KR102856603B1

KR102856603B1 - 스쿠알렌 생산능을 갖는 메틸로투비마이크로븀 속 km1 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102856603B1
Application number: KR1020240151031A
Authority: KR
Inventors: 김민식; 조재환; 김선정; 문명훈; 조영정; 강응수; 이준표; 박권우; 이수연; 민경선; 이지예
Original assignee: 한국에너지기술연구원
Priority date: 2024-10-30
Filing date: 2024-10-30
Publication date: 2025-09-10
Anticipated expiration: 2044-10-30

Abstract

본 발명은 스쿠알렌 생산능을 갖는 메틸로투비마이크로븀 속 KM1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 균주는 해수로부터 새롭게 분리 동정된 것으로, 스쿠알렌 생산능이 우수하고, 미생물을 이용하여 환경 친화적으로 스쿠알렌을 합성할 수 있는 바, 화장품, 식품, 의약품 등의 제조에 널리 활용될 수 있다.

Description

스쿠알렌 생산능을 갖는 메틸로투비마이크로븀 속 KM1 균주 및 이의 용도{Methylotuvimicrobium sp. KM1 strain for producing squalene and uses thereof}

본 발명은 스쿠알렌 생산능을 갖는 메틸로투비마이크로븀 속 KM1 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

메탄자화균은 메탄을 포함한 단일탄소 기질을 유일 탄소원 및 에너지원으로 사용할 수 있는 원핵생물이다. 메탄자화균은 메탄산화효소를 보유하고 있어 메탄을 메탄올로 산화시킬 수 있고 일련의 대사과정을 거쳐 바이오매스로 전환할 수 있는 능력을 가졌다. 메탄산화효소는 수용성 메탄산화효소(soluble methane monooxygenase;sMMO), 미립자메탄산화효소(particulate methane monooxygenase; pMMO)로 분류된다. pMMO는 sMMO와 비교하여 메탄에 대해 더 높은 친화력을 가지고 있어 메탄을 산화시켜 성장하는 세포내에서의 주요 생체 촉매로 생각되며, 상온 상압에서 메탄을 수산화하여 상온 상압에서의 메탄올 전환을 가능하게 한다. 구리가 존재하는 환경에서는 sMMO의 발현이 억제됨과 동시에 pMMO의 발현이 유도되며 pMMO는 막 단백질로서 세포막에 존재하여 메탄을 산화시킨다. 메탄이 산화되어 생성된 메탄올은 각종 화합물과 바이오연료로서의 사용이 가능한 고부가가치 산물이며, 이에 따라 메탄자화균을 이용한 메탄으로부터 고부가가치 물질을 생산하는 연구가 전세계적으로 진행되고 있다.

한편, 스쿠알렌은 건강에 미치는 유익한 효과에 대한 소비자의 인식 제고와 함께 화장품, 식품, 의약품 분야에서 널리 사용되고 있으며 특히, 뛰어난 보습 효과로 인해 화장품은 스쿠알렌이 가장 활발하게 사용되고 있는 분야로 손꼽힌다. 현재, 스쿠알렌은 주로 식물소재(올리브, 아마란스씨 등)와 동물소재(상어간유)에서 추출하고 있으나, 식물소재의 경우, 스쿠알렌의 함량이 낮아 생산성이 낮고, 동물소재의 경우 동물보호 차원에서 규제가 강화되고 있어, 새로운 스쿠알렌의 생산기술을 개발하여는 연구가 활발히 진행되고 있다.

더욱이, 스쿠알렌은 최근 코로나 바이러스 질병 2019(COVID-19) 백신의 보조제로 사용되는 등 그 가치가 크게 증가하고 있다. 따라서, 지속가능하고 환경 친화적인 스쿠알렌의 합성 방법이 개발되어야 한다.

