번호 2의 프라이머는 클로닝의 편의를 위하여XhoI 제한효소 인지 부위를 포함하는 31 개의 염기로 구성된 NS5BtC(XhoI)로서, 상기 융합 HCV 복제효소의 수용해도를 증가시키기 위하여 NS5B의 높은 소수성을 나타내는 C-말단의 24 개의 아미노산을 결실시키고자, NS5B의 아미노산 서열 562∼567을 암호화하는 염기 서열을 포함한다.
상기 과정에 의해 얻어진 융합 HCV 복제효소의 유전자를 제한효소NheI 및XhoI으로 절단하고, 히스티딘을 NS5Bt의 C-말단 하류에 포함하게 하는 pET21b 벡터에 삽입하여 본 발명에 따른 발현벡터를 제조한다. 본 발명의 발현벡터를 pET21b-NS5Bt라 명명하고, 이를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 제조한다. RdRp 활성을 나타내는 상기 융합 HCV 복제효소를 발현하는 대장균 양성 클론은 7 개의 클론중 하나인 pET21b-NS5Bt#5 발현벡터를 갖는 대장균 형질전환체이다(도 1 참조).
본 발명에서는, 상기 형질전환체를 대장균 BL21(DE3)/pET21b-NS5Bt라 명명하고, 부다페스트 조약하에 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재하는한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2002년 2월 5일자로 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 10167BP호를 부여받았다.
핵산 서열 자동분석기를 이용하여 본 발명의 발현벡터 pET21b-NS5Bt#5에 클로닝된 유전자의 염기 서열을 분석한다. 구체적으로, RdRp 활성을 나타내는 상기 융합 HCV 복제효소의 유전자는 서열번호 7의 염기 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 융합 HCV 복제효소와 V. Lohmann 등(1997,J. virol. 71: 8416-8428)에 의해 알려진 NS5B의 DNA 및 아미노산 서열을 비교 분석한 결과에 따르면, 염기 서열은 92.7%, 아미노산 서열은 98.7%의 상동성을 각각 나타낸다. 특히, NS5B RdRp 활성에 중요한 역할을 할 것으로 추측되고 보존되는 염기 서열을 갖는 모티프 A(220DTRCF225D), 모티프 B(282SGVLTTSCG291N), 모티프 C(317GD319D) 및 모티프 D (342AMTR346Y)의 경우, 5 개의 염기 서열이 상이하나 아미노산 서열은 완전 동일하다(도 2 참조).
또한, 본 발명은 상기에서 제조한 형질전환체를 이용하여 본 발명의 융합 HCV 복제효소를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 대장균 형질전환체를 배양하여 융합 단백질의 발현을 유도한후, 상기 융합 단백질이 발현된 대장균 세포를 파쇄하여 조세포 용출액을 얻는다. 상기에서 제조한 융합 HCV 복제효소는 C-말단에 6 개의 히스티딘을 포함하므로, 히스티딘 친화성 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리한다. 이때 용출용매로는 이미다졸 농도구배를 이용하는 것이 바람직하다. 이렇게 분리한 융합 HCV 복제효소의 순도를 높이기 위하여 헤파린 친화성크로마토그래피를 수행한다. 이때 용출용매로는 NaCl 농도구배를 이용하는 것이 바람직하다. 나아가, 융합 HCV 복제효소를 보다 높은 순도로 정제하기 위해서는 겔 여과 크로마토그래피(Sephacryl S-200 column)를 추가로 수행하는 것이 바람직하다. 그 결과, 본 발명의 제조방법에 의하여 약 65 kDa 크기의 융합 단백질이 합성되었음을 확인할 수 있다(도 3 참조).
상기에서 분리 정제한 융합 HCV 복제효소의 RdRp 활성을 동위원소로 표지한 기질이 삽입(incorporation)되는지를 분석하여 확인한다. 구체적으로, 동위원소로 표지한 기질로서 α-32P-UTP와 5,6-3H-UTP를 정제된 HCV 복제효소, 4 종의 rNTP, 주형 RNA(3'-X RNA 또는 프라이머인 올리고U12/G12를 포함하는 호모폴리머 RNA 폴리A/C) 및 완충액과 반응시킨후, 겔 전기영동 분석하여 방사성사진(autoradiography)으로 HCV 복제효소의 활성을 측정하거나, 쉬트형 또는 96-웰형의 DEAE 필터에 결합시킨후 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)로 HCV 복제효소의 활성을 측정한다(도 3 및 5 참조).
