KR20010023284A

KR20010023284A - 아미드화 폴리펩티드 호르몬 전구체 검출용올리고뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20010023284A
Application number: KR1020007001918A
Authority: KR
Inventors: 장 마르티네; 카테리느 고즈
Original assignee: 앙드레 부귄; 소시에떼 드 꽁세이으 드 르세르세 에 따블리까시옹 시앙띠피끄 (에스세.에르.아.에스.)
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2001-03-26
Also published as: IL134672A0; HUP0003567A2; ES2198066T3; FR2767830A1; WO1999010361A1; ZA987444B; AU8989598A; ATE238338T1; DE69813836T2; IS5383A; EP1007532A1; PT1007532E; CN1275988A; JP2001513981A; BR9811374A; CA2301737A1; FR2767830B1; DE69813836D1; EP1007532B1; NO20000889D0

Abstract

본 발명은 신규 올리고뉴클레오티드, 및 아미드화 폴리펩티드 호르몬의 전구체를 코딩하는 mRNA를 찾아내어 결국엔 신규 아미드화 폴리펩티드 호르몬을 찾아내기 위한 프로브로서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 공지된 올리고뉴클레오티드 및 아미드화 호르몬의 전구체를 찾아내는 방법에 관한 것이다.

Description

아미드화 폴리펩티드 호르몬 전구체 검출용 올리고뉴클레오티드 {Oligonucleotides for Identifying Precursors of Amidated Polypeptide Hormones}

본 발명은 신규 올리고뉴클레오티드 및 아미드화 폴리펩티드 호르몬의 전구체를 코딩하는 mRNA를 찾아내기 위한 프로브로서의 그의 용도, 및 신규 아미드화 폴리펩티드 호르몬의 검출 방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 하기한 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 호르몬 전구체의 검출 방법에 관한 것이다.

아미드화 폴리펩티드 호르몬은 우선 전구체의 형태로 합성되어 '성숙(maturation)'된다. 이 성숙 과정은 아미드화 반응으로 이루어진다.

C-말단의 아미드화 반응은 아미드화 폴리펩티드 호르몬의 특징적 반응이다. 하나 이상의 호르몬 전구체에서 일어나는 이 반응은 호르몬을 성숙시킬 뿐만 아니라 생리적 매질에서 그 생체안정성을 보장한다. 형성된 아미드기는 유리 산 관능기에 비해 잘 손상되지 않기 때문이다. 따라서 이 호르몬은 카르복시펩티다제에 대한 내성이 강하며, 세포 내에서 더 오래 활성 상태로 남아있으며 그의 수용체 부위에 대하여 최적의 친화도를 보유한다.

아미드화는 널리 규명되어 있으며 ("Peptide amidation", Alan F. Bradbury and Derek G. Smyth, TIBS 16 : 112-115, March 1991 and "Functional and structural characterization of peptidylamidoglycolate lyase, the enzyme catalysing the second step in peptide amidation", A. G. Katopodis, D. S. Ping, C. E. Smith and S. W. May, Biochemistry, 30(25): 6189-6194, June 1991), 그 메카니즘은 다음과 같다.

1. 호르몬의 전구체 폴리펩티드 사슬이 아르기닌 및(또는) 라이신 등 2개 염기성 아미노산 위치에서 엔도프로테아제에 의해 절단됨

2. 이어서 카르복시펩티다제에 의해 2회 절단이 일어나서 확장된 글리신 중간체가 생김

3. PAM (펩티딜-글리신-α-아미드화 모노옥시게나제) 효소는 2개의 상이한 효소 활성을 갖고 있다. 첫째는 상기한 확장된 글리신 중간체를 α-히드록시글리신 유도체로 전환시키는 것이며, 여기에 관여하는 PAM 서브유닛은 PHM (펩티딜-글리신-α-히드록실화 모노옥시게나제)이다. 이렇게 얻어진 유도체는 PAM의 제2 서브유닛 (PAL이라 불림, 펩티딜-α히드록시글리신-α-아미드화 리아제)의 기질로 작용하며, 이 글리신의 아민 관능기는 N-말단의 바로 옆 아미노산으로 고정되고 글리옥실레이트가 유리된다. 이 반응에는 호르몬(들)의 전구체 상의 인식 위치, 즉 글리신 및 염기성 아미노산 2개 (아르기닌 또는 라이신)의 서열을 포함하는 위치가 관여한다 (A. G. Katopodis et al., Biochemistry, 30 (25), 6189-6194, June 1991, 및 인용 문헌들 참조).