한국등록특허 제1137026호.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 스쿠알렌 생산방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 스쿠알렌 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 스쿠알렌 생산능을 갖는 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주(KCTC15734BP)를 제공한다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 균주는 해수에서 분리된 것일 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 배양은 메탄 및 산소 존재 하에 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 배양된 균주 또는 이의 배양산물로부터 스쿠알렌을 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 배양산물은 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 또는 이들의 분획물일 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 상기 균주 또는 이의 배양산물을 포함하는 스쿠알렌 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명은 스쿠알렌 생산능을 갖는 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 균주는 해수로부터 새롭게 분리 동정된 것으로, 스쿠알렌 생산능이 우수하고, 미생물을 이용하여 환경 친화적으로 스쿠알렌을 합성할 수 있는 바, 화장품, 식품, 의약품 등의 제조에 널리 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1 및 2는 분리한 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주를 관찰한 사진이다.
도 3 및 4는 분리한 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주의 16S rRNA 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 분리한 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주의 계통도이다.
도 6및 7은 분리한 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주의 스쿠알렌 생산능을 확인한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 스쿠알렌 생산능을 갖는 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주(KCTC15734BP)에 관한 것이다.

스쿠알렌을 생산할 수 있는 메탄자화균, 더욱 구체적으로, 메틸로투비마이크로븀 속 균주로서, 해수에서 분리된 것일 수 있다.

본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 배양은 당분야에 공지된 방법 및 조건으로 공지된 수단을 이용하여 수행될 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 메탄자화균의 특성상 주로 메탄을 사용하지만, 이외에도 글루코즈, 자일로즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등을 부가적으로 사용할 수 있는데, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

상기 배양은 메탄 및 산소 존재 하에 수행되는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로 메탄 및 산소가 1:1의 부피비로 존재하는 환경에서 수행될 수 있다.

본 발명은 상기 배양된 균주 또는 이의 배양산물로부터 스쿠알렌을 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 스쿠알렌을 분리하는 단계는 당분야에 공지된 방법 및 조건으로 공지된 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 균주에 화학적 또는 기계적 힘을 가해 세포벽을 파괴하여 분리할 수 있고, 또는 펜탄, 헥산, 사이클로핵산, 톨루엔 등과 같은 유기 용매를 사용하여 스쿠알렌을 분리할 수 있다.

상기 배양산물은 예를 들어, 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 또는 이들의 분획물일 수 있다.

본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양산물을 포함하는 스쿠알렌 생산용 조성물에 관한 것이다.

상기 균주 및 배양산물에 관하여는 전술한 바와 같다.

상기 조성물은 스쿠알렌 생산하는 데 사용될 수 있는 추가 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 균주가 스쿠알렌을 생산하는 반응에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 완충액 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

1. 균주의 분리 및 선별

신규 해양 메탄자화균을 분리하기 위해 국내 서해 부근 지역인 소근리에서 해수를 채취한 후 serum bottle에 넣고 head space 를 50% CH₄, 50% O₂로 치환한 후 30℃에서 진탕 배양을 진행하였다. 배양액을 1/1,000,000로 희석하여 seum bottle에서 재배양하였다. Sigle colony isolation을 위해 해수기반 plate에 streaking 하여 anaerobic jar에 넣고 head space를 산소 및 메탄(50:50, v:v)으로 치환한 후 30℃에서 2주간 배양하였다.

메탄만을 carbon source로 이용하는 메탄자화균을 선정하기 위해 확보된 메탄자화균 library에서 single colony를 선택하여 MJmet과 LB plate에 각각 triplica plating을 수행하였다. MJmet plate들을 anaerobic jar에 넣은 후 head space를 산소 및 메탄(50:50, v:v)으로 치환한 경우와 head space에 메탄을 공급하지 않은 2가지 조건으로 나누었다. LB plate는 치환 없이 30 ℃ 또는 35 ℃에서 배양하였다. 6일 동안 배양 후, LB plate에서는 자라지 못하고 메탄으로 치환된 jar안의 MJmet plate에서 자란 colony를 선정하였다. 위와 같은 serum bottle 배양 및 anaerobic jar에서의 plating을 단일 종으로 분리될 때까지 반복하였다.