상기에서 분리 정제한 융합 HCV 복제효소의 RdRp활성에 대한 저해제(Gliotoxin, LB80326, 천연물 LD0001)와 기질 유사체(ddUTP, ddCTP)를 다양한 농도로 처리하고 그들의 영향을 분석함으로써 상기 융합 HCV 복제효소의 효소 특이도를 확인한다(도 4 참조).
또한, 본 발명에서는 HCV 복제효소의 주형이 되는 3'-X RNA의 각 변형체의 유전자를 얻기 위하여, 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 얻은 HCV 게놈 RNA로부터 3'-X 서열의 중간 부분에 해당되는 프라이머로 cDNA를 제조하여 1 차 PCR을 실시하고, 2 차 PCR에서 3'-X 서열의 결실 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 3-'X 서열을 증폭한다. 이 PCR 산물을 pcDNA3에 클로닝하고 HCV 복제효소의 주형이 되는 3'-X RNA의 각 변형체의 염기 서열과 활성도를 분석함으로써, 활성이 높은 3'-X RNA의 특이도를 확인한다(도 6 참조).
본 발명의 융합 HCV 복제효소는 HCV의 치료제로서 HCV 복제효소 저해제를 개발하는데 있어서, HCV의 인 비트로 세포 배양(in vitrocell culture) 및 동물 모델이 없는 현재 상황하에서 항바이러스제 개발에 유용한 HTS 분석에 적용되어, 천연물 또는 비천연물 유래의 라이브러리를 대량으로 스크리닝할 수 있게 한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일뿐 이들에 의해 본 발명을 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 중합효소 연쇄반응을 위한 프라이머 합성
본 발명에 따른 융합 HCV 복제효소의 유전자를 얻기 위하여, 핵산 합성기(DNA synthesizer, Applied Biosystems Inc. Model 394)를 이용하여 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 각각 합성하였다.
<실시예 2> RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소 유전자의 클로닝
RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소 유전자를 얻기 위하여, 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 HCV 게놈 RNA를 추출하여 5'-UTR 부위에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 양성으로 판정된 혈청으로부터 HCV DNA 클론을 얻기 위하여, 이 혈청을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 HCV 게놈 RNA를 분리하고 cDNA 합성, 롱(long) PCR 및 레귤라(regular) PCR을 각각 실시하여 RT-PCR을 수행한후, HCV 전장 클로닝을 실시하였다. 여기서 얻어진 한국인 HCV DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.
상기 HCV DNA 10 ng, 0.75 ㎍의 NS5BF(NheI) 프라이머, 0.75 ㎍의 NS5BtC(XhoI) 프라이머에 10 배 농축한 반응 완충용액 10 ㎕ 및 10 mM dNTP 2 ㎕를 가하였다. 증류수를 가하여 최종부피 100 ㎕가 되도록 조정한후 Taq 중합효소(5 U/㎕, Perkin-Elmer Cetus, USA) 0.4 ㎕를 첨가하여 반응액을 제조하였다. 이 반응액을 사용하여 PCR(95 ℃, 30 초; 55 ℃, 30 초; 72 ℃, 30 초)을 30 회 반복 수행한 결과, 약 1,701 염기쌍의 핵산을 얻었다.
상기 약 1,701 염기쌍의 핵산을 정제한후NheI,XhoI 제한효소로 절단하고 그 절편을 순수 분리하였다. 이 절편을 pET21b(Novagen Cat. # 70763-3)의NheI,XhoI 부위에 클로닝하여 본 발명의 발현벡터 pET21b-NS5Bt를 얻었다.
<실시예 3> RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소 유전자의 염기 서열 결정
상기 실시예 2에서 클로닝된 발현벡터 pET21b-NS5Bt 유전자는 Taq 중합효소를 이용하는 DNA 염기 서열 분석키트(dye terminator cycle sequencing ready reaction kit, part # 402079, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 전체 핵산 염기 서열을 결정하였다.
