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KR102810478B1 - 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 - Google Patents

정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 Download PDF

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KR102810478B1
KR102810478B1 KR1020220091710A KR20220091710A KR102810478B1 KR 102810478 B1 KR102810478 B1 KR 102810478B1 KR 1020220091710 A KR1020220091710 A KR 1020220091710A KR 20220091710 A KR20220091710 A KR 20220091710A KR 102810478 B1 KR102810478 B1 KR 102810478B1
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polyhydroxyalkanoate
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decolorization
pha
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김정민
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Abstract

본 발명의 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법은 2종의 산화제를 순차적으로 사용하는 탈색 단계를 거쳐 최종 제품의 b* 값을 종래보다 낮출 수 있다. 또한 본 발명에서는 1차 산화제로 사용하는 아염소산나트륨(NaClO2)을 사용하여 색도 개선 효과가 크면서도 분자량 저하가 거의 발생하지 않는다.

Description

정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법{PREPARATION METHOD OF PURIFIED POLYHYDROXYALKANOATE}
본 발명은 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이며, 구체적으로 산화제를 이용한 탈색 공정을 거쳐 우수한 색도의 정제된 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA)는 수많은 미생물에 의해 생성되고, 세포내 저장 물질로 사용되는 여러 종류의 하이드록시 카르복실산으로 구성되는 생분해성 고분자이다. 폴리하이드록시알카노에이트는 기존의 석유로부터 유래된 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(polybutylene adipate terephthalate, PBAT), 폴리부틸렌 숙시네이트(polybutylene succinate, PBS), 폴리부틸렌 숙시네이트 테레프탈레이트(polybutylene succinate terephthalate, PBST), 폴리부틸렌 숙시네이트 아디페이트(polybutylene succinate adipate, PBSA)등과 같은 합성 고분자와 유사한 물성을 가지면서, 완전한 생분해성을 보이며, 생체적합성 또한 우수하다.
구체적으로, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 미생물 세포 내에 축적되는 열가소성의 천연 폴리에스테르 고분자로서, 생분해성 소재로 퇴비화가 가능하고, 유독성 폐기물 발생도 없으면서 최종적으로 이산화탄소, 물, 유기 폐기물로 분해될 수 있다. 특히, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 토양 및 해양 등 어떠한 환경 조건에서도 생분해되어 환경 친화적인 특성을 갖는다.
대한민국 공개특허공보 제 2001-0009719 호
폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 미생물로부터 얻은 발효액에서 셀 파쇄 및 분리를 거쳐 조 생성물을 수득한 이후, 탈색 등의 정제 공정을 통해 불순물을 제거함으로써 최종 PHA의 색도를 낮추는 것이 필요하다. 그러나 유연성과 점착성(tackiness)을 가지는 PHA의 경우, PHA 입자에 부착된 불순물이 제거되지 않고, 정제 과정에서 PHA 입도가 낮은 수준에 머무름에 따라 이후 반복적 고액 분리 및 세척이 어려워 최종 PHA 내의 불순물 함량이 여전히 높은 문제가 있었다. 이와 같이 기존의 PHA 정제 방법으로는 일부 PHA 내 불순물 함량을 효과적으로 낮출 수 없어서, 최종 정제된 PHA의 b* 값이 15 이상까지 높아지는 등 제품화에 어려움이 있었으며, 이러한 문제는 일부 결정성이 낮거나 없는 PHA의 경우에 더욱 심각하였다.
이에 본 발명자들이 연구한 결과, 폴리하이드록시알카노에이트의 정제 과정에서 2종의 산화제를 순차적으로 사용하는 탈색을 수행하여 기존 정제 방법의 문제점을 해소함으로써 최종 제품의 색도를 개선할 수 있음을 발견하였다.
따라서 본 발명의 과제는 산화제를 이용한 탈색 단계를 포함하여 우수한 색도의 정제된 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 조 생성물을 준비하는 단계; 상기 조 생성물을 1차 탈색하여 제 1 생성물을 얻는 단계; 및 상기 제 1 생성물을 2차 탈색하여 제 2 생성물을 얻는 단계를 포함하고, 상기 1차 탈색은 아염소산나트륨(NaClO2)을 포함하는 1차 산화제에 의해 수행되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법이 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 2차 탈색은 과산화수소(H2O2)를 포함하는 2차 산화제에 의해 수행될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 상기 1차 탈색은 pH 2 내지 7에서 수행되고, 상기 2차 탈색은 pH 8 내지 13에서 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 1차 탈색에서, 상기 아염소산나트륨은 상기 조 생성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량%의 양으로 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 2차 탈색에서, 상기 과산화수소는 상기 제 1 생성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량%의 양으로 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 제 1 생성물은 전체 고형분의 중량을 기준으로 한 지방류의 함량이 1 중량% 미만일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 제 2 생성물에 대해 단백질분해효소(protease)에 의해 탈단백하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 탈단백에서, 상기 단백질분해효소는 상기 제 2 생성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 0.1 중량%의 양으로 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 탈단백은 pH 7 내지 11에서 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트를 포함하는 조 생성물은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 발효액을 고액 분리하여 바이오매스를 얻는 단계; 상기 바이오매스에 계면활성제를 포함하는 첨가제를 혼합하여 현탁액을 얻는 단계; 상기 현탁액 내의 상기 바이오매스를 파쇄하여 슬러리를 얻는 단계; 및 상기 슬러리를 고액 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 준비될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방법에 의해 제조되고, CIELAB 색좌표의 b* 값이 15 미만인, 폴리하이드록시알카노에이트가 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 결정화 온도(Tc)는 측정되지 않거나 또는 60℃ 내지 120℃로 측정될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트를 구성하는 반복단위는 2-하이드록시부티레이트(2-HB), 3-하이드록시부티레이트(3-HB), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP), 3-하이드록시발레레이트(3-HV), 3-하이드록시헥사노에이트(3-HH), 3-하이드록시헵타노에이트(3-HHep), 3-하이드록시옥타노에이트(3-HO), 3-하이드록시노나노에이트(3-HN), 3-하이드록시데카노에이트(3-HD), 3-하이드록시도데카노에이트(3-HDd), 4-하이드록시부티레이트(4-HB), 4-하이드록시발레레이트(4-HV), 5-하이드록시발레레이트(5-HV) 및 6-하이드록시헥사노에이트(6-HH)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 2종의 산화제를 순차적으로 사용하는 탈색 단계를 거쳐 최종 제품의 b* 값을 15 미만으로 낮춤으로써, 기존의 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 수계 정제 과정에서 발생하였던 색도 증가 문제를 해결할 수 있다. 또한 이와 같이 기존의 색도 문제를 해결할 수 있는 2종의 산화제의 순차적 사용에 의해 효소의 사용량을 줄임으로써 생산비용을 저감할 수 있어 경제적이다.
