KR102801096B1 - 비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노 구조체의 체외 용출 특성 평가 방법 - Google Patents
비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노 구조체의 체외 용출 특성 평가 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에 의한 비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법은 구연산, 산 및 염기를 혼합하여 구연산 완충용액을 제조하는 제 1단계; 및 상기 구연산 완충용액에 비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체를 침지하여 용출을 수행하는 제 2단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노 구조체의 체외 용출 특성 평가 방법에 관한 것이다.
인간의 수명이 늘어남에 따른 골 질환 환자의 증가로 골 재생 및 골 대체를 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이에 따라 골 질환을 치료할 수 있는 생체 세라믹스 중 하나인 하이드록시아파타이트에 대한 관심이 증대되었다. 하이드록시아파타이트는 인간의 골과 무기화학적 성분이 비슷하고 부작용도 거의 없어 골과의 결합성이 좋아 생체적합성이 뛰어난 대표적인 재료이다. 하지만 인체 내에서 골과 융합되어 활용되기 위해서는 생체활성과 생체흡수성 또한 높아야 하는데, 하이드록시아파타이트는 이에 해당되지 않는다. 일반적으로 합성되는 하이드록시아파타이트는 하소 과정에서 받는 열로 인해 단단한 결정질로 변화하면서 강도, 내열성 등의 물리화학적 특성이 우수해지지만 생체활성과 생체흡수성이 떨어지게 된다. 그렇기 때문에 최근의 생체 재료 연구는 하소 과정 없이 합성되어 생체활성과 생체흡수성이 높은 비하소 하이드록시아파타이트로 진행되고 있다.
비하소 하이드록시아파타이트를 포함한 생체흡수성 물질 개발은 현재 새로운 과제로 자리잡아 진행되고 있지만, 생체흡수성 물질 자체는 오래 전부터 연구되어 왔다. 처음으로 보고된 생체흡수성 물질은 Single homopolymer로 구성된 것으로, 대표적으로 Polyglycolic acid (PGA)와 Poly-L-lactic acid (PLLA)가 있다. 이는 임상에서 사용된 최초의 생분해성 고분자로 기계적 특성이 뛰어났지만 분해 속도가 지나치게 빠르거나 느리고 산성 분해에 의한 생성물 형성과 용해성 제한으로 인해 부작용에 대한 위험이 있었다. 더하여 이 두 물질은 골 전도 및 골 결합 능력과 같은 생체활성 특성이 없어 인체 내에서의 사용이 매우 어려워 이러한 단점을 해결하기 위해 Particle/organic polymers 복합체가 만들어졌다.
이렇게 만들어진 물질은 비하소 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2)/PLLA) 복합체였으며, 생체흡수성 골 고정 장치 생산에 주로 사용되었다. 이 물질은 많은 연구에서 생체흡수성과 생체 적합성을 가지면서 기계적 강도가 높고 생체활성 특성을 가진 것으로 나타났다. 비하소 하이드록시아파타이트/PLLA 복합체는 동물 연구를 통해 PLLA 소재에 없는 골 전도성을 가지고 있으며, 골 고정 장치에 필요한 물리적 강도를 만족하였고 골 재생에 충분한 강도를 유지할 수 있음의 결과를 나타냈는데, 이것은 비하소 하이드록시아파타이트가 복합되면서 나타난 특성으로 판단되었다. 하지만 일반적으로 합성되는 비하소 하이드록시아파타이트는 침상형의 모양으로 인해 PLLA와 복합화된 후 Particle과 Polymer 사이의 큰 경계에서 시작되는 변형으로 인해 쉽게 파괴되었으며, 실제로 비하소 하이드록시아파타이트/PLLA 복합체로 만들어진 장치를 이식받은 환자에게 일부 생성물이 생성되어 수술 경과 2년 후 물질과의 염증 반응이 일어나 또 다른 문제점이 야기되었다. 이것은 비하소 하이드록시아파타이트가 가진 침상형의 형상 특성으로 인해 Polymer와 맞닿는 표면이 넓어 힘을 받는 면적도 커 파괴에 대한 원인이 되며, 이식된 후 물질이 분해될 때 그 과정에서 새로운 생성물이 생성되고, 물질이 인체 내에 오랜 시간 남아 있는 경우 부작용의 위험이 크다는 것을 의미한다. 따라서 생체 적합성 및 생체활성을 가진 생체흡수성 물질인 비하소 하이드록시아파타이트를 구형 나노구조체로 제조해 그에 대한 용출 및 분해 관련 연구가 필요하다.