<실시예 4> RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소를 생산하는 대장균 형질전환체의 제조
상기 발현벡터 pET21b-NS5Bt를 대장균 BL21(DE3) 균주(Novagen Cat. # 69387-1)에 형질전환시켜 융합 HCV 복제효소를 발현할 수 있는 형질전환된 균주, 대장균 BL21(DE3)/pET21b-NS5Bt를 얻었다. 이 균주를 LB 배지에서 배양하면서 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)로 발현을 유도하여 약 65 kDa 크기에서 원하는 단백질이 발현됨을 확인하였다.
구체적으로, NS5B 활성을 나타내는 양성 클론을 확인하기 위하여, pET21b에 서브클로닝된 여러 종류의 재조합 단백질을 암호화하는 발현벡터와 인 비트로 번역에 의해 전사와 번역이 확인된 pET21b-NS5Bt의 여러 변형체들로 형질전환된 대장균내에서 각각의 단백질을 발현하고, 니켈 아가로즈 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 인 비트로 RdRp 반응을 수행한후 전기영동하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, 5Bf는 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 얻은 전장 서열의 NS5B 유전자를 발현벡터에 클로닝, 발현 및 정제하여 얻은 재조합 NS5B 단백질로 인 비트로 RdRp 반응을 수행한후 RNA 합성을 조사한 것이다. INT #1과 #2는 단백질 정제시 오염을 확인하기 위한 음성 대조군으로서, HIV의 인테그라제(integrase) 유전자의 변형체를 발현벡터에 클로닝, 발현 및 정제하여 얻은 재조합 단백질로 인 비트로 RdRp 반응을 수행한후 RNA 합성을 조사한 것이다. 5Bt #5∼#16은 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 얻은 C-말단의 24 개의 아미노산이 결실된 NS5B 유전자 변형체를 발현벡터에 클로닝, 발현 및 정제하여 얻은 재조합 NS5B 단백질로 인 비트로 RdRp 반응을 수행한후 RNA 합성을 조사한 것이다. 인 비트로 RdRp 분석에서는 주형으로서 서열번호 9에 기재된 염기 서열을 갖는 3'-X RNA를 사용하였고, +와 -는 각각 인 비트로 RdRp 반응시 주형을 첨가한 것과 첨가하지 않은 것을 나타낸다. 3'-XM은 주형인 3'-X RNA의 크기를 확인하기 위하여 α-32P-UTP를 이용하여 인 비트로 전사에 의해 표지한 것이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 5Bt #5를 제외하고는 모두 어떤 밴드도 나타내지 않거나 웰에서부터 끌리는 패턴을 나타내는데, 이는 RdRp와는 무관한 INT에서도 나타나는 것으로 보아 단백질 정제과정중의 오염에 의한 것으로 추측된다. 그러나, 5Bt #5는 반응시간이 길어질수록 아래에서부터 밀고 올라오는 패턴을 나타내는 것으로 보아, RdRp 활성을 나타내는 NS5B 양성 클론으로 확인되었다.
본 발명의 형질전환체, 대장균 BL21(DE3)/pET21b-NS5Bt는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2002년 2월 5일자로 기탁되어 수탁번호 제KCTC 10167BP호를 부여받았다.
<실시예 5> RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소의 발현 및 정제
상기 실시예 4의 형질전환된 대장균 세포를 앰피실린이 100 ㎕/㎖ 첨가된 LB 배지에서 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 그 배양액 40 ㎖를 4 ℓ의 LB 배지에 가하고 계속 배양하였다. 37 ℃에서 진탕배양하여 세균의 흡광도가 600 nm의 파장에서 약 1.0이 될때 진탕배양기의 온도를 15 ℃로 내렸다. 30 분후 최종농도 0.3 mM이 되도록 IPTG를 첨가하고 밤새 배양한후 배양을 멈추고 원심분리기(Backman J2-21, JA14 rotor)를 사용하여 5,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 세균 세포 침전물을 수거하였다.