특히 본 발명에서 1차 산화제로 사용하는 아염소산나트륨(NaClO2)은 색도 개선 효과가 크면서, 다른 염소계 산화제(NaClO 등)와 달리 분자량 저하를 통한 고분자 물성의 변화를 거의 발생시키지 않는다. 따라서 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 정제된 폴리하이드록시알카노에이트는 종래보다 색도 및 순도가 개선되면서 분자량 유지 효과도 우수하다.
특히 이와 같은 본 발명의 효과는 비결정성 PHA의 정제 과정에서 보다 현저히 발휘될 수 있으며 그 외 결정성 및 반결정성 PHA의 정제 과정에도 본 발명의 방법을 적용함으로써 색도 및 순도 개선과 분자량 유지 효과가 발휘될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 2은 폴리하이드록시알카노에이트 조 생성물의 제조방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
이하 본 발명에 대해 다양한 구현예를 들어 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 각 구성요소를 지칭하는 용어는 다른 구성요소들과 구별하기 위해 사용되는 것이며, 본 발명을 한정하려는 의도로 사용되는 것은 아니다. 또한 본 명세서에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서에서 "포함"한다는 기재는 특정 특성, 영역, 단계, 공정, 요소 및/또는 성분을 구체화하기 위한 것이며, 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 그 외 다른 특성, 영역, 단계, 공정, 요소 및/또는 성분의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
본 명세서에서 제 1, 제 2 등의 용어는 다양한 구성 요소를 설명하기 위해 사용되는 것이고, 상기 구성 요소들은 상기 용어에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로 구별하는 목적으로 사용된다.
본 명세서에서 분자량 또는 중량평균분자량은 통상적으로 단위를 기재하지 않지만 g/mol 또는 Da의 단위를 갖는 것으로 이해해도 무방하다.
정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법
일 구현예에 따른 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 조 생성물을 준비하는 단계; 상기 조 생성물을 1차 탈색하여 제 1 생성물을 얻는 단계; 및 상기 제 1 생성물을 2차 탈색하여 제 2 생성물을 얻는 단계를 포함하고, 상기 1차 탈색은 아염소산나트륨(NaClO2)를 포함하는 1차 산화제에 의해 수행된다.
상기 방법은 상기 제 2 생성물에 대해 단백질분해효소(protease)에 의해 탈단백하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 1을 참조하여, 일례에 따르면 폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물(crude product)을 준비하고(S100), 상기 조 생성물에 산을 투입하여 약 pH 3~5로 조정하고 아염소산나트륨(NaClO2)을 투입하여 약 50~70℃에서 1차 탈색을 진행한 뒤(S210), 생성물에 알칼리 성분을 투입하여 약 pH 8~10으로 조정하고 과산화수소(H2O2)를 투입하여 약 50~70℃에서 2차 탈색을 진행한다(S220). 탈색된 생성물에 대해서는 알칼리 성분을 투입하여 약 pH 8~9.5로 조정하고 단백질분해효소에 의해 탈단백을 수행한다(S310). 탈단백 이후 PHA 고형분을 회수한 후(410), 수세척 및 탈수를 수행하여(S430) 최종 정제된 폴리하이드록시알카노에이트를 얻는다(S500).
한편 본 발명에서 출발물질로 사용되는 폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물은 발효액으로부터 여과, 파쇄, 정제 등의 공정을 거쳐 준비될 수 있다.
도 2는 폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물을 준비하는 방법의 일례를 나타낸 것이다.
도 2를 참조하여, 일례에 따르면 폴리하이드록시알카노에이트의 발효액을 준비하고(S10), 원심 분리 등에 의해 균체를 분리하고(S20), 계면활성제 등을 투입한 뒤(S30), 고압 균질기(homogenizer) 등에 의해 균체를 파쇄하고(S40), 원심 분리 등에 의해 고액 분리를 수행하여(S50), 폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물을 얻는다(S100).
이하 본 발명에 따른 방법의 각 단계별로 구체적으로 설명한다.
폴리하이드록시알카노에이트
폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 그 분자 구조에 따라 결정성(crystalline), 반결정성(semicrystalline), 또는 비결정성(amorphous) 폴리하이드록시알카노에이트로 구분될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 비결정성 폴리하이드록시알카노에이트를 포함할 수 있다. 비결정성 폴리하이드록시알카노에이트의 경우 특유의 유연성과 점착성(tackiness)으로 인해 수계 정제 과정에서 반복적 고액 분리 및 세척이 어려워 최종 정제된 PHA 내에서도 불순물 함량이 높아 제품화에 어려움이 있다. 그러나 본 발명의 방법에 따르면 비결정성 PHA의 정제 과정에서 2종의 산화제를 순차적으로 사용하는 탈색을 수행함으로써 최종 제품의 색도를 현저히 개선할 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 반결정성 폴리하이드록시알카노에이트를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 결정성 폴리하이드록시알카노에이트를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 비결정성 폴리하이드록시알카노에이트, 반결정성 폴리하이드록시알카노에이트 및 결정성 폴리하이드록시알카노에이트 중에서 2종 이상을 포함할 수 있다.
상기 폴리하이드록시알카노에이트는 2-하이드록시부티레이트(2-HB), 3-하이드록시부티레이트(3-HB), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP), 3-하이드록시발레레이트(3-HV), 3-하이드록시헥사노에이트(3-HH), 3-하이드록시헵타노에이트(3-HHep), 3-하이드록시옥타노에이트(3-HO), 3-하이드록시노나노에이트(3-HN), 3-하이드록시데카노에이트(3-HD), 3-하이드록시도데카노에이트(3-HDd), 4-하이드록시부티레이트(4-HB), 4-하이드록시발레레이트(4-HV), 5-하이드록시발레레이트(5-HV) 및 6-하이드록시헥사노에이트(6-HH)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 반복단위를 포함할 수 있다.
또한, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 이성질체를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 구조 이성질체, 거울상 이성질체 또는 기하 이성질체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 구조 이성질체를 포함할 수 있다.
상기 폴리하이드록시알카노에이트는 단일 중합체 또는 공중합체일 수 있다. 일 구현예에 따르면 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 공중합체를 포함할 수 있고, 구체적으로 중합체 사슬에 상이한 반복단위들이 불규칙하게(randomly) 분포되어 있는 2개 이상의 상이한 반복단위들을 함유하는 공중합체를 포함할 수 있다.
