KR102903132B1

KR102903132B1 - 보툴리누스 독소의 제조 방법

Info

Publication number: KR102903132B1
Application number: KR1020217013829A
Authority: KR
Inventors: 다이스케 요코우치; 아키코 미우라; 류 오카다; 유조 야마시타; 유야 사사키; 쇼고 니시하타
Original assignee: 시오노기세이야쿠가부시키가이샤
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2025-12-23
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: US20220081682A1; EP3901163B1; CN113056478A; WO2020129986A1; US11926853B2; JPWO2020129986A1; KR20210106983A; CA3124535A1; EP3901163A4; JP7454507B2; EP3901163A1

Abstract

간편하고, 독소 수율이 높고, 또한, 비활성이 높은 독소를 얻을 수 있는, 보툴리누스 독소의 제조 방법을 제공한다. (A) 배지 중에서 보툴리누스 독소 생성균에서 보툴리누스 독소를 생성시키고, 상기 보툴리누스 독소 유래의 균체 성분 및 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 a를 얻는 공정과; (B) 상기 혼합물 a를 상기 균체 성분의 제거에 제공하여 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 b를 얻는 공정과; (C) 상기 혼합물 b에 엔도뉴클레아제를 첨가하여 핵산 분해물과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 c를 얻는 공정과; (D) 상기 혼합물 c를 핵산 분해물의 제거에 제공하여 보툴리누스 독소 단리액 d를 얻는 공정;을 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.

Description

보툴리누스 독소의 제조 방법

본 발명은 보툴리누스 독소의 제조 방법에 관한 것이다.

보툴리누스균은 아포를 형성하는 편성혐기성 그람양성 간균이며, 전신성 마비를 초래하는 신경 독소(보툴리누스 독소)를 생성한다. 보툴리누스균에서 생성되는 보툴리누스 독소는 신경독 성분 NTX에 무독 성분이 결합한 복합체를 이루고 있다. 이 복합체는 분자량의 차이에 따라 LL독소(900KDa), L독소(500KDa), M독소(300KDa)로 분류된다. M독소는 NTX에 무독성 및 적혈구 응집 활성이 없는 단백질(무독성 비-HA 단백질)인 NTNH가 결합되고 있으며, L독소는 M독소에 무독성 및 적혈구 응집 활성이 있는 HA 단백질이 결합되고 있으며, LL독소는 L독소가 2분자 결합되고 있다. NTX만으로 구성되는 독소는 S독소(150KDa)라고 불린다. NTX만으로 이루어지는 S독소는 복합체 독소를 알칼리 조건에 제공하여 NTX와 NTNH를 괴리시켜 단리(單離)시킬 수 있다.

보툴리누스 독소는 A ~ G형의 혈청형으로 분류되며, 동일한 혈청형의 독소 중에서도 독소 유전자의 구조의 차이에 따라 여러 아형으로 더 분류되고 있다. 예를 들어 A형 보툴리누스균은 A1형 ~ A5형의 아형으로 분류되며, A1형 보툴리누스균은 LL독소, L독소 및 M독소를 생성하지만, A2형 보툴리누스균은 M독소만을 생성한다. B형, C형 및 D형 보툴리누스균은 LL독소 및 M독소를 생성한다. E형 및 F형 보툴리누스균은 M독소만을 생성하고, G형 보툴리누스균은 L독소만을 생성한다.

보툴리누스 독소는 그 신경 차단 작용을 이용하여 임상에 응용되고 있다. 적용예로서는 뇌졸중 후 상지/하지 경축(痙縮), 근육 긴장 이상, 반측 안면 경련, 뇌혈관 장애 후 후유증, 미용 성형 등을 들 수 있다.

이러한 임상 상의 유용성에서, 보툴리누스균에서 보툴리누스 독소를 제조하는 방법이 여러 가지 제안되고 있다. 보툴리누스 독소의 제조 방법에 있어서는, 보툴리누스균의 배양 후의 배지를 산으로 처리하여 보툴리누스 독소를 산 침전(acid precipitation)시키는 수법이 예전부터 이용되고, 개량되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 1에는 보툴리누스 독소를 포함하는 발효 배양물을 산 침전에 제공하여 산 침전물을 얻어 농축된 산 침전물의 샘플을 얻는 것; 샘플을 뉴클레아제 소화에 제공한 후에 소수성 상호 작용 칼럼에 로딩하여 보툴리누스 독소 복합체를 포착하는 것; 보툴리누스 독소 복합체를 용출시켜 해리시켜 조질의(crude) 비-복합 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물을 얻는 것; 및 음이온 교환 칼럼 및 양이온 교환 칼럼에 제공하는 것을 포함하는, 비-복합 보툴리누스 독소를 정제하기 위한 방법이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 2에는 보툴리누스 독소 생산 균주 배양액을 산으로 처리하여 보툴리누스 독소를 산 침전시키는 공정; 침전된 보툴리누스 독소에 완충 용액을 첨가한 후 프로테아제 억제제 및 핵산 분해 효소로 처리한 보툴리누스 독소를 추출하는 공정; 추출된 보툴리누스 독소를 산으로 처리하여 보툴리누스 독소를 산 침전시킨 후 침전물을 완충 용액에 용해시키는 공정; 및 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리누스 독소를 정제하는 공정을 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법이 개시되어 있다.

한편으로, 보툴리누스 독소의 제조 방법에 있어서는, 전술한 바와 같은 산 침전을 실시하지 않는 수법도 이용된다. 예를 들어, 특허문헌 3에는 보툴리누스균을 배양 및 발효시키는 단계와; 발효 배지에 존재하는 세포 파편을 제거하여 발효 배지를 채취하는 단계와; 채취한 배지를 음이온 교환 매체에 접촉시켜 보툴리누스 신경 독소를 포착하는 단계와; 음이온 교환 매체에서 용출시킨 용리액을 양이온 교환 매체에 접촉시키는 단계를 포함하는, A형 보툴리누스 신경 독소 복합체를 얻는 과정이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 4에는 막여과법으로 보툴리누스균 배양액에서 보툴리누스 균체를 제거하는 공정; 보툴리누스 균체가 제거된 보툴리누스 독소 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 전개하는 공정; 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼의 회수 획분을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 전개하여 보툴리누스 독소 성분을 흡착시키는 공정, 및 보툴리누스 독소를 용출시키는 공정을 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법이 개시되어 있다.

특허문헌 1: 일본 특표 2013-508388 호 공보 특허문헌 2: 일본 특표 2016-521968 호 공보 특허문헌 3: 일본 특표 2012-532932 호 공보 특허문헌 4: 일본 특개 2011-74025 호 공보

산 침전을 실시하는 보툴리누스 독소의 제조 방법에서는, 산 침전물에는 세포 성분(균체 성분)과 핵산 성분이 공침되어 있으며, 이 산 침전물에 대해 뉴클레아제 소화가 이루어져서 핵산 성분이 단편화된다. 또한, 산 침전으로 균체를 산성 조건에 노출시켜 균체에서 독소가 용출되고, 당해 독소도 균체 성분 및 핵산 성분과 함께 침전된다. 단편화된 핵산 성분과 세포 성분은, 그 후의 크로마토그래피 등을 이용한 정제 조작으로 제거된다. 그러나 산 침전을 이용하는 수법은 산 침전의 조작이 번잡한 것; 보툴리누스 독소와 함께 단편화된 핵산 성분과 세포 성분(균체 성분)이 대량으로 공존된 상태에서 정제에 제공되기 때문에 크로마토그래피 등에서의 분리가 예민하지 않고 분리 성능이 낮은 것; 및 협잡물이 대량으로 공침되어 있는 불용물에 대해 뉴클레아제 소화가 이루어져서 소화가 되지 않은 핵산이 잔존하는 위험 등이 상정된다. 한편으로, 산 침전을 실시하지 않는 보툴리누스 독소의 제조 방법에서는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 핵산 제거가 이루어진다. 그러나 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의한 핵산 제거를 이용하는 수법도 독소와 핵산의 양쪽이 음이온 교환 담체에 흡착되어 독소의 수율에 한계가 있고, 또한, 얻어지는 독소의 비활성도 만족스러운 수준이 아니다.

따라서 본 발명은 간편하고, 독소 수율이 높고, 또한, 비활성(比活性)이 높은 독소를 얻을 수 있는, 보툴리누스 독소의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 예의 검토한 결과, 지금까지 균체 성분이 보툴리누스 독소와 불가피하게 공존하는 산 침전물에 대해서만 적용되어 왔던 뉴클레아제 처리를, 보툴리누스균 배양 발효물에서 균체 성분을 제거한 보툴리누스 독소 혼합물에 대해 실시함으로써, 산 침전도, 핵산 제거를 위한 음이온 교환 크로마토그래피도 이용하지 않고, 독소 수율이 높고, 또한, 비활성이 높은 보툴리누스 독소를 제조할 수 있음을 발견했다. 본 발명은 이 지견에 기초하여 검토를 더 거듭하여 완성된 발명이다.

즉, 본 발명은 이하에 열거된 태양의 발명을 제공한다.

