KR102810165B1

KR102810165B1 - 항염증 및 항섬유화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102810165B1
Application number: KR1020220040544A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 김선수
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2025-05-22
Anticipated expiration: 2042-03-31
Also published as: JP2025511247A; EP4501344A4; WO2023191384A1; CN118973599A; MX2024011989A; KR20230141227A; US20250213649A1; EP4501344A1

Abstract

본 발명의 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제하는 활성을 갖는다. 또한, 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 폐의 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선에 유용한 활성물질로 사용될 수 있다.

Description

항염증 및 항섬유화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptide Having Activity of Anti-Inflammation and Anti-Fibrosis and Uses Thereof}

본 발명은 항염증 및 항섬유화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 폐 염증성 질환 또는 폐섬유증의 치료, 예방, 또는 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

인간의 폐는 신체의 6% 부피를 차지하고, 다수의 작은 가스낭인 폐포로 구성되어 있다. 폐의 일차적 목적은 전신 순환계와 가스 상호 교환을 촉진하는 것이다. 폐가 어떠한 원인에 의해서든 자극이 되어 염증반응(inflmmation response) 유발하게 되면 폐에서의 면역 세포인 호중구, 대식세포, 중성구, 비만세포 등의 세포와, 여러가지 폐 세포로부터 사이토카인(cytokine)이나 성장인자(growth factor)가 분비된다. 염증성 사이토카인은 염증성 폐질환의 중요한 매개물질로 알려져 있는데, 폐 상피세포는 염증세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 인터루킨(interleukin), 케모카인(chemokines), 콜로니 자극인자(colony stimulating factors)와 성장인자(growth factor)등을 생산하여 분비함으로써 국소 염증 부위에서이 사이토카인 네트워크에 중요한 역할을 한다.

폐에서의 염증성 질환으로서 대표적인 질환인 천식과 만성폐쇄성폐질환(COPD)은 모두 만성적인 기도 염증에 의해서 유발되는 질환이며, 전세계적으로 매우 흔하고, 그 유병율도 급증하고 있다. 천식 환자에서는 기도의 점막(mucosa)과, 점막하(submucosa)층에 호산구, 비만세포와 CD4+T 세포의 침범이 발생되며, 이들 세포는 IL-4, IL-5, IL-13를 생산 분비하고 있다. 또한, 폐의 섬유증은 폐에서의 염증반응이 매우 중요한 발병 원인이라고 알려져 있다. 대부분의 장기는 조직 손상후에 염증과 치유 과정을 거치게 되는데, 만약 손상이 작은 경우는 정상 구조와 기능을 유지하지만, 계속적인 손상이 있으면 치유 과정에서 조직이 섬유화되는 과정을 밟게 된다.

현재 사용되고 있는 폐 염증성 질환의 치료제로는 염증을 줄여주기 위한 항염증제로서 코르티코 스테로이드 제제가 가장 많이 사용되고 있으며, 그 외에도 면역반응이나 사이토카인을 표적으로 하는 약물로 Th1 반응을 활성화시키거나, Th2 반응을 억제시키는 치료제, 사이토카인 억제제로서 항 IL-2, 항 IL-4, 항 IL-5, 항 IL-9, 항 IL-13, 항 PGD2, 항 TNF-α, 비만세포 억제제, PPAR-γ 촉진제, 항-IgE, 항 CD23 등의 치료제가 개발되고 있다. 그러나, 이러한 약물들은 실제 임상에서 부작용이 발생하거나 실제 치료 효과가 미약하여, 보다 안전하고 높은 효능을 보이면서, 비용면에서 경제적인 새로운 약물의 개발이 절실한 실정이다.

WO 2011/029931

본 발명자들은 항염증 활성 특히 폐에서의 염증을 억제하고 폐 섬유화로의 진전을 억제할 수 있는 활성을 갖는 펩타이드를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 본 발명의 펩타이드가 폐에서의 염증반응을 현저히 완화시켜 주고, 폐의 섬유화로의 진행도 효과적으로 억제한다는 것을 폐세포 및 동물실험을 통해 증명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 폐 염증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 폐의 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 펩타이드 및 이의 활성

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.

본 명세서의 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 변형 없이 사용될 수 있으나, 상기 펩타이드가 가지는 본래의 활성, 예컨대 항당뇨 및 항비만 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환, 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 그 활성을 변화시키지 않는 범위내에서 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열이란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 상기 펩타이드에는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열이 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 및/또는 C-말단 변형이 유도된 것일 수 있다. 이러한 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 통해 본 발명의 펩타이드의 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 예를 들어, 펩타이드의 생체 내 투여 시 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기 용어 "안정성"은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보에서의 안정성 뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미이다.

상기 N-말단 변형은 펩타이드의 N-말단에 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기가 결합한 것일 수 있다. 상기 C-말단 변형은 펩타이드의 C-말단에 히드록시기(hydroxyl group, -OH), 아미노기(amino group, -NH2), 아자이드(azide, -NHNH2) 등이 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 폡타이드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 알려진 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성방법, 특히 고상 합성기술(solid-phasesynthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 염증반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제하는 활성을 갖는다.

