KR102800973B1

KR102800973B1 - 류신 리치 α2 글리코 단백질의 면역 측정 방법 및 측정 시약

Info

Publication number: KR102800973B1
Application number: KR1020217013480A
Authority: KR
Inventors: 시게오 다카야마; 데츠지 나카; 사토시 세라다
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤; 고쿠리츠 켄큐 카이하츠 호진 이야쿠 키반 켄코 에이요 켄큐쇼
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2025-04-29
Anticipated expiration: 2039-10-08
Also published as: WO2020075691A1; US12222351B2; EP3865873B1; JP7421711B2; US20210382041A1; CN112888946A; JPWO2020075691A1; SG11202103370RA; EP3865873A4; EP3865873A1; CN112888946B; KR20210073546A

Abstract

본 발명의 목적은, 생체 시료 중의 LRG를 간편하면서 단시간에 측정할 수 있는 측정 방법 및 측정용 시약을 제공하는 데 있다. 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토하여, 생체 시료를, 액상 중에서, 당해 시료와, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 접촉시키는 면역 응집 측정법에 의해, 간편하면서 단시간에 생체 시료 중의 LRG를 측정할 수 있다는 지견을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

Description

류신 리치 α2 글리코 단백질의 면역 측정 방법 및 측정 시약

본 발명은, 류신 리치 α2 글리코 단백질의 면역 측정 방법 및 면역 측정 시약에 관한 것이다. 특히, 류신 리치 α2 글리코 단백질에 대한 특이적 친화성 물질을 담지시킨 불용성 담체 입자를 사용하는 면역 측정 방법 및 면역 측정 시약에 관한 것이다.

류신 리치 α2 글리코 단백질(이하, 간단히 LRG라고 하는 경우가 있음)은 혈청 단백질 중 하나로 약 50kDa의 당 단백질이며, 호중구로부터 분비되는 것 등이 보고되어 있다(비특허문헌 1).

또한, LRG가 베체트병 등의 자기 면역 질환의 검사용 바이오마커로서 유용한 것이 개시되어 있다(특허문헌 1).

특허문헌 1에는, LRG의 검출이나 정량 측정은 프로테옴 해석이나 면역학적 방법에 의해 행해지고 있던 것이나, 면역학적 방법으로서 항LRG 모노클로날 항체를 사용한 ELISA법, 웨스턴 블로팅법 등이 기재되어 있다.

상기 ELISA법의 측정 시약으로서는, 예를 들어 Human LRG Assay Ki-IBL(IBL사)이 시판되고 있다. 이 인간 LRG를 측정하는 ELISA 시약은, LRG에 결합하는 항체와 LRG를 항원 항체 반응시켜 면역 복합체를 형성시킨 후, 면역 복합체 중의 표지된 양을 측정함으로써 시료 중의 LRG 농도를 정량하는 것이 가능하다.

일반적으로 ELISA법에서의 측정에 적합한 측정 대상물의 농도는 pg/mL 내지 ng/mL의 범위이기 때문에, 생체 시료 중에 측정 대상 물질이 μg/mL 단위의 비교적 고농도로 존재하는 경우에는, 측정 시약의 능력을 발휘할 수 있을 정도까지 희석하는 전처리가 필요하였다.

또한, 고배율 희석에 의한 오차를 방지하기 위해 복수 단계로 나누어 희석할 필요가 있어, 공정이 번잡해진다는 문제가 있었다. 구체적으로는 전술한 시판 시약이면, 시료 중의 LRG 농도로서, 1.56 내지 100ng/mL의 일정 범위에 들어가도록 희석할 필요가 있었다. 당해 희석은, 예를 들어 궤양성 대장염일 때에 일어날 수 있는 인간 혈청 중의 농도의 최고치가 100μg/mL이면, 1000배나 되는 희석이 필요한 것을 의미하고 있다.

또한, 지금까지의 LRG 측정 ELISA 시약에 있어서는, 측정 대상 시료와 고상 항체를 장시간 반응시킬 필요가 있었다. 예를 들어 전술한 시판 키트에서는 고상 항체와 시료를 접촉시키는 1차 반응에 하룻밤 소요되어, 지금까지 시료 중의 LRG를 단시간에 측정할 수 있는 시약은 존재하지 않았다.

일본 특허 공개 제2010-286279호 공보

J Leukoc Biol. 2002, 72(3), 478-85, 2002

본 발명의 목적은, 생체 시료 중의 LRG를 간편하면서 단시간에 측정할 수 있는 측정 방법 및 측정용 시약을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토하여, 당해 시료와, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 접촉시키는 면역학적 측정법, 구체적으로는 면역 응집법에 있어서 시약 조성을 연구함으로써, 희석 등의 전처리를 필요로 하지 않고, 간편하면서 단시간에 생체 시료 중의 LRG를 측정할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.

<1> 생체 유래 시료 중의 류신 리치 α2 글리코 단백질(LRG)의 면역학적 측정 방법이며,

액상 중에서, 당해 시료와, 적어도 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 측정 방법.

<2> 불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 100nm 내지 340nm인 라텍스 입자인, <1>에 기재된 측정 방법.

<3> 불용성 담체 입자가, 임계 응집 농도가 65mM 내지 270mM인 라텍스 입자인, <1> 또는 <2>에 기재된 측정 방법.

<4> 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입자경이 동일한, <1> 내지 <3> 중 어느 것에 기재된 측정 방법.

<5> 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자가 상기 액상 중에 등량 포함되어 있는, <1> 내지 <4> 중 어느 것에 기재된 측정 방법.

<6> 생체 유래 시료가 혈청인, <1> 내지 <5> 중 어느 것에 기재된 측정 방법.

<7> 면역 응집법이 호모지니어스법에 근거하는 방법인, <1> 내지 <6> 중 어느 것에 기재된 측정 방법.

<8> 상기 액상 중에서, 생체 유래 시료와, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 접촉시키는 공정이 다음 공정인, <1> 내지 <7> 중 어느 것에 기재된 측정 방법.