항 1. (A) 배지 중에서 보툴리누스 독소 생성균에서 보툴리누스 독소를 생성시켜 상기 보툴리누스 독소 유래의 균체 성분 및 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 a를 얻는 공정과,

(B) 상기 혼합물 a를 상기 균체 성분의 제거에 제공하여 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 b를 얻는 공정과,

(C) 상기 혼합물 b에 엔드뉴클레아제를 첨가하여 핵산 분해물과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 c를 얻는 공정과,

(D) 상기 혼합물 c를 핵산 분해물의 제거에 제공하여 보툴리누스 독소 단리액(單離液) d를 얻는 공정,

을 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 2. 상기 (C) 공정에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 세라티아균 Serratia marcescens 유래의 엔도뉴클레아제인, 항 1에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 3. 상기 (C) 공정을, Ph 5.8 ~ 6.5의 조건 하에서 실시하는, 항 1 또는 2에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 4. 상기 (C) 공정에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제를 복수회 첨가하는, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 5. 상기 (D) 공정에 있어서, 상기 핵산 분해물의 제거가 막에 의한 제거를 포함하는, 항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 6. (E) 상기 보툴리누스 독소 단리액 d를, 양이온 교환 크로마토그래피에 제공하여 보툴리누스 독소 복합체의 정제물을 얻는 공정을 더 포함하는, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 7. (F) 상기 보툴리누스 독소 복합체의 정제물을, 상기 보툴리누스 독소 복합체에서 무독성 비-HA 단백질이 괴리되는 조건 하에서 음이온 교환 크로마토그래피에 제공하여 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제물을 얻는 공정을 더 포함하는, 항 6에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 8. 적어도 상기 (A) 공정이 전배양 공정과 본배양 공정을 포함하며, 적어도 상기 전배양 공정을 정치 배양으로 실시하는, 항 1 내지 7 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 9. 상기 전배양 공정과 상기 본배양 공정의 양쪽을 정치 배양으로 실시하는, 항 1 내지 8에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 10. 상기 (A) 공정이,

(A1) pH 6.8 ~ 8.0의 배지 중에서 상기 보툴리누스 독소 생성균의 균체 증식을 실시하는 공정과,

(A2) pH 5.0 ~ 6.5의 배지 중에서 상기 보툴리누스 독소 생성균의 발효를 실시하는 공정,

을 이 순서로 포함하는, 항 8 또는 9에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 11. 상기 (A) 공정에 있어서, 상기 보툴리누스 독소 생성균이 아포의 형태로 보존된 균체의 발아체인, 항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 12. 상기 (B) 공정에 있어서, 상기 균체 성분의 제거가 필터 여과를 포함하는, 항 1 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 13. 상기 (F) 공정에 있어서, 상기 조건이 pH 7.3 ~ 8.5인, 항 7 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 14. 상기 (F) 공정에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 약음이온 교환 크로마토그래피인, 항 7 내지 13 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법.

항 15. 비활성이 3.0×10⁷U/mg 이상인 것을 특징으로 하는, 정제 보툴리누스 독소.

항 16. 항 1 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 보툴리누스 독소의 제조 방법에 의해 제조되는, 정제 보툴리누스 독소.

본 발명에 의하면, 간편하고, 독소 수율이 높고, 또한, 비활성이 높은 독소를 얻을 수 있는, 보툴리누스 독소의 제조가 가능하게 된다.

도 1은 실시예 1에 있어서의 보툴리누스 독소 정제를 나타내는 전기 영동 겔의 염색상을 나타낸다.
도 2는 비교예 1에 있어서의 보툴리누스 독소 정제를 나타내는 전기 영동 겔의 염색상을 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 있어서의 보툴리누스 독소 정제를 나타내는 전기 영동 겔의 염색상을 나타낸다.
도 4는 실시예 3에 있어서의 보툴리누스 독소 정제를 나타내는 전기 영동 겔의 염색상을 나타낸다.

본 발명의 보툴리누스 독소의 제조 방법은, (A) 배지 중에서 보툴리누스 독소 생성균에서 보툴리누스 독소를 생성시켜 상기 보툴리누스 독소 유래의 균체 성분 및 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 a를 얻는 공정과; (B) 상기 혼합물 a를 상기 균체 성분의 제거에 제공하여 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 b를 얻는 공정과; (C) 상기 혼합물 b에 엔도뉴클레아제를 첨가하고, 핵산 분해물과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 c를 얻는 공정과; (D) 상기 혼합물 c를 핵산 분해물의 제거에 제공하여 보툴리누스 독소 단리액 d를 얻는 공정;을 포함한다. 또한, 본 발명의 보툴리누스 독소의 제조 방법은, (E) 상기 보툴리누스 독소 단리액 d를, 양이온 교환 크로마토그래피에 제공하여 보툴리누스 독소 복합체의 정제물을 얻는 공정, 또는 (F) 상기 보툴리누스 독소 복합체의 정제물을, 상기 보툴리누스 독소 복합체에서 무독성 비-HA 단백질이 괴리하는 조건 하에서 음이온 교환 크로마토그래피에 제공하여 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제물을 얻는 공정을 더 포함해도 좋다.

본 발명에 있어서의 보툴리누스 독소는 혈청형으로서 A형, B형, C형, D형, E형, F형, 및 G형의 혈청형인 것을 들 수 있다. 또한, 보툴리누스 독소에는 보툴리누스 독소 복합체 및 보툴리누스 독소 비-복합체가 포함된다. 보툴리누스 독소 복합체로서는 LL독소(900KDa), L독소(500KDa) 및 M독소(300KDa)를 들 수 있다. 또한, 보툴리누스 독소 비-복합체는 NTX만으로 이루어지는 S독소(150KDa)를 가리킨다. NTX는 50KDa의 경쇄와 100KDa의 중쇄가 이황화물을 통해 결합된 이중 가닥 프레그먼트(fragment) 구조를 갖는다.

(A) 보툴리누스 독소 생성균에서의 보툴리누스 독소의 생성

(A) 공정에서는, 배지 중에서 보툴리누스 독소 생성균에서 보툴리누스 독소를 생성시켜 상기 보툴리누스 독소 유래의 균체 성분 및 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 a를 얻는다.

본 공정에서 생성되는 보툴리누스 독소로서는 천연 보툴리누스 독소 및 수식 보툴리누스 독소를 들 수 있다. 수식 보툴리누스 독소는 천연 보툴리누스 독소와 비교하여 그 아미노산 중 적어도 1개가 결실, 수식, 부가, 삽입 또는 치환된 보툴리누스 독소를 의미한다. 수식 보툴리누스 독소는 재조합으로 생성된 신경독일 수 있다. 수식 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 수용체에 결합되는 능력, 뉴런으로부터의 신경 전달 물질의 방출을 저해하는 능력 등의 천연 보툴리누스 독소의 생물학적 활성을 적어도 1개 갖고 있으면 된다. 수식 보툴리누스 독소의 예로서는 보툴리누스 독소 혈청형(혈청형 A 등) 유래의 경쇄와, 다른 보툴리누스 독소 혈청형(혈청형 B 등) 유래의 중쇄를 갖는 보툴리누스 독소를 들 수 있다. 또한, 본 공정에 있어서는 1종의 보툴리누스 독소가 생성되어도 좋고, 복수종의 보툴리누스 독소가 생성되어도 좋다. 정제 효율 등의 관점에서는 1종의 보툴리누스 독소가 생성되는 것이 바람직하다.

보툴리누스 독소 생성균(이하, 보툴리누스균이라고도 기재한다)은 상기의 보툴리누스 독소를 생성하는 균이면 좋고, 예를 들면, 클로스트리듐·보트리넘(Clostridium botulinum), 및 그 재조합체를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, LL독소, L독소 및 M독소를 생성하는 A1형 보툴리누스균; M독소만을 생성하는 A2형 보툴리누스균; LL독소 및 M독소를 생성하는 B형, C형 및 D형 보툴리누스균; M독소만을 생성하는 E형 및 F형 보툴리누스균; 및 L독소만을 생성하는 G형 보툴리누스균을 들 수 있다. 바람직하게는 M독소만을 생성하는 A2형, E형 및 F형 보툴리누스균을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 A2형 보툴리누스균을 들 수 있다. 구체적으로는 A2형 보툴리누스 균주로서 유아 보툴리누스증 원인균을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 Kyoyo-F, Chiba-H, Y-8036, 7I03-H, 7I05-H, KZ1828 등을 들 수 있고, 바람직하게는 Chiba-H를 들 수 있다. 또한, 보툴리누스 독소 생성균은 아포의 형태로 보존된 보툴리누스 균체의 발아체인 것이 바람직하다. 이에 따라 종자 균주로서의 안정성이 향상되고, 효율적으로 독소를 생성시킬 수 있다.

배지 중에서, 보툴리누스 독소 생성균에서 보툴리누스 독소를 생성하는 방법으로서는 어떠한 방법을 사용해도 좋다. 예를 들어, 사카구치 등의 방법(사카구치 쥐., 보툴리즘의 바이오 메디컬 관점; 클로스트리듐 보툴리눔 프로제니터 독성의 정제 및 구강 독성 효과., 21-34, 루이스 쥐이. 1981, 아카데믹 프레스, 뉴욕)(Sakaguchi G, Biomedical aspects of botulism: Purification and oral toxicities of Clostridium botulinum progenitor toxins., 21-34, Lewis GE. 1981, Academic Press, New York)을 들 수 있다. (A) 공정에는 전배양 공정과 본배양 공정을 포함할 수 있다. 전배양 공정은 바람직하게는 정치 배양으로 실시할 수 있으며, 본배양 공정은 바람직하게는 교반 배양 또는 정치 배양으로 실시할 수 있다. 더욱 바람직하게는 전배양 공정과 본배양 공정의 양쪽을 정치 배양으로 실시할 수 있다.

전배양 공정은 균체의 확대 배양을 실시하는 공정이며, 본배양 공정은 균체의 생산 배양을 실시하는 공정이다. 본배양 공정은 (A1) 보툴리누스 독소 생성균의 균체 증식을 실시하는 공정과, (A2) 보툴리누스 독소 생산균의 발효를 실시하는 공정을, 이 순서로 포함하는 것이 바람직하다. (A2) 공정에서는 보툴리누스 독소의 용출(용균)과 균의 증식의 양쪽이 진행된다.

또한, (A1) 공정에 있어서의 배지의 pH는 균의 증식을 보다 양호하게 진행시키는 관점에서 6.8 ~ 8.0인 것이 바람직하다. 구체적으로는 pH 7.0 ~ 8.0, 바람직하게는 pH 7.1 ~ 8.0, 보다 바람직하게는 pH 7.2 ~ 8.0, 더욱 바람직하게는 pH 7.2 ~ 7.8로 조정된 배지를 준비하고, 당해 배지를 이용하여 (A1) 공정을 개시할 수 있다.

또한, (A2) 공정에 있어서의 배지의 pH는 보툴리누스 독소의 용출(용균)과 균의 증식을 보다 양호하게 진행시키는 관점에서 5.0 ~ 6.5인 것이 바람직하다.

