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KR102903284B1 - 간경변증의 치료를 위한 금 클러스터(AuCs) 및 조성물 - Google Patents

간경변증의 치료를 위한 금 클러스터(AuCs) 및 조성물

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Publication number
KR102903284B1
KR102903284B1 KR1020227028338A KR20227028338A KR102903284B1 KR 102903284 B1 KR102903284 B1 KR 102903284B1 KR 1020227028338 A KR1020227028338 A KR 1020227028338A KR 20227028338 A KR20227028338 A KR 20227028338A KR 102903284 B1 KR102903284 B1 KR 102903284B1
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KR
South Korea
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cysteine
group
delete delete
ligand
nibc
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KR1020227028338A
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Inventor
타오레이 쑨
Original Assignee
우한 바스트 컨덕트 사이언스 파운데이션 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 우한 바스트 컨덕트 사이언스 파운데이션 컴퍼니 리미티드 filed Critical 우한 바스트 컨덕트 사이언스 파운데이션 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20220130733A publication Critical patent/KR20220130733A/ko
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Abstract

리간드-결합된 금 클러스터 및 상기 리간드-결합된 금 클러스터를 포함하는 조성물은 간경변증 치료 및 간경변증 치료용 약제의 제조에 사용된다.

Description

간경변증의 치료를 위한 금 클러스터(AuCs) 및 조성물
본 발명은 간경변증(liver cirrhosis) 치료의 기술 분야, 특히 리간드 결합된 금 클러스터(AuC) 및 간경변증의 치료를 위한 리간드-결합된 AuC를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
간은 인체에서 가장 큰 고체 기관이며, 응고, 산소 운반, 및 면역계를 돕는 혈액 단백질을 만드는 것; 과잉 영양소를 저장하고 영양소의 일부를 혈류로 되돌리는 것; 음식 소화를 돕는 담즙을 생산하는 것; 신체가 글리코겐 형태로 당(포도당)을 저장하도록 돕는 것; 약물과 알코올을 포함하여, 혈류에서 유해한 물질을 몸에서 제거하는 것; 및 포화 지방을 분해하고 콜레스테롤을 생성하는 것을 포함하는 많은 중요한 기능을 수행한다.
간경변증은 장기간 지속되는 간의 손상으로 인해 수년에 걸쳐 발달되는 천천히 진행되는 질병이다. 간경변증이 발달함에 따라, 건강한 간 조직은 점차 파괴되고 상처 조직으로 대체된다. 상처 조직은 간을 통한 혈액의 흐름을 차단하고, 영양소, 호르몬, 약물, 및 천연 독소를 처리하는 간의 활동을 지연시킨다. 또한 간에서 만들어지는 단백질 및 기타 물질의 생성을 감소시킨다. 경변증은 결국 간 이식이 필요할 수 있는 간부전 및/또는 간암으로 이어질 수 있다.
간경변증의 초기에는, 강한 간 보상 기능으로 인해 뚜렷한 증상이 없다. 후기 단계에서, 증상으로는 간 기능 손상, 문맥 고혈압, 상부 위장 출혈, 간성 뇌병증, 2차 감염, 비장 기능항진, 복수, 암 및 기타 합병증을 포함한다. 간경변증은 점진적인 간 변형과 경화를 초래한다. 조직병리학적으로, 간경변증은 광범위한 간 세포 괴사, 잔여 간세포의 결절 재생, 결합 조직 과증식(connective tissue hyperplasia) 및 섬유성 중격 형성을 특징으로 하며, 이는 간 소엽 구조의 파괴 및 유사소엽(pseudolobules)의 형성을 야기한다.
간경변증의 원인은 다양하다. 간경변증이 있는 일부 사람들은 한가지 이상의 간 손상 원인을 갖고 있다. 경변증의 일반적인 원인에는 장기간의 알코올 남용, 만성 B형 및 C형 간염 감염, 지방간 질환, 독성 금속, 유전성 질환, 영양 장애, 산업 독극물, 약물, 순환 장애, 대사 장애, 담즙정체, 주혈흡충증 등이 있다.
간경변증은 많은 검사/기법으로 진단할 수 있다. 예를 들어, 혈액 검사에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알칼리성 포스파타제(ALP), 빌리루빈을 포함하는 간 효소 수치가 증가하고 혈액 단백질 수치가 감소하면 간경변증을 시사할 수 있다.
현재, 치료법은 간경변증의 원인을 치료함으로써 이의 진행을 늦출 수 있지만, 간경변증에 대한 특별한 치료법은 없다.
본 발명은 대상체에서 간경변증의 치료를 위한 리간드-결합된 금 클러스터를 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태는 대상체에서 간경변증의 치료를 위한 리간드-결합된 금 클러스터를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 여기서 리간드-결합된 금 클러스터는 금 코어; 및 상기 금 코어에 결합된 리간드를 포함한다.
약학적 조성물의 특정 실시형태에서, 금 코어는 0.5 내지 3 nm 범위의 직경을 갖는다. 특정 실시형태에서, 금 코어는 0.5 내지 2.6 nm 범위의 직경을 갖는다.
약학적 조성물의 특정 실시형태에서, 리간드는 L-시스테인 및 이의 유도체, D-시스테인 및 이의 유도체, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체, 및 기타 티올-함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
약학적 조성물의 특정 실시형태에서, L-시스테인 및 이의 유도체는 L-시스테인, N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), 및 N-아세틸-L-시스테인(L-NAC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 그리고 D-시스테인 및 이의 유도체는 D-시스테인, N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), 및 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
약학적 조성물의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 디펩티드, 시스테인-함유 트리펩티드 또는 시스테인-함유 테트라펩티드이다.
약학적 조성물의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 디펩티드는 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), L(D)-히스티딘-L(D)-시스테인 디펩티드(HC), 및 L(D)-시스테인-L(D)-히스티딘 디펩티드(CH)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
약학적 조성물의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 트리펩티드는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), L(D)-리신-L(D)-시스테인-L(D)-프롤린 트리펩티드(KCP), 및 L(D)-글루타티온(GSH)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
약학적 조성물의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 테트라펩티드는 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR), 및 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
약학적 조성물의 특정 실시형태에서, 기타 티올-함유 화합물은 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, N-(2-머캅토프로피오닐)-글리신, 및 도데실 머캅탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
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본 발명의 목적 및 이점은 첨부된 도면과 연계하여 바람직한 실시형태에 대한 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 실시형태가 이제 도면을 참조하여 설명될 것이며, 도면에서 같은 참조 번호는 같은 요소를 나타낸다.
도 1은 입자 크기가 다른 리간드 L-NIBC-변형된 금 나노입자(L-NIBC-AuNP)의 자외선-가시광선(UV) 스펙트럼, 투과전자현미경(TEM) 이미지, 및 입자크기 분포도를 나타낸다.
도 2는 입자 크기가 다른 리간드 L-NIBC-결합된 금 클러스터(L-NIBC-AuC)의 자외선 가시광선(UV) 스펙트럼, TEM 이미지, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 3은 입자 크기가 다른 L-NIBC-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 리간드 CR-결합된 금 클러스터(CR-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 5는 리간드 RC-결합된 금 클러스터(RC-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 6은 리간드 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린(즉, Cap)-결합된 금 클러스터(Cap-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포도를 나타낸다.
