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KR102829810B1 - 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR102829810B1
KR102829810B1 KR1020220125437A KR20220125437A KR102829810B1 KR 102829810 B1 KR102829810 B1 KR 102829810B1 KR 1020220125437 A KR1020220125437 A KR 1020220125437A KR 20220125437 A KR20220125437 A KR 20220125437A KR 102829810 B1 KR102829810 B1 KR 102829810B1
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cell
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박현우
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 세포의 부착 비의존성을 변환하는 인자를 포함하는 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물, 상기 조성물을 이용한 세포의 부착 배양 효율 증진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물은 목적 세포의 부착 비의존성을 인위적으로 변경할 수 있을 뿐만 아니라 필요에 따라 변경된 표현형을 되돌릴 수 있어 배양 목적 및 환경에 맞게 재조합 단백질 생산용 숙주세포, 치료용 면역세포 및 줄기세포 등 다양한 세포의 배양 효율을 극대화할 수 있으며, 이를 이용하여 배양 효율이 증진된 세포주를 확립할 수 있다.

Description

세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물 및 이의 용도{Composition for enhancing efficiency of cell adhesion culture and uses thereof}
본 발명은 세포의 부착 비의존성(anchorage-independence)을 변환하는 인자를 포함하는 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물, 상기 조성물을 이용한 세포의 부착 배양 효율 증진 방법에 관한 것이다.
1982년 대장균(Esherichia coli)를 이용하여 생산한 재조합 인슐린이 FDA 승인을 받으면서 재조합 단백질 의약품의 시대가 열렸다. 초기 재조합 단백질 의약품은 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 E. coli를 통해 생산된 제품이 대부분이었다. 단백질 의약품은 본연의 기능을 수행할 수 있도록 활성화된 형태로 제조되어야 하므로 단백질의 당수식화(glycosylation)에 따른 적절한 단백질 폴딩(folding)이 요구되지만 원핵생물인 E. coli에서는 이러한 과정이 진행될 수 없었다. 따라서, 세균과 같은 원핵생물 대신 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 비롯한 여러 설치류 혹은 인간 유래 세포들을 숙주 세포로 사용함으로써 이러한 문제점을 극복하고자 하였고, 부착성 세포를 배양할 때 발생하는 공간적 한계를 극복하기 위해 부유 상태로 배양(suspension culture)할 수 있도록 공학적으로 가공하는 기술이 개발되고 있다. 그러나, 동물세포를 재조합 단백질 생산용 숙주 세포로 사용하기 위해서는 당수식화 오류 및 아노이키스(Anoikis)에 따른 단백질 생산성 악화 문제를 개선하기 위한 추가 공정이 요구되었고, 이로 인해 단백질 생산 공정의 시간과 비용이 현저히 증가하였다. 또한, 목적 단백질의 재조합적 생산을 위해 부유 세포를 사용하는 것은 부착 세포를 사용하는 경우에 비해 까다로운 공정이 요구되며, 이미 부유 상태로 가공된 세포주는 다시 부착 세포로 전환될 수 없기 때문에 단백질 의약의 재조합적 생산 공정 전반의 비효율성을 초래하게 된다. 따라서, 부착 세포를 원래 표현형과 달리 부유 상태로 인위적으로 전환시키고, 이를 다시 원하는 시점에 가역적으로 부착 상태로 복귀시키는 것이 가능하다면 세포 배양의 효율성이 혁신적으로 개선될 것으로 기대되고 있다.
본 발명은 세포의 부착 비의존성을 인위적으로 변경할 수 있는 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용한 세포의 부착 배양 효율 증진 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 TEAD2 및 YAP 유전자의 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 세포의 부착 배양(adhesion culture) 효율 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 “뉴클레오티드(nucleotide)”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가진다. 핵산 분자의 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 뉴클레오티드에서의 변이는 단백질에 변화를 가져오지 않는 것도 있는데, 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈(codon), 코돈의 축퇴성에 의해 동일한 아미노산을 암호화(coding)하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 암호화하는 코돈을 가지는 핵산분자를 모두 포괄한다.