본 발명의 목적은 비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 체외 용출 특성을 평가하여, 인체에 적용 시 분해 및 흡수 성능을 예측할 수 있는 비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법은 구연산 및 산 염기를 혼합하여 구연산 완충용액을 제조하는 제 1단계; 및 상기 구연산 완충용액에 하이드록시아파타이트를 침지하여 용출을 수행하는 제 2단계;를 포함하며, 상기 구연산 완충용액은 pH가 2.5 내지 4 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 제 1단계는 구연산과 염기를 혼합하여 구연산 수용액을 제조하는 구연산 수용액 제조단계; 및
산 수용액에 상기 구연산 수용액을 첨가하는 완충용액 제조단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 구연산 수용액은 1L 당 구연산 18 내지 25 g을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 염기는 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화마그네슘에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 구연산 수용액은 1L 당 염기를 0.05 내지 0.4 몰 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 산 수용액은 황산, 염산, 질산 및 인산에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 산 수용액은 농도가 0.05 내지 0.25 M인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 제 2단계는 35 내지 38.5 ℃를 유지하면서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 제 2단계는 1 내지 5 Hz로 용기를 상하 또는 원 운동하면서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 제 2단계를 4 내지 30일간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법은 상기 제 2단계 후, 고형분 및 여액을 분리하는 제 3단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 제 3단계는 원심분리를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 제 3단계 후, 상기 여액의 칼슘 및 인 농도를 분석하는 제 4단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가방법은 구연산, 산 및 염기를 혼합하여 구연산 완충용액을 제조하는 제 1단계; 및 상기 구연산 완충용액에 하이드록시아파타이트를 침지하여 용출을 수행하는 제 2단계;를 포함하며, 상기 구연산 완충용액은 pH가 2.5 내지 4인 것을 특징으로 하여, 보다 가혹한 조건에서 하이드록시아파타이트의 용출 특성을 평가하여 생체 흡수성 물질로 활용 가능한 하이드록시아파타이트를 빠르게 선별할 수 있는 장점이 있다.
도 1 및 2는 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자에 대한 완충용액에서 용출실험을 수행하고, 시간 경과에 따른 중량 변화 및 입자형상 변화를 관찰하고 이를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자에 대한 완충용액에서 용출실험 후 여액을 분석하고 그 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자에 대한 완충용액에서 용출실험 전후 XRD 피크를 분석하고 이를 도시한 것이며, 도 5는 이에 따른 결정화도 변화를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자에 대한 완충용액에서 용출실험에서 용출 시간에 따른 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 비하소 하이드록시아파타이트에서 용출 20일차 원소 분석 결과를 도시한 것이다.
도 8는 하소 하이드록시아파타이트에서 용출 20일차 원소 분석 결과를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트를 SEM 및 TEM으로 관찰하고 그 결과를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 응집체의 입경 분포를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자를 XRD 회절 피크를 통해 관찰하고 그 결과를 도시한 것이며, 도 12는 XRD 결과에 따른 결정화도를 계산하고 이를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자에 대한 완충용액에서 용출실험 후 여액을 분석하고 그 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자에 대한 완충용액에서 용출실험 전후 XRD 피크를 분석하고 이를 도시한 것이며, 도 5는 이에 따른 결정화도 변화를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자에 대한 완충용액에서 용출실험에서 용출 시간에 따른 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 비하소 하이드록시아파타이트에서 용출 20일차 원소 분석 결과를 도시한 것이다.
도 8는 하소 하이드록시아파타이트에서 용출 20일차 원소 분석 결과를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트를 SEM 및 TEM으로 관찰하고 그 결과를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 응집체의 입경 분포를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트 입자 및 하소 하이드록시아파타이트 입자를 XRD 회절 피크를 통해 관찰하고 그 결과를 도시한 것이며, 도 12는 XRD 결과에 따른 결정화도를 계산하고 이를 도시한 것이다.
본 발명의 실시예들에 대한 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명의 실시예들을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명의 실시예에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
종래 하이드록시아파타이트의 생체흡수성 평가는 하이드록시아파타이트 단독이 아닌 하이드록시아파타이트-고분자 복합체를 기준으로 한 것이 일반적이다. 또한, 체 내에 이식되는 재료로 활용되어 생체 내 환경과 동일한 pH 7.4에서 주로 모의 평가를 진행하였다. 하지만 의료 산업에서 사용되는 재료의 용출 및 분해 환경은 활용도에 따라 서로 다르기 때문에 극한의 환경 조건에 노출되었을 때의 용출 특성 평가가 필요하고, 용출 및 분해 과정에서 형성되는 생성물에 의한 부작용에 대한 검토가 필요하므로, 극한의 환경에 노출된 경우 하이드록시아파타이트의 용출 특성 평가가 필요한 실정이다.
이에, 본 발명에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법은 구연산, 산 및 염기를 혼합하여 구연산 완충용액을 제조하는 제 1단계;
상기 구연산 완충용액에 하이드록시아파타이트를 침지하여 용출을 수행하는 제 2단계;를 포함하며,
상기 구연산 완충용액은 pH가 2.5 내지 4인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법은 상술한 pH를 만족하는 완충용액을 이용하여 용출 특성을 평가함으로써, 빠른 속도로 생체 흡수성을 판별할 수 있는 장점이 있다.
