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KR102717614B1 - 진단 및 인비보 영상용 화학발광 프로브 - Google Patents

진단 및 인비보 영상용 화학발광 프로브 Download PDF

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KR102717614B1
KR102717614B1 KR1020187024288A KR20187024288A KR102717614B1 KR 102717614 B1 KR102717614 B1 KR 102717614B1 KR 1020187024288 A KR1020187024288 A KR 1020187024288A KR 20187024288 A KR20187024288 A KR 20187024288A KR 102717614 B1 KR102717614 B1 KR 102717614B1
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도론 사바트
로니트 사트치-파인아로
니르 하난야
오리 그린
탈 엘론
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라모트 앳 텔-아비브 유니버시티 리미티드
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Abstract

본 발명은 디옥세테인-기재의 화학발광 프로브, 더욱 특히 플루오로포어-테더링된 디옥세테인-기재의 화학발광 프로브 및 π* 수용기-함유 디옥세테인 기재의 화학발광 프로브, 및 그 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 화학발광 프로브는 진단 및 인비보 영상 모두에 유용하다.

Description

진단 및 인비보 영상용 화학발광 프로브
본 발명은 다양한 디옥세테인 기재의 화학발광 프로브 및 그 조성물을 제공한다.
약어: AcOH, 아세트산; ACN, 아세토니트릴; BBBPY, 4,4′-di-tert-butyl-2,2′-dipyridyl (4′-디-tert-부틸-2,2′-디피리딜), CIEEL, chemically initiated electron exchange luminescence (화학적으로 시작된 전자 교환 발광); DCM, dichloromethane (디클로로메탄); DEAD, diethyl azodicarboxylate (디에틸 아조디카르복실레이트); DMAP, 4-dimethylaminopyridine (4-디메틸아미노피리딘); DMF, N,N'-dimethylformamide (N,N'-디메틸포름아미드); DMSO, dimethyl sulfoxide (디메틸 설폭시드); ET, energy transfer (에너지 전달); EtOAc, ethylacetate (에틸아세테이트); Hex, hexane (헥산); LDA, lithium diisopropylamide (리티움 디이소프로필아미드); MeOH, methanol (메탄올); NHS, N-hydroxysuccinimide (N-하이드록시숙신이미드); NIR, near-infrared (근적외선); NIS, N-iodosuccinimide (N-요오드숙신이미드); PBS, Phosphate buffered saline (인산 완충 식염수); QCy, quinone-cyanine (퀴논-시아닌); RP- HPLC, reverse-phase high pressure liquid chromatography (역상 고압 액체 크로마토그래피); RLU, relative light unit (상대 광 유니트); RT, room temperature (실온); TBAF, tetra-n-butylammonium fluoride (테트라-n-부틸암모늄 플로오라이드); TBDMS, tert-butyldimethylsilyl (tert-부틸디메틸실릴); TBDPS, tert-butyldiphenylsilyl (tert-부틸디페닐실릴); TBS, tert-butyldimethylsilyl (tert-부틸디메틸실릴); TBSCl, tert-butyldimethylsilyl chloride (tert-부틸디메틸실릴 클로라이드); TEMP, 2,2,6,6-tetramethylpiperidine (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘); TFA, trifluoroacetic acid (트리플루오로아세트산); THF, tetrahydrofuran (테트라하이드로퓨란); TLC, thin layer chromatography (박막 크로마토그래피); TMS-Cl, trimethylsilyl chloride (트리메틸실릴 클로라이드).