소포체 (ER)의 외부로 분비되는 아미드화 폴리펩티드 호르몬은 약 14 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 공통(consensus) 신호 서열을 포함하는 것으로 알려져 있다. 이 공통 서열은 폴리펩티드 사슬의 N-말단에 위치하며, 나중에 신호 펩티다제 효소에 의해 절단되기 때문에 일단 분비된 단백질에서는 더이상 발견되지 않는다 (F. Cuttitta, The Anatomical Record, 236, 87-93 (1993) 및 인용된 문헌들 참조).

현재 신규한 단백질의 발견은 쉽지 않다. 단백질은 여러 기술에 의해 단리 및 정제될 수 있는데, 즉 등전점에서의 침전, 특정 용매를 이용한 선택적 추출에 이어 결정화에 의한 정제, 카운터 전류 분포, 흡착, 분할 또는 이온 교환 크로마토그래피, 전기영동 등이 있다. 그러나 이들 기술은 단리될 단백질의 성질을 알아야 적용할 수 있다. 더욱이 치료 수준에서 관심있는 신규 단백질의 순수한 샘플을 얻으려면 이 단백질을 합성할 수 있는 유전자 조작 미생물을 얻기 전에 여전히 몇가지 단계를 거쳐야만 한다.

본 발명에서 제시하는 방법은 지금까지 공지된 모든 아미드화 호르몬의 전구체의 펩티드 서열의 특징을 사용함으로써 이런 부류의 여러 신규 호르몬을 한번에 검출할 수 있다는 이점이 있다. 이 연구는 이들 호르몬의 전구체가 합성될 수 있는 조직으로부터 제조된 cDNA 은행에서 상기 전구체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 직접 찾아내는 것을 통해 수행된다.

이 방법에 의한 연구는 다음과 같은 측면에서 종래의 생화학적 기술에 비해많은 제약을 뛰어넘은 것이다.

- 하나의 조직에 존재하는 여러 가지 다른 전구체를 하나의 원리에 의해 단리할 수 있다.

- 동일한 기술적 조건에서 생화학적 성질 및 생물학적 성질이 매우 상이한 호르몬들에 상응하는 전구체의 검출이 가능하다.

- 하나의 전구체에 포함될 수 있는 모든 펩티드 호르몬을 동시에 찾아낼 수 있다.

즉, 총 매출액에서 연구개발비가 차지하는 비중이 매우 높은 분야에서는 본 발명에 의해 시간과 비용을 상당히 절약할 수 있다.

본 발명은 또한 포유동물에서 기본적인 생리적 역할을 담당하는 활성 물질, 즉 호르몬 및 더 구체적으로는 아미드화 폴리펩티드 신경호르몬의 약리학적 연구를 가능하게 한다. 우선 활성 물질에 상응하는 cDNA를 얻기만 하면, 유전공학에 의해 클로닝된 벡터를 미생물에 도입하여 치료적 용도가 있는 호르몬을 합성하도록 유도할 수 있다.

본 발명은 첫째, 온화한 조건 (mild condition)에서 서열 Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 (여기서 Y1은 1 내지 12 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않으며, Y2는 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 Arg 또는 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y5는 1 내지 21 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것임)의 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OX에 관한 것이다.

뉴클레오티드란 뉴클레오시드 인산 에스테르의 화학 구조를 갖는, RNA 또는 DNA의 단량체 단위를 의미한다. 뉴클레오시드는 퓨린 염기 (퓨린, 아데닌, 구아닌 또는 이의 유사체) 또는 피리미딘 염기 (피리미딘, 시토신, 우라실 또는 이의 유사체)와 리보오스 또는 데옥시리보오스가 결합하여 생성된다. 올리고뉴클레오티드는 프라이머 서열, 프로브, 또는 RNA나 DNA의 단편을 지칭하는 뉴클레오티드의 중합체이다.

상기 언급된 올리고뉴클레오티드는 합성하여 얻을 수 있으며, 참고로 문헌 ("DNA Synthesis" by S. A. Narang, Tetrahedron, 39, 3 (1983)) 및 ("Synthesis and use of synthetic oligonucleotides" by K. Itakura, J. J. Rossi and R. B. Wallace, Annu. Rev. Biochem., 53, 323 (1984))에 기재된 자동 방법을 참조할 수 있다.

바람직하게는 OX는 엄격 조건 (stringent condition)에서 OY와 혼성화될 수 있다.

더욱 바람직하게는 OX는 서열 Y2-Y3-Y4-Y5의 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있다.

또한 더욱 바람직하게는 OX는 서열 Y1-Y2-Y3-Y4 또는 Y2-Y3-Y4의 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있다.

특히 올리고뉴클레오티드 OX는 Y5가 뉴클레오티드 서열 Y6-Y7-Y8-Y9 (여기서 Y6은 Ser, Thr 또는 Tyr을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y7은 임의의 아미노산을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y8은 Glu 또는 Asp를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y9는 1 내지 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열임)인 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있다. 더 구체적으로는 OX는 Y1 및 Y9가 존재하지 않는 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있다.