(1) 액상 중에서, 당해 시료와 완충액을 포함하는 제1 시약을 접촉시키는 공정

(2) 공정 (1) 후에, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 포함하는 제2 시약을 액상 중에 첨가하는 공정

<9> 상기 (1)의 액상 중의 염 농도가 700 내지 900mM인, <8>에 기재된 측정 방법.

<10> 추가로, LRG와 항LRG 모노클로날 항체를 담지한 불용성 담체 입자의 복합체의 응집 정도를 광학적으로 측정하는 공정을 포함하는, <1> 내지 <9> 중 어느 것에 기재된 측정 방법.

<11> 광학적으로 측정하는 공정이 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도를 광학 기기로 측정하는 공정인, <10>에 기재된 측정 방법.

<12> 혈액 시료 중의 LRG를 면역학적 측정법에 의해 측정하기 위한 시약이며, 적어도 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 포함하는 상기 시약.

<13> 불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 100nm 내지 340nm인 라텍스 입자인, <12>에 기재된 측정 시약.

<14> 불용성 담체 입자가, 임계 응집 농도가 65mM 내지 270mM인 라텍스 입자인, <12> 또는 <13>에 기재된 측정 시약.

<15> 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입자경이 동일한, <12> 내지 <14> 중 어느 것에 기재된 측정 시약.

<16> 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자가 등량 포함되어 있는, <12> 내지 <15> 중 어느 것에 기재된 측정 시약.

<17> 생체 유래 시료가 혈청인, <12> 내지 <16> 중 어느 것에 기재된 측정 시약.

<18> 면역 응집법이 호모지니어스법에 근거하는 방법인, <12> 내지 <17> 중 어느 것에 기재된 측정 시약.

<19> 혈액 시료 중의 LRG를 면역 응집법에 의해 측정하기 위한 시약 키트이며, 이하를 포함하는 상기 시약 키트.

(1) 완충액을 포함하는 제1 시약

(2) 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 포함하는 제2 시약

<20> 불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 100nm 내지 340nm인 라텍스 입자인, <19>에 기재된 시약 키트.

<21> 불용성 담체 입자가, 임계 응집 농도가 65mM 내지 270mM인 라텍스 입자인, <19> 또는 <20>에 기재된 시약 키트.

<22> 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입자경이 동일한, <19> 내지 <21> 중 어느 것에 기재된 시약 키트.

<23> 상기 (2)의 제2 시약이 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 등량 포함하는, <19> 내지 <22> 중 어느 것에 기재된 시약 키트.

<24> 상기 (1)의 제1 시약이, 반응 액상 중의 염 농도가 700 내지 900mM이 되도록 염을 포함하는, <19> 내지 <23> 중 어느 것에 기재된 시약 키트.

<25> 추가로 이하를 포함하는, <19> 내지 <24> 중 어느 것에 기재된 시약 키트.

(3) 표준 항원 및/또는 대조로서의 LRG

본 발명에 따르면, 보다 간편하면서 단시간에 결과가 얻어지는 생체 시료 중의 LRG의 측정 방법 및 측정용 시약이 제공된다.

도 1은 처방예 1의 제1 시약과 제2 시약을 조합하고, 자동 분석 장치를 사용하여, 각 기지 농도의 LRG를 포함하는 시료를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 처방예 2의 제1 시약과 제2 시약을 조합하고, 자동 분석 장치를 사용하여, 각 기지 농도의 LRG를 포함하는 시료를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 처방예 3의 제1 시약과 제2 시약을 조합하고, 자동 분석 장치를 사용하여, 각 기지 농도의 LRG를 포함하는 시료를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 처방예 4의 제1 시약과 제2 시약을 조합하고, 자동 분석 장치를 사용하여, 각 기지 농도의 LRG를 포함하는 시료를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 처방예 5의 제1 시약과 제2 시약을 조합하고, 자동 분석 장치를 사용하여, 각 기지 농도의 LRG를 포함하는 시료를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 처방예 6의 제1 시약과 제2 시약을 조합하고, 자동 분석 장치를 사용하여, 각 기지 농도의 LRG를 포함하는 시료를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 정상인 검체 및 환자 검체를 사용하여 본 발명의 측정 방법에 의해 혈청 중의 LRG 농도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

(면역 응집법)

면역 응집법은, 항원 혹은 항체 등의 측정 대상에 대한 특이적 친화성 물질을 고정화한 불용성 담체 입자를 사용하여 항원이나 항체를 측정하는 면역 측정법의 일종이며, 임상 검사의 분야에서 널리 사용되고 있다. 불용성 담체 입자로서는 라텍스 등이 주로 사용되고, 그 경우를 특히, 라텍스 면역 응집법(LTIA)이라고 한다.

LTIA에 의해 LRG를 측정하는 방법으로서는, LRG에 대한 모노클로날 항체를 고정화한 라텍스 입자와, 항원인 LRG를 반응시켜, 샌드위치형의 면역 복합체를 형성시키고, 면역 복합체 형성에 수반하는 당해 라텍스 입자의 응집 정도로부터 LRG를 측정하는 방법과, 항원을 고정화한 라텍스 입자와 시료 중의 LRG를 경합시켜, 당해 라텍스 입자와 항체의 면역 복합체의 형성을 저해하고, 면역 복합체의 형성 저해에 수반하는 당해 라텍스 입자의 응집 저해의 정도로부터 LRG를 측정하는 방법으로 크게 구별할 수 있다.

(시료)

본 발명에 있어서의 시료는 생체 시료라면 특별히 한정은 되지 않지만, 전형적으로는 혈액 시료이며, 예를 들어 전혈, 혈청, 혈장을 들 수 있다. 혈장으로서는 헤파린 혈장, EDTA 혈장 등도 포함된다.

(측정 대상 물질)

본 발명에 있어서의 측정 대상 물질은 류신 리치 α2 글리코 단백질(LRG)이다.