일 구현예에서, 발현이 억제되는 상기 염증성 사이토카인 유전자는 TNF α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 발현이 억제되는 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질은 IL-1β, IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, 및 골수세포형과산화효소(Myeloperoxidase)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 폡타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 섬유화 유전자의 발현을 억제한다.

일 구현예에서, 상기 발현이 억제되는 섬유화 유전자는 α-SMA(Alpha Smooth Muscle Actin), 콜라겐 유형 I 알파 1(Collagen1A1), 피브로넥틴 1(Fibronectin1), 및 테나신 C (Tenascin C) 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다.

상술한 본 발명의 펩타이드가 상기와 같은 활성을 가짐으로써 폐의 염증성 질환을 치료, 예방 또는 개선하는데에 매우 우수한 효능을 발휘할 수 있다.

2. 폐 염증성 질환 치료 또는 예방용 조성물

약학적 조성물

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 상술한 바와 같이 염증 반응 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 단백질, 또는 신호전달 관련 단백질들의 발현을 억제하므로 우수한 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 폐 염증성 질환은 천식, 알러지성 천식, 기관지염, 만성 기관지염, 급성 기관지염, 세기관지염, 미만성 범세기관지염, 기관지 확장증, 흉막염, 폐포염, 혈관염, 폐렴, 과민성 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐손상, 연기 흡입 폐손상, 및 열에 의한 폐손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제할 수 있다.

상기 염증성 사이토카인 유전자는 TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질은 IL-1β, IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, 및 Myeloperoxidase으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 섬유화 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

상기 섬유화 유전자는 α-SMA, Collagen1A1, Fibronectin1, 및 Tenascin C유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 상술한 펩타이드의 치료학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 용어 "치료학적 유효량"은 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 펩타이드가 그 활성 또는 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미하고, 예컨대, 폐의 염증성 질환의 치료 또는 예방의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed., 1995, Williams & Wilkins)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 폐의 염증성 질환을 치료하기 위한 적합한 모든 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 1일당 0.0001 μg 내지 100 mg, 0.001 μg 내지 100 mg, 0.01 μg 내지 100 mg, 0.1 μg 내지 100 mg, 또는 1.0 μg 내지 1000 mg 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

식품 조성물

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

상기 폐 염증은 천식, 알러지성 천식, 기관지염, 만성 기관지염, 급성 기관지염, 세기관지염, 미만성 범세기관지염, 기관지 확장증, 흉막염, 폐포염, 혈관염, 폐렴, 과민성 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐손상, 연기 흡입 폐손상, 및 열에 의한 폐손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환에 의한 폐 염증일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 폐 염증 또는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제할 수 있다.

상기 염증성 사이토카인 유전자는 TNF α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 폐 염증 또는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 섬유화 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 폐 염증 또는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에서 펩타이드는 전체 조성물 중량에 대해 0.0001 중량% 내지 10 중량%의 범위내에서 적절한 양을 선택하여 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 상기 펩타이드의 식품학적 유효량 및 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 유효성분으로서 펩타이드 뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로오스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제, 타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 상술한 성분 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 기능성 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 펩타이드 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함될수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 상술한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 폐 염증성 질환의 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선 방법을 제공한다.

상기 폐 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선 방법에는 상술한 본 발명의 펩타이드, 약학적 조성물에 관해 설명된 내용이 모두 동일하게 적용될 수 있으며, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 기재하지 않는다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 MRC-5 세포에서 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 IL-8의 유전자 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드로 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 2는 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 A549 세포에서 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드로 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 3은 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 MRC-5 세포에서 IL-1β, IL-6, pJNK, pERK의 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 A549 세포에서 Phospho-PI3K, Phospho-AKT, Phospho-ERK, IL-1β, IL-6, COX2의 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 MRC-5 세포에서 IL-6 및 IL-8의 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 6은 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 MRC-5 세포에서 섬유화 유전자 α-SMA 및 Collagen1A1 유전자의 발현 수준에 대한, 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 7은 TGF-β1 처리한 MRC-5 세포에서 섬유화 유전자 α-SMA, Fibronectin1, Collagen1A1, 및 Tenascin C의 유전자의 발현 수준에 대한, 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 8은 IL-1β 처리한 A549 세포에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2의 유전자 발현 수준에 대한, 제조예 1의 펩타이드 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 9a, 도 9b 및 도 9c는 은 IL-1β 처리한 A549 세포에서 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, 및 IL-8의 발현 수준에 대한, 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 10a 및 도 10b는 LPS에 의해 폐 염증 유도된 마우스의 기관지세척액에서 총 세포수, 호중구(neutrophil)수, 대식세포(macrophage)의 수에 대한 제조예 1의 펩타이드 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 11a 내지 도 11d은 LPS에 의해 폐 염증 유도된 마우스의 기관지세척액에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, Myeloperoxidase(MPO)의 발현수준에 대한 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 12a 및 도 12b는 LPS에 의해 폐 염증 유도된 마우스의 폐조직의 H&E 염색후 관찰한 결과와, 폐포벽의 두께를 측정한 결과와, 총 세포의 수를 측정한 결과와, 폐포의 수를 측정한 결과이다.
도 13a는 BLM(Bleomycin)에 의해 폐 섬유증 유도된 마우스의 체중을 측정한 결과이고, 도 13b는 상기 마우스의 기관지세척액에서 대식세포(macrophage) 및 림프구(lymphocyte)의 수에 대한 제조예 1의 펩타이드를 처리한 영향을 측정한 결과이고, 도 13c 및 도 13d는 상기 마우스의 기관지세척액에서 세포들을 현미경으로 관찰한 결과 및 총 세포수를 측정한 결과이다.
도 14a는 BLM(Bleomycin)에 의해 폐 섬유증 유도된 마우스의 폐조직의 H&E 염색을 관찰한 결과이고, 도 14b는 상기 H&E 염색한 폐 조직사진에서 각처리 군의 폐포의 수를 측정한 결과와, 총 세포의 수를 측정한 결과와, 폐포벽의 두께를 측정한 결과이다.
도 15a는 BLM(Bleomycin)에 의해 폐 섬유증 유도된 마우스의 폐조직의 Trichrome 염색을 행하여 관찰한 결과이며, 도 15b는 정상군의 콜라겐의 양을 100% 로 하여 나머지 처리군의 콜라겐의 양의 변화를 %로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