특히 구체적으로는 올리고뉴클레오티드 OX는 Y2가 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며 Y3이 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y4가 Arg를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며 Y5가 Ser-Ala-Glu를 코딩하는 3개의 트리뉴클레오티드로 이루어진 서열인 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있다.

이 서열은 공지된 아미드화 위치 27개를 통계적으로 연구하여 결정되었으며, 6개 지점에 걸친 소정의 아미노산 패턴 Gly-Lys-Arg-Ser-Ala-Glu의 정의에 도달했다.

유전자 코드의 동의성 (degeneration)과 Gly (4개 코돈), Arg (6개 코돈) 및 Ser (6개 코돈)에 상응하는 높은 코돈 수로 인하여, 올리고뉴클레오티드 서열은

- DNA를 구성하는 4개의 질소 염기가 아닌 질소 염기 히포크산틴이 쌍을 이루는 뉴클레오티드인 이노신을 특정 위치에 사용하는 것과

- 도입된 질소 염기의 성질을 특정 위치에서 변화시켜 도입된 상이한 염기 수에 비례하여 많은 올리고뉴클레오티드의 조합을 생성시키는 절차를 통해, 동의성을 고려하여 제작했다.

본 발명은 또한 서열 Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 (여기서 Y1은 1 내지 12 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않으며, Y2는 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 Arg 또는 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y5는 1 내지 21 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것임)로 이루어진 뉴클레오티드 9 내지 42개를 포함하는 올리고뉴클레오티드 OY에 관한 것이다.

바람직하게는 본 발명은 Y1이 존재하지 않거나 Y5가 존재하지 않는 올리고뉴클레오티드 OY에 관한 것이다.

본 발명은 구체적으로는 Y5가 뉴클레오티드 서열 Y6-Y7-Y8-Y9 (여기서 Y6은 Ser, Thr 또는 Tyr을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y7은 임의의 아미노산을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y8은 Glu 또는 Asp를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y9는 1 내지 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열임)인 올리고뉴클레오티드 OY에 관한 것이다.

더 구체적으로는 Y1 및 Y9가 존재하지 않는 올리고뉴클레오티드 OY에 관한 것이다.

특히 구체적으로는 본 발명은 Y1이 존재하지 않고, Y2가 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이고, Y3이 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이고, Y4는 Arg를 코딩하는 트리뉴클레오티드이고, Y5는 Ser-Ala-Glu를 코딩하는 트리뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 OY에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아미드화 폴리펩티드 호르몬에 특징적인 공통 신호 서열인 Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 (여기서 Z1은 1 내지 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것이며, Z2 및 Z3은 Leu를 코딩하는 2개의 트리뉴클레오티드이며, Z4 및 Z5는 임의의 아미노산 2개를 코딩하는 2개의 트리뉴클레오티드이며, Z6은 Leu를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Z7은 1 내지 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것임)과 혼성화될 수 있으며 15 내지 39개의 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OZ에 관한 것이다.

이 발명에서 호르몬은 내분비계의 아미드화 폴리펩티드 호르몬, 더 구체적으로는 신경호르몬을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

공통 신호 서열이란 성숙된 후 세포에 의해 분비될 단백질의 전구체가 보유하는 서열이다.

마지막으로 본 발명은 조합 라이브러리를 구성하는 것과 같은 올리고뉴클레오티드 OX 또는 OZ의 그룹에 관한 것이다.

상기한 발명에서 조합 라이브러리란, 어떤 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 (이 중 몇개는 달라질 수 있음)를 모델로 하여 합성된 올리고뉴클레오티드군을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 유전자 코드의 동의성으로 인해 상이한 올리고뉴클레오티드의 그룹이 얻어질 것이다.

본 발명은 또한

1. DNA 은행의 입수 단계,

2. 상기 DNA 은행과 올리고뉴클레오티드 OX 하나 이상을 혼성화시키는 단계,

3. 상기 DNA 은행 중에서 올리고뉴클레오티드 OX와 혼성화되는 DNA 서열(들)을 찾아내는 단계, 및

4. 상기 서열(들) 중에서, 아미드화 C-말단을 가질 수 있는 하나 이상의 펩티드를 찾아내는 단계를 포함하는, 아미드화 C-말단을 갖는 펩티드의 전구체의 검출 방법에 관한 것이다.

이 방법은 상기 DNA 은행이 cDNA 은행일 때 바람직할 것이다.

상보적 DNA (cDNA)란 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 갖는 뉴클레오티드 사슬이며, 단일 가닥 cDNA를 합성하는 반응은 역전사효소에 의해 촉매된다. 이중 가닥 cDNA는 DNA 중합효소의 작용으로 얻을 수 있으며, 이 이중 가닥 cDNA는 리가아제를 이용하여, λ박테리오파아지로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 삽입한다.

cDNA 은행은 소정의 세포로부터 추출된 세포질 mRNA에 상응하는 cDNA를 포함한다. 이 은행은 만약 각 출발 mRNA의 박테리아 클론을 하나 이상 포함한다면 완성된 (complete) 것으로 불린다.