도 7은 리간드 GSH-결합된 금 클러스터(GSH-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 8은 리간드 D-NIBC-결합된 금 클러스터(D-NIBC-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 9는 리간드 L-시스테인-결합된 금 클러스터(L-Cys-AuCs)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포도를 나타낸다.
도 10은 경변증 모델 마우스에서 혈청 (A) ALT, (B) AST, (C) TBIL, (D) MAO 및 (E) ALB 수준에 대한 상이한 용량의 A-01 및 A-02의 효과를 보여주는 막대 그래프를 나타내며, 여기서 1)은 블랭크 대조 그룹, 2)는 모델 그룹, 3)은 소라페닙으로 처치한 양성 그룹, 4)는 A-01 저용량 그룹, 5)는 A-01 고용량 그룹, 6)은 A-02 저용량 그룹, 및 7)은 A-02 고용량 그룹을 나타낸다.
도 11은 경변증 모델 마우스에서 혈청 (A) ALT, (B) AST, (C) TBIL, (D) MAO 및 (E) ALB 수준에 대한 상이한 용량의 B-01 및 B-02의 효과를 보여주는 막대 그래프를 나타내며, 여기서 1)은 블랭크 대조 그룹, 2)는 모델 그룹, 3)은 소라페닙으로 처치한 양성 그룹, 4)는 B-01 저용량 그룹, 5)는 B-01 고용량 그룹, 6)은 B-02 저용량 그룹, 7)은 B-02 고용량 그룹을 나타낸다.
도 12는 경변증 모델 마우스에서 혈청 (A) ALT, (B) AST, (C) TBIL, (D) MAO 및 (E) ALB 수준에 대한 고용량 C의 효과를 보여주는 막대 그래프를 나타내며, 여기서 1)은 블랭크 대조 그룹, 2)는 모델 그룹, 3)은 소라페닙으로 처치한 양성 그룹, 4)는 약물 C 고용량 그룹을 나타낸다.
도 13은 HE 염색 이미지를 나타낸다: (A)는 블랭크 대조 그룹; (B)는 모델 그룹; (C)는 양성 대조 그룹; (D)는 A-01 저용량 그룹; (E)는 A-01 고용량 그룹.
도 14는 경변증 모델 마우스에서 혈청 (A) ALT, (B) AST, (C) TBIL, (D) MAO 및 (E) ALB 수준에 미치는 D, E 및 F 약물의 영향을 보여주는 막대 그래프를 나타내며, 여기서 1)은 블랭크 대조 그룹, 2)는 모델 그룹, 3)은 D 약물 그룹, 4)는 E 약물 그룹, 5)는 F 약물 그룹을 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 특정 실시형태에 대한 이하의 상세한 설명을 참조하여 더 쉽게 이해될 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 간행물이 참조되는 경우, 이들 간행물의 개시는 본 발명이 속하는 최신 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.
금 클러스터(AuC)는 금 원자와 금 나노 입자 사이에 존재하는 특별한 형태의 금이다. AuC는 3 nm 보다 작은 크기를 갖고, 단지 수개 내지 수백 개의 금 원자로 구성되며, 이는 금 나노 입자의 면심 입방 적층 구조의 붕괴를 야기한다. 결과적으로, AuC는 금 나노입자의 연속적 또는 준연속적 에너지 준위와 달리 뚜렷한 HOMO-LUMO 갭을 가진 분자-유사 특정 전자 구조(molecule-like discrete electronic structures)를 나타낸다. 이것은 표면 플라즈몬 공명 효과 및 통상적인 금 나노 입자가 보유한 uv-vis 스펙트럼에서의 상응하는 플라즈몬 공명 흡수 밴드(520 ± 20 nm)의 소실을 야기한다.
본 발명은 리간드-결합된 AuC를 제공한다.
특정 실시형태에서, 리간드-결합된 AuC는 리간드 및 금 코어를 포함하고, 여기서 리간드는 금 코어에 결합된다. 리간드가 금핵과 결합한다는 것은 리간드가 공유결합, 수소결합, 정전기력, 소수력, 반데르발스 힘 등을 통해 금 코어와 용액 내 안정한 착물(stable-in-solution complexes)을 형성하는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 금 코어의 직경은 0.5 내지 3 nm 범위이다. 특정 실시형태에서, 금 코어의 직경은 0.5 내지 2.6 nm의 범위에 있다.
특정 실시형태에서, 리간드-결합된 AuC의 리간드는 티올-함유 화합물 또는 올리고펩티드이다. 특정 실시형태에서, 리간드는 금 코어에 결합하여 Au-S 결합을 통해 리간드-결합된 AuC를 형성한다.
특정 실시형태에서, 리간드는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, L-시스테인, D-시스테인, 또는 시스테인 유도체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 시스테인 유도체는 N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), N-아세틸-L-시스테인(L-NAC), 또는 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC)이다.
특정 실시형태에서, 리간드는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이의 유도체이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드는 시스테인-함유 디펩티드이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 디펩티드는 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), 또는 L(D)-시스테인-L(D)-히스티딘 디펩티드(CH)이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드는 시스테인-함유 트리펩티드이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 트리펩티드는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), 또는 L(D)-글루타티온(GSH)이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드는 시스테인-함유 테트라펩티드이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 테트라펩티드는 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR) 또는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR)이다.
특정 실시형태에서, 리간드는 티올-함유 화합물이다. 특정 실시형태에서, 티올-함유 화합물은 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, 또는 도데실 머캅탄이다.
본 발명은 대상체에서 간경변증의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 개와 같은 애완 동물이다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 상기 개시된 바와 같은 리간드-결합된 AuC 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 부형제는 포스페이트-완충 용액, 또는 생리 식염수이다.
본 발명은 대상체에서 간경변증의 치료를 위한 약물을 제조하기 위한 상기 개시된 리간드-결합된 AuC의 용도를 제공한다.
본 발명은 대상체에서 간경변증을 치료하기 위한 상기 개시된 리간드-결합된 AuC의 용도 또는 상기 개시된 리간드-결합된 AuC를 사용하여 대상체에서 간경변증을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 치료 방법은 약제학적 유효량의 리간드-결합된 AuC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 약제학적 유효량은 정규의 생체내(in vivo) 연구에 의해 확인할 수 있다.
