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KR102900227B1 - Il-17a, il-17f에 대한 삼중 특이적 항체 및 기타 전염증성 분자 - Google Patents

Il-17a, il-17f에 대한 삼중 특이적 항체 및 기타 전염증성 분자

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KR102900227B1
KR102900227B1 KR1020187034250A KR20187034250A KR102900227B1 KR 102900227 B1 KR102900227 B1 KR 102900227B1 KR 1020187034250 A KR1020187034250 A KR 1020187034250A KR 20187034250 A KR20187034250 A KR 20187034250A KR 102900227 B1 KR102900227 B1 KR 102900227B1
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KR
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알렉산드레 블라디미로비치 카라벨스키
드미트리 발레르예비치 코르쟈빈
타티아나 베니아미노브나 체르노브스카야
알레산드르 발레르비치 그라체브
유리 아이반노비치 바소브스키이
에카데리나 알렉산드로브나 로므코바
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알렉세이 알렉산드로비치 알렉산드로브
엘레나 레오니도브나 모로조바
로만 알렉시비치 이바노브
파벨 안드리비치 이아코브레브
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조인트 스탁 컴퍼니 “바이오케드”
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Abstract

본 발명은 생명 공학 분야에 관한 것으로서, 인간 IL-17A, 인간 IL-17F 및 인간 전염증성(pro-inflammatory) 분자(특히, TNFα)에 고친화적으로 특이적 결합하는 모노클로날 삼중 특이적 결합 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 결합 분자를 코딩하는 DNA 구조물, 관련 발현 벡터 및 생산 방법, 및 상기 결합 분자를 사용하는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

IL-17A, IL-17F에 대한 삼중 특이적 항체 및 기타 전염증성 분자
본 발명은 생명 공학 분야에 관한 것으로서, 인간 IL-17A, 인간 IL-17F 및 인간 전염증성(pro-inflammatory) 분자(특히, TNFα)에 고친화적으로 특이적 결합하는 모노클로날 삼중 특이적 결합 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 결합 분자를 코딩하는 DNA 구조물, 관련 발현 벡터 및 생산 방법, 및 상기 결합 분자를 사용하는 치료 방법에 관한 것이다.
면역 시스템의 주요 기능은 암 병변뿐만 아니라 박테리아 또는 바이러스와 같은 감염으로부터 신체를 보호하는 것이다. 면역 반응은 염증, 즉 면역 세포가 체계적으로 또는 신체의 특정 부위에 축적되는 것을 포함한다. 면역 시스템의 세포는 단핵 세포, 대식세포, 수지상 세포, 호산구, T 세포, B 세포 및 호중구와 같은 여러 형태의 골수 및 림프구 세포를 포함한다. 감염이나 이물질에 대한 반응으로, 면역 세포는 사이토카인(cytokines)으로 알려진 신호 단백질을 분비하며 차례로 면역 세포의 증식, 발달, 분화 및/또는 이동을 조절한다. 어떤 경우에는 면역 반응이 자가 면역 질환과 같은 병리학적 과정을 초래할 수 있다(예를 들어, Abbas et al. (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pa.; Oppenheim and Feldmann (eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, Calif.; von Andrian and Mackay, New Engl J Med 343:1020-1034 (2000); Davidson and Diamond, New Engl J Med 345:340-350 (2001) 참조).
CD4+ T 세포는 면역 반응에 중심적인 역할을 하며 적응성 또는 내재 면역계의 다른 세포를 도와준다. 초기 연구에서는 두 종류의 CD4+ T 세포(Th1과 Th2)가 확인되었다. 최근에는 CD4+ T 세포의 새로운 아집단(subset)인 Th17 세포가 확인되었다. Th17 세포는 적응 면역계(adaptive immune system)의 파생물(offshoot)로 Th1 세포와 Th2 세포가 보호를 제공하지 않는 세포 외 박테리아 및 일부 균류 및 박테리아에 대한 숙주의 보호를 강화하는데 전문이었다.
Th17 세포는 현재 6개의 멤버(IL-17A-F)로 구성된 IL-17 계열의 사이토카인의 새로운 계열을 발견한 맥락에서 확인되었다. IL-17(이전에는 CTLA-8로 불림)은 실질적으로 Th17 세포에 의해 발현되고 IL-17 사이토카인 계열에서 최초의 분자인 IL-17A로 명명되었다. IL-17 패밀리의 서열은 현재 알려진 다른 포유류 단백질과 상동성이 없다; 따라서, IL-17 패밀리는 별도의 사이토카인 패밀리을 구성한다. IL-17F의 결정 구조에 기초하여 확립된 IL-17 패밀리의 구조적 특징은 많은 사이토카인과 유사하다; 구조적 분석은 이종이량체(heterodimer)가 존재할 수도 있음을 암시하지만, 각각의 패밀리 멤버는 동종이량체(homodimer)로서 생산될 수 있다. 보다 최근에는, 활성화된 CD4+ T 세포에 의해 발현된 이종이량체 IL-17A 및 IL-17F가 IL-17R/IL-17RC의 복합체를 통해 신호를 전달한다는 것이 밝혀졌다(Wright J.F. et al., J Immunol 181:2799-2805 (2001)).
인간 IL-17F를 코딩하는 유전자는 인간 IL-17A를 코딩하는 유전자에 인접하여 위치한다(Hymowitz et al., Embo J 20(19):5332-41 (2001)). IL-17A 및 IL-17F는 44% 아미노산 서열 동일성을 갖는 반면, IL-17 패밀리의 다른 구성원은 낮은 서열 동일성(15-27%)을 갖는다. 이것은 IL-17A와 IL-17F가 IL-17 계열의 특별한 하위 군(subgroup)을 형성함을 시사한다(Starnes et al., J Immunol 167(8):4137-40 (2001); Aggarwal and Gurney, J. Leukoc Biol 71(1):1-8 (2002)). IL-17F의 생물학적 효과, 예를 들어, 다양한 세포에서 IL-6, IL-8 및 G-CSF의 생산을 자극하는 능력은 IL-17A의 생물학적 효과와 유사하다는 것이 밝혀졌다. IL-17A와 마찬가지로, IL-17F는 연골 기질의 분비를 유도하고 새로운 연골 기질의 합성을 억제할 수 있다(US 2002/0177188 참조). 따라서, IL-17A와 마찬가지로, IL-17F는 염증성 질환의 병리(pathology)에 기여할 수 있다. 최근 저자들은 IL-17A와 IL-17F가 인터루킨 23(IL-23)에 노출된 T 세포에서 유도됨을 관찰했다(Aggarwal et al., J Biol Chem 278(3):1910-4 (2003)). IL-17A와 IL-17F가 유사한 염색체의 위치 및 유의한 서열 유사성을 갖는 발견 및 IL-17A 및 IL-17F가 특정 자극에 반응하여 동일한 세포 집단에서 유도된다는 사실은 IL-17A 및 IL-17F의 공유 헤테로다이머(covalent heterodimer)를 함유하는 새로운 인간 사이토카인의 확인(identification)을 유도하였다.
또한, IL-17A는 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 및 인터루킨-1 베타(IL-1β)와 상승 작용하여 상당한 염증전(pro-inflammatory) 상태를 달성한다. 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 퇴행성관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염 골다공증(rheumatoid arthritis osteoporosis), 염증성 섬유조직증식(inflammatory fibrosis) (예를 들어 피부경화증(scleroderma), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 및 간경변(cirrhosis)), 치은염(gingivitis), 치주증(periodontosis) 또는 치주염(periodontal diseases), 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases) (예를 들어. 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 염증성 장 질환), 천식(asthma)(알레르기성 천식 포함), 알레르기(allergies), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), 암을 포함하는 다양한 염증성, 면역성 및 증식성 질환을 치료하기 위해, 이들 분자의 길항제인 항체 또는 항원-결합 항체 단편으로 IL-17A의 활성을 감소시키는 것이 제안되었다(예를 들어, US 2003/0166862, WO 2005/108616, WO 2005/051422 및 WO 2006/013107 참조).
TNFα 길항제(antagonists)는 염증을 감소시키고 연골 및 뼈 파괴의 진행을 억제함으로써 관절염을 치료하는 것으로 알려져있다(van den Berg, Arthritis Res 3: 18-26 (2001)). 그러나 환자의 상당 부분이 TNFα 길항제 함유 약물에 대한 부적절한 반응을 보인다. 전임상 연구에 따르면 TNFα와 IL-17A는 관절염의 병리 생리학에서 동일한 특성을 나타낸다. 단독으로 TNFα 및 IL-17A가 염증성 유전자의 발현에 무시할 수 있는 영향을 미치지만, 이들의 조합은 강한 시너지 효과를 이끌어 낸다. TNFα와 IL-17A의 상호 작용은 사이토카인의 발현을 증가시킨다(LeGrand et al., Arthritis Rheum 44:2078-2083 (2001)) and pro-inflammatory chemokines (Chabaud et al., J. Immunol 167:6015-6020 (2001)), and also induces cartilage and bone destruction (Van Bczooijen et al., Ann Rheum Pis 61:870-876 (2002)).
현재 다수의 IL-17A 이중 특이성 항체 및 다른 전-염증성(pro-inflammatory) 분자, 예를 들어 DVD(Abbott) 및 COVA322(Covagen-Janssen)가 있다.
국제 특허 공보 WO 2015/014979에는 IL-17A 및 IL-17A에 대한 2개의 결합 부위 및 TNFα에 대한 2개의 결합 부위를 함유하는 IL-17A 및 TNFα 4가(tetravalent) 이중 특이성 항체가 개시되어 있다. 이러한 항체는 류마티스 관절염에서 염증 및 조직 파괴를 억제하는데 시너지 효과를 나타냈다.
국제 특허 출원 WO 2014/137961은 2개의 폴리 펩티드를 포함하는 IL-17A 및 TNFα 이중 특이적 항체를 개시한다. 이러한 이중 특이적 항체는 열적 및 화학적으로 안정하고, 낮은 응집력을 나타내며, 동시에 IL-17A 및 TNFα에 결합할 수 있다.
미국 특허 제8,496,936호에는 세포 분석 및 생체 내 동물 모델에서 다양한 리간드에 대해 상이한 활성을 나타내는 IL-17A, IL-17F 및 IL-23p19 삼중 특이적 항체가 개시되어 있으며, 안정한 배합 후보 물질을 생성하는데 필요한 물리적-화학적 특성을 나타내지 않았다.
염증 반응 및 자가 면역 질환, 특히 제형(formulation)에서 안정한 항체와 관련하여 IL-17A, IL-17F 및 TNFα 활성을 효과적으로 중화시킬 수 있는 항체의 생산은 여전히 중요하다.
본 발명은 IL-17A, IL-17F 및 TNFα와 같은 전염증성(pro-inflammatory) 분자에 대해 유도된 삼중 특이적 결합 분자를 제공한다. 상기 항체는 류마티스 관절염, 건선 및 건선관절염과 같은 자가 면역 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 항체 치료를 포함하는 이러한 장애에 대한 현재 이용 가능한 치료법과 비교하여, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 단독으로 또는 다른 항염증 및/또는 면역 억제제 조합하여 우수한 임상 반응을 제공할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 IL-17A 및 인간 IL-17-F에 결합하는 제1결합 도메인 및 인간 전염증성(pro-inflammatory) 분자에 결합하는 제2결합 도메인을 포함하는 삼중 특이적(tri-specific) 결합 분자를 제공한다. 특정 실시 예에서, 상기 인간 전염증성(pro-inflammatory) 분자는 인간 TNFα이다. 특정 실시 예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다.
일 실시 예에서, 제1결합 도메인은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 예에서, 제1결합 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 예에서, 제1결합 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인과 동일한 에피토프와 결합하거나 결합하기 위해 경쟁한다. 일 실시 예에서, 제1결합 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 서열이다. 특정 실시 예에서, 제1결합 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시 예에서, 제1결합 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열로 구성된다.
일 실시 예에서, 제1결합 도메인은 인간화된다. 특정 실시 예에서, 제1결합 도메인은 인간화된 VHH이다.
일 실시 예에서, 상기 제2결합 도메인은 다음을 포함하는 결합 도메인과 동일한 에피토프와 결합하거나 또는 결합에 대해 경쟁한다:
·SEQ ID NO: 10 내지 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 13 내지 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
·SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는
·SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일 실시 예에서, 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 실시 예에서, 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 10 내지 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 13 내지 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 실시 예에서, 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 8과 90% 이상 동일한 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO: 9와 적어도 90% 동일한 가변 도메인 또는 이들 모두를 포함한다. 일 실시 예에서, 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 이들 모두를 포함한다. 특정 실시 예에서, 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일 실시 예에서, 제2결합 도메인은 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 분자(scFv), 디아바디, 또는 단일 도메인 항체(dAb)이다.
일 실시 예에서, 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 5와 90% 이상 동일한 중쇄, SEQ ID NO: 6과 적어도 90% 동일한 경쇄 또는 이들 모두를 포함한다. 일 실시 예에서, 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 또는 이들 모두를 포함한다. 특정 실시 예에서, 상기 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.
일 실시 예에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 제1결합 도메인을 본원에 기재된 임의의 제2결합 도메인과 함께 포함하는 삼중 특이적 결합 분자를 제공한다.
일 실시 예에서, 본 발명은 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 제1결합 도메인 및 인간 TNFα에 결합하는 제2결합 도메인을 포함하는 삼중 특이적 결합 분자를 제공하며, 상기 제1결합 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 실시 예에서, 본 발명은 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 제1결합 도메인 및 인간 TNFα에 결합하는 제2결합 도메인을 포함하는 3 특이적 결합 분자를 제공하며, 상기 제1결합 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2결합 도메인은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 실시 예에서, 본 발명은 인간 IL-17A, 인간 IL-17F 및 인간 TNFα에 결합하는 삼중 특이적 결합 분자를 제공하며, 상기 결합 분자는 SEQ ID NO: 5 및 7의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 예에서, 상기 제1결합 도메인 및 상기 제2결합 도메인은 5개 이상(greater than) 아미노산의 펩티드 링커에 의해 연결된다. 특정 실시 예에서, 상기 펩티드 링커의 아미노산 잔기가 G, A, S, P, E, T, D 및 K로부터 선택된다. 특정 실시 예에서, 상기 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 제1결합 도메인은 상기 펩티드 링커를 통해 제2결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다.
일 실시 예에서, 상기 결합 분자는 이소타입 IgG의 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 상기 항체는 예를 들어 이소타입 서브타입 IgG1일 수 있다.
일 실시 예에서, 상기 결합 분자는 돌연변이가 없는 동일한 결합 분자와 비교하여 ADCC 및/또는 CDC를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 FC 영역을 포함한다.
일 실시 예에서, 상기 결합 분자는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다:
a) 10-11M 또는 이하의 IL-17A에 대한 KD;
b) 10-7M 또는 이하의 IL-17F에 대한 KD;
c) 10-11M 또는 이하의 TNFα에 대한 KD;
d) HT1080 세포의 IL-6 분석에서 200ng/mL 이하의 농도에서 IL-17A 및/또는 IL-17A/TNFα의 활성을 50% 이상(예를 들어 60%, 70%, 80% 또는 90%) 저해함.
e) HT080 세포에 의한 IL-17A 의존성 IL-6 방출을 억제함;
f) HT1080 세포에서 IL-6의 생성을 억제함;
g) WEHI-13VAR 세포에서 100ng/mL 이하의 농도에서 TNFα 의존성 세포 독성을 50% 이상(예를 들어 60%, 70%, 80% 또는 90%) 저해함;
h) 토끼, 마우스 또는 기니아 피그 TNFα에 결합하지 않음;
i) 동시에 IL-17A 및 TNFα에 결합함;
j) 사이노몰거스(cynomolgus) IL-17A 및 TNFα에 결합함;
k) 인간 혈청에서 37℃에서 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7일간(예를 들어 배양의 7일 이후) 배양한 후에도 안정적임;
l) 생체 내(in vivo)에서 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일(예를 들어 12일) 이상의 반감기를 갖음;
m) 생체 내 관절염 모델에서 전염증성(pro-inflammatory) 효과를 갖음; 및
l) 생체 내에서 IL-17 및 TNFα의 활성을 억제함.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 삼중 특이적 결합 분자 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제1결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제2결합 도메인의 중쇄, 경쇄 또는 이들 모두를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다:
· 본원에 기술된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제1결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
· 본원에 기술된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제2결합 도메인의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
· 본원에 기술된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제1결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
· 위의 임의의 조합.
일 실시 예에서, 분리된 핵산 분자는 제1결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2결합 도메인의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 펩티드 링커를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 분리된 핵산 분자는 예를 들어 SEQ ID NO: 4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 SEQ ID NO: 6을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 펩티드 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 임의로 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 예에서, 상기 펩티드 링커의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16이다. 일 실시 예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 7을 인코딩한다.
일 실시 예에서, 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 인코딩한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 발현 조절 서열을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한하기를 포함하는 숙주 세포를 제공한다:
· 본원에 기술된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제1결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
· 본원에 기술된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제2결합 도메인의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
· 본원에 기술된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제1결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
특정 실시 예에서, 숙주 세포는 SEQ ID NO: 5를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 SEQ ID NO: 7을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 숙주 세포를 제공하는 단계, 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 생성된 상기 결합 분자를 분리하는 단계를 포함하는 본원에 기술된 임의의 삼중 특이적 결합 분자의 제조 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 삼중 특이적 결합 분자 또는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시 예에서, 상기 환자는 IL-17A, IL-17F 또는 TNFα에 의해 매개되는 장애를 갖는다. 특정 실시 예에서, 본 발명은 환자의 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선(psoriasis) 또는 건선관절염(psoriatic arthritis)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 환자에게 본원에 기재된 임의의 삼중 특이적 결합 분자 또는 약학 조성물 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 방법은 항염증제 또는 면역 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 위의 치료 방법 중 하나에서, 환자는 인간일 수 있다.
도 1은 3 특이적 항-IL-17A/항-IL-17F/항-TNFα의 생산의 개략도를 도시한다.
도 2는 IL-17A-His6-FLAG의 단백질 서열을 나타낸다.
도 3은 정제된 IL-17A-His6-FLAG 단백질을 나타낸 겔이다.
도 4는 정제된 대조군 항-IL-17A 항체를 나타낸 겔이다.
도 5는 라마 글로마(Lama glama)의 면역화에 의해 생산된 항 인간 IL-17A 항체의 역가(titer)를 나타낸 그래프이다.
도 6은 항체 Fab 단편의 파아지 디스플레이를 위한 pH5 플라스미드를 도시한 지도이다.
도 7은 대장균(E. coli)에서 항체 Fab 단편의 분비 발현을 위한 pLL-Fab 플라스미드를 도시한 지도이다.
도 8은 면역 파아지 라이브러리로부터 항-IL17-A 단편을 선발한 후 특이적 및 비특이적 항원과 폴리클로날 파아지의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 9는 인간 IL-17A 및 IL-17F에 특이적인 고친화성(high affinity) VHH 도메인(VHH17; SEQ ID NO: 4) 및 그 모(parent) VHH 도메인(VHH; SEQ ID NO: 17)의 아미노산 서열을 나타낸다. 인간화(humanization) 과정에서 치환된 아미노산은 굵은 글씨체로 표시된다. CDR은 회색으로 강조 표시된다. 또한, 도 9는 항-인간 TNFα 항체(RU 2303604)의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열(각각 SEQ ID NO: 18 및 9)을 나타낸다.
도 10은 항-IL-17A/항-IL-17F/항-TNFα 삼중 특이적 항체의 일부로 사용된 항-TNFα 항체 변이체의 CDR에서의 돌연변이 표를 나타낸다(위에서 아래로, SEQ ID NO: 19-32).
도 11은 상이한 항-IL-17A/항-IL-17F/항-TNFα 삼중 특이적 항체 변이체의 일시적인 발현 결과를 나타낸다.
도 12는 WEHI-13VAR 세포를 사용한 세포 독성(cytotoxic) TNFα 의존성 실험에서 상이한 항-IL-17A/항-IL-17F/항-TNFα 삼중 특이적 항체 변이체의 항-TNFα 활성의 비교 분석을 나타낸다. 최대 억제 활성을 갖는 변이체(Variant)는 회색으로 표시된다.
도 13은 WEHI-13VAR 세포를 사용한 세포 독성(cytotoxic) TNFα 의존성 실험에서 세포 상해 성 TNFα에서의 3개의 항-IL-17A/항-IL-17F/항-TNFα 삼중 특이적 변이체(Mab12, Mab31 및 Mab32)의 항-TNFα 활성의 그래프를 도시한다.
도 14는 WEHI-13VAR 세포를 사용한 세포 독성(cytotoxic) TNFα 의존성 실험에서 항-IL-17A/항-IL-17F/항-TNFα 삼중 특이적 항체 BCD-121 및 2 종의 상업적 단일 특이적 항-TNFα 항체 아달리무맙(Adalimumab) 및 인플릭시맙(Infliximab)에 대한 항-TNFα 활성의 그래프를 나타낸다.
도 15는 양성 대조군(단일 특이적 항-IL-17A 항체 BCD-085) 및 음성 대조군(항-TNFα 항체 아달리무맙)과 비교하여 HT1080 세포에서 IL-17A-의존 IL-6 생산의 기능을 차단하는 BCD-121의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 16은 양성 대조군(단일 특이적 항-IL-17A 항체 BCD-085) 및 음성 대조군(항-TNFα 항체 아달리무맙)과 비교하여` HT1080 세포에서 이중 IL-17A/TNFα 의존성 IL-6 생성을 차단하는 BCD-121의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 17은 Jurkat-tm TNFα c1.8 세포 배양에 기초한 3가지의 상업적 단일 특이적 항-TNFα 항체(아달리무맙, 인플릭시맙 및 심지아(Cimzia))와 비교하여 항체 BCD-121로부터의 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 나타내는 그래프이다.