4 ℓ 배양에서 얻어진 형질전환된 대장균 세포 침전물에 약 100 ㎖의 완충용액 1(20 mM 이미다졸, 10 % 글리세롤, 0.5 M NaCl, 1 mM PMSF, 20 mM Tris, pH 7.5)을 가하여 현탁시킨후, 얼음 중탕내에서 초음파 분쇄기(ultrasonic homogenizer 4710: Cole-Parmer, USA)로 50%의 출력과 50%의 효율 싸이클(duty-cycle)에서 약 2 분간 초음파 처리하여 세포를 파쇄시켰다. 상기의 과정으로 얻은 세포 균질액을 고속 원심분리기(Backman J2-21M, JA14 rotor)로 10,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 수용성 단백질이 용해되어 있는 상층액을 얻었다.
상기에서 얻은 상층액을 완충용액 1로 평형화된 니켈 아가로즈 컬럼(His-bound metal chelation resin, Novagen, USA)에 가한후 분당 2 ㎖의 속도로 통과시켰다. 이어서 100 ㎖의 완충용액 1을 칼럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거한후 0 M에서 1.0 M 선형 농도구배의 이미다졸을 포함하는 200 ㎖의 완충용액 1을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 2 ㎖의 속도로 용출시켜 각 4㎖의 분획들을 수집하였다.
상기에서 수거한 시료를 풀링(pooling)하여 완충용액 2(1mM EDTA, 10% 글리세롤, 1 mM DTT, 20 mM Tris, pH 7.5)에 5 배 희석하여 완충용액 2로 평형화된 헤파린 아가로즈 칼럼(Heparin Sepharose CL-6B, Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)에 가한후 분당 2 ㎖의 속도로 통과시켰다. 이어서, 100 ㎖의 완충용액 2를 칼럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거한후 0 M에서 1.0 M 선형 농도구배의 NaCl을 포함하는 120 ㎖의 완충용액 2를 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 2 ㎖의 속도로 용출시켜 각 4 ㎖의 분획들을 수집하였다.
상기에서 수거한 시료를 풀링하여 한외여과기(Amicon Co, U.S.A., MW cut-off: 10,000)에 가하여 단백질 농도가 2 mg/㎖ 이상이 되도록 농축하고 농축된 단백질 시료에 대해 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 고순도의 단백질을 수거하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3a는 상기 재조합 NS5B 단백질의 발현 및 정제 모식도이고, 도 3b는 니켈 아가로즈 칼럼 크로마토그래피후의 용출 프로파일을 나타내는 SDS-PAGE 결과이다. 여기서, S는 세포 파쇄와 원심분리에 의해 얻어진 수용성 단백질이 용해되어 있는 상층액을, F는 이 상층액을 니켈 아가로즈 칼럼에 로딩한후의 플로쓰루(flowthrough)를, P는 세포 파쇄 및 원심분리후에 얻어진 침전물을 각각 나타낸다. 100 mM 이미다졸 농도에서 피크를 나타내었다. 또한, 도 3c는 헤파린 칼럼 크로마토그래피의 용출 프로파일을 나타내는 SDS-PAGE 결과이다. 여기서, S는 니켈 아가로즈 칼럼에 의해 용출된 분획 7∼26을 풀링하고 NaCl농도가 100 mM이 되도록 희석한 헤파린 칼럼에 로딩한 샘플을, F는 이 샘플을 헤파린 칼럼에 로딩한후의 플로쓰루를 각각 나타낸다. 800 mM NaCl 농도에서 피크를 나타내었다. 도 3d는 각 단계별 단백질의 순도를 비교 측정하기 위한 SDS-PAGE 결과이다. 여기서, M은 마커로서 좌측에 각 단백질의 크기를 kDa으로 나타내었다. T는 세포 파쇄에 의한 세포 용출액을, S는 세포 파쇄 및 원심분리에 의해 얻어진 수용성 단백질이 용해되어 있는 상층액을, Ni-NTA E는 니켈 아가로즈 칼럼 크로마토그래피시 용출 피크를 나타내는 100 mM 이미다졸 농도 분획을, 헤파린 E는 헤파린 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 용출액을 풀링하여 농축시킨 샘플이다. 농도계(densitometer)를 이용하여 각 샘플의 순도를 측정한 결과, Ni-NTA E는 54%, 헤파린 E는 82%의 순도를 갖는 것으로 나타났다. 또한, 도 3e는 각 단계별 단백질의 RdRp 활성을 나타내는 전기영동 결과이다. 여기서, 총용균물은 세포 파쇄 및 원심분리에 의해 얻어진 수용성 단백질이 용해되어 있는 상층액을, Ni-NTA 피크는 니켈 아가로즈 칼럼 크로마토그래피시 용출 피크를 나타내는 100 mM 이미다졸 농도 분획을, 헤파린 피크는 헤파린 칼럼 크로마토그래피시 용출 피크를 나타내는 800 mM NaCl 농도 분획을, 헤파린 용출액은 헤파린 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 용출액을 풀링하여 농축시킨 샘플로 각각 인 비트로 RdRp 분석한 것이고, P.C.는 양성 대조군이다. 총용균물과 Ni-NTA 피크까지는 다른 단백질이나 RNA에 의한 오염이 나타났지만, 헤파린 용출액에서는 오염이 전혀 나타나지 않았고 RdRp 활성도 매우 우수하였다.
