KR102731759B1

KR102731759B1 - 핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 변이를 검출하기 위한 방법, 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 및 이것들을 실시하기 위한 키트

Info

Publication number: KR102731759B1
Application number: KR1020247019351A
Authority: KR
Inventors: 나호히로 후지무라; 아미 다치바나; 도모아키 우치키; 미노루 다케우치; 요코 데루우치; 고지 와타나베
Original assignee: 니토 보세키 가부시기가이샤
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2024-11-21
Anticipated expiration: 2042-12-01
Also published as: KR20240099467A; EP4446434A1; CN118382708B; WO2023106198A1; JP7421718B2; JPWO2023106198A1; CN118382708A; US20250043335A1; EP4446434A4

Abstract

클램프-PCR 법에 의한 변이형 유전자의 검출 한계보다 낮은 변이형 유전자 함유율에서 변이형 유전자를 검출할 수 있는 간편한 방법 및 그것을 실시하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또, 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상으로 하는 염기 서열의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있는 간편한 방법 및 그것을 실시하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
핵산 증폭 반응에 있어서, 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b) (식 중, R¹은, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A) 와, 일반식 (I-c) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해의 증강제로서 사용한다.

Description

핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 변이를 검출하기 위한 방법, 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 및 이것들을 실시하기 위한 키트

본 발명은, 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하기 위한 방법, 및 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 그리고 이것들을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 클램프 핵산 (블로커 핵산이라고 불리는 경우도 있다) 을 사용하는 핵산 증폭 반응에 있어서, 특정한 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 존재하에서 핵산 증폭을 실시함으로써, 대상 염기 서열 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법 및 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 그리고 이것들을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다.

유전자의 돌연변이가 암의 기인이 되는 경우가 있어, 그러한 유전자의 돌연변이를 조기에 발견함으로써, 암의 조기 치료로 이어지는 것이 기대되고 있다. 또한, 어떤 특정한 유전자의 변이가 어떤 종류의 질병에 걸리기 쉬움, 약의 치료 효과, 부작용의 강약 등에 크게 관여하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 상피 증식 인자 수용체 (EGFR) 의 티로신 키나아제 저해제인 게피티닙 (상품명 : 이레사) 은, 특정한 유전자 변이를 갖는 일부의 폐암 환자에게는 큰 주효성 (奏效性) 을 나타내는 한편, 약 0.5 ％ 정도의 환자에게 위독한 간질성 폐렴을 일으키는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 1). 또한, 대장암에 있어서는, KRAS 유전자에 변이가 있으면 분자 표적약 세툭시맙 (상품명 : 얼비툭스) 의 주효율은 낮고, 변이가 없으면 주효율이 높은 것이 알려져 있다. 이 때문에, 환자마다 주효성이나 부작용을 예측할 수 있으면, 주효성을 기대할 수 없는 환자나 위독한 부작용이 예상되는 환자에 대한 투여를 앞두고, 부작용이 적은 효과적인 치료를 실시하는 것이 가능해진다.

이러한 점에서부터, 유전자의 변이를 밝히는 것은, 암의 조기 발견, 치료 효율의 향상 등의 면에서 중요한 것으로 인식되어, 이러한 니즈에 부응하기 위해, 유전자의 변이를 검출하는 다양한 기술 개발이 이루어지고 있다. 특히, PCR 법과 같은 유전자 증폭 기술 및 NGS 등의 망라적인 유전자 해석 기술에서는, 눈부신 진전이 보인다.

무엇보다, 종양 검체로부터 추출한 유전자에서는 대량의 야생형 유전자와 미량의 변이형 유전자를 포함하는데, 종래의 변이형 유전자를 검출하는 방법에서는, 여전히 미량의 변이형 유전자를 검출하는 데에는 충분한 감도를 갖지 않는 경우가 많다. 예를 들면, 유전자의 변이를 검출하는 수법의 하나로서, 변이형 유전자와 야생형 유전자를 비선택적으로 증폭시킨 후에, 전기 영동법 또는 하이브리다이제이션법 등으로 변이형 유전자를 야생형 유전자와 구별하는 방법이 있지만, 이 방법으로는, 야생형 유전자 중에 포함되는 극히 소량의 변이형 유전자를 충분한 감도 및 정밀도로 검출하는 것이 곤란하다.

이에 대해, 유전자 증폭의 단계에 있어서, 야생형 유전자의 기준 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 인공적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 야생형 유전자의 증폭을 저해하고 변이형 유전자를 선택적으로 증폭시키는, 이른바 「클램프법」이 개발되었다. 이 방법에서 사용되고 있는 인공 핵산은 클램프 핵산이라고 불리우며, 핵산 증폭 과정에서 (i) 야생형 유전자와 강하게 하이브리다이즈되지만, (ii) 변이형 유전자와는 강하게 하이브리다이즈되지 않고, (iii) 핵산 증폭 과정에서 분해되기 어렵다, 는 특성을 가지며, 이것을 이용하여 real-time PCR 을 실시하면, 변이형 유전자의 빈도가 1 ％ 까지 변이를 검출할 수 있고, 또한 real-time PCR 의 증폭 산물을 주형으로 다이렉트 시퀀스법을 실시하면 변이형 유전자의 빈도가 0.1 ％ 까지 변이를 검출할 수 있다고 되어 있다 (예를 들면, 특허문헌 1, 비특허문헌 2, 비특허문헌 3). 클램프 핵산으로는, peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA) 및 bridged nucleic acid (BNA) 가 개발되고, PNA-LNA clamp PCR 법, BNA clamp PCR 법 등의 증폭법이 개발되어 있다 (예를 들면, 비특허문헌 2, 3, 6 및 특허문헌 1 ∼ 9 참조).

그러나 이들 클램프법에 의해서도, 시료 중의 야생형 유전자의 비율에 대하여 변이형 유전자의 비율이 매우 낮은 경우에는, real-time PCR 을 실시하면 야생형 유전자를 증폭시켜 버려, 야생형 유전자와 변이형 유전자를 구별할 수 없는 경우가 있다. 또한, clamp PCR 의 증폭 산물을 주형으로 다이렉트 시퀀스법을 실시하면 변이형 유전자의 검출 감도를 높일 수는 있지만, 시퀀스 결정은, 방대한 검체를 즉석에서 처리하는 것이 요구되는 임상의 경우에는 적합하지 않다.

일본 특허 제6242336호 일본 특허 제5813263호 일본 특허 제4731324호 일본 특허 제4383178호 일본 특허 제5030998호 일본 특허 제4151751호 일본 공개특허공보 제2001-89496호 국제 공개 제2003/068795호 팜플렛 국제 공개 제2005/021570호 팜플렛 일본 특허 제3756313호 국제 공개 제2016/167320호 팜플렛

Thomas J., et.al., 2004, The NEW ENGLAND JURNAL of MEDICINE, 350 ; 21 Nagai K., et.al., 2005, Cancer Research, 65 : 7276-7282 Nishino K. et al., 2019, 폐암 환자에 있어서의 EGFR 유전자 변이 검사의 안내 제4.1판 Luming Z. et al., 2011 BioTechniques, 50 : 311-318 Nagakubo Y. et al., 2019, BMC Medical Genomics, 12 : 162 Murina F. F. et al., 2020, Molecules, 25(4) : 786

이와 같이, 임상이나 연구의 현장에 있어서, 시료 중의 야생형 유전자의 비율에 대하여 변이형 유전자의 비율이 매우 낮은 경우에도 변이형 유전자를 검출할 수 있는 방법에 대한 요구가 있어, 이것에 대응하는 수법의 연구가 진행되고 있다 (특허문헌 2, 비특허문헌 4, 및 비특허문헌 5). 그러나 종래의 방법은, 변이형 유전자를 고감도로 검출하기 위해서 고가의 기기나 2 단계 이상의 복잡한 해석 스텝을 필요로 하여 (비특허문헌 2), 임상의 현장이나 연구 현장에서는 간이한 방법으로 시료 중의 변이형 유전자를 고감도로 검출 가능한 방법이 요구되고 있다.

따라서 본 발명은, 종래의 클램프법에 의한 변이형 유전자의 검출 한계보다 낮은 변이형 유전자 함유율에서 변이형 유전자를 검출할 수 있는 간편한 방법 및 그것을 실시하기 위한 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상으로 하는 염기 서열의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있는 간편한 방법 및 그것을 실시하기 위한 키트를 제공하는 것도 목적으로 한다.

본 발명자들은, 클램프법에 의한 변이형 유전자의 검출 감도를 올리는 수법에 대해 검토를 거듭하는 와중에, 클램프 핵산과 함께 특정한 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 존재하에서 핵산 증폭 반응을 실시한 결과, 야생형 유전자의 증폭을 선택적으로 저해하는 클램프 핵산에 의한 효과가 당해 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 존재에 의해 증강되고, 이로써 변이형 유전자의 검출 감도를 높이는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 방법, 키트, 증강제 및 사용을 제공한다.

[1] 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법으로서,

상기 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,

일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 1]

(식 중, R¹은, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A) 와,

일반식 (I-c)

[화학식 2]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 사용하여, 상기 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하고,

상기 핵산 증폭 반응에 의해 얻어진 핵산 증폭 산물의 총량, 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수, 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양, 또는 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여, 상기 변이의 존재를 판정하는, 방법.

[2] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [1] 에 기재된 검출 방법.

[3] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [1] 에 기재된 검출 방법.

[4] 상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.

[5] 상기 핵산 증폭을 리얼타임 PCR 로 실시하는, [1] ∼ [4] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.

[6] 상기 시료 중의 핵산이 게놈 DNA 인, [1] ∼ [5] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.

[7] 상기 핵산 증폭 반응을 실시할 때에, 추가로 상기 표준 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하고,

상기 시료 중의 핵산을 주형으로 사용한 경우의 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수가, 상기 표준 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 사용한 경우의 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수와 비교하여 적었던 경우에, 상기 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 상기 변이가 존재한다고 판정하는, [1] ∼ [6] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.

[8] 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하기 위한 키트로서,

상기 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,

일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 3]

(식 중, R¹은, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A), 및

일반식 (I-c)

[화학식 4]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 포함하는 키트.

[9] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [8] 에 기재된 키트.

[10] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [9] 에 기재된 키트.

[11] 상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, [8] ∼ [10] 중 어느 한 항에 기재된 키트.

[12] 핵산 증폭 반응에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 시료 중의 핵산의 증폭을 억제하는 방법으로서,

상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,

일반식 (I-a) 혹은 (I-b)

[화학식 5]

(식 중, R¹은, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)

로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A), 및

일반식 (I-c)

[화학식 6]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 사용하여, 상기 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하는, 방법.

[13] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [12] 에 기재된 방법.

[14] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [12] 에 기재된 방법.

[15] 상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, [12] ∼ [14] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[16] 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 억제하기 위한 키트로서,

일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 7]

일반식 (I-c)

[화학식 8]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 포함하는, 키트.

[17] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [16] 에 기재된 키트.

[18] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [16] 에 기재된 키트.

[19] 상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, [16] ∼ [18] 중 어느 한 항에 기재된 키트.

[20]　클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해 효과를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제, 보다 구체적으로는, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 핵산 증폭을, 상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산에 의해 저해하는 효과를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제로서,

일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 9]

일반식 (I-c)

[화학식 10]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 포함하는, 증강제.

[21] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [20] 에 기재된 증강제.

[22] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [20] 에 기재된 증강제.

[23] 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해 효과를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제를 제조하기 위한 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 사용으로서,

상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체는,

일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 11]

일반식 (I-c)

[화학식 12]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 사용.

[24] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [23] 에 기재된 사용.

[25] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [23] 에 기재된 사용.