도 18은 Jurkat-tm TNFα c1.8 세포 배양에 기초한 3가지의 상업적 단일 특이적 항-TNFα 항체(아달리무맙, 인플릭시맙 및 심지아(Cimzia))와 비교하여 항체 BCD-121로부터의 보체 의존성 세포 독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)을 나타내는 그래프이다.
도 19는 Octet RED96을 사용하여 BCD-121을 IL-17A 및 인간 TNFα 모두에 동시에 샌드위치 결합시킨 센소그램(sensogram) 이다.
도 20은 인간 IL-17 패밀리에서 상이한 리간드에 결합하는 BCD-121 항체에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 상이한 orthologous TNFα 단백질에 결합하는 BCD-121 항체에 대한 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.
도 22는 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)을 이용한 BCD-121 단백질 응집체의 열 안정성을 나타낸 그래프이다. 상기 그래프는 4개의 완충 용액에 대한 평균 입자 크기(Z-평균) 대 온도를 나타낸다.
도 23은 4개의 상이한 완충 용액에서 Thermostress 50℃를 사용하여 장기 노출 동안 BCD-121의 열 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 24는 최적화된 정제 방법에 따라 안정한 세포주 생산자의 배양액으로부터 얻은 BCD-121의 순도 분석을 나타낸 것이다. 패널 A: 환원 조건(+β-ME). 패널 B: 비 환원 조건(-β-ME). 레인 2와 3: 각각 10μg과 40μg이 적용.
도 25는 ELISA에 의한 순수한 인간 혈청에서의 BCD-121 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 26은 M. fascicularis 콜라겐 유도성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 모델에서 BCD-121의 약동력학(pharmacokinetics)적 특성을 나타내는 그래프이다.
도 27은 10, 50 또는 100mg/kg의 투여량으로 단일 SC 투여 후 원숭이에서 BCD-121의 ELISA에 의한 약동력학(pharmacokinetics)적 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 28은 BCD-121이 HT1080 세포에서 IL-6의 생산을 유도하는 IL-17A 및 TNFα의 능력을 이중 차단할 수 있음을 보여주는 그래프이다. 20ng/ml의 IC50에서, BCD-121은 갖는 단일 특이성 항-TNF Ab1, 항-TNF Fab-PEG 또는 항-IL17 Ab(IL-17에 대한 단클론 항체)보다 IL-6 방출을 더 강력하게 차단한다.
도 29는 Zetasizer nano ZSP에 의한 흔들기 스트레스 응집 분석(shaking stress aggregation assay)(20 rpm에서 20 회)을 나타내는 그래프이다. 이 데이터는 BCD-121이 고농도 포뮬레이션에서 피하 주사(100mg/ml 이상)에 사용될 수 있는 고 가용성의 삼중 특이적 분자임을 보여준다.
정의와 일반적인 기술
본 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 포함한다. 예시적인 방법 및 물질이 아래에 기재되어 있지만, 본원에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고 문헌으로 인용된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 다수의 문헌이 본원에 인용되었지만, 이 인용 문헌은 이들 문헌 중 어느 것도 이 분야의 통상적인 지식의 일부를 구성한다는 인정을 구성하지는 않는다.
또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성(hybridization)과 관련하여 사용되는 명명법은 당해 기술 분야에서 널리 공지되고 일반적으로 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 통상적으로 또는 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 명세서에 따라 수행된다.
본 명세서 및 실시 예 전체에 걸쳐, "갖는" 및 "포함하는"이라는 단어 또는 "가지는", "갖고 있는", "포함하는" 또는 "포함하고 있는"과 같은 변형은 명시된 정수(integer) 또는 정수 그룹을 포함하지만 다른 정수 또는 정수 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
항체-관련 정의
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "IL-17A", "IL-17F" 및 "TNFα"는 각각 인간 IL-17A, IL-17F 및 TNFα를 나타낸다.
인터루킨-17("IL-17")은 20-30 kD 글리코실화된 동형이량체(homodimeric) 단백질이다. IL-17A 인간 유전자는 155 아미노산 단백질을 코딩하며, 19 아미노산 신호 서열 및 136 아미노산 성숙 세그먼트(mature segment)를 갖는다. IL-17F 인간 유전자는 163 아미노산 단백질을 암호화하며, 이는 30 아미노산 신호 서열 및 133 아미노산 성숙 세그먼트를 갖는다. 인간 IL-17A 폴리펩티드 서열은 Uniprot Accession No. Q16552로 입수 가능하다. 인간 IL-17F 폴리펩티드 서열은 Uniprot Accession No. Q96PD4로 입수 가능하다.
본원에 사용된 용어 "종양 괴사 인자 알파" 또는 "TNFα"는 Pennica et al., Nature 312:721(1984) or in Aggarwal et al., JBC 260:2345(1985)에 기술된 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 TNFα 분자를 나타낸다.
"면역 반응", "자가 면역 반응" 및 "자가 면역성 염증"이란 용어는 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구 및 용해성 거대 분자 또는 (병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암세포가 침입한 인체에서 선택적 손상, 파괴 또는 제거를 유발하는 항체, 사이토카인, 및 보체(complement), 또는 면역 또는 병리학적 염증의 경우, 정상적인 인간 세포 또는 조직을 포함하여) 간에서 생성되는 상기 세포의 작용을 의미한다.
용어 "결합 분자(binding molecule)"는 항체 및 면역글로불린을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체"(Ab) 또는 "면역글로불린"(Ig)은 2개의 중(H)쇄(약 50-70 kDa) 및 2개의 경(L)쇄(약 25 kDa)를 포함하는 4량체를 의미하며, 이황화 결합으로 상호 연결되어 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역은 "프레임 워크 영역"(FR)이라고 불리는 보다 보완적인 영역이 산재해 있는 "상보성 결정 영역"(CDRs)이라 불리는 초 가변성 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR(본원에서 H-CDR은 중쇄로부터의 CDR을 나타내고; 및 L-CDR은 경쇄로부터의 CDR을 나타냄) 및 4개의 FR 세그먼트로 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 각 영역에 대한 아미노산의 할당은 IMGT® 정의에 따를 수 있다(Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003); or the definitions of Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)); Chothia & Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987); or Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).
일부 실시 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 면역 글로불린은 중쇄 및 경쇄 이외에 VHH 도메인 또는 "나노 바디"를 포함할 수 있다. 이 단일 도메인은 중쇄 항체(hcAb)의 항원-결합 부분으로, 경쇄가 없고 라마와 알파카와 같은 낙타 종에서 전형적으로 발견된다.
본원에 사용된 항체(또는 단순히 "항체 부분")의 "항원-결합 부위"라는 용어는 항원(예를 들어, 인간 IL-17A, 인간 IL-17F, TNFα 또는 그의 일부)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분 또는 단편을 의미한다. 전장 항체(full-length antibody)의 특정 단편이 항체의 항원 결합 기능을 수행할 수 있다는 것이 밝혀졌다. "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편: VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편: 힌지(hinge) 영역에서 디설파이드 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체(dAb) 단편; 및 (vi) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편 VL 및 VH의 2개의 도메인이 별도의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 재조합 방법을 사용하여 VL 및 VH 영역 쌍(pair)이 1가 분자(단일 사슬 Fv (scFv)로 알려짐)를 형성하도록 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 VH 및/또는 VL을 포함하는 항원-결합 분자가 있다. VH의 경우, 상기 분자는 또한 CH1, 힌지(hinge), CH2 또는 CH3 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 - 결합 부위"라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 디아바디(diabodies)와 같은 다른 형태의 단일 사슬 항체도 포함된다. 디아바디는 2가, 이중 특이적 항체로 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리 펩티드 사슬 상에 발현되지만, 동일한 사슬 상의 두 도메인 사이의 쌍을 허용하는 매우 짧은 링커를 사용하여, 이로써 상기 도메인은 또 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게된다.
Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 전체 항체의 파파인(papain) 또는 펩신 분해(pepsin digestion)와 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자(immunoadhesion molecules)는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주로부터 발현되는 항체를 지칭하며, 상기 뉴클레오타이드 서열은 세포와 자연적으로 결합하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "변이체(variant)" 항체는 모(parental) 항체 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가, 결실 및/또는 치환됨에 의해 모 서열과 다른 아미노산 서열을 가진 분자를 의미한다. 바람직한 실시 예에서, 변이체 항체는 모 항체에 대해 적어도 하나 이상(예를 들어, 1개 내지 약 12개, 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개, 10개, 11개, 또는 12개; 및 일부 실시 예에서, 1 내지 12개)의 아미노산 첨가, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 예에서, 아미노산의 첨가, 결실 및/또는 치환은 변이체 항체의 CDR에 존재한다. 변이체 항체의 서열에 관한 동일성 또는 상동성을, 서열들을 정렬하고, 필요하다면 간격을 도입하여 최대 퍼센트의 서열 동일성을 달성하도록 한 후, 모 항체의 잔기와 동일한 변이체 항체의 서열에 존재하는 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의한다. 상기 변이체 항체는 모 항체가 결합하는 것과 같은 항원 또는 바람직하게는 에피토프에 결합하는 능력을 유지하거나, 일부 실시 예에서는 모 항체의 유사한 특성보다 우수한 하나 이상의 성질 또는 생물학적 활성을 나타낸다. 예를 들어, 변이체 항체는 모 항체와 비교하여 더 강한 결합 친화도, 보다 긴 반감기, 낮은 IC50를 포함할 수 있고 또는 항원의 생물학적 활성을 저해하는 능력을 증가시킬 수 있다. 본원에서 특히 중요한 변이체 항체는 모 항체와 비교하여 생물학적 활성이 약 2배(바람직하게는 약 5배, 10배 또는 20배) 증가하는 항체이다.
용어 "키메라 항체"는 가장 넓은 의미에서 하나의 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역, 일반적으로, 부분적으로는 인간 기원의 것이고 부분적으로는 비-인간 기원의 것인, 즉, 비-인간 동물, 예를 들어 마우스 또는 그 밖의 설치류, 또는 라마(llama) 또는 알파카와 같은 낙타(camelid)로부터 유래한 것일 수 있다. 키메라 항체는 인간 항-항체 반응, 예를 들어 뮤린 항체의 경우, 인간 항-마우스 항체 반응의 위험성을 감소시키는데 있어서 비-인간 항체보다 바람직하다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변 영역 서열이 뮤린이고 불변 영역 서열이 인간인 것이다. 키메라 항체의 경우, 비인간 부분은 항체를 인간화하기 위해 추가로 변형될 수 있다.
용어 "인간화"는 항체가 전체적으로 또는 부분적으로 비-인간 기원의 것, 예를 들어 관심 있는 항원으로 마우스를 면역화시켜 수득된 뮤린 또는 라마 항체 또는 그러한 뮤린 또는 라마 항체에 기반한 키메라 항체인 경우, 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 및 불변 영역에 있는 특정 아미노산을 대체시켜 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화할 수 있다는 사실을 의미한다. 항체가 표적 항원과 상호 작용하는 특이성은 주로 중쇄 및 경쇄의 6개 CDR에 위치한 아미노산 잔기에 존재한다. 따라서 CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열에 이식된, 특정 천연 생성 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성, 또는 보다 일반적으로 주어진 아미노산 서열을 갖는 임의의 특정 항체를 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다. 결과적으로, 비 - 인간 항체를 "인간화" 할 수 있고 원래 항체의 결합 특이성 및 친화성을 실질적으로 유지할 수 있다. 비록 면역원성, 그리고 이에 의해 특정 항체의 인간 항-항체 반응을 정밀하게 예측할 수는 없지만, 비-인간 항체는 인간 항체보다 더욱 면역원성인 경향이 있다. 외부(예, 설치류 또는 낙타) 불변 영역이 인간 기원의 서열로 대체된 키메라 항체는 일반적으로 완전히 외래 기원의 항체보다 면역원성이 작고, 치료 항체의 경향은 인간화된 또는 완전히 인간화된 경향이 있다. 따라서, 키메라 항체 또는 비 - 인간 기원의 다른 항체는 인간 항 - 항체 반응의 위험을 감소시키기 위해 인간화될 수 있다. 외래(일반적으로 설치류 또는 낙타) 불변 영역이 인간 기원의 서열로 대체된 키메라 항체는 완전한 외래 기원의 항체보다 일반적으로 덜 면역원성인 것으로 나타났고, 치료용 항체에서의 추세는 인간화 또는 완전한 인간 항체를 향하고 있다. 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 그 밖의 항체는 인간 항-항체 반응의 위험성을 감소시키 위해 인간화될 수 있다.
키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 변형을 포함한다. 상보성 결정 영역(CDR)의 일부인 아미노산 잔기는 통상적으로 인간화와 관련하여 변경되지 않을 것이나, 특정 경우에, 예를 들어 글리코실화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파테이트 이성질화 부위 또는 요망되지 않는 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하기 위해 개별적인 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. N-결합된 글리코실화는 올리고사카라이드 사슬이 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 부착함에 의해 일어나며, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-글리코실화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를, 바람직하게는 보존적 치환에 의해 상이한 잔기로 돌연변이시킴에 의해 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 요인에 의해 일어날 수 있다. 아스파라긴 잔기는 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때 특히 탈아미드화되기 쉽고, Asn-Ala과 같은 다른 디펩티드 서열에서는 적은 정도로 탈아미드화된다. 따라서, 그러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly이 CDR 서열에 존재할 때, 전형적으로 관여된 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적 치환에 의해 그 부위를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
항체 서열을 인간화하는 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, Almagro & Fransson, Front Biosci . 13:1619-1633 (2008)으 리뷰 참조. 한 가지 일반적으로 사용되는 방법은, 예컨대 뮤린-유래된 키메라 항체의 경우 뮤린 가변 영역 유전자에 대한 인간 생식계열 유전자 대응부를 동정하고 뮤린 CDR 서열을 이러한 프레임워크로 그래프트하는 것을 포함하는 CDR 그래프팅이다. CDR 그래프팅은 케이뱃 CDR 정의에 기반할 수 있으나, 최근 간행물(Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol . 64:210-225 (2007))은 IMGT® 정의 (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org)가 인간화의 결과를 향상시킬 수 있음을 제안하였다(Lefranc et al., Dev . Comp Immunol. 27:55-77 (2003) 참조). CDR 그래프팅은 CDR이 수득되는 모 항체와 비교하여 CDR 그래프트된 비-인간 항체의 결합 특이성 및 친화성, 및 이에 따라 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다. 모 항체의 결합 특이성 및 친화성을 재확립하기 위하여, 일반적으로 프레임 워크 영역에서 CDR 그래프트된 항체의 선택된 위치에 복귀 돌연변이 (때로는 "프레임 워크 수리"라고 함)가 도입될 수 있다. 가능한 복귀 돌연변이를 위한 위치의 확인은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용 가능한 정보를 이용하여 수행될 수 있다. 복귀 돌연변이의 후보인 아미노산 잔기는 전형적으로 항체 분자의 표면에 위치한 것들인 반면, 숨겨지거나 낮은 정도의 표면 노출을 지니는 잔기는 일반적으로 변경되지 않을 것이다. CDR 그래프팅 및 복귀 돌연변이에 대안적인 인간화 기법은 비-인간 기원의 표면 노출되지 않은 잔기를 유지하는 한편 표면 잔기를 인간 잔기로 변경시키는 리서피싱(resurfacing)이다.
특정 경우에, 표적 에피토프에 대한 결합 친화성을 향상시키기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이것은 "친화성 성숙화"로 알려져 있고, 예를 들어 항체의 인간화가 감소된 결합 특이성 또는 친화성을 초래하고 복귀 돌연변이 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 향상시킬 수 없는 상황에서, 임의로 인간화와 함께 수행될 수 있다. 다양한 친화성 성숙화 방법, 예를 들어 문헌 Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 기재된 시험관 내 스캐닝 포화 돌연변이 발생 방법 및 문헌 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998)의 단계식 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당 분야에 공지되어 있다.
"분리된 단백질", "분리된 폴리 펩티드 "또는 "분리된 항체"라는 용어는 그 기원이나 어원의 근원으로 인해 (1) 자연 상태에서 동반되는 자연적으로 관련된 성분과 결합되어 있지 않거나, (2) 동일한 종 유래의 다른 단백질이 실질적으로 없거나, (3) 다른 종 유래의 세포에 의해서 발현되거나, (4) 자연 상태에서 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 자연적으로 유래하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성되거나 화학적으로 합성된 폴리펩티드는 자연적으로 관련된 성분으로부터 "분리된" 것이다. 또한, 단백질은 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여 분리를 통해 자연적으로 관련된 성분이 실질적으로 없도록 제공될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "생식 세포계(germline)"는 생식 세포를 통해 부모로부터 자손으로 전달된 항체 유전자 및 유전자 단편의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 의미한다. 생식 세포 서열은 성숙한 B 세포에서 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 구별되며, 이들은 B 세포 성숙 과정에서 재조합 및 초돌연변이(hypermutation)에 의해 변형되었다. 특정 생식 세포 서열을 "이용하는" 항체는 다른 생식 세포 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열보다 더 밀접하게 특정되는 그 생식 세포주 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과 정렬하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 갖는다.
용어 "친화도"는 항원과 결합분자, 예를 들어 항체 간의 인력의 척도를 지칭한다. 항원에 대한 항체의 고유 친화도는 통상적으로 특정 항체-항원 상호작용의 결합 친화도 평형 상수(KD)로서 표현된다. 항체는 KD가 ≤ 1 mM, 바람직하게, ≤ 100nm일 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. KD 결합 친화도 상수는, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(BIAcoreTM) 또는 바이오-레이어 간섭굴절측정법(Bio-Layer Interferometry)에 의해, 예를 들어, Bio-Rad로부터의 ProteOnTM XPR36 SPR 시스템 또는 OctetTM 시스템을 이용하여 측정될 수 있다.
용어 "koff"는 특정 항체 항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. koff 해리 속도 상수는, 예를 들어, OctetTM 시스템을 이용한 바이오-레이어 간섭굴절법에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이중 특이적 결합 분자와 같은 관련 분자)에 특이적으로 결합하는 항원의 부분(결정인자)을 지칭한다. 에피토프성 결정 인자는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑, 예를 들어, 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지고, 일반적으로 특정 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 "선형"이거나 "입체구조(conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질(예를 들어, 항원)과 상호작용하는 분자(예를 들어, 항체) 간의 모든 상호작용 지점은 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형으로 일어난다. 입체구조 에피토프에서, 상호작용 지점은 일차 아미노산 서열에서 서로 분리되어 있는 단백질 상의 아미노산 잔기를 가로질러 일어난다. 항원 상의 요망되는 에피토프가 결정되면, 당해 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 그 에피토프에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, 항체 또는 다른 결합 분자의 생성 및 특성 규명은 바람직한 에피토프에 대한 정보를 해명할 수 있다. 이러한 정보로부터, 항원과의 결합을 위해 경쟁하는 결합 분자를 찾기 위하여 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는, 즉 경쟁 연구를 수행함으로써 결합 분자를 경쟁적으로 스크리닝 하는 것이 가능하다.
당업계에 공지된 방법을 이용하여 항체 또는 다른 결합 분자가 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자와 함께 IL-17A, IL-17F 또는 TNFα와 동일한 에피토프에 결합하거나 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 일 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 포화 조건하에서 IL-17A, IL-17F 또는 TNFα에 결합하고, 이어서 상기 표적 항원에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정한다. 시험 항체가 표준 삼중 특이적 결합 분자와 동시에 표적 항원에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 표준 삼중 특이적 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나 시험 항체가 표적 항원에 동시에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프, 또는 삼중 특이적 결합 분자에 의해 결합된 에피토프에 매우 근접한 에피토프에 결합한다. 이 실험은 ELISA, RIA, BIACORETM, 바이오-레이어 간섭굴절측정법 또는 유세포 분석을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자가 또 다른 결합 분자와와 교차-경쟁하는지 시험하기 위해, 상기 기재된 경쟁 방법을 두 방향으로 이용할 수 있고, 즉, 공지된 항체가 시험 항체를 차단하는지 및 그 반대인지를 결정할 수 있다. 그러한 교차-경쟁 실험은, 예를 들어, IBIS MX96 SPR 기계 또는 OctetTM 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.
일 실시 예에서, 본 발명의 결합 분자는 모노클로날 항체이다. 본원에서 사용된 두문자어 "mAb"는 단클론 항체, 즉 세포의 개별 클론 집단(clonal population)에 의해 합성되고 분비되는 항체를 의미한다. 클론 집단은 불멸화된 세포의 클론 집단일 수 있다. 일 실시 예에서, 클론 집단의 불멸화된 세포는 일반적으로 면역화된 동물의 개별 B 림프구와 림프구 종양의 개별 세포가 융합하여 만들어지는 하이브리드 세포-하이브리도마(hybridoma)이다. 하이브리도마는 조작된 세포 유형이며 자연에서 발생하지 않는다.
항체의 클래스(이소타입) 및 서브 클래스는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브 클래스는 항체의 특정 클래스 및 서브 클래스에 특이적인 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 항체는 상업적으로 이용 가능하다. 상기 클래스와 하위 클래스는 ELISA, Western Blot 및 기타 기술로 결정할 수 있다. 대안으로, 클래스 및 서브 클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역의 전부 또는 일부를 시퀀싱함으로써, 그들의 아미노산 서열을 면역 글로불린의 다양한 클래스 및 서브 클래스의 공지된 아미노산 서열과 비교함으로써, 항체의 클래스 및 서브 클래스를 결정함으로써 결정될 수 있다.