(A2) 공정에 있어서 상기 pH로 조정하는 방법의 일례로서는, (A2) 공정에 있어서 pH 조정제를 배지에 첨가하여 인위적으로 pH를 낮추는 방법을 들 수 있다. 인위적으로 pH를 낮추는 조작은 (A1) 공정에 의한 균의 증식이 정점에 도달한 것을 확인한 후에 실시할 수 있다. 이와 같은 인위적으로 pH를 낮추는 방법은 바람직하게는 교반 배양의 경우에 실시된다.

(A2) 공정에 있어서 상기 pH로 조정하는 방법의 다른 예로서는, (A1) 공정에서 인위적으로 제어하지 않고 자연스럽게 pH가 내려가는 현상을 이용하는 방법을 들 수 있다. 자연스럽게 pH가 내려가는 현상을 이용한 조정은 바람직하게는 정치 배양의 경우에 실시할 수 있다. 또한, 자연스럽게 pH가 내려가는 것에 의해 (A1) 공정에서 (A2) 공정으로 이행시킨 경우, (A) 공정이 진행되고 완료됨의 확인은, 배지의 pH가 바람직하게는 5.5 ~ 6.5까지 내려가 있는 것을 확인하여 실시할 수 있다.

(A) 공정에서 이용되는 배지는 특별히 한정되지 않으며, 당업자에 의해 적절하게 선택된다. 바람직하게는 배지에는 식물성 펩톤 및 동물 유래 펩톤 중 적어도 어느 하나가 포함된다. 식물성 펩톤은 식물에서 얻은 단백질의 분해 산물이며, 완두콩, 대두, 면실, 밀 글루텐 등에서 유래하는 것을 들 수 있으며, 바람직하게는 완두콩 유래 펩톤을 들 수 있다. 동물 유래 펩톤은 동물 조직 유래의 단백질 분해 산물이며, 돼지, 소, 양 등에서 유래하는 것을 들 수 있으며, 바람직하게는 돼지 유래 펩톤을 들 수 있다. 전배양 공정에서 이용되는 배지 중의, 식물성 펩톤 및 동물 유래 펩톤의 총 함유량으로서는, 예를 들어 1 ~ 12w/v%, 바람직하게는 2 ~ 10w/v%를 들 수 있으며, 본배양 공정에서 이용되는 배지 중의, 식물성 펩톤 및 동물 유래 펩톤의 총 함유량으로서는, 전배양 공정에서 이용되는 배지에 있어서의 식물성 펩톤 및 동물 유래 펩톤의 총 함유량보다 적은 것이 바람직하며, 예를 들면 식물성 펩톤 및 동물 유래 펩톤의 총 함량으로서, 0.1 ~ 5w/v%, 바람직하게는 1 ~ 3w/v%를 들 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 단위 "w/v%"는 제17 개정 일본 약국방에 있어서의 질량 대 용량 백분율을 가리킨다.

또한, 배지에는 탄소원 및 배지 환원제를 포함할 수 있다. 탄소원으로서는 단당류(예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스 등), 이당류(예를 들어, 말토오스, 수크로오스 등), 올리고당, 다당류(예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 전분 등) 또는 당 알코올(예를 들어, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등)을 들 수 있으며, 바람직하게는 단당류를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 글루코오스를 들 수 있다. 배지 환원제로서는 티오글리콜산 나트륨, 시스테인, L-아스코르브산 나트륨 등을 들 수 있고, 바람직하게는 티오글리콜산 나트륨을 들 수 있다.

(A) 공정 종료시의 배지에는, 보툴리누스 독소 생성균이 생성한 보툴리누스 독소가 보툴리누스 독소 생성균 유래의 균체 성분 및 핵산 성분과 공존하고 있다. 따라서, (A) 공정으로 보툴리누스 독소 생성균 유래의 균체 성분 및 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 a가 얻어진다. 혼합물 a에는 균체 성분, 핵산 성분 및 보툴리누스 독소 이외에 배지 성분도 포함된다.

(B) 균체 성분의 제거

(B) 공정에서는 (A) 공정에서 얻어진 혼합물 a를 상기 균체 성분의 제거에 제공하여 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 b를 얻는다. 본 발명에서는, 예를 들면 산 침전과 같은 혼합물 a에서 보툴리누스 독소와 함께 균체 성분과 핵산 성분을 침전시키는 수법은 실시하지 않고, 먼저 핵산 성분을 제거하는 수법도 실시하지 않는다. 따라서 본 발명은 산 침전 등의 침전 처리와 같은 번잡한 조작이 불필요하게 된다. 또한, 산 침전을 하지 않기 때문에 보툴리누스 독소의 손실이 적고 우수한 수율을 달성할 수 있다. 또한, 보툴리누스 독소가 강한 산성 조건에 노출되지 않기 때문에 보툴리누스 독소의 독소 활성을 양호하게 유지시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서는 (B) 공정에 의한 균체 성분의 제거를 실시하기 전에 혼합물 a에 뉴클레아제를 가하지도 않는다.

균체 성분의 제거를 위한 수법으로서는 특별히 한정되지 않으며, 구체적으로는 구멍 직경이 0.22μm 이하의 필터로 혼합물을 여과한 경우의 용출액과 동등 이상의 균체 성분의 분리능을 갖는 수법이면 좋다. 즉, 본 발명에 있어서 균체 성분의 제거에 있어서의 제거 정밀도로서는 적어도 구멍 직경이 0.22μm 이하의 필터로 달성되는 경우와 동등 이상의 제거 정밀도가 총족되어 있으면 좋다.

균체 성분의 제거를 위한 수법의 보다 구체적인 예로서는 예를 들어, 필터 여과, 원심 분리, 막여과를 들 수 있으며, 바람직하게는 필터 여과를 들 수 있다. 필터 여과에 이용되는 필터의 구멍 직경으로서는 예를 들면 10μm 이하를 들 수 있다. 필터 여과는 구멍 직경이 다른 필터를 이용하여 여과 대상이 제공되는 필터의 구멍 직경이 단계적으로 작아지도록 복수 단계에 걸쳐 실시해도 된다. 이 경우 필터 여과는 2 ~ 4단계, 바람직하게는 3 ~ 4단계에 걸쳐 실시할 수 있다. 필터 여과를 복수 단계에 걸쳐 실시하는 경우, 최종 단계에서 이용되는 필터의 구멍 직경은 균체 성분을 한층 적격하게 제거하는 관점에서 0.22μm 이하인 것이 바람직하다. 사용하는 필터의 재질로서는 셀룰로오스, 펄라이트, 레진, 규조토, 폴리에테르설폰, 초산 셀룰로오스, 폴리불화비닐리덴 등을 들 수 있다.

(B) 공정에서 제거되는 것은 주로 균체 성분이다. 또한, (B) 공정에서는 균체 성분과 함께 핵산 성분도 부분적으로 제거되어도 상관없다. 필터 여과를 실시할 경우는 필터 상에 균체 성분이 머물고 용출액을 혼합물 b로서 회수한다.

이와 같이 혼합물 a에서 균체 성분을 제거하여 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 b가 얻어진다. 또한, 혼합물 b는 적절히 농축된 것으로 얻어도 된다. 예를 들어, 상기의 필터를 통과한 용출액을 더욱 농축하여 얻어도 된다. 농축 수법으로서는 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 막농축을 들 수 있다. 이 경우, 한외 여과막을 이용하여 인산 완충액, MES 완충액 등의 보툴리누스 독소를 용해할 수 있는 완충액으로 완충액 치환을 하는 것이 바람직하다. 한외 여과막의 구멍 직경(분획 분자량)으로서는 20 ~ 40KDa, 바람직하게는 25 ~ 35KDa을 들 수 있다.

혼합물 b는 균체 성분이 제거되어 있어, 실질적으로 맑은 액체로서 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는 혼합물 b는 핵산 성분과 보툴리누스 독소를, 전술한 완충액과 함께 포함하는 태양으로 얻을 수 있다. 또한, 혼합물 b에는 상기의 배지 성분도 계속 포함될 수 있다.

(C) 엔도뉴클레아제 처리

(C) 공정에서는 혼합물 b에 엔도뉴클레아제를 첨가하여 핵산 분해물과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 c를 얻는다. 전술한 바와 같이, 본 발명에서는 보툴리누스 독소의 제조에서 자주 실시되는, 보툴리누스 독소와 함께 균체 성분과 핵산 성분을 침전시키는 산 침전 등의 수법은 실시하지 않는다. 먼저, 핵산 성분을 제거하기 위해 균체 성분이 미리 제거된 혼합물 b에 대해 엔도뉴클레아제를 첨가한다. 엔도뉴클레아제의 작용으로 혼합물 b 중의 핵산 성분이 단편화되어 핵산 분해물이 생긴다. 이에 따라 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 이용하지 않아도 후술하는 (D) 공정에서 우수한 효율로 핵산 분해물을 제거하는 것(잔존하는 핵산종이 보다 적게 되도록 핵산종이 제거되는 것)이 가능하게 된다. 또한, 본 발명에서는 혼합물 b에서 미리 균체 성분이 제거되어 있기 때문에, 균체 성분에 방해되지 않고 엔도뉴클레아제가 핵산 성분에 대해 작용하기 쉽다. 따라서 미소화 핵산의 잔존을 억제하여 효율적으로 단편화하는 것도 가능하게 된다. 이 점도 후술하는 (D) 공정에서 우수한 효율로 핵산 분해물을 제거하는데 기여한다.

엔도뉴클레아제로서는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 특별히 제한없이 이용할 수 있다. 또한, 엔도뉴클레아제의 기질이 되는 핵산 성분은 DNA 및 RNA를 들 수 있으며, 바람직하게는 DNA 및 RNA의 양쪽을 분해할 수 있는 효소를 들 수 있다. 구체적인 엔도뉴클레아제로서는, Shewanella sp. 유래의 엔도뉴클레아제, Staphylococcus aureus 유래의 엔도뉴클레아제, 세라티아균 Serratia marcescens 유래의 엔도뉴클레아제를 들 수 있으며, 이러한 엔도뉴클레아제 중에서도, 세라티아균 유래의 엔도뉴클레아제가 특히 바람직하다.