[26] 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해 효과를 증강하기 위한 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 사용으로서,

상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체는,

일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 13]

일반식 (I-c)

[화학식 14]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 사용.

[27] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [26] 에 기재된 사용.

[28] 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, [26] 에 기재된 사용.

상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체는, 그 자체로는 핵산 증폭 반응을 저해하지 않지만, 클램프 핵산에 의한 그것에 상보적인 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 효과를 선택적으로 증강할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 일 실시형태에 의하면, 시료 중에 있어서, 클램프 핵산에 상보적인 표준 염기 서열을 갖는 핵산에 대해, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 핵산의 비율이 매우 낮은 경우에도 (예를 들면, 0.1 ％ 이하), 클램프 핵산에 의해 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭이 선택적으로 저해되는 한편, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 핵산이 통상과 같이 증폭되어, 매우 고감도로 변이를 갖는 핵산의 검출을 간이한 방법에 의해 가능하게 한다.

도 1 의 a 는, 시험 1 에 있어서, PCR 반응을 저해하지 않는 경우의 핵산 증폭 곡선의 일례로서, 실시예 1 의 폴리머 (디알릴메틸아민염산염·이산화황 공중합체) 를 사용한 경우의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다. 도 1 의 b 는, 시험 1 에 있어서, PCR 반응을 저해하는 경우의 핵산 증폭 곡선의 일례로서, 비교예 1 의 폴리머 (디알릴아민염산염·이산화황 공중합체) 를 사용한 경우의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다.
도 2 는, BNA 를 포함하는 클램프 핵산 (BNA clamp) 의 존재하, 실시예 1 의 폴리머 (디알릴메틸아민염산염·이산화황 공중합체) 를 첨가하여, KRAS 변이형 유전자의 함유율이 10 ％, 1 ％, 0.10 ％, 0.01 ％ 또는 0 ％ (WT) 인 주형 DNA 를, 리얼타임 PCR 반응으로 증폭시켰을 때의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다.
도 3 의 a 는, BNA clamp 의 존재하, 폴리머 무첨가 조건으로, BRAF 변이형 유전자 유래의 DNA 의 함유율이 10 ％, 1 ％, 0.10 ％, 0.01 ％ 또는 0 ％ (WT) 인 주형 DNA 를, 리얼타임 PCR 반응으로 증폭시켰을 때의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다. 도 3 의 b 는, BNA clamp 의 존재하, 실시예 1 의 폴리머 (디알릴메틸아민염산염·이산화황 공중합체) 를 첨가하여, BRAF 변이형 유전자 유래의 DNA 의 함유율이 10 ％, 1 ％, 0.10 ％, 0.01 ％ 또는 0 ％ (WT) 인 주형 DNA 를, 리얼타임 PCR 반응으로 증폭시켰을 때의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다.

본 발명의 실시형태를 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정시켜 이해되어야 하는 것은 아니다.

본 발명은, 일 실시형태에 있어서, 클램프 핵산을 사용하는 핵산 증폭법에 있어서, 특정한 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 존재하에 핵산 증폭을 실시함으로써, 대상 염기 서열 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 다른 실시형태에 있어서, 핵산 증폭법에 있어서, 클램프 핵산 및 특정한 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 존재하에 핵산 증폭 반응을 실시함으로써, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 또 다른 실시형태에 있어서, 이들 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 또 다른 실시형태에 있어서, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해 효과의 증강제에 관한 것이다. 이하, 각 실시형태에 대해 상세하게 설명한다.

1. 대상 염기 서열 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법

본 발명의 일 실시형태는, 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 클램프 핵산과, 특정한 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 준비하고, 이들을 이용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하여, 대상 염기 서열이 표준 염기 서열에 대하여 변이를 갖는 경우에, 대상 염기 서열을 포함하는 영역을 표준 염기 서열보다 우선적으로 핵산 증폭시킴으로써, 변이의 존재를 검출하는 것이다.

시료

본 발명의 방법에 제공되는 시료는, 실시형태에 따라서, 변이의 검출이 소망되는 핵산 또는 증폭 저해 대상이 될 수 있는 핵산을 포함한다고 상정되는 시료이고, 본 실시형태에 있어서는, 변이의 검출이 소망되는 핵산을 포함한다고 상정되는 시료이다. 시료는, 예를 들어 포유 동물, 전형적으로는 인간으로부터 채취된 검체로부터 조제된 시료이다. 예를 들면, 혈액, 흉수, 기관지 세정액, 골수액, 림프액 등의 액체 시료, 또는 림프절, 혈관, 골수, 뇌, 비장, 피부 등의 고형 시료로부터 조제된 시료를 들 수 있다. 본 발명의 방법은 매우 높은 감도로 핵산의 변이를 검출할 수 있기 때문에, 예를 들면 암 등의 병변 부위로부터 채취된 검체로부터의 시료뿐만 아니라, 혈액 등의 변이형 유전자가 미량밖에 포함되지 않은 검체로부터의 시료를 이용할 수 있다.

대상 염기 서열

본원 명세서에 있어서, 「대상 염기 서열」이란, 본 발명의 실시형태에 의한 방법에 따라서, 변이 검출 또는 증폭 저해의 대상이 되는 1 이상의 염기로 이루어지는 염기 서열을 의미한다. 또한, 「시료 중의 핵산」은, 변이 검출 또는 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 포함할 수 있는 핵산이다. 단, 「대상 염기 서열」이, 실제로 변이를 갖는 것, 또는 실제로 증폭 저해되는 염기 서열을 포함하는 것까지는 의미하지 않으며, 「시료 중의 핵산」이, 실제로 변이 검출 또는 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 포함하는 것까지는 의미하지 않는다.

본 실시형태에 의한 방법에 있어서는, 「대상 염기 서열」은, 변이의 유무를 검출하는 대상이 되는 1 이상의 염기로 이루어지는 염기 서열이고, 「시료 중의 핵산」은, 변이의 유무를 검출하는 대상이 되는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 또한, 「대상 염기 서열을 포함하는 영역」은, 본 발명의 방법에 의해 증폭 대상이 되는 영역이다.

시료 중의 핵산

핵산은, DNA 여도 되고 RNA 여도 되며, 게놈 DNA, cDNA, 플라스미드 DNA, 무세포 DNA, 순환 DNA, RNA, miRNA, mRNA 등의 천연형 혹은 비천연형의 모든 핵산을 포함할 수 있다. 포유 동물, 전형적으로는 인간으로부터 채취된 검체로부터의 시료를 사용하는 경우에는, 변이 검출의 대상이 되는 핵산은, 많은 경우 DNA 이고, 전형적으로는 임상 상의 의의가 큰 게놈 DNA 이다.

게놈 DNA 로는, 예를 들면, 그 변이 (선천적 또는 후천적인 변이) 가 특정 질환의 발증 및/또는 치료 감수성에 관련되는 게놈 DNA 를 들 수 있다. 이러한 질환은 다수 알려져 있으며, 그 대표적인 예가 각종 암이다. 또한, 그 변이가 암의 발증 및/또는 치료 감수성에 관련되는 것이 알려져 있는 유전자로는, 예를 들면, ABL/BCR 융합 유전자 (만성 골수성 백혈병), HER2 유전자 (유방암), EGFR 유전자 (비소세포폐암), c-KIT 유전자 (소화관 간질 종양), KRAS 유전자 (대장암, 췌암), BRAF 유전자 (멜라노마, 대장암), PI3KCA 유전자 (폐암, 대장암), FLT3 유전자 (급성 골수성 백혈병), MYC 유전자 (여러가지 암), MYCN 유전자 (신경아세포종), MET 유전자 (폐암, 위암, 멜라노마), BCL2 유전자 (여포성 B 림프종), 및 EML4/ALK 융합 유전자 (폐암) 를 들 수 있다.

표준 염기 서열 및 변이

본원 명세서에 있어서, 「표준 염기 서열」이란, 「대상 염기 서열」의 변이를 검출하는 방법에 있어서, 「대상 염기 서열」이 변이를 갖고 있는지를 판단할 때의 기준이 되는 염기 서열을 의미하고, 「변이」는, 「대상 염기 서열」이 「표준 염기 서열」에 대하여 치환, 삽입, 결실, 역위, 중복, 전좌 또는 이들의 2 개 이상의 조합에 의해 어떠한 염기 서열의 상이를 가지고 있는 상태를 의미한다. 본원 명세서에 있어서, 이와 같은 「변이」는, 20 ％ 이하의 염기 서열의 상이, 10 ％ 이하의 염기 서열의 상이, 5 ％ 이하의 염기 서열의 상이, 또는 1 ％ 이하의 염기 서열의 상이어도 된다.

「표준 염기 서열」은, 검사 목적에 따라서 다양한 염기 서열을 선택할 수 있지만, 전형적으로는, 야생형의 핵산에서 유래하는 염기 서열이고, 바람직하게는 특정 질환의 발증 및/또는 치료 감수성에 관련되는 것이 알려져 있는 야생형 유전자에서 유래하는 염기 서열이다. 따라서, 「변이형 핵산」은, 전형적으로는, 야생형의 핵산에서 유래하는 염기 서열에 대해 치환, 삽입, 결실, 역위, 중복, 전좌 또는 이들의 2 개 이상의 조합에 의해 어떠한 염기 서열의 상이가 있는 핵산이며, 바람직하게는, 특정 질환의 발증 및/또는 치료 감수성에 관련되는 것이 알려져 있는 야생형 유전자에 대하여 이러한 염기 서열의 상이가 있는 핵산이다. 예를 들어, KRAS 유전자의 제 2 엑손의 12 번째 코돈 또는 13 번째 코돈의 변이는, 분자 표적약 세툭시맙의 주효율과 관련되는 것이 알려져 있다. 또한, BRAF 유전자에서는, 제 15 엑손의 600 번째 코돈의 변이는. 분자 표적약 세툭시맙 또는 파니투무맙의 주효율과 관련되는 것이 알려져 있다.

특정한 디알릴아민류·이산화황 공중합체가 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과를 특히 증대시키는 점에서, 상기 시료 중의 핵산에 포함되는, 변이를 포함하지 않는 대상 서열 (표준 염기 서열) 과, 상기 변이가 포함되는 대상 서열의 합계에 대해, 상기 변이가 포함되는 대상 염기 서열의 비율의 기대값은, 0.1 ％ 미만이어도 된다. 또한, 바람직한 실시형태에서는 0.05 ％ 이하여도 되고, 더욱 바람직한 실시형태에서는 0.01 ％ 이하여도 된다. 여기서, 변이가 포함되는 대상 염기 서열의 비율의 기대값은, 각 변이에 대하여 임상적으로 구해진다.

클램프 핵산

본원 명세서에 있어서, 「클램프 핵산」이란, 핵산 증폭을 저해하는 대상으로 한 「염기 서열」(실시형태에 따라서 「표준 염기 서열」인 경우도 「대상 염기 서열」인 경우도 있을 수 있다) 과 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 인공적인 핵산이다. 「클램프 핵산」은, 핵산 증폭을 저해하는 대상으로 한 「염기 서열」과 하이브리다이즈되어 핵산 증폭을 저해하지만, 그 염기 서열과 상보적이지 않은 염기 서열의 핵산은 강하게 하이브리다이즈되지 않아 핵산 증폭을 저해하지 않는다.

「대상 염기 서열」의 변이를 검출하는 방법에 있어서는, 「클램프 핵산」에 의해 핵산 증폭을 저해하는 대상이 되는 「염기 서열」은 「표준 염기 서열」이고, 「클램프 핵산」은, 「표준 염기 서열」에 하이브리다이즈되어 그 핵산 증폭을 저해한다.

