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KR102866812B1 - 신규한 항-pd-l1 항체 - Google Patents

신규한 항-pd-l1 항체

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KR102866812B1
KR102866812B1 KR1020227013499A KR20227013499A KR102866812B1 KR 102866812 B1 KR102866812 B1 KR 102866812B1 KR 1020227013499 A KR1020227013499 A KR 1020227013499A KR 20227013499 A KR20227013499 A KR 20227013499A KR 102866812 B1 KR102866812 B1 KR 102866812B1
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cancer
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antibodies
human
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윤잉 첸
징 니
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우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드
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Abstract

항-PD-L1 항체가 제공된다. 이는 또한 항-PD-L1 항체를 암호화하는 핵산 분자, 항-PD-L1 항체의 발현에 사용되는 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 개시 내용은 항-PD-L1 항체를 생산하는 방법 및 그의 용도를 추가로 제공한다.

Description

신규한 항-PD-L1 항체
본 출원은 일반적으로 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 출원은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 단일-도메인 항체, 그의 제조 방법, 및 그의 용도에 관한 것이다.
우선권 정보
본 출원은 2019년 9월 25일에 출원된 PCT/CN2019/107689의 우선권을 주장하며, 이는 전체가 참조로 여기에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 서열 목록을 포함하고 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
전임상 및 임상 결과에서 증가하는 증거는 면역 관문(immune checkpoint)을 표적으로 하는 것이 암 환자를 치료하는 가장 유망한 접근 방식이 되고 있음을 보여준다.
CD28과 상동성을 갖는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 억제성 구성원인 PD-1(Programmed Death 1) 단백질은 T 세포, 활성화된 B 세포 및 골수 세포에서 발현되고(Agata et al, supra; Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8) 면역계의 자극 및 억제 신호를 조절하는 데 중요한 역할을 한다(Okazaki, Taku et al. 2007 International Immunology 19:813-824). PD-1은 아포토시스 세포(apoptotic cell)에서 차등 발현에 대한 스크리닝을 통해 발견되었다(Ishida et al (1992) EMBO J 11:3887-95).
PD-1은 B7 계열의 세포 표면 발현 구성원인 PD-L1 (또한 B7-H1 또는 CD274라고도 함) 및 PD-L2(또한 B7-DC 또는 CD273이라고도 함)라는 두 개의 알려진 리간드를 갖는다(Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 및 PD-L2 모두 PD-1에 결합하지만, 다른 CD28 계열 구성원에는 결합하지 않는 B7 동족체(homolog)이다.
활성화된 T 세포에서 발현된 PD-1과 종양세포에서 발현된 PD-L1의 상호작용은 면역반응을 부정적으로 조절하고 항-종양 면역을 약화시킨다. PD-L1은 다양한 종류의 인간 암에 풍부하다(Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9). 종양에서 PD-L1의 발현은 식도(esophageal), 췌장(pancreatic) 및 기타 유형의 암에서 감소된 생존과 상관관계가 있으며, 이는 이 경로가 종양 면역요법의 유망한 표적임을 강조한다. 여러 그룹에서 PD-1-PD-L1 상호작용이 질병을 악화시켜, 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocytes)의 감소, T 세포 수용체 매개 증식의 감소 및 암세포에 의한 면역 회피를 초래한다는 것을 보여주었다(Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다.
단일-도메인 항체(single-domain antibody; sdAb)는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성된 항체이다. 전체 항체와 같이, 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 단일-도메인 항체는 2개의 중쇄 단백질 및 2개의 경쇄로 구성된 일반적인 항체보다 훨씬 작다. 최초의 단일-도메인 항체는 낙타과에서 발견되는 중쇄 항체에서 조작되었다((Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100); 이것을 VHH 단편이라고 한다. 현재 단일-도메인 항체에 대한 대부분의 연구는 중쇄 가변 도메인을 기반으로 한다.
단일-도메인 항체는 많은 장점이 있다. 예를 들어, 일반적으로 높은 용해도와 안정성을 나타내며 효모, 식물, 및 포유동물 세포에서도 쉽게 생성될 수 있다(Harmsen MM, De Haard HJ (2007) Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Appl Microbiol Biotechnol 77(1):13-22.). 또한, 열 안정성이 좋고 조직 침투가 좋다. 또한 생산 비용도 효율적이다. 단일-도메인 항체의 장점은 다양한 생명공학 및 치료 응용 분야에 적합하다. 예를 들어, 이들은 암, 감염성, 염증성 및 신경퇴행성 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병의 치료에 유용하다.
PD-L1에 대한 항체가 개발되고 있지만, 치료제로써 PD-L1에 대한 항체는 여전히 개선의 여지가 있다. 또한, 현재 PD-L1에 대한 단일-도메인 항체가 거의 없다는 점에 주목할 가치가 있다. 따라서, 당업계에서는 항-PD-L1 항체, 특히 PD-L1에 대한 단일-도메인 항체를 개발하고자 하는 요구가 있다.
본 개시내용은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있지만, 본 개시내용의 원리를 예시하는 그의 특정한 예시적인 구현예가 여기에 개시된다. 본 걔시는 예시된 특정한 구현예로 제한되지 않는다는 점이 강조되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 모든 섹션 제목은 조직적인 목적만을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 보다 구체적으로, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태 “a”“an”및 “the”는 문맥이 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “단백질”에 대한 언급은 복수의 단백질을 포함하고; “세포”에 대한 언급은 세포의 혼합물 등을 포함한다. 본 출원에서 “또는”의 사용은 달리 명시되지 않는 한 “및/또는”을 의미한다. 또한, “포함하는(comprising)”및 “포함하다(comprises)”및 “포함된(comrpised)”과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 제공되는 범위는 양 말단 값과, 양 말단 값 사이의 모든 수를 모두 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라, 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)을 참고한다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학적 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 실험실 절차 및 기술은 잘 알려져 있고 일반적으로 당업계에 사용된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 모든 섹션 제목은 조직적인 목적만을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
정의
본 개시내용을 잘 이해할 수 있도록, 관련 용어의 정의 및 설명을 다음과 같이 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “항체” 또는 “Ab”는 일반적으로 원하는 생물학적 또는 결합 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체를 의미한다. 여기에는 인간화 항체, 완전 인간 항체, 키메라 항체 및 단일-도메인 항체가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 항체는 중쇄(들) 및 경쇄(들)을 포함할 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 및 ε으로 분류될 수 있으며, 이는 항체의 이소타입(isotype)을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)과 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 초가변 영역(상보적 결정 영역(CDR)이라고 함)으로 더 나눌 수 있으며, 이 영역은 상대적으로 보존적인 영역(프레임워크 영역(FR)이라고 함)에 의해 이격되어 있다.
각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: N-말단에서 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 다양한 영역 또는 도메인에서의 아미노산 분포는 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 및 1991)) 또는 Chothia & Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883의 정의를 따른다. 항체는 상이한 항체 이소타입(isotype), 예를 들어, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "인간화 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 의미한다. 인간 프레임워크 서열 내에서 추가적인 프레임워크 영역 변형이 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유래된 항체, 예를 들어 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "PD-1"은 면역글로불린의 슈퍼패밀리에 속하고 면역 시스템을 음성적으로 조절하는 공동 억제 수용체(co-inhibitory receptor)로서 기능하는 프로그램된 세포 사멸 단백질(programmed cell death protein)을 의미한다. PD-1은 CD28/CTLA-4 패밀리의 구성원이며, PD-L1 및 PD-L2를 포함하는 2개의 알려진 리간드가 있다. PD-1에 대한 대체명 또는 동의어는 PDCD1, PD1, CD279 및 SLEB2 등을 포함한다. 인간 PD-1의 대표적인 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_005009.2로 개시되어 있고, 인간 PD-1을 암호화하는 대표적인 핵산서열은 NCBI 수탁번호 NM_005018.2로 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "PD-L1"은 프로그램된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1, 예를 들어, Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192: 1027 참조)을 의미한다. PD-L1에 대한 대체 이름 또는 동의어는 PDCD1L1, PDL1, B7H1, CD274 및 B7-H 등을 포함한다. 인간 PD-L1의 대표적인 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_054862.1로 개시되어 있고, 인간 PD-L1을 암호화하는 대표적인 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_014143.3으로 기재되어 있다. PD-L1은 태반(placenta), 비장, 림프절, 흉선(thymus), 심장, 태아 간에서 발현되며 많은 종양 또는 암세포에서도 발견된다. PD-L1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포에서 발현되는 그의 수용체 PD-1 또는 B7-1에 결합한다. PD-L1과 그 수용체의 결합은 신호 전달을 유도하여 사이토카인 생산 및 T 세포 증식의 TCR 매개 활성화를 억제한다. 따라서 PD-L1은 임신, 자가면역 질환, 조직 동종이식(allograft)과 같은 특정 사건 동안 면역계를 억제하는 주요 역할을 하며, 종양 또는 암세포가 면역학적 관문을 우회하고 면역 반응을 회피하도록 하는 것으로 여겨진다.
본 명세서에 사용된 용어 "PD-L2"는 프로그램된 세포 사멸 리간드 2를 의미한다. PD-L2에 대한 대체 이름 또는 동의어는 PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc 및 CD273 등을 포함한다. 인간 PD-L2의 대표적인 아미노산 서열은 NCBI 등록 번호: NP_079515.2로 개시되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항-PD-L1 항체"는 PD-1(예를 들어, 인간, 원숭이 또는 원숭이 PD-1)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 항-PD-L1 항체는 진단 및/또는 치료 용도를 제공하기에 충분한 친화도로 PD-L1에 특이적으로 결합한다는 점이 유리하다.
본 명세서에 사용된 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 나타내는 것으로 의도되는 반면, 본 명세서에 사용된 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 나타내는 것으로 의도된다. 항체에 대한 Kd 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 나타내는 것으로 의도되며, 여기에서 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로 표시된다. 항체의 Kd를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것이고, 바람직하게는 Biacore®시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적 결합(specific binding)" 또는 "특이적으로 결합하다(specifically binds)"는, 예를 들어, 항체와 항원 사이와 같은 2개의 분자 사이의 비-무작위 결합 반응을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "결합을 억제하는(inhibit binding)", "결합을 차단하는(block biding)" 또는 "동일한 에피토프에 대해 경쟁하는(compete for the same epitope)" 능력은 2개의 분자(예를 들어, 인간 PD-L1 및 항- PD-L1 항체) 사이의 결합 상호작용을 어느 정도 검출 가능한 정도로 억제하는 항체의 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, 2개의 분자 사이의 결합을 차단하는 항체는 2개의 분자 사이의 결합 상호작용을 적어도 50% 억제한다. 일부 구현예에서, 이러한 억제는 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과일 수 있다.
본 명세서에 사용된 IgG 항체에 대한 용어 "고친화성"은 표적 항원에 대해 1 x 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5 x 10-9M 이하 및 더욱 더 바람직하게는 1 x 10-9M 이하의 KD를 갖는 항체를 의미한다.
"최대 유효 농도의 절반"이라고도 하는 본 명세서에서 사용되는 용어 "EC50"은 지정된 노출 시간 후 기준값과 최대값 사이의 중간 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독성 물질의 농도를 의미한다. 본 출원의 문맥 상에서 EC50은 "nM" 단위로 표시된다.
본 명세서에 사용된 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부분을 의미한다. 또한, "에피토프"는 "항원 결정인자"라고도 한다. 에피토프 또는 항원 결정인자는 일반적으로 아미노산, 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 일반적으로 특정 3차원 구조 및 특정 전하 특성을 갖는다. 예를 들어, 에피토프는 일반적으로 다음과 같은 독특한 입체 구조에서 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속적 또는 비-연속적 아미노산을 포함하고, 이는 "선형(linear)" 또는 "구조적(conformational)"이다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)를 참조한다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들어, 항체) 사이의 모든 상호작용 부위는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 구조적 에피토프에서, 상호작용 부위는 단백질에서 서로 분리된 아미노산 잔기에 걸쳐 있다. 항체는 당업자에게 공지된 통상적인 기술에 의해 동일한 에피토프에 대한 결합 경쟁력에 따라 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 경쟁 또는 교차-경쟁에 대한 연구는 항원에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하거나 교차 경쟁하는 항체(예를 들어, RSV 융합 단백질)를 얻기 위해 수행될 수 있다. 교차 경쟁을 기반으로 하는 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 얻기 위한 고속 처리 방법(high-throughput methods)은 국제특허출원 WO 03/48731에 설명되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "분리된"은 인공적인 수단에 의해 자연 상태로부터 얻어진 상태를 의미한다. 특정 "분리된" 물질 또는 구성 요소가 자연에 존재하는 경우, 자연 환경이 변화하거나 물질이 자연 환경에서 분리되거나 둘 다이기 때문에 가능하다. 예를 들어, 어떤 분리되지 않은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 어떤 살아있는 동물의 체내에 자연적으로 존재하며, 이러한 자연 상태에서 분리된 고순도의 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드라고 한다. "분리된"이라는 용어는 혼합된 인공의 또는 합성된 물질이나 분리된 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 기타 불순물을 제외하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미하도록 의도된다(예를 들어, PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 PD-1 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나 인간 PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종의 PD-1 단백질과 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, “벡터”는 내부에 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 가질 수 있는 핵산 비히클(vehicle)을 의미한다. 벡터가 그 안에 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 벡터를 발현 벡터라고 한다. 벡터는 형질전환, 형질도입, 또는 숙주 세포로의 형질감염에 의해 숙주 세포에서 발현된 운반된 유전 물질 요소를 가질 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC); λ파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터로 사용할 수 있는 동물 바이러스에는 레트로바이러스(retrovirus)(렌티바이러스(lentivirus) 포함), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus)(예: 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus)), 수두 바이러스(pox virus), 배큘로바이러스(baculovirus), 유두종바이러스(papillomavirus), 파포바 바이러스(papova virus) (예컨대, SV40)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는 발현 조절을 위한 다중 요소를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기점을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “숙주 세포”는 벡터가 도입될 수 있는 세포를 의미하며, E. coli 또는 Bacillus subtilis와 같은 원핵 세포, 효모 세포 또는 Aspergillus와 같은 진균 세포, S2 Drosophila 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포 및 섬유 아세포(fibroblast), CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포와 같은 동물 세포 또는 인간 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
CHO 세포는 CHO-K1, CHO-S, CHO-DXB11, CHO-DG44 등과 같은 상업적으로 이용 가능한 많은 서브클론을 포함하는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cells)를 의미한다. 그 중 CHO-K1은 일반적으로 발현 플랫폼으로 사용된다. CHO-K1은 ATCC, ECACC, DSMZ 및 기타 여러 회사에서 상업적으로 이용 가능하다.
본 명세서에 사용된 용어 "T 세포"는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, T 헬퍼 1형 T 세포, T 헬퍼 2형 T 세포, T 헬퍼 17형 T 세포 및 억제성 T 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “동일성”은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정된 바와 같은 2개 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 의미한다. “퍼센트 동일성”은 비교되는 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오타이드 사이의 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하며, 비교되는 분자 중 가장 작은 크기를 기준으로 계산된다. 이러한 계산을 위해 정렬의 간격(있는 경우)은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, “알고리즘”)에 의해 처리되는 것이 바람직하다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하는데 사용할 수 있는 방법은 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073에 기재된 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “면역원성”은 유기체에서 특정 항체 또는 감작성 림프구의 형성을 자극하는 능력을 의미한다. 이는 항원이 특정 면역세포를 자극하여 활성화, 증식 및 분화하여 최종적으로 항체 및 감작성 림프구와 같은 면역학적 이펙터 물질을 생성하는 성질을 의미할 뿐 아니라, 항원으로 유기체를 자극한 후 유기체의 면역계에서 항체 또는 감작성 T 림프구가 형성될 수 있는 특정 면역 반응을 의미한다. 면역원성은 항원의 가장 중요한 성질이다. 항원이 숙주에서 면여반응의 발생을 성공적으로 유도할 수 있는지 여부는 항원의 성질, 숙주의 반응성, 면역 수단의 3가지 요인에 의해 결정된다.
본 명세서에 사용된 용어 “형질감염(transfection)”또는 “형질감염 시키다(transfect)”는 핵산이 진핵세포, 특히 포유동물 세포 내로 도입되는 과정을 의미한다. 형질감염을 위한 프로토콜 및 기술에는 지질 형질감염 및 전기천공(electroporation)과 같은 화학적 및 물리적 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 다수의 형질감염 기술이 당업계에 잘 알려져 있고 본 명세서에 개시되어 있다. 예를 들어, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197을 참고한다.
본 명세서에 사용된 용어 “SPR”또는 “표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)”는 예를 들어, BIAcore system (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출함으로써 실시간 생물특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 의미하고 포함한다. 추가 설명을 위해, 실시예 5 및 Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277을 참조한다.