이하의 실시예는 본 발명의 원리를 설명하기 위한 목적으로만 제공되며; 이들은 결코 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시형태
실시형태 1. 리간드-결합된 AuC의 준비
1.1 HAuCl4를 메탄올, 물, 에탄올, n-프로판올, 또는 에틸아세테이트에 용해시켜 HAuCl4 농도가 0.01 내지 0.03 M인 용액 A를 얻음;
1.2 리간드를 용매에 용해시켜 리간드의 농도가 0.01 내지 0.18 M인 용액 B를 얻음; 리간드는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, L-시스테인, D-시스테인 및 기타 시스테인 유도체, 예컨대 N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), N-아세틸-L-시스테인(L-NAC), 및 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC), 시스테인-함유 올리고펩티드 및 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 및 시스테인을 함유하는 기타 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 이들의 유도체, 예컨대 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), L-시스테인 L-히스티딘(CH), 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), L(D)-글루타티온(GSH), 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR) 및 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린 -L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR), 및 기타 티올-함유 화합물, 예컨대 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼 및 도데실 머캅탄 중 하나 이상을 포함하고; 용매는 메탄올, 에틸 아세테이트, 물, 에탄올, n-프로판올, 펜탄, 포름산, 아세트산, 디에틸 에테르, 아세톤, 아니솔, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 펜탄올, 부틸 아세테이트, 트리부틸 메틸 에테르, 이소프로필 아세테이트, 디메틸 술폭시드, 에틸 포르메이트, 이소부틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올 및 프로필 아세테이트 중 1종 이상임;
1.3 용액 A와 용액 B를 HAuCl4와 리간드의 몰비가 1:(0.01~100)이 되도록 혼합하고, 그런 다음 빙욕으로 0.1 내지 48시간 동안 교반하면서, 0.025 내지 0.8M NaBH4 물, 에탄올 또는 메탄올 용액을 첨가하고, 계속하여 빙수욕에서 교반하고 0.1 내지 12시간 동안 반응시킴. NaBH4와 리간드의 몰비는 1:(0.01~100)임;
1.4 MWCO 3K 내지 30K 한외여과 튜브를 사용하여 반응 종료 후 10 내지 100분 동안 구배로 반응 용액을 8000 내지 17500 r/min의 속도로 원심분리하여 다양한 평균 입자 크기의 리간드-결합된 AuC 침전물을 얻음. 다양안 MWCO의 한외여과 튜브용 여과막의 구멍은 막을 통과할 수 있는 리간드-결합된 AuC의 크기를 직접적으로 결정함. 이 단계는 선택적으로 생략할 수 있음;
1.5 단계(1.4)에서 얻은 서로 다른 평균 입자 크기의 리간드-결합된 AuC 침전물을 물에 녹여, 투석백에 담아 실온의 물에서 1 내지 7일 동안 투석함;
1.6 투석 후 리간드-결합된 AuC를 12 내지 24시간 동안 동결 건조하여 분말 또는 응집 물질, 즉 리간드-결합된 AuC를 얻음.
검출된 바와 같이, 전술한 방법에 의해 수득된 분말 또는 응집(flocculant) 물질의 입자 크기는 3 nm보다 작다(일반적으로 0.5 내지 2.6 nm로 분포함). 520 nm에서 명백한 흡수 피크를 나타내지 않는다. 얻어진 분말 또는 응집물질(floc)은 리간드-결합된 AuC인 것으로 결정된다.
실시형태 2. 다른 리간드와 결합된 AuC의 제조 및 특성규명
2.1 L-NIBC 결합 AuC, 즉 L-NIBC-AuC의 제조
리간드 L-NIBC를 예로 들어, 리간드 L-NIBC와 결합된 AuC의 제조 및 확인을 상세하게 설명한다.
2.1.1 HAuCl4 1.00g을 계량하고 메탄올 100 ㎖에 용해시켜 0.03M 용액 A를 얻음;
2.1.2 L-NIBC 0.57g을 계량하고 빙초산(아세트산) 100 ㎖에 용해시켜 0.03M 용액 B를 얻음;
2.1.3 용액 A 1 ㎖를 측정하고, 각각 용액 B 0.5 ㎖, 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖ 또는 5 ㎖와 혼합하고(즉, HAuCl4와 L-NIBC의 몰비는 각각 1:0.5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5임), 빙욕에서 2시간 동안 교반하면서 반응시키고, 용액이 담황색에서 무색이 되면, 새로 조제한 0.03 M NaBH4 에탄올 용액(11.3 ㎎의 NaBH4를 계량하여 10 ㎖의 에탄올 용액에 용해시켜 조제함) 1 ㎖를 재빨리 첨가하고, 용액이 암갈색으로 된 후 30분간 반응을 계속하고, 아세톤 10 ㎖를 첨가하여 반응을 종결시킴.
2.1.4 반응 후, 반응 용액을 구배 원심분리에 적용하여 입자 크기가 다른 L-NIBC-AuC 분말을 얻음. 구체적인 방법: 반응 종료 후 반응 용액을 MWCO 30K, 부피 50 ㎖의 한외여과 튜브에 옮겨 10000 r/min의 속도로 20분간 원심분리하고, 안쪽 튜브 내의 잔류물을 초순수에 녹여 약 2.6 nm의 입자 크기를 갖는 분말을 얻음. 그런 다음, 바깥쪽 튜브의 혼합 용액을 부피가 50 ㎖이고 MWCO가 10K인 한외여과 튜브로 옮기고 13,000 r/min의 속도로 30분간 원심분리함. 안쪽 튜브의 잔류물을 초순수에 용해하여 약 1.8 nm의 입자 크기를 갖는 분말을 얻음. 그런 다음, 외부 튜브의 혼합 용액을 부피가 50 ㎖이고 MWCO가 3K인 한외여과 튜브로 옮기고 17,500 r/min의 속도로 40분간 원심분리함. 내부 튜브의 잔류물을 초순수에 녹여 입자크기가 약 1.1 nm인 분말을 얻음.
2.1.5 구배 원심분리에 의해 얻은 3가지 입자 크기의 분말을 각각 침전시키고 용매를 각각 제거하고 조 생성물에 N2를 취입하여 건조시키고, 초순수 5 mL에 용해시키고, 투석 백(MWCO는 3KDa)에 넣고 2L의 초순수에 투석백을 넣고, 격일로 물을 갈아주고, 7일 동안 투석하고, 동결건조시키고 추후 사용을 위해 보관함.
2.2 L-NIBC-AuC의 특성규명
상기에서 얻은 분말(L-NIBC-AuCs)에 대해 특성화 실험을 수행했다. 한편, 대조 그룹으로 리간드 L-NIBC-변형된 금 나노입자(L-NIBC-AuNPs)를 사용한다. 리간드가 L-NIBC인 금 나노입자 제조 방법은 참고문헌(W. Yan, L. Xu, C. Xu, W. Ma, H. Kuang, L. Wang and N. A. Kotov, Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 15114; X. Yuan, B. Zhang, Z. Luo, Q. Yao, D. T. Leong, N. Yan and J. Xie, Angewandte Chemie International Edition 2014, 53, 4623)을 참조한다.
2.2.1 투과전자현미경(TEM)에 의한 형태학 관찰
테스트 분말(L-NIBC-AuCs 샘플 및 L-NIBC-AuNPs 샘플)을 샘플로 초순수에 2 ㎎/L이 되도록 녹인 후, 적하법(drop method)을 수행하여 시료를 제조했다. 보다 구체적으로, 5 ㎕의 샘플을 초박형 탄소 필름에 적하하고, 물방울이 사라질 때까지 자연적으로 휘발시킨 후, JEM-2100F STEM/EDS 전계 방출 고분해능 TEM으로 샘플의 형태를 관찰했다.
L-NIBC-AuNP의 4개의 TEM 이미지는 도 1의 패널 B, E, H 및 K에 나타나 있고; L-NIBC-AuC의 3개의 TEM 이미지는 도 2의 패널 B, E 및 H에 나타나 있다.
도 2의 이미지는 각각의 L-NIBC-AuC 샘플이 균일한 입자크기와 우수한 분산성을 가지며, L-NIBC-AuC의 평균 직경(금 코어의 직경 참조)이, 도 2의 패널 C, F 및 I의 결과에 따라 각각 각각 1.1 nm, 1.8 nm 및 2.6 nm임을 보여준다. 이에 비해 L-NIBC-AuNP 샘플은 더 큰 입자 크기를 갖는다. 이들의 평균 직경(금 코어의 직경 참조)은 각각 3.6 nm, 6.0 nm, 10.1 nm 및 18.2 nm이며, 도 1의 패널 C, F, I 및 L의 결과와 잘 일치한다.