세라티아균 유래의 엔도뉴클레아제의 구체적인 예로서는, 벤조나아제(BENZONASE)(메르크 카게아아 등록 상표), 데나라아제(DENARASE)(씨-렉타 게엠베하 등록 상표), 및 카네카 엔도뉴클레아제(카네카사제)를 들 수 있으며, 바람직하게는 벤조나아제 및 데나라아제를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 벤조나아제를 들 수 있다. 세라티아균 유래의 엔도뉴클레아제의 최적 pH는 일반 엔도뉴클레아제에 비해 높고, 구체적으로는 7.5 ~ 9.2 정도이다. 보다 구체적으로는, 벤조나아제의 최적 pH가 8.0 ~ 9.2, 데나라아제의 최적 pH가 8.0 ~ 9.0, 카네카 엔도뉴클레아제의 최적 pH가 7.5 ~ 9.0이다.

(C) 공정에서는 보툴리누스 독소의 괴리 및/또는 분해를 억제하는 관점에서, 바람직하게는 pH 5.8 ~ 6.5, 보다 바람직하게는 pH 5.9 ~ 6.3의 조건 하에서 엔도뉴클레아제를 작용시키는 것이 바람직하다. 전술한 바람직한 엔도뉴클레아제인 세라티아균 유래의 엔도뉴클레아제를 이용하는 경우도, 그 최적 pH에서는 크게 벗어나지만, 전술한 pH 조건 하에서 작용시키는 것이 바람직하다. 본 발명에서는, 세라티아균 유래의 엔도뉴클레아제를 pH 5.8 ~ 6.5의 조건 하에서 작용시켜도, 후술하는 공정 (D)에서 핵산 성분을 효율적으로 제거하는 것이 가능하게 된다.

(C) 공정에서 혼합물 b에 엔도뉴클레아제를 첨가하는 횟수로서는 특별히 한정되지 않으며, 1회여도 좋고 복수회여도 좋다. 세라티아균 유래의 엔도뉴클레아제를 이용하는 경우, 핵산을 보다 효율적으로 단편화하는 관점에서, 복수회 첨가하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 당해 엔도뉴클레아제를 2 ~ 4회, 보다 바람직하게는 2 ~ 3회 첨가할 수 있다. 복수회 첨가에 있어서의 각 회의 첨가의 타이밍으로서는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 1 ~ 12시간, 바람직하게는 2 ~ 9시간, 더욱 바람직하게는 3 ~ 7시간 간격으로 첨가할 수 있다. 또한, 엔도뉴클레아제를 작용시키는 온도로서는, 예를 들어 25 ~ 40℃, 바람직하게는 28 ~ 38℃를 들 수 있다. 또한, 엔도뉴클레아제 처리에 소요되는 총 시간으로서는, 예를 들어 10 ~ 24시간, 바람직하게는 12 ~ 20시간을 들 수 있다. 또한, 세라티아균 유래의 엔도뉴클레아제를 이용하는 경우, 본 (C) 공정과 후술하는 (D) 공정의 일련의 공정을 복수회 반복해도 좋다. 이 경우는, 1회 당 (C) 공정에서 혼합물 b에 엔도뉴클레아제를 첨가하는 횟수는 1회가 바람직하다. (C) 공정 및 (D) 공정의 일련의 공정을 반복하는 경우의 구체적인 반복 횟수로서는, 예를 들면 2 ~ 4회, 바람직하게는 2 ~ 3회를 들 수 있다. 예를 들어 당해 일련의 공정을 2회 반복하는 경우는, 본 발명은 (A) 공정, (B) 공정, (C) 공정, (D) 공정, (C) 공정, (D) 공정을 이 순서로 포함하게 된다.

이와 같이 혼합물 b를 엔도뉴클레아제 처리하여 핵산 분해물과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 c가 얻어진다. 또한, 혼합물 c는 분해하지 못한 핵산을 제거하는 등의 목적으로 필터 여과 등의 여과 처리를 거친 여액으로서 적절히 얻어도 된다. 구체적으로는, 혼합물 c는 핵산 분해물과 보툴리누스 독소와 함께 엔도뉴클레아제 잔사 및 완충액을 포함하는 태양으로 얻을 수 있다. 또한, 혼합물 c는 상기의 배지 성분도 계속 포함될 수 있다.

(D) 핵산 분해물의 제거

공정 (D)에서는 혼합물 c를 핵산 분해물의 제거에 제공하여 보툴리누스 독소 단리액 d를 얻는다. 핵산 분해물의 제거 수법으로서는, 핵산 분해물과 보툴리누스 독소를 분리할 수 있는 수단이면 특별히 한정되지 않지만, 음이온 교환 담체는 이용하지 않는다. 음이온 교환 담체를 이용한 경우에는 독소 수율에 한계가 있으며, 먼저 독소와 핵산종의 양쪽을 포착한 후에 pH 그레디언트 용리로 독소를 용출시키는 경우뿐만 아니라, 처음부터 핵산종만을 포착하여 독소를 포착하지 않고 용리시키는 경우에도 독소의 회수가 불충분하게 된다. 또한, 음이온 교환 담체를 이용하면 비활성이 충분한 독소를 얻을 수도 없다. 또한, 음이온 교환 담체를 이용하면 작업자에 의한 작업 시간이 길고 오염의 기회도 늘어난다. 따라서, 본 발명에서는 독소 수율, 독소의 비활성, 작업성 등의 관점에서, 핵산 분해물의 제거에 음이온 교환 담체는 이용하지 않는다.

또한, 본 발명에서는, 산 침전 등의, 혼합물 a에서 보툴리누스 독소와 함께 균체 성분과 핵산 성분을 침전시키는 처리를 하지 않고, 또한, 균체를 제거한 후에 잔존 핵산 성분을 분해하기 때문에, 보툴리누스 독소의 분리에 제공되는 대상(본 발명에서는 혼합물 c)에서는 제거되어야 할 협잡물이 적고, 또한, 저분자화도 되어 있다. 따라서 협잡물(즉, 핵산 분해물)의 제거를 분리 성능 좋게 실시할 수 있다.

핵산 분해물의 제거 수법으로서는, 음이온 교환 담체를 이용하지 않는 것을 한도로, 핵산 분해물과 보툴리누스 독소를 분리할 수 있는 수단을 특별히 제한없이 이용할 수 있다. 구체적으로는 막에 의한 제거를 들 수 있으며, 바람직하게는 막여과를 들 수 있다. 이에 따라 핵산 분해물 등의 저분자 물질을 막투과시켜 막투과되지 않는 보툴리누스 독소와 분리시킬 수 있다. 막에 의한 제거에 이용되는 막의 구멍 직경으로서는, 분획 분자량으로서 20 ~ 40KDa, 바람직하게는 25 ~ 35KDa을 들 수 있다. 막 분리액으로서는 인산 완충액, 초산 완충액 등의 보툴리누스 독소를 용해시킬 수 있는 완충액을 이용하는 것이 바람직하다.

이와 같이 혼합물 c에서 핵산 분해물을 제거하여 핵산 등의 협잡물이 양호하게 제거된 보툴리누스 독소 단리액 d를 얻을 수 있다. 보툴리누스 독소 단리액 d 중의 보툴리누스 독소는, (A) 공정에서 생성된 형태를 유지한 상태에서 얻어진다. 예를 들어, (A) 공정에서 A1형 보툴리누스균을 보툴리누스 독소 생성균으로서 이용한 경우는, (D) 공정에서 얻어지는 보툴리누스 독소 단리액 d 중의 보툴리누스 독소는 LL독소, L독소 및 M독소의 형태로 포함되며, (A) 공정에서 A2형 보툴리누스균을 보툴리누스 독소 생성균으로서 이용한 경우는, (D) 공정에서 얻어지는 보툴리누스 독소 단리액 d 중의 보툴리누스 독소는 M독소의 형태로 포함된다. 보툴리누스 독소 단리액 d는 맑은 액체로서 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는, 보툴리누스 독소 단리액 d는 보툴리누스 독소를 전술한 완충액과 함께 포함하는 태양으로 얻을 수 있다. 또한, 보툴리누스 독소 단리액 d에는 상기의 배지 성분도 계속 포함되는 경우도 있다.

보툴리누스 독소 단리액 d는 보툴리누스 독소를 정제 가능한 임의의 정제 공정에 더 제공할 수 있다. 보툴리누스 독소 정제의 수법으로서는 특별히 한정되지 않으며, 보툴리누스 독소의 형태에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 우수한 순도를 얻는 관점에서, 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 들 수 있다. 이온 교환 칼럼 크로마토그래피의 구체적인 수법은, 보툴리누스 독소의 pH 의존성에 따라 적절히 결정할 수 있다. 또한, 보툴리누스 독소는 산성 조건, 바람직하게는 pH 4.0 ~ 5.0, 바람직하게는 pH 4.0 정도로 양이온을 형성하고, pH 7.0 이상, 바람직하게는 pH 7.5 정도로 음이온을 형성하는 성질을 갖는다.또한, 보툴리누스 독소 복합체는 약산성 조건, 바람직하게는 pH 5.5 ~ 6.5, 바람직하게는 pH 6.0 정도로 복합체로서 안정적으로 존재하고, pH 상승, 예를 들어 pH 7.3 ~ 8.0으로 괴리하여 비-복합체를 형성하는 성질을 갖는다. 바람직하게는 이하의 (E) 공정에 의한 보툴리누스 독소 복합체의 정제, 또는 이하의 (F) 공정에 의한 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제를 더 들 수 있다.

(E) 보툴리누스 독소 복합체의 정제

(E) 공정에서는 보툴리누스 독소 단리액 d를 양이온 교환 크로마토그래피에 제공하여 보툴리누스 독소 복합체의 정제물을 얻는다. 보툴리누스 독소 복합체는 산성 조건에서 양이온을 형성하기 때문에, 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제는 보툴리누스 독소 복합체를 안정적으로 포착하여 정제할 수 있는 점에서 우수하다. 또한, 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제는 보툴리누스 독소 복합체의 괴리를 억제할 수 있는 pH 조건에서 정제할 수 있는 점에서도 우수하다.