비천연형 뉴클레오티드로는, 예를 들어, Peptide Nucleic Acid (PNA), Bridged nucleic acid (BNA), 포스페이트기를 갖는 펩티드 핵산 (PHONA), 모르폴리노 핵산을 들 수 있다. 또한, 제 1 세대의 BNA 는, Locked nucleic acid (LNA) 라고도 불린다 (예를 들어, 비특허문헌 2, 3 및 특허문헌 1, 2 참조).

PNA 를 포함하는 클램프 핵산 (PNA clamp) 은, 핵산의 인산 결합을 대신하여 펩티드 결합으로 골격을 형성하고 있는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 완전 수식형 인공 핵산이다. 수식 뉴클레오티드는, 전형적으로는, 뉴클레오티드의 당-인산 골격을, N-(2-아미노에틸)글리신을 단위로 하는 골격으로 치환하고, 메틸렌카르보닐 결합으로 염기를 결합시킨 구조를 갖는다. PNA 에 관한 상세는, 비특허문헌 6 에 기재하는 바와 같다. PNA clamp 는, 상보 구조의 DNA 사슬과의 하이브리다이즈능이 천연 DNA 보다 강하고, 핵산 분해 효소에 의한 분해를 받지 않는 점에서 클램프 핵산으로서 바람직한 특성을 가지고 있다.

BNA 를 포함하는 클램프 핵산 (BNA clamp) 은, 리보스의 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자를 가교한 구조를 갖는 1 이상의 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 인공 핵산이며, 제 1 세대의 BNA 는, Locked nucleic acid (LNA) 라고도 불린다. BNA clamp 는, 나선 구조가 고정화되어, 상보 사슬을 갖는 핵산에 하이브리다이즈되면 매우 안정적인 이중 가닥을 형성할 수 있다. 또, 수식된 뉴클레오티드의 수에 비례하여 상보 사슬을 갖는 핵산에 대한 결합이 강해지기 때문에, 핵산의 길이와 수식 뉴클레오티드의 수를 조정함으로써 적당한 하이브리다이즈능을 획득할 수 있어, 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬로 클램프 효과를 발휘시키는 것이 가능하다.

BNA clamp 의 대표적인 예는, 이하의 구조를 갖는 수식 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.

[화학식 15]

제 1 세대 BNA : 2',4'-BNA (LNA) (예를 들어, 특허문헌 10)

[화학식 16]

[화학식 17]

[화학식 18]

(식 중,

Base 는, 피리미딘 혹은 푸린 핵산 염기, 또는 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 탄소수 1 ∼ 5 의 알콕시기, 메르캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 메르캅토기, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬티오기, 아미노기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 아미노기, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기로 치환된 아미노기, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기 및 할로겐 원자 (예를 들어 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자) 로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기로 치환된 피리미딘 혹은 푸린 핵산 염기를 나타내고,

R₂는, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 또는 분기 사슬형의 알킬기, 탄소수 2 ∼ 20 의 직사슬 또는 분기 사슬형의 알케닐기, 탄소수 3 ∼ 10 의 시클로알킬기, 탄소수 6 ∼ 14 의 아릴기, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기가 탄소수 6 ∼ 14 의 아릴기로 치환되어 있는 아르알킬기, 아실기, 술포닐기, 또는 실릴기, 또는 표지 분자를 나타내고,

m 은, 0 ∼ 2 의 정수이고,

n 은, 1 ∼ 3 의 정수이다.)

식 (IV) 의 수식 뉴클레오티드는, 바람직하게는, Base 가 벤조일아미노푸린-9-일, 아데니닐, 2-이소부티릴아미노-6-하이드록시푸린-9-일, 구아니닐, 2-옥소-4-벤조일아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일, 시토시닐, 2-옥소-5-메틸-4-벤조일아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일, 5-메틸시토시닐, 우라시닐 및 티미닐기로 이루어지는 군에서 선택되고, R₁ 이 메틸기이고, m 이 0 이고, n 이 1 이다.

단, 본 발명에서 사용되는 BNA 는 상기에 한정되는 것은 아니며, 다른 BNA (예를 들어, 5'-amino-2',4'-BNA, 2',4'-BNACOC, 2',4'-BNANC 등) 도 사용할 수 있다. 또한, BNA clamp 에서는, 수식 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 사이, 또는 수식 뉴클레오티드 사이의 결합은 통상 인산디에스테르 결합이지만, 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. BNA 및 BNA clamp 의 상세에 대해서는 특허문헌 1 ∼ 10 에 기재되어 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는, 이들 문헌 등의 공지된 기술적 사항으로부터 어떠한 인공 핵산이 BNA clamp 에 해당하는지를 용이하게 이해할 수 있다.

클램프 핵산으로는, 비교적 적은 뉴클레오티드로 상보적인 서열의 핵산과 안정적인 이중 가닥을 형성하고, 당해 핵산의 핵산 증폭을 선택적으로 저해할 수 있는 (후술하는, 인터칼레이터법과 같은 야생형 유전자의 증폭 사이클수를 기준으로 한 변이 검출법을 사용한 경우에 있어서, ΔΔΔCt 값이 크다) 점에서, BNA clamp 가 바람직하고, 특히 식 (IV) 의 구조의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 BNA clamp 가 바람직하다.

클램프 핵산의 길이 및 비천연형 뉴클레오티드의 수는, 핵산 증폭을 저해하는 대상이 되는 핵산에 대한 결합력을 결정하는 인자이다. 따라서, 이들 인자는, 핵산 증폭을 저해하는 대상이 되는 핵산 (변이를 검출하는 방법에서는, 표준 염기 서열을 갖는 핵산이다) 에 강력하게 결합하여, 당해 핵산의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있도록 적절히 설정하는 것이 바람직하다. 이 점에서, 클램프 핵산의 길이는, 통상 5 ∼ 50 mer 이고, 바람직하게는 6 ∼ 30 mer 이고, 보다 바람직하게는 7 ∼ 25 mer 이고, 더욱 바람직하게는 8 ∼ 20 mer 이고, 특히 바람직하게는 9 ∼ 15 mer 이다.

또, 클램프 핵산에 있어서의 비천연형 핵산의 비율은, 동일한 점에서, 통상 10 ∼ 100 ％ 이고, 바람직하게는 30 ∼ 95 ％이고, 보다 바람직하게는 40 ∼ 90 ％ 이고, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 85 ％ 이고, 특히 바람직하게는 60 ∼ 80 ％ 이다.

클램프 핵산의 합성은, 특허문헌 7 ∼ 10 등의 문헌에 기초하여 실시할 수 있다. 또한, 클램프 핵산의 합성을 수탁하는 업자에게 위탁해도 된다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체

본 발명의 방법에 있어서는, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시할 때에, 상기 클램프 핵산과 함께, 특정 구조를 갖는 디알릴아민류·이산화황 공중합체가 존재하는 상태에서 핵산 증폭 반응을 실시한다. 본 발명에서 사용되는 디알릴아민류·이산화황 공중합체는, 스스로는 핵산 증폭 반응을 저해하지 않지만, 클램프 핵산에 의한 선택적인 핵산 증폭 저해 효과를 증강시키는 것으로, 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 19]

일반식 (I-c)

[화학식 20]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 공중합체이다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체는, 상기 구성 단위 (A) 와 상기 구성 단위 (B) 를 포함하는 공중합체이고, 따라서 구성 단위 (A) 및 구성 단위 (B) 만으로 구성되어 있어도 되고, 구성 단위 (A) 및 구성 단위 (B) 에 추가하여, 그 이외의 구성 단위를 가지고 있어도 된다. 그 이외의 구성 단위로는, 구성 단위 (A) 이외의 각종 카티온성 구성 단위, 구성 단위 (B) 이외의 각종 논이온성 구성 단위, 각종 아니온성 구성 단위 등을 들 수 있다.

구성 단위 (A) 와 구성 단위 (B) 의 합계가 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 전체 구성 단위에서 차지하는 비율에는 특별히 제한은 없지만, 통상 80 몰％ 이상이고, 바람직하게는 80 ∼ 100 몰％ 이고, 보다 바람직하게는 90 ∼ 100 몰％ 이고, 특히 바람직하게는 95 ∼ 100 몰％ 이다.

구성 단위 (A)

본 발명에 있어서 사용되는 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 구성하는 구성 단위 (A) 는, 상기 특정한 구조를 갖는, 디알릴아민계의 구성 단위이다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체는, 구성 단위 (A) 1 종류만을 포함하고 있어도 되고, 2 종류 이상의 구성 단위 (A) 를 포함하고 있어도 된다. 2 종류 이상의 구성 단위 (A) 를 포함하고 있는 경우, 상기 서술한 구성 단위 (A) 와 구성 단위 (B) 의 합계가 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 전체 구성 단위에서 차지하는 비율이나, 구성 단위 (A) 와 구성 단위 (B) 의 비율은, 당해 2 종류 이상의 구성 단위 (A) 의 합계량에 기초하여 계산된다.

구성 단위 (A) 는, 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 21]

로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는다.

일반식 (I-a) 및 일반식 (I-b) 중, R¹ 은, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.

어느 선택지라도, R¹ 은 적어도 1 개의 탄소 원자를 갖는 기가 되기 때문에, 구성 단위 (A) 는, 제 3 급의 아미노기를 포함하는 구조를 갖는 구성 단위가 된다.

R¹은, 탄소수 5 이하의 알킬기 또는 벤질기인 것이 바람직하고, 메틸기 또는 에틸기인 것이 보다 바람직하고, 메틸기인 것이 특히 바람직하다.

구성 단위 (A) 는, 상기의 구조식 (1-a), 또는 (1-b) 로 나타내는 구조의 무기산염, 혹은 유기산염 등인 구조, 즉 산 부가염인 구조를 가지고 있어도 된다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체의 제조시에 있어서는, 제조 비용 등의 관점에서는, 부가염을 갖는 디알릴아민 모노머를 사용하여 구성 단위 (A) 를 도입하는 것이 바람직하다. 중합체로부터 HCl 등의 부가염을 제거하는 프로세스는 번잡하여, 비용 증대의 원인이 되기도 하기 때문에, 그와 같은 프로세스를 필요로 하지 않고 제조 가능한, 부가염형의 구성 단위 (A) 를 사용하는 것은, 비용 등의 관점에서도 바람직한 실시형태이다.

입수의 용이함이나 반응의 제어성 등의 관점에서, 이 실시형태의 구성 단위 (A) 에 있어서의 무기산염, 또는 유기산염은, 염산염, 카르복실산염, 술폰산염, 또는 알킬술페이트염인 것이 바람직하고, 염산염인 것이 특히 바람직하다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체라는 명칭에도 나타나 있는 바와 같이, 구성 단위 (A) 는, 통상 디알릴아민계 단량체로부터 유도되는 것이다.

바람직한 구성 단위 (A) 의 보다 구체적인 예로서, 디알릴메틸아민으로부터 유도되는 구성 단위 및 그 염산염, 디알릴에틸아민으로부터 유도되는 구성 단위 및 그 염산염 등을 들 수 있다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체의 전체 구성 단위에서 차지하는 구성 단위 (A) 의 비율은, 통상 40 몰％ 이상이고, 바람직하게는 50 ∼ 80 몰％ 이고, 특히 바람직하게는 50 ∼ 70 몰％ 이다. 2 종류 이상의 구성 단위 (A) 를 포함하는 경우의 상기 비율은, 당해 2 종류 이상의 구성 단위 (A) 의 합계량에 기초하여 정의된다.

구성 단위 (B)

본 발명에 있어서 사용되는 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 구성하는 구성 단위 (B) 는, 일반식 (I-c)

[화학식 22]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.