혼성화는 두 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고 있어서 상보적 염기 사이에 수소결합이 일어나 그 길이에 걸쳐 결합할 수 있을 때 일어난다.

상기 방법이 올리고뉴클레오티드 OX가³²P 또는 디곡시게닌 등의 마커를 써서 검출할 수 있는 방법이라면 특히 바람직하다.

뉴클레오티드의 방사성 표지를 위해 가장 통상적으로 사용되는 마커로는 β선을 방출하는 원소, 예컨데³H,¹²C,³²P,³³P 및³²S 등이 있다.

올리고뉴클레오티드의 표지는 그의 5'말단에 (γ-³²P)-ATP 보유 인산염기를 부가하여 수행한다. 이 반응은 T4-폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 촉매된다. 디곡시게닌에 의한 표지는 면역효소활성에 의한 것이며, 디곡시게닌은 질소 염기와 결합함으로써 올리고뉴클레오티드로 통합된다. 디곡시게닌의 존재 여부는 디곡시게닌에 대한 항체를 사용하여 알칼리성 포스파타제에 커플링시킴으로써 밝혀낼 수 있다. 이 때 알칼리성 포스파타제가 기질을 가수분해시키면서 발색이 일어나 디곡시게닌의 존재가 밝혀진다.

다른 표지 방법도 사용할 수 있다. 예를 들면 금속 착제 (란탄계 착물이 종종 사용됨), 바이오틴 또는 아크리딘 에스테르 함유 기, 형광 화합물 (플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드) 등을 포함하는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다.

혼성화 단계에서 올리고뉴클레오티드 OX의 조합 라이브러리를 사용하여, 아미드화 폴리펩티드 호르몬의 전구체를 찾아내는 방법이 특히 바람직하다.

본 발명은 또한

1. DNA 은행의 입수 단계,

2. 올리고뉴클레오티드 OX군 및 올리고뉴클레오티드 OZ군을 사용하여 PCR법으로 원하는 단편을 증폭시키는 단계,

3. 올리고뉴클레오티드 OX와 혼성화되며 PCR 반응에 의해 증폭된 상기 DNA 은행의 DNA 서열(들)을 찾아내는 단계, 및

상기 원하는 단편이란, 아미드화 폴리펩티드 호르몬 하나 이상의 전구체를 코딩하는 cDNA 서열을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

PCR (중합효소 연쇄 반응)에 의해 DNA를 증폭시키는 반응은 DNA를 95 ℃에서 가열하여 변성시켜 준비할 필요가 있다. 준비된 DNA의 양 가닥에서 증폭될 서열의 양쪽 끝 부분에 과량의 상보적 올리고뉴클레오티드 2개를 결합시킨다. 그 다음 각 올리고뉴클레오티드는 DNA 중합효소를 위한 프라이머로 기능하여, DNA 가닥이 각기 복제된다. 여기서 DNA 중합효소는 터머스 아쿠아티투스 (Thermus aquatitus)의 열친화성 박테리아에서 추출해낸 Taq 중합효소이다. 이 주기를 연속된 변성-재생에 의해 자동식으로 반복할 수 있다.

PCR 프로토콜을 상세하게 설명한 참고문헌은 무수히 많다 (미국 특허 제4,683,192호, 제4,683,202호, 제4,800,159호 및 제4,965,188호, "PCR technology: principles and applications for DNA amplication", H. Erlich, ed. Stockton Press, New York (1989), "PCR protocols: a guide to methods and applications", Innis et al., eds. Academic Press, San Diego, California (1990)).

바람직하게는 상기 DNA 은행이 cDNA 은행이다.

더 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오티드 OX가³²P 또는 디곡시게닌 등의 마커를 써서 검출할 수 있다.

아미드화 폴리펩티드 호르몬의 전구체를 찾아내는 상기 방법은 증폭 단계에 올리고뉴클레오티드 OX의 조합 라이브러리와 올리고뉴클레오티드 OX의 조합 라이브러리를 사용하는 것이 특히 바람직할 것이다.

본 발명은 또한

1. DNA 은행의 입수 단계,

2. 올리고뉴클레오티드 OX군을 사용하여 PCR법으로 원하는 단편을 증폭시키는 단계,

3. 올리고뉴클레오티드와 혼성화되며 PCR 반응에 의해 증폭된 상기 DNA 은행의 DNA 서열을 찾아내는 단계, 및

4. 상기 DNA 서열 중에서, 아미드화 C-말단을 가질 수 있는 하나 이상의 펩티드를 찾아내는 단계를 포함하는, 아미드화 C-말단을 갖는 펩티드의 전구체의 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 아미드화 위치를 한 개 이상 갖고 있는 전구체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 특징을 규명하는 것이다.

