KR102816628B1 - 대사증후군 특이적 후성유전 메틸화 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대사증후군 특이적 후성유전 메틸화 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 대사증후군 특이적 후성유전 메틸화 마커로서 GFPT2(Glutamine-Fructose-6-Phosphate Transaminase 2) 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 조성물, 예측용 키트 및 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 후성유전 메틸화 마커 이용시 소량의 시료로도 DNA 메틸화와 발현값의 상관관계 분석을 통해 대사증후군 또는 그 중증도를 높은 예측도로 예측할 수 있는 바, 대사증후군 또는 그 위험도를 예측하여 대사증후군 환자의 맞춤치료 및 관리를 용이하게 할 수 있다.

Description

대사증후군 특이적 후성유전 메틸화 마커 및 이의 용도{Metabolic syndrome-specific epigenetic methylation markers and uses thereof}

본 발명은 대사증후군 특이적 후성유전 메틸화 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 대사증후군 특이적 후성유전 메틸화 마커로서 GFPT2(Glutamine-Fructose-6-Phosphate Transaminase 2) 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 조성물, 예측을 위한 정보를 제공하는 방법 및 예측용 키트에 관한 것이다.

대사증후군은 심장질환 및 당뇨병, 뇌졸중을 비롯하여 건강 문제의 위험성을 증가시키는 5가지 위험요소들(고혈압, 고혈당, 고중성지방 혈증, 낮은 고밀도지단백 콜레스테롤 그리고 중심비만) 중 3가지 이상을 한 개인이 가지고 있는 것을 뜻한다. 생활습관의 급속한 서구화로 인해 질병의 양상도 매우 큰 변화가 나타나고 있으며, 상기 대사증후군과 관련해 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 심뇌혈관질환 등이 폭발적으로 증가하고 있다. 전 세계의 성인 대사증후군 유병률이 20~25%이며 미국은 35%, 한국은 30%까지 보고되고 있다. 이러한 대사증후군은 오랜 시간 방치할 경우 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 그러나, 대사증후군을 정확히 예측할 수 있는 기술은 아직까지 없는 실정이다.

한편, DNA 메틸화란 DNA상에서 발생하는 후성유전학적 변이를 말하는데, 부모로부터 물려받은 DNA 서열은 변하지 않고, DNA에 메틸기(CH₃)가 달라붙는 화학적인 변화를 의미한다. 상기 DNA 메틸화를 적용하면 상대적으로 바이오마커가 소량 존재한다고 해도 측정 가능성이 높은 장점이 있어, 진단에 많이 사용되고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 대사증후군에서 변화하는 메틸화 후성영역을 활용하여 대사증후군 또는 그 중증도에 대해 높은 예측도를 나타내는 후성유전 마커를 발굴하고, 이를 실험적으로 검증하여 본 발명을 완성하였다.

1. KR 10-2007-0107576 A

본 발명의 하나의 목적은 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 대사증후군 또는 그 중증도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 키트를 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명, 및 실시형태는 각각의 다른 설명, 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 조성물은, GFPT2(Glutamine-Fructose-6-Phosphate Transaminase 2) 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "대사증후군"이란, 심장질환 및 당뇨병, 뇌졸중을 비롯하여 건강 문제의 위험성을 증가시키는 5가지 위험요소들(고혈압, 고혈당, 고중성지방 혈증, 낮은 고밀도지단백 콜레스테롤 그리고 중심비만) 중 3가지 이상을 한 개인이 가지고 있는 것으로, 상기 대사증후군과 관련해 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 심뇌혈관질환 등이 폭발적으로 증가하고 있다. 이러한 대사증후군은 오랜 시간 방치할 경우 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 그러나, 대사증후군을 정확히 예측할 수 있는 기술은 아직까지 없는 실정이다.

이에, 본 발명은 대사증후군에서 변화하는 메틸화 후성영역을 활용하여 대사증후군 또는 그 중증도에 대해 높은 예측도를 나타내는 후성유전 마커를 발굴하고, 이를 실험적으로 검증하여 실제 대사증후군 또는 그 중증도 예측에 적용할 수 있음을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.

본 발명의 용어, "GFPT2(Glutamine-Fructose-6-Phosphate Transaminase 2) 유전자"란, 헥소사민 경로로의 포도당 흐름을 조절하는 단백질을 코딩하는 유전자로서, 상기 GFPT2 단백질은 단백질의 N- 및 O-연결 글리코실화를 위한 전구체의 가용성 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다.