제조예 1: 펩타이드의 제조

자동 펩타이드 합성기(Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기의 [표 1]에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(Waters Associates, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 ㎜ Х 100 ㎜, 1.7 ㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.

서열번호	펩타이드의 아미노산 서열
1	KYLLVHRPYYRR

이어서, 상기 제조한 서열번호 1의 펩타이드에 대한 효능을 평가하였다.

실험예 1 : LPS에 의해 유도된 염증성 사이토카인 유전자 발현의 억제

제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다.

1. MRC-5 세포

MRC-5 세포 (lung fibroblast cell)를 12-웰 플레이트에 3 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS(Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드(10, 50, 100, 500μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성대조군)에 대해, 활성물질 및 약물들을 처리하고 24시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 MRC-5 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)로 cDNA 로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머(primer)로 반응 혼합물을 준비한 후, PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용한 프라이머의 염기서열은 아래의 [표 2]에 기재하였다. 실험결과, 도 1에서 보여지는 바와 같이, 염증유도인자인 LPS 처리에 의해 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 IL-8의 유전자 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드로 처리할 경우 증가된 상기 유전자들의 발현이 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.

2. A549 세포

A549 세포(Human alveolar basal epithelial cell)를 6-웰 플레이트에 3 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS(Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드(10, 50, 100, 500μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)에 대해, 활성 물질 및 약물들을 처리하고 3시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 상기 처리군 A549 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)로 cDNA 로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머(primer)로 반응 혼합물을 준비한 후 PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용한 프라이머의 염기서열은 아래의 [표 2]에 기재하였다. 실험결과, 도 2에서 보여지는 바와 같이, 염증유도인자인 LPS 처리에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드로 처리할 경우 증가된 상기 유전자들의 발현이 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.

유전자	프라이머	서열(5' -> 3')	서열번호
TNF-α	F	AACATCCAACCTTCCCAAACG	2
TNF-α	R	GACCCTAAGCCCCCAATTCTC	3
IL-1β	F	TTCGACACATGGGATAACGA	4
IL-1β	R	TCTTTCAACACGCAGGACAG	5
IL-6	F	AAA GAG GCA CTG CCA GAA AA	6
IL-6	R	ATC TGA GGT GCC CAT GCT AC	7
IL-8	F	GAAGGTGCAGTTTTGCCAAG	8
IL-8	R	ACCCTCTGCACCCAGTTTTC	9
COX-2	F	ATCATTCACCAGGCAAATTGC	10
COX-2	R	GGCTTCAGCATAAAGCGTTTG	11
GAPDH	F	GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT	12
GAPDH	R	GGA GCC AAA AGG GTC ATC AT	13

실험예 2 : LPS에 의해 유도된 염증성 사이토카인 단백질 발현의 억제

제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 염증성 사이토카인 단백질들의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다.

1. 웨스턴 블로팅 분석 1: MRC-5 세포

MRC-5 세포(lung fibroblast cell)를 6-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS (Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 24시간 배양하였다. 배양한 각 처리군 및 대조군의 세포에 용해버퍼를 첨가하여 용해시킨 후 4℃ 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 획득한 단백질을 BCA Protein Assay 키트(Sigma)를 사용하여 정량하였다. 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 수행한 후, 멤브레인(membrane)에 전기이동(electrotransfer)하였다. 단백질이 부착된 멤브레인을 5% 탈지유(skim milk)로 처리하여 블로킹(blocking)한 후, 1차 항체를 4℃에서 하룻밤(overnight) 반응시켰다. PBS-T로 세척한 다음 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고 다시 PBS-T로 세척한 후 Gel Doc(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 Western 검출 시약(Elpis Biotech, Daejeon, Korea)을 통해 시각화하였다. 실험에 사용한 항체는 다음과 같다: 항-IL-1β 항체(Cell signaling technology(CST), USA), 항-IL-6 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-pJNK 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-pERK 항체(Cell signaling technology(CST), USA), 항-β-Actin 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA). 실험결과, 도 3에서 보여지는 바와 같이, LPS를 처리한 경우 IL-1β, IL-6, pJNK, pERK의 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해, IL-1β, IL-6, pJNK, pERK의 발현이 농도 의존적으로 다시 감소하였다.