구체적으로, 상기 구연산 완충용액은 pH가 2.5 내지 4, 좋게는 2.7 내지 3.3일 수 있으며, 이러한 범위의 구연산 완충용액을 이용함으로써 지나치게 낮은 pH에 의해 용출 특성 평가에 영향을 주는 것을 예방하고 가혹한 조건에서 빠르게 생체흡수성을 판별할 수 있는 장점이 있다.
상기 제 1단계는 구연산과 염기를 혼합하여 구연산 수용액을 제조하는 구연산 수용액 제조단계; 및
산 수용액에 상기 구연산 수용액을 첨가하는 완충용액 제조단계;를 포함한다.
상기 구연산 수용액은 1L 당 구연산 18 내지 25 g, 좋게는 19 내지 24 g 포함할 수 있으며, 구연산 수용액의 첨가량이 낮은 경우 구연산 완충용액의 pH 제어가 어렵고, 구연산 수용액의 첨가량이 높은 경우 용출특성 평가에 영향을 줄 수 있다.
상기 염기는 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화마그네슘에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있으며, 상기 구연산 수용액은 1L 당 염기를 0.05 내지 0.4 몰, 구체적으로 0.1 내지 0.3몰 포함할 수 있다. 염기의 함량이 낮은 경우 완충 특성이 나타나기 어려우며, 염기의 함량이 높은 경우 pH 조절이 어려워질 수 있다.
상기 산 수용액은 황산, 염산, 질산 및 인산에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있으며, 농도가 0.05 내지 0.25 M, 구체적으로 0.07 내지 0.15 M일 수 있다. 산 수용액의 농도가 낮거나 높은 경우 구연산 완충용액의 완충 효과가 낮아지거나, 하이드록시아파타이트의 용출 특성에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법에서 상기 제 2단계는 상기 완충용액 1 L 당 30 내지 60 g, 구체적으로 35 내지 55 g의 하이드록시아파타이트를 침지하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 침지되는 하이드록시아파타이트의 양이 적은 경우 용출 특성 평가 효율이 낮아질 수 있고, 침지되는 하이드록시아파타이트의 양이 많은 경우 용출 특성 평가의 정확도가 낮아질 수 있다.
또한 상기 제 2단계는 35 내지 38.5 ℃, 구체적으로 36 내지 38 ℃를 유지하면서 수행할 수 있으며, 인체와 유사한 온도에서 용출 특성을 평가함으로써, 특성 평가의 신뢰성을 더욱 높일 수 있다.
상기 제 2단계는 상기 구연산 완충용액 및 하이드록시아파타이트가 침지된 용기를 1 내지 5 Hz, 구체적으로 1.5 내지 4 Hz로 원 운동 또는 상하 운동 하면서 수행될 수 있으며, 이를 통하여 구연산 완충용액의 균일도를 확보하여 보다 정확하게 생체 흡수성을 판별할 수 있는 장점이 있다.
상기 제 2단계는 4 내지 30일, 구체적으로 2 내지 25일간 수행될 수 있으며, 제 2단계를 단시간 수행하는 경우 용출 특성 평가의 정확도를 확보하기 어려우며, 제 2단계를 장시간 수행하는 경우 하이드록시아파타이트의 재흡수가 발생하여 용출 특성 평가의 정확도가 낮아질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법은 상기 제 2단계 후, 고형분 및 여액을 분리하는 제 3단계를 포함할 수 있으며, 이러한 고형분의 분리는 좋게는 원심분리를 이용할 수 있다.
상기 제 3단계 후, 상기 여액의 칼슘 및 인 농도를 분석하는 제 4단계를 포함할 수 있으며, 여액의 칼슘 및 인 농도를 분석함으로써 용출 특성을 평가할 수 있다.
구체적으로, 상기 여액의 칼슘 및 인 농도는 유도결합 플라즈마 분광 분석기(ICP-OES, Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy)를 이용할 수 있다.
좋게는, 본 발명의 일 실시예에 의한 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 용출 특성 평가 방법으로 20일간 침지 후, 인 방출량이 1L 당 40,000 내지 58,000 ㎎ 이상, 구체적으로 45,000 내지 55,000 ㎎인 경우 인체 적용시 빠르게 분해되어 부작용을 예방할 수 있으며, 지나치게 빠르게 흡수되어 인체 내에서 보강 등의 역할을 충분히 수행하기 전에 흡수되는 문제를 예방할 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 인 방출량을 만족하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법은 1L당 칼슘 전구체가 0.04 내지 0.085몰, 좋게는 0.05 내지 0.075몰, 더욱 좋게는 0.058 내지 0.072몰 포함된 칼슘 전구체 수용액; 및 1L당 인산염 전구체가 0.03 내지 0.08몰, 좋게는 0.04 내지 0.065몰, 더욱 좋게는 0.045 내지 0.06몰 포함된 인산염 전구체 수용액;을 준비하는 제 1단계;
상기 칼슘 전구체 수용액에 인산염 전구체 수용액을 투입하여 혼합용액을 제조하는 제 2단계; 및
상기 혼합용액에 수산화암모늄 수용액을 투입하는 제 3단계;를 포함한다.