상기 GFPT2 유전자의 구체적인 염기서열 또는 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI와 같은 database에 보고되어 있다. 예를 들면, NCBI RefSeqID: NM_00110.4(mRNA), NCBI RefSeqID: NP_005101.1(단백질) 등으로 보고되어 있다.

본 발명에 있어서, 상기 GFPT2 유전자의 CpG는 cg23248424, cg02891314 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 GFPT2 유전자의 CpG는 cg02891314, cg23248424, cg03849834, cg03906115, cg08412584, cg06419846, cg01132471, cg05496363, cg26663636, cg17746316, cg14694011, cg01085125, cg17967261, cg07581492, cg11802326, cg10322308, cg01296532, cg05661060, cg19914607, cg20088964, cg21129641, cg23284609, cg12449528, cg01020859, cg06899976, cg27615366, cg00558215, cg19534753, cg25935985, cg21183461, cg07262247, cg15279476, cg09050461, cg18932078, cg01507019, cg10461560, cg24001246, cg01905210, cg13680337, cg26523565, cg20512303, cg25264268, cg03103192, cg05215830, cg05904716, cg18355337 및 cg05374025로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 GFPT2 유전자 유래 CpG의 조합은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 47개의 CpG 중 1개 이상, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상 또는 47개의 CpG를 모두 포함하는 조합이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 GFPT2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는, 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 메틸화 민감성 제한효소, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인 및 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 바이설파이트 또는 이의 염은 CpG 부위의 메틸화 여부에 따라 상기 CpG의 C (사이토신)를 차별적으로 변형시키는 물질일 수 있다. 상기 바이설파이트는 메틸화된 사이토신은 변형시키지 않고, 비메틸화된 사이토신은 우라실로 변형시킨다.

상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 및 NotI로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 제한효소는 메틸화된 제한효소 인식 부위 또는 비-메틸화된 제한효소 인식부위를 선별적으로 절단하여, 이후 전기영동을 통해 산물의 크기를 분석함으로써 절단 여부에 따라 메틸화 상태를 판별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 정상인 대비 대사증후군에서 메틸화 변화에 의해 발현이 변화하는 유전자에 포함된 CpG 영역을 나타내는 후성유전지표를 선정하기 위해, pearson correlation(r) 방법을 활용하여 유전자 발현이 변화하는 차등발현유전자와 메틸화 값이 변화하는 차등 메틸화 영역을 선정하였으며, 메틸화와 유전자 발현 상관관계 분석을 통해 유의성 정도로 선정된 최종 후성유전지표의 후보군을 도출하였다(실시예 4).

대사증후군 특이적 후성유전지표로 선정된 2개 CpG 영역(GFPT2 유전자의 cg02891314, cg23248424)의 메틸화 값과 유의성 정도를 확인한 결과, cg23248424의 경우 p 값이 0.046, cg02891314의 경우 p 값이 0.0145로 정상인(N=5)에 비해 대사증후군 환자(N=5)에서 유의하게 과메틸화 되는 것을 실험적으로 검증하였다(실시예 4).

또한, 해당 CpG 후보군에 의한 타겟 유전자의 발현을 검증하기 위해 GFPT2 유전자를 qRT-PCR로 검증한 결과, 정상인(N=5)에 비해 대사증후군 환자(N=5)에서 유의하게 발현이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 5).

본 발명의 다른 일 실시양태는 대사증후군 또는 그 중증도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 대사증후군 또는 그 중증도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법은 개체로부터 분리된 시료로부터 GFPT2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법에 있어서, GFPT2 유전자의 CpG는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 개체는 대사증후군 또는 그 중증도를 예측하고자 하는 대상을 의미하며, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼 등의 대사증후군이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 분리된 시료는 메틸화 여부 또는 수준을 검출할 수 있는 생물학적 시료로서 상술한 조직 등에서 추출한 DNA 또는 핵산일 수 있다. 특히 메틸화된 CpG 부위에서 CpG의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다.