2.2.2 자외선(UV)-가시광선(vis) 흡수 스펙트럼
테스트 분말(L-NIBC-AuCs 샘플 및 L-NIBC-AuNPs 샘플)을 초순수에 농도가 10mg·L-1이 될 때까지 용해시킨 후, 실온에서 UV-vis 흡수 스펙트럼을 측정했다. 스캐닝 범위는 190 내지 1100 nm이었고, 샘플 셀은 1 cm의 광로를 갖는 표준 석영 큐벳이었으며, 참조 셀에는 초순수를 채웠다.
크기가 다른 4개의 L-NIBC-AuNP 샘플의 UV-vis 흡수 스펙트럼은 도 1의 패널 A, D, G 및 J에 나타나 있고, 입자 크기의 통계적 분포는 도 1의 패널 C, F, I 및 L에 나타나 있고; 크기가 다른 3개의 L-NIBC-AuC 샘플의 UV-vis 흡수 스펙트럼은 도 2의 패널 A, D 및 G에 나타나 있고, 입자 크기의 통계적 분포는 도 2의 패널 C, F 및 I에 나타나 있다.
도 1은 표면 플라즈몬 효과로 인해 L-NIBC-AuNPs가 약 520 nm에서 흡수 피크를 가짐을 나타낸다. 흡수 피크의 위치는 입자 크기와 관련이 있다. 입자 크기가 3.6 nm일 때, UV 흡수 피크는 516 nm에서 나타나며; 입자 크기가 6.0 nm일 때, UV 흡수 피크는 517 nm에서 나타나며; 입자 크기가 10.1 nm일 때, UV 흡수 피크가 520 nm에서 나타나고, 입자 크기가 18.2 nm일 때, 흡수 피크가 523 nm에서 나타난다. 4개의 샘플 중 어느 것도 560 nm 이상의 흡수 피크를 나타내지 않는다.
도 2는 입자 크기가 다른 3개의 L-NIBC-AuC 샘플의 UV 흡수 스펙트럼에서, 520 nm에서 표면 플라즈몬 효과 흡수 피크가 사라지고, 560 nm 이상에서 두 개의 뚜렷한 흡수 피크가 나타나며, 흡수 피크의 위치는 AuC의 입자 크기에 따라 약간 다르다는 것을 보여준다. 이것은 AuC가 면심입방구조의 붕괴로 인해 분자-유사 특성을 나타내기 때문이며, 이는 AuC의 상태 밀도의 불연속성, 에너지 준위 분할, 플라즈몬 공명 효과의 소멸 및 장파 방향에서 새로운 흡수 피크의 출현을 야기한다. 위에서 얻은 서로 다른 입자 크기의 3가지 분말 샘플은 모두 리간드-결합된 AuC라는 결론을 내릴 수 있다.
2.2.3 푸리에 변환 적외선 분광법
적외선 스펙트럼을 고체 분말 고진공 전반사 모드에서 Bruker에 의해 제조된 VERTEX80V 푸리에 변환 적외선 분광계로 측정하였다. 스캐닝 범위는 4000 내지 400 cm-1이고 스캔 횟수는 64회이다. L-NIBC-AuC 샘플을 예로 들어 설명하면, 테스트 샘플은 3가지 다른 입자 크기를 가진 L-NIBC-AuC 건조 분말이었고 대조 그룹 샘플은 순수한 L-NIBC 분말이었다. 그 결과는 도 3에 제시되어 있다.
도 3은 입자 크기가 다른 L-NIBC-AuC의 적외선 스펙트럼을 보여준다. 순수한 L-NIBC(하단 곡선)와 비교하여, 입자 크기가 다른 L-NIBC-AuC의 S-H 신축 진동은 모두 2500 내지 2600 cm-1에서 완전히 사라졌지만, L-NIBC의 다른 특징적인 피크는 여전히 관찰되었으며, 이는 L-NIBC 분자가 Au-S 결합을 통해 AuC의 표면에 성공적으로 결합되었음을 입증한다. 이 도면은 또한 리간드-결합된 AuC의 적외선 스펙트럼이 크기와 관련이 없음을 보여준다.
용액 B의 용매, HAuCl4와 리간드의 공급 비율, 반응 시간 및 NaBH4의 첨가량을 약간 조절한 것을 제외하고는, 상기 방법과 유사한 방법으로 다른 리간드와 결합된 AuC를 제조하였다. 예를 들어: L-시스테인, D-시스테인, N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC) 또는 N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC)을 리간드로 사용한 경우, 아세트산을 용매로 선택하고; 디펩티드 CR, 디펩티드 RC 또는 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린을 리간드로 사용하는 경우, 물을 용매로 선택하는 등; 다른 단계는 유사하므로, 여기에 세부사항을 추가로 제공하지는 않는다.
본 발명은 전술한 방법으로 일련의 리간드-결합된 AuC를 제조하여 얻었다. 리간드 및 제조 공정의 파라미터는 표 1에 제시되어 있다.
본 발명에서 다양한 리간드와 결합된 AuC의 제조 파라미터
리간드 파라미터
용액 B에 사용된 용매 HAuCl4와 리간드 간의 공급 비 NaBH4를 첨가 전 교반 하 빙욕에서의 반응 시간 HAuCl4와 NaBH4 간의 몰비 NaBH4 첨가 후 교반 하 빙욕에서의 반응 시간
L-시스테인 아세트산 1:3 2h 1:2 0.5h
D-시스테인 아세트산 1:3 2h 1:2 0.5h
N-아세틸-L-시스테인 에탄올 1:4 1h 1:1 0.5h
N-아세틸-D-시스테인 에탄올 1:4 1h 1:1 0.5h
L-NIBC 물 1:4 0.5h 1:2 0.5h
D-NIBC 물 1:4 0.5h 1:2 0.5h
기타 시스테인 유도체 가용성 용매 1: (0.1~100) 0.5h~24h 1: (0.1~100) 0.1~24h
CR 물 1:4 22h 2:1 0.5h
RC 물 1:4 20h 2:1 0.5h
HC 물 1:3 12h 1:2 2h
CH 에탄올 1:4 16h 1:3 3h
GSH 물 1:2 12h 1:1 3h
KCP 물 1:3 15h 1:2 1h
PCR 물 1:4 16h 1:3 2h
GSCR 물 1:4 16h 1:3 1.5h
GCSR 물 1:3 12h 1:2 2h
시스테인 함유 기타 올리고펩티드 가용성 용매 1:(0.1~100) 0.5h~24h 1:(0.1~100) 0.1~24h
1-[(2S)-2-메틸-3-
티올-1-옥소프로필]-L-프롤린		 물 1:8 2h 1:7 1h
머캅토에탄올 에탄올 1:2 2h 1:1 1h
티오글리콜산 아세트산 1:2 2h 1:1 1h
티오페놀 에탄올 1:5 5h 1:1 1h
D-3-트롤로볼 물 1:2 2h 1:1 1h
N-(2-머캅토프로피오닐)-글리신 물 1:2 2h 1:1 1h
도데실 머캅탄 메탄올 1:5 5h 1:1 1h
티올 함유 기타 화합물 가용성 용매 1:(0.01~100) 0.5h~24h 1:(0.1~
100)		 0.1~24h
표 1에 열거된 샘플은 전술한 방법에 의해 확인된다. 6가지 다른 리간드-결합된 AuC의 특성은 도 4(CR-AuC), 도 5(RC-AuC), 도 6(Cap-AuC)(Cap은 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린을 나타냄), 도 7(GSH-AuCs), 및 도 8(D-NIBC-AuCs), 도 9(L-Cys-AuCs)에 나타나 있다. 도 4 내지 도 9는 UV 스펙트럼(패널 A), 적외선 스펙트럼(패널 B), TEM 이미지(패널 C), 및 입자 크기 분포(패널 D)를 보여준다.