본 발명에 의한 골 흡수성이 향상된 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법은 상술한 제조방법을 이용함으로써 간단한 방법으로 체내 용출특성이 우수한 비하소 하이드록시아파타이트를 제조할 수 있는 장점이 있다.
상기 제 1단계의 칼슘 전구체 수용액 및 인산염 전구체 수용액이 상술한 농도 범위를 만족함으로써, 생성되는 비하소 하이드록시아파타이트 응집체의 입경이 지나치게 커지는 것을 방지하고, 규칙적인 입도 분포를 갖는 하이드록시아파타이트를 제조할 수 있는 장점이 있다.
칼슘 전구체 수용액 또는 인산염 전구체 수용액의 농도가 상술한 범위보다 낮을 경우 하이드록시아파타이트 제조 효율이 현저히 저하될 수 있으며, 칼슘 전구체 수용액 또는 인산염 전구체 수용액의 농도가 상술한 범위보다 높은 경우 불규칙한 형상이 생성되거나 지나치게 입경이 큰 하이드록시아파타이트 응집체를 형성하는 문제가 발생할 수 있다.
상기 제 2단계에서 칼슘 전구체 수용액 : 인산염 전구체 수용액의 부피비는 1:0.8 내지 1.5, 구체적으로 1:0.9 내지 1.2일 수 있으며, 이러한 범위를 만족함으로써 하이드록시아파타이트의 생성 효율을 높이면서도 부생성물의 생성을 예방할 수 있다.
상기 제 2단계는 상기 칼슘 전구체 수용액에 상기 인산염 전구체 수용액을 소량씩 나누어 투입하는 단계일 수 있으며, 구체적으로 상기 인산염 전구체 수용액을 시간당 0.6 내지 1 L 속도로 나누어 투입할 수 있다. 이러한 투입속도를 통하여 지나치게 큰 응집체의 형성을 예방하면서도 지나친 생산 효율 저하 없이 비하소 하이드록시아파타이트를 제조할 수 있는 장점이 있다.
상기 수산화 암모늄 수용액은 농도가 25 내지 33 중량%, 구체적으로 26 내지 30 중량%인 것을 이용할 수 있으며, 상기 수산화암모늄 수용액은 상기 칼슘 전구체 1 L 당 120 내지 350 ㎖, 구체적으로 200 내지 300 ㎖ 투입될 수 있다.
상기 제 3단계 또한 수산화암모늄 수용액을 일정한 속도로 나누어 투입할 수 있으며, 구체적으로 시간당 0.3 내지 0.6 L의 속도로 수산화암모늄 수용액을 나누어 투입할 수 있다.
상기 칼슘 전구체는 염화칼슘, 질산칼슘, 황산칼슘, 초산칼슘 및 이들의 수화물에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 질산칼슘 또는 질산칼슘 수화물을 이용할 수 있다.
상기 인산염 전구체는 인산암모늄, 인산2수소암모늄, 인산리튬, 인산철, 인산, 인산화물 및 인산수소2암모늄에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있으며, 좋게는 인산 암모늄, 인산2수소암모늄 및 인산수소2암모늄에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 골 흡수성이 향상된 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법은 상기 3단계 이후 고형분을 분리하는 제 4단계를 포함할 수 있으며, 분리된 고형분을 분쇄하는 제 5단계를 포함할 수 있다. 이때 상기 제 4단계는 필터 등의 고형분 분리방법을 이용할 수 있으나 본 발명이 이에 제한되지 않으며, 상기 제 5단계는 막자사발, 밀링, 믹서 등의 분쇄방법을 이용할 수 있으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 비하소 하이드록시아파타이트는 독특한 용출특성을 갖는 장점이 있으며, 용출특성이 우수하여 골 흡수성이 뛰어난 특징이 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법으로 제조된 비하소 하이드록시아파타이트는 응집체의 평균 입경이 10 내지 100 ㎛이며, 응집체에 포함된 단일 입자의 평균 입경이 60 ㎚ 이하인 것을 특징으로 한다. 상기 비하소 하이드록시아파타이트는 비하소로 제조되며 체내 용출 특성이 우수한 장점이 있다.
구체적으로, 상기 비하소 하이드록시아파타이트 입자는 응집체의 평균 입경이 10 내지 50 ㎛, 더욱 좋게는 15 내지 40 ㎛이며, 단일입자의 평균 입경이 10 내지 50 ㎚, 15 내지 40 ㎚일 수 있다. 또한, 상기 단일입자는 침상형이 아닌 구 형상으로 이때, 응집체의 평균 입경은 SEM(Scanning Electron Microscope)을 통해 관찰된 입자크기를 기준으로 할 수 있으며, 단일입자의 평균 입경은 TEM(Transmission Electron Microscope)을 통해 관찰된 입자크기를 기준으로 할 수 있다.
상기 비하소 하이드록시아파타이트는 상술한 입경범위를 만족함으로써 체내 용출 특성이 우수하며, 골 대체재로 활용이 용이한 장점이 있다.