바람직하게는 상기 DNA 은행이 cDNA 은행이다.

더욱 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오티드 OX가³²P 또는 디곡시게닌 등의 마커를 써서 검출할 수 있다.

아미드화 폴리펩티드 호르몬의 전구체를 찾아내는 상기 방법은 증폭 단계에 올리고뉴클레오티드 OX의 조합 라이브러리를 사용하는 것이 특히 바람직할 것이다.

본 발명에서 제시하는, 아미드화 C-말단을 갖는 폴리펩티드의 전구체의 또다른 검출 방법은

1. DNA 은행의 입수 단계,

2. 올리고뉴클레오티드 OX, 및 상기 DNA 은행의 DNA가 클로닝되어 있는 플라스미드 벡터의 서열에 포함된 보편적인 공통 서열과 온화한 또는 엄격한 조건에서 혼성화될 수 있는 다른 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (프라이머 T3, T7, KS, SK, M13, 리버스 등)을 사용하여 PCR법으로 원하는 단편을 증폭시키는 단계,

3. 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 상기 DNA 은행의 DNA 서열을 찾아내는 단계, 및

4. 상기 DNA 서열 중에서, 아미드화 C-말단을 가질 수 있는 하나 이상의 펩티드를 찾아내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

위에서 보편적인 공통 서열이란 상기 은행의 DNA가 클로닝된 벡터가 보유한 서열을 말한다. 이 서열은 서열 분석에서 프라이머로서 기능할 수 있다. 이들 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 문헌 (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., "Molecular Cloning, a laboratory manual", 2nd Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에서 찾을 수 있다.

PCR 반응은 벡터 내에 클로닝되어 있는 cDNA에 올리고뉴클레오티드 2개가 부착되어야 그 증폭이 일어날 수 있다. 증폭될 DNA 단편에 들어있는 서열이 단지 하나만 알려져 있는 경우에는 cDNA가 클로닝되어 있는 벡터에 들어있는 뉴클레오티드 서열, 예컨데 보편적인 공통 서열과 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 문제를 극복할 수 있다.

바람직하게는 상기 DNA 은행은 cDNA 은행이다.

상기 올리고뉴클레오티드 OX가³²P 또는 디곡시게닌 등의 마커를 써서 검출할 수 있는 것이 바람직하다.

증폭 단계는 올리고뉴클레오티드 OX의 조합 라이브러리를 사용하는 것이 특히 더 바람직할 것이다.

본 발명의 방법은 이미 단리된 호르몬에 대해 적용시킴으로써 그 효과를 입증했다. 선택한 신경호르몬은 콜레시스토키닌 (CCK)이며, 이는 뇌에서 가장 많은 양으로 나타나는 신경매개인자이다.

1.1 PCR 반응에 사용될 DNA 매트릭스를 스트라타젠 (미국 라졸라 소재)사의 상업적 은행 Lambda Zapp II (쥐의 뇌 cDNA 라이브러리 벡터, 관리번호 936 501)으로부터 정제하기

이 스트라타젠사의 cDNA 은행은 쥐 뇌세포의 cDNA의 복제본을 포함하고 있다.

1.1.1. 블루스크립트 (Bluescript) 파지미드 (미국 라졸라 소재 스트라타젠사 제품)의 형태로 클로닝된 cDNA의 방출

다음의 프로토콜에 따라 수행한다.

2.10⁸PFU/ml의 cDNA 은행 250 ㎕, XL₁블루 박테리아 (유전형 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hspR17 supE44 relAl lac[F'proAB lacI^qZ△M15 Tn10 (Tet^r)]^c(Bullock, Fernandez, Short, Biotechniques, 5, 376-379 (1987)-600 nm에서의 흡광도 :OD = 2.5) 200 ㎕, 및 파아지 ExAssist (상표) (Hay, B., Short, J., Strategies, 5, 16-18 (1992)) 1 ㎕를 37 ℃에서 15 분 동안 접촉시켰다. 그 다음 계 전체를 LB 배지 (조성: 멸균 생리수 1 리터당 NaCl 10 g, 효모 추출물 5 g 및 박토트립톤 10 g을 혼합) 50 ml에서 교반시키면서 3 시간 동안 인큐베이션시켰다 (37 ℃). 이 배양액을 원심분리하고 상층물을 20 분 동안 70 ℃에서 가열하여 활성화시켰다.