양이온 교환 담체는 미리 바람직하게는 pH 4.0 ~ 4.5, 구체적인 예로서 pH 4.2의 완충액으로 평형화해 둘 수 있다. 당해 평형화를 위한 완충액의 염농도로서는, 예를 들어 0.3mol/L 이하, 바람직하게는 0.2mol/L 이하, 구체적인 예로서 0.2mol/L를 들 수 있다. 완충액의 종류로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 초산 완충액, 호박산 완충액, 구연산 완충액, 포름산 완충액, 바르비투르산 완충액을 들 수 있으며, 바람직하게는 초산 완충액을 들 수 있다. 이와 같이 평형화된 양이온 교환 담체에 보툴리누스 독소 단리액 d를 적용하여 보툴리누스 독소(보툴리누스 독소 복합체)를 양이온 교환 담체에 포착시킨다.

포착한 보툴리누스 독소(보툴리누스 독소 복합체)의 용출은, 평형화를 위한 완충액과 동일한 완충액을, 평형화를 위한 완충액의 염농도에서 예를 들면 0.5 ~ 0.8mol/L, 구체적인 예로서 0.7mol/L까지의 그레디언트 조건에서 흘려서 실시할 수 있다. 이에 따라 정제된 보툴리누스 독소 복합체를 용출물로서 얻을 수 있다.

양이온 교환 담체로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, SP Sepharose Fast Flow(GE 헬스 케어), CM Sepharose Fast Flow(GE 헬스 케어), S Sepharose Fast Flow(GE 헬스 케어), SP 토요파루(토소) 등의 시판의 양이온 교환 수지를 들 수 있다. 완충액 중의 염의 종류는 한정되지 않으며, 이온 강도가 상기 농도의 염화 나트륨에 상당하는 농도가 되도록 사용하면 된다. 바람직하게는, 완충액 중의 염으로서는 염화 나트륨을 들 수 있다.

이와 같이 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 정제로 보툴리누스 독소 복합체를 얻을 수 있다. 보툴리누스 독소 복합체는 안정화시키는 것을 목적으로 하여, 필요에 따라 pH를 5.5 ~ 6.5, 구체적인 예로서 pH 6.0으로 조정할 수 있다. 필요에 따라 농축 및 여과 등의 처리가 실시된 것으로서 얻을 수도 있다. 농축의 구체적인 수법으로서는, 상기 (B) 공정에서 언급한 수법에서 선택할 수 있다. 여과의 구체적인 수법으로서는 멸균 또는 최종 여과의 목적으로 이용되는 수법을 들 수 있으며, 예를 들어, 구멍 직경 0.15 ~ 0.3μm, 구체적인 예로서 0.22μm의 필터를 이용하는 수법을 들 수 있다. 또한, 보툴리누스 독소 복합체의 형태로 보툴리누스 독소 제제를 제공하는 경우는, 여과 전에 보존제 등의 첨가물을 더 배합해도 좋다.

(F) 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제

(F) 공정에서는 보툴리누스 독소 복합체의 정제물을 보툴리누스 독소 복합체에서 무독성 비-HA 단백질이 괴리하는 조건 하에서 음이온 교환 크로마토그래피에 제공하여 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제물을 얻는다.

보툴리누스 독소 복합체의 정제물은 음이온 교환 크로마토그래피에 제공하기 전에 미리 보툴리누스 독소 복합체에서 무독성 비-HA 단백질이 괴리하는 조건에 제공해도 좋다. 보툴리누스 독소 복합체에서 무독성 비-HA 단백질이 괴리하는 조건으로서는, 바람직하게는 pH 7.3 ~ 8.5, 보다 바람직하게는 pH 7.4 ~ 8.0, 구체적인 예로서 7.5를 들 수 있다. 온도는 10℃ 이하인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 한외 여과막을 이용하여 당해 pH로 조정된 염농도가 0.1mol/L 이하, 바람직하게는 0.05mol/L 이하의 인산 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액 등의 완충액, 바람직하게는 인산 완충액으로 완충액 치환하여 무독성 비-HA 단백질을 괴리시킬 수 있다. 한외 여과막의 구멍 직경(분획 분자량)으로서는 5 ~ 30KDa, 바람직하게는 8 ~ 20KDa, 보다 바람직하게는 9 ~ 15KDa을 들 수 있다.

음이온 교환 담체는 미리 보툴리누스 독소 복합체에서 무독성 비-HA 단백질이 괴리하는 조건(바람직하게는 pH 7.3 ~ 8.5, 구체적인 예로서 pH 7.5)으로 조정된 완충액으로 평형화해 둘 수 있다. 또한, 당해 평형화를 위한 완충액의 염농도로서는 0.1mol/L 이하, 바람직하게는 0.05mol/L 이하를 들 수 있다. 완충액의 종류로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 인산 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액을 들 수 있고, 바람직하게는 인산 완충액을 들 수 있다. 이와 같이 평형화된 음이온 교환 담체에 보툴리누스 독소 복합체의 정제물 또는 그것을 무독성 비-HA 단백질이 괴리하는 조건에 미리 제공한 처리물을 적용하여 접촉 환경의 pH로 음이온화된 보툴리누스 독소(보툴리누스 독소 비-복합체)가 포착된다.

포착한 보툴리누스 독소 비-복합체의 용출은, 평형화를 위한 완충액과 동일한 완충액을 평형화를 위한 완충액의 염농도에서 예를 들면 0.1 ~ 0.5mol/L, 바람직하게는 0.2 ~ 0.4mol/L, 구체적인 예로서 0.3mol/L까지의 그레디언트 조건에서 실시할 수 있다. 이에 따라 정제된 보툴리누스 독소 비-복합체를 용출물로서 얻을 수 있다.

또한, 괴리된 무독성 비-HA 단백질도 담체에 포착될 수 있지만, 이동상의 염농도 구배 등으로 용출 타이밍이 다른 것 등을 이용한 수법으로 보툴리누스 독소 비-복합체와 분리시킬 수 있다.

음이온 교환 담체로서는 특별히 한정되지 않지만, 보툴리누스 독소 비-복합체의 용출을 보다 용이하게 하여 보툴리누스 독소 비-복합체와 괴리된 무독성 비-HA 단백질과의 분리를 보다 용이하게 하는 관점에서, 약음이온 교환 담체인 것이 바람직하다. 예를 들어, DEAE Sepharose Fast Flow(GE 헬스 케어), DEAE 토요파루(토소), 다이야이온 WA10(미츠비시 케미컬), 프락토겔 DEAE(메르크) 등의 시판의 음이온 교환 수지를 들 수 있다. 완충액 중의 염의 종류는 한정되지 않으며, 이온 강도가 상기 농도의 염화 나트륨에 상당하는 농도가 되도록 사용하면 된다. 바람직하게는, 완충액 중의 염으로서는 염화 나트륨을 들 수 있다.

이와 같이 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 정제로 보툴리누스 독소 비-복합체를 얻을 수 있다. 보툴리누스 독소 비-복합체는 필요에 따라 농축 및/또는 여과 등의 처리가 실시된 것으로서 얻을 수 있다. 또한, 보툴리누스 독소 비-복합체를 보툴리누스 독소 제제로서 제공하기 위해, 보존제 등의 첨가물을 더 배합해도 좋다. 농축 및 여과의 구체적인 수법으로서는 전술한 (E) 공정에서 언급한 수법에서 선택할 수 있다.

정제 보툴리누스 독소

본 발명의 방법에서 얻어지는 보툴리누스 독소의 정제체(정제 보툴리누스 독소라고도 기재한다)는 비활성이 우수하다. 구체적인 비활성으로서는, 예를 들면 3.0×10⁷U/mg 이상, 바람직하게는 4.0×10⁷U/mg 이상, 보다 바람직하게는 5.0×10⁷U/mg 이상, 더욱 바람직하게는 6.0×10⁷U/mg 이상, 더욱더 바람직하게는 7.0×10⁷U/mg 이상, 한층 더 바람직하게는 8.0×10⁷U/mg 이상, 특히 바람직하게는 9.0×10⁷U/mg 이상, 가장 바람직하게는 10.0×10⁷U/mg 이상을 들 수 있다.

여기에서 비활성은 단백질 1mg 당 역가(U/mg)이다. 여기에서 말하는 역가는 마우스 복강내 투여법으로 산출한 마우스에 대한 치사 활성(복강내 투여에 의한 LD50값)이며, 1U = 1LD50이다. 또한, 역가는 마우스의 미정맥 투여법으로 산출해도 좋다. 마우스 미정맥 투여법에 의한 정제 보툴리누스 독소의 역가 측정법은, 일반적으로 사용되는 마우스 복강내 투여법의 대체법이며, 고농도의 정제 보툴리누스 독소를 마우스 미정맥에 투여해서 생존 시간을 조사하고, 미리 검증한 마우스의 생존 시간과 복강내 투여에 의한 LD50값의 회귀직선으로 역가를 산출할 수 있다. 단백질은 자외 흡수 측정법(280nm), Lowry법 또는 BCA법 등으로 측정할 수 있다. 비활성의 구체적인 측정 방법으로서는, 예를 들어 보툴리누스 독소를 액체(보툴리누스 독소액)로서 얻는 경우, 보툴리누스 독소액 1mL 당 LD50값(U)을 측정하고, 얻어진 측정값을 당해 보툴리누스 독소액 1mL 중의 단백질량(mg)으로 나누어 도출할 수 있다.

보툴리누스 독소 제제

본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 정제 보툴리누스 독소는 보툴리누스 제제의 유효 성분으로서 유용하다. 보툴리누스 제제의 용도로서는 임상 응용되고 있는 모든 용도를 들 수 있으며, 예를 들어, 뇌졸중 후 상지/하지 경축, 근육 긴장 이상, 반측 안면 경련, 뇌혈관 장애 후 후유증, 미용 성형 등을 들 수 있다.

보툴리누스 제제에는, 유효 성분인 정제 보툴리누스 독소에 약학적으로 허용되는 추가의 성분이 포함될 수 있다. 이러한 추가의 성분으로서는 부형제, 안정화제, 완충제 등을 들 수 있으며, 부형제로서는 수크로오스, 트레할로오스, 락토오스, 폴리사카라이드 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 수크로오스를 들 수 있다. 안정화제로서는 사람 혈청 알부민, 재조합 사람 혈청 알부민, 카프릴산, 아세틸트립토판, 염화 나트륨, 폴리소르베이트 80, 옥타논산, 아르기닌(L-아르기닌 염산염) 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 재조합 사람 혈청 알부민, L-아르기닌 염산염을 들 수 있다. 완충제로서는 인산이수소 나트륨 수화물, 인산수소 이나트륨 수화물 등을 들 수 있다. 이러한 추가의 성분으로서는 1 또는 복수종을 이용할 수 있다.