"전-염증성 분자"라는 용어는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬, 부갑상선 호르몬, 티록신, 인슐린, 프로인슐린, 릴랙신(relaxin), 프로릴랙신(prorelaxin), 당단백질 호르몬, 예를 들어, 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH), 간 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 프로락틴, 태반 락토겐, 종양 괴사 인자, 뮐러관-억제 물질, 마우 스 고나도트로핀-관련 펩티드, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자, 인테그린, 트롬보포이에틴(TPO), 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 전환 성장 인자(TGF), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II, 에리트로포이에틴(EPO), 골유도 인자, 인터페론(IFN), 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어, 대식세포-CSF(M-CSF), 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF), 과 립구-CSF(G-CSF), 인터루킨(IL), 예를 들어, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL15, IL-12, IL17A, IL-22, 및 IL-23, 종양 괴사 인자 및 백혈병 억제 인자(LIF) 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 폴리 펩티드 인자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 "전-염증성 분자"라는 용어는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양으로부터 분리된 단백질 및 상기 단백질에 대한 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
삼중 특이적 항- TNFα /항-IL-17A/항-IL-17F 결합 분자
본 발명은 IL-17A, IL-17F 및 IL-17A 또는 IL-17F가 아닌 전-염증성 분자(예를 들어, TNFα)에 대해 유도된 삼중 특이적 결합 분자를 제공한다. 특정 실시 예에서, 삼중 특이적 결합 분자는 삼중 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다. 상기 결합 분자는 IL-17A, IL-17F 및 전-염증성 분자(예를 들어, TNFα)에 결합하는 도메인을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 결합 분자는 IL-17A 및 IL-17F에 결합하는 제1결합 도메인 및 TNFα에 결합하는 제2결합 도메인을 포함한다. 일 실시 예에서, IL-17A 및 IL-17F에 대한 결합 도메인은 분리될 수 있다.
일 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 항-TNFα/항-IL-17A/항-IL-17F 결합 분자는 인간 IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합하기 위해 경쟁하거나, 상기 항원(들)의 동일한 에피토프(들)에 결합하는 것으로, VHH는 하기의 서열을 포함한다;
·SEQ ID NOs: 1-3; or
·SEQ ID NO: 4.
일 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 항-TNFα/IL-17A/IL-17F 결합 분자는 인간 TNFα에 결합하기 위해 경쟁하거나, 상기 항원(들)의 동일한 에피토프(들)에 결합하는 것으로, 항체는 하기의 서열을 포함한다;
·SEQ ID NOs: 10-15;
·SEQ ID NOs: 8 and 9; or
·SEQ ID NOs: 5 and 6.
특정 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 항-TNFα/IL-17A/IL-17F 결합 분자는 인간 IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합하기 위해 경쟁하거나, 상기 항원(들)의 동일한 에피토프(들)에 결합하는 것으로, VHH는 하기의 서열을 포함한다;
·SEQ ID NOs: 1-3; or
·SEQ ID NO: 4;
그리고 인간 TNFα에 결합하기 위해 경쟁하거나, 상기 항원(들)의 동일한 에피토프(들)에 결합하는 것으로, 항체는 하기의 서열을 포함한다;
·SEQ ID NOs: 10-15;
·SEQ ID NOs: 8 and 9; or
·SEQ ID NOs: 5 and 6.
일 실시 예에서, 삼중 특이적 결합 분자는 항-IL-17A/항-IL-17F VHH 도메인을 포함한다. 특정 실시 예에서, 상기 항-IL-17A/항-IL-17F VHH 도메인은 인간화 되었다. 일부 실시 예에서, 상기 항-IL-17A/항-IL-17F VHH 도메인은 SEQ ID NO: 1의 중쇄 CDR1(H-CDR1) 아미노산 서열, SEQ ID NO: 2의 중쇄 CDR2(H-CDR2) 아미노산 서열, SEQ ID NO: 3의 중쇄 CDR3(H-CDR3) 아미노산 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 VHH 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 3의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 VHH 도메인은 SEQ ID NO: 4와 서열이 60% 이상, 예를 들어 SEQ ID NO: 4와 적어도 60%, 70% 또는 80% 동일하다. 일 실시 예에서, 상기 VHH 도메인은 SEQ ID NO: 4와 적어도 90% 동일한 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 4와 적어도 90% 또는 99% 동일하다. 특정 실시 예에서, 상기 VHH 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다.
일 실시 예에서, 삼중 특이적 결합 분자는 항-인간 TNFα 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다. 특정 실시 예에서, 항-인간 TNF-알파 항체는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 부분(예를 들어, 인간화된 Fab)이다.
일 실시 예에서, 항-인간 TNFα 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 10의 H-CDR1 아미노산 서열, SEQ ID NO: 11의 H-CDR2 아미노산 서열, SEQ ID NO: 12의 H-CDR3 아미노산 서열 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 10 내지 12의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 8과 적어도 60%, 예를 들어, SEQ ID NO: 8과 적어도 60%, 70% 또는 80% 동일한 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%, 예를 들어, SEQ ID NO: 8과 적어 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 특정 실시 예에서, 상기 VH는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다. 상기 VH는 이소타입 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자의 중쇄 불변 도메인(CH)에 결합될 수 있다. 특정 실시 예에서, 상기 CH는 이소타입 IgG, 예를 들어 이소타입 서브타입 IgG1, IgG2a 또는 b, IgG3 또는 IgG4이다. 특정 실시 예에서, 상기 CH는 이소타입 서브타입 IgG1이다.
일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 중쇄(HC)는 SEQ ID NO: 5와 서열이 적어도 60%, 예를 들어, SEQ ID NO: 5와 적어도 60%, 70% 또는 80% 동일하다. 일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 중쇄(HC)는 SEQ ID NO: 5와 서열이 적어도 90%, 예를 들어, SEQ ID NO: 5와 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 실시 예에서, HC는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다.
일 실시 예에서, 항-인간 TNFα 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 13의 경쇄 CDR1(L-CDR1) 아미노산 서열, SEQ ID NO: 14의 CDR2(L-CDR2) 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15의 CDR3(L-CDR3) 아미노산 서열 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 13 내지 15의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 9와 적어도 60%, 예를 들어, SEQ ID NO: 9와 적어도 60%, 70% 또는 80% 동일한 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 9와 적어도 90%, 예를 들어, SEQ ID NO: 9와 적어 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시 예에서, 상기 VL는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다.
일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 경쇄(LC)는 SEQ ID NO: 6과 서열이 적어도 60%, 예를 들어, SEQ ID NO: 6과 적어도 60%, 70% 또는 80% 동일하다. 일 실시 예에서, 상기 항-인간 TNFα 항체의 경쇄(LC)는 SEQ ID NO: 6과 서열이 적어도 90%, 예를 들어, SEQ ID NO: 6과 적어 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 실시 예에서, LC는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다.
일 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 직접적으로 또는 링커를 통해 항-TNFα 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 부분)의 중쇄 또는 경쇄에 결합된 항-IL-17A/항-IL-17F 결합 도메인(예를 들어, VHH 도메인)을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 결합 분자는 융합 분자(fusion molecule)를 형성하기 위해 항-TNFα 항체의 경쇄에 링커를 통해 결합된 항-IL-17A/항-IL-17F VHH 도메인을 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 링커는 SEQ ID NO: 16와 서열이 적어도 60% 동일하고, 예를 들어 SEQ ID NO: 16과 적어도 60%, 70% 또는 80% 동일하다. 일 실시 예에서, 상기 링커는 SEQ ID NO: 16와 서열이 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 16의 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 실시 예에서, 상기 링커는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다. 일 실시 예에서, 상기 융합 분자는 SEQ ID NO: 7과 서열이 적어도 60% 동일하고, 예를 들어 SEQ ID NO: 7과 적어도 60%, 70% 또는 80% 동일하다. 일 실시 예에서, 융합 분자는 SEQ ID NO: 7과 서열이 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 7과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 실시 예에서, 융합 분자는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다.
일부 실시 예에서, 상기 삼중 특이적 결합 분자는 상기 기재된 중쇄 중 임의의 하나 및 상기 기재된 경쇄 중 임의의 하나, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 항-TNFα 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시 예에서, 상기 삼중 특이적 결합 분자는 상기 기재된 항-IL-17A/항-IL-17F 결합 도메인 중 임의의 하나를 추가로 포함한다. 특정 실시 예에서, 상기 삼중 특이적 결합 분자는 상기 기재된 항-TNFα 결합 도메인 중쇄 중 임의의 하나와 조합하여 상기 기재된 융합 분자 중 임의의 하나를 포함한다.
여기에 기술된 방법으로 얻은 삼중 특이적 결합 분자의 클래스는 다른 클래스 또는 서브 클래스로 전환될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, VL 또는 VH를 코딩하는 핵산 분자는 CL 또는 CH를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않도록 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 분리된다. 이어서 VL 또는 VH를 코딩하는 핵산 분자는 상이한 면역글로불린 분자 클래스 유래의 CL 또는 CH를 코딩하는 핵산 서열에 작동되게 결합된다. 이것은 전술한 바와 같이 CL 또는 CH 사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이었던 결합 분자는 IgG로 클래스 스위칭될 수 있다. 또한, 상기 클래스 스위칭(class switching)은 하나의 IgG 서브 클래스를 다른 서브 클래스로, 예를 들어, IgG1에서 IgG2로 변환하는데 사용될 수 있다. 원하는 이소타입을 포함하는 본 발명의 결합 분자를 생산하는 바람직한 방법은 결합 분자의 중쇄를 암호화하는 핵산 및 결합 분자의 경쇄를 암호화하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 중쇄의 가변 도메인을 얻는 단계, 원하는 이소타입의 중쇄의 불변 도메인과 중쇄의 가변 영역을 결찰시키는 단계, 세포에서 경쇄 및 결찰된 중쇄를 발현시키는 단계, 및 원하는 이소타입을 갖는 결합 분자를 수집하는 단계를 포함한다
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있지만, 전형적으로 IgG 이소타입, 예를 들어, IgG 서브 클래스 IgG1, IgG2a 또는 b, IgG3 또는 IgG4를 포함한다. 일 실시 예에서, 상기 결합 분자는 IgG 서브 클래스 IgG1의 항체이다.
일 실시 예에서, 삼중 특이적 결합 분자는 Fc 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다수의 상이한 Fc 돌연변이가 공지되어 있고, 이러한 돌연변이는 변경된 이펙터 기능을 제공한다. 예를 들어, 많은 경우에, 예를 들어, 리간드/수용체 상호작용이 요망되지 않거나 항체-약물 컨쥬게이트의 경우에, 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 것이다. 이펙터 기능을 감소시키기 위해 돌연변이되는 것이 바람직할 수 있는 Fc 영역 아미노산 위치는 위치 228, 233, 234 및 235 중 하나 이상을 포함하고, 이때 아미노산 위치는 카밧 넘버링 체계(Kabat numbering scheme)에 따라 넘버링된다. 일부 실시 예에서, 상기 삼중 특이적 결합 분자는 돌연변이가 없는 동일한 결합 분자와 비교하여 ADCC 또는 CDC를 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 Fc 영역을 포함한다.
특정 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된, 보다 큰 면역접합 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역접합 분자의 예는 테트라머 scFv 분자를 제조하기 위해 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) 및 이가 및 바이오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위해 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov et al., Mol . Immunol . 31:1047-1058 (1994))을 포함한다. 다른 예는 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 관심 항원에 특이적으로 결합하는 면역접합체 (immunoadhesin)를 제조하기 위해 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 도입되는 경우를 포함한다. 이러한 실시 예에서, CDR(들)은 보다 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 도입될 수 있거나, 다른 폴리펩티드 사슬에 공유 결합될 수 있거나, 비공유적으로 도입될 수 있다.
다른 실시 예에서, 다른 폴리펩티드에 결합된 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역접합체가 제조될 수 있다. 특정 실시 예에서, 단지 삼중 특이적 결합 분자의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 결합된다. 특정 실시 예에서, 삼중 특이적 결합 분자의 VH 도메인은 제1폴리펩티드에 결합되며, 삼중 특이적 결합 분자의 VL 도메인은 항원-결합 부위를 형성시키기 위해 VH 도메인 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있는 방식으로 제1폴리펩티드와 회합하는 제2폴리펩티드에 결합된다. 다른 바람직한 실시 예에서, VH 도메인은 VH 도메인 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다(예를 들어, 단일쇄 항체). VH-링커-VL 항체는 이후에 관심 폴리펩티드에 결합된다. 또한, 2개(또는 그 이상)의 단일쇄 항체가 서로 결합된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 사슬 상에 이가 또는 다가 항체를 형성시키고자 하는 경우에 또는 이중 특이적 항체를 생성시키고자 하는 경우에 유용하다.
단일쇄 항체(scFv)를 형성시키기 위해, VH- 및 VL-인코딩 DNA 단편은 VH 서열 및 VL 서열이 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결된 VL 도메인 및 VH 도메인을 지닌, 인접한 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록, 가요성 링커를 인코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 인코딩하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, Bird et　al., Science 242:423-426 (1988); Huston et　al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883 (1988); and McCafferty et　al., Nature 348:552-554 (1990) 참조. 단일쇄 항체는 단지 단일 VH 및 VL이 사용되는 경우에 일가, 2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우에 이가, 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우에 다가일 수 있다.
다른 실시 예에서, 다른 변형된 항체는 삼중 특이적 결합 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디(kappa body)" (Ill et　al., Protein Eng . 10:949-57 (1997)), "미니바디(minibody)" (Martin et　al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)), "디아바디"(Holliger et　al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448 (1993)), 또는 "자누신(Janusin)" (Traunecker et　al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) 및 Traunecker et　al., Int . J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992))은 본 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 다른 분자(예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질)로 유도체화되거나 여기에 결합될 수 있다. 일반적으로, 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 부분)는 IL-17A, IL-17F 및/또는 TNFα 결합이 유도체화 또는 표지화에 의해 악영향을 받지 않도록 유도체화된다. 이에 따라, 본 발명의 결합 분자는 본원에 기술된 완전한 형태 및 변형된 형태의 삼중 특이적 결합 분자 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들어, 다른 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 약학적 제제, 및/또는 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와 결합 분자의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 (화학적 커플링, 유전학적 융합, 비공유 회합 또 는 다른 방법에 의해) 기능적으로 결합될 수 있다.
유도체화된 결합 분자의 한 유형은 2개 이상의 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체를 생성시키기 위해 동일하거나 상이 한 유형)를 가교시킴으로써 생산된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이 드록시석신이미드 에스테르)에 의해 분리된 2개의 별개의 반응성 기를 갖는 헤테로이작용성이거나 호모이작용성(예를 들어, 디석신이미딜 수베레이트)인 것을 포함한다. 이러한 링커는, 예를 들어, Pierce Chemical Company, Rockford, IL.로부터 입수 가능하다.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기와 같은 화학적 기로 유도 체화될 수 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특징을 개선시키기 위해, 예를 들어, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 삼중 특이적 결합 분자는 또한 표지될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "표지(label)" 또는 "표지된(labeled)"은 결합 분자에 다른 분자의 혼입을 지칭한다. 일 실시 예에서, 표지는 검출 가능한 마커, 예를 들어, 방사선표지된 아미 노산의 도입 또는 마킹된 아비딘(예를 들어, 광학적 방법 또는 비색법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유한 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 모이어티의 폴리펩티드에 대한 부착이다. 다른 실시 예에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예를 들어, 약물 컨쥬게이트 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 사용될 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 예는 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시 페라제, 알칼린 포스파타제), 화학발광 마커, 바이오티닐기, 2차 리포터(secondary reporter)에 의해 인지되는 사전 결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자성 제제(magnetic agent), 예를 들어, 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예를 들어, 백일해 독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시 예에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)에 의해 부착된다.
특정 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 중성 형태(쯔비터 이온 형태를 포함함) 또는 양으로 또는 음으로 하전된 종으로서 존재할 수 있다. 일부 실시 예에서, 항체는 약학적으로 허용되는 염을 형성하기 위해 반대이온과 착물화될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 반대이온을 포함하는 착물을 지칭하며, 여기서, 반대이온은 약학적으로 허용되는 무기 및 유기산 및 염기로부터 유도된다.
약학적으로 허용 가능한 무기 염기에는 금속성 이온이 포함된다. 금속성 이온에는 적절한 알칼리 금속염, 알칼리토 금속염 및 기타 생리학적으로 허용가능한 금속 이온이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 무기 염기로부터 유래되는 염에는 해당 보통 원자가의 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 코발트, 니켈, 몰리브덴, 바나듐, 망가니즈, 크로뮴, 셀레늄, 주석, 구리, 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 제2망가니즈 염, 제1망가니즈, 칼륨, 루비듐, 나트륨 및 아연이 포함된다.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 약학적으로 허용 가능한 산 부가 염은 하기 산으로부터 제조될 수 있다. 상기 산은 포름산, 아세트산, 아세트아미도벤조산, 아디프산, 아스코르브산, 붕산, 프로피온산, 벤조산, 캄포산, 탄산, 시클람산, 데히드로콜산, 말론산, 에데트산, 에틸술푸르산, 펜디조산, 메타인산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 타닌산, 시트르산, 질산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 엽산, 푸마르산, 프로피온산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 염산, 히드로브롬산, 히드로아이오딘산, 리신, 이소시트르산, 트리플루오로아세트산, 팜산, 프로피온산, 안트라닐산, 메실산, 오로트산, 옥살산, 옥살아세트산, 올레산, 스테아르산, 살리실산, 아미노살리실산, 실리케이트, p-히드록시벤조산, 니코틴산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산, 술폰산, 메탄술폰산, 인산, 포스폰산, 에탄술폰산, 에탄디술폰산, 암모늄, 벤젠술폰산, 판토텐산, 나프탈렌술폰산, 톨루엔술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 술파닐산, 황산, 질산, 아질산, 황산 모노메틸 에스테르, 시클로헥실아미노술폰산, β히드록시부티르산, 글리신, 글리실글리신, 글루탐산, 카코딜레이트, 디아미노헥산산, 캄포술폰산, 글루콘산, 티오시안산, 옥소글루 타르산, 피리독살 5-포스페이트, 클로로페녹시아세트산, 운데칸산, N-아세틸-L-아스파르트산, 갈락타르산 및 갈 락투론산을 포함한 산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약학적으로 허용되는 유기 염기에는 트리메틸아민, 디에틸아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디벤질아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민(N-메틸글루카민), 프로카인, 시클릭 아민, 4차 암모늄 양이온, 아르기닌, 베타인, 카페인, 클레미졸, 2-에틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄디아민, 부틸아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 에틸글루카민, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이미다졸, 이소프로필아민, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피리딘, 피리독신, 네오디뮴, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 메틸아민, 타우린, 콜레이트, 6-아미노-2-메틸-2-헵탄올, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산, 스트론튬, 트리신, 히드라진, 페닐시클로헥실아민, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산, 비스(2-히드록시에틸)아미노-트리스(히드록시메틸)메탄, N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산, 1,4-피페라진디에탄술폰산, 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산, 1,3-비스[트리스(히드록시메틸)메틸아미노]프로판, 4-모르폴린프로판술폰산, 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산, 2-[(2-히드록시-1,1-비스(히드록시메틸)에틸)아미노]에탄술폰산, N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산, 4-(N-모르폴리노)부탄술폰산, 3-(N,N-비스[2-히드록시에틸]아미노)-2-히드록시프로판술폰산, 2-히드록시-3-[트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판술폰산, 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-(2-히드록시프로판술폰산), 피페라진-1,4-비스(2-히드록시프로판술폰산) 2수화물, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진프로판술폰산, N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄술폰산), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판술폰산, N-트리스(히드록시메틸)메틸-4-아미노부탄술폰산, N-(1,1-디메틸-2-히드록시에틸)-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산, 2-(시클로헥실아미노)에탄술폰산, 3-(시클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판술폰산, 3-(시클로헥실아미노)-1-프로판술폰산, N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산, 4-(시클로헥실아미노)-1-부탄술폰산, N-[트리스(히드록시메틸)메틸]글리신, 2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올, 및 트로메타몰이 포함된다.
일 실시 예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체 분자는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 항-TNFα 항체, 및 상기 항체에 (직접 또는 링커를 통해) 연결된 항-IL-17A/항-IL-17F VHH 를 포함한다. 항-IL-17A/항-IL-17F VHH는 그의 N-말단 또는 C-말단에 의해 항-TNFα 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 특정 실시 예에서, 항-IL-17A/항-IL-17F VHH는 항-TNFα 항체의 경쇄의 N-말단에 연결된다. 본원에 기술된 임의의 이러한 융합은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, Ahmad et al., Clinical and Developmental Immunology 2012, Article ID 980250 (2012) 참조. 특정 실시 예에서, 항-TNFα 항체는 링커, 보다 바람직하게는 펩티드 링커에 의해, 가장 바람직하게는 단백질 분해 절단 부위(proteolytic cleavage site)가 없는 펩티드 링커에 의해 항-IL-17A/항-IL-17F VHH에 연결된다. 일부 실시 예에서, 링커의 아미노산 잔기는 G, A, S, P, E, T, D 및 K로부터 선택된다. 일부 실시 예에서, 링커는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다.