본 발명의 방법, 키트, 및 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해에 관하여, 구성 단위 (A) 단독으로 구성되는 중합체에서는, 그 강력한 카티온 차지에 의해 PCR 반응이 저해될수록, 이중 가닥을 구성하는 핵산간의 결합이 강화되어 버리는 바, 상기 구성 단위 (A) 에 추가하여 구성 단위 (B) 를 갖는 디알릴아민류·이산화황 공중합체에서는, 구성 단위 (B) 에 의해 구성 단위 (A) 의 카티온 차지가 적당히 간섭된다. 이 때문에, 클램프법에 의한 변이형 유전자의 검출 한계보다 낮은 변이형 유전자 함유율에서 변이형 유전자를 검출할 수 있고, 핵산 증폭 반응에 있어서 대상으로 하는 염기 서열의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체라는 명칭에도 나타나 있는 바와 같이, 구성 단위 (B) 는, 통상 이산화황으로부터 유도되는 것이다.

구성 단위 (B) 가 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 전체 구성 단위에 차지하는 비율은, 10 몰％ 이상인 것이 바람직하다.

구성 단위 (B) 의 비율은, 20 ∼ 50 몰％ 인 것이 보다 바람직하고, 30 ∼ 50 몰％ 인 것이 특히 바람직하다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체에 있어서의, 구성 단위 (A) 와 구성 단위 (B) 의 비율에도 특별히 제한은 없고, 본 발명의 목적과의 관계에 있어서 적절히 설정할 수 있으며, 또 공중합 가능한 한, 임의의 비율로 할 수 있다. 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 고분자량화의 관점에서는, 양 구성 단위의 비율은 크게는 상이하지 않은 것이 바람직하고, 예를 들어 구성 단위 (A) 와 구성 단위 (B) 의 몰비가 90 : 10 ∼ 40 : 60 인 것이 바람직하고, 80 : 20 ∼ 50 : 50 인 것이 보다 바람직하고, 70 : 30 ∼ 50 : 50 인 것이 특히 바람직하다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체에 있어서의, 구성 단위 (A) 및 구성 단위 (B) 의 몰비는, 구성 단위 (A) 의 구조가 이미 알려진 경우, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 이소프로필알코올 또는 아세톤 등의 유기 용매로 재침하고, 재침물에 대해, Perkin Elmer 2400II CHNS/O 전자동 원소 분석 장치 또는 동등한 성능의 장치를 사용하여, 상기 구성 단위의 구조에 따른 적절한 모드로 분석함으로써 특정할 수 있다. 또한, 측정은, 캐리어 가스로서 헬륨 가스를 사용하고, 주석 캡슐에 고체 시료를 칭량하여, 연소관 내에 낙하하고 순산소 가스 중에서 연소 온도 1800 ℃ 이상에서 시료를 연소시켜, 분리 칼럼 및 열전도 검출기에 의한 프론탈 크로마토그래피 방식으로 각 측정 성분을 검출하고, 교정 계수를 사용하여 각 원소의 함유율을 정량함으로써 실시할 수 있다. 또한, 디알릴아민류·이산화황 공중합체에 있어서의 구성 단위 (A) 의 구조를 알고 있지 않은 경우, 상기 원소 분석 장치에 의한 측정 전에, 1H-NMR 또는 13C-NMR 을 사용한 공지된 방법에 의해, 구성 단위 (A) 의 구조를 특정한다. 또한, 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 제조 (공중합) 에 있어서 공급한 각 단량체의 양, 및 디알릴아민류·이산화황 공중합체에 도입되지 않고 잔류한 각 단량체의 양으로부터 계산할 수도 있다. 또한, 디알릴아민류·이산화황 공중합체에 있어서의 각 단량체로부터 유도되는 구성 단위의 비율 (몰비) 은, 각 구성 단위의 투입 조성 (몰비) 과 거의 일치하기 때문에, 본 명세서에서는 편의적으로 모노머의 배합비를 구성 단위의 비율 (몰비) 로서 취급하는 경우가 있다.

상기를 종합하면, 디알릴아민류·이산화황 공중합체로는, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 및 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체가 바람직하고, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 및 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체가 특히 바람직하다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체는, 상기 구성 단위 (A) 및 구성 단위 (B) 에 추가하여, 그 이외의 구성 단위를 가지고 있어도 된다.

그 이외의 구성 단위로는, 구성 단위 (A) 이외의 각종 카티온성 구성 단위, 구성 단위 (B) 이외의 각종 논이온성 구성 단위, 각종 아니온성 구성 단위 등을 들 수 있다.

(C) 구성 단위 (A) 이외의 카티온성 구성 단위

구성 단위 (A) 이외의 각종 카티온성 구성 단위 (C) 로는, 구성 단위 (A) 이외의 디알릴아민 구성 단위, 예를 들어 제 2 급 또는 제 4 급의 아미노기를 갖는 디알릴아민 구성 단위, 혹은 그 부가염, 각종 모노알릴아민계 구성 단위 혹은 그 부가염, 카티온성 (메트)아크릴아미드계 구성 단위 등을 들 수 있다.

그 중에서도, 제 2 급의 아미노기를 갖는 디알릴아민 구성 단위를 바람직하게 사용할 수 있다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체가 구성 단위 (A) 이외의 카티온성 구성 단위를 갖는 경우의 당해 카티온성 구성 단위의 함유량에는 특별히 제한은 없고, 또 당해 카티온성 구성 단위의 종류에 따라서도 그 바람직한 양은 상이하지만, 20 몰％ 이하인 것이 바람직하고, 0 ∼ 10 몰％ 인 것이 특히 바람직하다.

(D) 아니온성 구성 단위

구성 단위 (A) 및 (B) 이외의 구성 단위로서 도입 가능한 아니온성 구성 단위 (D) 로는, 카르복실기 등의 아니온성기를 갖는 구성 단위이면 되고, 특별히 그 이외의 제한은 존재하지 않지만, 바람직한 예로서 말레산, 푸마르산 등의 불포화 디카르복실산계 단량체로부터 유도되는 구성 단위, 아크릴산, 메타크릴산 등의 불포화 모노카르복실산계 단량체로부터 유도되는 구성 단위 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 말레산, 아크릴산을 바람직하게 사용할 수 있다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체가 아니온성 구성 단위를 갖는 경우의 구성 단위 (B) 이외의 아니온성 구성 단위의 함유량에는 특별히 제한은 없고, 또한 아니온성 구성 단위의 종류에 따라서도 그의 바람직한 양은 상이하지만, 20 몰％ 이하인 것이 바람직하고, 0 ∼ 10 몰％ 인 것이 특히 바람직하다.

아니온성 구성 단위 (D) 는, 구성 단위 (A) 의 카티온 차지를 조정한다는 관점에서, 구성 단위 (A) 가 갖는 카티온 차지가 과대한 경우에는 상기의 범위에서 포함되는 것이 바람직하지만, 구성 단위 (A) 가 갖는 카티온 차지가 적당한 경우에는, 포함되지 않는 것이 바람직하다.

(E) 구성 단위 (B) 이외의 논이온성 구성 단위

본 실시형태에 있어서의 구성 단위 (B) 이외의 논이온성 구성 단위 (E) 는, 구성 단위 (A) 및 아니온성 구성 단위 (B) 와 공중합 가능한, 이산화황 이외의 비이온성 단량체로부터 유도되는 구성 단위이면 되고, 특별히 그 이외의 제한은 없지만, 메타크릴산에스테르계 단량체, 아크릴산에스테르계 단량체, 메타크릴아미드계 단량체, 아크릴아미드계 단량체 등으로부터 유도되는 구성 단위를 바람직하게 사용할 수 있다. 보다 구체적인 예로는, 메타크릴산메틸, 메타크릴산에틸, 메타크릴산부틸, 아크릴산메틸, 아크릴산에틸, 아크릴산부틸, 메타크릴아미드, N-메틸메타크릴아미드, 디메틸메타크릴아미드, N-(3-디메틸아미노프로필)메타크릴아미드, 아크릴아미드, 디메틸아크릴아미드, 하이드록시에틸아크릴아미드, 디메틸아미노프로필아크릴아미드, 디메틸아미노프로필아크릴아미드염화메틸4급염, 아크릴로일모르폴린, 이소프로필아크릴아미드, 4-t-부틸시클로헥실아크릴레이트 등으로부터 유도되는 구성 단위를 들 수 있다. 그 중에서도, 아크릴아미드, 하이드록시에틸아크릴아미드 또는 디메틸아크릴아미드로부터 유도되는 구성 단위를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

구성 단위 (B) 이외의 논이온성 구성 단위는, 통상 단량체로서 비이온성의 단량체를 사용함으로써, 고분자 중에 도입할 수 있다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체가 구성 단위 (B) 이외의 논이온성 구성 단위를 갖는 경우의 구성 단위 (B) 이외의 당해 논이온성 구성 단위의 함유량에는 특별히 제한은 없으며, 또 당해 논이온성 구성 단위의 종류에 따라서도 그 바람직한 양은 상이하지만, 20 몰％ 이하인 것이 바람직하고, 0 ∼ 10 몰％ 인 것이 특히 바람직하다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체의 분자량에는 특별히 제한은 없고, 본 발명의 방법, 키트 등에 있어서의 사용 형태나 다른 성분 등과의 관계에서 적절히 바람직한 분자량의 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 입수 또는 중합하면 된다.

핵산 등과 반응액을 형성하기 용이함이나, 실용상 허용 가능한 시간 및 비용으로 중합을 실시하는 관점에서는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 중량 평균 분자량 (Mw) 은 300 ∼ 30000 인 것이 바람직하다. 중량 평균 분자량 (Mw) 은, 1000 ∼ 9000 인 것이 보다 바람직하다. 중량 평균 분자량 (Mw) 은, 1500 ∼ 6000 인 것이 더욱 바람직하고, 2000 ∼ 4000 인 것이 특히 바람직하다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체의 중량 평균 분자량 (Mw) 은, 예를 들어, 액체 크로마토그래프를 사용하여, 겔 퍼미에이션 크로마토그래피 (GPC 법) 에 의해 측정할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들어 히타치 L-6000 형 고속 액체 크로마토그래프를 사용하여, 이하의 방법으로 상기 중량 평균 분자량을 측정할 수 있다. 용리액 유로 펌프로서 히타치 L-6000, 검출기로서 쇼덱스 RI-101 시차 굴절률 검출기, 칼럼으로서 쇼덱스 아사히팍의 수계 겔 여과 타입의 GS-220HQ (배제 한계 분자량 3,000) 와 GS-620HQ (배제 한계 분자량 200만) 를 직렬로 접속한 것을 사용한다. 샘플을 용리액으로 0.5 g/100 ml 의 농도로 조제하고, 20 μl 를 사용한다. 용리액에는, 0.4 몰/리터의 염화나트륨 수용액을 사용한다. 칼럼 온도는 30 ℃ 이고, 유속은 1.0 ml/분으로 실시한다. 표준 물질로서, 분자량 106, 194, 440, 600, 1470, 4100, 7100, 10300, 12600, 23000 등의 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 교정 곡선을 구하고, 그 교정 곡선을 바탕으로 공중합체의 중량 평균 분자량 (Mw) 을 구한다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체의 분자량은, 중합에 기여하는 모노머의 종류 및 조성, 중합 공정에 있어서의 온도, 시간 및 압력, 중합 공정에서 사용하는 라디칼 개시제 등의 종류 및 양 등을 조정함으로써, 적절히 조정할 수 있다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체의 회전 점도 [η] 에도 특별히 제한은 없으며, 본 발명의 방법, 키트 등에 있어서의 사용 형태나 제조 비용 등을 고려하여 적절히 설정할 수 있지만, 25.0 질량％ 수용액의 상태에서, 1.0 ∼ 150.0 mPa·s (25 ℃) 인 것이 바람직하고, 1.5 ∼ 30.0 mPa·s (25 ℃) 인 것이 보다 바람직하고, 2.0 ∼ 20.0 mPa·s (25 ℃) 인 것이 특히 바람직하다.