일례로서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 4-하이드록시부티레이트(4-HB) 반복단위를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 폴리하이드록시알카노에이트 내의 4-HB 반복단위의 함량은 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 이상, 1 중량% 이상, 5 중량% 이상, 10 중량% 이상, 20 중량% 이상, 30 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상, 또는 60 중량% 이상일 수 있고, 또한 100 중량% 이하, 99 중량% 이하, 90 중량% 이하, 80 중량% 이하, 70 중량% 이하, 또는 60 중량% 이하일 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 4-하이드록시부티레이트(4-HB) 반복단위를 25 중량% 이상 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 4-HB 반복단위를 포함하는 공중합체일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트에 4-HB와 함께 공중합될 수 있는 반복단위의 예로는 젖산, 글리콜산, 2-하이드록시부티레이트(2-HB), 3-하이드록시부티레이트(3-HB), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP), 3-하이드록시발레레이트(3-HV), 3-하이드록시헥사노에이트(3-HH), 3-하이드록시헵타노에이트(3-HHep), 3-하이드록시옥타노에이트(3-HO), 3-하이드록시노나노에이트(3-HN), 3-하이드록시데카노에이트(3-HD), 3-하이드록시도데카노에이트(3-HDd), 4-하이드록시발레레이트(4-HV), 5-하이드록시발레레이트(5-HV) 및 6-하이드록시헥사노에이트(6-HH)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 4-HB 반복단위 외에 3-HB, 3-HP, 3-HH, 3-HV, 4-HV, 5-HV 및 6-HH로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 반복단위를 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 4-HB 반복단위 및 3-HB 반복단위를 포함하는 공중합체를 포함할 수 있고, 구체적으로 폴리-3-하이드록시부티레이트-co-4-하이드록시부티레이트(P3HB-co-4HB)를 포함할 수 있다.
상기 PHA는 1종 또는 2종 이상의 PHA를 포함할 수 있고, 예를 들어 제 1 PHA, 제 2 PHA, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 제 1 PHA는 비결정성 PHA일 수 있고, 상기 제 2 PHA는 반결정성 PHA일 수 있다. 상기 제 1 PHA는 예를 들어 4-HB 반복단위를 15 중량% 내지 60 중량%, 15 중량% 내지 55 중량%, 20 중량% 내지 55 중량%, 25 중량% 내지 55 중량%, 30 중량% 내지 55 중량%, 35 중량% 내지 55 중량%, 20 중량% 내지 50 중량%, 25 중량% 내지 50 중량%, 30 중량% 내지 50 중량%, 35 중량% 내지 50 중량% 또는 20 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있다. 상기 제 2 PHA는 예를 들어 4-HB 반복단위를 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.5 중량% 내지 30 중량%, 1 중량% 내지 30 중량%, 3 중량% 내지 30 중량%, 1 중량% 내지 28 중량%, 1 중량% 내지 25 중량%, 1 중량% 내지 24 중량%, 1 중량% 내지 20 중량%, 1 중량% 내지 15 중량%, 2 중량% 내지 25 중량%, 3 중량% 내지 25 중량%, 3 중량% 내지 24 중량%, 5 중량% 내지 24 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 초과 내지 20 중량% 미만, 7 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 15 중량% 내지 25 중량% 또는 15 중량% 내지 24 중량%로 포함할 수 있다. 또한 상기 PHA는 제 1 PHA 및 상기 제 2 PHA가 20:80 내지 80:20, 또는 30:70 내지 70:30의 중량비로 혼합된 것일 수도 있다.
폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물
본 단계에서는 폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물을 준비한다.
일반적으로 폴리히드록시알카노에이트는 발효 공정에 의해 생산될 수 있으며, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물도 발효를 거쳐 얻어진 것일 수 있다.
상기 발효를 통한 폴리히드록시알카노에이트의 생산 방법은 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 특정 기질에서 배양된 야생형 또는 트랜스제닉 미생물을 이용한 발효를 통해 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다.
발효 이후 생성된 폴리하이드록시알카노에이트는 미생물의 세포 내부에 축적되므로, 이를 분리 정제하는 과정이 반드시 필요하다.
예를 들어, 발효액으로부터 폴리하이드록시알카노에이트가 함유된 바이오매스를 분리한 뒤, 계면활성제 등을 첨가하고 미생물의 세포를 파쇄하여 폴리하이드록시알카노에이트만을 분리하는 공정을 거칠 수 있다.
일례로서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트를 포함하는 조 생성물은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 발효액을 고액 분리하여 바이오매스를 얻는 단계; 상기 바이오매스에 계면활성제를 포함하는 첨가제를 혼합하여 현탁액을 얻는 단계; 상기 현탁액 내의 상기 바이오매스를 파쇄하여 슬러리를 얻는 단계; 및 상기 슬러리를 고액 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 준비될 수 있다.
먼저 미생물에 의한 발효액을 원심 분리나 막 분리와 같은 기계적 분리 방법 또는 그 외 공지된 방법에 의해 고액 분리하여 폴리하이드록시알카노에이트가 축적된 세포를 포함하는 바이오매스를 분리할 수 있다.
분리된 바이오매스는 용매와 혼합하여 고형분 농도를 조절할 수 있다. 상기 바이오매스는 계면활성제 등과 혼합될 수 있으며, 상기 계면활성제로는 예를 들어 음이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있고, 구체적으로 소듐라우레스설페이트(sodium laureth sulfate), 소듐라우릴설페이트, 도데실소듐설페이트, 도데실소듐벤젠설포네이트 등이 사용될 수 있다. 그 결과 바이오매스, 계면활성제 등을 포함하는 현탁액이 얻어질 수 있다.
이후 상기 현탁액 내의 상기 바이오매스를 파쇄하며, 상기 파쇄는 기계적 파쇄(물리적 파쇄) 또는 화학적 파쇄(비기계적 파쇄)로 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 파쇄는 초음파 파쇄, 고가압 파쇄 또는 밀링(milling) 파쇄로 수행될 수 있다. 상기 초음파 파쇄는 예를 들어 20 Hz 이상의 에너지량으로 10분 내지 60분 동안 수행될 수 있다. 또한 상기 고압 파쇄는 예를 들어 10 bar 이상의 압력으로 1분 내지 60분 동안 수행될 수 있다. 또한 상기 밀링 파쇄는 콜로이드밀, 비드밀, 볼밀 등에 의해 1분 내지 60분 동안 수행될 수 있다.
파쇄 이후 폴리하이드록시알카노에이트의 미립자 및 세포벽 등의 셀 유래 불순물을 포함하는 슬러리를 얻을 수 있으며, 상기 슬러리를 원심 분리나 막 분리와 같은 기계적 분리 방법 또는 그 외 공지된 방법에 의해 고액 분리함으로써 폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물을 얻을 수 있다.
상기 폴리하이드록시알카노에이트의 조 생성물은 미량의 셀 유래 불순물(단백질, 지방류 등)을 포함하여 추가의 정제 과정이 필요하다.
예를 들어 상기 조 생성물 내의 단백질 함량은, 상기 조 생성물 내의 전체 고형분 중량을 기준으로, 3.5 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2.7 중량% 이하, 또는 2.5% 이하일 수 있고, 또한 0.1 중량% 이상, 1 중량% 이상, 또는 1.5 중량% 이상일 수 있다.