본 발명에서의 뉴클레오티드는 TEAD2, YAP, TSC22D1, VAX2, SOX13, ARNT2, PPARG, BNC2, HOXD8, GLIS3, FOXD8, RARG, MEIS3, TGFB1l1, TBX3, SOX9, EPAS1, TEAD1 및 SNAl2 유전자의 공지된 서열과 실질적 동일성(substantial identity)을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 여기서 “실질적 동일성”이란 각각의 유전자 서열, 즉 염기서열 또는 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 뉴클레오티드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하여 분석하였을 때 상기 임의의 다른 뉴클레오티드 서열이 각각의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 유전자는 하기 표 1과 같이 각각의 서열번호의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
서열번호 유전자 서열번호 유전자
1 TEAD2 11 FOXD8
2 YAP 12 RARG
3 TSC22D1 13 MEIS3
4 VAX2 14 TGFB1l1
5 SOX13 15 TBX3
6 ARNT2 16 SOX9
7 PPARG 17 EPAS1
8 BNC2 18 TEAD1
9 HOXD8 19 SNAl2
10 GLIS3
본 발명에서 사용된 “부유 배양(suspension culture)”은 배양 대상의 세포를 기질(substrate) 등에 고정시키지 않은 채로 배양액 내에서 부유(floating)하는 상태로 배양하는 것을 의미하며, 이러한 부유 배양 특성을 가지는 세포를 “부유(성) 세포(suspension cell)”라고 한다. 이와 반대로, “부착 배양(adhesion culture)”은 배양 대상의 세포를 기질에 고정시키거나 세포간 결합한 상태로 배양하는 것을 의미하며, 이러한 부착 배양 특성을 가지는 세포를 “부착(성) 세포(adhesion cell)”라고 한다. 상기 부착 세포는 부착 의존성을 가지기 때문에 부유 배양 시 세포 응집을 일으키며, 이러한 응집에 포함되지 못하고 홀로 부유하는 세포는 세포사(apoptosis)가 유발되어 사멸하게 되므로 세포는 그 부착 특성에 맞는 환경이 조성되어야 한다.
본 발명에서 사용된 “세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물”은 세포를 부착 상태로 배양할 경우 세포의 생존성, 분화, 성장, 증식, 기타 생물학적 기능이 정상적이거나, 보다 향상되거나, 혹은 적어도 감소하지 않도록 하는 조성물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 처리하는 목적 세포로는 부유 세포, 부착 세포 또는 부착 의존성이 불분명한 세포가 모두 포함된다. 이 중 부유 세포를 대상으로 본 발명의 조성물을 사용하는 경우에는 부착 비의존성을 가지는 세포를 부착하는 특성으로 변환 또는 유도할 수 있으며, 본 발명에서는 이를 부유-부착 전이(suspension- adherent transition, SAT)라 한다.
본 발명에 따른 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물은 세포의 부착 비의존성을 변환하는 인자(이하 'SAT 인자'라 함)로서 TEAD2 및 YAP 유전자의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 TEAD2 및 YAP 유전자의 뉴클레오티드는 유전자 전달체 삽입되어 세포내 도입됨으로써 목적 세포 (또는 숙주세포)에서 각 유전자를 발현하여 부유 세포에서 부착 세포로 세포의 부착 비의존성을 변환할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 TSC22D1, VAX2, SOX13, ARNT2, PPARG, BNC2, HOXD8, GLIS3, FOXD8, RARG, MEIS3, TGFB1l1, TBX3, SOX9, EPAS1, TEAD1 및 SNAl2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.
또한 상기 뉴클레오티드는 세포내에서 SAT 인자의 발현을 조절할 수 있도록 조절자(regulator)와 함께 도입될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 IKZF1, KLF1, IRF8, BTG2, SPIB, GATA1, IKZF3, TAL1, EAF2, POU2F2, KLF2, SPI1, NFE2, AKNA, IRF5, TCF7, RHOXF2, MYB, BCL11A 및 GFI1B로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 발현 억제제에 포함된 유전자는 하기 표 2와 같이 각각의 서열번호의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
서열번호 유전자 서열번호 유전자
20 IKZF1 30 KLF2
21 KLF1 31 SPI1
22 IRF8 32 NFE2
23 BTG2 33 AKNA
24 SPIB 34 IRF5
25 GATA1 35 TCF7
26 IKZF3 36 RHOXF2
27 TAL1 37 MYB
28 EAF2 38 BCL11A
29 POU2F2 39 GFI1B
본 발명자들은 부착성 세포에서 배타적으로 발현되는 유전자뿐 아니라, 부유성 세포에서 배타적으로 발현되는 유전자를 발굴하고, 이들의 발현 억제를 통해 목적 세포의 부착 특성이 보다 강화될 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“발현 억제제”는 타겟 유전자의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 타겟 유전자의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 타겟 유전자의 생물학적 기능이 유의하게 저하될 수 있을 정도로 활성 또는 발현을 저하시키는 물질을 의미한다.