결과는 표 1에서 얻은 서로 다른 리간드와 결합한 AuC의 직경이 모두 3 nm 보다 작다는 것을 나타낸다. 자외선 스펙트럼은 또한 520±20 nm에서 피크의 소실과, 다른 위치에서 흡수 피크의 출현을 보여준다. 흡수 피크의 위치는 리간드와 입자 크기를 비롯한 구조에 따라 달라질 수 있다. 특정 상황에서, 주로 다른 입자 크기와 구조를 가진 AuC 혼합물의 형성 또는 UV-vis 스펙트럼 범위를 넘어 흡수 피크의 위치를 이동시키는 특정 특별한 AuC의 형성으로 인해, 특별한 흡수 피크가 없다. 한편, 푸리에 변환 적외선 스펙트럼은 리간드 티올 적외선 흡수 피크(도 4 내지 8의 패널 B에서 점선 사이)의 소멸을 보여주지만, 다른 적외선 특성 피크는 모두 유지되며, 이는 모든 리간드 분자가 금 원자에 성공적으로 결합되어 리간드-결합된 AuC를 형성했고, 본 발명은 표 1에 열거된 리간드와 결합된 AuC를 성공적으로 얻었음을 시사한다.
실시형태 3
3.1 재료 및 동물
3.1.1 테스트 샘플
A-01: 리간드 L-NIBC-결합된 금 클러스터(L-NIBC-AuCs), 0.9 ±0.2 nm.
A-02: 리간드 L-NIBC-결합된 금 클러스터(L-NIBC-AuCs), 1.9 ±0.5 nm.
B-01: 리간드 L-Cys-결합된 금 클러스터(L-Cys-AuCs), 1.0 ±0.2 nm.
B-02: 리간드 L-Cys-결합된 금 클러스터(L-Cys-AuCs), 1.7 ±0.3 nm.
C: L-NIBC-개질된 나노입자(L-NIBC-AuNPs), 6.3 ±1.5 nm
모든 테스트 샘플은 약간 변형하여 위에서 설명한 방법에 따라 준비했으며, 위에서 설명한 방법을 사용하여 품질을 특성화했다.
3.1.2 양성 대조 샘플
소라페닙.
3.1.3 실험동물 및 그룹
6-8주령이고 체중이 16-20g인 SPF 수컷 C57BL/6N 마우스 120마리를 Beijing Huafukang Experimental Animal Technology Co., Ltd.(생산 라이센스 번호: SCXK(Jing) 2019-0008)에서 구입했다. 체중에 따라 무작위로 다음 12개 그룹(n=10)으로 나누었다: 블랭크 대조 그룹, 모델 그룹, 양성 대조 그룹, A-01 저용량 그룹, A-01 고용량 그룹, A-02 저용량 그룹, A-02 고용량 그룹, B-01 저용량 그룹, B-01 고용량 그룹, B-02 저용량 그룹, B-02 고용량 그룹, 및 C 고용량 그룹.
3.2 모델링 프로토콜
블랭크 대조 그룹을 제외하고, 사염화탄소(CCl4)-유도 처리 방법으로 다른 그룹 마우스의 간경변증 모델을 제작했다. 모델링 프로토콜은 다음과 같았다: (1) 각 마우스에 10% CCl4(올리브 오일로 희석)를 7 ㎕/체중 g으로 총 8주 동안 주 2회 복강내로 주사했다. 블랭크 대조 그룹의 마우스에는 동일한 양의 올리브 오일 용매를 복강내로 주사했다. (2) 6주차부터 매주 마지막 주사 후 48시간 후에 2마리의 마우스를 선택하여 희생시켰다. 간의 외관(appearance)을 관찰했다. 외관이 간경변증의 특징과 일치한 후(8주차), 포르말린으로 간 조직을 고정시켰다. HE 염색 및 마송(Masson) 염색을 이용하여 간경변증 모델을 평가했다.
3.3 투여
성공적인 모델링 후, 양성 대조 그룹의 마우스에 25 mg/kg 소라페닙을 위내로 투여했고; A-01, A-02, B-01 및 B-02의 저용량 또는 고용량 그룹의 마우스에 상응하는 테스트 물질을 각각 2.5 또는 10 mg/kg으로 복강내로 주사하고; 고용량 그룹 C의 마우스에는 40 mg/kg의 용량으로 C를 복강내로 주사하고; 블랭크 대조 그룹 및 모델 그룹의 마우스에는 10 ㎖/㎏의 생리 식염수를 복강내로 투여했다. 투여를 연속 20일 동안 1일 1회 수행했다.
3.4 생화학 테스트
투여 완료 후, 마우스 안와에서 채혈하고, Zhongsheng Beikong 키트 및 생화학 분석기(Siemens)를 이용하여 알부민(ALbumin, ALB), 총빌리루빈(TBil), 알라닌 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 모노아민 옥시다제(MAO)의 생화학적 테스트를 위한 혈청을 얻었다. 검출 방법은 키트 설명서에 따라 엄격하게 수행했다.
표 2는 생화학적 테스트에 사용되는 키트의 제품 정보를 보여준다.
일련
번호 		키트 명칭 약어 등록 번호
1 알부민 테스트 키트
(브로모크레졸 그린 방법)		 ALB 베이징 식품의약품안전처 (승인) 2014 No. 2401133
2 총 빌리루빈 테스트 키트
(바나데이트 산화 방법)		 TBil 베이징 식품의약품안전처 (승인) 2014 No. 2401140
3 알라닌 아미노트랜스퍼라제 테스트 키트 (알라닌 기질 방법) ALT 베이징 식품의약품안전처 (승인) 2014 No. 2401158
4 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 테스트 키트(아스파트산 기질 방법) AST 베이징 식품의약품안전처 (승인) 2014 No. 2401157
5 모노아민 옥시다제 테스트 키트 (글루탐산 탈수소효소 방법) MAO 베이징 식품의약품안전처 (승인) 20162401129
3.5 병리학적 검사
3.5.1 HE 염색
안락사 후, 마우스 간 조직 샘플을 4% 파라포름알데히드 고정제로 48시간 이상 고정시켰다. 고정 후, 간 샘플을 알코올 구배로 탈수시키고 자일렌과 에탄올로 처리했다. 그런 다음 간 조직을 왁스에 담가 포매시켰다. 포매된 재료를 다듬고, 부착시키고, 복구한 후, 간 조직을 파라핀 마이크로톰(microtome)으로 슬라이스하고, 슬라이스의 두께는 4 ㎛로 했다. HE 염색의 주요 과정은 다음과 같다: 65℃의 오븐에서 베이킹한 후, 슬라이스를 자일렌으로 처리하고 에탄올 구배로 탈수시켰다. 슬라이스를 헤마톡실린, 블루 컬러 강화 용액(blue color-enhancing solution), 0.5% 에오신으로 순차적으로 염색한 후, 에탄올 구배와 자일렌으로 처리하고 중성검(neutral gum)으로 밀봉했다. 현미경으로 간 조직의 섬유화를 관찰했다.