회전 점도 [η] 는, 당업계에 있어서 관용되는 방법에 의해 측정할 수 있지만, 예를 들어, AMETEK Brookfield 제조 디지털 B 형 점도계 DV-3T 에 의해 측정할 수 있다. 측정에 있어서는, ULA 어댑터를 사용하고, 전형적으로는 액량 16 mL, 액온 25 ℃ 에서 측정할 수 있다.

회전 점도 [η] 도, 중합시의 희석 농도, 중합에 기여하는 모노머의 종류 및 조성, 중합 공정에서의 온도, 시간 및 압력, 중합 공정에서 사용하는 라디칼 개시제 등의 종류 및 양 등을 조정함으로써, 적절히 조정할 수 있다.

디알릴아민류·이산화황 공중합체의 제조 방법

디알릴아민류·이산화황 공중합체의 제조 방법에는 특별히 제한은 없고, 종래 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법으로 제조할 수 있지만, 예를 들어 구성 단위 (A) 에 대응하는 구조의 디알릴아민계 단량체, 및 구성 단위 (B) 에 대응하는 통상은 이산화황인 단량체, 그리고 원하는 바에 따라서 그 이외의 구성 단위에 대응하는 구조의 단량체를 공중합함으로써 제조할 수 있다.

디알릴아민계 단량체, 및 이산화황 등을 공중합하는 경우의 용매는 특별히 한정되지 않고, 수계 용매여도 되고, 알코올, 에테르, 술폭시드, 아미드 등의 유기계 용매여도 되지만, 수계 용매인 것이 바람직하다.

디알릴아민계 단량체, 및 이산화황 등을 공중합하는 경우의 단량체 농도는 단량체의 종류에 따라, 또한 공중합을 실시하는 용매의 종류에 따라 상이하지만, 수계 용매의 경우 통상 10 ∼ 75 질량％ 이다. 이 공중합 반응은, 통상, 라디칼 중합 반응이며, 라디칼 중합 촉매의 존재하에 실시된다. 라디칼 중합 촉매의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 그 바람직한 예로서, t-부틸하이드로퍼옥사이드 등의 과산화물, 과황산암모늄, 과황산나트륨, 과황산칼륨 등의 과황산염, 아조비스계, 디아조계 등의 수용성 아조 화합물을 들 수 있다.

라디칼 중합 촉매의 첨가량은, 일반적으로는 전체 단량체에 대해 0.1 ∼ 20 몰％, 바람직하게는 1.0 ∼ 10 몰％ 이다. 중합 온도는 일반적으로는 0 ∼ 100 ℃, 바람직하게는 5 ∼ 80 ℃ 이고, 중합 시간은 일반적으로는 1 ∼ 150 시간, 바람직하게는 5 ∼ 100 시간이다. 중합 분위기는, 대기 중에서도 중합성에 큰 문제를 일으키지 않지만, 질소 등의 불활성 가스의 분위기에서 실시할 수도 있다.

핵산 증폭 반응

본 실시형태에 의한 방법에서는, 클램프 핵산과 특정 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 사용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시한다.

핵산 증폭법으로는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 리얼타임 PCR 법, 디지털 PCR 법, 전통적인 PCR 법, RT-PCR 법 등의 PCR 법, LAMP 법, ICAN 법, NASBA 법, LCR 법, SDA 법, TRC 법, TMA 법을 들 수 있다. 핵산 증폭법은, 수법의 범용성·간편성의 관점에서 PCR 법이 바람직하고, 핵산 증폭물의 정량이 용이한 점에서, 리얼타임 PCR 법이 보다 바람직하다.

핵산 증폭용 반응액의 조성은, 사용하는 핵산 증폭법에 따라 다소 상이하지만, 통상은, 상기 서술한 클램프 핵산 및 디알릴아민류·이산화황 공중합체에 추가하여, 프라이머 세트와, 기질로서의 데옥시뉴클레오시드 삼인산 (예를 들면, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP : 이하 일괄하여 dNTP 라고 부른다) 과, 핵산 합성 효소 (예를 들면, DNA 폴리메라아제) 를 버퍼 중에 포함하고, 경우에 따라서는, 핵산 합성 효소의 보조 인자로서 마그네슘 이온 (예를 들면, 반응액 중 1 ∼ 6 mM 의 농도로 포함한다) 을 포함해도 된다.

또한, 리얼타임 PCR 법 등의 핵산 증폭과 증폭된 핵산의 검출을 동시에 실시하는 핵산 증폭법을 사용하는 경우에는, 인터칼레이터, 형광 표지 프로브, 사이클링 프로브 등의 적당한 검출용 시약도 핵산 증폭용 반응액 중에 포함한다.

프라이머 세트는, 대상 염기 서열을 포함하는 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭 가능하면 되고, 통상, 증폭 대상으로 하는 영역에 인접하는 소정의 영역에 하이브리다이즈되도록 설계되지만, 프라이머는 대상 염기 서열의 일부에 하이브리다이즈되는 서열을 포함하고 있어도 된다.

프라이머는, DNA, RNA 등의 핵산에 의해 구성할 수 있다. 프라이머의 농도는, 통상, 반응액 중 20 nM ∼ 2 μM 의 범위에서 적절한 농도를 선택하면 된다. 프라이머의 길이는, 통상 5 ∼ 40 mer 이고, 바람직하게는 12 ∼ 35 mer 이고, 보다 바람직하게는 14 ∼ 30 mer 이고, 더욱 바람직하게는 15 ∼ 25 mer 이다. 프라이머 사이의 거리, 즉 증폭 대상으로 하는 영역은 통상 50 ∼ 5000 염기이고, 바람직하게는 100 ∼ 2000 염기이다. 프라이머의 설계는 매뉴얼로 실시해도 되고, 적당한 프라이머 디자인용의 소프트웨어를 사용해도 된다. 이러한 소프트로는, 예를 들면, Primer3 소프트웨어 (http://frodo.wi.mit.edu) 등을 들 수 있다.

dNTP 의 농도는, 통상 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP 의 반응액 중의 각각의 농도가 100 ∼ 400 μM 의 범위가 되는 농도에서 선택하면 된다. 핵산 합성 효소로는, 예를 들면, DNA 폴리메라아제, RNA 폴리메라아제, 역전사 효소 등을 들 수 있고, 사용하는 핵산 증폭법에 따라서, 적합한 성질의 효소를 사용하면 된다. 예를 들면, PCR 법이면, TaqDNA 폴리메라아제, PfuDNA 폴리메라아제, 기타 바이오사이언스 관련의 각사에 의해 개발된 각종 내열성 DNA 폴리메라아제가 바람직하게 사용된다.

버퍼는, 사용하는 DNA 폴리메라아제의 최적 pH 및 최적 염 농도를 갖는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 핵산 증폭법에 따라서는, 추가로 리보뉴클레아제 H (RNaseH) 나 역전사 효소 (RT) 등을 포함하고 있어도 된다. 또한, 각 핵산 증폭법에 대해서 다양한 키트가 시판되고 있으므로, 핵산 증폭용 반응액은, 그러한 시판 키트에 첨부된 것을 사용해도 된다.

핵산 증폭 반응의 주형이 되는 핵산, 즉 「시료 중의 핵산」의 반응액 중의 농도는, 통상 반응액 100 μl 당 0.3 ng ∼ 3 μg 으로 하면 되지만, 주형이 되는 핵산의 양이 지나치게 많으면 비특이적 증폭의 빈도가 증가하기 때문에, 반응액 100 μl 당 0.5 μg 이하로 억제하는 것이 바람직하다.

반응액 중의 클램프 핵산의 양으로는, 시료 중의 표준 염기 서열을 갖는 핵산 (예를 들어, 야생형 핵산) 의 양에 대한 변이를 갖는 것으로 상정되는 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 양에 따라서, 대상 염기 서열이 변이를 갖는 경우에, 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭이 충분히 저해되고, 변이를 갖는 대상 염기 서열을 포함하는 핵산이 우선적으로 증폭되는 양을 선택하는 것이 바람직하다. 시료 중에서는 통상, 변이형 핵산에 대하여 야생형 핵산이 대다수이기 때문에, 10 nM ∼ 1 μM 으로 하는 것이 바람직하고, 20 nM ∼ 500 nM 이 보다 바람직하고, 50 nM ∼ 200 nM 이 특히 바람직하다.

반응액 중의 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 농도는, 핵산 증폭 반응에 악영향을 미치지 않고, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 반응의 선택적 저해 효과를 증강할 수 있도록 적절한 농도를 선택하는 것이 바람직하다. 반응액 중의 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 농도는 중합체의 종류에 따라서도 상이하지만, 이 점에서, 통상 0.001 ∼ 0.500 질량％ 로 하면 되고, 바람직하게는 0.005 ∼ 0.100 질량％ 이고, 보다 바람직하게는 0.010 ∼ 0.050 질량％ 이고, 특히 바람직하게는 0.020 ∼ 0.030 질량％ 이다.

상기 서술한 클램프 핵산과 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 사용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하면, 클램프 핵산은 표준 염기 서열을 갖는 핵산에 강하게 결합하여, 증폭 반응 동안의 프라이머의 어닐링 및/또는 프라이머의 신장을 저해하고, 공존하는 디알릴아민류·이산화황 공중합체는 이 저해 효과를 증강시킨다. 한편, 클램프 핵산의 결합력은 표준 염기 서열에 대하여 변이를 갖는 염기 서열에 대해서는 대폭 저하되기 때문에, 어닐링 및 프라이머의 신장은 거의 저해되지 않고 통상적인 핵산 증폭 반응을 일으킨다. 또한, 디알릴아민류·이산화황 공중합체는, 그 자체로는 핵산 증폭 반응을 저해하지 않는다. 이 결과, 본 실시형태의 방법에 의하면, 시료 중의 핵산 중, 변이를 갖는 핵산이 미량 (예를 들면, 0.1 ％ 이하 또는 0.05 ％ 이하, 특히 0.02 ％ 이하인 경우) 이고, 표준 염기 서열을 갖는 핵산이 지배적인 경우라도, 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭이 선택적으로 저해되고, 변이를 갖는 핵산이 우선적으로 증폭되기 때문에, 극히 미량으로 포함되는 변이를 갖는 핵산의 검출이 가능해진다.

본 실시형태의 방법에 있어서는, 상기 서술한 핵산 증폭 반응의 특성을 이용하여 변이의 존재를 검출한다. 즉, 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭이 선택적으로 저해되는 한편, 대상 염기 서열이 표준 염기 서열에 대하여 변이를 갖는 경우에는, 대상 염기 서열을 포함하는 영역이 우선적으로 증폭되어, 그 결과, 변이의 유무에 의해, 핵산 증폭 반응의 진행 속도, 반응 산물의 양 등에 차이를 일으키기 때문에, 이것들을 변이의 검출에 이용한다.

본 실시형태에 있어서, 변이의 검출은, 증폭 반응의 최종 산물에 대하여 검출을 실시하는 방법과, 증폭 반응 중에 경시적으로 증폭을 확인하는 방법이 있고, 예를 들면, 얻어진 핵산 증폭 산물의 총량, 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수, 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양, 또는 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여, 변이를 검출할 수 있다. 특히, 실시의 간편함이나 적응 범위가 넓다는 점에서, 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여 변이를 검출하는 방법이 바람직하다.

또한, 다이렉트 시퀀스법 등에 의해 증폭 산물의 염기 서열을 확인함으로써, 정확하고 또한 고감도의 검출이 가능하다. 단, 후술하는 실시예에서 실증하는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 시퀀스 결정에 상관없이, 정확하고 또한 고감도로 변이의 검출이 가능하다.