1.1.2. 이중 가닥 플라스미드 은행 형태의 cDNA 얻기

상기의 불활성화된 상층물 100 ㎕ 및 SOLR (상표) 박테리아 (유전형: e14-(McrA^-)△(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 sbcC recB recJ uvrC umuC::Tn5 (Kan^r)lac gyrA96 relA1 thi-1 endA1 λ^R[F'proAB lacI^qZ△M15]^cSu^-(비억제) (Hay, B., Short, J. M., Strategies, 5(1), 16-18 (1992)-OD = 1 - 600 nm) 200 ㎕을 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션할 필요가 있다. 100 mg/ml 암피실린 50 ㎕ 및 LB 배지 50 ml를 첨가한 후 계 전체를 밤새 교반시키면서 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 퀴아겐 플라스미드 미니 키트 프로토콜 및 퀴아겐 컬럼 (표면에 양전하 디에틸아미노에탄올기가 있는 음이온 교환 수지가 있어서 DNA 골격의 인산과 상호작용함)을 써서 배양물 50 ml로부터 플라스미드를 정제했다. 이렇게 하여 1.37 ㎍/㎕의 DNA 용액을 얻었다.

1.2. 위에서 얻은 플라스미드 은행로부터 CCK 전구체 일부를 증폭시키기

1.2.1. PCR 반응에 필요한 올리고뉴클레오티드 2개의 서열 확립

이 두 뉴클레오티드 중 하나는 CCK의 아미드화 위치를 코딩하는 서열과 상보적이다. 상기 아미드화 위치는 공지되어 있으며 Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu를 갖는다. 이 올리고뉴클레오티드는 올리고 CCK 아미드라 불릴 것이며, 그의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.

5' CTCAGCACTGCGCCGGCC 3'

제2 올리고뉴클레오티드는 올리고 CCK 5'으로 불리며, 아래의 공통 서열과 일치한다.

5' GTGTGTCTGTGCGTGGTG 3'

예상되는 증폭 생성물의 크기는 315 염기쌍이며, 이는 CCK의 전구체 서열에서 상기 두 올리고뉴클레오티드에 상응하는 서열 사이의 거리이다.

1.2.2. PCR 반응

효소 Taq 중합효소 Goldstar 5 U/㎕ (Reynier, P., Pellissier, J. F., Harle, J. R., Malthiery, Y., Biochemical and Biophysical Research Communications, 205 (1), 375-380 (1994)) 1 ㎕, 표준 Taq 중합효소가 10 배 농축된 완충액 1 ㎕ 및 물 8 ㎕가 함유된 희석액 D1을 제조했다.

250 ng/㎕ 올리고 CCK 5' 1 ㎕, 250 ng/㎕ 올리고 CCK 아미드 1 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕씩, 250 ng/㎕ cDNA 은행 1 ㎕, 효소 Taq 중합효소 10 배 농축 완충액 5 ㎕, 25 mM MgCl₂2 ㎕, 희석액 D1 1 ㎕ 및 물 37 ㎕를 혼합했다.

증폭 조건은 다음과 같다. 우선 95 ℃에서 5 분 동안 열처리한 후 30 사이클을 반복했다. 변성은 95 ℃에서 45 초간, 혼성화는 60 ℃에서 30 초간, 연장은 72 ℃에서 1 분간 수행했다. 마지막으로 보충 사이클을 수행하여 72 ℃에서 10 분 동안 연장시켰다.

1.2.3. 결과

이 결과는 PCR 반응의 생성물 1/10을 0.8 % 아가로오즈 겔 상에서 이동도로 판독했다. 3,8-디아미노-5-에틸-6-페닐페난트리디늄 브로마이드 (에티듐 브로마이드)의 존재하는 상태에서 분자량이 300인 마커 보다 약간 더 큰 크기의 진한 밴드 하나가 육안으로 확인되었다.

1.3. PCR 생성물의 서열분석 가능한 벡터로 서브클로닝

사용된 벡터는 pGEM T-easy 벡터 (Promega Corporation 판매, 미국 매디슨 소재, 관리번호 A1380, 서열은 아래의 부록 I에 제공)였다. 이 단계에서는

- PCR 생성물에 상응하는 밴드를 전기용출에 의해 정제하고

- 50 ng/㎕ 벡터 pGEM T-easy 1 ㎕ 및 10배 농축 리가아제 완충액 1 ㎕와 함께 16 ℃에서 하룻밤 라이게이션시키고

- 정제된 밴드로부터 20 ng/㎕로 추정되는 생성물 3 ㎕를 추출하고,

- 물로 10 ㎕까지 채웠다.

JM 109 박테리아 (유전형: e14-(McrA-)recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(r_K-m_K+) supE44 relA1 △(lac-proAB) [F'traD36 proAB lacI^qZ△M15], Yanish-Perron, C., Viera, J., Messing, J., Gene, 33, 103-199 (1985))을 CaCl₂로 미리 처리하여 감응성 (competent) 세포로 만든 후, 42 ℃에 45 초간 열충격을 주어 변형시키면 라이게이션의 1/5가 일어난다. 그 다음 세포를 페트리 디쉬 안의 LB-암피실린 배지에서 밤새 배양했다 (37 ℃).