본 명세서에서 용어 “형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting)”또는 “FACS”는 전문화된 유형의 유세포 분석을 의미한다. 각 세포의 특정 광 산란 및 형광 특성을 기반으로 한 번에 한 세포씩 2개 이상의 용기에 생물학적 세포의 이종 혼합물을 분류하는 방법을 제공한다(FlowMetric. “Out Fluorescence Activated Cell Sorting” FACS를 수행하기 위한 기기는 당업자에게 알려져 있고 대중에게도 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 기기의 예로는 Becton Dickinson (Foster City, Calif.)로부터 FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 기기, Coulter Epics Division (Hialeah, Fla.)로부터 Epics C 및 Cytomation (Colorado Springs, Colo.)로부터 MoFlo를 포함한다.
용어 “대상(subject)”는 인간 또는 인간이 아닌 동물, 바람직하게 인간을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “PD-L1과 연관된 상태(codition associated with PD-L1)” 또는 “PD-L1과 관련된 상태(condition related to PD-L1)”는 PD-L1(예를 들어, 인간 PD-L1)의 증가 또는 감소된 발현 또는 활성에 의해 유발되거나, 악화되거나 또는 이와 달리 연결된 상태를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “암”은 임의의 또는 종양 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이-매개, 고형 종양 및 백혈병과 같은 비-고형 종양 및 의학적 상태를 개시하는 것을 의미한다.
상태를 치료하는 맥락에서 본 명세서에서 사용된 용어 “치료(treatment)”“치료하는(treating)”또는 “치료된(treated)”은 일반적으로 인간이든 동물이든 간에 예를 들어, 상태의 진행을 억제하는 것과 같은, 원하는 치료 효과가 달성되는 치료 및 요법에 관한 것이고, 및 진행률의 감소, 진행률의 정지, 상태의 퇴행, 상태의 개선 및 상태의 치유를 포함한다. 예방 조치(즉, 예방(prophylaxis), 예방(prevention)로서의 치료 또한 포함한다. 암의 경우, “치료하는(treating)”은 종양 또는 악성 세포 성장, 증식, 또는 전이, 또는 이들의 일부 조합을 약화시키거나 늦추는 것을 의미할 수 있다. 종양의 경우, “치료(treatment)”는 종양의 전부 또는 일부의 제거, 종양 성장 및 전이의 억제 또는 감속, 종양 발달의 예방 또는 지연, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “치료적 유효량(therapeutically-effective amount)”는 활성 화합물의 양, 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투여량에 관한 것이고, 이는 원하는 치료 요법에 따라 투여될 때 합리적인 유익성/위해성 비율에 상응하는 일부 원하는 치료 효과를 생성하는데 효과적이다. 구체적으로, “치료적 유효량”은 인간 PD-1 관련 질병 또는 상태를 치료하는데 효과적인 양 또는 농도의 항체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 “숙주 세포”에서의 본 개시내용은 외인성 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “치료적 유효량” 또는 “유효량”은 인간 PD-1 관련 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적인 양 또는 농도의 약물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “약제학적으로 허용되는(pharmaceutically acceptable)”은 비히클(vehicle), 희석제, 부형제 및/또는 이의 염이 화학적으로 및/또는 물리적으로 제형의 다른 성분과 상용성이고, 수용자와 생리학적으로 상용성이 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “약학적으로 허용되는 담체 및 또는 부형제”는 당업계에 널리 공지된 대상 및 활성제와 약리학적 및/또는 생리학적으로 양립가능한 담체 및/또는 부형제를 지칭하고(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995을 참고), pH 조절제, 계면활성제, 어쥬번트 및 이온 강도 향상제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 인산염 완충액; 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, Tween-80; 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “어쥬번트(adjuvant)”는 비-특이적 면역증강제를 의미하며, 이는 항원과 함께 유기체에 전달되거나 미리 유기체에 전달되는 경우, 항원에 대한 면역 반응을 강화하거나 유기체의 면역 반응 유형을 변형할 수 있다. 알루미늄 어쥬번트(예를 들어, 수산화 알루미늄), Freund's 어쥬번트 (예를 들어, Freund's 완전 어쥬번트 및 Freund's 불완전 어쥬번트), 코리네 박테리아 파르붐(coryne bacterium parvum), 지질다당류, 사이토카인 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 보조제가 있다. Freund's 어쥬번트는 현재 동물 실험에서 가장 일반적으로 사용되는 어쥬번트이다. 수산화알루미늄 어쥬번트는 임상 시험에서 더 일반적으로 사용된다.
PD-L1 결합 분자
일부 측면에서, 본 개시내용은 PD-L1 결합 분자를 포함한다.
PD-L1 결합 분자는, 일반적인 의미에서, PD-L1에 특이적으로 결합하는 임의의 분자를 포함할 수 있다. 일부 상황에서, "PD-L1 결합 분자"는 "PD-L1 길항제"를 포함할 수 있다. "PD-L1 길항제"는 면역 세포(T 세포, B 세포 또는 NKT 세포) 상에서 발현되는 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 의미한다. PD-L1 결합 분자 또는 PD-1 길항제는 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 항체, 보다 구체적으로 항-PD-L1 항체일 수 있다.
항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일-도메인 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, PD-L1 결합 분자는 일반적으로 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성된 항체를 의미하는 단일-도메인 항체이다. 전체 항체와 마찬가지로 단일-도메인 항체는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다.
보다 구체적으로, PD-L1 결합 분자는 단일-도메인 중쇄 항체이며, 이는 용어 "VHH", "VHH 항체", "VHH 도메인", "VHH 항체 단편", "VHH" 또는 " Nanobody 등과 상호교환적으로 사용된다. 낙타과(Camelidae) 항체에서 파생된 VHH 분자는 알려진 가장 작은 온전한 항원-결합 도메인(약 15 kDa 또는 기존 IgG보다 10배 작음) 중 하나이므로 조밀한 조직으로 전달하고 거대분자 사이의 제한된 공간에 접근하는 데 매우 적합하다.
본 명세서에 개시된 개시내용의 단일-도메인 항체는 당업계에 공지된 방법 또는 임의의 미래의 방법에 따라 당업자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, VHH는 낙타를 면역화하고 이로부터 하이브리도마를 얻는 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하거나, 또는 당업계에 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 본 개시내용의 VHH 라이브러리를 복제하고 파지 디스플레이를 사용하여 후속적으로 선택함으로써 얻을 수 있다.
예를 들어, 단일-도메인 항체는 라마 또는 알파카를 원하는 항원으로 면역화한 후 중쇄 항체를 암호화하는 mRNA를 분리하여 얻을 수 있다. 역전사 및 중합효소 연쇄 반응에 의해 수백만 개의 클론을 포함하는 단일-도메인 항체의 유전자 라이브러리가 생성된다. 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이와 같은 스크리닝 기술은 항원에 결합하는 클론을 식별하는 데 도움이 된다. 하나의 기술은 (예를 들어, 인간) 항체의 라이브러리가 파지 상에서 합성되고, 관심 항원 또는 그의 항체-결합 부분으로 상기 라이브러리를 스크리닝하여, 항원에 결합하는 파지를 분리하는 파지 디스플레이며, 이 파지에서 면역반응성 단편을 얻을 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAPTM phage display kit, catalog no. 240612). 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용할 수 있는 다른 방법 및 시약도 있다(예를 들어, Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)를 참고)).
가장 강력한 클론이 확인되면, DNA 서열은 예를 들어, 친화성 성숙 또는 인간화에 의해 최적화된다. 인간화는 항체에 대한 인간 유기체의 면역학적 반응을 방지할 수 있다.
따라서, 단일-도메인 항체는 (1) 자연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인을 분리시킴으로써; (2) 자연 발생 VHH 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해; (3) 자연 발생 VHH 도메인의 "인간화"(하기에 기술됨) 또는 이러한 인간화 VHH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (4) 임의의 동물 종, 특히 포유동물 종, 예를 들어 인간으로부터의 자연 발생 VH 도메인의 "낙타화"에 의해, 또는 이러한 낙타화된 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (5) Ward 등(상기 참조)에 의해 기술된 "도메인 항체" 또는 "Dab"의 "낙타화", 또는 이러한 낙타화된 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (6) 단백질, 폴리펩타이드 또는 기타 아미노산 서열을 제조하기 위해 합성 또는 반-합성 기술을 사용하여; (7) 핵산 합성을 위한 기술을 사용하여 VHH를 암호화하는 핵산을 제조하고, 이에 따라 수득된 핵산을 발현시킴으로써; 및/또는 (8) 전술한 것의 조합에 의해 수득될 수 있다. 전술한 것을 수행하기 위한 적합한 방법 및 기술은 본 명세서의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 아래에서 보다 상세하게 기재되는 방법 및 기술을 포함한다.
단일-도메인 항체는 일반적으로 면역된 동물로부터 얻은 혈액, 림프절 또는 비장 cDNA의 가변 도메인 레퍼토리를 파지 디스플레이 벡터로 PCR 클로닝하여 생성된다. 항원-특이적 단일-도메인 항체는 일반적으로 고정된 항원, 예를 들어, 시험관의 플라스틱 표면에 코팅된 항원, 스트렙타비딘 비드에 고정된 비오틴화 항원, 또는 세포 표면에 발현된 막 단백질 상 라이브러리를 패닝에 파지 라이브러리를 패닝하여 선별된다. adAbs의 친화도는 예를 들어, CDR 영역의 부위 지정 돌연변이 유발 및 증가된 엄격성 조건(높은 온도, 높거나 낮은 염 농도, 높거나 낮은 pH, 및 낮은 항원 농도) 하에서 고정된 항원에 대한 추가 패닝에 의해, 시험관 내에서 이러한 전략을 모방함으로써 종종 개선될 수 있다 (Wesolowski et al., Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol (2009) 198: 157-174).
항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 VHH를 제조하는 방법은 참고문헌에 기재되어 있다, 예를 들어: R. van der Linden et al., Journal of Immunological Methods, 240(2000) 185-195; Li et al., J Biol Chem., 287(2012)13713-13721; Deffar et al., African Journal of Biotechnology Vol. 8(12), pp.2645, 17 June, 2009 및 WO94/04678.
일부 구현예에서, PD-L1 결합 분자 내의 VHH는 항체의 Fc-도메인, 예를 들어, IgG(예를 들어, IgG4 또는 IgG1)의 Fc-도메인에 융합된다. 특정 구현예에서, Fc-도메인은 인간 IgG1의 Fc-도메인이다. VHH를 Fc 도메인에 융합함으로써 이펙터 기능을 얻는 것이 더 효율적일 수 있다. 또한, VHH와 Fc 도메인의 융합은 PD-L1 결합 분자가 이량체를 형성하는 것을 도울 수 있으며, 또한 생체 내 PD-L1 결합 분자의 반감기 연장을 도울 수 있다.
본 명세서에서 용어 “항체-의존성 세포-매개 세포독성” 또는 “ADCC(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)”는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, Natural Killer (NK) cells, neutrophils, 및 macrophages)에 존재하는 Fc 수용체(FcRs)에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포로 하여금 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 세포독소로 표적 세포를 죽일 수 있도록 하는 세포독성의 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포를 “무장시키고(arm)”이러한 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγR1, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포에 대한 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국특허 제 5,500,362호 또는 제 5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관 내(in vitro) ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 자연살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내(in vivo), 예를 들어 Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
용어 "상보 의존적 세포독성" 또는 "CDC(Complement Dependent Cytotoxicity)"는 상보체(complement)의 존재 하에 표적 세포의 용해를 의미한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템(C1q)의 제1 성분이 그들의 동족 항원에 결합된 (적절한 서브클래스의)항체에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
설명의 편의를 위해, PD-L1 결합 분자는 다음 섹션에서 항-PD-L1 항체로 기재된다.
특정한 특성을 갖는 항-PD-L1 항체
본 개시내용의 항체는 항체의 특정한 기능 또는 특성을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(a) 1 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합한다;
(b) PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 억제한다;
(c) CD4+T 세포에서 IFN-γ또는 IL-2의 생산을 유도한다;
(d) 인간 PD-L2, CD80 및 CD86에 실질적으로 결합하지 않는다;
(e) 인간, 마우스 또는 시노몰구스 PD-L1과 교차 반응성이 있다; 및
(f) 적어도 60℃에서 안정하다.
본 개시내용의 항체는 높은 친화도로 세포 표면 PD-L1에 결합한다. PD-L1에 대한 본 개시내용의 항체의 결합은 당업계에 잘 확립된 하나 이상의 기술, 예를 들어 ELISA를 사용하여 평가될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 결합 특이성은 또한 PD-L1 단백질을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터링함으로써, 예를 들어, 유세포 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 세포 표면에서 PD-L1을 발현하도록 형질감염된 CHO 세포와 같은 인간 PD-L1을 발현하는 세포주와 항체가 반응하는 유세포 분석법에 의해 테스트될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 결합 키네틱(예를 들어, Kd 값)을 포함하는 항체의 결합은 BIAcore 결합 분석에서 테스트될 수 있다. 또 다른 적합한 결합 검정은 예를 들어, 재조합 PD-L1 단백질을 사용하는 ELISA 검정을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용이 항체는 1 x 10-7 M 이하, 5 x 10-8 M 이하, 2 x 10-8 M 이하, 5 x 10-9 M 이하, 4 x 10-9 M 이하, 3 x 10-9 M 이하, 2×10-9M 이하, 1×10-9M 이하, 5×10-10M 이하, 1×10-10M 이하의 KD로 세포 표면(예를 들어, 인간 PD-L1) 단백질에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 FACS에 의해 측정시, 약 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 또는 0.01 nM 이하의 EC50에서 시노몰구스 또는 원숭이 PD-L1에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 예를 들어 ELISA에 의해 측정시 0.2 nM 내지 100 nM(예를 들어, 0.2 nM 내지 50 nM, 0.2 nM 내지 30 nM, 0.2 nM 내지 20 nM, 0.2 nM 내지 10 nM, 또는 1 nM 내지 10 nM)의 IC50에서 PD-L1에 대한 인간 PD-1의 결합을 억제한다.
본 개시내용의 항-PD-L1 항체는 PD-L1에 특이적이다. 일부 구현예에서, 항체는 PD-L2, CD80 및/또는 CD86에 결합하지 않는다. 예를 들어, PD-L2, CD80 및/또는 CD86과의 결합 친화도는 PD-L1과의 결합 친화도의 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 PD-1에 대한 인간 PD-L1 의 결합을 차단하고, 이에 의해 예를 들어 활성화된 T 세포(예컨대 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포)로부터 사이토카인 생산을 유도하고, 활성화된 T 세포(예: CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포)의 증식을 유도하며, T reg의 억제 기능을 역전시키는 것을 포함하는 생물학적 활성을 제공한다. 예시적인 사이토카인은 IL-2 및 IFNγ을 포함한다. 용어 “IL-2”는 백혈구 (예를 들어, leukocyte)의 활성을 조절하는 면역계의 사이토카인 신호전달 분자 유형인 인터류킨 2(interleukin 2)를 의미한다. 용어 “인터페론 감마(IFNγ)”는 자연살해(NK), NK T 세포, CD4+ 및 CD8+T 세포에 의해 생성되는 사이토카인으로, 대식세포의 중요한 활성화제이자 조직적합성 복합체(MHC) 분자 발현의 유도제이다. 사이토카인 생산은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 ELISA를 사용하여 결정할 수 있다. 방법은 또한 [3H] 티미딘 통합 분석([3H] thymidine incorporation assay)을 포함하는 T 세포의 증식을 검출하는 데 사용될 수 있다.
CDR을 포함하는 항-PD-L1 항체
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항-PD-L1 항체는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하고, 여기에서 VHH는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, CDR2는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 및 CDR3은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
각 CDR에 대한 아미노산 할당은 달리 명시되지 않는 한, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia et al., 1987, PMID: 3681981; Chothia et al., 1989, PMID: 2687698; MacCallum et al.,1996, PMID: 8876650; 또는 Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co.에서 제공되는 넘버링 체계 중 하나를 따를 수 있다.