3.5.2 마송 염색
베이킹 후, 마우스 간 조직 슬라이스를 탈랍(dewaxing)하고 탈수시켰다. 크로마이징 후, 핵을 레가우드(Regaud) 헤마톡실린 염색 용액으로 염색했다. 물로 세척한 후, 마송 폰소 레드 산성 푹신(Masson's Ponceau Red Acidic Fuchsin)으로 염색하고, 2% 빙초산 수용액에 침지하여 1% 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid) 용액으로 분별시켰다. 아닐린 청색 또는 연녹색 용액으로 직접 염색한 후, 슬라이스를 0.2% 빙초산 수용액에 잠시 담그고 난 다음, 95% 알코올, 무수알코올, 자일렌으로 투명화시킨 다음, 중성검으로 밀봉했다. 현미경으로 간 조직을 관찰했다.
3.6 결과
3.6.1 성공적인 모델링
모델 그룹 마우스의 간을 증식하는 섬유성 격막에 의해 크기가 다른 원형 또는 타원형 덩어리로 나누었다. 혈청 ALT, TBil, 및 AST 지수는 블랭크 대조 그룹에 비해 유의하게 증가하였고, 혈청 ALB는 블랭크 대조 그룹에 비해 유의하게 감소하였으며, MAO 지수는 대조 그룹과 유의한 차이가 없었으나, 이 값 역시 증가했다. 위의 모든 결과는 이 실험적 모델링이 성공적이었음을 시사한다.
3.6.2 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 총 빌리루빈(TBil), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 모노아민 옥시다제(MAO) 및 알부민(ALB)에 대한 테스트 약물의 효과
3.6.2.1 테스트 약물 A-01 및 A-02
도 10A에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 ALT 활성은 블랭크 대조 그룹의 활성보다 극히 유의하게 높으며(43.5±8.1 U/L에서 188.5±4.9 U/L로 증가; P<0.01), 이는 간경변증 모델 마우스의 간 기능이 병리학적 변화를 나타냈음을 시사한다. A-01 및 A-02를 고용량 및 저용량으로 투여한 후, 모든 처치 그룹의 ALT 활성이 유의하게 감소했고(A-02 저용량 그룹의 경우 최고는 41.5±5.4 U/L이고; A-01 고용량 그룹의 경우 최저는 30.0±5.9 U/L이며; 양성 대조 그룹은 42.8±5.4 U/L임), 블랭크 대조 그룹과 유사한 수준 또는 심지어 더 낮은 수준으로 복귀되었으며, 이는 모델 그룹과는 유의한 차이가 있다(P <0.01).
도 10B에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 혈청 AST 활성은 블랭크 대조 그룹에 비해 유의하게 증가했다(141.9±13.5 U/L에서 192.0±11.3 U/L로 증가; P<0.05). A-01 및 A-02 투여 후, 모든 처치 그룹의 AST 활성은 감소했고, 고용량 A-01 및 A-02 투여는 AST 활성을 유의하게 감소시켰으며(A-01 고용량 그룹의 경우 130±12.8 U/L; A-02 고용량 그룹의 경우 131.3±9.9 U/L; 둘 다 P <0.01), 이것은 분명히 양성 대조 그룹(165.5±11.6 U/L)에 비해 우수한 것이다.
도 10C에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 TBil 농도는 블랭크 대조 그룹(1.02±0.20 μmol/L에서 2.91±0.39 μmol/L로 증가)에 비해 유의하게 높았고, 블랭크 대조 그룹(P <0.01)과 유의한 차이가 있었다. A-01 및 A-02의 고용량 및 저용량 투여 후, TBil의 농도는 모두 유의하게 감소하였으며(최고는 0.91±0.13 μmol/L이고; 최저는 0.78±0.25 μmol/L임); 이들은 블랭크 대조 그룹의 수준과 유사한 수준이지만, 모델 그룹의 수준과는 극히 유의한 차이를 나타낸다(P <0.01).
도 10D에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 MAO 활성은 블랭크 대조 그룹에 비해 증가하였지만(블랭크 대조 그룹의 경우 18.8±2.9 U/L; 모델 그룹의 경우 21.5±0.7 U/L), 통계적 차이는 없으며, 이는 사염화탄소에 의해 유도된 경변증 마우스에서 MAO 활성의 변화가 유의하지 않음을 시사한다. A-01과 A-02의 투여는 모든 처치 그룹의 MAO 활성에 유의한 영향을 미치지 않았으나, 모든 처치 그룹의 MAO 활성이 감소하였으며(최고 19.3±1.5 U/L, 최저 18.5±1.9 U/L); 이들은 블랭크 대조 그룹의 수준과 유사하다. 이에 비해, 양성 대조 그룹의 MAO 활성은 감소하지 않았다(21.3±2.1 U/L). 이 결과는 A-01과 A-02가 MAO의 활성을 블랭크 대조 그룹 수준으로 조절하여, 경변증 마우스에서 간 기능 회복에 역할을 할 수 있음을 시사한다.
도 10E에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 ALB 수준은 블랭크 대조 그룹(24.2±0.6g/L에서 22.1±1.3g/L으로 감소)에 비해 유의하게 감소하였고, 블랭크 대조 그룹과 유의한 차이가 있으며(P<0.05), 이는 사염화탄소 투여가 혈청 ALB 수준을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여준다. 다른 용량의 A-01과 A-02, 그리고 양성 대조 약물의 투여는 혈청 ALB 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다.
양성 약물인 소라페닙은 ALT, AST 및 TBIL 수치를 유의하게 감소시켰지만 MAO 지수에 대해 경변증 마우스에 대한 완화 효과를 나타내지 않을 수 있다. 결과는 A-01과 A-02가 간경변 마우스에서 간 기능 회복 효과가 있으며, 그 효과는 양성 대조 약물보다 우수하다는 것을 시사한다.
3.6.2.2 테스트 약물 B-01 및 B-02
도 11A에 도시된 바와 같이, B-01 및 B-02의 저용량 및 고용량은 ALT 활성을 상당히 감소시킬 수 있고(최고는 46.3±7.4 U/L이고; 최저는 33.0±7.1 U/L임); 블랭크 대조 그룹의 수준과 유사한 수준이나, 모델 그룹의 수준과는 유의한 차이(188.5±4.9 U/L; P<0.01)를 나타낸다.
도 11B에 나타낸 바와 같이, 모델 그룹(192.0±11.3 U/L)과 비교하여, B-01 저용량 또는 용량 투여는 AST 활성을 정상 수준(각각 132.3±10.0 U/L 및 129.7±26.6 U/L; P<0.01)으로 유의하게 감소시킬 수 있었고, B-02 저용량 투여는 AST 활성을 유의하게 감소시킬 수 있었으며(149.6±21.8 U/L; P<0.05); 이들은 블랭크 대조 그룹의 수준과 유사한 수준이다. 그러나 B-02 고용량 투여는 AST 활성을 어느 정도 감소시켰으나, 유의한 차이는 없었다(P>0.05). 이에 비해, 양성 약물인 소라페닙 역시 AST 활성을 165.5±11.6 U/L까지 감소시킬 수 있었으나(P<0.05), B-01 저용량 및 고용량, 그리고 B-02 저용량의 투여만큼 효과가 양호하지는 않았다.