또한 상기 비하소 하이드록시아파타이트는 결정화도가 80 내지 90%, 좋게는 82 내지 87% 일 수 있다. 이때 결정화도는 XRD(X-ray Diffraction) 피크를 통해 분석된 것일 수 있으며, 본 발명에 의한 비하소 하이드록시아파타이트는 하소를 통하여 결정성 상승히 발생하지 않은 바 상술한 결정화도를 만족하는 특징이 있다.
상기 비하소 하이드록시아파타이트는 Ca/P 몰비율이 1.3 내지 1.6, 좋게는 1.35 내지 1.55, 더욱 구체적으로 1.4 내지 1.5인 특징이 있으며, 이러한 범위를 만족하여 골 대체재의 칼슘 및 인 범위를 만족할 뿐만 아니라 우수한 용출 특성을 나타내는 장점이 있다.
상기비하소 하이드록시아파타이트는 pH 3인 구연산 완충용액 실험을 기준으로, 2일간 용출한 경우 초기 중량 대비 용출 이후 중량이 82 내지 90%, 구체적으로 84 내지 86% 일 수 있다. 반면, 동일 조건으로 제조되나 하소를 거친 하이드록시아파타이트 입자의 경우 동일 조건에서 2일간 용출하더라도 용출 이후 중량이 90 내지 94%로, 본 발명의 비하소 하이드록시아파타이트와 다른 거동을 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에 의한 비하소 하이드록시아파타이트는 상술한 용출 시간이 경과함에 따라 중량이 점점 증가하며, 이는 침상형의 새로운 생성물을 형성하며, 10일간 용출한 이후 초기 중량 대비 88 내지 94%, 구체적으로는 90 내지 94%일 수 있다.
또한, 상기 비하소 하이드록시아파타이트는 완충용액에서 4일간 용출한 이후 결정화도가 64 내지 72%, 구체적으로 66 내지 70%일 수 있으며, 초기 대비 낮은 결정화도를 바탕으로 침상형의 생성물이 결정성을 띠지 않음을 확인할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 구체적으로 설명한다. 아래 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 아래 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
용출특성 평가용 샘플 제조
[비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체의 제조]
증류수 40 L에 질산칼슘 사수화물 6.093 kg을 완전히 용해시켜 칼슘 전구체 수용액을 제조한다. 이와 별개로 증류수 40 L에 제이인산암모늄 2.641 kg을 용해시켜 인산염 전구체 수용액을 제조한다.
제조된 칼슘 전구체 수용액을 교반하는 동안 칼슘 전구체 수용액에 인산염 전구체 수용액을 48시간 동안 균일하게 투입하여 혼합용액을 제조하였다. 제조된 혼합용액에 28 중량% 암모니아수 10 L를 24시간 동안 균일하게 투입하여 반응을 수행하였다.
암모니아수 투입이 완료되면 48시간 동안 교반을 지속하며, 교반이 끝난 후 24시간 동안 방치하였다. 제조된 합성물을 증류수로 3번 세척하고, 80 ℃에서 6시간 동안 완전히 건조시켰으며, 건조된 합성물을 막자사발로 곱게 갈아 비하소 하이드록시아파타이트 구형 나노구조체를 제조하였다.
[하소 하이드록시아파타이트의 제조]
제조된 비하소 하이드록시아파타이트를 900 ℃에서 2시간 동안 하소하여 하소 하이드록시아파타이트를 제조하였다.
체외 용출 특성 평가
1. 완충용액의 제조
증류수 500 ㎖에 구연산 21 g을 용해시키고, 1M의 수산화나트륨 수용액 200 ㎖을 첨가한다. 이후, 총 용량이 1000 ㎖이 될 때 까지 증류수를 첨가하여 구연산 용액을 제조하였다. 제조된 구연산 용액을 덜어 0.1 M 염산 용액을 pH 3이 될 때 까지 투입하여 완충용액을 제조하였다.
2. 체외 용출 평가
제조된 하소 및 비하소 하이드록시아파타이트 입자를 막자사발과 공이로 곱게 갈아낸 후, 100 ℃에서 6시간 이상 건조하여 수분을 완전히 제거하였다. 건조한 하이드록시아파타이트를 튜브에 2 g 투입하고 분해 전 최초 무게를 측정하였다. 하이드록시아파타이트가 튜입된 튜브에 완충용액 40 ㎖을 첨가하고 튜브 마개를 닫았다. 이때 투입된 하이드록시아파타이트는 완충용액에 완전히 잠길 수 있도록 하였다.
상기 튜브는 온도가 37 ℃로 유지되는 환경에서 상하 또는 원운동을 2 Hz 주기로 수행하여 20일간 방치하였으며, 20일 간의 용출이 끝난 뒤 상온으로 냉각하고 원심분리기를 이용하여 완충용액을 분리한다.