항체 서열의 가변 영역 및 CDR은 당업계에서 개발된 일반적인 규칙(예를 들어, Kabat 넘버링 시스템과 같이 상기 기재된 바와 같음)에 따라 또는 공지된 가변 영역의 데이터베이스에 대해 서열을 얼라인함(aligning)으로써 확인될 수 있다. 이러한 영역을 식별하는 방법은 Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000에 기재되어 있다. 항체 서열의 예시적인 데이터베이스는 www.bioinf.org.uk/abs (영국 런던, 런던, 생화학 및 분자생물학과의 AC Martin에 의해 유지됨)의 "Abysis" 웹사이트 및 Retter et al., Nucl. Acids Res., 33(Database issue): D671 -D674(2005)에 기재된, www.vbase2.org의 VBASE2 웹사이트에 기재되어 있고, 이를 통해 액세스할 수 있다. 바람직하게 서열은 Kabat, IMGT 및 PDB(Protein Data BanK)의 서열 데이터를 PDB의 구조적 데이터와 통합하는 Abysis 데이터베이스를 사용하여 분석된다. Andrew C. R. Martin 박사의 책 챕터 Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains In: Antibody Engineering Lab Manual을 참조한다(Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, 웹사이트 bioinforg.uk/abs에서도 이용 가능). Abysis 데이터베이스 웹사이트는 본 명세서의 교시에 따라 사용될 수 있는 CDR을 식별하기 위해 개발된 일반적인 규칙을 추가로 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 모든 CDR은 Kabat에 따라 Abysis 데이터베이스 웹사이트에 따라 파생됩니다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항-PD-L1 항체는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하고, 여기에서 VHH는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 및 여기에서 CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며, CDR3은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항-PD-L1 항체는 하나의 VHH를 포함하고, 여기에서 VHH는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 및 여기에서 CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며, CDR3은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다.
VHH의 서열을 통해 정의된 항-PD-L1 항체
일부 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)를 포함하고, 여기에서 VHH는 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:
(A) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열;
(B) 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; 또는
(C) 서열번호 4와 비교하여 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 치환이 있는 아미노산 서열.
두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성(percent identity)은 PAM120 가중치 잔기 표(PAM120 weight residue table), 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 사용 가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970))의 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 개시내용의 단백질 서열은 예를 들어, 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열(query sequence)"로 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 본 개시내용의 항체 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 간격 얼라인먼트(alignment)을 얻기 위해 Gapped BLAST는 Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기재된 대로 사용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 매개변수를 사용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
일부 구현예에서, VHH의 아미노산 서열은 서열번호 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
일부 추가 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역에서 아미노산의 보존적 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 항원 결합을 제거하지 않는 특정 보존적 서열 변형이 이루어질 수 있음이 당업계에서 이해된다. 예를 들어, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864- 26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O' Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 and Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43을 참조한다.
상기 기재된 바와 같이, 본 명세서에 사용된 용어 “보존적 치환”은 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩타이드의 필수 특성에 불리한 영향을 미치지 않거나 변형시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 예를 들어, 보존적 치환은 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 해당 아미노산 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한(예를 들어, 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 포함한 화학적 성질 등) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 알칼리 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 상응하는 아미노산 잔기는 바람직하게 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 및 Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)을 참조).
일부 특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 하나의 VHH를 포함하고, 상기 VHH는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 한 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 하나의 VHH로 이루어지고, 이 항체는 본 개시내용의 맥락에서 “AP3R2-1A3-z12-Ig4”로 명명된다.
일부 다른 특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc 도메인에 융합된 하나의 VHH를 포함하는 키메라 항체이다. 한 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 하나의 VHH 및 인간 IgG1의 Fc 도메인으로 이루어진 키메라 항체이고, 이는 본 개시내용의 맥락에서 “AP3R2-1A3-z12-hIgG1”로 명명된다.
비닝(binning) 및 에피토프 맵핑(mapping)
개시된 항체는 선택된 표적 또는 이의 단편에 의해 제시되는 별개의 에피토프 또는 면역원성 결정인자와 연관되거나, 이에 결합할 것이라는 것이 추가로 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 에피토프 또는 면역원성 결정인자는 아미노산, 당측쇄, 포스포릴 기(phosphoryl group), 또는 설포닐 기(sulfonyl group)와 같은 분자의 화학적으로 활성의 표면 그룹화(grouping)를 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 특정 3차원 구조적 특성, 및.또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 “에피토프”는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않으면 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합(또는 면역-특이적으로 결합 또는 반응)한다고 한다. 일부 구현예에서, 항체는 평형 해리 상수(KD)가 10-6M 이하이거나 10-7M 이하일 때, 보다 바람직하게는 e KD가 10-8M 이하일 때, 및 더욱 바람직하게는 KD가 10-9M 이하일 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(때때로 “선형” 또는 “연속된” 에피토프라고도 함)는 일반적으로 단백질 변성 시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 단백질 변성 시 손상된다. 어떤 경우에도 항체 에피토프는 독특한 공간적 구조를 가지고 전형적으로 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
이와 관련하여, 일부 구현예에서, 에피토프는 예를 들어, 항-PD-L1 항체의 하나 이상의 영역, 도메인 또는 모티프와 연관되거나 이에 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 유사하게, 당업계에서 인정하는 용어 “모티프”는 그 일반적인 의미에 따라 사용될 것이며, 전형적으로 10 내지 20개의 인접한 아미노산 잔기인 단백질의 짧고, 보존된 영역을 일반적으로 의미할 것이다.
어떠한 경우에도 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본 개시내용에 기재된 기술을 사용하여 에피토프를 포함하는 펩타이드로 면역화함으로써 그 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로, 발견 과정 중 항체의 생성 및 특성화는 특정 도메인 또는 모티프에 위치한 바람직한 에피토프에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이 정보로부터, 동일한 에피토프에 대해 결합하는 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근 방식은 경쟁 연구를 수행하여 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 즉, 항체가 항원에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 찾는 것이다. 교차-경쟁을 기반으로 하는 항체를 비닝(binning)하기 위한 높은 처리량 프로세스(high throughput process)는 WO 03/48731에 기재되어 있다. 효모에서의 항체 경쟁 또는 항원 단편 발현을 포함하는 비닝 또는 도메인 수준 또는 에피토프 맵핑의 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “비닝(binning)”은 항체의 항원 결합 특성 및 경쟁에 기초하여 항체를 그룹화하거나 분류하는 데 사용되는 방법을 의미한다. 상기 기술은 본 개시내용의 항체를 정의하고 분류하는 데 유용하지만, 빈(bin)은 항상 에피토프와 직접적으로 상관관계가 있는 것은 아니며 에피토프 결합의 이러한 초기 결정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 당업계에서 인정된 다른 방법론에 의해 추가로 정제되고 확인될 수 있다. 그러나, 개별의 빈(bin)에 대한 항체의 경험적 할당은 개시된 항체의 치료 가능성을 나타낼 수 있는 정보를 제공하는 것으로 이해될 것이다.
보다 구체적으로, 선택된 기준 항체(또는 이의 단편)가 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 당업계에 공지되어 있고 본 명세서의 실시예에 기재된 방법을 사용하여 두 번째 테스트 항체에 대해 교차 경쟁하는지(즉, 동일한 빈(bin)에 있는지) 여부를 결정할 수 있다.
다른 호환가능한 에피토프 맵핑(mapping) 기술은 알라닌 스캐닝 돌연변이체, 펩타이드 블롯 (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63)(본 명세서에 그 전문이 구체적으로 참고로 인용됨), 또는 펩타이드 절단 분석을 포함한다. 또한, 항원의 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496)(본 명세서에서 그 전문이 구체적으로 참고로 인용됨).
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 VHH를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 개시내용의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하여) 수득된 항체의 경우, 이러한 항체를 암호화하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 5에 기재된 것이다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 서열번호 5와 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 동일성 백분율은 유전자 코드의 축퇴성으로부터 유래되고, 암호화된 단백질 서열은 변경되지 않은 채로 유지된다.
항-PD-L1 항체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 추가 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, 항체는 당업계에 공지된 상동 재조합에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 항체의 중쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 분리되고 시퀀스된다. 많은 벡터들이 이용될 수 있다. 벡터 구성요소는 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터(예를 들어 SV40, CMV, EF-1α), 및 전사 종결 서열. 선택 가능한 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, 미국특허 제 4,399,216호; 제 4,634,665호 및 제 5,179,017호 참조). 예를 들어, 일반적으로 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 상기 선택 가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase; DHFR) 유전자(메토트렉세이트(methotrexate) 선택/증폭과 함께 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위한) 및 neo 유전자(G418 선별을 위한)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터 시스템은 포유동물, 박테리아, 효모 시스템 등을 포함하고, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 등, 및 기타 실험실 및 상업적으로 이용 가능한 벡터와 같으나 이에 제한되지 않는 플라스미드를 포함한다. 적합한 벡터는 플라스미드, 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결합 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스(adenoviruses) 및 아데노 관련 바이러스(adeno-associated viruses))를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 한 구현예에서, 벡터는 pET, 예를 들어, 헥사-히스티딘- 및 c-Myc-태그의 유전자를 포함하는 pETbac일 수 있다.
PD-L1 결합 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 명세서의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은, 예를 들자면, E. coli와 같은 에스케리키아(Escherichia), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)와 같은 살모넬라(Salmonella), 세라티아 마르세스칸(Serratia marcesans)와 같은 세라티아(Serratia), 및 시겔라(Shigella)와 같은 장내세균(Enterobacteriaceae)뿐 아니라, B. 섭틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미(B. licheniformis)와 같은 바실리(Bicilli), P. 아루기노사(P. aeruginosa)과 같은 슈도모나스(Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)인 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 진정세균(eubacteria)를 포함한다.
원핵생물 이외에도, 사상균(filamentous fungi) 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 항-PD-L1 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 빵 효모는, 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주가 일반적으로 사용 가능하고, 본 명세서에서 쉬조사카로마이세스 폼(Schizosaccharomyces pombe)와 같은; 예를 들어, K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불라기쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위커라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), K. 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 K. 마르시아누스(K. marxianus)와 같은 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주; 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070) ; 칸디다(Candida); 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 슈반니오마이세스(Schwanniomyces); 및 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)과 같은 사상균(filamentous fungi), 및 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니제르(A. niger)와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주가 유용하다.
여기에 제공된 항-PD-L1 항체의 발현을 위한 다른 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda, 유충), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster, 초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 캘리포니카 NPV(Autographa californica NPV)의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV(Bombyx mori NPV)의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용 가능하며, 및 이러한 바이러스는 특히, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 본 개시내용에 따른 본 명세서의 바이러스로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양도 숙주로 사용될 수 있다.
숙주세포는 항-PD-L1 항체 생산을 위한 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자 증폭에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본 명세서에서 제공되는 항-PD-L1 항체를 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham의 F10(Sigma), MEM(Minimal Essential Media), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium, Sigma) 등의 상업적으로 이용할 수 있는 배지는 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한 Ham et al., Meth. Enz. 58:44(1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255(1980), 미국특허 제 4,767,704호; 제 4,657,866호; 제 4,927,762호; 제 4,560,655호; 또는 제 5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 U.S. Pat. Re.30,985에 기재된 임의의 배지는 숙주 세포의 배지로 사용될 수 있다. 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피성장인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 인산염), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, GENTAMCINTM 약물), 미량원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 포도당 또는 동등한 에너지원으로 보충할 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양조건은 발현을 위해 선택된 숙주세포와 함께 사전에 사용된 조건으로, 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내, 주변세포질 공간에서 생산되거나 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫 번째 단계로, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편이, 예를 들어, 원심분리 또는 초미세여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)은 E. coli의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 분리하는 절차를 기술한다. 간단히 말해서, 세포 페이스트를 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(phenylmethylsulfonylfluoride; PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동한다. 세포 파편은 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템의 상청액은 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초미세여과 장치를 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위해 임의의 상기 단계에 포함될 수 있고 항생제는 우발적인 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체는, 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography), 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 염석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 관심 항체 및 오염물질을 포함하는 혼합물은 바람직하게 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 약 2.5 내지 4.5의 pH에서 용리 완충액을 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
약제학적 조성물
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 저겅도 하나의 PD-L1 결합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
조성물의 성분
약제학적 조성물은 임의로 다른 항체 또는 약물과 같은 하나 이상의 추가적인 약제학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 항-PD-L1 항체가 백신에 대한 면역 반응을 향상시키도록 또다른 면역-자극제, 항암제, 항바이러스제, 또는 백신과의 조합 요법으로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 매질, 비-수성 매질, 항미생물제, 등장제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 킬레이트제, 희석제, 보조제, 부형제 또는 무독성 보조 물질, 당업계에 공지된 기타 다양한 성분의 조합 또는 그 이상의 것을 포함할 수 있다.
적합한 성분은, 예를 들어, 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예컨대 당 및 시클로덱스트린을 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는, 예를 들어, 메티오닌(methionine), 아스코르브산(ascorbic acid), EDTA, 티오황산나트륨(sodium thiosulfate), 백금, 카탈라제, 시트르산(citric acid), 시스테인, 메르캅토 글리세롤(mercapto glycerol), 티오글리콜산(thioglycolic acid), 메르캅토 소르비톨(Mercapto sorbitol), 부틸 메틸 아니솔(butyl methyl anisole), 부틸화 히드록시 톨루엔(butylated hydroxy toluene) 및/또는 프로필갈락트(propylgalacte)를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 개시된 바와 같이, 항체를 포함하는 본 개시내용의 조성물은 항체의 산화를 감소시키기 위해 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함한다. 산화 환원은 결합 친화도의 감소를 방지하거나 감소시켜, 항체 안정성을 향상시키고 저장 수명을 연장할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 추가로 항체가 그의 항체가 산화되는 것을 방지하여 그의 저장 수명 및/또는 증가된 활성을 연장할 수 있도록 항체를 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제와 혼합하는 다양한 방법을 제공한다.
추가로 설명하기 위해, 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 염화나트륨 주사와 같은 수성 비히클, 링거 주사, 등장성 포도당 주사, 멸균수 주사, 또는 덱스트로스 및 젖산염 링거 주사(dextrose and lactated Ringer's injection), 식물성 고정기름 목화씨 기름, 옥수수 기름, 참기름 또는 땅콩기름과 같은 비-수성 비히클, 정균성(bacteriostatic) 또는 정진균성(fungistatic) 농도의 항미생물제, 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장제, 인산염 또는 구연산염 완충액과 같은 완충액, 황산수소나트륨(sodium bisulfate)과 같은 항산화제, 염산프로카인(procaine hydrochloride)과 같은 국소마취제, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcelluose), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose) 또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 현탁 및 분산제, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80)(TWEEN-80)과 같은 유화제, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산(ethylene glycol tetraacetic acid))와 같은 격리 또는 킬레이트제, 에틸 알코올(ethyl alcohol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 염산(hydrochloric acid), 시트르산(citric acid), 또는 젖산(lactic acid)을 포함한다. 담체로 사용되는 항미생물제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올(benzyl alcohol), 클로로부탄올(chlorobutanol), 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르(methyl and propyl p-hydroxybenzoic acid esters), 티메로살(thimerosal), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride) 및 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride)를 포함하는 다중 용량 용기의 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 무독성 보조 물질은, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 향상제, 또는 아세트산 나트륨(sodium acetate), 소르비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate), 트리에탄올아민 올레에이트(triethanolamine oleate) 또는 시클로덱스트린(cyclodextrin)과 같은 제제를 포함할 수 있다.
투여, 제형 및 투여량
본 개시내용의 약제학적 조성물은 경구(oral), 정맥내(intravenous), 동맥내(intra-arterial), 피하(subcutaneous), 비경구(parenteral), 비강내(intranasal), 근육내(intramuscular), 두개내(intracranial), 심장내(intracardiac), 뇌실내(intraventricular), 기관내(intratracheal), 협측(buccal), 직장(rectal), 복강내(intraperitoneal), 피내(intradermal), 국소(topical), 경피(transdermal), 및 척추강내(intrathecal)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 경로에 의해, 또는 이식 또는 흡입에 의해 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 생체 내 투여될 수 있다. 대상 조성물은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있으며; 정제(tablets), 캡슐(capsules), 분말(powders), 과립(granules), 연고(ointments), 용액(solutions), 좌약(suppositories), 관장제(enemas), 주사제(injections), 흡입제(inhalants), 및 에어로졸(aerosols)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 제형 및 투여 경로는 의도된 적용 및 치료 요법에 따라 선택될 수 있다.
장내 투여에 적합한 제형은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 환제, 코팅 정제를 포함하는 정제, 엘릭시르(elixirs), 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 이의 제어 방출 형태를 포함한다.
비경구 투여(예를 들어, 주사)에 적합한 제형은 수성 또는 비수성, 등장제, 발열원이 없는 멸균 액체(예를 들어, 용액, 현탁애)를 포함하며, 여기에 활성 성분은 용해되거나, 현탁되거나, 달리 (예를 들어, 리포솜 또는 기타 미립자로) 제공된다. 이러한 액체는 항산화체, 완충제, 보존제, 안정화제, 정균제, 현탁제, 증점제, 및 제형을 의도된 수용자의 혈액(또는 기타 관련 체액)과 등장성으로 만드는 용질과 같은 기타 약제학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 부형제의 예는, 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등을 포함한다. 이러한 제형에 사용하기에 적합한 등장성 담체의 예는 염화나트륨 주사액, 링거액, 또는 젖산 링거 주사액을 포함한다. 유사하게, 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정 개인 및 해당 개인의 병력은 물론 약동학(pharmacokinetics)(예를 들어, 반감기, 제거율 등)과 같은 경험적 고려 사항에 따라 달라질 것이다.