<실시예 6> RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소의 활성 측정
상기 실시예 5에서 분리 정제한 융합 HCV 복제효소의 RdRp 활성을 동위원소로 표지한 기질이 삽입되는지를 분석하여 확인하였다. 사용된 동위원소로 표지한 기질은 10 μCi의 α-32P-UTP이고, 정제된 HCV 복제효소, 4 종의 rNTP(각 0.5 mM ATP, GTP, CTP, 10 μM UTP), 0.5 ㎍ 주형 3'-X RNA 및 완충용액 3(20 mM Tris, pH 7.0, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 U Rnasin, 50 ㎍/㎖ 액티노마이신 D)과 30 ℃에서 2 시간 반응시킨후 변성 PAGE 전기영동한후 방사성사진으로 HCV 복제효소의 활성을 측정하였다.
<실시예 7> RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소를 이용한 인 비트로 분석 시스템의 구축
상기 실시예 6에서 RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소를 이용하여 천연물 또는 비천연물 유래의 라이브러리를 대량으로 신속하게 스크리닝할 수 있게 하는 인 비트로 분석 시스템을 구축하기 위하여, 주형 3'-X RNA 대신 호모폴리머 RNA(프라이머인 올리고U12/G12를 포함하는 호모폴리머 RNA인 폴리A/C)를 이용하고, 변성 PAGE 전기영동후 방사성사진으로 HCV 복제효소의 활성을 측정하는 대신 필터 결합 분석법으로 HCV 복제효소의 활성을 측정하였다. 동위원소로 표지한 기질로서 1 μCi의 5,6-3H-UTP를 사용하고, 주형 RNA로서 4 pmole/㎕의 프라이머인올리고U12/G12를 포함하는 0.4 ㎍/㎕의 호모폴리머 RNA인 폴리A/C를 사용하는 점을 제외하고는 실시예 6과 동일하게 반응시켰다. 단, RdRp 활성 검출시 쉬트형과 96-웰형의 DEAE 필터에 결합시킨후 액체섬광계수기로 HCV 복제효소의 활성을 측정하였다.
도 5a에 한국인 HCV NS5B의 인 비트로 RdRp 분석 시스템에 있어서, 항바이러스제를 고속으로 스크리닝하는 방법의 단계도를 나타내었다. 또한, 도 5b에 각각 α-32P-UTP와 5,6-3H-UTP를 기질로 사용하고 폴리A/올리고U12를 주형/프라이머로 사용하여 RdRp 분석을 수행하여 반응시간에 따른 cpm 값을 나타내었다. 두 경우 모두 약 3 시간 반응시키면 S/N 비가 10 배 이상 증가하였다. 또한, 도 5c에 5,6-3H-UTP를 기질로 사용하고 폴리A/올리고U12를 주형/프라이머로 사용하여, 효소의 양을 0.5 ㎍ 및 5 ㎍으로 달리하고 반응온도도 30 ℃ 및 37 ℃로 달리하여 RdRp 분석을 수행한후 반응시간에 따른 cpm 값을 나타내었다. 효소의 순도가 50%임을 고려하면, 반응은 효소의 양에 민감하며 ㎍ 단위의 효소를 사용하여야 함을 알 수 있었고, 반응온도를 37 ℃로 하면 처음에는 반응이 빨리 진행되나 6 시간 이후에는 효소가 RdRp 활성을 상실함을 알 수 있었다. 또한, 도 5d에 5,6-3H-UTP를 기질로 사용하고 폴리A/올리고U12를 주형/프라이머로 사용하여 RdRp 분석을 수행하고 각각 DEAE 쉬트형과 96-웰형에서 검출하여 반응시간에 따른 cpm 값의 패턴을 비교하여 나타내었다. 양자의 경우 별 차이점이 없는 것으로 확인되어, 96-웰형을 사용하는것이 고속의 스크리닝을 가능하게 하고 더 간편한 것으로 결론내릴 수 있었다.