또한 상기 조 생성물 내의 지방류 함량은, 상기 조 생성물 내의 전체 고형분 중량을 기준으로, 1.5 중량% 이하, 1.3 중량% 이하, 1 중량% 이하, 또는 0.7 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 또는 0.3 중량% 이상일 수 있다.
또한 상기 조 생성물 내의 고형분 함량은, 상기 조 생성물 총 중량을 기준으로 1 중량% 이상, 3 중량% 이상, 5 중량% 이상, 7 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상일 수 있고, 또한 80 중량% 이하, 50 중량% 이하, 30 중량% 이하, 20 중량% 이하, 또는 15 중량% 이하일 수 있다.
1차 탈색
본 단계에서는 상기 폴리하이드록시알카노에이트를 포함하는 조 생성물을 1차 탈색하여 제 1 생성물을 얻는다.
상기 1차 탈색은 아염소산나트륨(NaClO2)을 포함하는 1차 산화제에 의해 수행된다. 상기 아염소산나트륨을 산화제로 이용하여 탈색을 수행할 경우, 색도 개선 효과가 크면서, 다른 염소계 산화제(NaClO 등)와는 달리 분자량 저하가 거의 발생하지 않는다. 이는 아염소산나트륨과의 반응에 의해 조 생성물 내의 셀 유래 불순물(단백질, 지방류 등)이 분해되면서도 PHA 분해는 거의 일어나지 않기 때문이다.
상기 1차 탈색 시에 상기 아염소산나트륨의 사용량은, 상기 조 생성물(용액) 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 이상, 0.02 중량% 이상, 0.03 중량% 이상, 0.04 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.06 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 0.3 중량% 이상, 0.4 중량% 이상, 또는 0.5 중량% 이상일 수 있고, 또한 1.3 중량% 이하, 1.2 중량% 이하, 1.1 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.9 중량% 이하, 0.8 중량% 이하, 0.7 중량% 이하, 또는 0.6 중량% 이하일 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기 1차 탈색에서, 상기 아염소산나트륨은 상기 조 생성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량%, 또는 0.05 내지 1 중량%의 양으로 사용될 수 있다. 상기 바람직한 아염소산나트륨의 사용량 범위 내에서, 탈색 효과가 충분히 발휘되면서도 분자량 저하가 최소화될 수 있다.
또한 상기 1차 탈색에 사용되는 1차 산화제로서 아염소산나트륨(NaClO2) 외에도 추가적인 산화제를 함께 사용할 수 있으며, 예를 들어 이산화염소(ClO2)를 상기 조 생성물 총 중량을 기준으로 0.05 내지 1 중량%의 양으로 사용할 수 있다.
상기 1차 탈색은 산성 pH 조건에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 1차 탈색 시의 pH 범위는 7 이하, 6.5 이하, 6 이하, 5.5 이하, 5 이하, 4.5 이하 또는 4 이하일 수 있고, 또한 1 이상, 1.5 이상, 2 이상, 2.5 이상, 3 이상 또는 3.5 이상일 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기 1차 탈색은 pH 1 내지 7, 또는 pH 2 내지 7에서 수행될 수 있다. 보다 구체적인 일례로서, 상기 1차 탈색은 pH 3 내지 6, 또는 pH 3 내지 5에서 수행될 수 있다.
이러한 산성 pH로 조정하기 위해 산 성분이 사용될 수 있다. 상기 1차 탈색 시에 pH 조정을 위해 사용되는 산 성분의 예로는 인산, 황산, 염산, 질산 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조 생성물은 이와 같은 산 성분을 적정량 포함하여 목적하는 산성 pH로 조절될 수 있다.
또한 상기 1차 탈색 시의 온도는 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상 또는 60℃ 이상일 수 있고, 또한 90℃ 이하, 80℃ 이하, 75℃ 이하, 70℃ 이하 또는 65℃ 이하일 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기 1차 탈색은 40℃ 내지 90℃, 또는 50℃ 내지 70℃의 온도에서 수행될 수 있다.
또한 상기 1차 탈색에 소요되는 시간은 10분 이상, 30분 이상, 또는 50분 이상일 수 있으며, 또한 3시간 이하, 2시간 이하, 또는 1시간 30분 이하일 수 있고, 구체적인 예로서 30분 내지 1시간 30분일 수 있다.
상기 1차 탈색을 거쳐 얻은 제 1 생성물 내의 불순물 함량은 이전 단계에 비해 감소될 수 있다.
예를 들어 상기 제 1 생성물 내의 단백질 함량은, 상기 제 1 생성물 내의 전체 고형분 중량을 기준으로, 3.5 중량% 이하, 3 중량% 이하, 또는 2.7 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.1 중량% 이상, 1 중량% 이상, 또는 1.5 중량% 이상일 수 있다.
또한 상기 제 1 생성물 내의 지방류 함량은, 상기 제 1 생성물 내의 전체 고형분 중량을 기준으로, 1.5 중량% 이하, 1.3 중량% 이하, 1 중량% 이하, 또는 0.7 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 또는 0.3 중량% 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 제 1 생성물은 전체 고형분의 중량을 기준으로 한 지방류의 함량이 1 중량% 미만으로, 이전 단계에 비해 현저히 감소될 수 있다.
또한 상기 제 1 생성물 내의 고형분 함량은, 상기 제 1 생성물 총 중량을 기준으로 1 중량% 이상, 3 중량% 이상, 5 중량% 이상, 7 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상일 수 있고, 또한 80 중량% 이하, 50 중량% 이하, 30 중량% 이하, 20 중량% 이하, 또는 15 중량% 이하일 수 있다.
2차 탈색
본 단계에서는 앞서 1차 탈색에서 얻은 제 1 생성물을 2차 탈색하여 제 2 생성물을 얻는다.
상기 2차 탈색은 과산화수소(H2O2)를 포함하는 2차 산화제에 의해 수행될 수 있다. 이와 같이 앞서의 1차 탈색 단계에서 아염소산나트륨을 산화제로 사용한 뒤 2차 탈색의 산화제로 과산화수소를 사용하는 경우, 2차 탈색 이후 불순물(단백질 및 조지방)의 함량이 현저히 감소할 수 있고, PHA 고형분 회수 시 불순물 가용화 효율을 높여 재회수되는 비율도 감소될 수 있다. 이에 따라 후속하는 탈단백 단계에서 단백질 분해를 위한 효소 투입량을 줄일 수 있어서 생산단가를 낮출 수 있다.