핵산 증폭 산물의 총량에 기초하여 변이를 검출하는 방법으로는, 예를 들어, 증폭 반응 후의 용액을 페놀·클로로포름 (1 : 1) 용액으로 제(除)단백 처리 후, 수층을 직접, 또는 에탄올 침전 후에, 적당한 정제 키트를 사용하여 정제하고, 정제 용액의 파장 260 nm 의 흡광도를, 흡광 광도계를 사용하여 측정하는 방법 ; 증폭 산물을 전기 영동에 의해 아가로오스겔, 또는 폴리아크릴아미드겔로 전개한 후, 적당한 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션법에 의해 검출하는 방법 ; 금 나노 입자를 사용한 크로마토 하이브리다이제이션법에 의해 검출하는 방법 ; 증폭시킨 핵산에 의한 용액의 탁도를 측정하는 방법 ; 증폭 프라이머의 5' 말단을 미리 형광 표지해 두고, 증폭 반응 후에 아가로오스겔, 또는 폴리아크릴아미드겔로 전기 영동 후, 이미징 플레이트에 형광 발광을 도입하고, 적당한 검출 장치를 사용하여 검출하는 방법 등을 들 수 있다.

핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여 변이를 검출하는 방법으로는, 인터칼레이터법, TaqManTM 프로브법, 사이클링 프로브법 등의 리얼타임 PCR 법을 들 수 있다. 또한, 상기 임계값은, 리얼타임 PCR 장치 (예를 들면, Step One Plus 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific 사 제조)) 에 의해, 자동 검출하는 것이 가능하다.

인터칼레이터법은, 인터칼레이터성 형광 색소 (인터칼레이터라고 하는 경우도 있다) 를 사용하는 방법이다. 인터칼레이터는, 이중 가닥 핵산의 염기쌍 사이에 특이적으로 결합하여 형광을 발하는 시약으로, 여기광을 조사하면 형광을 발한다. 인터칼레이터에서 유래하는 형광 강도의 검출에 기초하여, 프라이머 신장 산물의 양을 알 수 있다. 본 실시형태에 있어서는, 이 형광 강도를 리얼타임으로 모니터링함으로써, 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수를 알 수 있다. 본 실시형태에 있어서는, 통상 이 분야에서 사용되는 임의의 인터칼레이터를 사용할 수 있고, 예를 들어, SYBRTM Green I (Molecular Probe 사), 에티듐브로마이드, 플루오렌 등을 들 수 있다.

TaqManTM 프로브법은, 일방의 말단 (통상, 5' 말단) 을 형광기 (리포터) 로, 타방의 말단 (통상, 3' 말단) 을 소광기로 표지한, 대상 핵산의 특정 영역에 하이브리다이즈되는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 리얼타임 PCR 법에 의해, 목적으로 하는 미량의 핵산을 고감도이면서 정량적으로 검출할 수 있는 방법이다. 그 프로브는, 통상적인 상태에서는 소광기에 의해 리포터의 형광이 저해되고 있다. 이 형광 프로브를 검출 영역에 완전히 하이브리다이즈시킨 상태에서, 그 외측으로부터 DNA 폴리메라아제를 사용하여 PCR 을 실시한다. DNA 폴리메라아제에 의한 신장 반응이 진행되면, 그 엑소뉴클레아제 활성에 의해 형광 프로브가 가수분해되고, 리포터 색소가 유리되어, 형광을 발한다. 본 실시형태에 있어서는, 이 형광 강도를 리얼타임으로 모니터링함으로써, 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수를 알 수 있다.

사이클링 프로브법은, RNA 와 DNA 로 이루어지는 키메라 프로브와 RNase H 의 조합에 의한 고감도의 검출 방법이다. 그 프로브는, RNA 부분을 사이에 두고 일방이 형광 물질 (리포터) 이고, 다른 일방이 형광을 소광하는 물질 (??처) 로 표지되어 있다. 이 프로브는, 인택트한 상태에서는 ??칭에 의해 형광을 발하지 않지만, 서열이 상보적인 증폭 산물과 하이브리드를 형성한 후에 RNase H 에 의해 RNA 부분이 절단되면, 강한 형광을 발하게 된다. 본 실시형태에 있어서는, 이 형광 강도를 측정함으로써 핵산 증폭 산물의 총량을 알 수 있어, 형광 강도를 리얼타임으로 모니터링함으로써, 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수를 알 수 있다.

이 방법은, 사이클링 프로브의 RNA 부근에 미스매치가 존재하면, RNase H 에 의한 절단이 일어나지 않기 때문에, 1 염기의 차이도 인식할 수 있는 매우 특이성이 높은 검출이 가능하다. 사이클링 프로브에 대해서도, 적당한 업자에게 설계·합성을 위탁하거나 하여 취득할 수 있다.

핵산 증폭 산물 중의 염기 변이를 갖는 핵산량에 기초하여 변이를 검출하는 방법으로는, 생어 시퀀싱법, 융해 곡선 분석법 등을 들 수 있다.

핵산 증폭 산물 중의 염기 변이를 갖는 핵산량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여 변이를 검출하는 방법으로는, 염기 변이를 갖는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용하여, 상기 리얼타임 PCR 법을 적용하는 것을 들 수 있다.

2. 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하기 위한 키트

본 발명은, 다른 실시형태에 있어서, 상기 서술한 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 본 실시형태에 의한 키트는,

표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,

일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 23]

일반식 (I-c)

[화학식 24]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체와,

경우에 따라, 대상 염기 서열을 포함하는 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭 가능한 프라이머 세트와,

경우에 따라, 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 그 밖의 시약을 포함한다.

클램프 핵산, 디알릴아민류·이산화황 공중합체 및 프라이머 세트의 상세는, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 설명한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다.

핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 그 밖의 시약으로는, 뉴클레오시드 삼인산, 핵산 합성 효소, 및 증폭 반응용 완충액을 들 수 있다. 뉴클레오시드 삼인산은, 핵산 합성 효소에 따른 기질 (dNTP, rNTP 등) 을 포함할 수 있다. 핵산 합성 효소는, 키트가 대상으로 하는 핵산 증폭법에 따른 효소이며, DNA 폴리메라아제, RNA 폴리메라아제, 역전사 효소 등을 들 수 있다. 증폭 반응용의 완충액으로는, 예를 들면, 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액 등, 통상의 핵산 증폭 반응이나 하이브리다이제이션 반응을 실시하는 경우에 사용되는 완충액을 들 수 있으며, 그 pH 도 특별히 한정되지 않지만, 통상 5 ∼ 9 의 범위가 바람직하다.

본 실시형태에 의한 키트는 또한, 상기 서술한 핵산 증폭 반응 산물을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리얼타임 PCR 을 위해서 사용되는, 인터칼레이터, 형광 표지 프로브, 사이클링 프로브 등을 들 수 있다.

또한, 안정화제, 방부제 등의, 핵산 증폭 반응 시약에서 일반적으로 사용되는 다른 성분도 포함할 수 있다.

또한, 프라이머 세트 및 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 그 밖의 시약은, 핵산 증폭 반응을 실시하기 위해 필요하지만, 키트 중에 포함되지 않는 경우도 있다. 또한, 핵산 증폭 반응 산물을 검출하기 위한 시약이나, 안정화제, 방부제 등의 다른 성분은 핵산 증폭 반응에 있어서 임의 성분으로, 키트 중에 포함되지 않는 경우도 있다.

3. 핵산 증폭 반응에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법

본 발명은, 또 다른 실시형태에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는,

소정의 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,

일반식 (I-a) 혹은 (I-b)

[화학식 25]

일반식 (I-c)

[화학식 26]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 사용하여, 상기 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시한다.

이 실시형태에 있어서의 방법에서는, 「시료」는 증폭 저해 대상이 되는 핵산을 포함할 수 있다고 상정되는 시료이고, 「대상 염기 서열」은 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열이고, 「시료 중의 핵산」은 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 포함할 수 있는 핵산이다. 단, 이들 용어는, 이 방법에 제공되는 「시료 중의 핵산」이, 실제로 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 포함하는 것까지 의미하지는 않는다.

또한, 이 실시형태에 있어서의 「클램프 핵산」은, 「대상 염기 서열」에 상보적인 염기 서열을 갖고, 이와 같은 「클램프 핵산」의 존재에 의해, 당해 「대상 염기 서열」을 갖는 핵산의 증폭이 저해된다.

본 실시형태에 있어서는, 핵산 증폭 반응에 있어서, 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 클램프 핵산과 공존함으로써, 클램프 핵산의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 효과가 증강되어, 시료 중에 당해 대상 염기 서열을 갖는 핵산이 대량으로 존재하는 경우에도 당해 핵산의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있다.

시료, 및 시료 중의 핵산의 그 밖의 점은, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같으며, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다. 또한, 클램프 핵산 및 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 상세도, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다. 또한, 핵산 증폭 반응의 실시 및 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 시약의 상세도, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법 및 키트에서 서술한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법 및 키트와 동일하다. 다만, 본 실시형태의 방법에서는, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭 저해를 검출하는 것은 필수는 아니며, 이와 같은 검출을 위해서 필요한 공정 및 시약은, 필요에 따라 실시 혹은 사용한다.

4. 핵산 증폭 반응에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하기 위한 키트

본 발명은 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 서술한, 핵산 증폭 반응에서 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 본 실시형태에 의한 키트는,

대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,

일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 27]

일반식 (I-c)

[화학식 28]

본 실시형태에 있어서의 「시료」, 「대상 염기 서열」, 「시료 중의 핵산」 및 「클램프 핵산」이라는 용어의 의의는, 핵산 증폭 반응에 있어서 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법에서 서술한 것과 동일하다.

또, 시료, 및 시료 중의 핵산의 그 밖의 점은, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같으며, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다. 또한, 클램프 핵산 및 디알릴아민류·이산화황 공중합체의 상세도, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다. 또한, 핵산 증폭 반응의 실시 및 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 시약의 상세도, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법 및 키트에서 서술한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다.

5. 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제

본 발명은, 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 증폭 반응에 있어서, 클램프 핵산에 의한 그것에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭 저해 효과를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제를 제공한다.

이 증강제는, 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

[화학식 29]

일반식 (I-c)

[화학식 30]

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 포함한다.

이 증강제를 사용하여 실시하는 「핵산 증폭」은, 「상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산」을 사용하여 실시되는 것이고, 본 실시형태에 있어서의 「시료」, 「대상 염기 서열」, 「시료 중의 핵산」 및 「클램프 핵산」이라는 용어의 의의는, 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법에서 서술한 것과 동일하다.

또, 본 실시형태에 의한 「핵산 증폭 저해 증강제」는, 상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 포함하는데, 이것도 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같으며, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

1. 폴리머 첨가에 의한 PCR 반응에 대한 영향

상기 구성 단위 (A) 및 구성 단위 (B) 를 갖는 디알릴아민류·이산화황 공중합체 (실시예) 또는 다른 구성 단위를 갖는 폴리머 (비교예) 를 PCR 반응액 중에 첨가하여, PCR 반응에 대한 영향을 확인하였다.

1-1. 사용한 폴리머 수용액

이하의 표에 나타내는 폴리머를 물에 용해하여, pH 7.0, 10 질량％ 의 폴리머 수용액을 조제하였다. 또한, 표 중, 제품명은 모두 닛토보 메디컬 주식회사의 제품명이고, 중합체 1 ∼ 3 의 중합 조건은 이하와 같다.