투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있으며, 증식성 또는 종양성 세포의 수 감소, 이러한 신생물성 세포의 감소 유지, 신생물성 세포의 증식 감소 또는 전이 진행의 지연을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 투여되는 투여량은 잠재적인 부작용 및/또는 독성을 관리하기 위해 조정되거나 감쇄시킬 수 있다. 대안적으로, 대상 치료 조성물의 지속된 연속 방출 제형이 적절할 수 있다.
적절한 투여량은 환자마다 다양할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 최적의 투여량을 결정하는 것은 일반적으로 어떠한 위험이나 유해한 부작용에 대한 치료 이점 수준의 균형을 유지하는 것을 포함할 것이다. 선택된 투여량 수준은 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 기타 조합하여 사용되는 약물, 화합물 및/또는 재료, 상태의 중증도, 및 환자의 종, 성별, 연령, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 화합물의 양 및 투여 경로는 궁극적으로 의사, 수의사, 또는 임상의의 재량에 달려 있지만, 일반적으로 투여량은 실질적으로 유해하거나 유해한 영향이 없는 부작용 없이 원하는 효과를 달성하는 작용 부위에서 국소 농도를 달성하도록 선택될 것이다.
일반적으로, PD-L1 결합 분자는 다양한 범위로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 PD-L1 결합 분자는 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg(예를 들어, 약 0.01 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg)의 치료 유효 투여량으로 투여될 수 있다. 이들 중 특정 구현예에서, 항체는 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되고, 이들 중 특정 구현예에서 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 또는 0.5 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 구현예에서, 투여 용량은 치료 과정에 걸쳐 변경될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서 초기 투여 용량은 후속 투여 용량보다 높을 수 있다. 특정 구현예에서, 투여 용량은 대상(subject)의 반응에 따라 치료 과정에 걸쳐 변경될 수 있다.
어떠한 경우에도, 본 개시내용의 항체는 바람직하게 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 필요에 따라 투여된다. 투여 빈도의 결정은 치료되는 상태, 치료되는 대상의 연령, 치료되는 상태의 중증도, 치료되는 대상의 일반적인 건강 상태 등을 고려하여 주치의와 같은 당업자에 의해 이루어질 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 항체를 포함하는 치료 과정은 수주 또는 수개월의 기간에 걸쳐 선택된 약물 제품의 다중 용량을 포함할 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용의 항체는 매일, 2일마다, 4일마다, 매주, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 매월, 6주마다, 2개월마다, 10주마다 또는 3개월마다 한 번씩 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 투여량이 변경될 수 있거나 환자 반응 및 임상 관행에 기초하여 조정될 수 있음이 이해될 것이다.
투여량 및 요법은 또한 1회 이상의 투여(들)를 받은 개인에서 개시된 치료용 조성물에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 개인에게 본 명세서에 기술된 바와 같이 생성된 치료용 조성물의 증가된 투여량을 제공할 수 있다. 선택된 구현예에서, 투여량은 각각 경험적으로 결정되거나 관찰된 부작용 또는 독성에 기초하여 점진적으로 증가 또는 감소 또는 감쇄될 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 평가하기 위해, 특정 질병, 장애 또는 상태의 마커를 앞서 기재된 바와 같이 따를 수 있다. 암의 경우, 이는 촉진 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접적인 측정, X-ray 또는 기타 영상 기술에 의한 종양 크기의 간접적 측정; 종양 샘플의 직접적인 종양 생검 및 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 본 명세서에 기재된 방법에 따라 확인된 간접 종양 마커(예를 들어, 전립선 암의 PSA) 또는 종양원성 항원의 측정, 통증 또는 마비의 감소; 종양과 관련된 언어, 시력, 호흡 또는 기타 장애의 개선; 식욕 증가; 또는 허용된 테스트 또는 생존 연장에 의해 측정된 삶의 질 증가를 포함한다. 개인, 종양 상태의 유형, 종양 상태의 단계, 종양의 상태가 개인의 다른 위치로 전이되기 시작했는지 여부, 및 사용되는 과거와 동시 치료법에 따라 투여량이 다르다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
비경구 투여(예를 들어, 정맥내 주사)에 호환가능한 제형은 약 10㎍/ml 내지 약 100 mg/ml의 농도로 본 명세서에 제공된 PD-L1 결합 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PD-L1 결합 분자의 농도는 20 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 200 ㎍/ml, 300 ㎍/ml, 400 ㎍/ml, 500 ㎍/ml, 600 ㎍/ml, 700 ㎍/ml, 800 ㎍/ml, 900 ㎍/ml 또는 1 mg/ml를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, PD-L1 결합 분자의 농도는 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml, 12 mg/ml, 14 mg/ml, 16 mg/ml, 18 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml 또는 100 mg/ml를 포함한다.
본 발명의 응용
본 개시내용의 PD-L1 결합 분자는 수많은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 다양한 상황에서 면역성을 강화하기 위해, 배양, 시험관 내 또는 생체 외에서 세포에 투여될 수 있거나, 또는 예를 들어, 생체 내에서 인간 대상(subject)에게 투여될 수 있다. 면역 반응은 증가, 자극 또는 상향 조절될 수 있다.
바람직한 대상(subject)은 면역 반응의 강화를 필요로 하는 인간 환자를 포함한다. 상기 방법은 면역 반응(예를 들어, T-세포 매개 면역 반응)을 증가시킴으로써 치료될 수 있는 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. 특정 구현예예서, 상기 방법은 생체내 암의 치료에 특히 적합하다. 항원-특이적 면역력 강화를 위해, 항-PD-L1 항체를 관심 항원과 함께 투여하거나 항원이 이미 치료될 대상(예를 들어, 종양 보유 또는 바이러스 보유 대상)에 존재할 수 있다. 항-PD-L1 항체를 다른 약제와 함께 투여하는 경우, 순서대로 또는 동시에 투여할 수 있다.
본 개시내용은 PD-L1 결합 분자 및 PD-L1 사이에서 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에, 샘플 및 대조군 샘플을 PD-L1 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는 것으로, 샘플 내의 PD-L1 항원의 존재를 검출 또는 인간 PD-L1 항원의 양을 측정하는 방법을 추가로 제공한다. 그 후 복합체의 형성이 검출되며, 여기에서 대조군 샘플과 비교한 샘플 간의 복합체 형성의 차이는 샘플 내의 PD-L1 항원이 있음을 나타낸다. 또한, 본 개시내용의 PD-L1 결합 분자는 면역친화성 정제를 통해 인간 PD-L1을 정제하는 데 사용될 수 있다.
암 치료
PD-L1과 관련된 상태 및 장애는 면역 관련 질환 또는 장애일 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1 관련 상태 및 장애는 유방(breast)암, 폐(lung)암, 결장(colon)암, 난소(ovarian)암, 흑색종(melanoma), 방광(bladder)암, 신장(kidney)암, 간(liver)암, 침샘(salivary)암, 위(stomach)암, 신경교종(gliomas), 갑상선(thyroid)암, 흉선(thymic)암, 상피(epithelial)암, 두경부암(head and neck cancers), 위(gastric)암 및 췌장(pancreatic)암을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 종양 및 암을 포함한다.
보다 구체적으로, PD-L1과 관련된 상태 및 장애는 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 신세포 암(renal cell cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 위암종(gastric carcinoma), 방광암(bladder cancer), 식도암(esophageal cancer), 중피종(mesothelioma), 흑색종(melanoma), 두경부암(head and neck cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 육종(sarcoma), 전립선암(prostate cancer), 교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 흉선 암종(thymic carcinoma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphomas), 골수종(myelomas), 균상 식육종(mycoses fungoids), 메르켈 세포 암(merkel cell cancer), 및 다른 혈액암(other hematologic malignancies), 예컨대 고전적 호지킨 림프종(classical Hodgkin lymphoma; CHL), 원발성 종격 거대 B-세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), T-세포/조직구-풍부 B-세포 림프종(T-cell/histiocyte-rich B-cell lymphoma), EBV-양성 및 -음성 PTLD(EBV-positive and -negative PTLD), 및 EBV-연관 미만성 거대 B-세포 림프종(EBV-associated diffuse large B-cell lymphoma; DLBCL), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 외부 NK/T-세포 림프종(extranodal NK/T-cell lymphoma), 비인두 암종(nasopharyngeal carcinoma), 및 HHV8-연관 원발성 삼출 림프종(HHV8-associated primary effusion lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 중추 신경계(central nervous system; CNS)의 신생물, 예컨대 원발성 CNS 림프종(primary CNS lymphoma), 척추 종양(spinal axis tumor), 뇌간 신경교종(brain stem glioma)을 포함한다. 특정 구현예에서, 종양 및 암은 전이성, 특히 PD-L1을 발현하는 전이성 종양이다.
항체는 화학 치료 또는 방사선 치료와 함께 사용할 수 있다.
화학 요법과 병용
항체는 항암제, 세포독성제 또는 화학 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
용어 “항암제(anti-cancer agent)”또는 “항증식제(anti-proliferative agent)”는 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는데 사용할 수 있는 모든 제제를 의미하며, 세포독성제, 세포증식억제제, 항혈관신생제, 용적축소제, 화학치료제, 방사선 치료 및 방사선 치료제, 표적항암제, BRM, 치료 항체, 암 백신, 사이토카인, 호르몬 치료, 방사선 치료 및 항전이제 및 면역 치료제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 논의된 바와 같이 선택된 구현예에서, 이러한 항암제는 접합체를 포함할 수 있으며 투여 전에 개시된 부위-특이적 항체와 관련될 수 있음이 이해될 것이다. 보다 구체적으로, 일부 구현예에서 선택된 항암제는 조작된 항체의 짝을 이루지 않은 시스테인에 연결되어 본 명세서에 기재된 조작된 접합체를 제공할 것이다. 따라서, 이러한 조작된 접합체는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 명시적으로 간주된다. 다른 구현예에서, 개시된 항암제는 상기 기재된 바와 같이 상이한 치료제를 포함하는 부위-특이적 접합체와 조합되어 제공될 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 “세포독성제”는 세포에 독성이 있고 세포의 기능을 감소 또는 억제하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 일부 구현예에서, 물질은 살아있는 유기체로부터 유래된 자연 발생 분자이다. 세포독성제의 예로는 박테리아(예를 들어, 디프테리아 독소(Diptheria toxin), 슈도모나스 내독소 및 외독소(Pseudomonas endotoxin and exotoxin), 포도구균 장독소 A(Staphylococcal enterotoxin A)), 진균(예를 들어, α-사르신(α-sarcin), 레스트릭토신(restrictocin)), 식물(예를 들어, 아브린(abrin), 리신(ricin), 모데신(modeccin), 비스쿠민(viscumin), 포케위드 항바이러스 단백질(pokeweed anti-viral protein), 사포린(saporin), 젤로닌(gelonin), 모모리딘(momoridin), 트리코산틴(trichosanthin), 보리 독소(barley toxin), 알류리트 포르디 단백질(Aleurites fordii proteins), 디안틴 단백질(dianthin proteins), 피톨라카 아메리카나 단백질(Phytolacca mericana proteins)(PAPI, PAPII, 및 PAP-S)), 모모르디카 카란티아 억제제(Momordica charantia inhibitor), 커신(curcin), 크로틴(crotin), 사포나리아 오피시날리스 억제제(saponaria officinalis inhibitor), 젤로닌(gelonin), 미테겔린(mitegellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 네오마이신(neomycin), 및 트리코테센(the tricothecenes)), 또는 동물(예를 들어, 세포외 췌장 RNase와 같은 세포독성 RNase; 이의 단편 및/또는 변이체를 포함하는 DNase I)의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용의 목적을 위해, “화학 치료제”는 암 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 비특이적으로 감소시키거나 억제하는 화학적 화합물(예를 들어, 세포독성제 또는 세포증식억제제)을 포함한다. 이러한 화학 작용제는 종종 세포 성장 또는 분열에 필요한 세포 내 과정으로 유도되며, 따라서 일반적으로 빠르게 성장하고 분열하는 암세포에 특히 효과적이다. 예를 들어, 빈크리스틴(vincristine)은 미세소관을 탈중합시켜, 세포가 유사분열로 들어가는 것을 억제한다. 일반적으로, 화학 치료제는 암성 세포 또는 암이 될 가능성이 있는 세포 또는 종양원성 자손(예를 들어, TIC)을 생성할 가능성이 있는 세포를 억제하거나 억제하도록 설계된 임의의 화학 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 종종 투여되며, 예를 들어 CHOP 또는 FOLFIRI와 같은 요법에서 조합하여 가장 효과적인 경우가 많다.
본 개시내용의 부위-특이적 작제물과 조합하여 사용될 수 있는 항암제의 예(부위 특이적 접합체의 구성요소로서 또는 접합되지 않은 상태로)에는 알킬화제(alkylating agents), 알킬 설포네이트(alkyl sulfonates), 아지리딘(aziridines), 에틸렌이민 및 메틸아멜라민(ethylenimines and methylamelamines), 아세토게닌(acetogenins), 캄프토테신(camptothecin), 브리오스타틴(bryostatin), 칼리스타틴(callystatin), CC-1065, 트립토피신(cryptophycins), 톨라스타틴(dolastatin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 엘류테로빈(eleutherobin), 판크라티스타틴(pancratistatin), 사르코딕틴(sarcodictyin), 스폰지스타틴(spongistatin), 니트로겐 머스타드(nitrogen mustards), 항생제(antibiotics), 엔디인 항생제(enediyne antibiotics), 다이네미신(dynemicin), 비스포스포네이트(bisphosphonates), 에스페라미신(esperamicin), 발색단백 엔디인 항생물질 발색단(chromoprotein enediyne antiobiotic chromophores), 아클라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 아우트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycinis), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), ADRIAMYCIN®독소루비신(ADRIAMYCIN®doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycins), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 퀘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 항-대사물질(anti-metabolites), 에를로티닙(erlotinib), 베무라페닙(vemurafenib), 크리조티닙(crizotinib), 소라페닙(sorafenib), 이브루티닙(ibrutinib), 엔잘루타미드(enzalutamide), 엽산 유사체(folic acid analogues), 퓨린 유사체(purine analogs), 안드로겐(androgens), 항-부신(anti-adrenals), 프롤린산(frolinic acid)과 같은 엽산 보충제(folic acid replenisher), 아세글라톤(aceglatone), 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside), 아미노레불린산(aminolevulinic acid), 에닐루라실(eniluracil), 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지쿠온(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 갈륨 질산염(gallium nitrate), 히드록시(hydroxyurea), 렌티난(lentinan), 로니다이닌(lonidainine), 메이탄시노이드(maytansinoids), 미토구아존(mitoguazone), 미톡산트론(mitoxantrone), 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴(pentostatin), 페나메트(phenamet), 피라루비신(pirarubicin), 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드(2- ethylhydrazide), 프로카바진(procarbazine), PSK®다당류(PSK®polysaccharide complex)(JHS Natural Products, Eugene, OR), 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온(triaziquone); 2,2',2"- 트리클로로트리에틸아민(2,2',2"-trichlorotriethylamine); 트리코테센(trichothecenes)(특히, T-2 독소, 베라쿠린 A(verracurin A), 로리딘 A(roridin A) 및 안귀딘(anguidine)); 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미톨락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노사이드(arabinoside ("Ara-C")); 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 티오테파(thiotepa); 탁소이드(taxoids), 클로란부실(chloranbucil); GEMZAR® 젬시타빈(GEMZAR®gemcitabine); 6-티오구아닌(6-thioguanine); 메르캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 백금 유사체(platinum analogs), 빈블라스틴(vinblastine); 백금(platinum); 에토프시드(etoposide (VP-16)); 이포스파미드(ifosfamide); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine); NAVELBINE® 비노렐빈(NAVELBINE® vinorelbine); 노반트론(novantrone); 테니포사이드(teniposide); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); 이리노테칸(irinotecan (Camptosar, CPT-11)), 토포이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor) RFS 2000; 디플루오로메틸로니틴(difluorometlhylornithine); 레티노이드(retinoids); 카페시타빈(capecitabine); 콤브레타스타틴(combretastatin); 류코보린(leucovorin); 옥살리플라틴(oxaliplatin); 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 및 VEGF-A의 억제제 및 상기 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 이 정의에는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 아로마타제 억제제, 부신에서 에스트로겐 생선을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 및 항안드로겐; 뿐만 아니라 트록사시타빈(troxacitabine)(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체(1,3- dioxolane nucleoside cytosine analog)); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제와 같은 리보자임; 백신, PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 비노렐빈(Vinorelbine) 과 에스페라미신(Esperamicins) 및 상기 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
방사선 치료와 병용
본 개시내용은 또한 항체와 방사선 치료(즉, 감마선 조사, X선, UV 조사, 마이크로파, 전자 방출 등과 같은 종양 세포 내에서 국부적으로 DNA 손상을 유도하기 위한 임의의 메커니즘)의 조합을 제공한다. 종양 세포로의 방사선 동위원소의 유도된 전달을 이용하는 병용 요법도 검토되며, 개시된 접합체는 표적화된 항암제 또는 다른 표적화된 수단과 연계되어 사용될 수 있다. 전형적으로, 방사선 치료는 약 1주 내지 약 2주의 기간에 걸쳐 펄스로 투여된다. 방사선 치료는 약 6주 내지 약 7주 동안 두경부암이 있는 대상에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 방사선 치료는 단일 용량 또는 다중 연속 용량으로 투여될 수 있다.