핵산 분자 및 벡터
본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자 및 서열을 제공한다. 일부 실시 예에서, 상이한 핵산 분자는 삼중 특이적 결합 분자의 제1도메인 및 제2도메인 아미노산 서열을 인코딩한다. 제1도메인 및/또는 제2도메인이 중쇄 및 경쇄를 포함하는 경우, 일부 실시 예에서, 상이한 핵산은 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. 다른 실시 예에서, 동일한 핵산 분자는 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. 특정 실시 예에서, 핵산 분자는 제1 및 제2도메인의 아미노산 서열(예를 들어 중쇄 및 경쇄 서열)의 임의의 조합을 인코딩할 수 있다. 특정 실시 예에서, 핵산 분자는 제1결합 도메인의 아미노산 서열 및 제2결합 도메인의 경쇄 아미노산 서열을 인코딩할 수 있으며, 선택적으로 둘을 결합시키는 임의의 펩티드 링커 서열을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 기술하지 않는 한 이의 보체(complement)를 포함한다. 이에 따라, 특정 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 이의 보체 서열을 갖는 이의 보체 가닥을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 지칭되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 적어도 10개의 염기인 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 개질된 형태를 의미한다. 이러한 용어는 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 언급된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 1-16로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특정 실시 예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4-9로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%동일한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 핵산 서열의 맥락에서 용어 "서열 동일성"은 최대 일치(correspondence)를 위해 정렬될 때 2개의 서열에서 동일한 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 대개 적어도 약 18개의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로, 적어도 약 24개의 뉴클레오티드, 통상적으로, 적어도 약 28개의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로, 적어도 약 32개의 뉴클레오티드, 및 바람직하게, 적어도 약 36, 48개 이상의 뉴클레오티드의 신장(stretch) 이상일 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 당해 분야에 공지된 여러 상이한 알고리즘이 존재한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 FASTA, Gap 또는 Bestfit를 이용하여 비교될 수 있으며, 이는 Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG)(Madison, Wisconsin)의 프로그램이다. 예를 들어, 프로그램 FASTA2 및 FASTA3을 포함하는 FASTA는 조회 서열과 검색 서열 간의 최상의 중첩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol . 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol . Biol . 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol . Biol . 276:71-84 (1998); 본원에서 참고로 포함됨). 달리 명시하지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘에 대한 기본 파라미터들이 사용된다. 예를 들어, 핵산 서열들 간의 퍼센트 서열 동일성은 이의 기본 파라미터(6의 단어 크기 및 스코어링 매트릭스를 위한 NOPAM 인자)를 갖는 FASTA를 이용하거나 GCG Version 6.1에 제공된 바와 같은 이의 기본 파라미터를 갖는 Gap을 이용하여 결정될 수 있으며, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
일 실시 예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 16에서 선택된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 또한 상기 뉴클레오티드 서열의 임의의 조합을 포함 할 수 있다. 일 실시 예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시 예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 4 및 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시 예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 4, 6 및 16을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시 예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 7을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시 예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 5를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
임의의 상기 실시 예에서, 핵산 분자들은 분리될 수 있다.
추가 실시 예에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 뉴클레오타이드 서열을 발현시키기에 적합한 벡터를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 여기에 연결된 다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 실시 예에서, 벡터는 플라스미드, 즉, 추가적인 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 DNA의 원형의 이중 가닥 조각이다. 일부 실시 예에서, 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 일부 실시 예에서, 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포(예를 들어, 복제 및 에피솜 포유동물 벡터의 박테리아 기원을 갖는 박테리아 벡터)에서 자율 복제가 가능하다. 다른 실시 예에서, 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시에 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순하게, "발현 벡터")로서 지칭된다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 삼중 특이적 결합 분자 또는 그의 일부 아미노산 서열(예를 들어, 제1 및/또는 제2결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄 서열) 중 임의의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 이의 프로브를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 삼중 특이적 결합 분자 또는 그의 일부를 생산하는 임의의 공급원으로부터 분리될 수 있다. 특정 실시 예에서, 본 발명의 핵산 분자는 분리되기보다는 합성될 수 있다.
일부 실시 예에서, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터의 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인프레임으로 결합된 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 제1 또는 제2도메인으로부터의 VH 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터의 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인 프레임으로 결합된 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 제1 또는 제2도메인으로부터의 VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 실시 예에서, 제1 또는 제2결합 도메인의 중쇄(VH) 및/또는 경쇄(VL)의 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 전장 항체 유전자로 "전환"될 수 있다. 일 실시 예에서, VH 도메인 또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는, VH 세그먼트가 벡터 내에서 CH 세그먼트(들)에 작동 가능하게 결합되고/거나 VL 세그먼트가 벡터 내에서 CL 세그먼트에 작동 가능하게 결합되도록, 각각 중쇄 불변(CH) 도메인 또는 경쇄 불변(CL) 도메인을 이미 인코딩하는 발현 벡터로의 삽입에 의해 전장 항체 유전자로 전환된다. 다른 실시 예에서, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 CH 도메인 및/또는 CL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자에 VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 연결시킴으로써, 예를 들어, 라이게이션시킴으로써 전장 항체 유전자로 전환된다. 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자는 이후에 이들이 도입된 세포로부터 발현될 수 있다.
핵산 분자는 대량의 삼중 특이적 결합 분자를 재조합적으로 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자는 또한 본원에 기술된 바와 같은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 이중 특이적 항체, 단일쇄 항체, 면역접합체, 디아바디, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 특이적 아미노산 서열을 위한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용된다. 예를 들어, 핵산은 그 삼중 특이적 결합 분자 부분(예를 들어 가변 도메인)을 인코딩하는 추가적인 핵산 분자를 분리시키기 위해 사용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서 또는 진단 방법에서의 프로브로서 사용될 수 있다. 일부 실시 예에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시 예에서, 올리고뉴클레오티드는 삼중 특이적 결합 분자의 고도의 가변 도메인으로부터 기인한 것이다. 일부 실시 예에서, 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 CDR들 중 하나 이상의 모두 또는 일부를 인코딩한다.
다른 실시 예에서, 핵산 분자 및 벡터는 돌연변이된 삼중 특이적 결합 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 삼중 특이적 결합 분자의 결합 성질을 변경시키기 위해, 제1및/또는 제2결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, L-17A, IL-17F, 및/또는 TNFα와 관련하여, 돌연변이는 삼중 특이적 결합 분자의 KD를 증가시키거나 감소시키기 위해, koff를 증가시키거나 감소시키기 위해, 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해 CDR들 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 다른 실시 예에서, 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 제1 또는 제2 결합 도메인에 상응하는 항체에서의 생식 계열과 비교하여 변경되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 구성된다. 돌연변이는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역, 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 바람직한 실시 예에서, 돌연변이는 가변 도메인에서 구성된다. 일부 실시 예에서, 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서의 생식 계열과 비교하여 변경되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 구성된다.
다른 실시 예에서, 프레임워크 영역(들)은 얻어진 프레임워크 영역(들)이 상응하는 생식 계열 유전자의 아미노산 서열을 갖도록 돌연변이 된다. 돌연변이는 삼중 특이적 결합 분자의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 00/09560호 참조). 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한 삼중 특이적 결합 분자의 면역원성을 변경시키기 위해 및/또는 다른 분자에 대한 공유 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하기 위해 이루어질 수 있다. 본 발명에 따르면, 삼중 특이적 결합 분자는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역들 중 임의의 하나 이상 또는 불변 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 전사 및 번역 조절 서열과 같은 필수적인 발현 조절 서열에 유전자가 작동 가능하게 결합되도록 발현 벡터에, 상술된 바와 같이 얻어진, 제1 및 제2결합 도메인의 부분 또는 전장 서열(예를 들어, 상기 결합 도메인이 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 서열)을 인코딩하는 DNA를 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래된 에피솜 등을 포함한다. DNA는 벡터 내의 전사 및 번역 조절서열이 상기 DNA의 전사 및 번역을 조절하는 이의 의도된 기능을 제공하도록 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 양립 가능하도록 선택될 수 있다. 제1 및 제2결합 도메인의 부분 또는 전장 서열(예를 들어, 상기 결합 도메인이 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 서열)은 별도의 벡터에 삽입될 수 있다. 일 실시 예에서, 상기 DNA의 임의의 조합이 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 상기 DNA는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 블런트 단부 라이게이션(blunt end ligation))에 의해 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
편리한 벡터는, 상술된 바와 같이, 임의의 VH 서열 또는 VL 서열이 용이하게 삽입되고 발현되도록, 공학처리된 적절한 제한 부위를 갖는 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 인코딩하는 벡터이다. 그러한 벡터의 HC- 및 LC-인코딩 유전자는 관련 mRNA를 안정화시킴으로써 전체 항체 단백질 수율을 향상시킬 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열은 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터 부위의 측면에 있으며, RNA 스플라이싱이 발생할 곳을 결정한다. 인트론 서열의 위치는 항체 사슬의 가변 또는 불변 영역에 있거나, 다중 인트론이 사용되는 경우 가변 및 불변 영역 둘 모두에 있을 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 다운스트림의 고유 염색체 부위에서 일어날 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 면역글로불린 사슬의 아미노 말단에 인 프레임으로 결합되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 지닐 수 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 변형되는 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예를 들어, 레트로바이러스 LTR, 시토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40, SV40)(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter; AdMLP))로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서, 폴리오마(polyoma) 및 강한 포유동물 프로모터, 예를 들어, 고유 면역글로불린 및 액틴 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열의 추가 설명을 위하여, 예를 들어, 미국특허 제5,168,062호, 제4,510,245호 및 제4,968,615호가 참조된다. 프로모터 및 벡터의 설명을 포함하는 식물에서 항체를 발현시키는 방법 뿐만 아니라 식물의 형질전환이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 미국특허 제6,517,529호 참조). 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예를 들어, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선택 가능한 마커 유전자를 지닐 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 미국특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 통상적으로, 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에 약물, 예를 들어, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선택 가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhft-숙주 세포에서 사용하기 위한), neo 유전자(G418 선택을 위한), 및 글루타메이트 합성효소 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현 조절 서열"은 라이게이션되는 코딩 서열의 발현 및 처리를 달성하는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 요망될 때, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하다; 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함한다; 진핵생물에서, 일반적으로 이러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 최소로, 발현 및 처리를 위해 필수적으로 존재하는 모든 성분들을 포함하도록 의도되고, 또한 존재하는 것이 유리한 추가적인 성분, 예를 들어, 리더 서열(leader sequence) 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
숙주 세포 및 삼중 특이적 결합 분자 생산 방법
본 발명의 추가적인 실시 예는 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태의 일 실시 예는 삼중 특이적 결합 분자를 발현시킬 수 있는 재조합 숙주 세포를 제공하고, 삼중 특이적 결합 분자의 발현을 위해 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양시키고, 얻어진 삼중 특이적 결합 분자를 분리시키는 것을 포함하는, 본원에서 정의된 바와 같은 삼중 특이적 결합 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포에서 상기 발현에 의해 형성된 삼중 특이적 결합 분자는 본원에서 "재조합 삼중 특이적 결합 분자"로 지칭된다. 본 발명은 또한 이러한 숙주 세포의 자손 세포, 및 이에 의해 형성된 삼중 특이적 결합 분자를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 본 발명은, 예를 들어, 상술된 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 제1결합 도메인및/또는 제2결합 도메인의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포 뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 개질이 돌연변이 또는 환경적 영향 중 어느 하나로 인해 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로, 부모 세포와 일치하지 않지만, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
삼중 특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 트랜스펙션(transfection)을 위해 사용될 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의한 것일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란-매개 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리 브렌-매개 트랜스펙션, 원형질 융합, 전기천공, 리포솜 중에 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵에 DNA의 직접 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 미국특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호, 및 제4,959,455호 참조). 식물 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 아그로박테리윰-매개 형질전환, 유전자총법 형질전환, 직접 주입, 전기천공 및 바이러스 형질전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
발현을 위한 숙주로서 입수 가능한 포유동물 세포주는 당해 분야에서 널리 공지되어 있고, 미국 표준 균주 배양 수집소(American Type Culture Collection; ATCC)로부터 입수 가능한 다수의 무한증식 세포주를 포함한다. 이러한 것은 다른 것들 중에서, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 Freestyle 세포(Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 그린 몽키 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 세포주가 높은 발현 수준을 갖는 지를 결정함에 의해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주에는 곤충 세포주, 예를 들어, Sf9 또는 Sf21 세포가 있다. 삼중 특이적 결합 분자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 상기 결합 분자는 숙주 세포를, 숙주 세포에서 상기 결합 분자의 발현을 가능하게 하거나 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지에 결합분자의 분비를 가능하게 하는데 충분한 시간 동안 배양시킴으로써 생산된다. 삼중 특이적 결합 분자는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 식물 숙주 세포는 예를 들어, 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 좀개구리밥(duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 대장균(E.coli) 및 스트렙토마이세스 종을 포함한다. 효모 숙주 세포는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
또한, 생산 세포주로부터의 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 발현은 다수의 공지된 기술을 이용하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정 조건하에서 발현을 향상시키기 위한 일반적인 방법이다. 상기 GS 시스템은 EP 특허 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 및 0 338 841와 관련하여 전부 또는 일부 논의되어 있다.
상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현된 삼중 특이적 결합 분자가 서로 상이한 당화 패턴을 가질 가능성이 있다. 그러나 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 삼중 특이적 결합 분자는 결합 분자의 당화 상태와 무관하게, 그리고, 보다 일반적으로, 번역후 개질(들)의 존재 또는 부재와는 무관하게, 본 발명의 일부이다.
삼중 특이적 결합 분자는 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, IL-17A, IL-17F 및/또는 TNFα 또는 이들의 임의의 조합에 결합하는 도메인은 (예를 들어, 화학적 단백질 합성, 재조합 발현 방법, 하이브리도마 기술 등을 사용하여) 개별적으로 제조될 수 있고 다음 직접적으로 또는 링커를 통해 서로 화학적으로 부착될 수 있다. 화학적으로 결합하는 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 부분)의 수단은 당업자에게 잘 알려져있다. 폴리 펩티드는 전형적으로 다양한 작용기를 함유한다; 카르복실산(COOH) 또는 유리 아민(-NH2) 그룹, 이는 상응하는 폴리 펩티드 상의 적절한 작용기 또는 링커와의 반응에 이용 가능하다. 항체는 또한 추가의 반응성 작용기를 노출시키거나 부착시키기 위해 유도체화될 수 있으며, Rockford 111의 Pierce Chemical Company로부터 입수 가능한 것과 같은 하나 이상의 링커 분자의 부착을 수반할 수 있다. 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자에 사용되는 링커는 당업계에 공지된 임의의 다양한 적합한 링커일 수 있다.
본 발명의 특정 실시 예에서, IL-17A, IL-17F 및/또는 TNFα 또는 이들의 임의의 조합에 결합하는 도메인은 숙주 세포에서 재조합 항체 또는 항원 결합 부분의 발현에 의해 생성된다. 결합 도메인의 임의의 조합을 코딩하는 서열은 (직접적으로 또는 링커를 통해) 연결될 수 있다. IL-17A, IL-17F 및 TNFα에 결합하는 도메인을 인코딩하는 생성된 핵산 분자는 발현 벡터에 삽입되고 숙주 세포 내로 도입된다. 이어서, 생성된 삼중 특이적 결합 분자를 발현 시스템으로부터 발현시키고 분리 및 정제한다.
본 발명의 특정 실시 예에서, 삼중 특이적 결합 분자의 결합 도메인은 결합 분자의 단백질 분해에 대해 보호하도록 고안된 신규한 링커 분자와 함께 쌍을 이룰 수 있다. 그러한 링커는 전형적으로 단백질 분해성 절단 부위(proteolytic cleavage site)를 갖지 않는다.
약학적 조성물
본 발명의 또 다른 실시 예는 활성 성분으로서(또는 단독 활성 성분으로서) 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물이다. 약학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 임의의 삼중 특이적 결합 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 조성물은 IL-17A, IL-17F, TNFα 및/또는 자가 면역 또는 염증성 질환의 활성에 의해 영향을 받을 수 있는 질병의 개선, 예방 및/또는 치료를 위한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는, 예를 들어, 아래에 기술된 바와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제(들)와 회합하여 제형으로서 투여되기에 적합하다.
본 발명의 약학적 조성물은 적어도 하나의 상중 특이적 결합 분자, 및 하나 이상의 세포 표면 수용체, 예를 들어 자가 면역 또는 염증 반응에 수반되는 세포 표면 수용체를 표적으로 하는 하나 이상의 추가 결합 분자(예를 들어, 항체)를 포함할 수 있다.
용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 기술하기 위해 본원에서 사용된다. 부형제(들)의 선택은 특정 투여 모드, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여 형태의 특성과 같은 인자에 상당히 크게 좌우될 것이다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 부형제"는 생리학적으로 양립 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제의 일부 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합물이 있다. 여러 경우에, 조성물에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용되는 물질의 추가적인 예로는 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤 또는 에멀젼화제, 보존제 또는 완충제가 있으며, 이는 항체의 저장 수명 또는 효능을 향상시킨다.
본 발명의 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 이러한 조성물 및 이의 제조 방법은 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)에서 확인될 수 있다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP(우수 제조관리 기준(good manufacturing practices)) 조건하에서 제조된다.
본 발명의 약학적 조성물은 대량으로, 단일 단위 용량으로서, 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 "단위 투여량"은 사전 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 개별 양(discrete amount)이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 피검체에 투여되는 활성 성분의 투여량과 같거나, 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어, 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3이다.
당해 분야에서 허용되는 펩티드, 단백질 또는 항체를 투여하기 위한 임의의 방법은 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자을 위해 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 비경구 투여를 위해 적합하다. 본원에서 사용되는 약학적 조성물의 "비경구 투여"는 피험자의 조직의 물리적 블리칭(physical breaching) 및 조직에 브리치(breach)를 통한 약학적 조성물의 투여에 의해 특징되는 임의의 투여 경로를 포함하며, 이에 따라, 일반적으로 혈류에, 근육에 또는 내부 장기에 직접 투여를 발생시킨다. 이에 따라, 비경구 투여는 조성물의 주사에 의해, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용에 의해, 조직-침투 비-외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학적 조성물의 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 요도내, 두개내, 및 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 비제한적으로 포함하는 것으로 고려된다. 또한 종양내 전달, 예를 들어 종양내 주입이 유리할 수도 있다. 또한 국소 관류법이 고려된다. 바람직한 구체예는 정맥내 및 피하 경로를 포함한다.
비경구 투여를 위해 적합한 약학적 조성물의 제형은 통상적으로 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 멸균수 또는 멸균 등장성 염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적절한 형태로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 주사용 제형은 보존제를 함유하는 앰플 또는 다중-용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁화제, 안정화제 또는 분산제가 포함되지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가적인 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 일 구체예에서, 활성 성분은 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공되고, 이는 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 전에 적절한 비히클(예를 들어, 멸균 발열원-비함유수(sterile pyrogen-free water))로 재구성된다. 비경구 제형은 부형제, 예를 들어, 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게, 3 내지 9의 pH까지)를 함유할 수 있는 수용액을 포함하지만, 일부 적용을 위하여, 이들은 더욱 적합하게 멸균 비-수용액으로서 또는 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균, 무발열원 수와 함께 사용되는 건조된 형태로서 제형화될 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 수용액 중의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 투여 형태는 요망되는 경우에, 적합하게 완충될 수 있다. 유용할 수 있는 다른 비경구적으로 투여 가능한 제형은 미정질 형태 또는 리포솜 제조물에 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다. 비경구 투여를 위한 제형은 즉시 및/또는 변형된 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연된-, 지속된-, 펄스화된-, 조절된-, 표적화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
예를 들어, 일 양태에서, 멸균 주사 가능한 용액은 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이의 조합과 함께, 적절한 용매 중에 요구되는 양의 삼중 특이적 결합 분자를 혼입시키고, 필요한 경우에, 이후에 여과 멸균화함으로서 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기에 나열된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유한 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이전의 이의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써, 및/또는 변형된-방출 코팅(예를 들어, 서방출 코팅)을 사용함으로써 초래될 수 있다.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 또한 통상적으로 건조 분말 흡입기로부터의 건조 분말 형태로(단독으로, 혼합물로서, 또는 혼합된 성분 입자로서, 예를 들어, 적합한 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 입자로서), 적합한 추진제의 사용 유무와 함께, 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기(바람직하게는 미세한 미스트를 형성시키기 위한 전기유체역학을 이용한 분무기) 또는 네불라이저로부터의 에어로졸 스프레이로서, 또는 점비액으로서, 비강내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기, 또는 네불라이저는 일반적으로, 예를 들어, 활성물의 방출물을 분산, 가용화 또는 팽창시키기 위한 적합한 제제, 용매로서 추진제(들)를 포함하는 본 발명의 결합 분자의 용액 또는 현탁액을 함유한다.
건조 분말 또는 현탁액 제형에서 사용하기 전에, 약물 제품은 일반적으로 흡입에 의한 전달을 위해 적합한 크기(통상적으로, 5 마이크론 미만)로 미세화된다. 이는 임의의 적절한 분쇄 방법, 예를 들어, 나선형 제트 밀링, 유체층 제트 밀링, 나노입자를 형성시키기 위한 초임계 유체 가공, 고압 균질화 또는 스프레이 건조에 의해 달성될 수 있다.
흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐, 블리스터(blister), 및 카트리지는 본 발명의 화합물, 적합한 분말 베이스 및 성능 개질제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
미세 미스트를 형성시키기 위해 전기유체역학(electrohydrodynamics)을 이용하는 분무기에서 사용하기 위한 적합한 용액 제형은 1회 구동(actuation) 당 적합한 용량의 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자를 함유할 수 있으며, 구동 부피는 예를 들어, 1 μl 내지 100 μl로 다양할 수 있다.
적합한 풍미제, 예를 들어, 멘톨 및 레보멘톨, 또는 감미제, 예를 들어, 사카린 또는 사카린 소듐이 흡입/비강 내 투여를 위해 의도된 본 발명의 제형에 첨가될 수 있다.