중합체 1 : 교반기, 온도계, 유리 마개를 구비한 100 ml 의 3 구 플라스크에 희석수 19.32 g (단량체 농도 60 질량％ 가 되는 양) 과 디알릴에틸아민염산염 수용액 0.25 몰을 투입하였다. 20 ℃ 이하의 냉각하에서 이산화황 0.25 몰을 투입한 후, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 (APS) 수용액을, 당해 수용액 중의 과황산암모늄량이 모노머 전체량에 대하여 1.5 질량％ 가 되는 양만큼 10 분할하여 첨가하고, 15 ∼ 30 ℃ 에서 중합을 실시하였다.

중합체 2 : 교반기, 온도계, 유리 마개를 구비한 100 ml 의 3 구 플라스크에 희석수 4.29 g (단량체 농도 70 질량％ 가 되는 양) 과 디알릴프로필아민염산염 수용액 0.13 몰과 35 질량％ 염산을 0.27 g 투입하였다. 20 ℃ 이하의 냉각하에서 이산화황 0.13 몰을 투입한 후, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 (APS) 수용액을 과황산암모늄량이 모노머 전체량에 대하여 1.5 질량％ 가 되는 양만큼 10 분할하여 첨가하고, 15 ∼ 30 ℃ 에서 중합을 실시하였다.

중합체 3 : 교반기, 온도계, 냉각관을 구비한 1 L 의 4 구 플라스크에 65.0 ％ 디알릴디메틸암모늄클로라이드 248.74 g (1.0 몰), 무수 말레산 49.03 g (0.5 몰), 증류수 89.77 g, 이산화황을 32.03 g (0.5 몰) 투입하고, 20 ℃ 까지 냉각하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 (APS) 수용액을 과황산암모늄량이 모노머 전체량에 대하여 1.5 질량％ 로 되는 양만큼 9 분할하여 첨가하였다. 내온을 60 ℃ 로 승온시키고, 추가로 상기 과황산암모늄 (APS) 수용액을, 과황산암모늄량이 모노머 전체량에 대하여 5.0 질량％ 로 되는 양만큼 5 분할하여 첨가하고, 72 시간 반응시켰다.

1-2. PCR 반응

하기의 표에 나타내는 조성의 PCR 반응액을 조제하였다.

1-3. 프라이머 및 주형 DNA

PCR 반응에서 사용한 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머의 서열은 하기 표에 나타낸 바와 같다.

각 프라이머는 KRAS 유전자 (염기 서열은, 예를 들어, NCBI (DB 명) 로 확인할 수 있다) 를 타깃으로 하여, Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu 에서 입수) 을 사용하여 설계하였다.

주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (증폭 대상 서열) 을 포함하는, HCC70 세포로부터 추출한 게놈을 사용하였다.

[화학식 31]

또한, HCC70 세포 게놈 중, 상기 염기 서열을 포함하고, 이것에 인접하는 염기 서열은 이하와 같다.

[화학식 32]

1-4. 리얼타임 PCR 시스템

Step One Plus 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 을 사용하였다.

1-5. PCR 반응

조제한 PCR 반응 용액 20 μL 를 리얼타임 PCR 시스템에 세팅하고, 하기 표에 기재된 스텝 (i) 을 실시한 후, 스텝 (ii) ∼ (iv) 를 40 사이클 반복하였다.

40 사이클 종료 후, 스텝 (v) ∼ (vii) 을 실시하고, 반응을 종료하였다. 사이클마다 반응액의 형광 강도를 측정함으로써, DNA 증폭량을 모니터하였다. 또한, 반응의 종료 후, 형광 강도가 Threshold Line 에 도달하고 있는지 여부로, PCR 반응의 저해의 유무를 판정하였다. Threshold Line 은, 상기 장치에 의해 자동 산출하였다. 일부, 실험에 의해 어쩔 수 없이 통상보다 낮게 설정되어 버리는 경우에는, 다른 실험과 동렬로 비교하기 위해, 수동으로 ΔRn 값 0.7 ∼ 1.2 의 사이로 설정하였다.

1-5. 결과

PCR 반응의 성부 (成否) 를 하기 표에 나타낸다.

또한, PCR 반응을 저해하지 않는 경우의 핵산 증폭 곡선의 예로서 실시예 1 의 폴리머 (디알릴메틸아민염산염·이산화황 공중합체) 를 첨가한 경우의 핵산 증폭 곡선과, 저해하는 경우의 핵산 증폭 곡선의 예로서, 비교예 1 (디알릴아민염산염·이산화황 공중합체) 을 첨가한 경우의 핵산 증폭 곡선을 각각 도 1 에 나타낸다.

상기와 같이, 구조 중에 3 급 아민을 포함하는 카티온성 구성 단위와, 이산화황의 단량체로부터 유도되는 구성 단위를 포함하는 디알릴아민류·이산화황 공중합체인, 실시예 1 ∼ 3 의 폴리머를 첨가한 경우에는, PCR 반응은 저해되지 않았다. 한편, 2 급 아민 또는 4 급 아민을 함유하는 카티온성 구성 단위와, 이산화황의 단량체 또는 이산화황 및 말레산으로부터 유도되는 구성 단위를 포함하는 공중합체인, 비교예 1 ∼ 3 의 폴리머를 첨가한 경우에는, PCR 반응은 저해되었다.

2. BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적인 증폭 저해 효과의 폴리머 혹은 모노머에 의한 증강

시험 1 에서 PCR 반응을 저해하지 않는 것을 확인한 실시예 1 ∼ 3 의 폴리머 및 그 일부의 구성 단위가 유래하는 모노머 (디알릴메틸아민염산염) 를, BNA clamp PCR 에 있어서의 야생형 KRAS 유전자의 증폭 저해 효과의 증강에 대해 평가하였다.

2-1. 사용한 폴리머 또는 모노머

본 시험에서는, 실시예 1 ∼ 3 의 폴리머 및 디알릴메틸아민염산염 (비교예 4) 을 사용하였다. 각 폴리머 또는 모노머는 물에 용해하여, pH 7.0, 0.25 질량％ 의 폴리머 수용액 또는 모노머 수용액을 제조하였다.

2-2. 사용한 키트

변이형 KRAS 유전자를 검출하기 위한 키트인, BNA Clamp KRAS Enrichment Kit (리켄 제네시스사) 의 부속물을 사용하였다. 상세한 것은 이하에 기재하지만, Primer set 및 BNA clamp 는, 키트 부속물을 사용하였다. 또, real-time PCR 의 반응 조건은 키트 프로토콜에 준거하였다.

2-3. 프라이머, BNA clamp 및 주형 DNA

이하의 표에 나타내는 포워드 프라이머, 리버스 프라이머 및 BNA clamp 를 사용하였다.

또한, 표준 염기 서열을 갖는 주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (증폭 대상 서열 ; 후술하는 서열 번호 10 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다) 을 포함하는, 야생형 KRAS 유전자를 갖는 HCC70 세포의 게놈을 사용하였다.

[화학식 33]

또한, HCC70 세포 게놈 중, 상기 염기 서열과 그것에 인접하는 염기 서열은 이하와 같다 (후술하는 서열 번호 11 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다).

[화학식 34]

한편, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (증폭 대상 서열 ; 전술한 서열 번호 8 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다) 을 포함하는, 변이형 KRAS 유전자를 갖는 MDA-MB-231 세포의 게놈을 사용하였다.

[화학식 35]

또, MDA-MB-231 세포 게놈 중, 상기 염기 서열 및 그것에 인접하는 염기 서열은 이하와 같다 (전술한 서열 번호 9 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다).

[화학식 36]

2-4. BNA clamp PCR 반응액

하기의 표에 나타내는 조성의 반응액 1 ∼ 4 를 조제하였다. 반응액 1 또는 반응액 2 에 있어서, 폴리머 또는 모노머의 농도는 0.025 질량％ 였다.

2-5. 리얼타임 PCR 시스템

Step One Plus 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하였다.

2-6. PCR 반응

조제한 각 반응 용액 20 μL 를 PCR 용 튜브에 칭량하여 넣고, PCR 용 튜브를 리얼타임 PCR 시스템에 세팅하여, 하기 표에 기재된 스텝 (i) 을 실시한 후, 스텝 (ii) ∼ (iv) 를 50 사이클 반복하였다. 50 사이클 종료 후, 스텝 (v) ∼ (vii) 을 실시하고, 반응을 종료하였다. 사이클마다 반응액의 형광 강도를 측정함으로써, DNA 증폭량을 모니터하여, 각 반응액의 증식 곡선을 얻었다.

2-7. 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 ΔCt (WT) 및 ΔCt (Mutant) 의 산출, 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 ΔΔCt 의 산출, 그리고 ΔΔΔCt 의 산출

반응액 1 (폴리머 첨가, BNA clamp 첨가), 반응액 2 (폴리머 첨가, BNA clamp 무첨가), 반응액 3 (폴리머 무첨가, BNA clamp 첨가), 및 반응액 4 (폴리머 무첨가, BNA clamp 무첨가) 를, 주형 DNA 로서 야생형 KRAS 유전자 또는 변이형 KRAS 유전자를 사용하여, 상기 PCR 반응을 실시하여 증폭 곡선을 얻고, 각 조건의 증폭 곡선으로부터, 설정한 Threshold Line 으로부터 각각의 Ct 값을 얻었다 (대부분의 실험 구분에 있어서, Threshold Line 은, 장치에 의해 자동 산출하였다. 일부, 실험에 의해 어쩔 수 없이 통상보다 낮게 설정되어 버리는 경우에는, 다른 실험과 동렬로 비교하기 위해, 수동으로 ΔRn 값을 0.7 ∼ 1.2 의 사이로 설정하였다).

이어서, 이하의 식에 의해, 폴리머 무첨가의 경우의 ΔCt (WT) 및 ΔCt (Mutant) 를 산출하였다.

[수학식 1]

[수학식 2]

또한, 인터칼레이터법에 있어서의 비특이적인 증폭이 없는 것의 확인을 위해, 이하의 식에 의해 폴리머 무첨가의 경우의 ΔΔCt 를 산출하였다.

[수학식 3]

폴리머 무첨가의 경우의 ΔΔCt ＞ 0 의 경우, 인터칼레이터법에 있어서의 비특이적인 증폭이 없는 것이 이해된다.

다음으로, 이하의 식에 의해, 폴리머 첨가의 경우의 ΔCt (WT) 및 ΔCt (Mutant) 를 산출하고, 또한, 인터칼레이터법에 있어서의 비특이적인 증폭이 없는 것의 확인을 위해, 폴리머 첨가의 경우의 ΔΔCt 를 산출하였다.

[수학식 4]

[수학식 5]

[수학식 6]

폴리머 첨가의 경우의 ΔΔCt ＞ 0 의 경우, 인터칼레이터법에 있어서의 비특이적인 증폭이 없는 것이 이해된다.

마지막으로, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과의 폴리머 첨가에 의한 증강을 평가하기 위한 지표로서, 하기 식에 의해 ΔΔΔCt 를 산출하였다.

[수학식 7]

시험상 일어날 수 있는 결과의 변동을 고려해도, 인터칼레이터법과 같은 야생형 유전자의 증폭 사이클수를 기준으로 한 변이 검출법을 사용한 경우에 있어서, ΔΔΔCt ≥ 1.00 이면, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 충분히 증강하였다고 평가할 수 있다. 또한, 인터칼레이터법과 같은 야생형 유전자의 증폭 사이클수를 기준으로 한 변이 검출법을 사용한 경우에 있어서, ΔΔΔCt ≥ 4.00 이면, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 현저히 증강하였다고 평가할 수 있다. 또한, 인터칼레이터법과 같은 야생형 유전자의 증폭 사이클수를 기준으로 한 변이 검출법을 사용한 경우에 있어서, ΔΔΔCt ≥ 8.00 이면, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 매우 현저히 증강하였다고 평가할 수 있다. 또한, ΔΔΔCt = 3.20 이, 감도가 약 10 배 향상되는 기준이 된다.