이와 같은 방법으로 I-1-8-1-15-4 균주를 분리하였고, 현미경 상으로 단일 균주로 관찰되었다(도 1 및 2). 이 균주를 동정하기 위해 배양액 1 mL을 8000 rpm으로 10분 동안 원심분리 한 후 세포 펠렛을 이용하여 16S rRNA sequencing 분석을 수행하였다.

2. 선별된 균주의 16S rRNA sequence 분석

선별된 I-1-8-1-15-4 균주를 동정하기 위해 배양액 1 mL을 10000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 cell pellet을 마크로젠(Seoul, Republic of Korea)에 의뢰하여 16S rRNA sequencing 분석을 수행하였다. I-1-8-1-15-4 균주의 16S rRNA 서열(도 3 및 4)을 바탕으로 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool, https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통해 상동성 검사를 수행하였다. 상기 I-1-8-1-15-4 균주는 Methylotuvimicrobium 속(genus)에 속하는 Methylotuvimicrobium alcaliphilum 균주와 98.61% 상동성을 나타내었다. 따라서 상기 I-1-8-1-15-4 균주를 Methylotuvimicrobium sp. KM1으로 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2023년 12월 11일에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC15734BP를 부여받았다. 또한 Methylotuvimicrobium sp. KM1 균주의 계통도를 작성하여 도 5에 나타내었다.

3. 선별된 균주의 스쿠알렌 생산 확인

Methylotuvimicrobium sp. KM1 균주의 스쿠알렌 생산을 확인하기 위해 미생물 건조 중량 0.0028 g에 해당하는 cell에 1 ml의 chloroform 및 methanol(1:2, v/v) 용액을 분주하여 넣고 vortex mixer machine에서 상온 1시간 vortexing을 수행하였다. 원심분리(3000 g, 10 min)하고 상등액을 필터(Polytetrafluroethylene Hydrophobic, 0.2 μm)를 이용하여 여과 후 갈색병에 보관하고 이후 크로마토그래피 불꽃이온화 (GC-FID) 검출기를 이용하여 분석되었다.

GC-FID 분석은 HP-5 컬럼(30 m, 0.32 mm, 0.25 μm, Agilent)을 갖춘 가스크로마토그래피 불꽃이온화 검출기(Agilent 7890B, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 splitless로 1 μL의 샘플이 주입되어 분석되었다. 초기 오븐 온도는 185 ℃에서 3분 동안 지속되었으며, 다음으로 가열 속도 20 ℃/min으로 200 ℃까지 7.25분 동안, 가열속도 20 ℃/min으로 260℃까지 20분 동안 지속되었다. 이동상 기체는 He 30mL/min의 속도로 사용되었다.

Sigma에서 구입한 스쿠알렌 시약과 KM1 균주에서 추출한 sample을 섞어서 GC 분석을 진행하였을 때 peak 분리되지 않고 하나의 peak로 나타나는 것을 알 수 있었다(도 6).

따라서, Methylotuvimicrobium sp. KM1 균주는 메탄가스로부터 스쿠알렌을 생산하기 위한 whole cell biocatalyst로 이용할 수 있다.

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)

KCTC15734BP

20231211

서열목록 전자파일 첨부

Claims

스쿠알렌 생산능을 갖는, 수탁번호 KCTC15734BP인 메틸로투비마이크로븀 속(Methylotuvimicrobium sp.) KM1 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 해수에서 분리된 것인, 메틸로투비마이크로븀 속 KM1 균주.
청구항 1의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌을 생산하는 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 배양은 메탄 및 산소 존재 하에 수행되는 것인, 스쿠알렌을 생산하는 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 배양된 균주 또는 이의 배양산물로부터 스쿠알렌을 분리하는 단계를 더 포함하는, 스쿠알렌을 생산하는 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 배양산물은 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 또는 이들의 분획물인, 스쿠알렌을 생산하는 방법.
청구항 1 의 균주 또는 이의 배양산물을 포함하는 스쿠알렌 생산용 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 배양산물은 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 또는 이들의 분획물인, 스쿠알렌 생산용 조성물.