2. 웨스턴 블로팅 분석 2 : A549 세포

A549 세포(Human alveolar basal epithelial cells)를 6-웰 플레이트에 3 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS (Sigma Aldrich) (5μg/ml) 처리군(음성대조군), LPS (5μg/ml) 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, LPS (5μg/ml) 및 Dexamethasone (DEX) (10μM) 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 24시간 배양하였다. 배양한 각 처리군 및 대조군의 세포에 용해버퍼를 첨가하여 용해시킨 후 4℃ 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 획득한 단백질을 BCA Protein Assay 키트(Sigma)를 사용하여 정량하였다. 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)한 다음 멤브레인(membrane)에 전기이동(electrotransfer)하였다. 단백질이 부착된 멤브레인을 5% 탈지유(skim milk)로 처리하여 블로킹(blocking)한 후, 1차 항체를 4℃에서 하룻밤(overnight) 반응시켰다. PBS-T로 세척한 다음 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고 다시 PBS-T로 세척한 후 Gel Doc(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 Western 검출 시약(Elpis Biotech, Daejeon, Korea)을 통해 시각화하였다. 실험에 사용한 항체는 다음과 같다: 항-IL-1β 항체: (Cell signaling technology(CST), USA), 항-IL-6 항체: (Santa Cruz Biotechnology , USA), 항-COX2 항체: (Santa Cruz Biotechnology , USA), 항-Phospho-PI3K 항체: (Cell signaling technology(CST), USA), 항-Phospho-AKT 항체: (Cell signaling technology(CST), USA), 항-Phospho-ERK 항체: (Cell signaling technology(CST), USA), 항-β-Actin 항체: (Santa Cruz Biotechnology , USA). 실험결과, 도 4a 및 도 4b에서 보여지는 바와 같이, LPS를 처리한 경우 Phospho-PI3K, Phospho-AKT, Phospho-ERK, IL-1β, IL-6, COX2의 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 단백질들의 발현수준이 농도 의존적으로 감소하였다.

3. ELISA 분석

MRC-5 세포(lung fibroblast cell)를 12-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS (Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 72시간 배양하였다. 세포 배양후 배양액을 4℃ 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 획득한 상등액에 대해 IL-6 Quantikine ELISA Kit (R&D systems) 및 IL-8 Quantikine ELISA kit (R&D systems)을 사용하여 키트 지시서의 사용방법에 따라 ELISA 분석을 수행한 뒤, Microplate reader를 이용하여 흡광도를 450nm 에서 측정하였다. 실험결과, 도 5a 및 도 5b에서 보여지는 바와 같이, LPS를 처리한 경우 IL-6 및 IL-8의 발현 수준이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 IL-6 및 IL-8의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소하였다.

실험예 3 : LPS에 의해 유도된 섬유화(fibrosis) 유전자 발현의 억제

제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 LPS에 의해 유도된 섬유화 유전자들의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다. MRC-5 세포(lung fibroblast cell)를 12-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS (Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성 대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 3시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 MRC-5 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 cDNA로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머로 반응 혼합물을 준비한 후 PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용된 프라이머의 염기서열은 아래 표 3에 기재하였다.

유전자	프라이머	서열(5' -> 3')	서열번호
α-SMA	F	GGTGCTGTCTCTCTATGCCTCTGGA	14
α-SMA	R	CCCATCAGGCAACTCGTAACTCTTC	15
Collagen1A1	F	CATCACCTACCACTGCAAGAAC	16
Collagen1A1	R	ACGTCGAAGCCGAATTCC	17
GAPDH	F	GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT	12
GAPDH	R	GGA GCC AAA AGG GTC ATC AT	13

실험결과, 도 6에서 보여지는 바와 같이, LPS를 처리한 경우 α-SMA 및 Collagen1A1 유전자의 발현 수준이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 α-SMA 및 Collagen1A1 유전자의 발현 수준이 농도 의존적으로 다시 감소함을 확인하였다.

실험예 4 :TGF-β1에 의해 유도된 섬유화 유전자 발현의 억제

제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 TGF-β1에 의해 유도된 섬유화(fibrosis) 유전자들의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다. MRC-5 세포(lung fibroblast cell)를 12-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, TGF-β1 5ng/ml 처리군(음성대조군), TGF-β1 5ng/ml 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, TGF-β1 5ng/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 3시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 MRC-5 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 cDNA로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머로 반응 혼합물을 준비한 후 PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용된 프라이머의 염기서열은 아래 표 4에 기재하였다.

