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KR102801138B1 - 변형된 산화 프로토콜을 사용한 올리고뉴클레오티드의 제조 공정 - Google Patents

변형된 산화 프로토콜을 사용한 올리고뉴클레오티드의 제조 공정 Download PDF

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KR102801138B1
KR102801138B1 KR1020217040546A KR20217040546A KR102801138B1 KR 102801138 B1 KR102801138 B1 KR 102801138B1 KR 1020217040546 A KR1020217040546 A KR 1020217040546A KR 20217040546 A KR20217040546 A KR 20217040546A KR 102801138 B1 KR102801138 B1 KR 102801138B1
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Abstract

본 발명은 요오드, 유기 용매, 및 물을 혼합하여 수득한 산화 용액을 사용하여 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키는 단계를 포함하는 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 산화 용액은 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 산화시키지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키기에 충분한 시간 동안 숙성되는 것을 특징으로 한다.

Description

변형된 산화 프로토콜을 사용한 올리고뉴클레오티드의 제조 공정
본 발명은 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 단계를 포함하는 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것으로서,
상기 산화는 특정 산화 프로토콜을 따른다.
올리고뉴클레오티드 합성은 원칙적으로 원하는 서열이 조립될 때까지 성장하는 사슬의 5'-말단에 뉴클레오티드 잔기를 단계적으로 첨가하는 것이다.
일반적으로, 각 첨가는 합성 주기라고 하며 원칙적으로 하기의 화학 반응들로 구성된다:
a1) 고체 지지체 상에서 보호된 히드록실기를 블록킹 해제하고;
a2) 활성화된 포스포라미디트로서의 제1 뉴클레오시드를 상기 고체 지지체 상에서 유리 히드록실기와 커플링시키고,
a3) 각각의 P 결합된 뉴클레오시드(포스파이트 트리에스테르)를 산화 또는 황화시켜 각각의 포스포디에스테르(P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트(P=S)를 형성하고;
a4) 선택적으로, 상기 고체 지지체 상에서 임의의 미반응 히드록실기를 캡핑하고;
a5) 상기 고체 지지체에 부착된 제1 뉴클레오시드의 5' 히드록실기를 블로킹 해제하고;
a6) 제2 뉴클레오시드를 활성화된 포스포라미디트로서 커플링하여 각각의 P 결합된 이량체를 형성하고;
a7) 각각의 P 결합된 디뉴클레오티드(포스파이트 트리에스테르)를 산화 또는 황화시켜 각각의 포스포디에스테르(P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트(P=S)를 형성하고;
a8) 선택적으로, 임의의 미반응 5' 히드록실기를 캡핑하며;
a9) 원하는 서열이 조립될 때까지 이전의 단계 a5 내지 a8을 반복한다.
올리고뉴클레오티드 합성의 원리는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다(예컨대, Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis, of March 15, 2016을 참조).
상기 산화 단계는 일반적으로 피리딘 및 물인 유기 용매인 요오드를 포함하는 산화 용액을 이용하여 실시한다.
하지만, 새로 제조된 산화 용액이 적용될 때, 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물이 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로의 원하는 산화가 발생할 뿐만 아니라, 부반응으로서 분자에 존재하는 포스포로티오에이트 뉴클레오티간 결합은 뉴클레오티드 간 결합에서 P=S에서 P=O로의 전환에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는 화학식 II의 화합물 내 포스포디에스테르 결합의 예상보다 더 높은 함량을 유발한다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합에 영향을 미치지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시킬 수 있는 산화 프로토콜을 찾는 것이었다.
본 발명의 목적은 요오드, 유기 용매, 및 물을 혼합하여 수득한 산화 용액을 사용하여 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 단계를 포함하는 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 공정으로서,
상기 산화 용액은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합을 산화시키지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키기에 충분한 시간 동안 숙성되는 것을 특징으로 하는 공정을 통해 달성될 수 있음이 밝혀졌다.
하기의 정의는 본원의 발명을 설명하기 위해 사용된 다양한 용어의 의미 및 범위를 예시하고 정의하기 위해 제시된다.
용어 “C1-6-알킬”은 1 내지 6개의 탄소 원자, 보다 상세한 구현예에서는 1 내지 4개의 탄소 원자의 1가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 지칭한다. 전형적인 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸, 또는 t-부틸, 바람직하게는 메틸 또는 에틸을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 2개 또는 그 이상의 공유 결합된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 규정된다. 치료적으로 가치 있는 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 10 내지 40개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 25개의 뉴클레오티드의 길이를 갖도록 합성된다.
올리고뉴클레오티드는 선택적으로 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 선택적으로 변형된다는 표현은 당 모이어티 또는 핵염기 모이어티에 하나 또는 그 이상의 변형을 도입함으로써 등가 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형됨을 지칭한다.