<실시예 8> RdRp 활성에 대한 저해제 및 기질 유사체의 영향 분석
상기 실시예 6에서 RdRp 활성을 나타내는 융합 HCV 복제효소를 이용하여 RdRp 활성에 대한 저해제와 기질 유사체의 영향을 분석하기 위하여, HCV 복제효소의 RdRp 활성에 대한 저해제(Gliotoxin, LB80326, 천연물 LD0001)와 기질 유사체(ddUTP, ddCTP)를 다양한 농도로 각각의 RdRp 반응에 1/10 희석하여 처리하고 HCV 복제효소의 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 1 및 도 4에 나타내었다.
(PPi: 피로포스페이트; PAA: 포스포노아세트산; PFA: 포스포노포름산; MPA: 마이코페놀산; Cer: 세루레닌(cerulenin))
상기 표 1의 결과는 화합물 없이 반응시킨후 검출되는 cpm 값을 100%로 보았을 때 해당 농도의 화합물을 처리하였을때 검출되는 cpm 값을 %로 나타낸 것이다(% 활성). GDP∼Cer에 대한 결과는 Lohmann 등(2000,J. Viral Hepatitis7: 167-174)이 발표한 저해제와 기질 유사체의 저해효과이고, ddCTP∼LD0001에 대한 결과는 본 발명에서 확인된 저해제와 기질 유사체의 저해효과이다. 한편, LB80326은 저해효과(IC50=0.14 μM)가 이미 확인된 디케토산 유도체이고(PCT WO 00/06529) LD0001은 천연물의 일종이다.
또한, 도 4는 해당 농도의 화합물로 처리하였을때의 RdRp 저해효과를 정성적으로 나타내는 전기영동 결과이다.
<실시예 9> 활성이 높은 주형 3'-X RNA 유전자의 클로닝
HCV 복제효소의 주형이 되는 3'-X RNA의 각 변형체의 유전자를 얻기 위하여, 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 얻은 HCV 게놈 RNA로부터 3'-X 서열의 중간 부분에 해당되는 프라이머 3(3'-X58R) cDNA를 제조하고, 이 cDNA를 주형으로 하여 프라이머 4(99-8939F)와 프라이머 3을 사용하여 1 차 PCR을 수행하였다. 이 PCR 산물을 다시 주형으로 하여 프라이머 5(99-9029F)와 프라이머 6(3'-X long primer)으로 2 차 PCR을 수행하였다. 각 PCR은 사용한 프라이머를 제외하고는 실시예 2와 동일하게 수행하였다. 이 PCR 산물을HindIII와XbaI으로 분해하여 동일한 제한효소로 처리한 pcDNA3에 클로닝하고 이를 pcDNA3-3'-X라 명명하였다. 이 서열을 분석한 결과, 기존에 알려진 3'-X와 동일하거나 거의 유사한 서열을 가짐을 알 수 있었다. 또한, 활성이 높은 3'-X RNA 주형을 얻을 수 있음을 확인하였다.