상기 2차 탈색 시에 상기 과산화수소의 사용량은, 상기 제 1 생성물(용액) 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 이상, 0.02 중량% 이상, 0.03 중량% 이상, 0.04 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.06 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 0.3 중량% 이상, 0.4 중량% 이상, 또는 0.5 중량% 이상일 수 있고, 또한 1.3 중량% 이하, 1.2 중량% 이하, 1.1 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.9 중량% 이하, 0.8 중량% 이하, 0.7 중량% 이하, 또는 0.6 중량% 이하일 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기 2차 탈색에서, 상기 과산화수소는 상기 제 1 생성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량%, 또는 0.05 내지 1 중량%의 양으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 과산화수소의 사용량은 종래 기술에서 사용되던 과산화수소의 사용량보다 적은 편인데, 이는 아염소산나트륨(1차 산화제)과의 순차 사용으로 인해 가능해진 것이다.
상기 2차 탈색은 염기성 pH 조건에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 2차 탈색 시의 pH 범위는 7 이상, 7.5 이상, 8 이상, 또는 8.5 이상일 수 있고, 또한 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10.5 이하, 10 이하, 9.5 이하, 또는 9 이하일 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기 2차 탈색은 pH 7 내지 13, 또는 pH 8 내지 13에서 수행될 수 있다. 보다 구체적인 일례로서, 상기 2차 탈색은 pH 8 내지 11, 또는 pH 8 내지 10에서 수행될 수 있다.
이러한 염기성 pH로 조정하기 위해 알칼리 성분이 투입될 수 있다. 상기 2차 탈색 시에 pH 조정을 위해 사용되는 알칼리 성분의 예로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬, 탄산나트륨 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 제 1 생성물은 이와 같은 알칼리 성분을 적정량 포함하여 목적하는 염기성 pH로 조절될 수 있다.
또한 상기 2차 탈색 시의 온도는 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상 또는 60℃ 이상일 수 있고, 또한 90℃ 이하, 80℃ 이하, 75℃ 이하, 70℃ 이하 또는 65℃ 이하일 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기 2차 탈색은 40℃ 내지 90℃, 또는 50℃ 내지 70℃의 온도에서 수행될 수 있다.
또한 상기 2차 탈색에 소요되는 시간은 10분 이상, 30분 이상, 또는 50분 이상일 수 있으며, 또한 3시간 이하, 2시간 이하, 또는 1시간 30분 이하일 수 있고, 구체적인 예로서 30분 내지 1시간 30분일 수 있다.
상기 2차 탈색을 거쳐 얻은 제 2 생성물 내의 불순물 함량은 이전 단계에 비해 감소될 수 있다.
예를 들어 상기 제 2 생성물 내의 단백질 함량은, 상기 제 2 생성물 내의 전체 고형분 중량을 기준으로, 2.5 중량% 이하, 2 중량% 이하, 또는 1.5 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.1 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 또는 1 중량% 이상일 수 있다.
또한 상기 제 2 생성물 내의 지방류 함량은, 상기 제 2 생성물 내의 전체 고형분 중량을 기준으로, 1 중량% 이하, 0.8 중량% 이하, 0.6 중량% 이하, 또는 0.4 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 또는 0.3 중량% 이상일 수 있다.
또한 상기 제 2 생성물 내의 고형분 함량은, 상기 제 2 생성물 총 중량을 기준으로 1 중량% 이상, 3 중량% 이상, 5 중량% 이상, 7 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상일 수 있고, 또한 80 중량% 이하, 50 중량% 이하, 30 중량% 이하, 20 중량% 이하, 또는 15 중량% 이하일 수 있다.
탈단백
이후 상기 제 2 생성물에 대해 단백질분해효소(protease)에 의해 탈단백하는 단계가 수행될 수 있다.
상기 단백질분해효소의 예로는 알칼라제, 펩신, 트립신, 파파인, 키모트립신, 아미노펩티다제, 카르복시펩티다제 등을 들 수 있으며, 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다.
상기 탈단백에서 상기 단백질분해효소의 사용량은 상기 제 2 생성물(용액) 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 이상, 0.002 중량% 이상, 0.003 중량% 이상, 0.004 중량% 이상, 0.005 중량% 이상, 0.006 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.015 중량% 이상, 0.02 중량% 이상, 0.025 중량% 이상일 수 있고, 또한 0.2 중량% 이하, 0.15 중량% 이하, 0.1 중량% 이하, 0.05 중량% 이하, 0.045 중량% 이하, 0.04 중량% 이하일 수 있다. 일례로서, 상기 탈단백에서 상기 단백질분해효소는 상기 제 2 생성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 0.1 중량%, 또는 0.005 내지 0.1 중량%로 사용될 수 있다.
상기 단백질분해효소 외에도, 상기 제 2 생성물에는 지방류분해효소, 세포벽분해효소, DNA분해효소 등이 추가로 첨가될 수 있다. 상기 지방류분해효소의 예로는 리파제류, 포스포리파제류, 콜린에스테라제류, 포스파타제류 등을 들 수 있고, 상기 세포벽분해효소의 예로는 리소자임, 아밀라제, 셀룰라아제, 말타아제, 사카라아제, α-글리코시다제, β-글리코시다제, N-글리코시다제 등을 들 수 있으며, 상기 DNA분해효소의 예로는 리보뉴클레아제류 등을 들 수 있다.
상기 탈단백은 염기성 pH 조건에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 탈단백 시의 pH 범위는 7 이상, 7.5 이상, 8 이상, 또는 8.5 이상일 수 있고, 또한 12 이하, 11 이하, 10.5 이하, 10 이하, 9.5 이하, 또는 9 이하일 수 있다.
이러한 염기성 pH로 조정하기 위해 알칼리 성분이 투입될 수 있다. 상기 탈단백 시에 pH 조정을 위해 사용되는 알칼리 성분의 예로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬, 탄산나트륨 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 제 2 생성물은 이와 같은 알칼리 성분을 적정량 포함하여 목적하는 염기성 pH로 조절될 수 있다.
또한 상기 탈단백 시의 온도는 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상 또는 60℃ 이상일 수 있고, 또한 90℃ 이하, 80℃ 이하, 75℃ 이하, 70℃ 이하 또는 65℃ 이하일 수 있다.
구체적인 일례로서, 상기 탈단백은 pH 7 내지 11에서 수행될 수 있고, 보다 구체적으로 pH 8 내지 10 및 온도 50℃ 내지 70℃에서 수행될 수 있다.
상기 탈단백을 거치면서 단백질 함량이 현저히 감소될 수 있으며, 예를 들어 탈단백 이후 생성물 내의 고형분 중량을 기준으로 한 단백질의 함량이 1 중량% 이하, 0.8 중량% 이하, 0.6 중량% 이하, 또는 0.4 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.1 중량% 이상, 0.15 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 또는 0.25 중량% 이상일 수 있다.
또한 상기 탈단백 이후 생성물 내의 고형분 중량을 기준으로 한 지방류의 함량은 1.5 중량% 이하, 1.3 중량% 이하, 1 중량% 이하, 또는 0.7 중량% 이하일 수 있고, 또한 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 또는 0.3 중량% 이상일 수 있다.