흡입/비강내 투여를 위한 제형은 즉시 및/또는 변형된 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연된-, 지속된-, 펄스화된-, 조절된-, 표적화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
건조 분말 흡입제 및 에어로졸의 경우에, 투여 유닛은 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 유닛은 통상적으로 계량된 용량 또는 "퍼프(puff)"의 본 발명의 결합 분자를 투여하도록 배열된다. 전체 일일 용량은 통상적으로 단일 용량으로, 또는 보다 일반적으로 나누어진 용량으로서 종일 투여될 것이다.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 또한 경구 경로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 경구 투여는, 화합물이 위장관으로 진입하도록, 연하(swallowing)를 포함할 수 있고/거나, 협측, 설측 또는 설하 투여는 화합물이 입으로부터 혈류로 직접적으로 진입하게 한다.
경구 투여를 위해 적합한 제형은 고체, 반-고체, 및 액체 시스템, 예를 들어, 정제; 다중- 또는 나노-미립자, 액체 또는 분말을 함유한 연질 캡슐 또는 경질 캡슐; 로젠지(액체 충전을 포함함); 츄(chew); 겔; 속분산 투여 형태; 필름; 오불(ovule); 스프레이; 및 협측/점막접착 패치를 포함한다.
액체 제형은 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이러한 제형은 (예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시 프로필메틸셀룰로스로부터 제조된) 연질 캡슐 또는 경질 캡슐 중의 충전제로서 사용될 수 있고, 통상적으로, 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸셀룰로스, 또는 적합한 오일, 및 하나 이상의 에멀젼화제 및/또는 현탁제를 포함한다. 액체 제형은 또한, 예를 들어, 사세(sachet)로부터 고체의 재구성에 의해 제조될 수 있다.
일 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 pH 5.0 내지 6.5의 완충액 중에서 1 내지 100 mM의 농도로 히스티딘 및 아세테이트를 포함하는 조성물로 제형화된다.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 치료 용도
일 양태에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 IL-17A, IL-17F 및/또는 TNFα의 활성에 의해 영향을 받을 수 있는 장애의 치료에 사용된다. 예를 들어, 의사는 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자를 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 (연속적으로 또는 동시에) 투여함으로써 자가 면역 질환 또는 염증성 질환을 치료할 수 있다. 삼중 특이적 결합 분자는 IL-17A, IL-17F 및/또는 TNFα의 활성을 조절하여 자가 면역 또는 염증 반응을 감소시킨다. 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자 및 방법에 의해 치료될 수 있는 장애는 다음 중 임의의 것을 포함 할 수 있다: 류마티스 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 화농성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절병증, 전신홍반루푸스, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기 질환, 건선, 판상형 건선, 아토피 피부염, 피부경화증, "이식편대숙주" 장기 이식거부 반응, 장기 이식 관련 만성 또는 급성 면역 질환, 사르코이드증, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활동 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 후천성면역결핍 증후군, 급성 횡단척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성담관간경화증, 용혈성 빈혈, 성인(급성) 호흡곤란 증후군, 탈모, 원형탈모, 혈청반응음성 관절병증, 관절병증, 라이터병, 궤양성 대장염 관절염 관련 건선성 관절염, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽천포창, 유천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 관절염, 원발성 경화성 A형 간염. 잠복 자가면역 간염, 섬유증 폐질환, 잠복 섬유화 폐포염, 염증-후 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 만성 호산구 폐렴, 감염후 간질성 폐질환, 통풍 관절염, 자가면역 간염, 자가 면역성 간염 유형 I(고전적 자가면역 또는 루푸스 모양 간염), 자가면역 간염 유형 II 골관절염, 원발성 경화 담관염, 1형 건선, 2형 건선, 특발성 백혈구감소, 자가면역 호중구감소, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 원반모양홍반루푸스, 특발성 NOS-남성 불임, 항정자 면역성, 다발성 경화증(모든 유형), 교감 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿파스처 증후군, 결절성 다발동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸씨병, 전신 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야스 동맥염, 자가면 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선기능항진증, 자가면역 갑상선기능저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 1차 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알러지, 천식, 정신 장애(우울증 및 정신분열증 포함), Th1- 및 Th2-매개 질환, 결막염, 알러지성 접촉 피부염, 알러지성 비염, 알파-I 항트립신 결핍증, 측면 근위축성 경화증, 빈혈, 낭포성 섬유증, 사이토킨 요법에 의한 장애, 탈수초성 질환, 피부염, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 허혈/재관류에 의한 질환, 허혈성 뇌졸중, 소아 류마티스성 관절염, 자가 면역 장질환, 자가 면역 청력 손실, 자가 면역 림프 증식성 증후군(ALPS), 자가 면역 심근염, 자가 면역 조기 난소 부전 및 안검염. 삼중 특이적 결합 분자는 또한 상기 질환의 임의의 조합을 치료할 수 있다.
특정 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염 골다공증(rheumatoid arthritis osteoporosi), 염증성 섬유증(inflammatory fibrosis) (예를 들어, 피부경화증(scleroderma), 폐섬유증(pulmonary fibrosis) 및 간경변(cirrhosis)), 치은염(gingivitis), 치주증(periodontosis) 또는 치주병(periodontal disease), 염증성 장질환(예: 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 염증성 장질환), 천식(asthma)(알레르기성 천식 포함), 알레르기(allergies), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis) 및 암으로부터 선택되는 장애를 치료하는데 사용되나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선(psoriasi) 또는 건선 관절염(psoriatic arthritis)을 치료하는데 사용된다.
"치료하다," "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 이의 수반되는 증상들 중 적어도 하나를 완화시키거나 제거하는 방법을 지칭한다. 본원에서 사용되는 질병, 장애 또는 질환을 "완화시키는" 것은 질병, 장애 또는 질환의 증상의 중증도 및/또는 발생 횟수를 감소시키는 것을 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"에 대한 언급은 치료, 완화 및 예방 치료에 대한 언급을 포함한다.
일 양태에서, 상기 치료의 피험자 또는 환자는 포유 동물, 바람직하게는 인간 피험자이다. 상기 피험자는 임의의 연령의 남성 또는 여성 일 수 있다.
"치료적 유효량"은 치료되는 질환의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시킬 투여되는 치료제의 양을 지칭한다. 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 약물 또는 항체와 조합하여(또는 이들의 임의의 조합물로서) 투여될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 약학적 조성물, 방법 및 용도는 또한, 하기에 상세히 기술되는 바와 같이, 다른 활성제와의 조합(동시-투여)의 실시 예를 포함한다.
하나 이상의 다른 치료제와 함께 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자를 지칭하는 본원에서 사용되는 용어 "동시-투여", "동시-투여된" 및 "-와 조합하여"는 하기 기술된 것을 의미하는 것으로 의도되고, 이를 지칭하며 이를 포함한다:
·성분들이 환자에게 실질적으로 동시에 상기 성분들을 방출시키는 단일 투여 형태로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자 및 치료제(들)의 조합물의 동시 투여,
·성분들이 환자에 의해 실질적으로 동시에 취해지는 별도의 투여 형태로 서로 분리되게 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자 및 치료제(들)의 조합물의 실질적인 동시 투여, 여기서 상기 성분들은 상기 환자에게 실질적으로 동시에 방출됨,
·성분들이 환자에 의해 각 투여 간에 상당한 시간 간격을 갖는 연속적 시간에 취해지는 별도의 투여 형태로 서로 분리되게 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자 및 치료제(들)의 조합물의 순차적인 투여, 여기서 상기 성분들은 상기 환자에게 실질적으로 상이한 시간에 방출됨; 및
·성분이 조절된 방식으로 상기 성분들을 방출하는 단일 투여 형태로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자 및 치료제(들)의 조합물의 순차적인 투여, 여기서 이들은 상기 환자에게 동일한 시간에 및/또는 상이한 시간에 동시에, 순차적으로, 및/또는 중첩되게 방출되며, 여기서 각 부분은 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있음.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 추가적인 치료학적 치료 없이, 즉, 독립 치료법으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자으로의 치료는 적어도 하나의 추가적인 치료학적 치료(병용 요법)를 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 삼중 특이적 결합 분자는 자가 면역 또는 염증성 질환의 치료를 위한 다른 약물치료/약물과 동시-투여되거나 제형화될 수 있다.
일부 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 항염증제와 함께 투여된다. 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자와 함께 투여될 수 있는 항염증제는 코르티코스테로이드(예를 들어, 베타메타손, 부데소니드, 코르티솔, 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 및 트리암시놀론), 비스테로이드 항염증제(예를 들어, 발살라지드, 셀레콕시브, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 프로타페닌, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페남산, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 오살라진, 옥사프로진, 페닐부타존, 케토롤락, 로르녹시캄, 록소프로펜, 피록시캄, 살살레이트, 술린닥, 테녹시캄, 티아프로펜산, 및 톨메틴) 뿐만 아니라 아세트아미노펜, 항히스타민제, 아미노아크릴카르복실산 유도체, 아크릴아세트산 유도체, 아릴부티릭산 유도체, 아크릴카르복실산, 아크릴프로피온산, 피라졸, 피라졸론, 살리실산 유도체(예를 들어, 설파살라진 및 메살라민), 티아진카르복스아미드, ε-아세타미도카프로익산, S-아데노실메티오린, 3-아미노4-하이드록시부티릭산, 아미제트린, 벤다작, 벤지다민, 부콜롬, 디펜피라미드, 디타졸, 에모르파존, 구아이아줄렌, 나부메톤, 니메슐리드, 오르고테인(Orgotein), 옥사세프롤, 파라닐린, 페리소살, 피포자임, 프로카존, 프로자졸 및 테니답을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 스테로이드(steroid), 사이클로스포린(cyclosporine), 사이클로스포린 유사체, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 메틸프레드니손(methylprednisone), 프레드니손(prednisone), 아자티오프린(azathioprine), FK-506, 15-데옥시스페르구알린(15-deoxyspergualin), 나탈리주맙(natalizumab)과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 면역억제제 및 반응하는 T 세포의 기능을 억제함으로써 작용하는 그 밖의 면역 억제제와 함께 투여된다.
일부 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 ORTHOCLONETM(OKT3), SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(사이클로스포린), PROGRAFTM(타크롤리무스), CELLCEPTTM(마이코페놀레이트), 아자티오프린, 글루코코르티코스테로이드, AVONEXTM(인터페론-베타 1A), 및 RAPAMUNETM(시롤리무스)와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 면역억제제와 함께 투여된다. 일 실시 예에서, 면역 억제제는 장기 또는 골수 이식의 거부를 방지하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 TNF 길항제와 함께 투여된다. 본 발명의 결합 분자와 함께 투여될 수있는 TNF 길항제는 인플릭시맵(REMICADETM), 아달리무맵(HUMIRATM), 세토리주맵 페골(CIMZIATM), 골리무맵(SIMPONITM), 에타너셉트(ENBRELTM), 크산틴 유도체(예를 들어, 펜톡시필린) 및 부프로피온(WELLBURTINTM, ZYBANTM)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시 예에서, TNF 길항제는 TNFα 길항제이다.
일 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합분자는 IL-6R 길항제(예를 들어, 토실리주맵 및 세룰루맵), IL-6 길항제, IL-1a or IL-1b 길항제, IL-23 길항제, IL-22 길항제, and GM-CSF 길항제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 목록의 길항제와 조합하여 투여된다.
일부 실시 예에서, 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 IL-17A 및/또는 IL-17F 길항제와 조합하여 투여된다. 　특정 실시 예에서, 상기 길항제는 항-IL-17A 및/또는 항-IL-17F 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다.
약제적 물품(pharmaceutical article)은 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자 및 자가 면역 또는 염증성 질환의 치료에서 동시, 분리 또는 연속 투여를 위한 조합 치료로서 사용될 수 있는 적어도 하나의 다른 제제(예를 들어, 면역 억제성 또는 항염증제)를 포함한다.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 전술한 바와 같은 치료 방법에 사용될 수 있으며, 전술한 바와 같은 치료에 사용될 수 있으며, 및/ 또는 전술한 바와 같은 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
투여 용량 및 경로
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 고려되는 질환의 치료를 위한 유효량으로, 즉, 요망되는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그러한 시간 동안 투여될 것이다. 치료적 유효량은 치료될 특정 질환, 환자의 연량, 성별 및 체중, 및 삼중 특이적 결합 분자가 독립 치료로서 또는 하나 이상의 추가적인 항-자가면역 또는 항염증 치료제와 함께 투여되는 지의 여부와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다
투여 요법은 최적의 원하는 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수 개의 나누어진 용량이 시간에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급 사태(exigency)에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 환자/치료될 피검체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미한다; 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 화합물의 사전결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 일반적으로 (a) 화학요법제의 독특한 특징 및 달성될 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에서의 고유의 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 따른다.
이에 따라, 당업자는 본원에 제공된 설명을 기초로 하여, 용량 및 투여 요법이 치료 분야에서 널리 공지된 방법에 따라 조절된다는 것을 인식할 것이다. 즉, 최대 내약 용량이 용이하게 규명될 수 있으며, 환자에 대한 검출 가능한 치료 이득을 제공하는 유효량이 또한, 환자에 대한 검출 가능한 치료 이득을 제공하기 위해 각 제제를 투여하기 위한 일시적 요건일 수 있으므로, 결정될 수 있다. 이에 따라, 특정 용량 및 투여 요법이 본원에 예시되어 있지만, 이러한 예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 실행함에 있어서 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 한정하지 않는다.
투여량 값이 개선될 질환의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있고, 단일 용량 또는 다중 용량을 포함할 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 임의의 특정 피검체에 대하여, 특정 투여 요법이 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단 및 개개 필요에 따라 시간에 따라 조절될 것이며, 본원에 기술된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이고 구현된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하지 않도록 의도된다는 것이 추가로 이해된다. 또한, 본 발명의 조성물로의 투여 요법은 질병의 유형, 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 상태, 질환의 중중도, 투여 경로, 및 사용되는 특정 삼중 특이적 결합 분자를 포함하는 다양한 인자를 기초로 할 수 있다. 이에 따라, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 관례대로 표준 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 약동력학 또는 약물역학적 파라미터를 기초로 하여 조절될 수 있으며, 이는 임상 효과, 예를 들어, 독성 효과 및/또는 실험실 수치를 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 환자내 용량-상승을 포함한다. 적절한 투여량 및 요법을 결정하는 것은 관련 분야에서 널리 공지되어 있고, 본원에 기술된 교시를 제공한 후에 당업자에 의해 포함될 것으로 이해될 것이다.
적합한 투여 경로의 예는 상기에 제공된다.
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 적합한 용량은 0.1 내지 100mg/kg, 예를 들어, 약 0.5 내지 50mg/kg, 예를 들어, 약 1 내지 20mg/kg 범위일 것으로 고려된다. 삼중 특이적 결합 분자는, 예를 들어, 적어도 0.25mg/kg, 예를 들어, 적어도 0.5mg/kg, 예를 들어, 적어도 1mg/kg, 예를 들어, 적어도 1.5mg/kg, 예를 들어, 적어도 2mg/kg, 예를 들어, 적어도 3mg/kg, 예를 들어, 적어도 4mg/kg, 예를 들어, 적어도 5mg/kg; 및 예를 들어, 최대 50mg/kg, 예를 들어, 최대 30mg/kg, 예를 들어, 최대 20mg/kg, 예를 들어, 최대 15mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여는 대개 적합한 간격으로, 예를 들어, 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회, 그리고 필요한 경우에 투여량을 임의적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있는 주치의에 의해 적절한 것으로 여겨지는 동안 반복될 것이다.
자가 면역 또는 염증 질환 치료를 위한 유효량은 환자에서 질병 진행을 안정화시키고/거나 증상을 개선시키는 이의 능력, 및 바람직하게, 질병 진행을 역전시키는 능력에 의해 측정될 수 있다. 자가 면역 또는 염증 질환을 억제하기 위한 본 발명의 삼중 특이적 결합 분자의 능력은 예를 들어, 실시 예에 기술된 바와 같은 시험관내 검정뿐만 아니라, 그러한 장애에서의 효능을 예측하는 적합한 동물 모델에 의해 평가될 수 있다. 적합한 투여 요법은 각 특정 상황, 예를 들어, 단일 볼루스로서 또는 연속 주입으로서, 및 각 경우의 경험에 의해 지시되는 바와 같은 투여량의 가능한 조절로 투여되는 상황에서 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 선택될 것이다.
진단 용도 및 조성물
본 발명의 삼중 특이적 결합 분자는 또한 진단 과정(예를 들어, 시험관내, 생체외)에서 유용하다. 예를 들어, 삼중 특이적 결합 분자는 환자로부터의 샘플 샘플(예를 들어, 조직 샘플, 또는 체액 샘플, 예를 들어, 염증 삼출물, 혈액, 혈청, 장액, 타액, 또는 소변)에서 IL-17A, IL-17F 및/또는 TNFα의 수준을 검출하고/거나 측정하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 검출 및 측정 방법은 면역학적 방법, 예를 들어, 유세포분석, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 화학적발광 검정, 방사면역검정, 및 면역조직학을 포함한다. 본 발명은 본원에 기술된 항체를 포함하는 키트(예를 들어, 진단 키트)를 추가로 포함한다.
본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시 예가 기술된다. 이러한 실시 예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어선 안된다.
본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 전문이 참조로서 포함된다. 전술한 본 발명은 이해의 명료성을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 설명되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 첨부된 실시 예들의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 변경 및 수정이 이루어질 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1: 삼중 특이적 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 항체의 생성 및 최적화
삼중 특이적 항-IL-17A/항-IL-17F/항-TNFα 항체는 도 1과 같이 생성되고 최적화되었다.
실시예 2: 포유류 세포의 부유 배양에서 재조합 항원 및 항체 생산
항체 및 항원은 공개된 프로토콜(Longo et al., Methods Enzymol 529:227-240 (2013))에 따라 EBNA 1(Epstein-Barr 바이러스 핵 항원 1)을 구성적으로 발현하는 CHO-K1 세포에서 생산되었다. Life Technologies Corporation에서 제조한 무혈청 배지를 사용하여 제조사의 지시에 따라 오비탈 쉐이커(orbital shaker)로 부유물(suspension)에서 세포를 배양하였다. 일시적인 발현을 위해 선형 폴리에틸렌이민(PEI MAX, Polysciences)을 사용하여 2 x 10E6/ml의 농도로 세포를 형질 감염시켰다. DNA/PEI 비율은 1:3이었다. 형질 감염 후 5-7일, 배지를 2000g에서 20분간 원심 분리하고 0.22㎛ 필터로 여과하였다. 표적 단백질은 친화성 크로마토그래피로 배양액에서 추출하였다.
Profinity IMAC Ni-charged resin(Bio-Rad Company)을 사용하여 배양액으로부터 단백질 및 FLAG-펩티드(도 2)의 C-말단에 6개의 아미노산을 함유하는 재조합 단백질 IL-17A를 추출 및 정제하였다. 정제 전에, NiCl2를 배양액에 1mM의 농도로 첨가하였다. Profinity IMAC Ni-charged resin 5ml를 배양액에 첨가하고 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 흡착제(sorbent) 5ml를 Thermo scientific Polypropylene 컬럼으로 옮기고 5컬럼 부피의 PBS로 세척하여 비특이적 결합 성분을 제거하였다. 결합 항원은 0.3M 이미다졸, pH 8, 150mm NaCl을 사용하여 qns리되었다. 그 다음, 단백질은 SnakeSkin Dialysis Tubing 기술을 이용하여 PBS(pH 7.4) 내로 투석하고, 여과(0.22㎛)한 뒤, 튜브에 옮겨 담아 -70℃에서 보관했다. 수득한 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 평가했다(도 3). 시험 IgG1 항체 및 대조용 IgG1 항체는 IL-17A-Fc에 대해 전술한 절차에 따라 1ml Hi Trap rProeinA FF 컬럼(GE Healthcare) 상에서 정제했다. 수득한 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 평가했다(도 4).
변성 조건하에서의 전기 영동 순도 데이터에 따르면, 재조합 항원 생성물 및 IL-17A-H6F 및 IL-17A-Fc는 면역화 및 추가 연구에 적합하다. 또한, 순도가 양호한 대조군 AIN457(노바티스, 재현성(US7807155 B2))을 본 연구에 사용할 수 있다.
실시예 3: 인간 IL-17A를 이용한 라마 면역화 및 라마 Fab 파지 항체 라이브러리의 생산
라마(Lama Glama)는 동량의 완전 프로인트(Freund's) 보강제(1차 주사 시) 또는 불완전 프로인트 보강제(1차 외에 모든 주사 시)와 혼합된 항원 물질을 피하 투여로 사용하여 연속 5회 면역화시켰다. 재조합 단백질의 혼합물(주사 당 각 단백질 0.2mg)을 항원으로써 사용했으며, 이 중 하나는 인간 IL-17A-H6F이다(실시 예 2). 2차 주사(면역화 단계)는 1차 주사 3주 후에 수행했고; 2주 간격으로 3회 더 면역화를 수행했다. 3회째부터 각 주사 후에 혈액 샘플(50ml)을 5개 수집했다
채혈한 혈액을 1mM EDTA를 함유하는 PBS로 2배 희석했다. 그 다음, 희석한 혈액 35ml를 Histopaque®-1077 배지(Sigma, 밀도 1.077 g/ml) 위에 중층시키고 800g에서 20분 동안 원심분리했다. 혈장/Histopaque 배지 계면 구역에서 단핵 세포(림프구 및 단핵구)를 취하여 1mM EDTA를 함유하는 PBS로 세척했다.표준 프로토콜에 따라 인증된 IL-17A에 대한 결과 혈청 면역 글로불린 역가는 1/10000 이상이었고, 이는 항체 라이브러리(5)의 제작에 만족스럽다.