도 11C에 나타난 바와 같이, B-01 및 B-02의 저용량 및 고용량은 모두 TBil을 상당히 감소시켰고(최고는 1.28±0.12 μmol/L이고; 최저는 0.96±0.15 μmol/L임); 이들은 블랭크 대조 그룹(1.02±0.20 μmol/L)의 수준과 유사한 수준이지만, 모델 그룹의 수준(2.91±0.39 μmol/L; P <0.01)과는 유의한 차이를 나타낸다.
도 11D에 나타난 바와 같이, 모델 그룹(21.5±0.7 U/L)과 비교하여, B-01 저용량(17.3±1.3 U/L; P<0.01) 및 B-02 고용량(18.3±0.6 U/L; P<0.05)은 혈청 MAO 수준을 블랭크 대조 그룹(18.8±2.9 U/L)에 비해 유의하게 감소시켰으나, 양성 대조 약물은 혈청 MAO 수준에 영향을 미치지 않았다(21.3±2.1 U/L).
도 11E에 나타난 바와 같이, 테스트 약물과 양성 대조 약물의 투여는 ALB 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다.
위의 결과는 B-01과 B-02가 ALT, AST, TBIL 및 MAO의 수준을 유의하게 감소시키고, 경변증 마우스의 간 기능 회복에 특정 용량-의존적 영향을 미치며, 이들의 효과는 적어도 일부 지표(indicators)에서는 양성 대조 약물 보다 더 양호하다는 것을 보여준다.
3.6.2.3 테스트 약물 C
도 12에 나타난 바와 같이, 모델 그룹과 비교하여, 고용량 약물 C 투여는 모델 대조 그룹에 비해 (A) ALT, (B) AST, (C) TBIL, (D) MAO, (D) MAO, (E) ALB 수준에서 유의한 개선을 나타내지 않았고, 심지어 어느 정도 악화되는 경향이 있었으며, 이는 약물 C가 경변증 마우스의 간 기능 개선에 효과적이지 않고 독성을 나타낼 수 있음을 시사한다.
3.6.3 병리학적 분석
간경변증은 병리학적으로 간 조직의 미만성 섬유증 및 유사소엽(pseudolobules)의 형성을 특징으로 한다. HE 염색 병리학적 분석 결과, 도 13A에 나타난 바와 같이, 블랭크 대조 그룹 마우스의 정상 간 조직은 깨끗한 구조, 온전한 간 소엽, 깔끔하게 배열된 간세포, 중심 정맥을 중심으로 하는 방사상 배열, 정상적인 간세포의 핵 및 집수 영역(catchment area)에서 단지 소량의 섬유 조직을 나타냈다. 도 13B에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 간 조직에서는 간세포가 무질서하고, 풍선-유사 구조가 나타나며, 간소엽은 거의 소실되었으며, 유사소엽(도 13B에서 오른쪽 방향 화살표로 표시되어 있음)이 풍부하게 형성되었으며, 그리고 다수의 증식된 원형섬유(protofibrils)가 간 조직에 존재하여 원형 또는 타원형의 섬유성 격막(fibrous septa)을 형성하였다(도 13B에서 왼쪽 방향 화살표로 표시되어 있음). 도 13C에 나타난 바와 같이, 모델 대조 그룹에 비해, 양성 대조 그룹은 간 손상이 유의하게 감소하였고; 간세포는 명확하게 정돈된 배열을 나타내며; 섬유성 과증식은 증가하지만 명백히 감소되어, 섬유성 격막을 형성하지 않고; 유사소엽은 거의 사라졌으며; 그러나 정상 간 조직과 비교하여, 양성 대조 그룹의 간 조직은 세포간 갭(inter-cellular gaps)의 명백한 증가를 나타냈다(아래쪽 방향 화살표로 표시되어 있음). 모델 대조 그룹과 비교하여, 금 클러스터 약물(A-01, A-02, B-01 및 B-02)을 투여한 4개 그룹은, 섬유성 과증식 및 유사소엽의 뚜렸한 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 간 손상으로부터 이들의 간세포가 유의하게 회복되었으며, 이 회복은 어느 정도 용량 의존적이었음을 보여준다.
도 13D 및 도 13E는, 각각, 간 손상 회복에 대한 예시적인 A-01 손실 및 고용량 약물 투여의 효과를 나타내는 HE 이미지를 보여준다. 도 13D에 나타난 바와 같이, A-01 저용량 약물 투여 그룹은 비교적 정돈된 간세포의 배열, 거의 소실된 유사소엽, 섬유성 과증식의 뚜렷한 감소를 보였으나, 정상 간 조직에 비해 간세포 간(inter-hepatocytes) 갭이 어느 정도 증가하였다(도 13D에서 아래쪽 방향 화살표로 표시됨). 도 13E에 나타난 바와 같이, A-01 저용량 약물 투여 그룹과 비교하여, A-01 고용량 약물 투여 그룹은 감소된 간 손상, 완전히 소실된 가소엽, 관찰되지 않은 섬유성 과증식, 식별가능하게 증가되지 않은 간세포간 갭, 및 정상 간 조직과 차이가 없는 외관의 훨씬 더 우수한 효과를 나타냈다. 결론적으로, A-01 약물이 양성 대조 약물보다 간손상 회복에 더 좋은 효과를 나타냈다.
마송 염색 결과는 H 염색 결과가 제공한 것과 동일한 결론을 제공했다.
다른 3개의 약물도 A-01 약물과 유사한 효과를 나타냈으며; 상세한 설명은 제공하지 않는다.
요약하면, 4개의 테스트 약물 A-01, A-02, B-01 및 B-02는 간 섬유성 과증식 및 간 유사소엽을 유의하게 감소시켰다. 간기능 지표 테스트 결과는 또한 간기능 회복도 나타냈다. 가장 중요한 변화는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)와 총 빌리루빈(TBil)이었다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)와 모노아미노 옥시다제(MAO)도 유의하게 회복되었지만, 알부민(ALB)은 유의하게 변하지 않았다. 4가지 금 클러스터 약물은 간경변 마우스에서 간 기능과 간 병리 구조의 일부를 크게 개선할 수 있으며, 전체 효과가 양성 대조 그룹 약물인 소라페닙보다 우수하여, 향후 추가 적용을 위한 실험적 기반을 제공한다. 그러나, 약물 C는 뚜렷한 치료 효과가 없었으며, 간경변증 치료에 사용할 수 없다.
실시형태 4
4.1 재료 및 동물
4.1.1 테스트 샘플
D: 리간드 L-NAC-결합된 금 클러스터(L-NAC-AuC), 0.5-3 nm.
E: 리간드 CR-결합된 금 클러스터(CR-AuC), 0.5-3 nm.
F: 리간드 RC-결합된 금 클러스터(RC-AuC), 0.-3 nm.
모든 테스트 샘플은 약간의 변형을 가하여 위에 기술한 방법에 따라 제조했고, 이들의 품질은 위에 기술한 방법을 이용하여 특성규명했다.
4.1.2 실험용 동물 및 그룹
6-8주령이고 체중 16-20g의, 50마리의 SPF 수컷 C57BL/6N 마우스를 Beijing Huafukang Experimental Animal Technology Co., Ltd.(생산 허가 번호: SCXK(Jing) 2019-0008)에서 구입했다. 체중에 따라, 이들을 무작위로 5개 그룹(n = 10)으로 나누었다: 블랭크 대조 그룹, 모델 그룹, D 약물 투여 그룹, E 약물 투여 그룹, 및 F 약물 투여 그룹.