정제된 폴리하이드록시알카노에이트
본 발명에 따르면, 앞서 설명한 방법에 따라 얻어지는 정제된 폴리하이드록시알카노에이트를 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 정제된 폴리하이드록시알카노에이트는 고상 형태를 가질 수 있고, 예를 들어 고상의 수지(resin)일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 상기 정제된 폴리하이드록시알카노에이트는 액상 형태를 가질 수 있고, 예를 들어 액상 수지 또는 수성 현탁액일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 폴리하이드록시알카노에이트는 개선된 색도를 가질 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 CIELAB 색좌표의 b* 값은 15 미만이다. 예를 들어 상기 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 CIELAB 색좌표의 b* 값은 14 이하, 13.5 이하, 13 이하일 수 있고, 또한 0 이상, 1 이상, 5 이상, 또는 10 이상일 수 있다.
상기 폴리하이드록시알카노에이트의 유리전이온도(Tg)는 예를 들어 -45℃ 내지 -10℃, -35℃ 내지 -10℃, -35℃ 내지 -15℃, -35℃ 내지 -20℃ 또는 -30℃ 내지 -20℃일 수 있다.
또한 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 용융 온도(Tm)는 예를 들어 측정되지 않거나, 예를 들면 100℃ 내지 170℃, 100℃ 내지 160℃, 110℃ 내지 160℃, 또는 120℃ 내지 150℃일 수 있다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트는 비결정성 폴리하이드록시알카노에이트, 반결정성 폴리하이드록시알카노에이트, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 결정화 온도(Tc)가 측정되지 않거나, 또는 결정화 온도(Tc)가 60℃ 내지 120℃, 구체적으로 60℃ 내지 110℃, 70℃ 내지 120℃, 또는 75℃ 내지 115℃로 측정될 수 있다.
상기 폴리하이드록시알카노에이트를 구성하는 반복단위는 2-하이드록시부티레이트(2-HB), 3-하이드록시부티레이트(3-HB), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP), 3-하이드록시발레레이트(3-HV), 3-하이드록시헥사노에이트(3-HH), 3-하이드록시헵타노에이트(3-HHep), 3-하이드록시옥타노에이트(3-HO), 3-하이드록시노나노에이트(3-HN), 3-하이드록시데카노에이트(3-HD), 3-하이드록시도데카노에이트(3-HDd), 4-하이드록시부티레이트(4-HB), 4-하이드록시발레레이트(4-HV), 5-하이드록시발레레이트(5-HV) 및 6-하이드록시헥사노에이트(6-HH)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 4-하이드록시부티레이트(4-HB) 반복단위를 포함할 수 있고, 구체적으로 4-HB 반복단위를 포함하는 공중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 폴리하이드록시알카노에이트 내의 4-HB 반복단위의 함량은 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 이상, 1 중량% 이상, 5 중량% 이상, 10 중량% 이상, 20 중량% 이상, 30 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상, 또는 60 중량% 이상일 수 있고, 또한 100 중량% 이하, 99 중량% 이하, 90 중량% 이하, 80 중량% 이하, 70 중량% 이하, 또는 60 중량% 이하일 수 있다. 구체적인 예로서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 4-하이드록시부티레이트(4-HB) 반복단위를 25 중량% 이상 포함할 수 있다.
또한 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 중량평균분자량(Mw)은 예를 들어 50,000 이상, 100,000 이상, 200,000 이상, 300,000 이상, 400,000 이상, 또는 500,000 이상일 수 있고, 또한 1,200,000 이하, 900,000 이하, 800,000 이하, 700,000 이하, 또는 600,000 이하일 수 있다.
또한 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 순도는 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 98.55% 이상, 98.6% 이상, 또는 99.0% 이상일 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: PHA 발효액의 준비
유전자 조작된 E. coli 균주를 이용하여 PHA 발효액을 준비하였다. 먼저 PHA 생성 균주를 종균 배양(seed culture)하여 일정량 확보한 후 주발효를 진행하였다. PHA 생성 균주의 발효를 위해 탄소원으로 포도당 또는 원당을 이용하며 다양한 미네랄 성분들을 영양분으로 첨가하였다. 발효 pH를 조절하기 위해 수산화나트륨 용액 또는 암모니아 가스를 이용하였다. PHA 생성 균주를 이용한 발효 공정은 30~40℃, pH 6~9 사이에서 수행하였다.
실시예 1: 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조
단계 1) 고액 분리 및 셀 파쇄
PHA 발효액을 기계적 방식의 분리기(mechanical separator)에 의해 고액 분리하여, 배양액 불순물과 PHA를 함유한 바이오매스를 분리하였다. 분리된 바이오매스를 총 고형분(total solid) 10~15 중량%가 되도록 조절하고, 반응액의 총 중량을 기준으로 0.13 중량%의 계면활성제(sodium laureth sulfate, 30%, 미원상사)를 첨가하였다. 충분히 교반 후, 고압 균질기(high pressure homogenizer, 베르톨리)을 이용하여 물리적 셀 파쇄를 실시하였다(400~800 bar, 1 pass). 수득된 PHA 용액에 대해 두 번째 고액 분리를 실시하여, PHA 함유 고형분과 셀 유래 불순물을 분리하였다.
단계 2) 탈색
분리된 PHA 용액에 산(10% H3PO4, 덕산과학)을 투입하여 약 pH 3.5~4로 조정한 반응액을 얻고, 반응액 총 중량을 기준으로 0.55 중량%(고형분 기준 약 5 중량%)의 아염소산나트륨(NaClO2)를 투입한 뒤 60℃에서 1시간 동안 1차 탈색을 수행하였다.
1차 탈색된 슬러리에 알칼리(40% NaOH, 덕산과학)를 투입하여 약 pH 9~9.5로 조정한 반응액을 얻고, 반응액 총 중량을 기준으로 0.22 중량%(고형분 기준 약 2 중량%)의 과산화수소(H2O2)를 투입한 뒤 60℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
단계 3) 탈단백
상기 탈색 단계에서 얻은 반응액 총 중량을 기준으로 0.044 중량%(고형분 기준 약 0.4 중량%)의 알칼리성 단백질분해효소(Alcalase, Novoyzme)를 투입하고, 약 pH 9.5에서 2시간 동안 탈단백을 수행하였다. 탈단백 이후, 회수된 고형분(PHA)을 물로 세척하고 건조하여 최종 정제된 폴리하이드록시알카노에이트 수지를 얻었다.
실시예 2
상기 실시예 1과 동일한 절차를 반복하되, 1차 산화제(NaClO2) 및 2차 산화제(H2O2)의 투입량을 아래 표 1과 같이 변경하여 정제된 폴리하이드록시알카노에이트 수지를 얻었다.