타겟 유전자의 억제제는 예를 들어 당업계에 이미 그 서열이 공지된 상기 유전자의 발현을 유전자 수준에서 억제하는 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 타겟유전자를 인식하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템과, 단백질 수준에서 억제하는 항체 또는 앱타머 뿐 아니라, 이들의 활성을 억제하는 화합물, 펩타이드 및 천연물을 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 모든 유전자 및 단백질 수준의 억제수단이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어“shRNA(small hairpin RNA)”는 in vivo 상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드로서, RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열을 의미한다. 통상적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성하며, 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 타겟 유전자의 발현억제가 유전되도록 한다.
본 명세서에서 용어“siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이고, 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다.
본 명세서에서 용어 “miRNA(microRNA)”는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드로서 짧은 스템-루프 구조를 가지면서 타겟 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제하는 단일 가닥 RNA분자를 의미한다.
본 명세서에서 용어“리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 mRNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.
본 명세서에서 용어“PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지면서 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성되며, 상보적인 염기서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization)를 통해 이중가닥을 형성하여 타겟 유전자의 발현을 조절한다.
본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로서 타겟 mRNA 내의 상보적 서열에 결합하여 이의 단백질로의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 발현 억제제는 상기 유전자들이 코딩하는 단백질의 활성을 저해하는 특이적 항체일 수 있다. 목적 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol.,222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manualof Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명은 항체 대신 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용하여 이의 활성을 억제할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cellcycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA.95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 Tet 억제 단백질(Tet repressor protein) 유전자의 뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Tet 억제 단백질 유전자는 서열번호 40의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
상기 Tet 억제 단백질 유전자의 뉴클레오티드는 유전자 전달체에 삽입되어 세포내 추가로 도입됨으로써 SAT 인자의 발현이 차단된 상태로 목적 세포 (또는 숙주세포) 내에 존재하다가 테트라사이클린(tetracycline) 또는 이의 유도체 존재 하에서만 선택적으로 발현될 수 있다. 따라서 SAT 인자 및 Tet 억제 단백질 관련 뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 뉴클레오티드의 도입 후 부유성 세포와 부착성 세포 간의 표현형을 원하는 시점에 독시사이클린 처리를 통해 가역적으로 신속하게 전환할 수 있다.
본 발명에서 사용된 “유전자 전달체(vector)”는 원하는 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 전달 유전자 발현으로 인한 표현형 변화 이외의 부차적인 표현형 변화 및 기타 세포의 본래적 기능에 영향을 미치지 않으면서 대량생산에 용이하고 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.
본 발명에서 사용된 “유전자 전달”은 외래 유전자가 세포 내로 운반, 삽입되어 숙주 세포 내에서 발현될 수 있는 상태에 놓이는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, “유전자 전달”은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로도 표현될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재할 수 있다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 여기서 “작동적으로 연결된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 결합된 프로모터(promoter)는, 구체적으로는 동물세포, 보다 구체적으로는 포유동물 세포에서 작동하여 타겟 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈(genome)으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, U6 프로모터 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 유전자 전달체는 통상적인 유전자 전달에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 구체적으로는 플라스미드, 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 (Lashford LS., et al., Adeno-associated viral vectiors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Act. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 (Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 유전자 전달체는 본 발명의 뉴클레오티드 분자를 렌티바이러스에 적용하여 제조된다.
상기 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시될 수 있다.
또한, 상기 유전자 전달체가 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau. etene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau.et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 부착 비의존성을 가지는 DU4475 및 H524 세포주를 대상으로 TEAD2 및 YAP 유전자의 뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 처리함으로써 각각 TEAD2 및 YAP 유전자가 도입되어 세포가 플레이트에 부착된 상태로 존재하는 것을 확인하였다. 상기 뉴클레오티드가 TetR 유전자 전달체에 삽입된 경우에는 뉴클레오티드가 도입된 세포가 부유성을 나타내지만 테트라사이클린 유도체의 일종인 독시사이클린에 의해 YAP 유전자가 발현되어 부착 상태로 전환되는 것을 확인하였다.