단핵성 라마 세포의 총 RNA는 RNeasy Mini Kit를 사용하여 프로토콜(QIAGEN)에 따라 분리했다. RNA 농도 분석은 Nanovue(GE Healthcare)를 사용하여 수행했고; 분리된 RNA의 품질은 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 검사했다.
역전사 반응은 MMLV RT 키트(Evrogen)를 사용하여 MMuLV 역전사효소 및 랜덤 헥사머 프라이머를 이용하는 권장된 프로토콜에 따라 수행했다.
제한 효소 부위가 인접해 있는 가변 도메인 유전자를 생산하기 위하여 올리고 뉴클레오타이드 세트 및 공개된 프로토콜(de Haard et al., J Biol Chem 274(26):18218-30 (1999); De Genst et al., Dev Comp Immunol 30(1-2):187-98 (2006))을 사용하여 역전사 생성물을 2단계 PCR에서 주형으로 사용하였다. 그 다음, 하나의 단편의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인 유전자의 화합물을 연속적인 제한, 연결 및 증폭에 의해 수행하였다. 중쇄 유전자는 각각 카파 및 람다 경쇄 유전자에 부착시켰다. 이 경우, 모든 반응들에서 추정되는 매트릭스 분자의 수는 1011 이상이었다. 수득되는 DNA 산물(VL-CK-VH)은 NheI/Eco91I 제한효소로 처리하고, 오리지널 파지미드 pH5에 결찰시켰다. 파지미드 구조는 도 6에 제시했다. 결찰 산물은 공지된 프로토콜(Bond et al., J Mol Biol 332(3):643-55 (2003))에 따라 제조한 SS320 일렉트로컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용했다. Fab 라이브러리의 카파 유도체의 레퍼토리는 각각 5.1*10E8 이고 Fab 라이브러리의 람다 유도체는 3.7*10E8이었다.
실시예 4 : 파지 항체의 Fab 라이브러리 선택
특이적 항-IL17A 파지 Fab은 재조합 인간 IL-17A(R&D Systems)를 사용하여 Fab-디스플레이 라이브러리로부터 분리하였고; 일련의 선택 사이클은 전술한 바와 같이 수행했다(Marks et al., J Mol Biol 222(3):581-597 (1991); de Haard et al., J Biol Chem 274(26):18218-30 (1999)). 패닝(panning)법으로 선택 공정을 수행하기 위해, 인간 IL-17A는 50mM 탄산염 완충액(pH 9.5)에서 HighSorb 튜브(Nunc) 표면 위에 4℃ 하에 밤새 흡착시켰다. 또한, 튜브는 PBS(pH 7.4)로 세척하고, 그 다음, PBS(pH 7.4)-탈지유(0.5% w/vol)를 함유하는 용액으로 1시간 동안 차단시켰다. 그 다음, PBS(pH 7.4)-탈지유(0.5% w/vol) 중의 파지 용액 2.4ml(ml당 1012 파지 입자)를 항원과 함께 튜브로 옮기고, 교반 하에 1시간 동안 항온처리했다. 미결합된 파지는 PBS(pH 7.4)-Tween 20(0.1% vol/vol)으로 일련의 세척 사이클로 제거했다. 세척 사이클의 횟수는 제1 라운드에서부터 제3 라운드까지 각각 20회, 30회 및 40회로 증가시켰다. 결합된 상태를 유지하는 파지 입자는 교반 하에 15분 동안 100mM Gly-HCl 용액(pH 2.5)으로 용출시키고, 그 다음 1M TRIS-HCl(pH 7.6)로 중화시켰다. 수득한 파지를 박테이라 균주 E. coli TG1에 감염시켰고; 이후 파지를 분리하여 다음 선택 사이클에 사용했다. IL-17A의 제2 및 제3 선택 라운드 이후, 다중클론 파지 산물에 대해 수행된 ELISA는 유의적인 농축을 나타냈다. 항-IL-17A에 특이적인 인간 Fab이 농축된 수집된 클론은 중쇄 CH1 유전자의 C 말단에 His6 태그 및 myc 태그(tag)를 함유하는 발현 플라스미드 pLL(도 7)에 재클로닝했다
실시예 5: 인간 IL-17a에 대한 Fab의 특이적 결합 분석
선택된 Fab 단편들과 인간 IL-17A와의 결합을 측정하기 위해 ELISA를 이용했다.공개된 서열(Novatis)을 보유한 Fab 항체 AIN457를 양성 대조군으로 사용했다. 특이적 결합 분석을 위해, ELISA 평판 웰(Nunc ImmunoMaxisorp)은 50㎕ IL-17A(1X 코팅 탄산염 완충액 중에 0.5㎍/ml) 로 코팅하고, 밀봉한 뒤, 4℃에서 밤새 항온처리했다. 이후의 모든 단계들은 GenetixQ-pix2xt(Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200(Tecan)과 같은 고성능 시스템을 가지고 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행했다. 비특이적 결합은 차단 완충액 BB(PBS 중의 0.5% 탈지유 200㎕)를 첨가하여 차단시켰다. 플레이트는 실온에서 1h 동안 진탕기에서 항온처리했다. PBS-Tween으로 세척한 후, 각 셀은 시험 Fab-함유 세포 상등액과 동량의 BB 혼합물 50㎕로 코팅했다. 플레이트는 다시 진탕기에서 실온 하에 1시간 동안 항온처리하고; 다시 각 플레이트의 웰을 PBS-Tween 완충액으로 5회 세척했다. 세척 후, 각 웰은 인간 항-Fab HRP-접합된 2차 항체(Pierce-ThermoScientific)가 첨가된 PBS-Tween(1:5000)로 코팅했다(50㎕/웰). 플레이트를 회전 진탕기로 옮기고(실온에서 50min), 그 다음 전술한 바와 같이 PBS-Tween 완충액으로 5회 세척했다. 포화될 때까지(평균 3 내지 5min) TMB(100㎕/웰)를 첨가하여 비색 시그널을 수득하고; 추가 발색은 정지 용액(100㎕/웰, 10% 황산)을 첨가하여 차단시켰다. 색시그널은 적당한 Tecan-Sunrise 평판 판독기(Tecan)를 사용하여 450nm에서 측정했다. 항체 결합은 생성된 시그널에 비례했다. 색 시그널이 기준 시그널에 비해 5배가 넘는 클론들은 경쟁적 ELISA로 시험하여, IL-17A 리간드와 수용체 사이의 상호작용을 차단하는 길항작용적 Fab를 밝혀냈다.
실시예 6: IL-17A 리간드와 IL-17R 수용체 간의 상호작용을 차단하는 경쟁적 EIA
경쟁적 ELISA 기술을 이용하여 이전에 선택된 항-인간 IL-17A Fab의 길항작용능을 분석하였다. 우리는 Fab 항체 AIN457(Novartis)를 양성 길항물질 대조군으로 사용했다. ELISA 평판(Nunc Immuno Maxisorp) 웰은 50㎕ IL-17RA-Fc 수용체(R&D Systems)를 1X 코팅 탄산염 완충액 중에 1㎍/ml의 농도로 고정하고, 4℃에서 밤새 항온처리했다. 이후의 모든 단계들은 GenetixQ-pix2xt(Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200(Tecan)과 같은 고성능 시스템을 가지고 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행했다. 비특이적 결합은 차단 완충액 BB(PBS 중의 0.5% 탈지유 200㎕)를 첨가하여 차단시켰다. 평판은 실온에서 1h 동안 진탕기에서 항온처리했다. 이와 나란히, 비결합성 96웰 평판 중의 시험 Fab-함유 세포 상청액 50㎕를 IL-17A-His6-Flag(PBS-Tween으로 희석된 1% 밀크 중의 0.4㎍/ml) 50㎕와 혼합했다. 다음 진탕기에서 500 rot/min 하에 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다
IL-17RA-Fc 수용체를 함유하는 평판은 BB 용액으로 세척한 후, 상기 반응 혼합물을 웰당 90㎕로 옮겼다. 평판은 실온에서 45분 동안 교반 하에 항온처리하고, 각 웰은 PBS-Tween 완충액으로 5회 세척했다. 또한, 1㎍/ml의 농도로 마우스 항-FLAG M2 항체(Sigma) 50㎕/웰을 첨가하였다. 상기 평판을 실온에서 45분 동안 항온 처리한 후 각 평판 웰을 PBS-Tween으로 5회 세척하였다. PBS-Tween으로 1:5000으로 희석된 항-마우스-IgG HRP-접합된 2차 항체(Pierce-ThermoScientific) 50㎕/웰로 코팅했다. 평판은 실온에서 45분 동안 회전 진탕기에서 항온처리하고, 전술한 바와 같이 PBS-Tween으로 5회 세척했다. 포화될 때까지(평균 3 내지 5min) TMB(100㎕/웰)를 첨가하여 비색 시그널을 수득하고, 추가 발색은 정지 용액(100㎕/웰, 10% 황산)을 첨가하여 차단시켰다. 색 시그널은 적당한 Tecan-Sunrise 평판 판독기(Tecan)를 사용하여 450nm에서 측정했다. 항체 결합은 생성된 시그널에 비례했다. 대조용 Fab 항체 AIN457에 대응하는 수준으로의 차단을 입증해 보이는 클론들은 양성으로 표시하고, 추가 시험에 사용했다. 양성 클론들의 가변 도메인들의 유전자는 Applied Biosystems 3130 유전자 분석기(Applied Biosystems)에서 표준 프로토콜에 따라 서열분석하고, 적당한 분석으로 처리했다. VHH 가변 도메인을 함유하는 클론은 추가 연구를 위해 선택했다. 또한, 하나의 클론, 3VHHFab은 다양한 서열의 23 경쇄 도메인 서열과 함께 나타나는 것으로 발견되었고, 이는 상대적 구조 내성을 시사하고, VHH 도메인은, 경쇄가 아닌, IL-17A 결합에 기여한다는 사실을 시사한다.
실시예 7: 동적 해리 상수(kinetic dissociation constant) k off ( k dis )에 의한 항-IL-17A VHHFab 후보들의 비교 스크리닝
항-IL-17A Fab 후보들에 대한 비교 koff의 비교 스크리닝은 Bio Octet Red 96(Pall-Forte) 시스템을 사용하여 수행했다. 항-FABCH1 바이오센서들은 10mM PBS(pH 7.2 내지 7.4), 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 함유하는 작업 완충액에서 30분 동안 재수화시켰다. E. coli 10x 작업 완충액을 첨가하여 1x의 최종 농도로 만들었다. 그 다음, 항-FABCH1 바이오센서를 후보 Fab 단편 및 E. coli 에 담그고 4℃의 온도에서 12시간 동안 항온처리했다. 표면에 고정된 Fab 단편들을 포함하는 센서들은 러닝 완충액(runline buffer)이 담긴 웰로 이동시키고, 기준 값을 특정했다(60sec). 그 다음, 센서들을 항원-항체 결합을 달성하도록 피분석물 용액(IL-17A, 30㎍/ml)이 담긴 웰로 이동시켰다(300sec). 그 후 센서들은 다시 해리시키기 위해 러닝 완충액이 담긴 웰로 복귀시켰다(300sec). 각 실험 후, 사용된 센서는 시험 후 사용을 위해 재생 완충액(Gly-HCl, pH 1.7)에 3회 방치함으로써 재생시켰다. 수득된 곡선들은 Octet Data Analysis(버전 7.0)을 사용하여 1:1 상호작용 모델과 표준 절차에 따라 분석했다.
항-IL-17A Fab 후보들의 koff-스크리닝에서 수득된 결과는 [표 1]에 제시했다. 인간 IL-17A와 모든 고유의 VHHFab의 특이적인 고친화성 결합이 입증되었고, 여기서 3VHHFab는 이 장치의 검출 한계를 벗어나는 매우 빠른 kon 및 매우 느린 kdis(1/s)를 나타냈다.
인간 IL-17A에 대한 VHHFab 유사성 및 인간 IL-17F에 대한 특이성
K D (M) k on (1/ Msec ) k dis (1/sec) 인간 IL-17F *에 결합
1VHH 2.485E-08 2.498E04 6.206E-04 -
2VHH 1.352E-08 1.628E05 2.201E-03 -
3VHHVK4B11 - - <2.272E-06 +++
* - 배경(background)보다 50% 이상 초과하지 않는 EIA 신호 없음
+++ 배경(background)보다 10배 이상 강한 신호.
따라서, 분석 데이터에 기초하여, 3VHHVK4B11의 VHH 모노도메인은 다른 두 후보와 비교하여 최대 결합 친화도를 나타냈다.
실시예 8: 인간 IL-17F에 대한 VHHFab의 특이적 결합
ELISA 분석은 실시 예 5에 기재된 표준 ELISA 프로토콜에 따라, 그러나 인간 IL-17F(R&D Systems)에 대해 전술한 3가지 VHHFab에 대해 수행하였다. Fab 항체 AIN457(공개된 서열, Novartis)을 양성 대조군으로 사용하였다. 3가지 VHHFab 후보자의 상호 작용에 대한 정성적 분석의 결과가 [표 1]에 제시되어 있다. 하기에 기술된 돌연변이를 갖는 VHH17(SEQ ID NO: 1; 도 9)으로 이후 명명된 VHH 모노 도메인은 3VHHVK4B11 Fab에 대한 친화도 및 교차 반응성 시험에 기초하여 추가 연구를 위해 선택되었다.
실시예 9: 항-IL-17A VHH17 도메인의 CDR의 스캐닝 돌연변이
VHH17 도메인 CDR의 개별 위치에 대한 돌연변이는 제조자의 프로토콜에 따라 Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit(NEB)를 사용하는 NNK 랜덤화 기술에 의해 삽입되었다. 플라스미드 pET22b-VHH17을 매트릭스로 사용하였다. PCR 산물을 저융점 아가로오스겔 상에서 분획하고 적절한 컬럼상에서 정제하였다. 결찰 후, DNA를 대장균 발현 균주 BL21(DE3)에 형질 전환시켰다. 상기 언급한 바와 같이 개별 클론은 96-웰 플레이트에서 발현시켜 수득하였다. 돌연변이 VHH17을 함유하는 상등액을 상기 기술된 조건하에 고성능 Genetix Q-pix2xt 및 Tecan Freedom EVO200 시스템을 사용하여 ELISA로 분석하였다. 고정화된 IL-17A의 농도는 0.2 μg/ml이었다. 고정된 VHH17 모노 도메인을 1 : 5000 희석 마우스 항-myc-tag 9E10 및 항-마우스 IgG(HRP) 접합체(Pierce) 및 TMB+H2O2/H2SO4 염료로 염색하였다; 흡광도는 파장 450nm에서 측정되었다.
돌연변이를 검색하여 얻어진 결과를 [표 2]에 나타내었다. 상기 표는 야생형 서열과 비교했을 때 돌연변이 VHH17/인간 II-17A 결합 시그널의 ≤30% 감소에 상응하는 CDR 치환을 나타낸다. 일 양태에서, 본 발명은 이들 돌연변이 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 삼중 특이적 결합 분자를 제공한다.
VHH17 스캐닝 돌연변이
돌연변이 위치 돌연변이의 양성 아미노산
HCDR3
V94 S, T, A, K, D, G
R95 K
R96 Y, H, W, K, D, G
R97 A, L, M, S, H, V
F98 -
D99 E, G, A, R, V, K, Q
G100 N,S
T100a G, P, V, R, S, N, K
S100b V, M, T, L, T, A, H, G, I , C
Y100c W, S
Y100d R, L, W, K, A, G, Q, I, V
T100e A, L, S
G100f A, L, T, P, N, Q, F, I, D
D107 -
HCDR2
A50 G,L
S52 -
P52a A
S53 -
G54 -
G55 S, R, P, D, I, T, E, K , A, L
D56 -
R57 -
I58 -
HCDR1
S32 N, K, R, E, W, M, Q, D, F, V, L, A
P33 S
M34 I
G35 L, A, I, S, R, V, N, Q, M
이 스크리닝은 아미노산 치환에 내성있는 VHH17의 CDR에서 아미노산 위치를 확인하였다. 본 발명의 아미노산 치환 패널은 인간 IL-17A에 대한 VHH17 친화성의 결합 친화도를 유의적으로 변화시키지 않는 것으로 입증되었다. 따라서 이 치환 패널을 사용하여 후보자의 다양한 속성을 향상시킬 수 있다.
실시예 10: 항-IL-17A/항-IL-17F 및 항- TNFα 삼중 특이적 항체의 공학 및 생성 : VHH - IgG1 ( LALA )
인간 TNFα(RU 2303604)에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자를 오리지널 코돈 조성에서 합성하고 각각 중쇄 및 경쇄에 대해 pEE-Hc(IgG1) 및 pEE-Lc 플라스미드로 클로닝하였다. 이것은 CHO-EBNA 세포에서 합동 일시 발현이 IgG1 이소타입 단일클론 항체를 생산할 수 있게 한다. 이러한 구조는 시퀀싱에 의해 검증되었고 중쇄에 대해서는 pEE-aTNF-IgG1Hc, 경쇄에 대해서는 pEE-aTNFLc로 명명되었다(도 9는 가변 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다).
도 9에 도시된 가변 도메인을 포함하는 항-TNFα IgG1의 "효과 없음" LALA 변이체(Woodle et al., Transplantation 68(5):608-16 (1999))를 수득하기 위해, 공개된 프로토콜(Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit(NEB))에 따라 PfuUltraHS 중합효소(Stratagene)를 통해 올리고 뉴클레오티드-유도 돌연변이 유발을 사용하여 pEE-aTNF-IgG1Hc 구조물에 아미노산 치환 L234A/L235A(Kabat 명명법)를 도입하였다. PCT 산물은 저융점 아가로스 상에서 분획화하고 적당한 컬럼 상에서 정제했다. 결찰 후, DNA로 E. coli를 형질전환시켰다. 표적 서열은 시퀀싱에 의해 확인되었고 이후에는 pEE-aTNF-IgG1HcLALA로 명명되었다.
또한, 실시 예 8에서 검출된 IL-17A 및 IL-17F에 대한 고친화성 VHH 서열을 기초로 VHH17 유전자를 합성하였다(SEQ ID NO: 4; 도 9). 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VH 및 VL) 사이의 서브유닛 간(inter-subunit) 접촉 부위에서 돌연변이 E44G/R45T의 조합뿐만 아니라 인간 VH 생식 계열(germline)에 특이적인 돌연변이의 초기 세트가 도입되었다(Q5V, S11L, D61A, Y77N, R93V). 앞에서 보았듯이(RU 2014138740), 이는 항체 경쇄와 함께 조합하여 VHH 유도체의 안정성을 제공한다.
또한, 표준 유전자 공학 절차에 따라, 상기 VHH17 유전자(SEQ ID NO: 1)를 경쇄 pEE-aTNFLc 구조물의 N- 말단에 클로닝 하였으며, 융합 분자 내에서의 폴리 펩티드의 올바른 독립적인 폴딩 및 상이한 항원과의 독립적인 결합에 필요한 특정 13-아미노산 가요성 링커에 의해 경쇄로부터 분리된다. 생성된 구조물을 pEE-VHH17-77N-aTNFLc로 명명하였다.
다른 아미노산 치환은 중쇄 pEE-aTNF-IgG1HcLALA 및 경쇄 pEE-VHH17-77N-aTNFLc의 CDR(도 10의 표 참조) (명칭 Kabat)에서 계산된 위치에 위에서 설명한 절차에 다음 공지된 프로토콜(Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit(NEB))에 따라PfuUltraHS 중합효소(Stratagene)를 사용하여 올리고 뉴클레오티드-유도 돌연변이 유발을 통해 도입되었다. 추가 작업을 위해 선택된 클론의 돌연변이를 도 10에 나타내었다.
중쇄 및 경쇄 돌연변이를 함유하는 구조물을 쌍으로 조합하여 실시 예 2에서 기술된 바와 같이 다양한 쌍 화합물을 수득하고 일시적 축적을 유지하였다. 이것은 항-TNFα 도메인의 CDRs 돌연변이가 없는 변이체(MabC) 1세대, 및 삼중 특이적 항체(Mab1-32; 도 11)의 32 변이체를 생성시켰다. 모든 변이체의 생산성은 100mg/l에 가깝거나 더 높았으며, 이는 그 특성에 대한 추가 연구를 만족시킨다.
실시예 11: 삼중 특이성 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 결합 분자에 의한 종양-알파 괴사 인자 중화의 비교 분석
항체의 시험 용액을 웰 당 2에서100㎕로 증가시키면서 500ng/ml의 농도에서 96- 웰 플레이트로 적정하였다. 500 pg/ml의 농도로 재조합 인간 TNFα의 용액을 제조한 다음, 50㎕를 시험 샘플과 함께 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다.
WEHI-13VAR 세포를 1 Х 106 세포/ml의 농도로 현탁하고 시험 용액으로 50㎕를 각 웰에 도입하였다. 플레이트를 CO2 배양기에서 37℃, 20-24 시간 동안 배양하였다. 살아있는 세포의 수는 생체 염색(vital stain) Alamar Blue를 사용하여 측정되었다. 인큐베이션 완료 후, Alamar Blue 시약 20㎕를 분석물 플레이트의 각 웰에 첨가 한 다음 플레이트를 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 실온에서 5분 동안 진탕하였다. 플레이트를 37℃에서 16-20 시간 동안 배양하였다. 형광 판독은 Fluoroskan Ascent FL 장치를 사용하여 544/590nm의 여기/방출 파장에서 상대 형광 단위로 평가되었다. 데이터 분석을 위해 Microsoft Excel을 사용하여 형광 신호 및 테스트 및 표준 샘플의 농도에 대한 의존도 다이어그램(dependency diagram)을 도시하였다.