유전자	프라이머	서열(5' -> 3')	서열번호
α-SMA	F	GGTGCTGTCTCTCTATGCCTCTGGA	14
α-SMA	R	CCCATCAGGCAACTCGTAACTCTTC	15
Fibronectin1	F	GGATGCTCCTGCTGTCAC	18
Fibronectin1	R	CTGTTTGATCTGGACCTGCAG	19
Collagen1A1	F	CATCACCTACCACTGCAAGAAC	16
Collagen1A1	R	ACGTCGAAGCCGAATTCC	17
Tenascin C	F	CCAGCGACCATCAACGCAGC	20
Tenascin C	R	GGGGCTTGTTCAGTGGATGCCT	21
GAPDH	F	GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT	12
GAPDH	R	GGA GCC AAA AGG GTC ATC AT	13

실험결과, 도 7에서 보여지는 바와 같이, TGF-β1을 세포에 처리한 경우, α-SMA, Fibronectin1, Collagen1A1, 및 Tenascin C의 유전자의 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해, 유전자들의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다.

실험예 5 :IL-1β에 의해 유도된 염증성 사이토카인 유전자 발현의 억제

제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다. A549 세포(Human alveolar basal epithelial cell)를 6-웰 플레이트에 3 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, IL-1β(2ng/ml) 처리군(음성대조군), IL-1β (2ng/ml) 및 제조예 1의 펩타이드(10, 50, 100, 500μM) 처리군, IL-1β (2ng/ml) 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)에 대해, 활성 물질 및 약물들을 처리하고 3시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 상기 각군의 A549 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)로 cDNA 로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머로 반응 혼합물을 준비한 후 PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용한 프라이머의 염기서열은 [표 2]와 같다. 실험결과, 도 8에서 보여지는 바와 같이, IL-1β 처리에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자 발현 수준이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드로 처리할 경우 상기 유전자들의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.

실험예 6 :IL-1β에 의해 유도된 염증성 사이토카인 단백질 발현의 억제

제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 IL-1β에 의해 유도된 염증성 사이토카인 단백질의 발현을 억제하는지에 대해 실험하였다. A549 세포(Human alveolar basal epithelial cells)를 12-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군(NON), IL-1β (2ng/ml) 처리군(음성대조군, NC), IL-1β (2ng/ml) 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, IL-1β (2ng/ml) 및 Dexamethasone (DEX) (10μM) 처리군(양성대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 72시간 배양하였다. 세포 배양후 배양액을 4℃ 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 획득한 상등액에 대해 IL-6 Quantikine ELISA Kit(R&D systems), IL-8 Quantikine ELISA Kit(R&D systems), IL-1β Quantikine ELISA Kit(R&D systems)을 사용하여 키트 지시서의 사용방법에 따라 ELISA 분석을 수행한 뒤, Microplate reader를 이용하여 흡광도를 450nm 에서 측정하였다. 실험결과, 도 9a, 도 9b 및 도 9c에서 보여지는 바와 같이, IL-1β를 처리한 경우, IL-1β, IL-6, 및 IL-8의 발현 수준이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 IL-1β, IL-6 및 IL-8의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.

실험예 7 : LPS에 의해 유도된 급성 폐염증의 억제

1. 동물 실험

동물 실험에는 BALB/c 마우스 (Female/7W)를 이용하였으며, LPS를 주입하여 급성 폐 염증 모델(acute lung inflammation model)을 확립하였다. 7 주령 BALB/c 암컷 마우스를 5 마리씩 5 그룹으로 아래 [표 5]와 같이 나누어 실험을 수행하였다. 1일차에 G2-G5 그룹에 비강을 통해 LPS(10μg/50μl/mouse)를 투여하였고, LPS 투여 1시간 후에, G3 및 G4 그룹은 제조예 1의 펩타이드(0.5 mg, 1 mg)을 비강투여하였으며, G5 양성대조군은 Dexamethasone (100μg)을 복강투여하였다. 활성물질 및 약물을 투여하고 24 시간 경과 후 마우스를 희생하여 기관지 세척액(Bronchoalveolar Lavage Fluid) 및 폐조직을 얻고, 이를 다음 분석에 사용하였다.

그룹	성별	동물 수 및 번호	테스트 그룹	LPS	펩타이드 /약물	Dose (mg/head)	Dose amount (mL/head)
G1	Female	5(1-5)	정상군	-	-	-	-
G2	Female	5(6-10)	음성대조군	+	-	-	-
G3	Female	5(11-15)	실험군 1	+	펩타이드(IN)	0.5mg	0.05 mL
G4	Female	5(16-20)	실험군 2	+	펩타이드(IN)	1mg	0.05 mL
G5	Female	5(21-25)	양성대조군	+	DEX(IP)	100μg	0.05 mL

[표 5]에서 펩타이드: 제조예1의 펩타이드, DEX: Dexamethasone, IN: 비강투여(intranasal administration), IP: 복강투여(intraperitoneal administration).