(측정 방법)

LTIA로 대표되는 면역 응집의 측정 방법으로서는, 발생한 응집의 정도를 광학적 혹은 전기 화학적으로 관찰함으로써 피검 물질을 측정할 수 있다. 광학적으로 관찰하는 방법으로서는, 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도를 광학 기기로 측정하는 방법(엔드 포인트법, 레이트법 등)을 들 수 있다. 시료를 측정하여 얻은 흡광도 등의 측정값을, 표준 물질(LRG의 농도가 기지인 시료)을 측정하여 얻은 흡광도 등의 측정값과 비교하여, 시료 중에 포함되어 있던 LRG의 농도(정량값)를 산출한다. 또한, 투과광 또는 산란광 등의 흡광도 등의 측정은 1파장 측정이어도 되고, 또는 2파장 측정(2개의 파장에 의한 차 또는 비)이어도 된다. 측정 파장은 500nm로부터 800nm 중에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 시료 중의 LRG의 측정은 용수법(用手法)에 의해 행해도 되고, 또는 측정 장치 등의 장치를 사용하여 행해도 된다. 측정 장치는 범용 자동 분석 장치여도 되고, 전용의 측정 장치(전용기)여도 된다. 또한, 이 측정은 2스텝법(2시약법) 등의 복수의 조작 스텝에 의해 행하는 방법에 의해 실시하는 것이 바람직하다.

(항LRG 모노클로날 항체)

본 발명의 모노클로날 항체는 당업자에게 주지된 방법에 의해 취득할 수 있다. 즉, 항원으로서 인간 LRG를 인산 완충 생리 식염수 등의 용매에 용해시키고, 이 용액을 동물에 투여하여 면역함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 필요에 따라서 상기 용액에 적당한 아쥬반트를 첨가한 후, 에멀션을 사용하여 면역을 행해도 된다. 아쥬반트로서는, 유중수형 유제, 수중유중수형 유제, 수중유형 유제, 리포솜, 수산화알루미늄 겔 등의 범용되는 아쥬반트 이외에도, 생체 성분 유래의 단백질이나 펩티드성 물질 등을 사용해도 된다. 예를 들어, 프로인트의 불완전 아쥬반트 또는 프로인트의 완전 아쥬반트 등을 적합하게 사용할 수 있다. 아쥬반트의 투여 경로, 투여량, 투여 시기는 특별히 한정되지 않지만, 항원을 면역하는 동물에 있어서 원하는 면역 응답을 증강시킬 수 있도록 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

면역에 사용하는 동물의 종류도 특별히 한정되지 않지만, 포유 동물이 바람직하고, 예를 들어 마우스, 래트, 소, 토끼, 염소, 양 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 마우스를 사용할 수 있다. 동물의 면역은 일반적인 방법을 따라서 행하면 되고, 예를 들어 항원의 용액, 바람직하게는 아쥬반트와의 혼합물을 동물의 피하, 피내, 정맥, 또는 복강내에 주사함으로써 면역을 행할 수 있다. 면역 응답은 일반적으로 면역되는 동물의 종류 및 계통에 따라 상이하므로, 면역 스케줄은 사용되는 동물에 따라서 적절히 설정하는 것이 바람직하다. 항원 투여는 최초의 면역 후에 몇번이든 반복해서 행하는 것이 바람직하다.

모노클로날 항체를 얻는 경우, 계속해서 이하의 조작이 행해지는데, 거기에 한정되지 않고, 모노클로날 항체 그 자체의 제조 방법에 대하여는 예를 들어 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988))]에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.

최종 면역 후, 면역한 동물로부터 항체 산생 세포인 비장 세포 혹은 림프절 세포를 적출하고, 높은 증식능을 갖는 미엘로마 세포와 세포 융합시킴으로써 하이브리도마를 제작할 수 있다. 세포 융합에는 항체 산생능(질·양)이 높은 세포를 사용하는 것이 바람직하고, 또한 미엘로마 세포는, 융합하는 항체 산생 세포가 유래되는 동물과 적합성이 있는 것이 바람직하다. 세포 융합은 당해 분야에서 공지된 방법에 따라서 행할 수 있지만, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜법, 센다이 바이러스를 사용한 방법, 전류를 이용하는 방법 등을 채용할 수 있다. 얻어진 하이브리도마는 공지된 방법에 따라서 증식시킬 수 있고, 산생되는 항체의 성질을 확인하면서 원하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. 하이브리도마의 클로닝은, 예를 들어 한계 희석법이나 연한천법 등의 공지된 방법에 의해 행하는 것이 가능하다.

제1 및 제2 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마의 선택에 대하여 설명한다. 하이브리도마의 선택은, 산생되는 항체가 실제의 측정에 사용되는 조건을 고려하여, 선택의 단계에서 효율적으로 행할 수도 있다. 예를 들어, ELISA법, RIA법, 비아코어(Biacore)법 등에 의해, 인간 LRG에 반응하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택함으로써 얻어진다. 구체적으로는, 먼저 배양 상청 중의 모노클로날 항체를, 고상화한 인간 LRG와 반응시키고, 이어서 표지 항IgG 항체를 반응시키는 항원 고상화 ELISA법에 의해, 인간 LRG에 대하여 높은 반응성을 갖는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택한다.

이와 같이 하여 선별된 하이브리도마를 대량 배양함으로써, 원하는 특성을 갖는 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 대량 배양의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 하이브리도마를 적당한 배지 중에서 배양하여 모노클로날 항체를 배지 중에 산생시키는 방법이나, 포유 동물의 복강내에 하이브리도마를 주사하여 증식시켜, 복수 중에 항체를 산생시키는 방법 등을 들 수 있다. 모노클로날 항체의 정제는, 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법 등을 적절히 조합하여 행할 수 있다.