완충용액이 제거된 튜브를 증류수로 여러번 씻어낸 뒤, 80 ℃에서 완전히 건조시킨 뒤 무게를 측정하여 초기 무게와 대비하였다.
도 1 및 2는 시간 경과에 따른 중량 변화 및 입자 형상을 관찰하고 이를 도시한 것이다. 도 1에서 중량 변화는 (최초의 무게)/(분해 후 건조 무게)×100으로 계산한 것이다.
도 1를 참고하면, 체외 용출시험 2일차에 실시예 및 비교예 모두 중량이 급격히 낮아진 것을 확인할 수 있으며, 비하소 하이드록시아파타이트가 하소 하이드록시아파타이트와 대비하여 중량이 6% 더 낮아진 것을 확인할 수 있다. 이를 통하여 비하소 하이드록시아파타이트가 더 용출이 많이 일어나는 것을 확인할 수 있다. 이는 하소 과정에서 하이드록시아파타이트의 결합력이 강해져 분해속도가 떨어지는 것으로 볼 수 있다.
또한 시간이 지남에 따라 하소 및 비하소 하이드록시아파타이트 모두 중량이 점점 증가하는 것을 확인할 수 있다. 10일차 이후 비하소 하이드록시아파타이트는 더 이상 중량이 거의 증가하지 않았으나, 하소 하이드록시아파타이트의 경우 계속하여 중량이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
도 3은 유도결합 플라즈마 분광 분석기(ICP-OES, Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy)를 이용하여 여액의 원소 함량을 분석하고 그 결과를 도시한 것이다. 도 3을 참고하면 2일차 여액에서 칼슘 원소 함량은 비하소 하이드록시아파타이트가 하소 하이드록시아파타이트보다 적었으나, 인 원소 함량은 더 많았다. 도 5에서 비하소 하이드록시아파타이트의 분해속도가 더 빠른 것을 확인하였으나, 칼슘 이온 함량 결과는 반대로 나타났으며, 이는 하이드록시아파타이트의 용출 및 분해 메커니즘과 함께 설명할 수 있다.
1단계) Ca5(PO4)3OH (s) + H+ (aq) ↔ Ca5(PO4)3(H2O)+ (s)
2단계) 2Ca5(PO4)3(H2O)+ (s) ↔ 3Ca3(PO4)2 (s) + Ca2+ (aq) + 2H2O (aq)
3단계) Ca3(PO4)2 (s) + 2H+ (aq) ↔ Ca2+ (aq) + 2CaHPO4 (s)
4단계) CaHPO4 (s) + H+ (aq) ↔ Ca2+ (aq) + H2PO4 - (aq)
5단계) CaHPO4 (s) + H+ (aq) ↔ Ca2+ (aq) + H2PO4 2- (aq)
하이드록시아파타이트가 완충용액과 접촉하였을 때 위의 메커니즘에서 2단계를 보면 칼슘 이온이 먼저 용출되고, 이후에 인 이온이 용출된다. 비하소가 하소보다 분해속도가 더 빠르다면 상대적으로 비하소에서 용출되는 칼슘 이온이 더 많을 것이다. 하지만 도 2의 2일차에서 보면 비하소 하이드록시아파타이트가 침상형의 새로운 생성물을 다수 형성하는 것을 확인할 수 있으며, 이를 바탕으로, 용출되는 칼슘 이온이 더 많음에도 불구하고 침상형의 새로운 생성물 형성 속도는 비하소가 훨씬 빠른 것으로 볼 수 있다. 도 3의 10일차에서 하소 하이드록시아파타이트의 칼슘 이온 함량 감소폭이 점점 줄어들어 하소와 비하소의 함량이 유사해 지는 것으로 보아 20일차에 형성된 생성물의 양은 하소와 비하소가 유사하다고 볼 수 있다.
용출에 따른 결정성 확인
도 4는 실시예와 비교예의 하이드록시아파타이트의 용출 전 및 후 XRD 패턴을 도시한 것이다. 도 4에서 0일차와 20일차의 회절 패턴을 비교한 결과 20일차에서 새로운 피크가 발견되었다. 도 4는 용출 시간 경과에 따른 결정화도를 측정하고 이를 도시한 것이다. 도 4에서 하소의 경우 C10H16CaO4H2O, CaH2, P가 각각 5°에서의 (100), 29°에서의 (100), 45°에서의 (111)에서 나타났고, 비하소의 경우 C10H16CaO4H2O, PO2, Ca10(PO4)6CO3, CaO가 각각 5°에서의 (100), 17°에서의 (11-1), 23°에서의 (211), 37°에서의 (200)에서 나타났다. 상기에 서술한 용출 및 분해 메커니즘에 의해 P 원소가 함유된 생성물은 완전한 분해 전에 나타날 수 있으며, 이 결과는 도 2에서 관찰된 새로운 생성물에 Ca 원소가 함유되어 있음을 예상할 수 있다. 도 5는 용출 시간 경과에 따른 결정화도를 분석하고 이를 도시한 것이며, 하소 및 비하소 하이드록시아파타이트 모두 시간 경과에 따라 결정화도가 낮아지며, 특히 비하소 하이드록시아파타이트의 경우 4일 이후 70% 이하의 결정화도를 유지하는 것을 확인할 수 있다.