도 12의 표는 돌연변이 되지 않은 변이체 MabC 및 단일 특이성 항-TNFα 항체 아딜리무맙과 비교하여 32 돌연변이 삼중 특이적 항체의 길항 활성을 비교 분석 한 결과를 나타낸다. 이 분석을 바탕으로 여섯 가지 최고의 변종을 선정하여 최고의 세 가지를 확인했다. Mab12(ED50 = 4ng/ml), Mab31(ED50 = 20ng/ml) 및 Mab32(ED50 = 4ng/ml). 도 13은 대조근과 관련된 이러한 변형의 비교 분석 다이어그램을 보여준다. 이 분석에 기초하여, Mab12 변이체는 추적 관찰을 위해 선정되었으며 BCD-121로 명명되었다.
또한, 동일한 방법을 사용하여, 상중 특이적 후보 BCD-121을 2종의 항-TNFα 단일 특이성 항체인 인플릭시맙(infliximab) 및 아달리무맙(adalimumab)과 비교하였다. 결과는 BCD-121는 6ng/ml의 EC50으로 아달리무맙(5배 초과) 및 인플릭시맙(10배 초과)보다 더 큰 길항 활성을 나타냄을 확인했다(도 14).
실시예 12: 삼중 특이성 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 결합 분자에 의한 IL-17A-의존성 IL-6 생산 저해의 비교 분석
인간 HT1080 세포(ATCC:CCL-121)에 의한 IL-6의 생산을 유도하는 IL-17의 능력을 사용하여 인간 재조합 IL-17A 및 TNFα의 존재 하에서 삼중 특이적 후보 BCD-121(실시 예 10 참조)의 중화 활성을 분석하였다. 세포는 10% 불활화된 태아 혈청, 젠타마이신 및 글루타민이 첨가된 DMEM 배양 배지에서 증식시켰다. 96웰 배양판에 5x104 세포/웰의 분취량을 첨가하고, 세포는 5시간 동안 고착시켰다. 40ng/ml 재조합체 IL-17A 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 항체 희석액과 함께 항온 처리했다. 그 다음, 세포에 사이토킨/항체 혼합물을 첨가하고 밤새 방치했다. HT1080 세포 배양물에 의한 IL-6의 생산은 IL-17 첨가량에 비례한다. 세포 상청액 샘플에 방출된 IL-6의 양은 DuoSet ELISA Development System Human IL6(RD System, Cat. No. DY206)을 사용하여 ELISA 기술로 평가했다. 그 결과를 도 15에 도시하였다. 재생된 항-TNFα 단일 특이성 항체 아달리무맙을 음성 대조군으로 사용하고 항 IL-17A 단일 특이성 항체 BCD-085를 양성 대조군(BIOCAD)으로 사용하였다. 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 아달리무맙은 IL-6 생산을 억제하지 못하고 BCD-085는 약 9.2ng/mL의 IC50으로 IL-6 생산을 억제하지만, BCD-121 항체는 3.5ng/mL의 IC50로 IL-6 생산을 유리하게 억제하였다. 따라서, 이 분석에서 후보 항체 BCD-121은 IL-6 생산의 가장 강력한 길항제이다.
실시예 13: 삼중 특이적 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 결합 분자 BCD-121에 의한 이중 IL-17A/ TNFα 의존성 IL-6 생성 저해 비교 분석
인간 HT1080 세포(ATCC:CCL-121)에 의한 IL-6의 생산을 유도하는 IL-17A 또는 이중 IL-17A/TNFα의 능력은 인간 재조합 IL-17A 및 TNFα의 존재하에 삼중 특이적 결합 분자 후보 BCD-121(실시 예 10 참조)의 중화 활성을 분석하는데 사용했다. 세포는 10% 불활화된 태아 혈청, 젠타마이신 및 글루타민이 첨가된 DMEM 배양 배지에서 증식시켰다. 96웰 배양판에 5x104 세포/웰의 분취량을 접종했다. 세포는 5시간 동안 고착시켰다. 40ng/ml 재조합체 IL-17A 및 20ng/ml TNF-α의 혼합물은 항체 희석액과 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 그 다음, 세포에 사이토킨/항체 혼합물을 첨가하고 밤새 방치했다. HT1080 세포배양물에 의한 IL-6의 생산은 IL-17A 첨가량에 비례했다. 세포 상청액 샘플에 방출된 IL-6의 양은 DuoSet ELISA Development System Human IL6(RD System, Cat. No. DY206)을 사용하여 ELISA 기술로 평가했다. 그 결과를 도 16에 도시하였다. 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, BCD-121 삼중 특이적 항체는 단일 특이적 항체와 비교하여 유리한 효과를 나타내며, 낮은 플래토(lower plateau)에서 약 25pM의 IC50 값 및 거의 검출할 수 없는 양의 IL-6을 나타낸다. 대조적으로, 대조군 항체 아달리무맙은 약 100pM의 IC50 값을 가졌다. BCD-085는 약 25pM의 유사한 IC50 값을 보였으나, BCD-121보다 20배 더 낮은 역치 플래토(plateau)를 갖는다. 따라서, BCD-121은 사용된 분석에서 IL-6 생산의 가장 강력한 길항제이다.
실시예 14: Jurkat - tmTNFα 세포에서 삼중 특이적 항-IL-17A/항-IL-17F/항-TNFα 결합 분자 BCD-121의 항체 의존성 세포 독성( ADCC ) 분석
하기 정량 분석에서 사용하기 위해, Jurkat-tmTNFα cl.8 세포 배양물을 플라스크로부터 수집하고 5분 동안 200g에서 원심 분리하였다. 상등액을 따라 내고, 정량적 측정을 위해 다시 한번 배지에서 세척하였다.
상기 세포 펠릿을 5㎖의 정량용 배지에 현탁시켰다. 세포 생존력 및 수를 측정하였다. 백색 96-웰 배양 플레이트를 접종하기 위한 세포 현탁액을 3Х105cells/ml로 제조하였다.
시험 샘플을 96-웰 플레이트의 웰에 희석시켰다. 시험 샘플을 갖는 웰에서, 상기Jurkat-tmTNFα cl.8 세포 현탁액을 첨가하고 플레이트를 CO2 배양기에서 15 내지 30분 동안 배양하였다.
PBMC 세포의 현탁액을 7.5 x 106세포/ml의 농도로 제조하고 시험 샘플을 갖는 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다.
분석 완충액을 "CytoTox-Glotm Cytotoxicity Assay" 세트의 AAF-GloTM Substrate와 혼합한 다음 시험 샘플을 사용하여 각 웰에 첨가 하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션 하였다.　형광은 Fluoroskan Ascent FL 장치에서 측정되었다. 이 방법에 의해, 세포 내 프로테아제의 활성이 결정된다; 발광 신호는 용해된 세포의 수에 비례한다.도 17에 나타낸 바와 같이, BCD-121은 IgG1 유래 항체인 아달리무맙 및 인플릭시맙(infliximab)과 비교하여 약 100배 적은 ADCC 활성을 나타내었고, 이 활성 수준에서 심지아(cimzia)(Fab-PEG)와 비교할 만하다.
실시예 15: Jurkat - tmTNFα 세포에서 삼중 특이적 항-IL-17A/항 -IL-17F/항-TNFα 결합 분자 BCD-121의 보체 의존적 독성( CDC ) 분석
항체의 시험 용액을 96- 웰 플레이트에서 2씩 증가시키면서 15μg/ml의 농도로 50 μl/웰에 적정하였다. 인간 보체를 분석용 냉각 배지(1% BSA를 함유하는 RPMI)에 1:3으로 용해시키고 시험 샘플을 갖는 웰에 50㎕를 첨가하였다. 　Jurkat-tmTNFα 세포 현탁액 50㎕를 1 x 106 세포/ml(웰 당 5 x 104 세포)의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 오비탈 쉐이커상에서 3분 동안 진탕시키고 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 2-3 시간 동안 두었다. 살아있는 세포의 수는 생체염색(vital stain) Alamar Blue를 사용하여 측정되었다. 인큐베이션 완료 후, Alamar Blue 시약 15μl를 분석물 플레이트의 각 웰에 첨가 한 후, 플레이트를 실온에서 5분 동안 오비탈 쉐이커로 진탕하였다. 플레이트를 37℃에서 18 내지 24 시간 동안 배양하였다. 형광 판독은 Fluoroskan Ascent FL 장치를 사용하여 544/590nm의 여기/방출 파장에서 상대 형광 단위로 평가되었다.
도 18에 도시된 바와 같이, BCD-121은 IgG1 유래 항체 아달리무맙(adalimumab) 및 인플릭시맙(infliximab)과 비교하여 Jurkat-tm TNFα cl.8 세포에서 CDC 활성을 나타내지 않으며, 심지아(Fab-PEG)와 유사한 수준이다.
실시예 16: OctetRED96 장치를 사용하여 BCD-121과 인간 IL-17A 및 사람 TNFα의 동시 상호 작용 분석
인간 IL-17A 및 인간 TNFα에 대한 BCD-121의 동시 결합 분석은 Octet Red96 장치(Pall-ForteBio)에 의한 고전적인 "Sandwich" 분석 방법을 사용하여 수행되었다(도 19). 분석은 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 사용하여 30℃에서 러닝 버퍼로서 수행하였다. 실험 동안, 제1항원(IL-17A-biotin)을 스트렙타비딘 코팅된 센서에 20μg/ml의 농도와 200 μl/well의 양으로 고정시켰다. 추가 센서는 20μg/ml의 농도로 항체 200μl/well의 항체 용액에 담갔다. 이어서, 센서를 1mg/ml의 농도로 200㎕/웰의 TNFα 용액 및 단백질을 함유하지 않는 염수(saline)에 침지시켰다.
베이스 라인 신호를 뺀 결합 곡선을 표준 절차에 따라 Octet Data Analysis(버전 7.0)을 사용하여 분석하였다.
도 19에 나타낸 센조그램(sensogram)은 삼중 특이적 결합 분자 BCD-121이 IL-17A 및 TNFα에 동시에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 17: Biacore T200 장치를 이용한 이종상동성 ( orthologous ) IL-17A 및 TNFα 리간드와의 BCD-121 결합 분석
분석은 Sino Biologics에 의해 제조된 IL-17A 및 TNFα 제제를 사용하는 샌드위치 방법을 사용하여 수행되었다. 칩의 활성화 후, 개별 리간드는 20μg/ml의 농도로 바이오 센서 표면상에(NH2 그룹에 의해) 비특이적으로 고정되었다. 이어서, 항체의 로딩을 1 내지 25㎍/ml의 농도로 수행하였다. 그 후, 센서는 복합 해리 단계를 위해 러닝 버퍼에 잠겼다. 유속은 10 μl/min이었다.
수득된 데이터의 분석은 BIA Evolution 3.1 소프트웨어 및 Heterogeneous Ligand 모델을 사용하여 수행하였다.
[표 3]은 BCD-121과 인간 및 영장류의 이종상동성(orthologous) IL-17A 및 TNFα 리간드와의 상호 작용에 대한 데이터를 나타낸다. BCD-121은 모든 리간드에 대해 매우 높은 친화성(pM 이하)을 나타낸다.
IL-17A, IL-17F 및 TNFα에 대한 BCD-121의 친화도
IL-17A human KD, M IL-17A cyno KD, M IL-17F human KD, M( OctetRED96 )
BCD-121 <<1,0E-12* ~1,0E-12 ~4,0E-9
TNFα human KD, M TNFα cyno KD, M TNFα multta KD, M
BCD-121 <<1,0E-12* <<1,0E-12* ~1,0E-12
*- Biacore T200 장치의 임계 민감도 이하
실시예 18: BCD-121과 다양한 IL-17 계열 항원(A, B, C, D, E, F 및 A/F) 사이의 상호 작용에 대한 효소 면역 분석
ELISA를 사용하여 BCD-121의 인간 IL17 패밀리 항원에 대한 비교 결합을 측정하였다. 결합 분석을 위해, ELISA 플레이트(Greiner bio로부터의 배지 결합)를 (1X 코팅 탄산염 완충액 중) 1㎍/ml 의 농도로 50㎕의 인간 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-17A/F(R & D Systems)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 항온처리했다. 모든 후속 단계는 표준 EIA 프로토콜에 의해 수행되었다. 비특이적 결합은 차단 완충액 BB(PBS 중의 0.5% 탈지유 200㎕)를 첨가하여 차단시켰다. 평판은 실온에서 1h 동안 진탕기에서 항온처리했다. PBS-Tween으로 세척한 후, 50 ㎕의 시험 항체를 PBS-Tween 중 5㎍/ml의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 실온에서 1시간 동안 진탕 배양한 다음, 플레이트의 각 웰을 PBS-Tween 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후, 인간 항-Fab HRP-접합 2차 항체(Pierce-ThermoScientific)를 PBS-Tween 중 1:5000의 비율로(50㎕/웰) 첨가하였다. 플레이트를 회전 진탕기(50분, 실온)에서 진탕시키고, 전술한 바와 같이 PBS-Tween 완충액으로 3회 세척하였다. 포화될 때까지(평균 3 내지 5min) TMB(100㎕/웰)를 첨가하여 비색 시그널을 수득하고, 추가 발색은 정지 용액(100㎕/웰, 10% 황산)을 첨가하여 차단시켰다. 흡광도는 적당한 Tecan-Sunrise 평판 판독기(Tecan)를 사용하여 450nm에서 측정했다. 항체 결합은 생성된 시그널에 비례했다.
인간 IL-17 패밀리의 구성원과 BCD-121의 상호 작용의 결과가 도 20에 제시되어있다. BCD-121에 대한 광흡수 농도의 곡선으로부터 알 수 있는 바와 같이, 삼중 특이적 결합 분자는 높은 친화력으로 IL-17A 및 IL-17F와 특이적으로 상호 작용하고, 낮은 친화력으로 갖는 천연 헤테로다이머 IL-17A/F와 상호 작용한다. BCD-121은 다른 패밀리 구성원들과 교차 반응을 보이지 않는다.
실시예 19: 기니아 피그 , 토끼 및 마우스 TNFα와 BCD-121의 상호 작용의 효소 면역 측정법
ELISA 분석은 실시 예 16에서 기술된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 인간, 기니아 피그, 토끼 및 마우스 TNFα 항원은 R&D Systems의 것이다.
인간, 기니아 피그, 토끼 및 마우스 TNFα와 BCD-121의 상호 작용 결과를 도 21에 나타내었다. BCD-121의 광흡수-농도에 대한 곡선으로부터 알 수 있는 바와 같이, 삼중 특이적 결합 분자는 특이적으로 그리고 인간 TNFα에만 높은 친화성으로 반응한다. BCD-121은 TNFα 상동성(orthologs)(실시 예 17에 나타낸 바와 같이 영장류 TNFα 상동성을 제외하고)와 교차-반응하지 않는다.
실시예 20: 동적 광산란법 (Dynamic Light Scattering Method, DLS)을 사용하여 단백질 응집 점을 평가함으로써 열 안정성 결정
Zetasizer Nano ZSP 장치에서 시료(1mg/ml)의 응집점을 측정했다. 용액 0.5ml를 분진이 없는 석영 큐벳에 넣고 장치에서 1.5oC 단계로 50℃에서 85℃로 서서히 가열했다. 각 온도는 산란광 강도의 일정한 측정으로 30초 동안 유지되었다. 산란광의 강도는 각도 θ = 173°에서 검출되었다.
동적 광산란법을 이용하여 얻어진 데이터를 4개의 상이한 완충액에서의 단백질 응집점(protein aggregation points)에 대해 도 22 및 [표 4]에 나타내었다.
동적 광산란으로 측정한 BCD-121 응집점
발생 샘플(Incurred samples) 응집점
BCD-121 아세테이트 버퍼, pH 5.0 69.5℃
구연산염 버퍼, pH 5.0 66.5℃
히스티딘 버퍼, pH 6.0 69.5℃
인산 버퍼, pH 6.0 65.0℃
실시예 21: 열 스트레스 50℃ 방법으로 장시간 노출시 열 안정성 측정
~ 5mg/ml의 농도에서 단백질 샘플을 각각 200μl의 3부분으로 나누어 별도의 튜브에 넣었다: 각각의 조성물에 대한 1개의 튜브를 +4℃에서 냉장고에 보관하고 다른 2개를 시험관 히터에 넣고 50℃에서 각각 6시간 및 24시간 동안 배양했다. 가온 후, 튜브를 히터로부터 제거하고, 실온에서 15분간 방치하고, 8000rpm으로 5분간 원심 분리하고, 상등액을 UV 검출기로 겔 여과하여 옮겼다.
크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 대한 연구 표준이 사용되었다(Bio-rad; 카탈로그 번호 151-1901).50℃의 장시간 가열 하에서 다양한 완충액에서의 BCD-121 안정성 데이터를 도 23의 표에 나타내었다.
상기 결과는 모든 테스트된 완충액이 만족스러운 BCD-121 열 스트레스 안정성을 제공함을 보여준다.
실시예 22 : BCD-121 생산을 위한 안정적인 세포주 생성
BCD-121에 대한 안정한 생산자 세포주는 Neon Transfection System(Life Technologies) 슬러리 모 세포주 CHO-S 벡터 구성을 사용하여 전기천공법(electroporation)으로 형질 감염시켜 수득하였으며, 경쇄 및 중 중쇄 항체 사슬을 최적화된 비율로 함유한다. ClonePix 로봇 플랫폼(Molecular Devices)을 사용하여 높은 생산성(최대 1000mg/L)을 가진 클론 라인(clonal lines)을 수득하였고, minipool 선별의 예비 단계는 다양한 배양 형태에서 항생제를 사용하여 수행되었다. 생산성 분석은 분석 시스템 Octet RED96(Pall Life Sciences)을 사용하여 수행되었다. DOE는 자동화 시스템 Biomek FX 로봇 공학(Beckman Coulter)을 사용하여 기본 배지 및 배양 계획을 선택했다. 생산 세포를 배양하기 위해, 무혈청 배지 및 피팅을 사용하였으며, 이는 동물성 단백질을 함유하지 않는다. 전임상 연구를 위한 BCD-121의 축적은 HyClone 단일-사용 생물 반응기(Thermo Fisher Scientific)에서 50 리터의 작업 부피로 수행되었다.
실시예 23: 생산적인 안정적인 세포주 환경에서 BCD-121 분리
BCD-121을 함유하는 배양액의 정화는 딥-베드 필터 Millistak C0HC(Merck-Millipore)에서 수행되었다. 1차 항체 정제는 특정 표적 단백질을 사용하여 단백질 A와의 친화성 수지상에서 수행되었고, 항체는 pH3.3 ~ 3.8에서 글리신 완충액으로 용출되었다. 용출액을 바이러스성 불활성화를 위해 산성 pH에서 30-60분 동안 항온 처리 한 다음 1M Tirs-OH 용액으로 중화시켰다. 최종 크로마토그래피 정제는 흡착제 CHTTM Ceramic Hydroxyapatite(Bio-Rad)를 사용하여 잔류 DNA, 단백질 생산 세포, 절단된 리간드 친화력 흡착제 응집체 및 항체 단편을 제거하였다. 이 방법에서는 단백질 용액을 pH 7.5로 제조한 흡착제에 가한 다음 염화나트륨으로 특이적 용출 구배를 가하였다. 정제된 단백질을 Viresolve PRO 필터 세트(Merck Millipore)를 사용하여 바이러스에 대해 여과하였다. 단백질은 50 kDa의 컷오프 한계치를 갖는 테이프상의 접선 유동(tangential flow)에서 농축되고, 이어서 아세테이트 완충액(pH 5.0), 소르비톨 및 폴리소르베이트-80을 함유하는 최종 완충액에 대한 투석 여과가 이루어졌다. 최종 용액 중의 단백질 농도는 70mg/ml 이상이었다.
정제 결과는 도 24에 제시되어 있다. 환원 조건과 비환원 조건에서 SDS를 이용한 폴리아크릴아미드겔을 이용한 수직 전기 영동은 제품의 순도를 입증하였으며, 이는 약학 조성물에서 사용하기에 충분하다.