본 발명의 항체로서는, 항체 분자 전체 이외에도 항원 항체 반응 활성을 갖는 항체의 기능성 단편을 사용하는 것도 가능하고, 상기와 같이 동물에 대한 면역 공정을 거쳐 얻어진 것 이외에도, 유전자 재조합 기술을 사용하여 얻어지는 것이나, 키메라 항체를 사용하는 것도 가능하다. 항체의 기능성 단편으로서는, 예를 들어 F(ab')₂, Fab' 등을 들 수 있고, 이들 기능성 단편은 상기와 같이 하여 얻어지는 항체를 단백질 분해 효소(예를 들어, 펩신이나 파파인 등)로 처리함으로써 제조할 수 있다.

(불용성 담체 입자)

본 발명에 사용하는 불용성 담체 입자로서는, 항LRG 모노클로날 항체를 담지할 수 있고, 시료 중의 LRG의 측정을 할 수 있는 불용성 담체 입자이면 되고, 예를 들어 라텍스 입자, 자성 입자, 금속 입자 등을 들 수 있지만, 이 중에서도 라텍스 입자가 바람직하다.

불용성 담체 입자의 평균 입자경 및 임계 응집 농도는, LRG의 시료 중에서의 농도 혹은 측정 기기의 검출 감도 등을 고려하여 적절히 선택된다.

불용성 담체 입자의 평균 입자경은 바람직하게는 100nm 내지 340nm, 보다 바람직하게는 150nm 내지 260nm이다.

또한, 불용성 담체 입자의 임계 응집 농도는 바람직하게는 65mM 내지 270mM, 보다 바람직하게는 150mM 내지 270mM인 것이 적절히 선택된다.

(라텍스 입자)

본 발명에 사용하는 불용성 담체 입자의 바람직한 예인 라텍스 입자로서는, 면역학적 측정 시약으로서 일반적으로 사용되고 있는 라텍스 입자라면 특별히 제한되지 않는다. 라텍스 입자는 각종 모노머를 중합 또는 공중합시킴으로써 얻을 수 있다. 여기에 모노머로서는, 예를 들어 스티렌, α-메틸스티렌, o-메틸스티렌, p-메틸스티렌, p-클로로스티렌, 4-비닐벤조산, 디비닐벤젠, 비닐톨루엔 등의 페닐기를 갖는 중합성 단량체, 스티렌술폰산염, 디비닐벤젠술폰산염, o-메틸스티렌술폰산염, p-메틸스티렌술폰산염 등의 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체, 1-비닐나프탈렌, 2-비닐나프탈렌, (메트)아크릴산α-나프틸, (메트)아크릴산β-나프틸 등의 나프틸기를 갖는 중합성 단량체 등의 중합성 불포화 방향족류, 예를 들어 (메트)아크릴산, 이타콘산, 말레산, 푸마르산 등의 중합성 불포화 카르복실산류, 예를 들어 (메트)아크릴산메틸, (메트)아크릴산에틸, (메트)아크릴산-n-부틸, (메트)아크릴산-2-히드록시에틸, (메트)아크릴산글리시딜, 에틸렌글리콜-디-(메트)아크릴산에스테르, (메트)아크릴산트리브로모페닐 등의 중합성 불포화 카르복실산에스테르류, (메트)아크릴로니트릴, (메트)아크롤레인, (메트)아크릴아미드, N-메틸올-(메트)아크릴아미드, 메틸렌비스(메트)아크릴아미드, 부타디엔, 이소프렌, 아세트산비닐, 비닐피리딘, N-비닐피롤리돈, 염화비닐, 염화비닐리덴, 브롬화비닐 등의 불포화 카르복실산아미드류, 중합성 불포화 니트릴류, 할로겐화비닐류, 공액 디엔류 등을 들 수 있다. 이들 모노머는 요구되는 표면 특성, 비중 등에 의해 적절히 선택되고, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

라텍스 입자의 평균 입자경은 레이저 회절·산란법(LS법), 콜터(Coulter) 원리, 동적 광산란 광자상관법, 전자 현미경 등으로 해석할 수 있다.

라텍스 입자의 평균 입자경은 바람직하게는 100nm 내지 340nm, 보다 바람직하게는 150nm 내지 260nm인 것이 적절히 선택된다. 100nm 미만이면, 저농도부터 중농도 영역의 감도가 저하되어 정확한 측정이 어렵고, 또한 340nm를 초과하면 저농도측의 감도는 높아지지만 고농도측에서는 소위 후크 현상이 일어나버려 실제 농도보다 낮은 값이 나오는 현상이 일어나기 때문이다.

라텍스 입자의 임계 응집 농도란, 라텍스가 응집되지 않는 염의 최대 농도이며, 항체가 감작되어 있지 않은 라텍스 입자에 단계적으로 염을 가하여 완전히 자기 응집하는 염 농도를 구하고, 그 농도의 한 단계 묽은 염 농도를 말한다. 예를 들어, 인산나트륨 수용액(pH 7.4) 10mM마다 10 내지 400mM의 범위에서 준비하고, 각 농도의 인산나트륨 수용액에, 라텍스 입자를 최종 농도 1％(W/V)가 되는 양을 투입하여 교반한다. 1분간 경과 후에 눈으로 확인하여 라텍스가 자기 응집하였는지 여부를 확인하고, 완전히 자기 응집하는 농도의 한 단계 묽은 인산나트륨 수용액 농도를 임계 응집 농도(최대 비응집 농도)로 한다.

라텍스 입자의 임계 응집 농도(인산나트륨 수용액 농도)는 바람직하게는 65mM 내지 270mM, 보다 바람직하게는 150mM 내지 270mM인 것이 적절히 선택된다. 65mM 미만이면, 라텍스 입자의 분산을 유지하는 것이 어렵고, 270mM 이상이면, 면역 반응이 일어나기 어렵고 응집하지 않는다.

라텍스 입자의 임계 응집 농도는 원료의 중량비를 적절히 변경함으로써 조정할 수 있다. 예를 들어, 스티렌 라텍스는 스티렌 등의 페닐기를 갖는 중합성 단량체의 소정량과 소정량의 스티렌술폰산나트륨 등의 페닐기와 술폰산염을 갖는 중합성 단량체를, 수계 매체 중에서 공중합시킴으로써 얻어지는데, 이 경우의 스티렌과 스티렌술폰산나트륨의 혼합비를 변경함으로써 임계 응집 농도를 조제할 수 있다.