도 6은 용출 시간에 따른 하이드록시아파타이트의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다. 하소 및 비하소 하이드록시아파타이트 둘 다 1590, 1420 cm-1에서 새로운 피크가 나타났지만, 비하소의 경우 1310 cm-1에서 C-O 결합이 추가적으로 발견되었다. 이것은 도 6에서 발견된 새로운 피크와 상관이 있으며, 하소는 10일차부터 생성되었고 비하소는 2일차부터 생성된 것으로 보아 분해 속도와 형성 속도는 비하소가 하소보다 더 빠른 것으로 볼 수 있다.
도 7 및 8은 하소 및 비하소 하이드록시아파타이트에서 용출 20일차 원자 함량 그래프 및 결과를 도시한 것이며, 형상에서 Map은 보여지는 사진의 전체, Point 1은 하이드록시아파타이트의 한 부분, Point 2는 침상형의 새로운 생성물의 한 부분에 대한 원소함량 결과이다.
도 7 및 8에서 하소 및 비하소 하이드록시아파타이트 모두 산소, 칼슘 및 인 원소가 발견되었고, Map 및 Point2의 결과에서 각각의 원소 함량은 유사한 것을 확인할 수 있다. 하지만 Point 1에서 하소 및 비하소 하이드록시아파타이트 모두 인 원소가 없거나 미량으로 나타났으며, 산소와 칼슘 원소가 발견되었으나, 칼슘 원소 함량의 경우 비하소가 훨씬 높은 것으로 나타났으며, 이 결과는 앞서 관찰된 새로운 생성물이 칼슘을 함유하고 있는 점을 감안하면, 비하소 하이드록시아파타이트가 더 많은 칼슘 이온 용출 및 새로운 물질을 생성하는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통하여 비하소 하이드록시아파타이트가 분해 속도와 분해율, 흡수성이 높다고 볼 수 있다.
입자 형상 확인
도 9는 비하소 하이드록시아파타이트 및 하소 하이드록시아파타이트를 SEM 및 TEM으로 관찰하고 그 결과를 도시한 것이다. 도 9에서 큰 사진은 SEM 분석결과이며, 작은 사진은 TEM 분석 결과이다. 또한 도 10은 도 9의 하이드록시아파타이트 응집체의 입경 분포를 도시한 것이다.
도 9 및 10을 참고하면, SEM으로 관찰할 수 있는 응집체 입자의 크기는 하소 하이드록시아파타이트가 5 ㎛ 이하인 것을 확인할 수 있으며, 반면에 비하소 하이드록시아파타이트의 응집체 입자 크기는 10 내지 50 ㎛ 수준인 것을 확인할 수 있으며, 이를 통하여 하소 하이드록시아파타이트의 응집체 입자가 더 큰 것을 알 수 있다. 이는 하소 과정에서 발생하는 입자의 수축으로 인한 것으로 판단된다. 또한 도 2를 참고하면 비하소 하이드록시아파타이트가 더욱 균일한 입자분포를 갖는 것을 확인할 수 있다.
반면, 도 9의 TEM 사진을 관찰하면, 응집체를 구성하는 개별 입자의 크기는 하소 하이드록시아파타이트가 70 내지 250 ㎚ 이며, 비하소 하이드록시 아파타아트의 경우 개별 입자의 평균 크기가 5 내지 60 ㎚인 것을 확인할 수 있으며, 또한 비하소 하이드록시아파타이트의 경우 구 형상을 갖는 것을 확인할 수 있다.
결정성 확인
도 11은 실시예 및 비교예에 의한 하이드록시아파타이트의 결정성을 XRD를 통해 분석하고, 이를 JCPDS#01-080-6199와 대비한 것이며, 도 12는 XRD 분석을 바탕으로 결정화도를 분석하고 그 결과를 도시한 것이다. 이때 결정화도는 Y축 20 내지 40° 사이에서 {결정의 적분강도/[결정의 적분강도 + 비정질의 적분강도]}×100으로 계산하였다.
도 3을 참고하면, 두 합성물 모두 주 피크 (121), (202) 및 (300)을 가지는 JCPDS#01-080-6199 즉 하이드록시아파타이트 단일상으로 나타나 완전한 하이드록시아파타이트가 합성되었다고 볼 수 있다. 도 4에서 보는 바와 같이 비하소 하이드록시아파타이트의 결정화도가 낮으므로, XRD 결과에서 비하소 하이드록시아파타이트가 보다 완만한 피크가 나타난 것을 확인할 수 있다.