2. 기관지세척액(BALF) 수득 및 세포의 계수

마우스를 마취한 후, 70% 에탄올로 시술 부위를 소독하였다. 이어서, 마우스의 아랫입술에서부터 흉부까지 피부를 절개하였으며, 기도를 열어준 뒤 IV catheter (BD, USA)를 통해 PBS 1ml의 주입 및 회수를 2회 반복하여 기관지세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)를 채취하였다. 채취된 BALF를 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 분리하고, 분리된 세포는 0.5 ml PBS에 재현탁한 뒤, 트립판 블루(trypan blue) 용액과 1:1 비율로 희석하고, hematocytometer를 이용하여 총 세포를 계수하였다. 남은 세포 현탁액에서 10 μl를 이용하여 슬라이드 글라스에 도말(smear) 하였고, different cell count를 위하여 Diff-Quik staining solution (Sysmex, Japan)으로 세포를 염색하였다. 염색이 끝난 후, 현미경을 통해 세포를 관찰 및 계수하였고, 총 세포수 대비 면역세포수를 환산하여 그래프로 나타내었다. 도 10a 및 도 10b에 나타낸 실험결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 호중구(neutrophil)수는 LPS 처리에 의해 증가하였고, 증가된 호중구의 수는 제조예 1의 펩타이드 처리에 의해 농도 의존적 방식으로 유의하게 감소하였다. 대식세포(macrophage)는 LPS 처리에 의해 유의적 증가가 없었으며, 제조예 1의 펩타이드 처리에 의해서도 증가 또는 감소가 없었다.

3. 기관지세척액(BALF)에서 친염증성 단백질의 발현 분석

상기 채취한 BALF에 대해 친염증성 단백질들에 대해 ELISA 분석을 수행하였다. 채취된 BALF를 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액에 대해 TNF-α Quantikine ELISA kit (R&D systems), IL-1β Quantikine ELISA kit (R&D systems), IL-6 Quantikine ELISA kit (R&D systems), Myeloperoxidase(MPO) Quantikine ELISA Kit (R&D systems)를 사용하여 사용 지침서에 따라 분석을 수행한 뒤, Microplate reader를 이용하여 흡광도를 450nm에서 측정하였다. 실험결과, 도 11a 내지 도 11d에서 알 수 있는 바와 같이, LPS 투여에 의해, TNF-α, IL-1β, IL-6, Myeloperoxidase(MPO)의 발현수준이 증가하였고, 증가한 상기 사이토카인의 발현수준이 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 농도 의존적 방식으로 감소하였다.

4. 폐조직에서의 조직학적 변화 측정

동물실험을 수행한 마우스에서 얻은 폐조직을 상온에서 PBS로 세척한 후에, 4% paraformaldehyde (PBS dilution)으로 고정(fixation)하였다. 고정이 완료된 조직을 PBS로 3회 세척하고, 70% 내지 100%의 농도구배 에탄올 연속물(series)을 사용하여 탈수시켰다. 이어서, 폐조직 샘플을 포매(embedding)하고, 4μm 두께의 박편으로 절단하였다. 슬라이드 글라스에 위치된 4 μm 크기의 박편된 표본을 농도구배된 에탄올 연속물로 탈랍(dewaxing) 및 수화(hydration) 시키고, 차례로 hematoxlin 용액에서 1분, Eosin 용액에서 10초 동안 염색하였다. 염색이 끝나면 차례로 90%, 100% 에탄올에 조직 슬라이드를 담가주었으며, 마지막으로 자일렌(xylene)에 5분간, 2회 담근후에 조직 슬라이드의 마운팅(mounting)을 진행하였다.

폐조직의 H&E 염색을 관찰한 결과는 도 12a에 나타내었다.

도 12b의 그래프는 폐포벽의 두께를 측정한 결과(정상군의 폐포벽 두께를 100%로 하여 나머지 처리군의 두께의 증가정도를 %로 나타냄, 염색한 폐사진에서의 세포의 수를 측정한 결과(정상군의 세포의 수를 100%로 하여 나머지 처리군의 세포의 수의 증가정도를 %로 나타냄), 폐사진에서의 폐포의 수를 측정한 결과(정상군의 폐포의 수를 100%로 하여 나머지 처리군의 폐포의 수의 증가 및 감소를 %로 나타냄)를 각각 나타낸다.

실험예 8 : BLM 유도된 폐섬유증의 억제

1. BLM 유도 폐섬유증 동물 모델

8주령 BALB/c 수컷 마우스를 5 마리씩 4개의 그룹으로 아래 [표 6]와 같이 나누었다. 1 일차에 구강 인두를 통한 Bleomycin 용액(10ng/50μl/mouse)을투여하여 BLM 유도를 1회 진행한 후, 7일차 부터, 주 3회 14 일간 제조예 1의 펩타이드(1 mg/mouse)을 비강투여하였으며, 양성대조군인 Pirfeninone (2mg/mouse)는 주 3회 14일간 경구 투여하였다. BLM 유도 21일차에 마우스를 희생하여 기관지 세척액 및 폐조직을 얻고, 이를 다음 분석에 사용하였다.