사용되는 라텍스 입자는, 감도 향상 등의 원하는 성능을 얻기 위해서 재질이나 입자경을 적절히 선택할 수 있고, 재질이나 입자경이 다른 것을 조합하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 응집 반응 측정 시의 라텍스 입자의 농도는 특별히 제한이 없고, 원하는 감도나 성능에 따라서 적절히 설정할 수 있다.

(항LRG 모노클로날 항체를 담지한 불용성 담체 입자)

LRG에 대한 항체는 물리적 흡착(소수 결합)법, 화학적 결합법 또는 이들의 병용 등의 공지된 방법에 의해 라텍스 입자 등의 불용성 담체 입자에 고정화하여 담지시킬 수 있다. 이하, 불용성 담체 입자의 대표예로서 라텍스를 예로 들어 설명한다.

물리적 흡착법에 의한 경우에는, 공지된 방법에 따라서, LRG에 대한 항체와 라텍스 입자를 완충액 등의 용액 중에서 혼합하여 접촉시키거나, 또는 완충액 등에 용해된 LRG에 대한 항체를 담체에 접촉시키는 것 등에 의해 행할 수 있다.

또한, 화학적 결합법에 의해 행하는 경우에는, 일본 임상 병리학회편 「임상 병리 임시 증간 특집 제53호 임상 검사를 위한 면역 검정-기술과 응용-」, 임상 병리 간행회, 1983년 발행; 일본 생화학회편 「신 생화학 실험 강좌 1 단백질 IV」, 도꾜 가가꾸 도진, 1991년 발행 등에 기재된 공지된 방법에 따라서, LRG에 대한 특이적 결합 물질과 담체를, 글루타르알데히드, 카르보디이미드, 이미드에스테르 또는 말레이미드 등의 2가성 가교 시약과 혼합, 접촉시켜, LRG에 대한 특이적 결합 물질과 담체 각각의 아미노기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기 또는 수산기 등과 상기한 2가성 가교 시약을 반응시키는 것 등에 의해 행할 수 있다.

라텍스 입자가 담지하는 특정 물질에 대한 항체는 샌드위치를 형성하기 위해 적어도 2종류인 것이 요구된다. 즉, 항LRG 모노클로날 항체로서는, 인식 부위가 다른 2 이상의 모노클로날 항체를 사용한다.

또한, 제1 모노클로날 항체와 제2 모노클로날 항체는 각각 별도의 불용성 담체 입자에 담지되어 있는 것을 요한다.

본 발명에 있어서, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자의 농도는, 전술한 바와 같이 원하는 감도나 성능에 따라서 적절히 설정할 수 있지만, 반응 액상 중에 있어서 등량 포함되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입자경은 전술한 바와 같이 각각 100nm 내지 340nm인 것이 바람직하고, 양쪽 평균 입자경은 동일한 정도인 것이 바람직하고, 동일한 것이 한층 더 바람직하다. 동일한 정도란 한쪽의 평균 입자경이 다른 쪽의 평균 입자경의 80 내지 120％의 범위에 포함되는 것을 말하고, 동일하다는 것은, 한쪽의 평균 입자경이 다른 쪽의 평균 입자경의 90 내지 110％의 범위에 포함되는 것을 말한다.

또한, 라텍스 입자의 자연 응집이나, 비특이적 반응 등을 억제하기 위해 처리를 행할 필요가 있으면, 라텍스 입자의 표면에, 소혈청 알부민(BSA), 카제인, 젤라틴, 난백 알부민 혹은 그의 염 등의 단백질, 계면 활성제 또는 탈지 분유 등을 접촉시켜 피복시키는 것 등의 공지된 방법에 의해 처리하여, 담체의 블로킹 처리(마스킹 처리)를 행해도 된다.

(접촉)

액상 중에서, LRG를 포함하는 시료와, 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 접촉시킨다는 것은, 전형적으로는 이하의 (1) 내지 (4)를 들 수 있다.

(1) 당해 시료와 완충액을 혼합한 후, 이 혼합액에 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체를 혼합하는 양태,

(2) 당해 시료, 완충액, 그리고 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 동시에 혼합하는 양태,

(3) 당해 시료와 완충액을 혼합한 후, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 혼합하고, 이어서 제2 항LRG 모노클로날 항체 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 혼합하는 양태,

(4) (1) 내지 (3)에 있어서 당해 시료를 마지막으로 첨가하여 혼합하는 양태.

(측정용 시약)

본 발명의 측정용 시약은, 혈액 시료 중의 LRG를 면역 응집법에 의해 측정하기 위한 시약이며, 적어도 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 포함한다. 전형적으로는 2개 이상의 구성 시약에 의해 구성되고, 적어도 하나의 구성 시약은 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 포함하고, 다른 구성 시약은 완충액을 포함한다. 또한, 본 발명의 측정용 시약은 액상의 시약이다.

본 발명의 측정용 시약은, 이 중에서도 제1 시약과 제2 시약을 포함하는 2시약형이 바람직하다. 예를 들어, 2시약형의 제1 시약은, LRG를 포함하는 생체 유래 시료를 희석하기 위한 완충액을 포함하고, 제2 시약은, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 포함하는 시액(試液)이다.

또한, 본 발명의 측정용 시약이 제1 시약, 제2 시약과 제3 시약을 포함하는 3시약형인 경우, 예를 들어 제1 시약은 완충액 등을 포함하고, 제2 시약은, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 포함하는 시액, 제3 시약은, 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 포함하는 시액이다.

본 발명의 측정 시약에 포함되는 완충액으로서는 일반적으로 사용되는 것이면 되고, 예를 들어 트리스염산, 붕산, 인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 프탈산, 글루타르산, 말레산, 글리신 및 그들의 염 등이나, MES, 비스-트리스(Bis-Tris), ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES 등의 구드(Good's) 완충액 등을 들 수 있다.