구체적으로, CpG 부위의 메틸화 여부 검출에 사용되는 핵산은 DNA, 특히 게놈 DNA일 수 있다. 이러한 CpG 부위의 메틸화 여부의 검출에 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 최신판)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 GFPT2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는, (a) 분리된 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 DNA를 GFPT2 유전자의 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 바이설파이트 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 CpG 부위의 메틸화 수준 측정에는 다양한 증폭 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 PCR(Polymerase Chain Reaction), 메틸화 특이적 PCR, 실시간 메틸화 특이적 PCR(real timemethylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, DNA 마이크로어레이, 파이로서열분석 및 바이설파이트 서열분석 등을 통해서 수행될 수 있다. PCR 이외의 증폭방법으로는 라이게이즈 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR) (Barringer et al, 1990. Gene 89, 117-122), 전사 증폭(WO1988/10315), 표적서열의 선택적 증폭 방법(U.S. Pat. No. 6,410,276), 보존서열을 이용한 PCR(U.S. Pat. No. 4,437,975), 무작위 프라이머를 이용한 PCR(WO1990/06995), 핵산기재 서열 증폭(NASBA) (U.S. Pat. Nos. 5,409,818; 5,554,517; 6,063,603) 및 틈(nick) 교체 증폭(WO2004/067726) 방법 등을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

메틸화 수준을 측정할 수 있는 다른 방법으로는 MALDITOFF, MassARRAY, MethyLight, QAMA(Quantitative analysis of ethylated alleles), ERMA(enzymatic regional methylation assay), HeavyMethyl, QBSUPT, MS-SNuPE, MethylQuant, Quantitative PCR sequencing 및 올리고뉴클레오타이드 기재의 마이크로어레이 등을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

메틸화 상태의 검출을 위해 사용되는 프로브, 프라이머 등은 표적 핵산과 교잡을 통해 작용한다. 교잡 조건은 구체적 실험 목적, 반응에 사용되는 핵산의 특성 등에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면 교잡부위의 핵산의 길이, 상동성정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA) 등이 교잡조건의 선택에 고려된다. 일반적으로 특이성을 높이기 위한 최적 조건은 교잡반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다.

CpG 부위의 메틸화 수준 검출을 위한 PCR 프라이머는 검출 방법에 따라 다양하게 제작될 수 있다. 예를 들면 바이설파이트 분석, COBRA(Called Combined Bisulfite Restriction Analysis), 또는 Ms-SNuPE(Methylation-sensitive single nucleotide primer extension) 분석의 경우, 프라이머 자체는 DNA 메틸화 부위 및 가능 부위는 커버하지 않거나, 교잡하지 않도록 디자인되며, 차별적으로 메틸화가 일어나는 부위에서의 서열변이는 한 쌍의 프라이머 사이에 위치하도록 한다. 또는 프라이머가 화합물 처리 후의 메틸화 또는 비-메틸화 부위에 특이적으로 교잡하도록 제작될 수 있으며, 결합 상보성이 충분하여 교잡을 방해하지 않는 경우, 추가의 서열 예를 들면 제한효소 부위, 리간드 결합부위, 링커 또는 반복서열을 포함하도록 제작될 수 있다.

또한, 변형 또는 비변형 DNA 검출을 위해 특정 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브가 사용될 수 있으며, 이러한 프로브는 변형된 산물에 직접 결합하거나 또는 변형된 산물의 증폭 산물에 결합할 수 있으며, 검출을 위해 공지의 다양한 물질, 예를 들면 형광물질, 방사선물질, 생물발광물질, 발광물질, 화학발광물질, 효소, 수용체 또는 리간드로 표지될 수 있다. 표지방법은 당해 분야에 널리 알려진 기술로, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, CpG 부위의 메틸화 수준은 BSAS (Bisulfite Amplicon Sequencing)을 통해 측정될 수 있다. 상기 BSAS은 다양한 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들면 메틸화 DNA를 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 혼성화시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 대사증후군 특이적 후성유전지표로 선정된 2개 CpG 영역(GFPT2 유전자의 cg02891314, cg23248424)의 메틸화 값을 정상인과 비교하여 유의하게 과메틸화 되는 경우, 대사증후군 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있으며, 과메틸화 수준이 높을수록 그 중증도도 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시양태는 본 발명의 조성물을 포함하는, 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 키트를 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 키트는 qRT-PCR 키트, PCR 키트, 메틸화 특이적 PCR 키트, 실시간 메틸화 특이적 PCR 키트, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 키트, DNA 마이크로어레이 키트, MALDITOFF 키트, MassARRAY 키트, MethyLight 키트, QAMA 키트, ERMA 키트, HeavyMethyl 키트, QBSUPT 키트, MS-SNuPE 키트, MethylQuant 키트, Quantitative PCR sequencing 키트 및 올리고뉴클레오타이드 기재의 마이크로어레이 키트 등일 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 키트라면 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 후성유전 메틸화 마커 이용시 소량의 시료로도 DNA 메틸화와 발현값의 상관관계 분석을 통해 대사증후군 또는 그 중증도를 높은 예측도로 예측할 수 있는 바, 대사증후군 또는 그 위험도를 예측하여 대사증후군 환자의 맞춤치료 및 관리를 용이하게 할 수 있다.