원소분석
유도결합 플라즈마 분광 분석기를 이용하여 비교예 및 실시예에서 제조한 하이드록시아파타이트의 칼슘과 인 비율을 분석하고 그 결과를 표 1로 나타내었다.
| Ca(중량%) | P(중량%) | Ca/P 몰비율 | |
| 실시예 | 41.18 | 21.78 | 1.46 |
| 비교예 | 42.51 | 19.85 | 1.66 |
표 1을 참고하면, 칼슘 원소의 경우 하소 후 1.33 중량% 증가하였으며, 인 원소의 경우 하소로 1.93 중량% 감소하여 Ca/P 몰비율이 하소의 경우 1.66으로 나타났으며, 비하소의 경우 1.46으로 계산되었다. 두 샘플 모두 골 대체재로 사용되는 인산칼슘계 세라믹스의 Ca/P 비율인 1.4 내지 1.7을 만족하는 것을 확인할 수 있다.
Claims (14)
1L당 칼슘 전구체가 0.04 내지 0.085몰 포함된 칼슘 전구체 수용액; 및 1L당 인산염 전구체가 0.03 내지 0.08몰 포함된 인산염 전구체 수용액;을 준비하는 제 1단계;
상기 칼슘 전구체 수용액에 인산염 전구체 수용액을 투입하여 혼합용액을 제조하는 제 2단계; 및
상기 혼합용액에 수산화암모늄 수용액을 투입하는 제 3단계;를 포함하며,
상기 제 1단계 내지 제 3단계로 제조된 비하소 하이드록시아파타이트는 응집체의 평균 입경이 10 내지 100 ㎛이며, 응집체에 포함된 단일 입자의 평균 입경이 60 ㎚ 이하이고,
구연산, 산 및 염기를 혼합하여 pH가 2.5 내지 4인인 구연산 완충용액을 제조하는 단계; 및
상기 구연산 완충용액에 하이드록시아파타이트를 침지하여 용출을 수행하는 용출 단계;를 포함하여 용출 특성을 평가한 결과,
하이드록시아파타이트 2 g 및 구연산 완충용액 40 ㎖을 혼합한 결과를 기준으로 20일 경과 후 인 방출량이 1 L 당 45,000 내지 55,000 ㎖를 만족하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 칼슘 전구체 수용액에 인산염 전구체 수용액을 투입하여 혼합용액을 제조하는 제 2단계; 및
상기 혼합용액에 수산화암모늄 수용액을 투입하는 제 3단계;를 포함하며,
상기 제 1단계 내지 제 3단계로 제조된 비하소 하이드록시아파타이트는 응집체의 평균 입경이 10 내지 100 ㎛이며, 응집체에 포함된 단일 입자의 평균 입경이 60 ㎚ 이하이고,
구연산, 산 및 염기를 혼합하여 pH가 2.5 내지 4인인 구연산 완충용액을 제조하는 단계; 및
상기 구연산 완충용액에 하이드록시아파타이트를 침지하여 용출을 수행하는 용출 단계;를 포함하여 용출 특성을 평가한 결과,
하이드록시아파타이트 2 g 및 구연산 완충용액 40 ㎖을 혼합한 결과를 기준으로 20일 경과 후 인 방출량이 1 L 당 45,000 내지 55,000 ㎖를 만족하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 구연산 완충용액을 제조하는 단계는 구연산과 염기를 혼합하여 구연산 수용액을 제조하는 구연산 수용액 제조단계; 및
산 수용액에 상기 구연산 수용액을 첨가하는 완충용액 제조단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 구연산 완충용액을 제조하는 단계는 구연산과 염기를 혼합하여 구연산 수용액을 제조하는 구연산 수용액 제조단계; 및
산 수용액에 상기 구연산 수용액을 첨가하는 완충용액 제조단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 구연산 수용액은 1L 당 구연산 18 내지 25 g을 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 구연산 수용액은 1L 당 구연산 18 내지 25 g을 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 염기는 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화마그네슘에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 염기는 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화마그네슘에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 구연산 수용액은 1L 당 염기를 0.05 내지 0.4 몰 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 구연산 수용액은 1L 당 염기를 0.05 내지 0.4 몰 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 산 수용액은 황산, 염산, 질산 및 인산에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 산 수용액은 황산, 염산, 질산 및 인산에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 산 수용액은 농도가 0.05 내지 0.25 M인 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 산 수용액은 농도가 0.05 내지 0.25 M인 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 용출 단계는 상기 완충용액 1 L 당 30 내지 60 g의 하이드록시아파타이트를 침지하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 용출 단계는 상기 완충용액 1 L 당 30 내지 60 g의 하이드록시아파타이트를 침지하는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 용출 단계는 35 내지 38.5 ℃를 유지하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 용출 단계는 35 내지 38.5 ℃를 유지하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 용출 단계는 1 내지 5 Hz로 용기를 상하 또는 원 운동하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
상기 용출 단계는 1 내지 5 Hz로 용기를 상하 또는 원 운동하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 비하소 하이드록시아파타이트 제조방법.
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| US20090074837A1 (en) | 2007-09-19 | 2009-03-19 | Ut-Battelle, Llc | Bioresorbable Calcium-Deficient Hydroxyapatite Hydrogel Composite |
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