완충액 성분의 농도는, 시약 중의 불용성 담체 입자의 자연 응집이 일어나지 않고, 또한 원하는 면역 반응이 행해지는 농도 범위이면 되고, 반응 용액 중에 있어서 100mM 이상이면 되고, 바람직하게는 200mM 이상, 더욱 바람직하게는 300mM 이상, 한층 더 바람직하게는 400mM 이상이다.

본 발명의 측정 시약은 추가로 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염의 종류로서는 무기염이 바람직하고, 무기염으로서는 염화나트륨, 염화칼슘 등을 들 수 있다.

염 농도는, 시약 중의 불용성 담체 입자의 자연 응집이 일어나지 않고, 또한 원하는 면역 반응이 행해지는 농도 범위이면 되고, 농도의 하한은 반응액 중에 있어서 100mM 이상이면 되고, 바람직하게는 300mM 이상, 더욱 바람직하게는 500mM 이상, 한층 더 바람직하게는 700mM 이상이다. 또한, 농도의 상한으로서는 반응액 중에 있어서 2000mM 이하가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1500mM 이하, 한층 더 바람직하게는 1000mM 이하, 가장 바람직하게는 900mM 이하이다.

또한, 농도의 범위는 반응액 중에 있어서 바람직하게는 100 내지 1500mM이며, 더욱 바람직하게는 300 내지 1000mM이며, 한층 더 바람직하게는 500 내지 1000mM이며, 가장 바람직하게는 700 내지 900mM이다.

본 발명의 측정 시약의 측정 가능한 범위(측정 레인지)는 LRG를 진단용 마커로서 측정하기 위해서는, 10 내지 80μg/mL 정도이면 되고, 바람직하게는 5.0 내지 100μg/mL이다.

(시약 키트)

본 발명의 시약 키트는, 적어도 하기 (1) 및 (2)의 요소를 포함하는 것을 특징으로 한다.

(1) 완충액을 포함하는 제1 시약

(2) 적어도 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 포함하는 제2 시약

또한, 본 발명의 시약 키트에는, 상기 측정 시약 외에도 (3) 표준 항원 또는 대조로서의 LRG를 포함할 수 있다.

또한, 시료를 전처리하기 위한 시료 전처리 시약이 포함되어 있어도 된다. 시료 전처리 시약은 (1)의 완충액을 포함하는 제1 시약에 포함시켜 둘 수도 있고, (1), (2)와는 다른 시약 구성으로서 포함할 수도 있다.

또한, 사용 설명서, 시료 채취 용구(채취 피펫, 시린지, 면봉, 여과 필터 등), 시료 희석액, 시료 추출액을 포함할 수 있다.

(호모지니어스법)

본 발명에 있어서 호모지니어스법이란, 시료와 시약액의 혼화 용액(반응액) 중에서 진행되는 반응을 B/F(결합/비결합) 분리를 행하지 않고 특이적으로 검출하는 측정법을 가리키고, B/F 분리 조작에 의해 측정 반응에 관여하지 않은 잉여 성분을 완전히 세정·제거한 후, 주 반응을 진행시켜 검출하는 헤테로지니어스 측정법과 대비하여 호칭되는 측정법을 말한다. 따라서, 본 발명에서 말하는 「면역 응집법이 호모지니어스법에 근거하는 방법이다」란, 전형적인 하기 (1) 내지 (3)의 공정에 있어서,

(1) 액상 중에서, 시료와 완충액을 접촉시키는 공정

(2) (1) 공정 후에, 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 액상 중에 첨가하는 공정

(3) (2)의 공정 후에, LRG와 당해 불용성 담체 입자의 응집 반응을 측정하는 공정

(3)의 공정은, 「(2)의 공정 도중, 혹은 (2)의 공정 후에, 세정·분리 공정을 거치지 않고 당해 LRG와 당해 불용성 담체 입자의 응집 반응을 측정하는 공정」인 것을 의미한다.

(기타 시약 성분)

본 발명의 시약은 불용성 담체 입자의 응집 형성을 증강시키는 성분으로서 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 인지질 폴리머 등의 고분자를 포함해도 된다. 또한, 응집의 형성을 컨트롤하는 성분으로서, 단백질, 아미노산, 당류, 금속염류, 계면 활성제류, 환원성 물질이나 카오트로픽 물질 등 범용되는 성분을 1종류 또는 복수의 성분을 조합하여 포함해도 된다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들에 한정하여 해석되는 것은 아니다.

[시험예 1〕

LRG 농도 측정에 있어서의 불용성 담체 입자의 입자경을 변경하고, 농도 의존적인 흡광도 변화가 보이는지 여부, 또한 검량선의 제작이 가능한지 여부를 조사하였다.

1. 시약

(1) 제1 시약

이하에 나타내는 성분을 포함하고, pH를 6.5 내지 7.5로 조정하였다.

·HEPES

·1M NaCl

·1.0％ BSA

·0.05％ Proclin950

(2) 제2 시약

(2-1) 처방예 1

하기 2종류의 항LRG 모노클로날 항체 감작 라텍스 입자 용액을 등량 혼합하고, 10mM HEPES 완충액(pH 7.2)으로 파장 570nm의 흡광도가 4.5Abs.가 되도록 희석하여 제2 시약으로 하였다.

(i) 제1 항LRG 모노클로날 항체(Kan10) 감작 라텍스 입자 용액

평균 입자경 343nm, 임계 응집 농도 60mM의 1％ 폴리스티렌 라텍스 용액(20mM 글리신 완충액)에, 등량의 50mM 글리신 완충액으로 0.71mg/mL로 희석한 항LRG 모노클로날 항체(Kan10) 용액을 첨가하여 4℃, 2시간 교반하였다. 그 후, 등량의 합성 폴리머(BlockmasterCE210 JSR사제)를 첨가하여 4℃, 1시간 교반하였다. 그 후, 정제수에 용해시킨 10％ BSA액을 1/10양 첨가하여 4℃, 1시간 교반하여, 항LRG 모노클로날 항체(Kan10) 감작 라텍스 용액을 제작하였다.