보툴리누스 제제의 형태로서는 특별히 한정되지 않으며, 액체여도 좋고 고체여도 좋다. 고체의 보툴리누스 제제는 액체 제제의 동결 건조물, 진공 건조물 또는 분무 건조물일 수 있고, 사용시에 식염수 또는 물에 녹여 액체 제제로서 복원할 수 있다.

실시예

이하에서는, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

[시험예 1]

[1] 보툴리누스 독소의 제조

<실시예 1>

이하의 순서로 보툴리누스 독소를 제조했다.

(A) 보툴리누스균의 생성

정치 배양 1 및 정치 배양 2로 이루어지는 전배양 공정과, 교반 배양에 의한 균체 증식 단계 및 발효 단계로 이루어지는 본배양 공정를 실시했다. 즉, 전배양 공정과 (A1) 본배양 공정의 균체 증식 단계를 실시한 후, (A2) 본배양 공정의 발효 단계를 실시했다.

정치 배양 1에서는 Bacto Proteose Peptone No. 3(돼지 펩톤, 벡톤디킨슨사제)(최종 농도 8w/v%), 효모 추출물(최종 농도 1w/v%), 티오글리콜산 나트륨(최종 농도 0.025w/v%), 및 글루코오스(최종 농도 0.5w/v%)를 포함하는, pH 7.3으로 조정한 배지 20mL에 아포 상태의 유아 보툴리누스증 원인균 Chiba-H(A2형 보툴리누스균 Chiba-H주)로 제작한 시드 균체를 0.5mL 파종하여 35℃에서 OD660이 0.5 이상이 될 때까지 배양했다. 정치 배양 2에서는 상기 조성 및 상기 pH의 배지 400mL에 정치 배양 1의 배양물 20mL를 파종하여 OD660이 2.5 이상이 될 때까지 35℃에서 배양했다.

본배양 공정의 균체 증식 단계에서는 Bacto Proteose Peptone No. 3(돼지 펩톤, 벡톤디킨슨사제)(최종 농도 2w/v%), 효모 추출물(최종 농도 1w/v%), 티오글리콜산 나트륨(최종 농도 0.025w/v%), 및 글루코오스(최종 농도 0.5w/v%)를 포함하는, pH 7.3의 배지 10L에 정치 배양 2의 배양물 약 150mL를 파종하여 질소 가스 분위기 하에서 35℃에서 교반 배양하여 균의 증식이 정점에 도달한 후, 1mol/L의 HCl을 가하여 배지의 pH를 5.8로 낮추고 발효 단계를 실시했다. 발효 단계에서는 필요에 따라 1mol/L의 HCl을 가하여 종료까지 배지의 pH를 5.8로 유지시켰다. 또한, 본배양 공정에 소요된 시간은 약 44시간이었다.

(B) 균체 성분의 제거

상기 본배양 공정으로 얻어진 배양물을 이하의 필터와 막을 이용하여 거친 여과 및 막농축했다. 필터 여과는 본배양 공정으로 얻어진 배양물을 필터 1[3M사제 제타 플러스 필터(05SP)/1020cm²; 구멍 직경 1.0 ~ 10μm 상당], 필터 2[3M사제 제타 플러스 필터 맥시마이저(60SP03A)/1020cm²; 구멍 직경 0.1 ~ 1.0μm 상당], 및 필터 3[싸토리우스사제 자르트포어 2(구멍 직경 0.45μm+0.2μm)/0.1m²]의 순서로 통과시키는 필터 여과로 실시했다. 막여과로 얻어진 여액을 0.1mol/L NaCl과 20mmol/L 구연산을 포함하는 20mmol/L 인산 완충액(pH6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축했다. 이를 통해 얻어진 0.9L의 막농축액을 하베스트액 11이라고도 기재한다. 이어서 0.9L의 반량(0.45L)을 10mmol/L 인산 완충액(pH 6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축했다. 이를 통해 얻어진 막농축액을 하베스트액 12라고도 기재한다.

(C) 엔도뉴클레아제 처리

최종 농도가 1mmol/L이 되는 MgCl₂과 최종 농도가 20U/mL이 되는 벤조나아제(메르크 카게아아 등록 상표)를 하베스트액 12에 첨가하여, pH6.0의 조건 하에서 교반하면서 30℃에서 약 15시간 반응시켰다. 벤조나아제의 첨가 횟수는 1회였다. 그 후, 엔도뉴클레아제 처리물을 3M사제 Zeta Plus Encapsulated Filter를 이용하여 필터 여과시켰다.

(D) 핵산 분해물의 제거

얻어진 여액을 10mmol/L 인산 완충액(pH 6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축하여 핵산 분해물을 제거했다. 또한, 이 막에 의한 핵산 분해물의 제거에는 접선 흐름(tangential flow) 여과를 이용했다. 이를 통해 막농축액을 얻었다.

얻어진 막농축액을 0.2mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 나트륨 (pH 4.2) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축했다. 이들을 통해 얻어진 막농축액을 보툴리누스 독소 단리액 1이라고도 기재한다.

(E) 보툴리누스 독소 복합체의 정제

보툴리누스 독소 단리액 1을 양이온 교환 크로마토그래피에 제공했다. 양이온 교환 담체로서는 SP-Sepharose-fast flow를 이용하여 70×550mm 크기의 칼럼에 담체를 30cm 충전했다. 세정액으로서 0.2mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 나트륨(pH 4.2)을 이용하여 칼럼을 평형화하고 보툴리누스 독소 단리액 1을 적용시켜 용출액으로서 0.7mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 나트륨(pH 4.2)을 이용하여 0.7mol/L NaCl까지 8칼럼 볼륨의 그레디언트 조건에서 용출시켰다. 유속은 약 15mL/분이었다. 얻어진 용출액을 0.2mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 완충액 (pH 6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축하고, 얻어진 농축액을 구멍 직경 0.22μm 필터(코닝사제 보틀 탑 필터, PES제)를 이용하여 더 여과하여 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물을 얻었다.

(F) 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제

얻어진 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물을 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.5) 및 구멍 직경(분획 분자량) 10KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice 50 Hydrosart 10kD, 및 밀리포어사제 펠리콘 XL 울트라셀 10kD)을 이용하여 막농축했다. 그 후, 막농축물을 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 제공했다. 음이온 교환 칼럼 담체로서는 약음이온 교환 담체인 DEAE-Sepharose-fast flow를 이용하여 10×450mm의 칼럼에 담체를 30cm 충전했다. 세정액으로서 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.5)을 이용하여 칼럼을 평형화하고 막농축물을 적용하고 용출액으로서 0.3mol/L NaCl을 포함하는 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.5)을 이용하여 0.3mol/L NaCl까지 10칼럼 볼륨의 그레디언트 조건에서 용출시켰다. 유속은 약 1mL/분이었다. 얻어진 용출액을 구멍 직경 0.22μm 필터(Starlab사제 PES제 주사기 필터)를 이용하여 여과하고 보존제(L-아르기닌 염산염)를 최종 농도가 1w/v%가 되도록 첨가하여 보툴리누스 독소 비-복합체(S독소)의 정제물(이하, S독소 정제물 1이라고도 기재한다)을 얻었다.

<비교예 1>

상기 (C) 공정 및 (D) 공정을 이하의 방법으로 대체한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 보툴리누스 독소 비-복합체(S독소)의 정제물을 얻었다. 구체적으로는, 실시예 1의 (B) 공정에서 얻어진 하베스트액 11(필터 여액)의 나머지 반량 0.45L를 사용하여 이하의 음이온 교환 크로마토그래피, 막농축 및 여과를 실시하고, 그 후, 실시예 1의 (E) 공정 및 (F) 공정을 실시했다.

하베스트액 11을 음이온 교환 크로마토그래피에 제공했다. 음이온 교환 담체로서는 Qsepharose-fast flow를 이용하여 140×500mm의 칼럼에 담체를 10cm 충전했다. 세정액으로서 0.1mol/L NaCl과 20mmol/L 구연산을 포함하는 20mmol/L 인산 완충액(pH 6.0)을 이용하여 칼럼을 평형화하고 실시예 1의 (B) 공정에서 얻어진 하베스트액 11을 적용하고 동일한 세정액을 유속 약 150mL/분으로 흐르게 하고 독소 획분을 흡착시키지 않고 패스쓰루(pass-through) 획분으로서 회수했다. 회수액을, 0.2mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 나트륨(pH 4.2) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축했다. 얻어진 막농축액을 보툴리누스 독소 단리액 1'라고도 기재한다. 또한 실시예 1과 동일한 (E) 공정 및 (F) 공정을 실시하여 보툴리누스 독소 비-복합체(S독소)의 정제물(이하, S독소 정제물 1'라고도 기재한다)을 얻었다.

[2] 정제의 확인

실시예 1에 대해서는 하베스트액 12, 보툴리누스 독소 단리액 1, 및 S독소 정제물 1을 각각 SDS-PAGE 전개하고, 비교예 1에 대해서는 하베스트액 11, 보툴리누스 독소 단리액 1', 및 S독소 정제물 1'를 SDS-PAGE 전개하고, 각각 CBB 염색을 실시하여 보툴리누스 독소의 정제를 확인했다. 얻어진 염색 겔을 도 1(실시예 1) 및 도 2(비교예 1)에 나타낸다. 도 중, A2-NTX(H)는 약 100KDa의 중쇄를 나타내고, A2-NTX(L)는 약 50KDa의 경쇄를 나타낸다.