그룹	성별	동물의 수 및 번호	테스트 그룹	BLM	펩타이드 /약물	Dose (mg/head)	Dose amount (mL/head)
G1	Male	5 (1-5)	정상군	-	-	-	-
G2	Male	5 (6-10)	음성대조군	+	-	-	-
G3	Male	5 (11-15)	실험군	+	펩타이드(IN)	1 mg	0.05 mL
G4	Male	5 (16-20)	양성대조군	+	Pirfeninone (Oral)	2 mg	0.1 mL

상기 [표 6]에서 펩타이드: 제조예1의 펩타이드, IN: 비강투여(intranasal administration), Oral : 경구투여.

2. 체중 변화

실험을 수행한 마우스의 체중을 측정한 결과를 도 13a에 나타내었다. BLM 유도 폐섬유화 마우스에서 체중이 감소하였으며, 제조예 1의 펩타이드를 투여한 경우 감소되었던 체중이 다시 회복되었다.

3. 기관지세척액(BALF) 수득 및 세포의 계수

실험을 수행한 마우스를 마취한 후, 70% 에탄올로 시술 부위를 소독하였다. 이어서, 마우스의 아랫입술에서부터 흉부까지 피부를 절개하였으며, 기도를 열어준 뒤 IV catheter (BD, USA)를 통해 PBS 1ml의 주입 및 회수를 2회 반복하여 기관지세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)를 채취하였다. 채취된 BALF를 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 분리하고, 분리된 세포는 0.5 ml PBS에 재현탁한 뒤, 트립판 블루(trypan blue) 용액과 1:1 비율로 희석하고, hematocytometer를 이용하여 총 세포를 계수하였다. 남은 세포 현탁액에서 10 μl를 이용하여 슬라이드 글라스에 도말(smear)하였고, different cell count를 위하여 Diff-Quik staining solution (Sysmex, Japan)으로 세포를 염색하였다. 염색이 끝난 후, 현미경을 통해 세포를 관찰 및 계수하였고, 총 세포수 대비 면역세포수를 환산하여 그래프로 나타내었다. 도 13b에 나타낸 실험결과에서 알 수 있는 바와 같이, 대식세포(macrophage) 및 림프구(lymphocyte)의 수는 BLM 처리에 의해 증가하였고, 증가된 대식세포 및 림프구의 수는 제조예 1의 펩타이드 처리에 의해 감소하였다. 도 13c 및 도 13d에는 세포들을 현미경으로 관찰한 결과 및 총 세포수를 측정한 결과를 나타내었다.

4. 폐조직에서의 조직학적 변화 측정- H&E 염색

동물실험을 수행한 마우스에서 얻은 폐조직을 상온에서 PBS로 세척한 후에, 4% paraformaldehyde (PBS dilution)으로 고정(fixation)하였다. 고정이 완료된 조직을 PBS로 3회 세척하고, 70% 내지 100%의 농도구배 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수시켰다. 이어서, 폐조직 샘플을 포매(embedding)하고, 4μm 두께의 박편으로 절단하였다. 슬라이드 글라스에 위치된 4 μm 크기의 박편된 표본을 농도 구배된 에탄올 시리즈로 탈랍(dewaxing) 및 수화(hydration)시키고, 차례로 hematoxlin 용액에서 1분 및 Eosin 용액에서 10초 동안 염색하였다. 염색이 끝나면 차례로 90%, 100% 에탄올에 조직 슬라이드를 담가주었으며, 마지막으로 자일렌(xylene)에 5분간, 2회 담근후에 조직 슬라이드의 마운팅(mounting)을 진행하였다.

도 14a에는 폐조직의 H&E 염색을 관찰한 결과를 나타내었다.

도 14b에는 염색한 폐 조직사진에서 각처리 군의 폐포의 수를 측정한 결과, 염색한 폐 조직 사진에서 총 세포의 수를 측정한 결과(정상군의 총 세포의 수를 100%로 하여 나머지 처리군의 총세포 수의 증가정도를 %로 타나냄), 염색한 폐 조직 사진에서 각 처리군의 폐포벽의 두께를 측정한 결과(정상군의 폐포벽 두께를 100%로 하여 나머지 처리군의 두께의 증가정도를 %로 나타냄)을 각각 보여준다.