진단
본 개시내용은 증식성 장애를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 시험관 내 및 생체 내 방법 및 종양형성 세포를 포함하는 종양 세포를 확인하기 위해 환자로부터 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 치료를 위해 암에 걸린 개인을 확인하거나 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하고, 이는 본 명세서에 기재된 항체와 환자 또는 환자로부터 얻은 (생체내 또는 시험관내)샘플을 접촉시키는 단계 및 샘플 내의 결합 또는 자유 표적 분자에 대한 항체의 유무, 결합 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출가능한 표지 또는 리포터 분자를 포함할 것이다.
일부 구현예에서, 샘플 내의 특정 세포와 항체의 결합은 샘플이 종양원성 세포를 포함할 수 있음을 나타낼 수 있고, 이에 의해 암에 걸린 개체가 본원에 기재된 항체로 효과적으로 치료될 수 있음을 나타낼 수 있다.
샘플은 방사선면역분석(radioimmunoassays), 면역분석(enzymeimmunoassays)(예를 들어, ELISA), 경쟁적 결합 분석(competitive-binding assays), 형광 면역분석(fluorescent immunoassays), 면역블롯 분석(immunoblot assays), 웨스턴 블롯 분석(Western Blot analysis) 및 유세포 분석(flow cytometry assays)과 같은 수많은 분석에 의해 분석될 수 있다. 호환 가능한 생체내 진단 또는 진단 분석은 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging), 컴퓨터 단층 촬영(computerized tomography)(예를 들어, CAT 스캔), 양전자 단층 촬영(positron tomography)(예를 들어, PET 스캔), 방사선 촬영, 초음파 등과 같은 당업계에 인정된 영상화 또는 모니터링 기술을 포함할 수 있다.
약제학적 팩 및 키트
하나 이상의 용량의 항체를 포함하는, 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 및 키트가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 단위 투여량이 제공되고, 여기에서 단위 투여량은 하나 이상의 추가 제제의 존재 또는 부재 하에, 예를 들어 항체를 포함하는 조성물의 미리 결정된 양을 포함한다. 다른 구현예의 경우, 이러한 단위 투여량은 주사용 1회용 사전충전형 주사기로 공급된다. 또 다른 구현예에서, 단위 투여량에 포함된 조성물은 염, 수크로스 등; 인산염 등과 같은 완충액을 포함할 수 있고; 및/또는 안정하고 효과적인 pH 범위 내에서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 접합체 조성물은 적절한 액체, 예를 들어, 멸균수 또는 식염수의 첨가시 재구성될 수 있는 동결건조된 분말로서 제공될 수 있다. 특정의 바람직한 구현예에서, 조성물은 수크로스 및 아르기닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질 응집을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 용기(들) 상의 또는 이와 관련된 라벨은 동봉된 접합체 조성물이 선택한 종양 질환 상태를 치료하는 데 사용됨을 나타낸다.
본 개시내용은 또한 부위-특이적 접합체 및 선택적으로 하나 이상의 항암제의 단일-용량 또는 다중-용량 투여 단위를 생산하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 용기 및 용기 위 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있고 접합 또는 비접합 형태로 개시된 접합체의 약제학적 유효량을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 용기(들)은 멸균 접근 포트를 포함한다(예를 들어, 용기는 정맥내주사 용액 봉투 또는 피하주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 이러한 키트는 일반적으로 적절한 용기에 조작된 접합체의 약제학적으로 허용되는 제형 및, 선택적으로 동일하거나 상이한 용기에 하나 이상의 항암제를 포함할 것이다. 키트는 또한 진단 또는 병용 요법을 위해 다른 약제학적으로 허용되는 제형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 항체 이외의 화학치료제 또는 방사선치료제; 항혈관신생제; 항전이제; 표적항암제; 세포독성제; 및/또는 기타 항암제와 같은 다양한 항암제 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 키트는 개시된 항체를 포함하는 추가 성분 포함 또는 포함하지 않고 단일 용기를 가질 수 있으며, 또는 원하는 각 제제에 대해 별도의 용기를 가질 수 있다. 접합을 위해 결합 치료제가 제공되는 경우, 단일 용액은 몰 등가 조합으로 또는 한 성분이 다른 성분보다 과량으로 사전 혼합될 수 있다. 대안적으로, 환자에게 투여하기 전에 키트의 접합체 및 임의의 항암제를 별개의 용기 내에서 별도로 유지할 수 있다. 또한 키트는 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection; BWFI), 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS), 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 살균된 약제학적으로 허용되는 완충액 또는 기타 희석제를 함유하기 위한 제 2/제 3의 용기 수단을 포함할 수 있다.
키트의 성분이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 바람직하게 수용액이고, 멸균수용액 또는 식염수용액이 특히 바람직하다. 그러나, 키트의 구성 요소는 건조 분말로 제공될 수 있다. 시약 또는 구성 요소가 건조 분말로 제공되는 경우, 적절한 용매를 추가하여 분말을 재구성할 수 있다. 용매는 또한 다른 용기에 제공될 수 있다.
상기 간략히 표시된 바와 같이 키트는 항체 및 임의의 선택적 성분을 환자에게 투여하기 위한 수단, 예를 들어, 하나 이상의 바늘, I.V. 백 또는 주사기, 또는 점안기, 피펫, 또는 기타 유사한 장치를 포함할 수 있으며, 이 방법을 통해 제제를 동물에 주입 또는 도입하거나 신체의 병든 부위에 적용할 수 있다. 본 개시내용의 키트는 또한 통상적으로 바이알, 또는 이와 같은, 및 예를 들어, 원하는 바이알 및 기타 장치가 배치되고 유지되는 주입 또는 중공 성형 플라스틱 용기(blow-molded plastic container)와 같은 상업적 판매를 위해 밀폐된 다른 구성 요소를 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다.
시퀀스 목록 요약
다수의 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 서열 목록이 본 출원에 첨부되어 있다. 다음 표 A는 포함된 서열의 요약을 제공한다.
이들 및 다른 목적은 넓은 의미에서 개선된 효능을 갖는 항체를 제공하는 화합물, 방법, 조성물 및 제조 물품에 관한 본 개시내용에 의해 제공된다. 본 개시내용에 의해 제공되는 이점은 항체 치료 및 진단 분야에서 광범위하게 적용가능하고 다양한 표적과 반응하는 항체와 함께 사용될 수 있다. 본 개시내용은 항-PD-L1 항체, 바람직하게는 단일-도메인 항체를 제공한다. 이는 또한 항체를 제조하는 방법, 항-PD-L1 항체를 암호화하는 핵산 분자, 항-PD-L1 항체의 발현에 사용되는 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 개시내용의 항체는 PD-L1과 관련된 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 PD-L1 결합 분자에 관한 것이다.
일부 구현예에서, PD-L1 결합 분자는 다음의 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(a) 1 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합하고;
(b) PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 억제하며;
(c) CD4+T 세포에서 IFN-γ또는 IL-2의 생산을 유도하고;
(d) 인간 PD-L2, CD80 및 CD86에 실질적으로 결합하지 않으며;
(e) 인간, 마우스 또는 시노몰구스 PD-L1과 교차 반응성이 있고; 및
(f) 적어도 60℃에서 안정하다.
일부 구현예에서, PD-L1 결합 분자는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하고, 여기에서 VHH는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 및 여기에서 CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 및 CDR3은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1 결합 분자는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)을 포함하고, 여기에서 VHH는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 및 여기에서 CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며, 및 CDR3은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 상기 PD-L1 결합 분자는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH)를 포함하고, 여기에서 VHH는 다음을 포함한다:
(A) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열;
(B) 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; 또는
(C) 서열번호 4와 비교하여 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 치환이 있는 아미노산 서열.
일부 구현예에서, 상기 PD-L1 결합 분자는 PD-1 길항제, 예를 들어, 항-PD-L1 항체이다.
일부 구현예에서, 상기 PD-L1 결합 분자는 단일-도메인 항체, 예를 들어, 중쇄 단일-도메인 항체이다.
일부 구현예에서, 상기 PD-L1 결합 분자는 키메라 항체 또는 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, 상기 VHH는 알파카 또는 라마를 포함하는 낙타과 동물로부터 유래된 것이다.
일부 구현예에서, 상기 VHH는 면역글로불린의 Fc 도메인, 형광 단백질, 또는 뚜렷한 특이성을 갖는 VHH를 포함하는 또 다른 분자에 융합된다.
일부 구현예에서, 상기 VHH는 IgG의 Fc 도메인에 융합된다. 추가 구현예에서, PD-L1 결합 분자는 낙타과 동물로부터 유래된 VHH 및 인간 IgG의 Fc 도메인의 키메라 항체이다. 추가 구현예에서, PD-L1 결합 분자는 낙타과 동물로부터 유래된 VHH 및 인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc 도메인의 키메라 항체이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 PD-L1 결합 분자는 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제 또는 차단하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 PD-L1 결합 분자는 대상(subject)에서 PD-L1과 관련된 상태를 치료 또는 예방하는데 사용된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자와 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 PD-L1 결합 분자에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열번호 5에 기재된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 PD-L1 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포(예를 들어, E. coli), 진균 세포(예를 들어, 효모) 또는 포유동물 세포로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 PD-L1 결합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 PD-L1 결합 분자를 발현하는 조건 하에 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포로부터의 PD-L1 결합 분자를 분리시키는 단계를 포함하는, PD-L1 결합 분자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자의 치료학적 유효량을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제 또는 차단하는 방법에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자의 치료학적 유효량을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 PD-L1과 관련된 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 대상(subject)은 PD-L1 길항제에 반응할 가능성이 있는 장애 또는 상태를 갖는 것으로 확인되었다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자의 치료학적 유효량을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 상향 조절로부터 이익을 얻을 대상의 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 대상(subject)은 PD-L1의 상향조절된 발현을 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 암과 같은 증식성 장애를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자의 용도에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 면역 반응의 상향 조절로부터 이익을 얻을 상태를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서 본 명세서에 개시된 PD-L1 결합 분자의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 상태는 암을 포함하는 증식성 장애, 또는 감염이다.
일부 구현예에서, 상기 암은 유방(breast)암, 폐(lung)암, 결장(colon)암, 난소(ovarian)암, 흑색종(melanoma), 방광(bladder)암, 신장(kidney)암, 간(liver)암, 침샘(salivary)암, 위(stomach)암, 신경교종(gliomas), 갑상선(thyroid)암, 흉선(thymic)암, 상피(epithelial)암, 두경부암(head and neck cancers), 위(gastric)암 및 췌장(pancreatic)암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 감염은 만성 감염이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 암과 같은 증식성 장애의 치료에 유용한, 본 명세서에 개시된 PD-L1 결합 분자, 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물을 사용하는 키트 또는 장치 및 관련 방법에 관한 것이다. 이를 위해, 본 개시내용은 바람직하게 본 명세서에 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자를 포함하는 리셉터클(receptacle)을 포함하는 이러한 장애를 치료하는데 유용한 제조 물품 및 증식성 장애 또는 이의 진행 또는 재발을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 본 명세서에 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자를 사용하기 위한 지침 자료를 제공한다. 선택된 구현예에서, 상기 장치 및 관련 방법은 하나 이상의 순환 종양 세포를 본 명세서에 개시된 바와 같은 PD-L1 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함할 것이다.
전술한 내용은 요약이므로 필요에 따라 세부 사항의 단순화, 일반화 및 생략을 포함한다. 결과적으로, 당업자는 상기 요약이 단지 예시적이며 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및/또는 장치 및/또는 기타 주제의 다른 측면, 특징 및 이점은 본 명세서에 기재된 교시에서 명백해질 것이다. 요약은 하기 상세한 설명에서 추가로 기재되는 단순화된 형태의 개념 선택을 소개하기 위해 제공된다. 상기 요약은 청구된 주제의 주요 특징 또는 필수 기능을 식별하기 위한 것이 아니며, 청구된 주제의 범위를 결정하는데 도움을 주기 위한 것도 아니다. 또한, 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
도 1은 MFI(Median Fluorescence Intensity)에 의해 발현되고 FACS로 측정되는, 세포 표면 PD-L1에 대한 항-PD-L1 항체의 결합을 나타낸다. 도 1A는 세포 표면 인간 PD-L1에 대한 항-PD-L1 항체의 결합을 나타낸다. 도 1B는 세포 표면 마우스 PD-L1에 대한 항-PD-L1 항체의 결합을 나타낸다. 도 1C는 세포 표면 원숭이 PD-L1에 대한 항-PD-L1 항체의 결합을 나타낸다.
도 2는 FACS에 의해 측정된, 항-PD-L1 항체에 의한 세포 표면 PD-L1 또는 CD80에 대한 PD-1의 결합에 대한 차단을 나타낸다. 도 2A는 항-PD-L1 항체에 의한 세포 표면 인간 PD-L1에 대한 인간 PD-1의 결합에 대한 차단을 나타낸다. 도 2B는 항-PD-L1 항체에 의한 세포 표면 마우스 PD-L1에 대한 마우스 PD-1의 결합에 대한 차단을 나타낸다. 도 2C는 항-PD-L1 항체에 의한 세포 표면 인간 CD80에 대한 인간 PD-1의 결합에 대한 차단을 나타낸다.
도 3은 ELISA로 측정한 인간 PD-1, PD-L2, CD80 및 CD86에 대한 교차 반응성을 나타낸다.
도 4는 벤치마크 항체(benchmark antibodies)에 대한 항체 AP3R2-1A3-z12-hIgG1의 에피토프 비닝(epitope binning)을 나타낸다: (A) BMK6 및 BMK8에 대한 비닝, 및 (B) BMK9에 대한 비닝.
도 5는 ELISA에 의해 측정되고 IL-2(pg/mL) 또는 IFN-γ(ng/ml)의 수준에 의해 반영된 바와 같이, 인간 동종 혼합 림프구 반응(human allogeneic mixed lymphcyte reaction)(Allo-MLR) 또는 자가(autologous) MLR에 대한 항-PD-L1 항체의 효과를 나타낸다. 도 5A는 인간 IL-2(hIL-2)의 수준에 의해 반영된 바와 같이, 인간 Allo-MLR에 대한 항-PD-L1 항체의 효과를 나타낸다. 도 5B는 인간 IFN-γγ의 수준에 의해 반영되는 바와 같이, 인간 Allo-MLR에 대한 항-PD-L1 항체의 효과를 나타낸다. 도 5C는 인간 IFN-γγ의 수준에 의해 반영된 바와 같이, 인간 자가 MLR에 대한 항-PD-L1 항체의 효과를 나타낸다.
도 6은 ELISA에 의해 측정되고 IL-2의 수준(pg/mL) 또는 분당 카운트(counts per minute; CPM)에 의해 반영된 바와 같이, 마우스 동종이계(allogeneic) MLR에 대한 항-PD-L1 항체의 효과를 나타낸다. 도 6A는 마우스 IL-2(mIL-2)의 수준에 의해 반영된 바와 같이, 마우스 동종이계 MLR에 대한 항-PD-L1 항체의 효과를 나타낸다. 도 6B는 CPM 수준에 의해 반영된 바와 같이, 마우스 동종이계 MLR에 대한 항-PD-L1 항체의 효과를 나타낸다.
도 7은 PD-L1 형질감염 세포에 대한 항-PD-L1 항체의 ADCC 테스트 결과를 나타낸다.
도 8은 PD-L1 형질감염된 세포에 대한 항-PD-L1 항체의 CDC 테스트 결과를 나타낸다.
도 9는 유세포분석기(flow cytometry)로 측정한 혈청 안정성 테스트(serum stability test)의 결과를 나타낸다.
도 10은 DSF(Differential Scanning Fluorimetry) assay에 의한 열 안정성 테스트(thermal stability test) 결과를 나타낸다.