(ii) 제2 항LRG 모노클로날 항체 감작 라텍스 입자 용액

평균 입자경 343nm, 임계 응집 농도 60mM의 폴리스티렌 라텍스를 사용하여 상기 (i)과 동일한 방법에 의해 항LRG 모노클로날 항체(Kan11) 감작 라텍스 입자 용액을 제작하였다.

(iii) 라텍스 입자의 물리적 성질

(a) 라텍스 입자의 입자경 측정 방법

레이저 회절·산란법 입도 분포 장치 LS13320(베크만 콜터사제)으로 라텍스 입자경을 해석하였다.

(b) 라텍스 입자의 임계 응집 농도의 측정 방법

인산나트륨 수용액(pH 7.4)을 10 내지 400mM의 범위에서 10mM마다 준비하고, 각 농도의 인산나트륨 수용액에, 라텍스 입자를 최종 농도 1％(W/V)가 되는 양을 투입하여 교반하였다. 이어서, 1분간 경과 후에 라텍스가 자기 응집되어 있는지 여부를 눈으로 확인하고, 완전히 자기 응집되는 농도의 한 단계 묽은 인산나트륨 수용액 농도를 임계 응집 농도로 하였다.

(2-2) 처방예 2 내지 6

처방예 1의 라텍스 입자를 이하와 같이 변경한 것 이외에는 마찬가지로 행하였다.

처방예 2: 평균 입자경 305nm, 임계 응집 농도 70mM

처방예 3: 평균 입자경 251nm, 임계 응집 농도 260mM

처방예 4: 평균 입자경 207nm, 임계 응집 농도 180mM

처방예 5: 평균 입자경 194nm, 임계 응집 농도 230mM

처방예 6: 평균 입자경 121nm, 임계 응집 농도 210mM

2. 피검 시료

생리 식염수에 정제 LRG(Bio Vendor Laboratory medicine사제)를 0, 5.0, 10.0, 23.0, 50.0, 100.0μg/mL가 되도록 첨가하였다.

3. 측정 방법

각 처방예의 제1 시약과 제2 시약을 조합하고, 히타치 7180형 자동 분석 장치를 사용하여, 각 기지 농도의 LRG를 포함하는 시료를 측정하였다. 구체적으로는, 시료 2.5μL에 제1 시약 150μL를 첨가하여 37℃에서 5분간 보온한 후, 제2 시약 50μL를 첨가하여 교반하였다. 응집 형성에 수반하는 흡광도 변화를, 그 후 5분간에 걸쳐 주 파장 570nm, 부 파장 800nm에서 측정하고, 그 흡광도 변화량을 측정하였다. 각 흡광도 측정값으로부터 검량선을 작성하고, R²(결정 계수)를 구하였다.

4. 측정 조건

히타치 7180형 자동 분석 장치의 파라미터 조건을 이하에 나타낸다.

(1) 액량 검체-제1 시약-제2 시약; 2.5μL-150μL-50μL

(2) 분석법 2포인트 엔드법(측광 포인트 19-34)

(3) 측정 파장 주 파장 570nm/부 파장 800nm

(4) 캘리브레이션 스플라인

5. 측정 결과 및 고찰

결과를 도 1 내지 도 6에 나타낸다.

본 결과에 의하면, 처방예 1은 고농도의 LRG 농도(100μg/ml)에서는 후크 현상이 보였지만, 저 내지 중농도에서는, 농도 의존적으로 흡광도가 상승하였다. 또한, 처방예 2 내지 6은 저농도 내지 고농도에서 농도 의존적으로 흡광도가 상승하고, R²도 0.99 이상이었다. 이 중에서도 특히 처방예 3, 4, 5는 R²가 매우 양호하며 0.996 이상이었다.

이상으로부터, 라텍스 입자의 평균 입자경은 100nm 내지 340nm이면, 인간 혈청 중의 LRG 농도 분포를 망라하는 농도 범위에서 정확한 측정이 가능하고, 그 중에서도 150nm 내지 260nm이면, 보다 고도의 정확성을 갖는 측정이 가능한 것을 알았다.

또한, 임계 응집 농도는 65mM 내지 270mM이면, 인간 혈청 중의 LRG 농도 분포를 망라하는 농도 범위에서 정확한 측정이 가능하고, 그 중에서도 150mM 내지 270mM이면, 보다 고도의 정확성을 갖는 측정이 가능한 것을 알았다.

[시험예 2〕

실제 검체에 가까운 검체의 측정이 가능한지 여부를 조사하기 위해서, 풀 혈청에 정제 LRG를 첨가하여 기지 농도의 LRG 모의 검체를 조제하고, LRG의 농도 측정을 행하였다.

1. 시약

시험예 1의 처방예 2 내지 6의 시약을 사용하였다.

2. 피검 시료

(1) 풀 혈청을 패널 검체 L로 하였다.

(2) 풀 혈청에 정제 LRG를 28.2μg/mL가 되도록 첨가하고, 패널 검체 M으로 하였다.

(3) 풀 혈청에 정제 LRG를 63.1μg/mL가 되도록 첨가하고, 패널 검체 H로 하였다.

3. 측정 방법 및 측정 조건

시험 방법 및 측정 조건은 시험예 1과 동일하다. 시험예 1에서 구한 검량선으로 각 패널 검체의 농도를 구하고, 또한 기지 농도와의 상대비(％)를 산출하였다.

4. 측정 결과 및 고찰

결과를 표 1에 나타낸다.

본 결과에 의하면, 처방예 2 내지 6의 시약에서 실제 검체에 가까운 모의 검체에서도 정확한 측정이 가능한 것을 알았다. 특히, 처방예 3 내지 5는 기지 농도에 대한 상대비가 99％라는 매우 높은 정확성을 갖고 있었다.

이상으로부터, 라텍스 입자의 평균 입자경이 100nm 내지 340nm이면, 정확한 측정이 가능하고, 그 중에서도 150nm 내지 260nm이면, 보다 고도의 정확성을 갖는 측정이 가능한 것을 알았다.