도 1은 대사질환 후성유전지표 예측 방법 및 시스템의 실험 개략도이다.
도 2는 후성유전마커를 이용한 ROC/AUC 결과(메틸레이션)이다.
도 3은 후성유전지표 후보군인 45개 CpG 영역(붉은색 표시) 및 후성유전지표로 선정된 2개의 CpG 영역(cg02891314, cg23248424; 녹색 표시)을 나타낸 도이다.
도 4는 후성유전지표로 선정된 2개의 CpG 영역(cg02891314, cg23248424)의 BSAS(bisulfite amplicon sequencing) 검증 결과이다.
도 5는 대사증후군 환자 및 정상인에서 후성유전지표로 선정된 2개의 CpG 영역(cg02891314, cg23248424)의 메틸레이션 값과 유의성 정도를 검증한 결과이다.
도 6은 대사증후군 환자 및 정상인에서 후성유전지표로 선정된 2개의 CpG 영역(cg02891314, cg23248424)에 의한 타겟 유전자(GFPT2)의 발현을 검증한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 연구 샘플의 수집

대전시민코호트 중 정상인(9명)과 대사증후군 환자(11명)를 대상으로 유전체 전반에 걸친 유전자 발현을 도출하기 위해 RNA-seq(대용량 전사체 데이터)와 메틸화 정도를 측정하기 위해 메틸화 칩을 수행하였다.

상기 메틸화는 특정 유전자내 특정 CpG에 사이토신(C)이 메틸화 되어 메틸사이토신(mC)으로 변화하는 것을 의미하며, 메틸화가 일어나면 그로 인해 전사인자 등의 결합이 방해를 받게 되어 유전자의 발현이 억제된다.

실시예 2: 차등발현유전자의 선정 (|FC|>2 이면서 P-value<0.05)

정상인에 비해 대사증후군자에서 발현이 변화하는 유전자를 선정하기 위하여 RNA-seq에서 생산된 염기서열의 Q30 이상의 시퀀싱 리드 중 adaptor는 제거하고 중복되는 리드를 제거 후 사람 유전체에 매핑을 하여 유전자별 발현량을 측정하였다. 발현 fold change(FC)가 2배이상 차이가 나면서 유의성을 나타내는 P-value 값이 0.05이하인 유전자를 선정하였다.

실시예 3: 차등메틸화영역의 선정 (P-value <0.05)

정상인에 비해 대사증후군자에서 메틸화가 변화하는 영역을 선정하기 위해 메틸화 칩(Human Methylation 850K BeadChip)의 이미지 파일을 이용해 detection P value 값이 0.05이하인 CpG 영역이 99%이상인 데이터를 대상으로 t-test를 수행하였다(P-value< 0.05).

실시예 4: 후성유전지표의 선정

정상인 대비 대사증후군에서 메틸화 변화에 의해 발현이 변화하는 유전자에 포함된 CpG 영역을 나타내는 후성유전지표를 선정하기 위해, pearson correlation(r) 방법을 활용하여 유전자 발현이 변화하는 차등발현유전자와 메틸화 값이 변화하는 차등 메틸화 영역을 선정하였다(47개).

후성유전지표 계산을 위해 사용된 유전자 마커는 다음 표 1과 같다. 메틸화와 유전자 발현 상관관계 분석을 통해 유의성 정도로 선정된 최종 후성유전지표의 후보군을 도출하였으며, 후성유전지표로 메틸화 칩의 프로브를 기재하였다.

후성유전지표의 예측력 판단을 위한 2개 프로브(3개 유전자)에 대한 ROC/AUC 결과를 도 2에 나타내었다. 해당 후성유전 지표 외에 위에 표 1에서 제시된 후성유전지표를 이용해 대사증후군을 판별할 수 있는 대사증후군 예측도를 측정하여 대사증후군자의 맞춤치료 및 관리를 용이하게 할 수 있는 예측 시스템으로 활용할 수 있다.

또한, 해당 후성유전지표의 재현성을 위하여 2개의 CpG 프로브 영역을 포함하는 영역(497 bp)의 BSAS(bisulfite amplicon sequencing)을 통해 검증하였다.