비교예 1
상기 실시예 1과 동일한 절차를 반복하되, 산화제로서 과산화수소(H2O2)만을 사용하여 아래 표 1과 같은 조건에서 탈색을 수행하여 정제된 폴리하이드록시알카노에이트 수지를 얻었다.
비교예 2
상기 실시예 1과 동일한 절차를 반복하되, 산화제로서 아염소산나트륨(NaClO2)만을 사용하여 아래 표 1과 같은 조건에서 탈색을 수행하여 정제된 폴리하이드록시알카노에이트 수지를 얻었다.
비교예 3
상기 실시예 1과 동일한 절차를 반복하되, 산화제로서 차아염소산나트륨(NaClO)을 사용하여 아래 표 1과 같은 조건에서 탈색을 수행하여 정제된 폴리하이드록시알카노에이트 수지를 얻었다.
비교예 4
상기 실시예 1과 동일한 절차를 반복하되, 1차 산화제로서 차아염소산나트륨(NaClO)을 사용하고 2차 산화제로서 과산화수소(H2O2)를 이용하여 아래 표 1과 같은 조건에서 탈색을 수행하여 정제된 폴리하이드록시알카노에이트 수지를 얻었다.
이상의 실시예 및 비교예에서 사용한 산화제 및 반응 조건을 아래 표에 정리하였다.
구 분 산화제 종류 탈색 반응 조건 산화제 투입량*
비교예 1 H2O2 pH 9-9.5, 60℃, 2h 0.77 (7)
비교예 2 NaClO2 pH 3.5-4, 60℃, 2h 0.55 (5)
실시예 1 NaClO2 H2O2 pH 3.5-4, 60℃, 1h pH 9-9.5, 60℃, 1h 0.55 (5) 0.22 (2)
실시예 2 NaClO2 H2O2 pH 3.5-4, 60℃, 1h pH 9-9.5, 60℃, 1h 0.22 (2) 0.33 (3)
비교예 3 NaClO pH 9-9.5, 25℃, 0.5h 1.1 (10)
비교예 4 NaClO H2O2 pH 9-9.5, 25℃, 0.5h pH 9-9.5, 25℃, 1.5h 1.1 (10) 0.55 (5)
* 산화제 투입량(단위: 중량%): 반응액 총 중량을 기준으로 투입되는 산화제의 양(괄호 안은 고형분을 기준으로 한 산화제의 투입량)
시험예 1: 색도 및 분자량
상기 실시예 및 비교예에서 탈단백 이후 수득되는 폴리하이드록시알카노에이트 수지에 대해 아래와 같이 시험하였다.
(1) 색도(b* 값)
PHA 고형분의 b* 값을 색도계(spectrophotometer, Konica Minolta사)를 이용하여 측정하였다. 약 8~10 g의 PHA 고형분을 색도계 전용 페트리디쉬에 올려놓은 후 색도를 측정하였다.
(2) 분자량
PHA 분자량을 겔투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정하였다. PHA 고형분 대비 50배에 해당하는 클로로포름을 첨가하여 PHA를 녹인 후, 0.45 ㎛ 시린지 필터를 이용하여 불순물을 제거한 후 GPC 분석을 실시하여 중량평균분자량(Mw)을 산출하였다.
그 결과를 아래 표에 나타내었다.
구 분 b* 값 Mw 결과 요약
비교예 1 16.2 541,408 b* 15 이상
비교예 2 15.6 560,771 b* 15 이상
실시예 1 10.0 535,546 분자량 저하 없이 색도 개선됨
실시예 2 12.4 563,062 분자량 저하 없이 색도 개선됨
비교예 3 7.4 384,926 분자량 저하됨
비교예 4 7.4 474,711 분자량 저하됨
상기 표에서 보듯이, 비교예 1 및 2와 같이 과산화수소(H2O2) 또는 아염소산나트륨(NaClO2) 중 어느 하나만을 사용할 경우 최종 PHA 수지의 b* 값이 15 이상으로 측정되어 색도 개선 효과가 없었다.
반면, 실시예 1 및 2와 같이 아염소산나트륨(NaClO2) 및 과산화수소(H2O2)를 순차적으로 사용할 경우 최종 PHA 수지의 b* 값이 15 미만으로 색도가 현저히 개선되었다. 특히 실시예 1에서 얻은 PHA 수지의 분자량(Mw)은 비교예 1 및 2와 비교하여 차이가 거의 없어서 분자량 저하 없이 색도가 개선됨을 알 수 있었다.
이와 달리, 비교예 3과 같이 산화제로서 차아염소산나트륨(NaClO) 만을 사용한 경우 색도 개선 효과는 확인되었지만 분자량이 현저히 저하(비교예 1 대비 약 29% 저하)되었고, 비교예 4와 같이 과산화수소와 순차적으로 사용하더라도 색도 개선 효과는 있었지만 역시 분자량이 크게 저하되었다.
시험예 2: 불순물 함량 분석
상기 실시예 및 비교예에서 제조되는 각 단계별 생성물에 대해 셀 유래 불순물(단백질 및 지방류) 함량을 분석하였다. 구체적으로 각 정제 단계별 확보한 PHA 슬러리 액을 원심분리하여 고형분과 액상물로 분리한 뒤, 듀마스 분석 방법을 이용한 단백질 분석 및 디에틸에테르를 이용한 지방류 추출을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 4에 정리하였다.
비교예 1 고상 성분(g) 액상 성분(g) 총 합계(g)
전체 단백질 지방류 전체 단백질 전체 단백질
1 고액 분리 이후 98.9 1.73
(1.75%)		 0.41
(0.42%)		 1.1 0.59 100.0 2.32
2 탈색 이후
(H2O2)		 96.4 1.33
(1.38%)		 0.97
(1.01%)		 1.9 1.04 98.3 2.36
3 탈단백 이후 90.2 0.23
(0.25%)		 0.49
(0.54%)		 4.3 2.18 94.6 2.40
4 최종 PHA 수지 88.3 0.58
(0.66%)		 0.67
(0.76%)
실시예 2 고상 성분(g) 액상 성분(g) 총 합계(g)
전체 단백질 지방류 전체 단백질 전체 단백질
1 고액 분리 이후 99.1 2.26
(2.28%)		 0.56
(0.57%)		 0.9 0.48 100.0 2.74
2-1 1차 탈색 이후
(NaClO2)		 99.5 2.61
(2.63%)		 0.51
(0.51%)		 3.0 0.17 102.5 2.79
2-2 2차 탈색 이후
(H2O2)		 97.4 1.34
(1.38%)		 0.31
(0.32%)		 4.7 0.89 102.0 2.23
3 탈단백 이후 95.4 0.27
(0.28%)		 0.46
(0.48%)		 6.1 1.93 101.5 2.19
3 최종 PHA 수지 89.7 0.25
(0.31%)		 0.49
(0.55%)
상기 표 3에서 보듯이, 과산화수소를 산화제로 사용하는 비교예 1의 경우 단백질은 분해되지만 지방류 물질의 분해는 거의 일어나지 않았다. 또한 정제 이후 고형분 회수 시에 불순물(단백질 및 지방류) 함량 증가에 따라 최종 PHA 수지의 b* 값의 증가에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
반면 상기 표 4에서 보듯이, 1차 산화제(NaClO2) 및 2차 산화제(H2O2)를 순차적으로 사용하는 실시예 2의 경우, 2차 탈색 이후 단백질 및 지방류 함량이 현저히 감소하였으며, 고형분 회수 시에 불순물이 재회수되는 비율이 비교예 1에 비해 낮은 것을 알 수 있다. 이는 1차 산화제(NaClO2)에 의한 탈색 시에 단백질 및 지방류 화합물의 구조적 와해 및 분해를 야기하고, 2차 산화제(H2O2)에 의한 탈색 시에 급격히 단백질과 지방 분해율이 증가되어 셀 유래 불순물의 급격한 분해를 야기함으로써, 최종 PHA 수지 내에 잔존하는 불순물의 함량을 낮춰 b* 값의 감소를 유도하는 것으로 사료된다.