실시예
따라서 일반적으로 기재된, 본 발명의 개시내용은 예시로서 제공되고 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아닌, 하기 실시예를 참조하여 보다 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 실시예는 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이 아니다.
실시예 1
재료의 준비
1. 재료의 준비
1.1 상업용 재료
실시예에 사용된 상업적으로 이용가능한 물질에 대한 정보는 표 1에 제시되어 있다. 출처가 명시되지 않은 물질도 상업적으로 이용가능하거나 또는 표준 분자 또는 유전학적 생물학적 방법에 따라 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
상업용 재료
물질 판매회사 Cat.
PE mouse anti-human CD274 Ab eBioscience Cat.#12-5983-42
PE rat anti-mouse CD274 Ab eBioscience Cat.#12-4317-87
PE goat anti-mouse IgG Fc Abcam Cat.#ab98742
R-PE goat anti-human IgG Fc Jackson Immuno Research Cat.#109-115-098
PE goat anti-mouse IgG Fc Abcam Cat.#Ab98742
Human PD-L1, ECD, mFc tag Sino Biological Cat.#10084-H05H
SA-PE eBioscience Cat.#12-4317-87
HRP goat anti-human IgG Fc Bethyl Cat.#A80-304P
Ficoll-PaqueTM PLUS GE Healthcare Cat.#17-1440-02
CD14 MicroBeads, human Milteny Cat.#130-050-201
Human CD4+ T Cell Enrichment kit STEMCELL Cat.#19052
Recombinant human GM-CSF Amoytop Biotech Cat.#S10980039
Recombinant human IL-4 R&D Cat.#204-IL-010
Standard recombinant human IFN-γ PeproTech Cat.#300-02
Human IFN-γ capture antibody Pierce Cat.#M700A
Human IFN-γ detection antibody Pierce Cat.#M701B
SA-HRP Invitrogen Cat.#SNN1004
Standard recombinant human IL-2 R&D Cat.#202-IL-010
Human IL-2 capture antibody R&D Cat.#MAB602
Human IL-2 detection antibody R&D Cat.#BAF202
Mouse IL-2 ELISA kit BD Cat.#2614KI
CMV pp65 peptide Miltenyi Biotec Cat.#130-093-435
LPS Sigma Cat.#L5418
H3-thymidine PerkinElmer Cat.#NET027001MC
MicroScint-20 PerkinElmer Cat.#6013621
Herceptin Roche Lot.#N3550
Human Serum Complement Quidel Cat.#A112
Cytotoxicity Detection Kit Roche Cat.#11644793001
CellTiter Glo Kit Promega Cat.#G7571
BT-474 cell line ATCC Cat.# HTB-20
Raji cell line ATCC Cat.#CCL-86
Lipofectamine?? 2000 Transfection Reagent Invitrogen Cat.#11668019
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium Gibco Cat.#21127022
FreeStyle?? 293 Expression Medium Gibco Cat.#12338002
Fetal Bovine Serum HyClone Cat.#SV30087.03
Blasticidin Gibco Cat.#R21001
1.2 재료 코드
벤치마크 항체, 세포외 도메인 및 세포를 포함하는 물질에 대한 코드 또는 약어는 표 2에 요약되어 있다.
재료 코드
재료 이름 코드
Benchmark antibody 6, same sequence with Imfinzi BMK6.uIgG1K(LFLEPS) or W315- BMK6.uIgG1K(LFLEPS)
Benchmark antibody 6, variable region of Imfinzi conjugated with human IgG4 constant region BMK6.hIgG4 or W315-BMK6.hIgG4
Benchmark antibody 8, same sequence with Tecentriq BMK8.uIgG1K(RKNA) or W315-BMK8.uIgG1K(RKNA)
Benchmark antibody 8, variable region of Tecentriq conjugated with human IgG4 constant region BMK8.hIgG4 or W315-BMK8.hIgG4
Benchmark antibody 9, same sequence with KN035 BMK9.Fc(IgG1) or W315-BMK9.Fc(IgG1)
Benchmark antibody 9，variable region of KN035 conjugated with human IgG4 constant region BMK9.Fc(IgG4) or W315-BMK9.Fc(IgG4)
Human IgG1 isotype control hIgG1 Isotype
Human IgG4 isotype control hIgG4 Isotype
Human PD-1 extracellular domain, mFc tag W305-hPro1.ECD.mFc
Mouse PD-1 extracellular domain, mFc tag W305-mPro1.ECD.mFc
Human PD-L1 extracellular domain, mFc tag W315-hPro1.ECD.mFc
Mouse PD-L1 extracellular domain, mFc tag W315-mPro1.ECD.mFc
Human PD-L1-expressing CHO-K1 cell W315-CHO-K1.hPro1.C11
Mouse PD-L1-expressing 293F cell W315-293F.mPro1.C1
Human CD80-expressing CHO-K1 cell CHO-K1.CD80.B9
Cynomolgus monkey PD-L1-expressing 293F cell W315-293F.cynoPro1.2A2
2. 항원의 생산
항원 W305-hPro1.ECD.mFc (NP_005009.2), W315-hPro1.ECD.mFc (NP_054862.1) 및 W305-mPro1.ECD.mFc (NP_032824.1), W315-mPro1.ECD.mFc (NP_068693.1)은 표준 분자생물학적 방법에 따라 제조하였다. 간단히 말해서, 항원의 세포외 도메인 세그먼트를 암호화하는 DNA 서열은 각 항원 유전자의 상응하는 수탁 번호를 기반으로 GENEWIZ(Suzhou, China)에서 합성된 다음 C 말단에 마우스 Fc 태그가 있는 pcDNA3.3 발현 벡터(Thermo Fisher Scientific)로 서브클로닝되었다. 그런 다음 재조합 플라스미드를 Expi293 세포(Invitrogen-A14527)에 형질감염시켰다. 세포 배양물을 150 rpm의 회전 속도로 가습 플랫폼 진탕기에서 성장시켰다. 온도는 8%의 CO2 수준으로 37℃로 유지되었다. 배양 5일 후, 상청액을 모으고 정제를 위해 여과하였다.
3. 벤치마크 항체의 생산
항-인간 PD-L1 대조군 항체 BMK6.uIgG1K (LFLEPS) 및 BMK6.hIgG4의 가변 서열은 MedImmune에 의해 제출된 PCT 출원 WO2015036499로부터의 클론 MEDI4736의 서열에 기초하여 합성되었고; BMK6.uIgG1K(LFLEPS) 및 BMK6.hIgG4는 상업적으로 이용가능한 Imfinzi의 서열에 따라 제조하였다. BMK8.uIgG1K(RKNA) 및 BMK8.hIgG4의 가변 서열은 Roche에 의해 제출된 PCT 출원 WO2010077634로부터의 클론 YW243.55.S70의 서열에 기초하여 제조되었다. BMK8.uIgG1K(RKNA) 및 BMK8.hIgG4는 Tecentriq(Genentech으로부터 상업적으로 이용가능함)의 서열을 기반으로 제조되었다. BMK9.Fc(IgG1)는 Suzhou ALPHAMAB에 의해 제출된 PCT 출원 WO2017020802로부터의 클론 KN035의 서열을 기반으로 제조되었다. 인간 IgG1 및 IgG4 이소타입 대조군 항체는 WuXi Biologics Discovery HD 그룹에 의해 발견되었고 PS 그룹에 의해 제조되었으며, 이는 동일한 가변 영역을 공유한다.
유전자는 GENEWIZ(Suzhou, China)에서 합성한 다음, 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터(Thermal Fisher Scientifics)에 서브클로닝하였다. Expi293 세포(Invitrogen-A14527)를 정제된 발현 벡터로 형질감염시켰다. 세포를 5일 동안 배양하고 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, 175438)을 사용하여 단백질 정제를 위해 상청액을 수집하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE와 SEC로 분석한 후 -80℃에서 보관하였다.
4. 안정적인 세포주/세포 풀 구축
인간 PD-L1 발현 세포주(W315-CHO-K1.hPro1.C11), 마우스 PD-L1 발현 세포주(W315-293F.mPro1.C1), 사이노몰구스 원숭이 PD-L1 발현 세포주(W315- 293F.cynoPro1.2A2), 인간 CD80-발현 세포주(CHO-K1.CD80.B9)는 WuXi Biologics Discovery PS 그룹에 의해 생성되었다.
인간 PD-L1(NP_054862.1) 및 CD80(NP_005182.1) 고발현 세포주 구축을 위해, 인간 PD-L1 및 CD80의 유전자를 발현 벡터 pcDNA 3.3에 각각 삽입하였다. 그런 다음 각 발현 벡터를 CHO-K1 세포에 각각 형질감염시켰다. 간단히 말해서, 형질감염 하루 전에, 5x105 CHO-K1 세포를 6웰 조직 배양 플레이트의 1웰에 플레이팅하고 5% CO2 및 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포에 10% FBS가 포함된 신선한 배지 F12-K 3 ml를 공급하였다. 200 ㎕의 최종 볼륨이 되도록 10 ㎍의 Lipofectamine 2000 및 Opti-MEM 배지와 혼합된 4 ㎍의 DNA를 포함하는 1.5 mL 튜브에서 형질감염 시약을 제조하였다. 튜브 피펫의 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하였다. 형질감염 6 내지 8시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 3 ml의 새로운 배지를 공급하였다. 발현 세포를 형질감염 24 내지 48시간 후에 트립신으로 수거하고 선택 배지(10% FBS 및 10 ㎍/ml 블라스티시딘을 포함하는 F12-K)에서 T75 플라스크에 플레이팅하였다. 안정한 단일 세포 클론은 희석을 제한하여 분리되었다.
마우스 및 시노몰구스 원숭이 PD-L1 고발현 세포주 구축을 위해 마우스 PD-L1(NP_068693.1) 및 시노몰구스 원숭이 PD-L1(XP_015292694.1)의 유전자를 발현 벡터 pcDNA 3.3에 각각 삽입하였다. 그런 다음 각 발현 벡터를 293F 세포에 각각 형질감염시켰다. 간단히 말해서, 세포를 계수하고 1.2 x 106/ml의 밀도로 125 ml 플라스크에 희석하고 5% CO2 및 37℃에서 진탕하였다. 세포에 30 ml의 신선한 배지 Freestyle293을 공급하였다. 3 ml의 최종 볼륨이 되도록 75 ㎕의 Lipofectamine 2000 및 Opti-MEM 배지와 혼합된 30 ㎍의 DNA를 포함하는 15 ml 튜브에서 형질감염 시약을 제조하였다. 튜브 피펫의 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하였다. 형질감염 후 발현 세포를 수확하고 선택적 배지(Freestyle293 및 4㎍/ml 블라스티시딘)에서 125ml 플라스크로 옮겼다. 안정한 단일 세포 클론은 희석을 제한하여 분리되었다.
실시예 2
VHH 및 VHH-Fc 융합 항체의 생산
1. 면역화
낙타과 동물에서 PD-L1에 대한 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 동물에 인간 및 마우스 PD-L1 ECD 단백질(실시예 1의 "2. 항원의 생산" 참조)을 1 내지 3주 간격으로 8회 피하 주사하였다. 용량 범위는 주사당 50 ㎍에서 200 ㎍이다.
2. 혈청 역가 검출
면역화 후, 동물 혈청에 제시된 항-PD-L1 특이적 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. 간단히 말해서, ELISA 플레이트(Nunc, Rochester, MN, USA)를 각각 1 ㎍/ml의 재조합 his 태그가 붙은 인간 및 마우스 PD-L1 ECD 단백질로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 차단 및 세척 후, 면역 전 또는 면역 혈청의 연속 희석액을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한 다음, 염소 항-라마 IgG-HRP(Novas Biologicals, Littleton, CO, USA)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하고 2 M HCl로 반응을 중단시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
3. 파지 라이브러리 구축
마지막 두 번의 주사 후 6 내지 7일에 각각 50 ml의 혈액 샘플을 수집하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에서 밀도 구배 원심분리에 의해 정제하여 대략 1 x 108 PBMC를 분리하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라 이러한 PBMC에서 전체 RNA를 추출하고 oligo-dT 프라이머와 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix System(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 cDNA로 전사하였다. 이어서 정제된 cDNA를 주형으로 사용하여 신호 펩티드 도메인 특이적 프라이머 및 CH2 도메인 특이적 프라이머를 사용하여 Ig 중쇄-암호화 유전자 절편의 레퍼토리를 증폭시켰다. 이 증폭으로 약 900 bp(기존 IgG를 나타냄) 및 700 bp(CH1 도메인이 없는 중쇄 IgG를 나타냄)의 PCR 단편이 생성되었다. 그런 다음 두 클래스의 중쇄 암호화 유전자를 아가로스 겔에서 크기 분리하고 중쇄 전용 IgG를 암호화하는 유전자를 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Hilden, Germany)로 정제하였다. 정제된 단편은 프레임워크1(FR1) 및 프레임워크4(FR4) 특이적 프라이머 쌍을 사용하여 VHH 레퍼토리를 증폭하기 위한 템플릿으로 사용되었다. 이 증폭 절차는 FR1의 5' 말단에 Sfi I 제한 부위를 도입하고 FR4의 3' 말단에 Not I 제한 부위를 도입하였다. 약 300 내지 400 bp의 PCR 증폭 VHH 유전자 레퍼토리를 아가로스 겔에 로딩하고 QIAquick Gel Extraction Kit로 정제하였다. 그런 다음 정제된 단편을 Sfi I 및 Not I로 절단하고 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen, Hilden, Germany)로 정제하였다. VHH 유전자 단편을 최종적으로 파지미드 벡터 pFL249(Nanjing GenScript)에 연결하고 E.Coli TG1으로 전기변환하였다. 형질전환 후, TG1 세포를 200 rpm에서 1시간 동안 진탕하면서 SOC 배지에서 배양한 다음, E.Coli TG1을 100㎍/mL 탄수화물 및 1%(w/v) 글루코오스가 보충된 고체 2YT 배지를 함유하는 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 콜로니를 1/3(v/v)의 80% 글리세롤이 보충된 액체 2YT 배지에 긁어내고 -80℃에서 보관하였다.
4. 항-PD-L1 특이적 VHH 단편의 파지 디스플레이 선택
PD-L1에 효과적으로 결합하는 VHH 단편을 선택하기 위해 단백질 패닝 방법이 사용되었다.
간단히 말해서, 20 ㎍의 재조합 his-tagged 인간 PD-L1 ECD 단백질을 400 rpm에서 진탕하면서 4℃에서 밤새 5 ml 면역 튜브(Nunc, Rochester, MN, USA)에 고정화시켰다. 다음날, 결합되지 않은 단백질을 세척한 후, 25℃에서 1시간 동안 10% 스킴밀크로 튜브를 블로킹하였다. 면역 파지 라이브러리로부터 약 1012 cfu 파아지를 10% 스킴밀크로 블로킹된 코팅되지 않은 면역 튜브에 첨가하여 비특이적으로 결합된 파지를 고갈시킨 다음, 상기 기재된 바와 같이 처리된 파지를 튜브에 첨가하고 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. PBST(phosphate buffered solution)로 광범위하게 세척한 후, 비특이적으로 흡착된 파지는 폐기하고 표적 특이적으로 결합된 파지는 Glycine-HCl(pH 2.2)로 용출시킨 다음 기하급수적으로 성장하는 TG1 세포의 감염을 위해 1 M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화시켰다. 감염된 TG1 세포를 2%(w/v) 글루코스 및 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 2YT 아가(agar) 플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 콜로니를 3 ml 2YT로 플레이트에서 긁어내고 1/3(v/v) 80% 글리세롤을 첨가하여 -80℃에서 동결시켰다. 긁어낸 박테리아 라이브러리를 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 2YT-Carb에 접종하고 파지 구조(rescue)를 위해 50 ㎍/ml 카나마이신 및 1 mM IPTG를 포함하는 2YT 배지에서 헬퍼 파지 M13KO7로 감염시키고 다음 패닝을 위한 인풋(input)으로 사용하였다.
5. VHH 단백질 발현 및 스크리닝
원하는 패닝 단계 후, 플레이트 상에서 성장한 파지 감염된 TG1 세포 콜로니를 긁어내고 VHH 단편을 함유하는 pFL249 파지미드를 추출하였다. VHH 단편은 pFL249 플라스미드를 Sfi I 및 Not I로 절단하여 클로닝한 다음 hexa-histidine- 및 c-Myc-tag의 유전자를 포함하는 발현 벡터 pETbac에 연결하였다. 결찰 생성물을 E. coli BL21 (DE3) 컴피턴트 세포(competent cell)로 형질전환시킨 후, ZYM-5052 배지에서 25℃에서 48시간 동안 230 rpm에서 진탕시키면서 배양하였다. 그런 다음 ELISA 또는 FACS 테스트를 위해 박테리아 배양 상층액을 수집하였다.