4.2 모델링 프로토콜
블랭크 대조 그룹을 제외하고는, 사염화탄소(CCl4)-유도 처리 방법으로 다른 군 마우스의 간경변증 모델을 제작했다. 모델링 프로토콜은 다음과 같았다: (1) 총 8주 동안 매주 2회, 7 ㎕/체중 g으로 10% CCl4(올리브 오일로 희석)를 각 마우스에 복강 내 주사하고; 블랭크 대조 그룹의 마우스에는 동일한 양의 올리브 오일 용매를 복강내 주사했다. (2) 6주차부터, 매주 마지막 주사 후 48시간 후에 2마리의 마우스를 선택하여 희생시켰다. 간의 외관을 관찰했다. 외관이 경변증의 특징과 일치한 후(8주차), 포르말린으로 간 조직을 고정했다. HE 염색 및 마송 염색을 이용하여 간경변증 모델을 평가했다.
4.3 투여
성공적인 모델링 후, 3개의 약물 투여 그룹의 마우스에 상응하는 금 클러스터 약물을 각각 40 mg/kg의 용량으로 복강내 주사하고; 블랭크 대조 그룹 및 모델 그룹의 마우스에는 10 mL/kg의 생리 식염수를 복강 내로 투여했다. 투여는 연속 20일 동안 1일 1회였다.
4.4 생화학적 테스트
시약 및 프로토콜은 섹션 3.4에 설명된 것과 동일했다.
4.5 결과
4.5.1 성공적인 모델링
모델 그룹의 마우스 간을 증식하는 섬유성 격막에 의해 다른 크기의 원형 또는 타원형 덩어리로 나누었다. 혈청 ALT, TBil, AST 지수는 블랭크 대조 그룹에 비해 유의하게 증가하였고, 혈청 ALB는 블랭크 대조 그룹에 비해 유의하게 감소하였으며, MAO 지수는 대조 그룹과 유의한 차이가 없었으나, 이 값 역시 증가했다. 위의 모든 결과는 이 실험적 모델링이 성공적이었음을 시사한다.
4.5.2 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 총빌리루빈(TBil), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 모노아민 옥시다제(MAO) 및 알부민(ALB)에 대한 테스트 약물의 효과
도 14A에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 ALT 활성은 블랭크 대조 그룹의 활성에 비해 극히 유의하게 높으며(P<0.01, **), 이는 간경변증 모델 마우스의 간 기능에 병리학적 변화가 있음을 시사한다. D, E, F 약물 투여 후, 모든 처치 그룹의 ALT 활성이 유의하게 감소하였고, 블랭크 대조 그룹과 유사한 수준으로 회복되었으며, 이는 모델 그룹의 수준에 비해 유의한 차이가 있었다(P <0.01).
도 14B에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 AST 활성은 블랭크 대조 그룹의 활성에 비해 유의하게 더 높았다(P<0.05, *). D, E 또는 F 약물 투여 후, 모든 처치군의 AST 활성이 유의하게 감소하였다(P <0.05, *).
도 14C에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 TBil 농도는 블랭크 대조 그룹의 농도에 비해 유의하게 더 높았다(P<0.01, **). D, E, F 약물 투여 후, 모든 처리군의 TBil 농도는 블랭크 대조 그룹 수준으로 유의하게 감소하였지만, 모델 대조 그룹의 수준에 비해 유의한 차이가 있었다(P <0.01, **).
도 14D에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 MAO 활성은 블랭크 대조 그룹에 비해 증가하였으나, 통계적 차이는 없었으며(P> 0.5), 이는 사염화탄소에 의해 유도된 경변증 마우스에서 MAO 활성의 변화는 유의하지 않음을 시사한다. D, E 또는 F 약물의 투여는 MAO 활성에 유의한 영향을 미치지 않았으나, 모든 약물 투여 그룹의 MAO 활성은 블랭크 대조 그룹의 수준으로 감소했다.
도 14E에 나타난 바와 같이, 모델 그룹의 ALB 농도는 블랭크 대조 그룹에 비해 감소하였으나, 그 차이는 유의하지 않았다(P >0.05). 그러나 D, E 또는 F 약물의 투여는 혈청 ALB 농도를 증가시켰으나, 그 차이는 유의하지 않았다(P >0.05).
요약하면, 3개의 금 클러스터 약물 D, E 및 F는 간 기능을 유의하게 개선했다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)와 총 빌리루빈(TBil)이 가장 유의한 변화를 나타냈고, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)와 모노아미노 옥시다제(MAO)도 뚜렷한 회복을 나타냈으며, 알부민(ALB)도 유의하지는 않지만 개선되었다. 이러한 결과는 향후 추가 적용을 위한 실험적 근거를 제공한다.
다른 크기의 L-Cys-AuC, L-NIBC-AuC, L-NAC-AuC, CR-AuC, RC-AuC, 및 크기가 다른 리간드-결합된 AuC도 유사한 효과를 나타내지만, 이들의 효과는 어느 정도 다양하다. 이에 대해서는 본 명세서에서 상세히 설명하지 않는다.
본 발명이 특정 실시형태를 참조하여 설명되었지만, 실시형태는 예시적이며 본 발명의 범위가 이로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 대안적인 실시형태는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 이러한 대안적인 실시형태는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 정의되고 전술한 설명에 의해 뒷받침된다.

Claims (20)

  1. 대상체에서 간경변증의 치료를 위한 리간드-결합된 금 클러스터를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 리간드-결합된 금 클러스터는,
    금 코어; 및
    상기 금 코어에 결합된 리간드를 포함하고,
    상기 리간드는 L-시스테인 또는 이의 유도체, D-시스테인 또는 이의 유도체, 시스테인-함유 올리고펩티드, 및 기타 티올-함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    상기 L-시스테인 또는 이의 유도체는 L-시스테인, N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), 및 N-아세틸-L-시스테인(L-NAC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고; 상기 D-시스테인 또는 이의 유도체는 D-시스테인, N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), 및 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고;
    상기 시스테인-함유 올리고펩티드는 시스테인-함유 디펩티드, 시스테인-함유 트리펩티드, 또는 시스테인-함유 테트라펩티드이고,
    상기 시스테인-함유 디펩티드는 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), L(D)-히스티딘-L(D)-시스테인 디펩티드(HC), 및 L(D)-시스테인-L(D)-히스티딘 디펩티드(CH)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고;
    상기 시스테인-함유 트리펩티드는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), L(D)-리신-L(D)-시스테인-L(D)-프롤린 트리펩티드(KCP), 및 L(D)-글루타티온(GSH)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고;
    상기 시스테인-함유 테트라펩티드는 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR), 및 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고;
    상기 기타 티올-함유 화합물은 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, N-(2-머캅토프로피오닐)-글리신, 및 도데실 머캅탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    금 코어가 0.5 내지 3 nm 범위의 직경을 갖는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    금 코어가 0.5 내지 2.6 nm 범위의 직경을 갖는 것인, 약학적 조성물.
  4. 삭제
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KR1020227028338A 2020-03-16 2020-10-28 간경변증의 치료를 위한 금 클러스터(AuCs) 및 조성물 Active KR102903284B1 (ko)

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