몇몇 재조합 클론의 플라스미드 DNA를 제조했다. 그 다음 Eco RI을 이용한 효소 소화를 통해 서브클로닝을 확인했다.

1.4 서열 분석

(QIAGEN 팁 100 키트를 사용하여 대규모로 정제된) 315개 염기쌍의 PCR 생성물이 혼입되어 있는 pGEM T-Easy 벡터의 디데옥시뉴클레오티드 SANGER의 통상적인 기술을 써서 서열 분석을 수행했다. 서열 분석에 사용된 프라이머는 pGEM T-easy 벡터 플라스미드에 존재하는 T7 보편적 올리고뉴클레오티드였다.

1.5. 결과

다음과 같은 천연 그대로의 서열이 얻어졌다.

GTG TGT CTG TGC GTG GTG ATG GCA GTC CTG GCA GCA GGC GCC CTG

GCG CAG CCG GTA GTC CCT GTA GAA GCT GTG GAC CCT ATG GAG CAG

CGG GCG GAG GAG GCG CCC CGA AGG CAG CTG AGG GCT GTG CTC CGA

CCG GAC AGC GAG CCC CGA GCG CGC CTG GGC GCA CTG CTA GCC CGA

TAC ATC CAG CAG GTC CGC AAA GCT CCC TCT GGC CGC ATG TCC GTT

CTT AAG AAC CTG CAG GGC CTG GAC CCT AGC CAC AGG ATA AGT GAC

CGG GAC TAC ATG GGC TGG ATG GAT TTC GGC CGG CGC AGT GCT GAG

얻어진 서열을 아미노산으로 번역하면 다음과 같다.

VCLCVV MAVLAAGALA QPVVPVEAVD PMEQRAEEAP

RRQLRAVLRP DSEPRARLGA LLARYIQQVR KAPSGRMSVL

KNLQGLDPSH RISDRDYMGW MDFGRRSAE

CCK (이 서열은 스위스 데이타뱅크 No. p01355에서 제공)의 전구체의 뉴클레오티드 서열은 쉽게 찾을 수 있다.

아미노산은 다음과 같은 약자로 표현된다.

알라닌 A 루이신 L

아르기닌 R 라이신 K

아스파르트산 D 메티오닌 M

아스파라긴 N 페닐알라닌 F

시스테인 C 프롤린 P

글루탐산 E 세린 S

글루타민 Q 트레오닌 T

글리신 G 트립토판 W

히스티딘 H 티로신 Y

이소루이신 I 발린 V

〈부록 1〉

pGEM (등록상표)-T Easy 벡터 플라스미드의 서열

pGEM (등록상표)-T Easy 벡터 플라스미드 (서열은 아래와 같음)를 이 서열의 제60 염기 (*로 표시)에서 EcoR V로 잘라 선형화했다. 두 3' 말단에 T를 추가했다. 추가된 T는 이 서열에 포함되지 않는다. 아래에 재현된 서열은 T7 RNA 중합효소에 의해 합성된 RNA와 일치하며, SP6 RNA 폴리머라제에 의해 합성된 RNA와 상보적이다.