도 6a는 3'-X RNA의 각 변형체의 활성도를 나타내는 전기영동 결과이다. 3'-X RNA의 각 변형체를 주형으로 하여 RdRp 분석을 수행한 결과, #1, 4, 5 및 7의 밴드 밀도가 낮고 #6, 8, 9 및 10의 밴드 밀도가 높은 것으로 나타났다. 이중 #6 변형체의 활성이 가장 높은데, 양성 대조군인 3'-X RNA(포항공대로부터 입수) 보다 활성이 더 우수함을 알 수 있었다. 도 6b는 활성을 나타내는 3'-X RNA의 각 변형체의 염기 서열을 나타내는 것이다. 활성도와 염기 서열간 상관관계로 활성이 낮은 #1, 4 및 7은 폴리U(U/C) 트랙이 짧은 3'-X RNA이고, 활성이 높은 #6, 8 및 9는 폴리U(U/C) 트랙이 긴 3'-X RNA임이 확인되었다. 특이한 점은 길이가 거의 유사함에도 불구하고 #5의 활성은 약한데 반해 #10의 활성은 강하다는 점이다. 이는 #5의 경우 3'-X RNA의 보존 부위인 X 부위가 3 염기씩이나 상이한데다가 C가 많은 반면, #10은 3'-X RNA의 보존 부위가 완전히 동일하고 T가 많기 때문인 것으로 보인다.
본 발명의 융합 HCV 복제효소는 한국인 C형 간염환자의 혈청으로부터 유래된 탁월한 RdRp 활성을 나타내는 고순도의 수용성 NS5B 재조합 단백질로서, HCV의 인 비트로 세포 배양 및 동물 모델이 없는 현재 상황하에서 항바이러스제 개발에 유용한 HTS 분석에 적용되어, HCV 증식 억제제로 사용될 수 있는 후보물질을 대규모로 고속 스크리닝할 수 있게 한다.
Claims (17)
- HCV(Hepatitis C Virus) NS5B 단백질의 C-말단으로부터 24 개의 아미노산이 결실된, RNA-의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase; RdRp) 활성을 갖는 수용성의 재조합 NS5B 단백질.
- 제1항에 있어서,317G318D319D,220D225D, 및283G287T291N으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 이상의 모티프가 보존된 재조합 NS5B 단백질.
- 제2항에 있어서, 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 재조합 NS5B 단백질.
- 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 따른 재조합 NS5B 단백질을 암호화하는 유전자.
- 제4항에 있어서, 서열번호 7에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자.
- 제4항에 따른 유전자를 함유하는 발현벡터.
- 제6항에 있어서, 발현벡터 pET21b-NS5Bt.
- 제6항에 따른 발현벡터로 형질전환된 원핵세포.
- 제8항에 있어서, 제6항에 따른 발현벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pET21b-NS5Bt(수탁번호: 제KCTC 10167BP호).
- 제8항에 따른 원핵세포를 배양하여 재조합 NS5B 단백질의 발현을 유도하고 조세포 용출액을 얻은후, 그로부터 재조합 NS5B 단백질을 분리 정제하는 것을 포함하는 재조합 NS5B단백질의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 재조합 NS5B 단백질을 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 1 차 정제한후, 헤파린 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피로 2 차 정제하는 재조합 NS5B단백질의 제조방법.
- HCV 복제효소로서 제1항에 따른 재조합 NS5B 단백질 및 HCV 복제효소의 주형으로서 3'-X RNA를 사용하여 겔 전기영동 분석을 수행하거나, HCV 복제효소로서 제1항에 따른 재조합 NS5B 단백질 및 HCV 복제효소의 주형으로서 호모폴리머 RNA를 사용하여 필터 결합 분석을 수행하는 것을 포함하는, HCV 복제효소의 활성 및 활성화 조건 분석방법.
- HCV 복제효소로서 제1항에 따른 재조합 NS5B 단백질 및 HCV 복제효소의 주형으로서 3'-X RNA의 변형체를 사용하는 것을 포함하는, 3'-X RNA 변형체의 활성 측정방법.
- 서열번호 9에 기재된 염기 서열을 갖는 재조합 NS5B 단백질의 주형 3'-X RNA.
- HCV NS5B RdRp활성에 대한 저해제 또는 기질 유사체의 후보물질의 제1항에 따른 재조합 NS5B 단백질에 대한 영향을 분석하는 것을 포함하는, HCV 증식 억제제의 스크리닝 방법.
- 제15항에 있어서, DEAE 필터로 코팅된 멀티웰 플레이트상에서 필터 결합 분석을 수행하는 HCV 증식 억제제의 스크리닝 방법.
- 제15항에 있어서, 동위원소로서 5,6-3H-UTP를 사용하는 HCV 증식 억제제의 스크리닝 방법.
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-
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- 2002-02-26 KR KR1020020010174A patent/KR20020070125A/ko not_active Ceased
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