또한, 라텍스의 임계 응집 농도는 65mM 내지 270mM이면, 정확한 측정이 가능하고, 그 중에서도 150mM 내지 270mM이면, 보다 고도의 정확성을 갖는 측정이 가능한 것을 알았다

[시험예 3〕

정상인 검체 및 환자 검체를 사용하여 본 발명의 측정 방법에 의해 마커로서 LRG의 측정이 가능한 것을 확인하였다.

1. 시약

시험예 1의 처방예 5의 시약을 사용하였다.

2. 피검 시료

(1) 정상인의 혈청 검체

PROMEDDEX사에서 구입한 7검체

(2) 궤양성 대장염 환자(경증(관해기))의 혈청 검체

Bioreclamtion사에서 구입한 13검체

(3) 궤양성 대장염 환자(중증(활동기))의 혈청 검체

Bioreclamtion사 및 Proteogenex사에서 구입한 5검체

3. 측정 방법 및 측정 조건

시험예 1과 동일하다.

4. 측정 결과 및 고찰

결과를 도 7에 나타낸다.

본 결과에 의하면, 정상인, 경증 및 중증의 궤양성 대장염 환자의 검체 중의 LRG의 측정이 가능하고, 이들의 상태를 구별 가능한 마커로서의 측정이 가능한 것을 알았다.

따라서, 본 발명 측정 시약은 진단약으로서의 역할을 할 수 있다.

본 발명에 따르면, 액상 중에서, LRG를 포함하는 생체 시료와, 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 접촉시켜 응집 정도를 측정함으로써, 간편하면서 단시간에 결과가 얻어지는 생체 시료 중의 LRG의 측정 방법 및 측정 시약을 제공할 수 있었다. 본 발명의 측정 방법 및 측정 시약은 범용의 자동 분석 장치에도 적용할 수 있기 때문에, LRG를 보다 간단하면서 대량으로 동시 측정하는 것이 가능하게 되었다.

따라서, LRG를 바이오마커로서 간단하면서 단시간에 정량할 수 있고, 염증성 장질환 등의 질환 활동성의 평가를 용이하게 행할 수 있게 되었다.

Claims

생체 유래 시료 중의 류신 리치 α2 글리코 단백질(LRG)의 면역학적 측정 방법이며,
액상 중에서, 당해 시료와, 적어도 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 접촉시키는 공정과,
LRG와 항LRG 모노클로날 항체를 담지한 불용성 담체 입자의 복합체의 응집 정도를 측정하는 공정을 포함하며,
불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 100nm 내지 340nm인 라텍스 입자이며, 임계 응집 농도가 65mM 내지 270mM인 라텍스 입자인, 측정 방법.
제1항에 있어서, 불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 150nm 내지 260nm인 라텍스 입자이며, 임계 응집 농도가 150mM 내지 270mM인 라텍스 입자인 측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입자경이 동일한 측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자가 상기 액상 중에 등량 포함되어 있는 측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 생체 유래 시료가 혈청인 측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 응집법이 호모지니어스법에 근거하는 방법인 측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 액상 중에서, 생체 유래 시료와, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 접촉시키는 공정이 다음 공정인 측정 방법.
(1) 액상 중에서, 당해 시료와 완충액을 포함하는 제1 시약을 접촉시키는 공정
(2) 공정 (1) 후에, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 포함하는 제2 시약을 액상 중에 첨가하는 공정
제7항에 있어서, 상기 (1)의 액상 중의 염 농도가 700 내지 900mM인 측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, LRG와 항LRG 모노클로날 항체를 담지한 불용성 담체 입자의 복합체의 응집 정도를 측정하는 공정이, 광학적으로 측정하는 공정인 측정 방법.
제9항에 있어서, 광학적으로 측정하는 공정이 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도를 광학 기기로 측정하는 공정인 측정 방법.
혈액 시료 중의 LRG를 면역학적 측정법에 의해 측정하기 위한 시약이며, 적어도 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 포함하며,
불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 100nm 내지 340nm인 라텍스 입자이며, 임계 응집 농도가 65mM 내지 270mM인 라텍스 입자인 시약.
제11항에 있어서, 불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 150nm 내지 260nm인 라텍스 입자이며, 임계 응집 농도가 150mM 내지 270mM인 라텍스 입자인 측정 시약.
제11항 또는 제12항에 있어서, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입자경이 동일한 측정 시약.
제11항 또는 제12항에 있어서, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자가 등량 포함되어 있는 측정 시약.
제11항 또는 제12항에 있어서, 생체 유래 시료가 혈청인 측정 시약.
제11항 또는 제12항에 있어서, 면역 응집법이 호모지니어스법에 근거하는 방법인 측정 시약.
혈액 시료 중의 LRG를 면역 응집법에 의해 측정하기 위한 시약 키트이며, 이하를 포함하는 시약 키트.
(1) 완충액을 포함하는 제1 시약
(2) 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 포함하며, 불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 100nm 내지 340nm인 라텍스 입자이며, 임계 응집 농도가 65mM 내지 270mM인 라텍스 입자인, 제2 시약
제17항에 있어서, 불용성 담체 입자가, 평균 입자경이 150nm 내지 260nm인 라텍스 입자이며, 임계 응집 농도가 150mM 내지 270mM인 라텍스 입자인 시약 키트.
제17항 또는 제18항에 있어서, 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자와 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자의 평균 입자경이 동일한 시약 키트.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 (2)의 제2 시약이 제1 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자 및 제2 항LRG 모노클로날 항체를 담지하는 불용성 담체 입자를 등량 포함하는 시약 키트.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 (1)의 제1 시약이, 반응 액상 중의 염 농도가 700 내지 900mM이 되도록 염을 포함하는 시약 키트.
제17항 또는 제18항에 있어서, 추가로 이하를 포함하는 시약 키트.
(3) 표준 항원 및/또는 대조로서의 LRG
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