5. 폐조직에서의 조직학적 변화 측정- Masson's Trichrome 염색

동물실험을 수행한 마우스에서 얻은 폐조직을 상온에서 PBS로 세척한 후에, 4% paraformaldehyde (PBS dilution)으로 고정(fixation)하였다. 고정이 완료된 조직을 PBS로 3회 세척하고, 70% 내지 100%의 농도구배 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수시켰다. 이어서, 폐조직 샘플을 포매(embedding)하고, 4μm 두께의 박편으로 절단하였다. 슬라이드 글라스에 위치된 4 μm 크기의 박편된 표본을 농도 구배된 에탄올 시리즈로 탈랍(dewaxing) 및 수화(hydration) 시켰다. Weigert's iron hematoxlin, Biebrich scarlet-acid fuchsin solution, Phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution, 및 아닐린블루 용액(aniline blue solution)에서 각각 10분씩 염색을 수행하였다. 염색 완료후, 1% 아세트산 용액에 2분간 조직 슬라이드를 담근 후 D.W로 세척하였다. 차례로 95%, 100% 에탄올에 조직 슬라이드를 담가주었으며, 마지막으로 자일렌(xylene)에 5분간, 2회 담근 후 조직 슬라이드의 마운팅(mounting)을 진행하였다. 도 15a는 Trichrome 염색법을 이용하여 콜라겐을 염색한 결과이다. 도 15b는 정상군의 콜라겐의 양을 100% 로 하여 나머지 처리군의 콜라겐의 양의 변화를 %로 나타내었다. BLM 처리에 의해 유도된 폐의 섬유화 정도를 콜라겐의 양의 변화를 통해서 확인한 결과, 제조예 1의 펩타이드 처리시 폐 조직내의 콜라겐 침착 정도가 뚜렷하게 감소하는 것을 확인하였다.

제조예 2: 약학적 조성물의 제조

2-1. 산제의 제조

본 발명의 펩타이드 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2-2. 정제의 제조

본 발명의 펩타이드 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

2-3. 캡슐제의 제조

본 발명의 펩타이드 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

2-4. 환의 제조

본 발명의 펩타이드 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4g이 되도록 제조하였다.

2-5. 과립의 제조

본 발명의 펩타이드 150 mg

대두추출물 50 mg

포도당 200 mg

전분 600 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 mg을 첨가하여 섭씨 60

에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

제조예 3: 기능성 식품 조성물의 제조

3-1. 건강식품의 제조

본 발명의 펩타이드 500 μg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 mg

비타민 E 1.0mg

비타민 D 0.13mg

비타민 B2 0.15mg

비타민 B6 0.5mg

비타민 B12 0.2mg

비타민 C 10mg

비오틴 10mg

니코틴산아미드 1.7mg

엽산 50mg

판토텐산 칼슘 0.5mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75mg

산화아연 0.82mg

탄산마그네슘 25.3mg

제1인산칼륨 15mg

제2인산칼슘 55mg

구연산칼륨 90mg

탄산칼슘 100mg

염화마그네슘 24.8mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

3-2. 건강음료의 제조

본 발명의 펩타이드 500 μg

구연산 1000mg

올리고당 100g

매실농축액 2g

타우린 1g

정제수를 가하여 전체 900ml

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시할 수 있다.

상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> CAREGEN CO.,LTD. <120> Peptide Having Activity of Anti-Inflammation and Anti-Fibrosis and Uses Thereof <130> 2021-DPA-4554 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 1 Lys Tyr Leu Leu Val His Arg Pro Tyr Tyr Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for TNF alpha <400> 2 aacatccaac cttcccaaac g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for TNF alpha <400> 3 gaccctaagc ccccaattct c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for IL-1 beta <400> 4 ttcgacacat gggataacga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for IL-1 beta <400> 5 tctttcaaca cgcaggacag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for IL-6 <400> 6 aaagaggcac tgccagaaaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for IL-6 <400> 7 atctgaggtg cccatgctac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for IL-8 <400> 8 gaaggtgcag ttttgccaag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for IL-8 <400> 9 accctctgca cccagttttc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for COX-2 <400> 10 atcattcacc aggcaaattg c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for COX-2 <400> 11 ggcttcagca taaagcgttt g 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for GAPDH <400> 12 gtgatggcat ggactgtggt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for GAPDH <400> 13 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for alpha-SMA <400> 14 ggtgctgtct ctctatgcct ctgga 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for alpha-SMA <400> 15 cccatcaggc aactcgtaac tcttc 25 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Collagen1A1 <400> 16 catcacctac cactgcaaga ac 22 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Collagen1A1 <400> 17 acgtcgaagc cgaattcc 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Fibronectin1 <400> 18 ggatgctcct gctgtcac 18 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Fibronectin1 <400> 19 ctgtttgatc tggacctgca g 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Tenascin C <400> 20 ccagcgacca tcaacgcagc 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Tenascin C <400> 21 ggggcttgtt cagtggatgc ct 22

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로서,
상기 폐 염증성 질환은 천식, 알러지성 천식, 기관지염, 만성 기관지염, 급성 기관지염, 세기관지염, 미만성 범세기관지염, 기관지 확장증, 흉막염, 폐포염, 폐렴, 과민성 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 폐에서의 낭포성 섬유증 질환, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐손상, 연기 흡입 폐손상, 및 열에 의한 폐손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환인 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 폡타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제하는 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 염증성 사이토카인 유전자는 TNF α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질은 IL-1β, IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, 및 골수세포형과산화효소(Myeloperoxidase)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 폡타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 섬유화 유전자의 발현을 억제하는 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 6에 있어서,
상기 섬유화 유전자는 α-SMA(Alpha Smooth Muscle Actin), 콜라겐 유형 I 알파 1(Collagen1A1), 피브로넥틴 1(Fibronectin1), 및 테나신 C(Tenascin C) 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 폡타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시키는 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물.