그 결과, 총 45개 CpG 영역을 검증하였으며, 이 중 녹색으로 표시된 두 개의 CpG 영역이 후성유전지표로 선정된 2개의 영역이며(도 3), 해당 CpG 프로브 영역의 실험 결과는 도 4와 같다.

실시예 5: 후보군의 실험적 검증

45개 CpG 영역 중 대사증후군 특이적 후성유전지표로 선정된 2개 후보군(GFPT2의 cg23248424, cg02891314)의 메틸화 정도를 실험적으로 검증하기 위해 해당 프로브를 포함하는 영역을 대사증후군 환자 5명, 정상인 5명을 대상으로 BSAS을 통해 검증하였다. 이 CpG 영역이 GFPT2 발현에 영향을 주는 살펴보기 위하여, qRT-PCR을 통해 해당 유전자의 발현 또한 대사증후군 환자 5명, 정상인 5명을 대상으로 검증하였다.

상기 qRT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 다음 표 2와 같다.

Targets	BS-primer_FWD (5' to 3')	BS-primer_REV (5' to 3')
GFPT2	TTAAGAGGGGAGGGGAAAGGAAA(서열번호 1)	CACCTTAAATATAAAAATCAACC(서열번호 2)

2개 CpG 영역(cg02891314, cg23248424)의 메틸화 값과 유의성 정도를 확인한 결과, cg23248424의 경우 p 값이 0.046으로 정상인(N=5)에 비해 대사증후군 환자(N=5)에서 유의하게 과메틸화되는 것을 확인하였으며, cg02891314는 p값이 0.0145로 대사증후군자에서 유의하게 과메틸화되는 것을 실험적으로 검증하였다(도 5).

또한, 해당 CpG 후보군에 의해 타겟 유전자의 발현을 검증하기 위해 GFPT2 유전자를 qRT-PCR로 검증 실험한 결과, 정상인(N=5)에 비해 대사증후군 환자(N=5)에서 유의하게 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 6).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Metabolic syndrome-specific epigenetic methylation markers and uses thereof <130> KPA211231-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BS-primer_FWD <400> 1 ttaagagggg aggggaaagg aaa 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BS-primer_REV <400> 2 caccttaaat ataaaaatca acc 23

Claims (8)

1. GFPT2(Glutamine-Fructose-6-Phosphate Transaminase 2) 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 조성물로서,
   상기 GFPT2 유전자의 CpG는 cg23248424, cg02891314,
   cg03849834, cg03906115, cg08412584, cg01132471, cg26663636, cg14694011, cg17967261, cg07581492, cg11802326, cg10322308, cg01296532, cg19914607, cg20088964, cg21129641, cg23284609, cg12449528, cg06899976, cg27615366, cg00558215, cg19534753, cg25935985, cg21183461, cg07262247, cg15279476, cg09050461, cg18932078, cg01507019, cg10461560, cg24001246, cg13680337, cg26523565, cg20512303, cg25264268, cg05215830, cg05904716, cg18355337, 및 cg05374025 를 포함하는 것인, 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 GFPT2 유전자의 CpG는 cg06419846, cg05496363, cg17746316, cg01085125, cg05661060, cg01020859, cg01905210, 및 cg03103192로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는, 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 메틸화 민감성 제한효소, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인 및 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 및 NotI로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
   
5. 개체로부터 분리된 시료로부터 GFPT2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대사증후군 또는 그 중증도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
   상기 GFPT2 유전자의 CpG는 cg23248424, cg02891314,
   cg03849834, cg03906115, cg08412584, cg01132471, cg26663636, cg14694011, cg17967261, cg07581492, cg11802326, cg10322308, cg01296532, cg19914607, cg20088964, cg21129641, cg23284609, cg12449528, cg06899976, cg27615366, cg00558215, cg19534753, cg25935985, cg21183461, cg07262247, cg15279476, cg09050461, cg18932078, cg01507019, cg10461560, cg24001246, cg13680337, cg26523565, cg20512303, cg25264268, cg05215830, cg05904716, cg18355337, 및 cg05374025 를 포함하는 것인, 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 GFPT2 유전자의 CpG는 cg06419846, cg05496363, cg17746316, cg01085125, cg05661060, cg01020859, cg01905210, 및 cg03103192로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 방법.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 GFPT2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는,
   (a) 분리된 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
   (b) 상기 처리된 DNA를 GFPT2 유전자의 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계;를 포함하는 것인, 방법.
   
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 대사증후군 또는 그 중증도 예측용 키트.