또한, 도 1에 있어서, 마커의 오른쪽 옆 레인은 본배양액의 배양 상청을 나타내고, 보툴리누스 독소 단리액 1과 S독소 정제물 1 사이의 레인은 왼쪽으로부터 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물, DEAE 크로마토그래피 후의 독소 함유액, DEAE 크로마토그래피 후의 불순물액 1, DEAE 크로마토그래피 후의 불순물액 2를 나타낸다. 도 2에 있어서, 마커의 오른쪽 옆 레인은 본배양액의 배양 상청을 나타내고, 보툴리누스 독소 단리액 1'과 S독소 정제물 1' 사이의 레인은 왼쪽으로부터 음이온 교환 크로마토그래피 후의 불순물액, 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물, 양이온 교환 크로마토그래피 후의 불순물액 1, 양이온 교환 크로마토그래피 후의 불순물액 2, DEAE 크로마토그래피 후의 독소 함유액, DEAE 크로마토그래피 후의 불순물액 1, DEAE 크로마토그래피 후의 불순물액 2, DEAE 크로마토그래피 후의 불순물액 3, DEAE 크로마토그래피 후의 불순물액 4를 나타낸다.

도 1 및 도 2의 대비에서 볼 수 있듯이, 비교예 1에서는 약 75kDa 부근의 불순물이 잔존하고 있는 것에 대해, 실시예 1에서는 당해 불순물이 거의 제외되어 있는 것으로 나타났다.

[3] 정제 효율의 측정

핵산 제거 조작에 의한 정제 효율을 측정했다. 구체적으로는, 실시예 1에 있어서의 정제 효율은 (B) 공정에서 얻어진 하베스트액 12(막농축액) 중의 핵산량에 대한 (D) 공정에서 얻어진 보툴리누스 독소 단리액 1 중의 핵산량의 비율(%)을 산출하고, 100%에서 당해 비율을 제외하여 얻었다. 비교예 1에 있어서의 정제 효율은 (B) 공정에서 얻어진 하베스트액 11(필터 여액) 중의 핵산량에 대한 보툴리누스 독소 단리액 1' 중의 핵산량의 비율을 산출하고, 100%에서 당해 비율을 제외하여 얻었다.

[수학식 1]

실시예 1에서의 핵산 제거 조작에 의한 정제 효율

=100 - {(보툴리누스 독소 단리액 1 중 핵산량/하베스트액 12 중 핵산량)×100}

비교예 1에서의 핵산 제거 조작에 의한 정제 효율

=100 - {(보툴리누스 독소 단리액 1' 중 핵산량/하베스트액 11 중 핵산량)×100}

또한, 핵산량은 Qubit 3.0 플루오로미터(써모피셔사제)를 이용한 ds DNA HS Assay Kit로 측정된 DNA량과, 동일한 기기를 이용한 RNA HS Assay Kit로 측정된 RNA량의 총량으로서 도출했다.

그 결과, 보툴리누스 독소 단리액 1' 중의 핵산량은 보툴리누스 독소 단리액 1 중의 핵산량의 약 2배였다. 따라서, 실시예 1에 있어서의 핵산 제거 조작으로 비교예 1에서의 핵산 제거 조작과 비교하여 현저하게 높은 정제 효율이 달성되었다.

[4] 보툴리누스 독소 수율의 측정

핵산 제거 조작에 의한 보툴리누스 독소 수율을 측정했다. 구체적으로는, 실시예 1에 있어서의 보툴리누스 독소 수율은, (B) 공정에서 얻어진 하베스트액 12(막농축액) 중의 총 독소량에 대한 (D) 공정에서 얻어진 보툴리누스 독소 단리액 1 중의 총 독소량의 비율로서 산출하고; 비교예 1에서의 보툴리누스 독소 수율은, (B) 공정에서 얻어진 하베스트액 11(필터 여액) 중의 총 독소량에 대한 보툴리누스 독소 단리액 1' 중의 총 독소량의 비율로서 산출했다.

[수학식 2]

실시예 1에서의 핵산 제거 조작에 의한 독소 수율

=(보툴리누스 독소 단리액 1 중 총 독소량/하베스트액 12 중 총 독소량)×100

비교예 1에서의 핵산 제거 조작에 의한 독소 수율

=(보툴리누스 독소 단리액 1' 중 총 독소량/하베스트액 11 중 총 독소량)×100

또한, 총 독소량은 하베스트액 11, 하베스트액 12, 보툴리누스 독소 단리 액 1, 보툴리누스 독소 단리액 1' 각각을 이용하여 후술하는 역가 측정법에 준거하여 검체의 조제 및 마우스에의 접종을 실시하여 단위 U(1U = 1LD50)로 하는 값으로서 얻었다.

그 결과, 실시예 1에서의 핵산 제거 조작에 의한 독소 수율은 53.18%, 비교예 1에서의 핵산 제거 조작에 의한 독소 수율은 50.46%이며, 실시예 1은 비교예 1과 비교하여 높은 독소 수율이었다.

[5] 보툴리누스 독소의 측정

이하와 같이 하여 단위 U/mL로 하는 역가를 도출했다.

얻어진 S독소 정제물을 적당히 희석하여 마우스의 미정맥에, 한 마리 당 0.1mL를 접종한 후, 마우스의 생존 시간을 확인했다. 미리 검증한 생존 시간과 복강내 투여에 의한 LD50값과의 회귀직선에서 S독소 정제물 1mL 당 LD50값(U/mL)을 산출했다. 또한, 280nm의 적외선 흡수에서 S독소 정제물 1mL 당 단백질 질량(mg/mL)을 측정했다. S독소 정제물 1mL 당 LD50값(U/mL)을 S독소 정제 물 1mL 당 단백질 질량(mg/mL)으로 나누어 비활성(U/mg)을 도출했다.

그 결과, 실시예 1에서 얻어진 S독소 정제물 1의 비활성은 8.21×10⁷U/mg, 비교예 1에서 얻어진 S독소 정제물 1'의 비활성은 2.59×10⁷U/mg이며, 실시예 1은 비교예 1과 비교하여 비활성이 높은 정제물을 얻을 수 있었다.

[시험예 2]

[1] 보툴리누스 독소의 제조

<실시예 2>

본 실시예에서는 보툴리누스 독소 생성 공정에서 애니멀 프리(animal-free)의 배지를 이용하고 엔도뉴클레아제로서 데나라아제를 이용한 점을 주된 변경점으로 한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 하여 보툴리누스 독소를 제조했다. 구체적으로는, 이하의 순서로 보툴리누스 독소를 제조했다.

(A) 보툴리누스균의 생성

전배양 공정 및 본배양 공정에서의 배지로서, Vegetable Peptone No. 1 (식물 펩톤, 써모피셔사)을 이용한 것, 전배양 공정(정치 배양 1 및 정치 배양 2)에 서의 배양량을 반량으로 하여 정치 배양 1의 배양물 약 10mL를 정치 배양 2의 배지에 파종한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 하여 보툴리누스균을 생성했다.

(B) 균체 성분의 제거

상기 본배양 공정으로 얻어진 배양물을 이하의 필터와 막을 사용하여 거친 여과 및 막농축했다. 필터 여과는 본배양 공정으로 얻어진 배양물을 필터 1[3M사제 제타 플러스 필터(05SP)/1020cm²; 구멍 직경 1.0 ~ 10μm 상당], 필터 2[3M사제 제타 플러스 필터 맥시마이저(60SP03A)/1020cm²; 구멍 직경 0.1 ~ 1.0μm 상당], 및 필터 3[싸토리우스사제 자르트포어 2(구멍 직경 0.45μm + 0.2μm)/0.1m²]의 순서로 통과시키는 필터 여과에 의해 실시했다. 막여과로 얻어진 여액을 0.1mol/L NaCl과 20mmol/L 구연산을 포함하는 20mmol/L 인산 완충액(pH 6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축했다. 또한, 10mmol/L 인산 완충액(pH 6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축했다. 이들을 통해 얻어진 막농축액을 하베스트액 22라고도 기재한다.

(C) 엔도뉴클레아제 처리

엔도뉴클레아제로서 데나라아제(씨-렉타 게엠베하 등록 상표)를 이용하여 반응 시간을 약 19시간으로 한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 하여 엔도뉴클레아제 처리 및 여과를 실시하여 여액을 얻었다.

(D) 핵산 분해물의 제거

얻어진 여액을 10mmol/L 인산 완충액(pH 6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)를 이용하여 약 1시간 막여과하여 핵산 분해물을 제거했다. 또한, 이 막에 의한 핵산 분해물의 제거에는 접선 흐름 여과를 이용했다. 이를 통해 막농축액을 얻었다. 얻어진 막농축액을, 0.2mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 나트륨(pH 4.2) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 약 20분간 막농축했다. 이들을 통해 얻어진 막농축액을 보툴리누스 독소 단리액 2라고도 기재한다.

(E) 보툴리누스 독소 복합체의 정제

보툴리누스 독소 단리액 2를, 실시예 1과 동일하게 하여 양이온 교환 크로마토그래피에 제공했다. 얻어진 용출액을, 0.2mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 완충액(pH 6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축하고, 또한, 구멍 직경 0.22μm 필터(코닝사제 보틀 탑 필터, PES제)를 이용해서 여과하여 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물을 얻었다.

(F) 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제

보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물에서, 실시예 1과 동일하게 하여 보툴리누스 독소 비-복합체(S독소)의 정제물(이하, S독소 정제물 2라고도 기재한다)을 얻었다.

<실시예 3>

본 실시예에서는 보툴리누스 독소 생성 공정의 본배양 공정에서 정치 배양을 실시하고, 엔도뉴클레아제의 첨가를 2회 실시한 것을 주된 변경점으로 한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 하여 보툴리누스 독소를 제조했다. 구체적으로는, 이하의 순서로 보툴리누스 독소를 제조했다.

(A)보툴리누스균의 생성

시드 균체를 0.4mL 파종한 것, 정치 배양 1에 있어서의 배양량을 10mL로 한 것, 정치 배양 2에 있어서의 배양량을 250mL로 한 것, 정치 배양 1의 배양물 약 10mL를 정치 배양 2의 배지에 파종한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 하여 전배양 공정(정치 배양 1 및 정치 배양 2)을 실시했다. 본배양 공정의 균체 증식 단계에서는 Bacto Proteose Peptone No. 3(돼지 펩톤, 벡톤디킨슨사제)(최종 농도 2w/v%), 효모 추출물(최종 농도 1w/v%), 티오글리콜산 나트륨(최종 농도 0.025w/v%), 및 글루코오스(최종 농도 1.0w/v%)를 포함하는, pH 7.3의 배지 10L에 정치 배양 2의 배양물 약 150mL를 파종하여 밀봉 조건하 35℃에서 정치 배양하여 pH 조정을 하지 않고 정치 배양 그대로 자연스럽게 발효 단계로 이행시켰다. 본배양 공정에 소요된 시간은 약 44시간이며, 배양 종료시의 배지의 pH는 약 6.0이었다.