전형적인 변형은 당 모이어티 또는 잠금 핵산(LNA)에서의 2'-O-(2-메톡시에틸)-치환(2'-MOE) 치환일 수 있고, 이는 리보스 모이어티가 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가 가교를 통해 변형된 변형 RNA 뉴클레오티드이다.
용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 용어 "뉴클레오시드 유사체” 또는 변형된 "단위" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
DNA 또는 RNA 뉴클레오티드는 일반적으로 2개의 뉴클레오티드를 함께 공유결합으로 커플링하는 포스포디에스테르(P=O) 또는 포스포로티오에이트(P=S) 뉴클레오티드 간 결합에 의해 결합된다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 뉴클레오티드 간 결합은 포스포로티오에이트(P=S)로 구성되어야 한다. 따라서, 일부 올리고뉴클레오티드에서 모든 다른 뉴클레오티드 간 결합은 포스포디에스테르(P=O)로 구성될 수 있거나 다른 올리고뉴클레오티드에서는 뉴클레오티드 간 결합의 서열이 가변되고 포스포디에스테르(P=O) 및 포스포로티오에이트(P=S) 뉴클레오티드 간 결합을 모두 포함한다.
따라서, 용어 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 뉴클레오티드 간 결합이 포스포로티오에이트(P=S)로 구성되어야 하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
핵염기 모이어티는 각각의 대응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예컨대 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있고, 각 문자는 등가 기능의 변형된 핵염기를 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 올리고뉴클레오티드에서 핵염기 모이어티는 LNA 뉴클레오시드의 경우 대문자 A, T, G 및 MeC(5-메틸 시토신)로, DNA 뉴클레오시드의 경우 소문자 a, t, g, c 및 MeC로 기재된다. 변형된 핵염기는 tert-부틸페녹시아세틸, 페녹시아세틸, 벤조일, 아세틸, 이소부티릴 또는 디메틸포름아미디노와 같은 보호기를 보유하는 핵염기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다(Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese of March 24, 2016을 참조).
바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 10 내지 40개, 바람직하게는 10 내지 25개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
올리고뉴클레오티드 합성의 원리는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다(예컨대, Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis, of March 15, 2016을 참조).
오늘날 대규모 올리고뉴클레오티드 합성은 컴퓨터 제어 합성기를 사용하여 자동화된 방식으로 실시된다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드 합성은 고체상 합성이며, 조립되는 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 히드록시기를 통해 고체 지지체 물질에 공유 결합되고 사슬 조립의 전체 과정에 걸쳐 부착된 상태로 유지된다. 적합한 지지체는 GE 헬스케어(Healthcare)의 프라이머(Primer) 지지체 5G 또는 키노베이트(Kinovate)의 닛토페이즈(NittoPhase)®HL 지지체와 같은 상업적으로 입수 가능한 거대 다공성 폴리스티렌 지지체이다.
수지로부터의 후속 절단은 농축된 수성 암모니아를 이용해 실시될 수 있다. 인산염 및 뉴클레오티드 염기 상의 보호기도 상기 절단 절차 내에서 제거된다.
개략적으로 상기 설명된 바와 같이, 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 공정은 요오드, 유기 용매 및 물을 혼합함으로써 수득한 산화 용액을 사용하여 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 단계를 포함하고,
상기 산화 용액은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합을 산화시키지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키기에 충분한 시간 동안 숙성되는 것을 특징으로 한다.
상기 혼합된 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합을 포함한다.
상기 산화 용액은 일반적으로 요오드, 유기 용매 및 물을 혼합하여 수득할 수 있는 용액이다.
상기 유기 용매는 피리딘으로부터 또는 C1-6알킬 치환된 피리딘, 예컨대 루티딘으로부터, 하지만 바람직하게는 피리딘으로부터 선택될 수 있다. 테트라히드로푸란과 같은 추가 유기 용매가 존재할 수 있다.
상기 산화 용액은 시그마 알드리치(머크(Merck))로부터, 예컨대 산화제 용액으로서 상업적으로 입수 가능하다. 대안적으로, 상업적으로 입수 가능한 요오드 및 피리딘을 사용하여 신선한 용액을 제조할 수 있다.
피리딘 또는 C1-6알킬 치환된 피리딘 대 물의 부피비는 1:1 내지 20:1, 바람직하게는 5:1 내지 15:의 범위에서 가변될 수 있지만, 더 바람직하게는 9:1일 수 있다.
상기 산화 용액 중 요오드 농도는 10 mM 내지 100 mM의 범위, 더 바람직하게는 20 mM 내지 50 mM의 범위일 수 있다.
최적의 숙성 기간은 상기 산화 용액이 숙성되는 온도에 크게 좌우된다. 숙성 온도가 낮을수록 숙성 기간이 길어지지만, 숙성 온도가 높을수록 숙성 시간이 상당히 단축된다.
상기 산화 용액의 숙성은 20℃ 내지 100℃의 온도에서, 바람직하게는 30℃ 내지 60℃의 온도에서 발생할 수 있음이 밝혀졌다.
상기 산화 용액의 숙성에 필요한 기간은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합을 산화시키지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키기에 충분해야 한다.
일반적으로, 상기 산화 용액은 적어도 1일, 3일, 5일, 10일, 15일 또는 20일 이상의 기간 동안 숙성될 수 있다.