ELISA는 인간 PD-L1 ECD 단백질에 대한 VHH의 결합을 테스트하기 위한 첫 번째 스크리닝 방법으로 사용되었다. 간단히 말해서, 96웰 플레이트(Nunc, Rochester, MN, USA)를 재조합 his-tagged 인간 PD-L1 ECD 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 블로킹 및 세척 후, BL21 E.coli 상층액을 코팅된 플레이트로 옮기고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 세척하였고, 2차 항체 Goat Anti-c-Myc-HRP(Bethyl, Montgomery, TX, USA)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 2 M HCl로 반응을 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 판독하였다.
인간 PD-L1에 대한 고유의 결합을 확인하고 세포막에 발현된 형태적 PD-L1 분자에서 PD1과의 상호작용의 차단을 확인하고자, CHOK1.PD-L1 세포를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 세포를 먼저 96-웰 U-바닥 플레이트(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 E.coli 배양 상청액 샘플 및 리간드와 함께 4℃에서 1시간 동안 1 x 106 세포/웰의 밀도로 인큐베이이션하였고, 그런 다음 이차 항체 염소 항-c-Myc-PE(Bethyl, Montgomery, TX, USA)로 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 각 단계 사이에 2회 세척을 적용하고 유세포 분석을 위해 세포를 1X PBS/1% BSA에 재현탁하였다(IntelliCyt, Albuquerque, NM, USA).
6. 키메라 VHH-Fc(higG1) 단백질 생산
관심 클론은 VHH-Fc(hIgG1) 융합 항체로 전환되었다. 간략하게, VHH 유전자는 적절한 제한 부위를 포함하는 VHH-특이적 클로닝 프라이머를 사용하여 pET-bac 벡터로부터 PCR 증폭된 다음, 인간 hIgG1의 Fc를 포함하는 변형된 발현 pcDNA3.3 벡터로 융합에 의해 클로닝되어 VHH-Fc(hIgG1) 키메라 항체에 상응하는 클론을 생성하였다. 293F 또는 Expi293 세포를 항체 발현용 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 항체를 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하고 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 3
항체 인간화
ELISA 및 FACS 스크리닝 후, PD-L1에 대한 원하는 친화도 및 특이성을 갖는 하나의 VHH 리드(lead)가 인간화를 위해 선택되었다. VHH 체인을 인간화하기 위해 "Best Fit" 접근 방식이 사용되었다. VHH 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 V-유전자 데이터베이스에 대해 블라스팅되었고, 인간화 VHH 서열은 Kabat CDR 정의를 사용하여 상위 히트의 인간 CDR 서열을 VHH CDR 서열로 대체함으로써 생성되었다. 프레임워크 영역의 특정 잔기는 친화도를 유지하기 위해 VHH의 잔기로 역돌연변이되었다. 인간화된 유전자는 역번역되었고, 포유동물 발현을 위한 코돈 최적화를 수행하였으며, GENEWIZ에 의해 합성되었다. SPR을 사용하여 PD-L1 결합에 대해 테스트한 후, VHH 변이체 AP3R2-1A3-z12가 인간화 항체 리드(lead)로 선택되었다. 이들의 서열 정보는 표 A 및 서열 목록에 제공된다(서열 번호 4(아미노산 서열) 및 5(뉴클레오타이드 서열) 참조).
VHH AP3R2-1A3-z12의 유전자는 추가 특성화를 위해 VHH-Fc(hIgG1) 또는 VHH-Fc(hIgG4)의 상응하는 클론을 생성하기 위해 인간 hIgG1 또는 인간 IgG4의 Fc를 포함하는 변형된 pcDNA3.3 벡터 내로 클로닝되었다. 인간화 클론은 AP3R2-1A3-z12-hIgG1 또는 AP3R2-1A3-z12-hIgG4로 명명되었다. 본 개시내용 및 도면에서, 인간화 항체 AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 또한 W3156-AP3R2-1A3-z12-hIgG1에 의해 제시되고 인간화 항체 AP3R2-1A3-z12-hIgG4는 또한 W3156-AP3R2-1A3-z12-hIgG4에 의해 제시된다. 2개의 인간화 항체는 본 개시내용에서 "W3156 항체"로 집합적으로 지칭된다.
실시예 4
시험관내 특성화
1. FACS에 의해 측정된 인간, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 PD-L1에 대한 AP3R2-1A3-z12-hIgG1의 결합
1.1 인간 PD-L1 결합
인간 PD-L1 형질감염된 W315-CHO-K1.hPro1.C11 세포를 1×105 세포/웰로 96-웰 U-바닥 플레이트(BD)에 플레이팅하고 다양한 농도의 항-PD-L1 항체(133.3 nM에서 0.008 nM으로 4배 연속 희석)와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1xPBS/1%BSA로 세척한 후, 2차 항체 PE-표지된 염소 항-인간 IgG를 적용하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 인큐베이션하였다. 항-인간 PD-L1 항체 BMK6.hIgG4, BMK8.hIgG4 및 BMK9.Fc(IgG1)를 양성 대조군으로 사용하였다. 인간 IgG1 및 IgG4 이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1x PBS/1% BSA에 재현탁시켰다. 세포의 MFI는 유세포 분석기(BD)로 측정하고 FlowJo(버전 7.6.1)로 분석하였다. 데이터는 도 1A 및 표 3에 나타내었다.
항체와 인간 PD-L1 간의 결합의 EC50 값
Abs EC 50 (nM)
AP3R2-1A3-z12-hIgG1 0.458
BMK6.hIgG4 0.304
BMK8.hIgG4 0.562
BMK9.Fc (IgG1) 0.456
도 1A 및 표 3에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 BMK 항체와 유사한 EC50으로 세포 표면 인간 PD-L1에 결합한다.
1.2 마우스 PD-L1 결합
마우스 PD-L1 형질감염된 W315-293F.mPro1.C1 세포를 2×105 세포/웰로 96-웰 U-바닥 플레이트에 플레이팅하고 다양한 농도의 항-PD-L1 항체(133.3 nM에서 0.0068 nM으로 3배 연속 희석)와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1xPBS/1%BSA로 세척한 후, 2차 항체 PE-표지된 염소 항-인간 IgG를 적용하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 인큐베이션하였다. 항-인간 PD-L1 항체 BMK8.hIgG4 및 BMK9.Fc(IgG1)를 대조군 항체로 사용하였다. 인간 IgG1 및 IgG4 이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1x PBS/1% BSA에 재현탁시켰다. 세포의 MFI는 유세포 분석기(BD)로 측정하고 FlowJo(버전 7.6.1)로 분석하였다. 데이터는 도 1B 및 표 4에 나와 나타내었다.
항체와 마우스 PD-L1 간의 결합의 EC50 값
Abs EC 50 (nM)
AP3R2-1A3-z12-hIgG1 1.241
BMK9.Fc (IgG1) -
BMK8.hIgG4 1.477
도 1B 및 표 4에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 BMK8 Ab와 유사한 EC50으로 세포 표면 마우스 PD-L1에 결합한다.
1.3 사이노몰구스 원숭이 PD-L1 결합
사이노몰구스 원숭이 PD-L1 형질감염된 293F.cynoPro1 세포를 2×105개 세포/웰로 96-웰 U-바닥 플레이트에 플레이팅하고 다양한 농도의 항-PD-L1 항체(133.3 nM에서 0.0068 nM으로 3배 연속 희석) 와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1xPBS/1%BSA로 세척한 후, 2차 항체 PE-표지된 염소 항-인간 IgG를 적용하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 인큐베이션하였다. 항-인간 PD-L1 항체 BMK6.hIgG4, BMK8.hIgG4 및 BMK9.Fc(IgG1)를 대조군 항체로 사용하였다. 인간 IgG1 및 IgG4 이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1x PBS/1% BSA에 재현탁시켰다. 세포의 MFI는 유세포 분석기(BD)로 측정하고 FlowJo(버전 7.6.1)로 분석하였다. 데이터는 도 1C 및 표 5에 나타내었다.
항체와 시노몰구스 원숭이 PD-L1 간의 결합의 EC50 값
Abs EC 50 (nM)
AP3R2-1A3-z12-hIgG1 2.056
BMK9.Fc (IgG1) 2.326
BMK6.hIgG4 2.649
BMK8.hIgG4 2.189
도 1C 및 표 5에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 BMK Ab와 유사한 EC50으로 세포 표면 원숭이 PDL-1에 결합한다.
2. 완전한 동역학적 친화도(Full kinetic affinity)(SPR)
his-태그된 인간 PD-L1(R&D-9049-B7), his-태그된 시노몰구스 PD-L1(Sino Biological-90251-C08H) 및 his-태그된 마우스 PD-L1(Sino Biological-50010-M08H)에 대한 항체 결합 친화도는 소프트웨어 ProteOn을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석에 의해 검출되었다. 시험용 항체는 항-인간 IgG Fc 항체를 고정화한 GLM 칩(Bio-rad)에 포획하였다. 칩을 90° 회전시키고 기준선이 안정될 때까지 러닝 버퍼로 세척하였다. 다른 농도의 hPro1.ECD.His, cynoPro1.ECD.His 및 mPro1-ECD-His를 120초의 결합 단계에 대해 100 uL/min의 유속으로 센서 칩 위에 주입한 후 240 내지 800초 해리를 수행하였다. 칩은 모든 해리 단계 후에 10 mM 글리신(pH 1.5)에 의해 재생되었다.
기준 채널 L1 및 버퍼 채널 A6에 대한 센서그램을 테스트 센서그램에서 감산되었다. 실험 데이터는 1:1 결합 모델에 맞춰졌다. 40 kDa의 분자량을 사용하여 분석물 hPro1.ECD.His(R&D), cynoPro1.ECD.His 및 mPro1-ECD-His의 몰 농도를 계산하였다.
데이터는 표 6에 나타내었다.
친화도
리간드 분석물 ka (1/Ms) kd (1/s) K D (M)
AP3R2-1A3-z12-hIgG4 hPro1.ECD.His (인간 PD-L1 ECD) 1.85Х106 3.85Х10-4 2.08Х10-10
cynoPro1.ECD.His
(시노 PD-L1 ECD)		 1.91Х106 4.78Х10-4 2.51Х10-10
mPro1-ECD-His
(마우스 PD-L1 ECD)		 5.89Х105 1.14Х10-2 1.94Х10-8
3. 세포 표면 PD-L1에 대한 결합 친화도(FACS)
세포 표면 인간, 시노몰구스 및 마우스 PD-L1에 대한 시험 항체의 결합 친화도를 엔지니어링 세포주에 대한 유세포 분석에 의해 각각 결정하였다. 세포를 5x104개 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-바닥 플레이트(BD)로 옮겼다. 테스트할 항체는 1% BSA/1XPBS에 1 : 2-배 연속 희석되었고 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션되었다. 그 다음, 플레이트를 1500 rpm에서 4분 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다. 이차 항체인 Alexa647 접합된 염소 항-인간 IgG Fc(Jackson, Cat No.109-605-098, Lot No.121363)를 세포를 재현탁하기 위해 첨가하고 암조건(dark)의 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 한 번 세척하고 100 μL 1% BSA/1XPBS에 재현탁한 다음 유세포 분석(BD Canto II)으로 측정하고 FlowJo로 분석하였다. 형광 강도는 정량적 비드(QuantumTM MESF Kit, Bangs Laboratories)를 기반으로 결합된 분자/세포로 변환되었다. KD 값은 Graphpad Prism5로 계산하였다.
데이터는 표 7-1, 표 7-2 및 표 7-3에 나타내었다.
[표 7-1]
세포 표면 인간 PD-L1에 대한 친화도
[표 7-2]
세포 표면 시노몰구스 PD-L1(cynoPD-L1)에 대한 친화도
[표 7-3]
세포 표면 마우스 PD-L1에 대한 친화도
표 7-1, 표 7-2 및 표 7-3에 나타낸 바와 같이, 세포 표면 인간, 시노몰구스 및 마우스 PD-L1에 대한 AP3R2-1A3-z12-hIgG1의 결합 친화도는 BMK Ab의 결합 친화도보다 우수/유사하다.
4. PD-L1 또는 CD80에 대한 결합 차단
4.1 FACS에 의해 측정된 인간 PD-1/PD-L1 차단
인간 PD-L1 형질감염된 W315-CHO-K1.hPro1.C11 세포를 1×105개 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-바닥 플레이트에 옮겼다. 다양한 농도의 항체(266.7 nM에서 0.016 nM으로 4배 연속 희석)와 5 ㎍/mL의 일정한 농도의 인간 PD-1 ECD 단백질(hPro1.ECD.mFc)을 미리 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 배양하였다. 1xPBS/1%BSA로 세척한 후, 이차 항체 PE-표지된 염소 항-마우스 IgG를 적용하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 인큐베이션하였다. 항-인간 PD-L1 항체 BMK6.hIgG4, BMK8.hIgG4 및 BMK9.Fc(IgG1)를 양성 대조군으로 사용하였다. 인간 IgG1 및 IgG4 이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1x PBS/1% BSA에 재현탁시켰다. 세포의 MFI는 유세포 분석기(BD)로 측정하고 FlowJo(버전 7.6.1)로 분석하였다. 데이터는 도 2A 및 표 8에 나타내었다.
[표 8]
인간 PD-1과 PD-L1 간의 결합 억제의 IC50
4.2 FACS에 의해 측정된 마우스 PD-1/PD-L1 차단
마우스 PD-L1 형질감염된 W315-293F.mPro1.C1 세포를 2 x 105 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-바닥 플레이트로 옮겼다. 다양한 농도의 항-PD-L1 항체(133.3 nM에서 0.068 nM로 3배 연속 희석) 및 5 ㎍/mL의 일정한 농도의 마우스 PD-1 ECD 단백질(W305-mPro1.ECD.mFc)을 미리 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 배양하였다. 1xPBS/1%BSA로 세척한 후, 이차 항체 PE-표지된 염소 항-마우스 IgG를 적용하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 인큐베이션하였다. 항-인간 PD-L1 항체 BMK8.hIgG4 및 BMK9.Fc(IgG1)를 대조군 항체로 사용하였다. 인간 IgG1 및 IgG4 이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1x PBS/1% BSA에 재현탁시켰다. 세포의 MFI는 유세포 분석기(BD)로 측정하고 FlowJo(버전 7.6.1)로 분석하였다.
데이터는 도 2B 및 표 9에 나타내었다.
[표 9]
마우스 PD-1과 PD-L1 간의 결합 억제의 IC50
4.3 FACS에 의해 측정된 인간 PD-L1/CD80 차단
인간 CD80-발현 세포(CHO-K1.CD80.B9)를 1 x 105개 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-바닥 플레이트에 옮겼다. 다양한 농도의 항체(667 nM, 66.7 nM 및 6.67 nM) 및 5 μg/mL의 일정한 농도의 인간 PD-L1 ECD 단백질(W315-hPro1.ECD.mFc)을 30분 동안 사전 혼합하고 세포와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1xPBS/1%BSA로 세척한 후, 이차 항체 PE-표지된 염소 항-마우스 IgG를 적용하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 인큐베이션하였다. 항-인간 PD-L1 항체 BMK6.hIgG4, BMK8.hIgG4 및 BMK9.Fc(IgG1)를 양성 대조군으로 사용하였다. 인간 IgG1 및 IgG4 이소타입 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1x PBS/1% BSA에 재현탁시켰다. 세포의 MFI는 유세포 분석기(BD)로 측정하고 FlowJo(버전 7.6.1)로 분석하였다. 데이터는 도 2C에 나타내었다.
도 2C에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 용량 의존적 방식으로 세포 표면 CD80에 대한 인간 PD-L1의 결합을 차단하는 데 효과적이다.
5. ELISA에 의해 측정된 교차-패밀리 단백질 결합 분석
96-웰 플레이트는 인간 PD-L1 ECD 단백질(R&D-9049-B7), hPD-L2.ECD.His(SinoBiological-10292-H08H), hCD80.ECD.His(SinoBiological-10698-H08H) 또는 hCD86.ECD.His(SinoBiological-10699-H08H)의 웰당 1 ㎍/mL, 100 μL로 4℃에서 밤새 사전 코팅되었다. 200 μL의 1xPBS/2%BSA를 사용하여 1시간 동안 차단한 후, 테스트 항체를 66.7 nM의 농도로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 고정된 단백질에 대한 항체의 결합은 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG 항체에 의해 검출되었다. 100 μL의 TMB 기질을 분배하여 색상을 발색한 다음, 100 μL의 2 N HCl로 정지하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 각각 450 nm 및 540 nm에서 판독되었다. 데이터는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 특히 인간 PD-L1이며 PD-L2, CD80 및 CD86에 교차 반응하지 않는다.