한편, 본 발명의 일 양상은 전술한 조성물을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 세포의 부착 배양 효율 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 조성물을 세포에 도입하는 단계 이후, 상기 세포에 테트라사이클린 또는 이의 유도체를 처리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 테트라사이클린 유도체는 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 클로르테트라사이클린(chlortetracycline) 및 독시사이클린(doxycycline)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 언급한 것과 같이 Tet 억제 단백질(TetR)은 세포주 내 SAT 인자, 즉 TEAD2 및 YAP 유전자의 발현을 차단하지만, 테트라사이클린 또는 이의 유도체의 존재 하에서 해당 유전자를 발현할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 세포주는 테트라사이클린 또는 이의 유도체를 이용하여 효율적인 배양을 결정하는 세포의 표현형 (부착/부유)을 간단하고 신속하게 스위치-온/오프할 수 있다.
본 발명의 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물 및 세포의 부착 배양 효율 증진 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명에 따른 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물은 목적 세포의 부착 비의존성을 인위적으로 변경할 수 있을 뿐만 아니라 필요에 따라 변경된 표현형을 되돌릴 수 있어 배양 목적 및 환경에 맞게 재조합 단백질 생산용 숙주세포, 치료용 면역세포 및 줄기세포 등 다양한 세포의 배양 효율을 극대화할 수 있으며, 이를 이용하여 배양 효율이 증진된 세포주를 확립할 수 있다.
도 1은 DU4475 세포주에 TEAD2 및 YAP 유전자의 도입 유무에 따른 플레이트에 부착된 세포와 배지에 부유하는 세포를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 2은 H524 세포주에 TEAD2 및 YAP 유전자의 도입 유무에 따른 플레이트에 부착된 세포와 배지에 부유하는 세포를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 3은 HEK293A 세포주에 20개의 AST인자 도입 유무에 따른 플레이트에 부착된 세포와 배지에 부유하는 세포를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. SAT 인자를 도입한 세포주 제작
부유 세포를 대상으로 세포의 부착 배양 효율을 증진시키기 위해, 부유 배양 특성을 가진 DU4475 또는 H524 세포주에 SAT 인자로서 TEAD2 및 YAP를 도입한 부유 세포주를 제작하였다.
DU4475 및 H524 세포주는 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, 15140122) 및 10% FBS (Hyclone, SV30207.02)를 포함하는 DMEM (Hyclone, SH30022) 배지에서 배양하였다.
SAT 인자를 발현하는 벡터를 제작하기 위해서는 SAT 인자인 TEAD2(서열번호 1) 및 YAP(서열번호 2) 유전자를 V5로 태깅하고 Gateway 삽입 벡터인 pENTR4 벡터 (Addgene)에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 pENTR4 벡터를 LR 재조합 효소 (Invitrogen, 1179019)를 이용하여 목적 벡터인 pLenti CMV/TO Puro DEST (670-1) 벡터 (Addgene #17293)와 재조합함으로써 SAT 발현용 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. 모든 컨스트럭트(construct)는 시퀀싱을 통해 구조를 검증하였다.
DU4475 또는 H524 세포주를 Polyplus 시약 (Merck)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 pMD2G (Addgene #12259) 및 psPAX2 (Addgene #12260)를 코딩하는 플라스미드와 각 SAT 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 뒤에 바이러스 입자를 함유한 배지를 수집하고 0.45 μm 필터로 여과하였다. 8 μg/ml 폴리브렌(polybrene)을 첨가하고 SAT 발현용 바이러스 입자를 함유한 배지를 이용하여 DU4475 또는 H524 세포주를 24시간 감염시킨 후, 형질감염된 세포를 신선한 배지에서 24시간 동안 배양하고 퓨로마이신(puromycin) (1 μg/ml) 및 블라스티시딘(blasticidin) (10 μg/ml)으로 선별하였다. 선별된 세포를 1x105/well으로 6웰 플레이트(6 well plate)에 분주하고 SAT 발현용 바이러스 입자를 함유하는 배지를 첨가하였다. 감염 2일 후, 형질감염된 세포를 트립신화하고 새로운 플레이트에 다시 분주한 다음 퓨로마이신 (4 mg/ml)을 처리하여 선별하였다. 플레이트에 부착된 세포 (plate)와 배지에 부유하는 세포 (media)를 구분하여 광학현미경으로 관찰하였고 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내 었다.