2-8. 결과

시험 결과를 이하에 정리하여 나타낸다.

상기의 시험 결과로부터, 실시예 1 내지 3 의 폴리머를 첨가하면, 변이형 유전자의 증폭은 저해하지 않고, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 증강하는 것이 분명해졌다.

한편, 비교예 4 의 모노머에서도 BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 증강했지만, 실시예 1 ∼ 3 의 폴리머만큼 충분한 저해 증강 효과는 인정되지 않았다.

또한, 모노머를 첨가한 경우, 오차 (결과의 편차) 가 커서, 효과가 안정적이지 않은 것을 알 수 있었다. 이 오차 (결과의 편차) 에 대해서는, 모노머는 열, 광 등에 의해 라디칼을 발생시킬 수 있는 점에서, 그 라디칼 중합에 의한 가능성을 생각할 수 있다. 이 시험에 의해, 높은 재현성으로 BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 보다 크게 증강시킬 수 있는 점에서, 모노머보다 폴리머 구조의 쪽이 유리하다는 것을 알 수 있었다.

3. 폴리머 첨가에 의한 BNA clamp PCR 의 고감도화

상기 시험에서 BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 증강하는 효과가 확인된 실시예 1 의 폴리머를 사용하여, BNA clamp PCR 의 고감도화를 시도하였다.

3-1. 사용 폴리머

실시예 1 의 폴리머를 물로 용해하고, pH 7.0, 10 질량％ 의 폴리머 수용액을 조제하였다. 얻어진 10 질량％ 의 폴리머 수용액을 다시 물로 희석하여, 0.1 질량％ 의 폴리머 수용액을 조제하고, 이것을 반응액의 조제에 사용하였다.

3-2. 사용한 키트

시험 2 와 동일한 키트의 부속물을 사용하였다.

3-3. 주형 DNA

표준 염기 서열을 갖는 주형 DNA 로서, 서열 번호 8 의 염기 서열을 포함하는, 야생형 KRAS 유전자를 갖는 HCC70 세포의 게놈을 사용하였다. 또한, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 주형 DNA 로서, 서열 번호 10 의 염기 서열을 포함하는, 변이형 KRAS 유전자를 갖는 MDA-MB-231 세포의 게놈을 사용하였다.

본 시험에서는, 주형 DNA 전체의 양이 2.0 μL 중에 50 ng 이 되도록 하면서, 전체 주형 DNA 중의 변이형 유전자의 주형 DNA 의 질량％ 가 이하의 표가 되도록, 야생형 유전자의 주형 DNA 와 변이형 유전자의 주형 DNA 를 혼합하고, 얻어진 각 주형 DNA 혼합물과, 야생형 유전자의 주형 DNA 를 PCR 반응에 사용하였다.

3-4. 프라이머 및 BNA clamp

시험 2 와 동일한 프라이머 및 BNA clamp 를 사용하였다.

3-5. BNA clamp PCR 반응액

하기의 표에 나타내는 조성의 반응액 1 및 2 를 조제하였다. 또한, 반응액 1 에 있어서, 폴리머 농도는 0.01 질량％ 였다.

3-6. 리얼타임 PCR 시스템 및 PCR 반응

시험 2 와 동일한 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여, 시험 2 와 동일한 조건으로 PCR 반응을 실시하였다.

3-7. 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 의 결정, 및 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δδCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 의 산출

반응액 1 (폴리머 첨가, BNA clamp 첨가) 및 반응액 2 (폴리머 무첨가, BNA clamp 첨가) 를, 주형 DNA 또는 각 주형 DNA 혼합물을 사용하여, 상기 PCR 반응에 제공하여 증폭 곡선을 얻고, 각 조건의 증폭 곡선으로부터 시험 2 와 동일하게 하여 Ct (Mutant 10 ％ ∼ 0 ％) 를 결정하고, 이하의 표에 나타내는 바와 같이 Ct (Mutant 0 ％, WT) 로부터 각 변이형 유전자 템플릿 농도의 Ct (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 를 빼서, 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 각 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 를 산출하였다.

마지막으로, 각각, 폴리머 첨가의 경우의 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 로부터 폴리머 무첨가의 경우의 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 를 빼서, δδCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 를 산출하였다.

δδCt ＞ 0 의 경우, 폴리머를 첨가함으로써, 변이형 유전자가 특이적으로 검출되어, 변이형 유전자의 증폭 곡선이 야생형 유전자의 증폭 곡선으로부터 구별되고 있는 것을 의미한다 (참고 문헌 : 특허문헌 11).

3-8. 결과

시험 결과를 이하의 표 및 도 2 에 정리하여 나타낸다.

본 시험의 결과, 폴리머 무첨가의 경우에서는, Mutant 비율이 0.01 ％ 이고, δCt 가 0 미만이 되어, 변이형 유전자의 증폭 곡선을 야생형 유전자의 증폭 곡선으로부터 구별할 수 없지만, 실시예 1 의 폴리머를 첨가한 경우에서는, 0.01 ％ 의 Mutant 비율에서도 변이형 유전자의 증폭 곡선을 야생형 유전자의 증폭 곡선으로부터 구별할 수 있음이 분명해졌다. 또한, 본 실험에 있어서는, BNA clamp 무첨가 반응액에 대해서 시험하고 있지 않지만, 시험 2 의 결과로부터, BNA clamp 무첨가 반응액에 있어서도 폴리머 첨가의 유무에 상관없이, 비특이적인 증폭이 없는 것은 분명하다.

4. KRAS 이외의 변이형 유전자에 대한 적응 가능성 1 (BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과의 폴리머에 의한 증강)

4-1. 사용한 폴리머

실시예 1 의 폴리머를 물에 용해하여, 0.1 질량％ 의 폴리머 용액을 조제하고, 이것을 반응액의 조제에 사용하였다.

4-2. 사용한 키트

변이형 BRAF 유전자를 검출하기 위한 키트인, BNA Clamp BRAF Enrichment Kit (리켄 제네시스사) 를 사용하였다. Primer set 및 BNA clamp 는, 키트 부속물을 사용하였다. 또, real-time PCR 의 반응 조건은 키트 프로토콜에 준거하였다.

4-3. 주형 DNA

표준 염기 서열을 갖는 주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (후술하는 서열 번호 13 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다) 을 포함하는, 야생형 BRAF 유전자를 갖는 HCC70 세포의 게놈을 사용하였다.

[화학식 37]

또한, 상기 서열은, 증폭 대상 서열 이외의 염기 서열을 포함한다고 이해되는 점에 유의해야 한다.

한편, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (전술한 서열 번호 12 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다) 을 포함하는, 변이형 BRAF 유전자를 갖는 DU4475 세포의 게놈을 사용하였다.

[화학식 38]

4-4. BNA clamp PCR 반응액

하기의 표에 나타내는 조성의 반응액 1 ∼ 4 를 조제하였다. 또한, 반응액 1 및 2 중의 폴리머 농도는 0.01 질량％ 가 되었다.

4-5. 리얼타임 PCR 시스템 및 PCR 반응

시험 2 와 동일한 시스템을 사용하고, 시험 2 와 동일하게 하여 PCR 반응을 실시하였다.

4-6. 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 ΔCt (WT) 및 ΔCt (Mutant) 의 산출, 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 ΔΔCt 의 산출, 그리고 ΔΔΔCt 의 산출

시험 2 와 동일하게 실시하였다.

4-7. 결과

시험 결과를 이하에 정리하여 나타낸다.

상기와 같이, 실시예 1 의 폴리머의 첨가에 의해, KRAS 유전자와 마찬가지로 BNA clamp 에 의한 야생형 BRAF 유전자의 선택적 증폭 저해 효과가 현저히 증강되었다.

5. KRAS 이외의 변이형 유전자에 대한 적응 가능성 2 (폴리머 첨가에 의한 BNA clamp PCR 의 고감도화)

5-1. 사용한 폴리머

5-2. 사용한 키트

시험 4 와 동일한 키트를 사용하였다.

5-3. 주형 DNA

시험 4 와 동일한 주형 DNA 를 사용하였다.

5-4. 프라이머 및 BNA clamp

시험 4 와 동일한 프라이머 및 BNA clamp 를 사용하였다.

5-5. BNA clamp PCR 반응액

하기의 표에 나타내는 조성의 반응액 1 ∼ 4 를 조제하였다. 또한, 반응액 1 중의 폴리머 농도는 0.01 질량％ 가 되었다.

5-6. 리얼타임 PCR 시스템 및 PCR 반응

시험 2 와 동일한 장치를 사용하고, 시험 2 와 동일하게 하여 PCR 반응을 실시하였다.

5-7. 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 의 결정, 및 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δδCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 의 산출

시험 3 와 동일하게 실시하였다.

5-8. 결과

시험 결과를 이하의 표 및 도 3 에 정리하여 나타낸다.

본 시험의 결과, 폴리머 무첨가의 경우에서는, Mutant 비율이 0.01 ％ 이고, δCt 가 0 미만이 되어, 변이형 유전자의 증폭 곡선을 야생형 유전자의 증폭 곡선으로부터 구별할 수 없지만, 실시예 1 의 폴리머를 첨가한 경우에서는, 0.01 ％ 의 Mutant 비율에서도 변이형 유전자의 증폭 곡선을 야생형 유전자의 증폭 곡선으로부터 구별할 수 있음이 분명해졌다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법으로서,
상기 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

(식 중, R¹은, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기를 나타낸다.) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A) 와,
일반식 (I-c)

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 사용하여, 상기 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하고,
상기 핵산 증폭 반응에 의해 얻어진 핵산 증폭 산물의 총량, 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수, 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양, 또는 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여, 상기 변이의 존재를 판정하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 검출 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 검출 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, 검출 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 증폭을 리얼타임 PCR 로 실시하는, 검출 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시료 중의 핵산이 게놈 DNA 인, 검출 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 증폭 반응을 실시할 때에, 추가로 상기 표준 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하고,
상기 시료 중의 핵산을 주형으로 사용한 경우의 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수가, 상기 표준 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 사용한 경우의 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수와 비교하여 적었던 경우에, 상기 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 상기 변이가 존재한다고 판정하는, 검출 방법.
시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하기 위한 키트로서,
상기 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

(식 중, R¹은, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기를 나타낸다.) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A), 및
일반식 (I-c)

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 포함하는 키트.
제 8 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 키트.
제 8 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 키트.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, 키트.
핵산 증폭 반응에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 시료 중의 핵산의 증폭을 억제하는 방법으로서,
상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
일반식 (I-a) 혹은 (I-b)

(식 중, R¹은, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기를 나타낸다.) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A), 및
일반식 (I-c)

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 사용하여, 상기 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하는, 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 방법.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, 방법.
핵산 증폭 반응에 있어서, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 억제하기 위한 키트로서,
상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

(식 중, R¹은, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기를 나타낸다.)
로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A), 및
일반식 (I-c)

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 포함하는, 키트.
제 16 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 키트.
제 16 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 키트.
제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, 키트.
클램프 핵산에 의해 핵산 증폭을 저해하는 효과를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제로서,
일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)

(식 중, R¹은, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기를 나타낸다.) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (A) 와,
일반식 (I-c)

로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (B) 를 포함하는, 디알릴아민류·이산화황 공중합체를 포함하는, 핵산 증폭 저해 증강제.
제 20 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체, 디알릴에틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴에틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 핵산 증폭 저해 증강제.
제 20 항에 있어서,
상기 디알릴아민류·이산화황 공중합체가, 디알릴메틸아민·이산화황 공중합체, 또는 디알릴메틸아민산 부가염·이산화황 공중합체인, 핵산 증폭 저해 증강제.