상기 기간은 언급된 바와 같이 숙성 온도에 따라 크게 가변될 수 있으며 30°C 내지 35°C의 숙성 온도에서는 10일 내지 150일 사이, 보다 일반적으로 20일 내지 60일 사이에서 가변될 수 있는 반면, 60°C 내지 65°C의 숙성 온도에서는 1일 내지 30일 사이, 더 일반적으로 2일 내지 15일 사이로 가변될 수 있다.
일반적으로 상기 숙성은 전도도(μS/cm)의 증가 및 pH의 감소와 함께 진행된다. 본 발명의 추가 구현예에서, 본 발명의 공정은 상기 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합을 산화시키지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키기에 충분한 기간을 결정하기 위해 파라미터인 pH 및 전도도를 모니터링하는 단계를 포함한다.
상기 산화 반응에 사용되는 산화제의 양은 1.1 당량 내지 15 당량, 더 바람직하게는 1.5 당량 내지 4.5 당량, 가장 바람직하게는 2 당량 내지 4 당량에서 선택될 수 있다.
일반적으로 산화 반응 온도는 15℃ 내지 27℃, 더 바람직하게는 18℃ 내지 24℃에서 실시된다.
예로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하기로부터 선택될 수 있다:
5′ - Me C S Me U O Me C O A O G STSASAS MeCSASTSTSGSAS MeCS A O Me C O Me C O A S Me C- 3′
밑줄로 강조된 잔기는 2'-MOE 뉴클레오시드이다. 포스포로티오에이트 및 포스페이트 디에스테르 결합의 위치는 각각 S 및 O로 각각 지정된다. 2'-O-(2-메톡시에틸)-5-메틸우리딘(2'-MOE MeU) 뉴클레오시드는 때때로 2'-O-(2-메톡시에틸)리보티미딘(2'-MOE T)으로 지칭되는 것을 유념해야 한다.
본원에 개시된 화합물은 하기의 핵염기 서열을 갖는다:
서열 번호 1: cucagtaacattgacaccac
실시예
실시예 1
5′ - Me C S Me U O Me C O A O G STSASAS MeCS ASTSTSGSAS MeCS A O Me C O Me C O A S Me C- 3′의 합성
올리고뉴클레오티드는 AKTA 올리고파일롯(Oligopilot) 100 및 프라이머 서포트 유니링커(Primer Support Unylinker, 닛토페이즈(NittoPhase) LH 유니링커(Unylinker) 330)를 사용하여 2.20 mmol 규모의 고체상에서 표준 포스포라미디트 화학에 의해 생성하였다. 일반적으로 1.4 당량의 DNA/2'-MOE-포스포르아미디트를 사용하였다. 다른 시약(디클로로아세트산, 1-메틸이미다졸, 4,5-디시아노이미다졸, 아세트산 무수물, 페닐아세틸 디설파이드, 피리딘, 트리에틸아민)은 상업적으로 입수 가능한 공급원으로부터 수령한 그대로 사용하고 적절한 농도의 시약 용액을 제조하였다(하기의 표 1을 참조). 수산화암모늄을 사용하여 절단 및 탈보호를 달성함으로써 조 올리고뉴클레오티드를 생성하였다.
표 1:
표준 시약 용액
블로킹 해제 톨루엔 중 10% 디클로로아세트산(v/v)
포스포라미디트 아세토니트릴 중 0.2 M
NMI/DCI 활성제 아세토니트릴 중 1.0 M 4,5-디시아노이미다졸/0.1 M 1-메틸이미다졸
산화제 피리딘/물 9:1(v/v) 중 0.05 M 요오드; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에서 구입하거나 새로 제조함(예시를 참조)
티올화 3-피콜린/아세토니트릴(1:1 v/v) 중 0.2 M 페닐아세틸 디설파이드
캡 A 1-메틸이미다졸/피리딘/아세토니트릴 2:3:5(v/v/v)
캡 B 아세트산 무수물/아세토니트릴 1:4(v/v)
아민 세척 아세토니트릴 중 50% 트리에틸아민(v/v)
절단 및 탈보호 28-32% 수성 수산화암모늄
실시예 2
산화제 숙성 실험
실시예 2.1
구입한 산화제 용액으로
표 2:
산화제 배치 1 산화제 배치 2
실시예 30-35°C에서의 숙성 시간(d) 총(P=O)1 3 함량(%) 실시예 30-35°C에서의 숙성 시간(d) 총(P=O)1 3 함량(%)
2.1 01 7.8 3.1 01 14.8
2.2 3 3.5 3.2 3 9.3
2.3 6 1.8 3.3 6 4.5
2.4 9 1.7 3.4 9 3.4
2.5 162 4.5 3.5 162 11.6
1 시판 용액의 분취량을 사용 시험용으로 취하고 상기 용액의 나머지에 대한 열처리를 시작한 시점을 나타낸다. 이는 상기 용액의 제조 시간과 동일하지 않다.
2 상기 용액은 30-35°C에서 숙성되지 않았지만 t = 0에서 시작하여 1-15°C에서 보관하였다.
3 질량 분석에서 결정된 원하는 화합물의 분자 질량에 대비하여 16 Da의 질량 차이를 갖는 분자의 백분율, 즉 1 P=S 결합이 P=O 결합으로 변환된 분자의 백분율을 나타낸다.
실시예 2.2
새로 제조한 산화제 용액으로:
a) 요오드 용액의 제조
실온에서 1.00 kg의 물을 8.00 kg의 피리딘에 첨가하였다. 127 g의 요오드를 첨가하였다. 0.827 kg의 피디딘을 첨가하여 헹구고 혼합물을 건조 질소의 양압 하에서 1시간 동안 교반하였다.
b) 요오드 용액의 숙성
· 30-35°C에서의 숙성:
800 mL의 분취량은 사용 시까지 황색 유리병 내에 30-35°C에서 보관하였다.
· 60-65°C에서의 숙성:
재료는 사용 시까지 건조 질소의 양압 하에서 60-65°C의 재킷 유리 반응기 내에 보관하였다.
표 3: (30-35°C에서의 숙성)
30°C 내지 35°C에서 숙성된 산화제 배치
실시예 30-35°C에서의 숙성 시간(d) 총(P=O)1 2 함량(%) pH 전도도(S/cm)
2.6 01 15.0 7.31 186
2.7 9 8.2 6.38 1144
2.8 17 4.3 6.33 1440
2.9 29 2.0 6.21 1576
3.0 59 1.5 6.35 1654
3.1 122 1.2 6.18 1633
표 4 (60°C-65°C에서의 숙성)
60°C 내지 65°C에서 숙성된 산화제 배치
실시예 60-65°C에서의 숙성 시간(d) 총(P=O)1 2 함량(%) pH 전도도(S/cm)
3.2 01 15.0 7.31 186
3.3 1 8.3 6.34 1215
3.4 3 1.5 6.21 1718
3.5 10 1.3 6.18 1970
3.6 30 1.2 6.09 2144
1 용액의 제조가 완료된 시점을 나타낸다.
2 질량 분석에서 결정된 원하는 화합물의 분자 질량에 대비하여 16 Da의 질량 차이를 갖는 분자의 백분율, 즉 1 P=S 결합이 P=O 결합으로 변환된 분자의 백분율을 나타낸다.
<110> F.Hoffmann-La Roche Ltd. F.Hoffmann-La Roche Ltd. <120> Process for the preparation of oligonucleotides using modified oxidation protocol <130> P35593-WO <150> EP19179310.8 <151> 2019-06-11 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Oligonucleotide <400> 1 cucagtaaca ttgacaccac 20