시험예 3: 정제된 PHA 분석
상기 실시예 및 비교예에서 최종적으로 얻은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 수지에 대해 아래 시험을 수행하였다.
(1) b* 값
PHA 고형분의 b* 값을 색도계(spectrophotometer, Konica Minolta사)를 이용하여 측정하였다. 약 8 g의 PHA 고형분을 색도계 전용 페트리디쉬에 올려놓은 후 색도를 측정하였다.
(2) 4-HB 함량
PHA 내 4-HB 함량을 부탄올리시스(butanolysis) 반응 후에 가스 크로마토그래피(GC)에 의해 측정하였다. 4-HB 함량 분석을 위한 표준 시약으로 γ-부티로락돈(GBL)을 이용하여 동일하게 부탄올리시스 반응하여 부틸에스터(butyl ester)로 전환한 후에 농도별 표준으로 정량화하였다. PHA 샘플 20 mg에 부탄올리시스 용액(n-butanol+ 4M HCl in dioxnae)과 내부 표준액(diphenylmethane)을 첨가한 후, 70℃에서 1시간 동안 초음파처리(sonication)하여 충분히 용해시켰다. 용해된 샘플을 95℃ 온탕 수조에서 6시간 동안 반응시킨 후 물을 첨가하여 층 분리를 유도하고 상층(유기층)을 분리하여 GC 분석을 실시하여 4-HB 함량을 산출하였다.
(3) PHA 순도
건조된 PHA 고형분 내 불순물 함량을 측정한 뒤, 이로부터 PHA 순도를 아래 식과 같이 계산하였다. 불순물로서는 조단백, 조지방 및 기타불순물(ash)의 함량을 측정하였으며, 불순물 함량은 총 건조 중량 기준으로 측정되었다.
PHA 순도(%)= 100 - (조단백(%) + 조지방(%) + 기타불순물(ash)(%))
그 결과를 하기 표에 정리하였다.
구 분 최종 PHA 수지
비교예 1 실시예 2
b* 값 약 18 (16~20 범위) 약 13 (12~14 범위)
4-HB 함량 > 40 중량% > 40 중량%
PHA 순도 98.54% 99.14%
상기 표에서 보듯이, 본 발명에 따른 실시예 2에서 얻은 최종 PHA 수지는 4-HB 함량이 40 중량%를 초과하는 비결정성 수지로서 PHA 순도가 98.5% 이상으로 높으면서, 황색도를 나타내는 지표인 b* 값이 15 미만으로 비교예 1에 비해 현저히 낮아서 색도가 우수함을 알 수 있다.

Claims (13)

  1. 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 조 생성물을 준비하는 단계;
    상기 조 생성물을 1차 탈색하여 제 1 생성물을 얻는 단계; 및
    상기 제 1 생성물을 2차 탈색하여 제 2 생성물을 얻는 단계를 포함하고,
    상기 1차 탈색은 아염소산나트륨(NaClO2)을 포함하는 1차 산화제에 의해 수행되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 2차 탈색은 과산화수소(H2O2)를 포함하는 2차 산화제에 의해 수행되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 1차 탈색은 pH 2 내지 7에서 수행되고, 상기 2차 탈색은 pH 8 내지 13에서 수행되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 1차 탈색에서, 상기 아염소산나트륨은 상기 조 생성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량%의 양으로 사용되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 2차 탈색에서, 상기 과산화수소는 상기 제 1 생성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량%의 양으로 사용되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 생성물은 전체 고형분의 중량을 기준으로 한 지방류의 함량이 1 중량% 미만인, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 생성물에 대해 단백질분해효소(protease)에 의해 탈단백하는 단계를 추가로 포함하는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 탈단백에서, 상기 단백질분해효소는 상기 제 2 생성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 0.1 중량%의 양으로 사용되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 탈단백은 pH 7 내지 11에서 수행되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리하이드록시알카노에이트를 포함하는 조 생성물은
    폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 발효액을 고액 분리하여 바이오매스를 얻는 단계;
    상기 바이오매스에 계면활성제를 포함하는 첨가제를 혼합하여 현탁액을 얻는 단계;
    상기 현탁액 내의 상기 바이오매스를 파쇄하여 슬러리를 얻는 단계; 및
    상기 슬러리를 고액 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 준비되는, 정제된 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  11. 제 1 항의 방법에 의해 제조되고, CIELAB 색좌표의 b* 값이 15 미만이며, 4-하이드록시부티레이트(4-HB) 반복단위를 25 중량% 이상 포함하는, 폴리하이드록시알카노에이트.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 폴리하이드록시알카노에이트의 결정화 온도(Tc)는 측정되지 않거나 또는 60℃ 내지 120℃로 측정되는, 폴리하이드록시알카노에이트.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 폴리하이드록시알카노에이트를 구성하는 반복단위는 2-하이드록시부티레이트(2-HB), 3-하이드록시부티레이트(3-HB), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP), 3-하이드록시발레레이트(3-HV), 3-하이드록시헥사노에이트(3-HH), 3-하이드록시헵타노에이트(3-HHep), 3-하이드록시옥타노에이트(3-HO), 3-하이드록시노나노에이트(3-HN), 3-하이드록시데카노에이트(3-HD), 3-하이드록시도데카노에이트(3-HDd), 4-하이드록시부티레이트(4-HB), 4-하이드록시발레레이트(4-HV), 5-하이드록시발레레이트(5-HV) 및 6-하이드록시헥사노에이트(6-HH)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 폴리하이드록시알카노에이트.
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