(B) 균체 성분의 제거

상기 본배양 공정으로 얻어진 배양물에 대하여, 0.1mol/L NaCl과 20mmol/L 구연산을 포함하는 20mmol/L 인산 완충액(pH 6.0) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축하지 않은 점을 제외하고 실시예 1과 동일하게 하여 하베스트액 12에 대응하는 하베스트액 32를 얻었다.

(C) 엔도뉴클레아제 처리

최종 농도가 1mmol/L이 되는 MgCl₂과 최종 농도가 50U/mL이 되는 벤조나아제(1회차 첨가분)를 하베스트액 32를 가하여 pH 6.0의 조건 하에서 교반하면서 30℃에서 약 5시간 반응시켰다. 그 후, 벤조나아제(2회차 첨가분)를 50U/mL 더 첨가하여 1회차와 2회차의 벤조나아제의 합계량이 100U/mL이 되도록 하고, 약 12시간(합계 약 13시간) 더 반응시켰다. 그 후, 엔도뉴클레아제 처리물을 3M사제 Zeta Plus Encapsulated Filter를 이용하여 필터 여과시켰다.

(D) 핵산 분해물의 제거

얻어진 여액을 0.2mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 완충액(pH 4.2) 및 구멍 직경(분획 분자량) 30KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice Hydrosart 30kD)을 이용하여 막농축하여 핵산 분해물을 제거했다. 또한, 이 막에 의한 핵산 분해물의 제거에는 접선 흐름 여과를 이용했다. 이를 통해 얻어진 막농축액을 보툴리누스 독소 단리액 3이라고도 기재한다.

(E) 보툴리누스 독소 복합체의 정제

얻어진 보툴리누스 독소 단리액 3을 실시예 1과 동일하게 하여 양이온 교환 크로마토그래피에 제공했다. 용출액으로서 0.7mol/L NaCl을 포함하는 50mmol/L 초산 나트륨(pH 4.2)을 이용하여 0.7mol/L NaCl까지 8칼럼 볼륨의 그레디언트 조건에서 용출시켰다. 얻어진 용출액을 10mmol/L 인산염 완충액(pH 7.5) 및 구멍 직경(분획 분자량) 10KDa의 막(싸토리우스사제 Sartocon Slice 50 Hydrosart 10kD)을 이용하여 막농축하여 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물을 얻었다.

(F) 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제

얻어진 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물을 10mmol/L 인산염 완충액(pH 7.5) 및 구멍 직경(분획 분자량) 10KDa의 막(밀리포어사제 펠리콘 XL 울트라셀 10kD)을 이용하여 막농축하여 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 제공했다. 음이온 교환 칼럼 담체로서는 약음이온 교환 담체인 DEAE-Sepharose-fast flow를 이용하여 10×450mm의 칼럼에 담체를 30cm 충전했다. 세정액으로서 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.5)을 이용하여 칼럼을 평형화하고 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물을 적용하여 용출액으로서 0.3mol/L NaCl을 포함하는 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.5)을 이용하여 0.3mol/L NaCl까지 10칼럼 볼륨의 그레디언트 조건에서 용출시켰다. 유속은 약 1mL/분이었다. 얻어진 용출액에 보존제(L-아르기닌 염산염)을 최종 농도가 1w/v%가 되도록 첨가하여 구멍 직경 0.22μm 필터(Starlab사제 PES제 주사기 필터)를 이용해서 여과하여 보툴리누스 독소 비-복합체(S독소)의 정제물(이하, S독소 정제물 3이라고도 기재한다)을 얻었다.

[2] 정제의 확인

실시예 2에 대해서는 하베스트액 22, 보툴리누스 독소 단리액 2, 및 S독소 정제물 2를 각각 SDS-PAGE 전개하고, 실시예 3에 대해서는 하베스트액 32, 보툴리누스 독소 단리액 3, 및 S독소 정제물 3을 SDS-PAGE 전개하고, 각각 CBB 염색을 실시하여 보툴리누스 독소의 정제를 확인했다. SDS-PAGE 및 염색의 방법은 시험예 1과 동일하다. 얻어진 염색 겔을 도 3(실시예 2) 및 도 4(실시예 3)에 나타낸다. 도 중, A2-NTX(H)는 약 100KDa의 중쇄를 나타내고, A2-NTX(L)는 약 50KDa의 경쇄를 나타낸다.

또한, 도 3에 있어서, 보툴리누스 독소 단리액 2와 S독소 정제물 2 사이의 레인은 왼쪽으로부터 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물, DEAE 크로마토그래피 후의 독소 함유액을 나타낸다. 도 4에 있어서, 하베스트액 32의 왼쪽 옆의 레인은 본배양액의 배양 상청을 나타내고, 보툴리누스 독소 단리액 3과 S독소 정제물 3 사이의 레인은 왼쪽으로부터 SP 크로마토그래피 후의 독소 함유액, 보툴리누스 독소 복합체(M독소)의 정제물, DEAE 크로마토그래피 후의 독소 함유액, DEAE 크로마토그래피 후의 불순물액 1, DEAE 크로마토그래피 후의 불순물액 2를 나타낸다.

도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 2 및 3에서는 불순물이 거의 제외되어 있는 것으로 나타났다.

[3] 보툴리누스 독소 수율의 측정

핵산 제거 조작에 의한 보툴리누스 독소 수율을 측정했다. 구체적으로는, 실시예 2, 3에 있어서의 보툴리누스 독소 수율은, (B) 공정에서 얻어진 하베스트액 22, 32(막농축액) 중의 총 독소량에 대한 (D) 공정에서 얻어진 보툴리누스 독소 단리액 2, 3 중의 총 독소량의 비율로서 산출했다.

[수학식 3]

실시예 2에서의 핵산 제거 조작에 의한 독소 수율

=(보툴리누스 독소 단리액 2 중 총 독소량/하베스트액 22 중 총 독소량)×100

실시예 3에서의 핵산 제거 조작에 의한 독소 수율

=(보툴리누스 독소 단리액 3 중 총 독소량/하베스트액 32 중 총 독소량)×100

또한, 총 독소량은 하베스트액 22, 32, 보툴리누스 독소 단리액 2, 3 각각을 이용하여 전술한 역가 측정법에 준거하여 검체의 조제 및 마우스에의 접종을 실시하여 단위 U(1U=1LD50)로 하는 값으로서 얻었다.

그 결과, 실시예 2에서의 핵산 제거 조작에 의한 독소 수율은 59.71%, 실시예 3에서의 핵산 제거 조작에 의한 독소 수율은 89.68%였다.

[4] 보툴리누스 독소의 측정

단백질 함량을 BCA법으로 측정한 것을 제외하고, 시험예 1과 동일하게, 얻어진 보툴리누스 독소(S독소 정제물 2, 3)의 비활성을 측정했다. 그 결과, 실시예 2에서 얻어진 S독소 정제물 2의 비활성은 10.06×10⁷U/mg이며, 실시예 3에서 얻어진 S독소 정제물 3의 비활성은 6.46×10⁷U/mg이었다.

Claims

(A) 배지 중에서 보툴리누스 독소 생성균에서 보툴리누스 독소를 생성시켜 상기 보툴리누스 독소 유래의 균체 성분 및 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 a를 얻는 공정과,
(B) 상기 혼합물 a를 상기 균체 성분의 제거에 제공하여 핵산 성분과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 b를 얻는 공정과,
(C) 상기 혼합물 b에 엔도뉴클레아제를 첨가하여 핵산 분해물과 보툴리누스 독소를 포함하는 혼합물 c를 얻는 공정과,
(D) 상기 혼합물 c를 핵산 분해물의 제거에 제공하여 보툴리누스 독소 단리액(單離液) d를 얻는 공정,
을 포함하고,
산 침전의 공정을 포함하지 않는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 (C) 공정에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 세라티아균 Serratia marcescens 유래의 엔도뉴클레아제인, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 (C) 공정을, pH 5.8 ~ 6.5의 조건 하에서 실시하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 (C) 공정에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제를 복수회 첨가하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 (D) 공정에 있어서, 상기 핵산 분해물의 제거가 막에 의한 제거를 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
(E) 상기 보툴리누스 독소 분리액 d를, 양이온 교환 크로마토그래피에 제공하여 보툴리누스 독소 복합체의 정제물을 얻는 공정을 더 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
(F) 상기 보툴리누스 독소 복합체의 정제물을, 상기 보툴리누스 독소 복합체에서 무독성 비-HA 단백질이 괴리하는 조건 하에서 음이온 교환 크로마토그래피에 제공하여 보툴리누스 독소 비-복합체의 정제물을 얻는 공정을 더 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
적어도 상기 (A) 공정이 전배양 공정과 본배양 공정을 포함하며, 적어도 상기 전배양 공정을 정치 배양으로 실시하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 전배양 공정과 상기 본배양 공정의 양쪽을 정치 배양으로 실시하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 (A) 공정이,
(A1) pH 6.8 ~ 8.0의 배지 중에서 상기 보툴리누스 독소 생성균의 균체 증식을 실시하는 공정과,
(A2) pH 5.0 ~ 6.5의 배지 중에서 상기 보툴리누스 독소 생성균의 발효를 실시하는 공정,
을 이 순서로 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 (A) 공정에 있어서, 상기 보툴리누스 독소 생성균이 아포의 형태로 보존된 균체의 발아체인, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 (B) 공정에 있어서, 상기 균체 성분의 제거가 필터 여과를 포함하는, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 (F) 공정에 있어서, 상기 조건이 pH 7.3 ~ 8.5인, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 (F) 공정에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 약음이온 교환 크로마토그래피인, 보툴리누스 독소의 제조 방법.
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