도 1 및 도 2를 보면, 부유 배양 특성을 가진 DU4475 또는 H524 세포주이므로, SAT 인자인 TEAD2 및 YAP를 도입하지 않은 세포주는 배지에서 확인되었다. 반면, SAT 인자인 YAP를 도입한 세포주는 플레이트에서 확인되었다. 이것으로 배지에 존재하는 부유 세포에서 부착 세포로 변화한 것을 알 수 있다.
실시예 2. 추가 SAT 인자를 도입한 세포주 제작
TEAD2 및 YAP에 추가 SAT 인자인 TSC22D1(서열번호 3), VAX2(서열번호 4), SOX13(서열번호 5), ARNT2(서열번호 6), PPARG(서열번호 7), BNC2(서열번호 8), HOXD8(서열번호 9), GLIS3(서열번호 10), FOXD8(서열번호 11), RARG(서열번호 12), MEIS3(서열번호 13), TGFB1l1(서열번호 14), TBX3(서열번호 15), SOX9(서열번호 16), EPAS1(서열번호 17), TEAD1(서열번호 18) 및 SNAl2(서열번호 19)로부터 선택되는 하나 이상를 더 포함하는 것을 도입한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 실험하였다.
그 결과 도 1 및 도 2와 같은 양상으로 TEAD2, YAP 및 추가 SAT 인자를 도입하지 않은 세포주는 배지에서 확인되었다. 반면, TEAD2, YAP 및 추가 SAT 인자를 도입한 세포주는 플레이트에서 확인되었다. 이것으로 배지에 존재하는 부유 세포에서 부착 세포로 변화한 것을 알 수 있다.
실시예 3. AST 인자를 도입한 세포주 제작
부착 배양 특성을 가진 HEK293A 세포주에 AST 인자로서 IKZF1(서열번호 20), KLF1(서열번호 21), IRF8(서열번호 22), BTG2(서열번호 23), SPIB(서열번호 24), GATA1(서열번호 25), IKZF3(서열번호 26), TAL1(서열번호 27), EAF2(서열번호 28), POU2F2(서열번호 29), KLF2(서열번호 30), SPI1(서열번호 31), NFE2(서열번호 32), AKNA(서열번호 33), IRF5(서열번호 34), TCF7(서열번호 35), RHOXF2(서열번호 36), MYB(서열번호 37), BCL11A(서열번호 38) 및 GFI1B(서열번호 39)를 도입한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 실험하였다.
도 3을 보면, 부착 배양 특성을 가진 HEK293A에 20개의 AST 인자를 도입하지 않은 세포주는 플레이트에서 확인되었다. 반면, 상기 AST 인자를 도입한 세포주는 배지에서 확인되었다. 이것으로 플레이트에 존재하는 부착 세포에서 부유세포로 변화한 것을 알 수 있고, 상기 AST인자를 억제하면 부유세포로 변화하는 것을 막을 수 있는 것을 알 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. TEAD2 및 YAP 유전자의 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 부유 세포의 부착 배양(adhesion culture) 효율 증진용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 TSC22D1, VAX2, SOX13, ARNT2, PPARG, BNC2, HOXD8, GLIS3, FOXD8, RARG, MEIS3, TGFB1l1, TBX3, SOX9, EPAS1, TEAD1 및 SNAl2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 뉴클레오타이드를 더 포함하는 부유 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 IKZF1, KLF1, IRF8, BTG2, SPIB, GATA1, IKZF3, TAL1, EAF2, POU2F2, KLF2, SPI1, NFE2, AKNA, IRF5, TCF7, RHOXF2, MYB, BCL11A 및 GFI1B로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 억제제를 더 포함하는 것인 부유 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드는 Tet 억제 단백질(Tet repressor protein)을 발현하는 유전자 전달체에 삽입된 것인 부유 세포의 부착 배양 효율 증진용 조성물.

  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 조성물을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 부유 세포의 부착 배양 효율 증진 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 조성물을 세포에 도입하는 단계 이후,
    상기 세포에 테트라사이클린 또는 이의 유도체를 처리하는 단계를 더 포함하는 부유 세포의 부착 배양 효율 증진 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 테트라사이클린 유도체는 옥시테트라사이클린, 클로르테트라사이클린 및 독시사이클린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 부유 세포의 부착 배양 효율 증진 방법.
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