실시예 24: 순수한 혈청에서 BCD-121의 안정성을 보여주는 효소 면역 측정법
순수 인간 혈청 내 BCD-121의 안정성을 평가하기 위해, 삼중 특이적 항체를 7명의 건강한 공여자로부터 얻은 순수한 인간 혈청 혼합물에 2, 10 및 50μg/ml의 농도로 첨가하고 0.01%의 티메로살로 보존하고 37℃에서 7일간 보관하였다. 7일 후, BCD-121의 농도를 ELISA에 의해 2가지 분석 포맷으로 측정하였다: 고정화된 TNFα 및 스트렙타비딘-HRP 접합체와 함께 비오틴화 IL-17 검출 및 염소 항-인간 IgG Fc-HRP 접합체와 함께 고정화된 TNFα 검출. ELISA 측정 직전에 BCD-121을 2, 10, 50μg/ml의 농도로 첨가한 혈청 검체를 대조군으로 사용하였다. 측정은 다음과 같이 수행하였다 : 2, 10 또는 50μg/ml의 BCD-121을 함유한 대조군과 보관 혈청 시료를 100ng/ml(각각 20, 100 및 500 배)로 희석하고, 실제 농도는 PBS-Tween에 용해된 표준 검정 곡선(6.25 ~ 200ng/ml)에 대해 측정되었다. 모든 ELISA 단계는 표준 EIA 프로토콜에 의해 수행되었다. 100㎕의 희석된 시료 또는 보정 표준을 TNFα에 의해 미리 코팅된 마이크로 웰에 첨가하였다. 코팅된 TNFα의 농도는 pH 9.5에서 20 mM 탄산염 완충액에서 2 μg/ml이었다. 이어서, 블로킹 완충액(BB: PBS 중 0.5% 탈지유 200 ㎕)을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕기에서 인큐베이션하였다. PBS-Tween으로 세척한 후, 비오틴화 IL17(3μg/ml) 또는 염소 항-인간 IgG Fc-HRP(Sigma로부터, 1:20000의 비율로) 100 μl를 PBS-Tween에 농도로 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 실온에서 1시간 동안 진탕 배양한 다음, 플레이트의 각 웰을 PBS-Tween 완충액으로 3회 세척하였다. 바이오틴 화 IL17이 미리 첨가된 웰에 1:20000(Sigma)의 비율로 스트렙타비딘-HRP 접합체 100㎕를 추가로 첨가하였다. 1시간 동안 계속 배양하고 세척한 후, 포화(평균 10-15 분)될 때까지 TMB(100㎕/웰)를 첨가하여 비색 신호를 발색시킨 다음 종결 용액(50㎕/웰 10% 황산)을 첨가하여 종료시켰다. 적절한 플레이트 판독기(Tecan-Sunrise; Tecan)를 사용하여 450nm에서 색 신호를 측정하였다. BCD-121 결합 양은 색 신호 생성에 비례한다. 검량선 농도(calibration curve)에 희석 배수를 곱하여 이론적으로 혈청 BCD-121 농도에 대한 %로 표시하였다.
실시예 25: 생체 내에서 BCD-121 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 결합 분자의 유효성 평가
아래의 연구는 콜라겐 유도성 관절염 모델을 사용하여 수컷 흰쥐 원숭이(Macaca fascicularis)에서 수행되었다. 실험에서 총 동물 수는 20마리(각각 4마리의 원숭이 5개 그룹)이다. 실험에서, 제품의 4회 복용량을 사용하였다 : 0.2mg/kg; 1.0㎎/㎏; 5.0mg/kg; 및 10.0mg/kg. 대조군 동물은 플라세보를 받았다. 제품 및 플라세보의 투여는 콜라겐을 예비 감작(preliminary sensitization) 후에 시작되었다. 이 연구 동안 모든 그룹의 동물을 측정하여 APW의 관절 표면을 계산했다. 연구가 끝나면, 중수지절(metacarpophalangeal)과 중족지절관절(metatarsophalangeal-phalangeal joints)는 파괴적인 변화의 심각성을 평가하기 위해 취해졌다. 실험 그룹에 대한 개략도가 아래의 [표 5]에 나와 있다.
그룹 번호 동물 수 제품 투여 루트 양
1 4(♂) BCD-121 피하 0.2mg/kg
2 4 (♂) 1.0mg/kg
3 4 (♂) 5.0mg/kg
4 4 (♂) 10.0mg/kg
5 4 (♂) Placebo -
관절염 유도를 위해, 소 유형 II 콜라겐(Sigma)의 에멀젼을 동물에게 3회 투여하였다.
콜라겐의 제1투여:
콜라겐의 총 투여량은 실험 동물 당 2mg이었다. 이 목적을 위해 2mg의 콜라겐을 0.1M 아세트산의 0.7ml 에 용해시켰다. 이 용액에 완전 Freund's 보조제 0.7ml를 가했다.
동물은 콜라겐의 제1투여 후 28일 동안 유지되었다.
콜라겐의 제2투여:
콜라겐의 총 투여량은 실험 동물 당 3mg이었다. 이 목적을 위해 3mg의 콜라겐을 0.1M 아세트산의 1ml 에 용해시켰다. 이 용액에 완전 Freund's 보조제 1ml를 가했다.
동물은 콜라겐의 제2투여 후 21일 동안 유지되었다.
콜라겐의 제3투여:
콜라겐의 총 투여량은 실험 동물 당 3mg이었다. 이 목적을 위해 3mg의 콜라겐을 0.1M 아세트산의 1ml 에 용해시켰다. 이 용액에 완전 Freund's 보조제 1ml를 가했다.
관절의 크기 측정은 다음 시점에서 분배기(dividers)에 의해 수행되었다.
·콜라겐의 제1투여 전;
·콜라겐의 제2투여시; 및
·7주간 콜라겐의 투여 직전 제2투여 후 매주.
측정 프로세스 동안 관절의 세로(longitudinal)축 및 가로(transverse)축을 측정하였다. 이 절차는 엄지 손가락을 제외한 모든 중수지절 관절과 중족지절 관절에 대해 수행되었다. 면적 계산은 다음 식에 의해 수행되었습니다.
JA = 세로축의 값 × 가로축의 값 × 3,14 × 0,25.
각 동물의 16 개 관절에 대한 데이터는 염증 부위(PIA)의 백분율을 계산하는 데 사용되었다.이 계산은 다음 공식으로 수행되었습니다.
실험 당일의 JA값 Х 100
관절염 유발 전의 JA 평균치
도 26에 나타낸 결과는 원숭이 CIA 모델에서 BCD-121의 용량 의존성 항염증 효과를 입증한다.
실시예 26: BCD-121 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 결합 분자의 독성태학 평가
독성 동태학 분석은 시노몰구스 마카크(cynomolgus)에서 수행되었다. 이 연구는 BCD-121 생성물의 3가지 복용량 수준을 사용했다. 실험 그룹의 개략도를 하기 [표 6]에 나타내었다.
그룹 번호 동물의 수 생성물 투여 루트 복용량
1 3 (♂) BCD-121 피하 최소
2 3 (♂) BCD-121 중간
3 3 (♂) BCD-121 최대
4 3 (♂) 플라세보 -
연구 과정에서 다음 매개 변수가 평가되었다.
　- 임상 시험 결과;
　- 동물의 체중(투여 전 및 실험 7, 14, 21, 28, 35 및 42일);
　- 체온(투여 전, 투여 후 1, 2, 4, 6, 24 시간 실험 7, 14, 21, 28, 35, 42 일에);
　- 소변 검사(투여 전 및 실험 7, 14, 21, 28, 35 및 42일);
　- 매개 변수에 대한 임상 혈액 분석: 적혈구 수, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도(투여 전 및 실험 7, 14, 21, 28, 35 및 42 일);
　- 혈청 비율의 생화학적 분석: LDH, 총 빌리루빈, 총 단백질, 포도당, 아스파테이트 아미노전이효소 및 알라닌 아미노전이효소(투여 전 및 실험 7, 14, 21, 28, 35 및 42 일); 및
영장류의 혈청 내 약물 농도(투여 후 0.5, 1, 3, 6, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 264, 336, 408, 504, 624, 720, 816, 912 및 1008 시간).
ELISA와 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)를 지표 효소로 사용하여 혈청 내 약물의 수준을 평가했다.
96-웰 마이크로타이터 플레이트("Costar", Cat. No. 3590)의 웰을 250ng/100 μl의 20 mM Tris ΡI 버퍼 용액(well 당 9.0)에 기초한 재조합 인간 TNFα로 감작시키고 4℃에서 16-18 시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 항원은 웰에서 제거되었다. 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 1.0% BSA, 0.14M NaCl 및 0.05% Tween-20(블로킹 완충액-BB)을 함유하는, pH 7.2-7.4(TB), 200㎕의 20 mM Tris HCl 완충 용액을 각각의 웰에 도입하고, 그 다음 웰을 37℃에서 30분 동안 배양하였다. BB 용액을 제거하고, BB로 1000-10000배 희석한 시험 혈청 100㎕를 각 웰에 도입하였다. 　3.9~250ng/ml의 범위에서 BCD-121의 다른 농도를 함유한 BB 100 μl를 각 웰에 넣었다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 웰 내용은 제거되고, 웰을 0.05 Tween-20을 함유하는 200㎕의 TB로 각각 3회 세척하고, 겨자무과산화효소(≪Sigma≫, USA, Cat. No. 0170 at working dilution)로 표지된 인간 IgG Fc-단편에 대한 항체를 함유하는 100㎕의 BB를 각 웰에 도입하고, 그 다음 웰을 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 웰 내용물을 제거하고, 각 웰을 0.05 Tween-20을 함유하는 200㎕의 TB 및 0.1mg/ml 테트라메틸벤지딘을 함유하는 pH 5.0, 100㎕의 0.1M 아세트산 나트륨 완충액으로 4회 세척하고, 0.003% H2O2를 각 웰에 넣었다. 반응을 멈추기 위해, 50㎕의 2M H2SO4를 각각의 웰에 도입하고, 450nm에서 플레이트 분광 광도계를 사용하여 웰의 흡광도를 측정하였다.
시험 샘플에서 BCD-121의 농도를 결정하기 위해, 참조 표준에서의 BCD-121의 흡광도와 농도 사이의 관계의 검정 곡선이 그려졌으며, 시험 샘플로 수득한 흡광도 값을 사용하여 BCD-121의 농도를 측정하였다.
신뢰성있는 BCD-121 검출의 하한은 2ng/ml이었다.
시험 혈청(Υ)에서 BCD-121의 농도(μg/ml)는 다음 공식에 따라 계산되었다.
Х = A x F
여기서, A-검량선을 사용하여 결정된 시험 샘플에서 BCD-121 표의 농도,ng/ml;
F-초기 혈청 희석.
PK 프로파일의 결과는 예상 수준의 BCD-121을 나타냈다(도 27). 말기 배치(terminal disposition) 반감기는 12일 이상으로 계산되었다. 원숭이에서 얻은 BCD-121의 PK 프로파일은 천연 인간 IgG 항체와 유사하였고 전형적인 용량 의존성을 보였다.
실시예 27: 시노몰구스(Cynomolgus)원숭이에게 1개월 반복 피하 투여시 다음 1개월 동안의투여 없는 기간의 독성 평가
BCD-121를 1개월 반복 피하 투여한 다음 다음 1개월 동안의 투여 없는 기간의 독성 평가가 Javanese macaques에 대해 수행되었다. 실험에서 3회 복용량 수준이 사용되었다. 실험 그룹의 도식을 하기 [표 7]에 나타내었다.
그룹 번호 동물의 수 생성물 투여 루트 복용량
1 3 (♂) BCD-121 피하 최소
3 (♀)
2 3 (♂) BCD-121 중간
3 (♀)
3 3 (♂)* BCD-121 최대
3 (♀)*
3 (♂)
3 (♀)
4 3 (♂) 플라세보 -
3 (♀)
연구 과정에서 다음 매개 변수가 평가되었다.
　- 임상 시험 결과;
　- 동물 체중(투여 전과 매주);
　- 체온(투여 전, 실험 종료까지 매주);
　- 폴리 스펙트럼(Poly-Spectrum) 시스템을 사용하여 심장의 생체 전기 활동을 평가한 심혈관 시스템에 대한 영향; 투여 전, 그리고 실험 3, 5, 7주에 평가하였다;
- 소변 검사(투여 전, 실험 3, 5, 7주);
- 매개 변수에 대한 임상 혈액 분석: 적혈구 수, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도, 림프구 수, 단핵구 수, 호중구, 호산구 및 호염기구 및 혈소판 수(투여 전, 실험 첫 주로부터 시작하여 1주일에 1회);
- 혈액 응고 시스템에 미치는 영향 평가: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 피브리노겐 농도, 및 프로트롬빈 시간(투여 전, 다음 실험 3, 5 및 7주);
　- 혈청 비율의 생화학적 분석:
나트륨, 칼륨, 크레아티닌, 요소, 알칼라인 포스파타제, LDH, 총 빌리루빈, 총 단백질, 포도당, 트리글리세라이드, 아스파테이트 아미노전이효소, 알라닌 아미노전이효소, 총 콜레스테롤(투여 전 및 실험 3, 5, 7주);
　- 투여 기간이 끝날 때 3*군의 위성 동물(satellite animals)을 안락사시킨 후 병리학적으로 검사하였다: 연구 종료시, 3군과 대조군의 동물은 동일하게 투여되었다.
　- 독성 연구의 일환으로,
주입 부위의 연조직을 선택하고 조직 검사를 시행하여 국소 자극제의 영향도 평가하였다.
실시예 28: BCD-121 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 결합 분자의 면역 독성 연구
BCD-121를 1개월 반복 피하 투여한 다음 다음 1개월 동안의 회복 기간의 면역 독성 평가가 Javanese macaques에 대해 수행되었다. 실험에서 3회 복용량 수준이 사용되었다. 실험 그룹의 도식을 하기 [표 8]에 나타내었다.
그룹 번호 동물의 수 생성물 투여 루트 복용량
1 3 (♂) BCD-121 피하 최소
3 (♀)
2 3 (♂) BCD-121 중간
3 (♀)
3 3 (♂) BCD-121 최대
3 (♀)
4 3 (♂) 플라세보 -
3 (♀)
연구 과정에서 다음 매개 변수가 평가되었다:
- 림프구의 모집단 구성, 이는 투여 전과 실험 2, 4 및 6주에 평가하였다.
- 면역 글로불린 종류 비율, 이는 투여 전 및 실험 2, 4 및 6주에 평가하였다;
- 식균 작용에 미치는 영향을 투여 전과 투여 후 실험 2, 4 및 6주에 평가하였다;
실시예 29: BCD-121 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 결합 분자의 반복 피하 투여시 면역원성 평가
BCD-121를 1개월 반복 피하 투여한 다음 1개월 동안의 회복 기간의 면역원성 평가가 Javanese macaques에 대해 수행되었다. 실험에서 3회 복용량 수준이 사용되었다. 실험 그룹의 도식을 하기 [표 9]에 나타내었다.
그룹 번호 동물의 수 생성물 투여 루트 복용량
1 3 (♂) BCD-121 피하 최소
3 (♀)
2 3 (♂) BCD-121 중간
3 (♀)
3 3 (♂) BCD-121 최대
3 (♀)
면역 원성 검정은 투여 전 및 실험 3, 5, 7주에 혈청을 선택하여 분리하여 항체 결합 수준에서 수행되었다.
실시예 30: BCD-121 항-IL-17A/항-IL-17F/항- TNFα 결합 분자의 반복 피하 투여 중 약물 동태학 평가
BCD-121를 1개월 반복 피하 투여한 다음 다음 1개월 동안의 회복 기간의 약물동태학 평가가 Javanese macaques에 대해 수행되었다. 실험에서 3회 복용량 수준이 사용되었다. 실험 그룹의 도식을 하기 [표 10]에 나타내었다.
그룹 번호 동물의 수 생성물 투여 루트 복용량
1 3 (♂) BCD-121 피하 최소
3 (♀)
2 3 (♂) BCD-121 중간
3 (♀)
3 3 (♂) BCD-121 최대
3 (♀)
제품 수준을 평가하기 위해 혈액 샘플링을 실험 1, 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 29, 36, 및 43일에 수행했다.
SEQ ID NO: 설명
1 VHH17 CDR1 아미노산 서열
2 VHH17 CDR2 아미노산 서열
3 VHH17 CDR3 아미노산 서열
4 VHH17 아미노산 서열
5 항-TNFα HC 아미노산 서열
6 항-TNFα LC 아미노산 서열
7 VHH17 + 항-TNFα LC 아미노산 서열
8 항-TNFα VH 아미노산 서열
9 항-TNFα VL 아미노산 서열
10 항-TNFα HC-CDR1 아미노산 서열
11 항-TNFα HC-CDR2 아미노산 서열
12 항-TNFα HC-CDR3 아미노산 서열
13 항-TNFα LC-CDR1 아미노산 서열
14 항-TNFα LC-CDR2 아미노산 서열
15 항-TNFα LC-CDR3 아미노산 서열
16 펩티드 링커
17 모(parent) VHH 아미노산 서열
18 모(parent) 항-TNFα VH 아미노산 서열
19 VKY92F 아미노산 서열
20 VKY94F 아미노산 서열
21 VKS50A 아미노산 서열
22 VKS50D 아미노산 서열
23 VKS50G 아미노산 서열
24 VKN33D 아미노산 서열
25 VKN33A 아미노산 서열
26 VHG33A 아미노산 서열
27 VHG33S 아미노산 서열
28 VHN35A 아미노산 서열
29 VHN35H 아미노산 서열
30 VHN35S 아미노산 서열
31 VHN52T 아미노산 서열
32 VHN52Q 아미노산 서열
<110> JOIMT STOCK COMPANY "BIOCAD" <120> TRISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST IL-17A, IL-17F AND OTHER PRO-INFLAMMATORY MOLECULE <130> PCTRU2016050073 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH17 CDR1 amino acid sequence <400> 1 Gly Thr Phe Ala Thr Ser Pro Met Gly 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH17 CDR2 amino acid sequence <400> 2 Ala Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asp Arg Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH17 CDR3 amino acid sequence <400> 3 Val Arg Arg Arg Phe Asp Gly Thr Ser Tyr Tyr Thr Gly Asp Tyr Asp 1 5 10 15 Ser <210> 4 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH17 amino acid sequence <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ala Thr Ser 20 25 30 Pro Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Thr Glu Phe Val 35 40 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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Val Phe Leu Phe 290 295 300 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 305 310 315 320 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 325 330 335 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 340 345 350 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TNF alpha LC amino acid sequence <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH17 + anti-TNF alpha LC amino acid sequence <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ala Thr Ser 20 25 30 Pro Met 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Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VKY92F amino acid sequence <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VKY94F amino acid sequence <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VKS50A amino acid sequence <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VKS50D amino acid sequence <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VKS50G amino acid sequence <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VKN33D amino acid sequence <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VKN33A amino acid sequence <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHG33A amino acid sequence <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHG33S amino acid sequence <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHN35A amino acid sequence <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHN35H amino acid sequence <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHN35S amino acid sequence <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHN52T amino acid sequence <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Thr Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHN52Q amino acid sequence <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Gln Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (43)

  1. 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    인간 TNFα에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하는 삼중특이적(tri-specific) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 제1 결합 도메인은 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열을 포함하되, 여기서 H-CDR1은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, H-CDR2는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하며, H-CDR3은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제2 결합 도메인은 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하되, 여기서 H-CDR1은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하고, H-CDR2는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하며, H-CDR3은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고, L-CDR1은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하고, L-CDR2는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하며, L-CDR3은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 결합 도메인은 인간화된(humanized), 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서,
    상기 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항에 있어서,
    제2 결합 도메인은 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, Fv, Fab, F(ab')2, 단일 사슬 Fv 분자(scFv) 또는 디아바디인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서,
    상기 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제1항에 있어서,
    인간 IL-17A 및 인간 IL-17F에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    인간 TNFα에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하고,
    상기 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 제1 결합 도메인 및 상기 제2 결합 도메인은 5개 이상의 아미노산의 펩티드 링커에 의해 결합되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 펩티드 링커의 아미노산 잔기가 G, A, S, P, E, T, D 및 K로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편는 이소타입(isotype) IgG의 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 항체는 이소타입 서브타입 IgG1인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 삭제
  28. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 특성들:
    a) 10-11M 또는 이하의 IL-17A에 대한 KD;
    b) 10-7M 또는 이하의 IL-17F에 대한 KD;
    c) 10-11M 또는 이하의 TNFα에 대한 KD;
    d) HT1080 세포의 IL-6 분석에서 200ng/mL 이하의 농도에서 IL-17A 및/또는 IL-17A/TNFα의 활성을 50% 이상 저해함;
    e) HT080 세포에 의한 IL-17A 의존성 IL-6 방출을 억제함;
    f) HT1080 세포에서 IL-6의 생성을 억제함;
    g) WEHI-13VAR 세포에서 100ng/mL 이하의 농도에서 TNFα 의존성 세포 독성을 50% 이상 저해함;
    h) 토끼, 마우스 또는 기니아 피그 TNFα에 결합하지 않음;
    i) 동시에 IL-17A 및 TNFα에 결합함;
    j) 사이노몰거스(cynomolgus) IL-17A 및 TNFα에 결합함;
    k) 인간 혈청에서 37℃에서 7일간 배양한 후에도 안정적임;
    l) 생체 내(in vivo)에서 12일 이상의 반감기를 가짐;
    m) 생체 내 관절염 모델에서 전염증성(pro-inflammatory) 효과를 가짐; 및
    n) 생체 내에서 IL-17 및 TNFα의 활성을 억제함
    중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제1항, 제7항, 제8항, 제14항 내지 제16항, 제18항 내지 제26항, 및 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
    약학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하는, IL-17A, IL-17F 또는 TNFα에 의해 매개되는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로서,
    상기 IL-17A, IL-17F 또는 TNFα에 의해 매개되는 질병 또는 장애가 류마티스 관절염, 건선, 또는 건선성 관절염인, 약학적 조성물.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 제1항에 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제1 결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열,
    제1항에 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제2 결합 도메인의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및
    펩티드 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  34. 삭제
  35. 제33항에 따른 분리된 핵산 분자 및 발현 조절 서열을 포함하는 벡터.
  36. a) 제1항에 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제1 결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    b) 제1항에 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제2 결합 도메인의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    c) 제1항에 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제2 결합 도메인의 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  37. 삭제
  38. 제1항, 제7항, 제8항, 제14항 내지 제16항, 제18항 내지 제26항, 및 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법으로서,
    상기 방법은
    제36항에 따른 단리된 숙주 세포를 제공하는 단계,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현에 적합한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    생성된 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리하는 단계
    를 포함하는,
    제조 방법.
  39. 제1항에 있어서,
    IL-17A, IL-17F 또는 TNFα에 의해 매개되는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  40. 삭제
  41. 제39항에 있어서,
    상기 질병 또는 장애가 류마티스 관절염, 건선, 또는 건선성 관절염인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  42. 제29항에 있어서,
    항염증제 또는 면역 억제제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  43. 삭제
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