〈서열〉

〈서열 계속〉

Claims

9 내지 42 개의 뉴클레오티드를 포함하며, 온화한 조건 (mild condition)에서 서열 Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 (여기서, Y1은 1 내지 12 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않으며, Y2는 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 Arg 또는 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y5는 1 내지 21 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것임)의 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OX.
제1항에 있어서, 9 내지 42 개의 뉴클레오티드를 포함하며, 엄격한 조건 (stringent condition)에서 서열 Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 (여기서, Y1은 1 내지 12 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않으며, Y2는 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 Arg 또는 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y5는 1 내지 21 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것임)의 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OX.
제1 또는 2항에 있어서, Y1이 존재하지 않는 상기 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OX.
제 1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, Y5가 존재하지 않는 상기 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OX.
제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, Y5가 뉴클레오티드 서열 Y6-Y7-Y8-Y9 (여기서, Y6은 Ser, Thr 또는 Tyr을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y7은 임의의 아미노산을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y8은 Glu 또는 Asp를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y9는 1 내지 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열임)인 상기 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OX.
제5항에 있어서, Y1 및 Y9가 존재하지 않는 상기 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OX.
제6항에 있어서, Y2가 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이고, Y3이 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y4가 Arg를 코딩하는 트리뉴클레오티드이고, Y5가 Ser-Ala-Glu를 코딩하는 3개의 트리뉴클레오티드로 이루어진 서열인 상기 올리고뉴클레오티드 OY와 혼성화될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OX.
뉴클레오티드 9 내지 42개를 포함하는 서열 Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 (여기서 Y1은 1 내지 12 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않으며, Y2는 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 Arg 또는 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y5는 1 내지 21 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것임)로 이루어진 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OY.
제8항에 있어서, Y1이 존재하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 OY.
제8 또는 9항에 있어서, Y5가 존재하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 OY.
제8 또는 9항에 있어서, Y5가 뉴클레오티드 서열 Y6-Y7-Y8-Y9 (여기서, Y6은 Ser, Thr 또는 Tyr을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y7은 임의의 아미노산을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y8은 Glu 또는 Asp를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y9는 1 내지 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열임)임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 OY.
제11항에 있어서, Y1 및 Y9가 존재하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 OY.
제12항에 있어서, Y2가 Gly를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y3이 Lys을 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y4가 Arg를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Y5가 Ser-Ala-Glu를 코딩하는 3개의 트리뉴클레오티드로 이루어진 서열인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 OY.
15 내지 39개의 뉴클레오티드를 포함하며, 온화한 또는 엄격한 조건에서 아미드화 폴리펩티드 호르몬에 특징적인 공통 신호 서열인 Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 (여기서 Z1은 1 내지 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것이며, Z2 및 Z3은 Leu를 코딩하는 2개의 트리뉴클레오티드이며, Z4 및 Z5는 임의의 아미노산 2개를 코딩하는 2개의 트리뉴클레오티드이며, Z6은 Leu를 코딩하는 트리뉴클레오티드이며, Z7은 1 내지 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이거나 존재하지 않는 것임)과 혼성화될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 OZ.
조합 라이브러리를 구성하는 것을 특징으로 하는, 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 OX 또는 제14항에 따른 올리고뉴클레오티드 OY의 그룹.
- DNA 은행의 입수 단계,

- 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 하나 이상을 상기 DNA 은행과 혼성화시키는 단계,

- 상기 DNA 은행 중에서 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 DNA 서열(들)을 찾아내는 단계, 및

- 상기 서열(들) 중에서, 아미드화 C-말단을 가질 수 있는 펩티드의 전구체 하나 이상을 찾아내는 단계를 포함하는 연속적인 단계를 특징으로 하는, 아미드화 C-말단을 갖는 펩티드의 전구체의 검출 방법.
제16항에 있어서, 상기 혼성화 단계에 제15항에 따른 조합 라이브러리를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- DNA 은행의 입수 단계,

- 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드군 및 제14항에 따른 올리고뉴클레오티드군을 사용하여 PCR법으로 원하는 단편을 증폭시키는 단계,

- 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 상기 DNA 은행의 DNA 서열(들)을 찾아내는 단계, 및

- 상기 서열(들) 중에서, 아미드화 C-말단을 가질 수 있는 펩티드의 전구체 하나 이상을 찾아내는 단계를 포함하는 연속적인 단계를 특징으로 하는, 아미드화 C-말단을 갖는 펩티드의 전구체의 검출 방법.
제18항에 있어서, 상기 증폭 단계에 제15항에 따른 조합 라이브러리를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- DNA 은행의 입수 단계,

- 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드군을 사용하여 PCR법으로 원하는 단편을 증폭시키는 단계,

- 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 상기 DNA 은행의 DNA 서열(들)을 찾아내는 단계, 및

- 상기 서열(들) 중에서, 아미드화 C-말단을 가질 수 있는 펩티드의 전구체 하나 이상을 찾아내는 단계를 포함하는 연속적인 단계를 특징으로 하는, 아미드화 C-말단을 갖는 펩티드의 전구체의 검출 방법.
제20항에 있어서, 상기 증폭 단계에 제15항에 따른 조합 라이브러리를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- DNA 은행의 입수 단계,

- 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 및 상기 DNA 은행의 cDNA가 클로닝되어 있는 플라스미드 벡터의 서열에 포함된 보편적인 공통 서열과 온화한 또는 엄격한 조건에서 혼성화될 수 있는 다른 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (프라이머 T3, T7, KS, SK, M13, 리버스 등)를 사용하여 PCR법으로 원하는 단편을 증폭시키는 단계,

- 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 상기 DNA 은행의 DNA 서열을 찾아내는 단계, 및

- 상기 DNA 서열 중에서, 아미드화 C-말단을 가질 수 있는 펩티드의 전구체 하나 이상을 찾아내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아미드화 C-말단을 갖는 펩티드의 전구체의 검출 방법.
제22항에 있어서, 상기 증폭 단계에 제15항에 따른 조합 라이브러리를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 은행이 cDNA 은행인 것을 특징으로 하는 방법.
제16 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가³²P 또는 디곡시게닌 등의 마커를 사용하여 검출할 수 있는 것임을 특징으로 하는 방법.