6. FACS에 의한 에피토프 비닝(binning)
인간 PD-L1 발현 세포 W315-CHO-K1.hPro1.C11을 1×105개 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-바닥 플레이트에 옮겼다. 다양한 농도의 W3156 항체(133.3 nM에서 0.0068 nM로 3배 연속 희석)를 각각 일정한 농도의 비오틴화된 BMK6.hIgG4(0.5 ㎍/mL) 또는 비오틴화된 BMK8.hIgG4(0.5 ㎍/mL)와 혼합하였다. 그 다음 혼합물을 96-웰 플레이트의 세포에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1xPBS/1%BSA로 세척한 후, 이차 항체 SA-PE를 적용하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1x PBS/1% BSA에 재현탁시켰다. 세포의 MFI는 유세포 분석기로 측정하고 FlowJo(버전 7.6.1)로 분석하였다.
BMK9, Fc(IgG1)에 대한 에피토프 비닝(binning)을 테스트하기 위해, W3156 리드(lead) 항체를 C-myc 및 His 태그가 결합된 VHH 형식으로 구축하였다. W315-CHO-K1.hPro1.C11 세포를 1×105개 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-바닥 플레이트에 옮겼다. 일정한 농도의 AP3R2-1A3 VHH 형식을 다양한 농도의 BMK9.Fc(IgG1)(133.3 nM에서 0.0008 nM으로 3배 연속 희석)와 각각 혼합하였다. 그 다음 혼합물을 96-웰 플레이트의 세포에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1×PBS/1%BSA로 세척한 후, 2차 항체 PE-표지된 항-C-myc를 적용하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 1x PBS/1% BSA에 재현탁시켰다. 세포의 MFI는 유세포 분석기로 측정하고 FlowJo(버전 7.6.1)로 분석하였다. 데이터는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 BMK6, BMK8 및 BMK9와 유사한 에피토프 빈(bin)을 공유한다.
7. 인간 세포 기반 기능 분석
원-웨이(one-way) 혼합 림프구 반응(원-웨이 MLR)을 사용하여 인간 CD4+ T 세포의 사이토카인 분비 및 증식에 대한 항-PD-L1 항체의 효능 효과를 테스트하였다.
i) 세포 분리, 세포 배양 및 유도
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Ficoll-Paque PLUS 구배 원심분리를 사용하여 건강한 기증자로부터 갓 분리되었다. 분리된 PBMC를 100 U/mL 재조합 인간 IL-2가 보충된 완전한 RPMI-1640(10% FBS 및 1% PS 함유)에서 배양하였다.
인간 단핵구는 제조업체의 지침에 따라 인간 CD14 MicroBeads 키트를 사용하여 분리되었다. 세포 농도는 800 U/mL의 재조합 인간 GM-CSF 및 50 ng/mL의 IL-4가 보충된 완전 RPMI-1640 배지에서 2 x 106개 세포/mL로 조정되었다. 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 2.5 mL/웰로 시딩하였다(was seeded). 세포를 5 내지 7일 동안 배양하여 수지상 세포(DC)로 분화시켰다. 배지의 절반을 사이토카인이 보충된 새로운 배지로 교체하여 사이토카인을 2 내지 3일마다 보충하였다. MLR 18 내지 24시간 전에 1 ㎍/mL LPS를 배양액에 첨가하여 DC 성숙을 유도하였다.
인간 CD4+ T 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 인간 CD4+ T 세포 농축 키트를 사용하여 분리되었다.
ii) 혼합 림프구 반응
인간 동종이계(allogeneic) MLR의 경우, 정제된 CD4+ T 세포를 동종 성숙 DCs(mDCs)와 공동 배양하였다.
인간 자가(autologous) MLR의 경우, PBMC를 CD4+ T 세포 분리 전에 5일 동안 CMV 펩티드로 처리하였다. 분석 당일 DC를 CMV 펩타이드로 1시간 동안 처리한 후 자가 인간 CD4+ T 세포와 공동 배양하였다.
MLR은 완전한 RPMI-1640 배지를 사용하여 96웰 둥근 바닥 플레이트에 설정되었다. CD4+ T 세포, 다양한 농도의 항체(166.7 nM, 66.7 nM, 6.67 nM, 0.667 nM, 0.0667 nM 및 0.0067 nM) 및 동종 DC를 적절한 비율로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. IL-2 및 IFN-γ생산은 각각 3일 및 5일에 결정되었다.
iii) 사이토카인 검출
인간 IFN-γ및 IL-2 방출은 일치하는 항체 쌍을 사용하여 ELISA에 의해 측정되었다. 재조합 인간 IFN-γ및 IL-2은 각각 표준으로 사용되었다. IFN-γ의 연속 농도는 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 ng/mL이었고 IL-2의 농도는 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 ng/mL였다. 플레이트를 각각 인간 IFN-γ또는 IL-2에 특이적인 포획 항체로 미리 코팅하였다. 차단 후, 50 μL의 표준 또는 샘플을 각 웰에 피펫팅하고 주변 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 상응하는 사이토카인에 특이적인 비오틴 결합 검출 항체를 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 스트렙타비딘-HRP를 주위 온도에서 30분 동안 웰에 첨가하였다. 50 μL의 TMB 기질을 분배하여 색상을 발색한 다음 50 μL의 2 N HCl로 정지시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450 nm 및 540 nm에서 판독되었다. 상등액의 사이토카인 농도는 표준 곡선에서 계산되었다. 데이터는 도 5A, 5B 및 5C에 나타내었다.
도 5A에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 동종이계(allogeneic) MLR 분석에서 용량 의존적 방식으로 인간 CD4+ T 세포 IL-2 생산을 촉진한다. 그리고 도 5B에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 동종이계 MLR 분석에서 용량 의존적 방식으로 CD4+ T 세포 IFNγ생산을 촉진한다. 또한, 도 5C에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 자가(autologous) MLR 분석에서 용량 의존적 방식으로 CD4+ T 세포 IFN-γ생산을 촉진한다.
8. 마우스 세포 기반 기능 분석
원-웨이(one-way) MLR을 사용하여 마우스 CD4+ T 세포의 사이토카인 분비 및 증식에 대한 PD-L1 항체의 효능 효과를 테스트했습니다.
i) 세포 분리, 세포 배양 및 유도
Balb/c 및 C57BL/6 마우스는 Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.에서 구입하였다.
마우스 골수 세포를 20 ng/mL 재조합 마우스 GM-CSF 및 20 ng/mL 마우스 IL-4가 보충된 완전한 RPMI-1640 배지에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 2.5 mL/웰로 시딩하였다(was seeded). 세포를 5 내지 7일 동안 배양하여 DC로 분화시켰다. 배지의 절반을 사이토카인이 보충된 새로운 배지로 교체하여 사이토카인을 2 내지 3일마다 보충하였다. MLR 18 내지 24시간 전에 1 ㎍/mL LPS를 배양액에 첨가하여 DC 성숙을 유도하였다.
제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 CD4+ T 세포 농축 키트를 사용하여 마우스 CD4+ T 세포를 비장에서 분리하였다.
ii) 혼합 림프구 반응
MLR은 완전한 RPMI-1640 배지를 사용하여 96웰 둥근 바닥 플레이트에 설정되었다. Balb/c 마우스의 CD4+ T 세포, 다양한 농도의 항체(166.7 nM, 66.7 nM, 6.67 nM, 0.667 nM, 0.0667 nM 및 0.0067 nM) 및 C57BL/6 마우스의 mDC를 적절한 비율로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. IL-2 생산은 3일째에 측정되었다. 3H-TDR에 의한 CD4+ T 세포 증식을 측정하기 위해 세포를 5일째에 수확하였다.
iii) 사이토카인 검출
마우스 IL-2 방출은 일치하는 항체 쌍을 사용하여 ELISA에 의해 측정되었다. 재조합 마우스 IL-2는 표준으로 사용되었다. IL-2의 연속 농도는 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625, 0.003125 ng/mL였다. 플레이트를 마우스 IL-2에 특이적인 포획 항체로 미리 코팅하였다. 블로킹 후, 50 μL의 표준 또는 샘플을 각 웰에 피펫팅하고 주변 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 바이오틴이 결합된 검출 항체를 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 스트렙타비딘-HRP를 주위 온도에서 30분 동안 웰에 첨가하였다. 50 μL의 TMB 기질을 분배하여 색상을 발색한 다음, 50 μL의 2 N HCl로 정지시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450 nm 및 540 nm에서 판독되었다. 상등액의 사이토카인 농도는 표준 곡선에서 계산되었다.
iv) 증식 검출
3H-티미딘(3H-thymidine)을 0.9% NaCl 용액에 희석하고, 세포 배양 플레이트에 0.5 uCi/웰로 첨가하였다. 증식하눈 세포에 3H-티미딘이 혼입된 것이 확인되기 전에, 플레이트는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16 내지 18시간 동안 배양되었다.
도 6A에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 MLR 분석에서 용량 의존적 방식으로 마우스 CD4+ T 세포 mIL-2 생산을 촉진한다. 그리고, 도 6B에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 MLR 분석에서 용량 의존적 방식으로 마우스 CD4+ T 증식을 촉진한다.
9. 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)
W315-CHO-K1.hPro1.C11 세포 및 다양한 농도의 시험 항체(66.7 nM에서 0.00667 pM로 10배 희석)를 96-웰 플레이트에서 혼합하고, PBMC를 50 : 1(셀 번호)의 이펙터/표적 비율로 첨가하였다. 플레이트를 4 내지 6시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 유지하였다. 표적 세포 용해는 LDH-기반 세포독성 검출 키트에 의해 확인되었다. BT-474 세포에 대한 허셉틴 유도 ADCC 효과(Herceptin induced ADCC effect)를 양성 대조군으로 사용하였다. ADCC 테스트 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 PD-L1 형질감염 세포에 ADCC 효과를 약하게 유도할 수 있다.
10. 보체 의존적 세포독성(CDC)
W315-CHO-K1.hPro1.C11 세포 및 다양한 농도의 시험 항체(200 nM, 20 nM 및 2 nM)를 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 인간 보체를 1 : 50의 희석비로 첨가하였다. 플레이트를 2 내지 3시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 유지하였다. 표적 세포 용해는 CellTiter-Glo에 의해 결정되었다. 리툭시맙(Rituximab)으로 유도된 Raji 세포 용해를 양성 대조군으로 사용하였다. ADCC 테스트 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 CDC 효과를 유도하지 않는다.
11. 인간 혈청 내 항체 안정성
건강한 공여자로부터 원심분리에 의해 신선한 인간 혈청을 제조하였다. 테스트 항체를 혈청과 혼합하고 혈청 함량이 총 부피의 >90%인지 확인하였다. 혼합 분취량을 각각 0일, 1일, 4일, 7일 및 14일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상기 나타낸 시점에서 샘플을 액체 질소에서 급속 동결하고 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 상기 시점에서 분취물의 PD-L1에 대한 결합을 각각 유세포 분석에 의해 평가하였다. ADCC 테스트의 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 인간 혈청에서 37℃에서 적어도 14일 동안 안정하다.
12. DSF assay에 의한 열적 안정성
시험 항체의 열적 안정성은 DSF assay로 측정하였다. DSF assay는 7500 Fast Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었다. 간단히 말해서, 19 μL의 항체 용액을 1 μL의 62.5 X SYPRO Orange 용액(Invitrogen)과 혼합하고 96-웰 플레이트(Biosystems)에 첨가하였다. 플레이트를 2℃/분의 속도로 26℃에서 95℃로 가열하고 생성된 형광 데이터를 수집하였다. 상이한 온도에 대한 형광 변화의 음의 도함수를 계산하고, 최대값을 용융 온도 Th로 정의하였다. 단백질에 다중 전개 전이가 있는 경우, 처음 두 개의 Th가 보고되었으며, Th1 및 Th2로 명명되었다. Th1은 항상 다른 단백질 간의 비교를 용이하게 하기 위해 형식적 용융 온도 Tm으로 해석된다. 데이터 수집 및 Th 계산은 운영 소프트웨어에 의해 자동으로 수행되었다. DSF assay에 의한 열적 안정성에 대한 결과는 도 10 및 표 10에 나타내었다.
[표 10]
열 안정성
그 결과 AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 정상적인 DSF 프로파일을 가지고 Th1은 61.2℃임을 나타낸다.
13. 비-특이적 결합 ELISA
비-특이적 결합 ELISA는 96-웰 고결합 플레이트(Nunc-Immuno Plate, Thermo Scientific)에서 수행되었다. 플레이트를 4℃에서 밤새 2 ㎍/mL의 다양한 항원(표 11의 왼쪽 컬럼에 열거됨)으로 코팅하였다. 2% BSA-PBS로 블로킹한 후, 10 ㎍/ml 항체를 플레이트에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 2차 항체 염소 항-인간 IgG Fc-HRP(Bethyl, A80-304P)와 함께 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. TMB 퍼옥시다제 기질을 첨가하여 HRP 신호를 검출하고 2 M HCl을 사용하여 12분 후에 반응을 중단시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Molecular Device)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다. 모든 인큐베이션 단계는 실온에서 수행되었다. 플레이트를 단계 사이에 PBST(0.05% Tween20-PBS)로 세척하였다. 이 테스트에서 AP3R2-1A3-z12-hIgG1은 비-특이적 결합을 나타내지 않았다. 결과는 표 11에 제공된다.
[표 11]
비특이적 결합 ELISA의 결과
당업자는 본 개시내용이 그 정신 또는 중심 속성을 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구현될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 본 개시내용의 전술한 설명은 그의 예시적인 구현예만을 개시한다는 점에서, 다른 변형이 본 개시내용의 범위에 포함되는 것으로 간주하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 개시내용은 본 명세서에서 상세히 기재된 특정 구현예들에 제한되지 않는다. 오히려, 본 개시내용의 범위 및 내용을 나타내는 첨부된 청구범위를 참조해야 한다.
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Claims (33)

  1. 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인 VHH을 포함하는 항 PD-L1 항체, 상기 VHH는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 CDR2는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 및 상기 CDR3은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 항 PD-L1 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 VHH는 다음을 포함하는, 항 PD-L1 항체:
    (A) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열; 또는
    (B) 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항 PD-L1 항체는 PD-1 길항제인, 항 PD-L1 항체.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 항 PD-L1 항체는 단일-도메인 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체로부터 선택되는 것인, 항 PD-L1 항체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 항 PD-L1 항체는 중쇄 단일-도메인 항체인, 항 PD-L1 항체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 VHH는 알파카 또는 라마를 포함하는 낙타과 동물로부터 유래된 것인, 항 PD-L1 항체.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 VHH는 면역글로불린 Fc 도메인, 형광 단백질, 또는 뚜렷한 특이성을 갖는 VHH를 포함하는 다른 분자에 융합된 것인, 항 PD-L1 항체.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 VHH는 IgG의 Fc 도메인에 융합된 것인, 항 PD-L1 항체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 항 PD-L1 항체는 낙타과 동물로부터의 VHH 및 인간 IgG의 Fc 도메인의 키메라 항체인, 항 PD-L1 항체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 항 PD-L1 항체는 낙타과 동물로부터의 VHH, 및 인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc 도메인의 키메라 항체인, 항 PD-L1 항체.
  11. 제 1항에 따른 항 PD-L1 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  12. 제 11항에 있어서, 서열번호 5에 기재된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 단리된 핵산 분자.
  13. 제 11항 또는 제 12항의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  14. 제 11항 또는 제 12항의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  15. 제 13항의 발현 벡터를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  16. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나 이상의 항 PD-L1 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상(subject)에서 PD-L1과 관련된 상태의 치료용 약제학적 조성물:
    상기 PD-L1과 관련된 상태는 암인 것임.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 암은 유방(breast)암, 폐(lung)암, 결장(colon)암, 난소(ovarian)암, 흑색종(melanoma), 방광(bladder)암, 신장(kidney)암, 간(liver)암, 침샘(salivary)암, 위(stomach)암, 신경교종(gliomas), 갑상선(thyroid)암, 흉선(thymic)암, 상피(epithelial)암, 두경부암(head and neck cancers), 위(gastric)암 및 췌장(pancreatic)암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  18. 다음 단계를 포함하는 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 항 PD-L1 항체의 제조 방법:
    - 숙주 세포에서 항 PD-L1 항체를 발현하는 조건 하에 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 항 PD-L1 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    - 숙주 세포로부터 항 PD-L1 항체를 분리시키는 단계.
  19. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 항 PD-L1 항체를 포함하는 용기를 포함하는, PD-L1과 관련된 상태의 치료 또는 진단용 키트:
    상기 PD-L1과 관련된 상태는 암인 것임.



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