Claims (10)

  1. 요오드, 유기 용매, 및 물을 혼합하여 수득한 산화 용액을 사용하여 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 단계를 포함하는 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 공정으로서,

    상기 산화 용액은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합을 산화시키지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키기 위해, 적어도 1일, 3일, 5일, 10일, 15일 또는 20일 이상의 기간 동안, 30℃ 내지 100℃의 온도, 또는 30℃ 내지 60℃의 온도에서 숙성되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유기 용매는 피리딘 또는 C1-6알킬 치환된 피리딘인, 공정.
  3. 제2항에 있어서,
    피리딘 또는 C1-6알킬 치환된 피리딘 대 물의 부피비는 1:1 내지 20:1인, 공정.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 산화 용액 중 요오드 농도는 10 mM 내지 100 mM인, 공정.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 공정은 상기 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합을 산화시키지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키기 위한 산화 용액의 숙성 기간을 결정하기 위해 pH 및 전도도를 모니터링하는 단계를 포함하는, 공정.
  8. 제1항에 있어서,
    산화 반응에 사용되는 산화제의 양은 1.1 당량 내지 15 당량에서 선택되는, 공정.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 산화 반응을 위한 반응 온도는 15℃ 내지 27℃에서 선택되는, 공정.
  10. 제1항 내지 제4항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 10 내지 40개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 공정.
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