화학발광 분석법은 그 감도 및 높은 신호대노이즈의 비로 인해 다양한 화학 및 생물학 응용분야에서 널리 사용된다 (Roda 및 Guardigli, 2012; Roda et al., 2005). 형광기반의 분석과 달리, 화학발광은 빛의 여기를 필요로 하지 않는다. 따라서, 화학발광에서는 자가형광으로 인한 배경 신호가 존재하지 않는다. 이러한 화학발광의 특징은 조직 및 전신 영상에 특히 유용하다(Gross et al., 2009; Zhang et al., 2013; Van de Bittner et al., 2013; Porterfield et al., 2015).
현재 사용되는 대부분의 화학발광 화합물은 산화에 의해 활성된다; 즉, 통상적으로 안정적 전구체가 과산화수소에 의해 산화되어 산화된 고 에너지 중간체를 형성하게 되고, 이는 이어서 분해되어 여기된 종(species)을 생성한다. 후자는 기저상태로 붕괴되면서 광을 방출하거나 또는 에너지를 전달한다. 이러한 화학발광 기전에 작용하는 공통적 프로브는 일반적으로 루미놀(Merenyi et al., 1990) 및 옥살레이트 에스터(Silva et al., 2002) 기재이다. 이러한 산화-활성화된 화학발광 작용 기전을 이용하여, 반응성 산소 종(ROS)의 인비보 영상을 위한 수개의 시스템이 개발되었다(Lee et al., 2007; Kielland et al., 2009; Lim et al., 2010; Cho et al., 2012; Lee et al., 2012; Shuhendler et al., 2014; Lee et al., 2016; Li et al., 2016).
내제적으로, 전적으로 산화에 의해 활성화되는 화학발광은 ROS의 영상 및 검출에만 한정적이다. 그러나, 1987년에 폴 샤프(Paul Schaap)는 선택된 효소 또는 분석물에 의해 활성화될 수 있는 새로운 클래스의 화학발광 프로브를 개발하였다(Schaap et al., 1987a-c). 도식 1에 기재된 바와 같이, Schaap의 아다만틸리덴-디옥세테인 기재의 화학발광 프로브(구조 I)는 프로브의 페놀 모이어티의 마스킹에 사용되는 분석물-반응성 보호기를 가지고 있다. 관심있는 분석물에 의한 보호기의 제거는 불안정한 페놀레이트-디옥세테인 종 II을 생성하며, 이는 화학여기 과정을 통해 분해되어 여기된 중간체 벤조에이트 에스터 III 및 아다만타논을 생산한다. 이러한 여기 중간체는 청색 광 광자를 방출하면서 그 기저 상태(벤조에이트 에스테르 IV) 붕괴된다.
반응식 1: Schaap의 아다만틸리덴-디옥세테인의 화학발광 활성화 경로
바이오분석에서, 수성 조건에서, Schaap의 디옥세테인은 한가지 큰 단점이 있다; 이들의 화학발광 효율이 물 분자와의 상호작용에 의해 비-방사성 에너지 전달 과정(??칭)을 통해 심각하게 감소한다(Matsumoto, 2004). Schaap의 디옥세테인의 화학발광 신호를 증폭하는 공통 방법은 초래되는 여기 종(벤조에이트 에스터 III)으로부터의 에너지 전달을 통해 달성된다(Park et al., 2014; Tseng 및 Kung, 2015). 따라서, 계면활성제-염료 어덕트가 시중에서 판매되는 화학발광 면역분석에 일반적으로 추가된다. 상기 계면활성제는, 그 에너지를 전달하여 근접한 형광성 염료를 여기시키는 여기된 화학발광 프로브에 대하여 소수성 환경을 제공하여 물에 의해 유도된 ??칭을 감소시킨다. 그 결과 저-효율 발광 과정이 수용성 매질에서 최대 400배까지 증폭된다(Schaap et al., 1989). 그러나, 계면활성제 작용 기전은 마이셀 형성에 의존하기 때문에, 그 작용 농도가 상대적으로 높다(임계 마이셀 농도를 상회) (Dominguez et al., 1997). 마이셀 구조는 동물에 전신 투여될 때 그 구조가 유지되지 않기 때문에, 이러한 계면활성제-염료 어덕트 접근법은 효소 또는 화학 분석물에 의해 생성되는 생물학적 활성의 영상 또는 인비보 검출에는 실용적이 못하다(Torchilin, 2001).
두가지-성분 시스템(디옥세테인 프로브 및 계면활성제-형광 염료 어덕트)의 한계를 극복하기 위해, 플루오로포어(형광단)가 컨쥬게이트된 디옥세테인으로 구성된 단일 성분이 필요하다. 종전의 두 종류의 보고서는 디옥세테인이 화학발광 에너지를 테더링된 플루오로포어에 효과적으로 전달하여 선택한 플루오로포어에 따라 변할 수 있는 파장에서 빛을 방출할 수 있는 디옥세테인-형광 염료 컨쥬게이트를 기술하고 있다(WO 1990007511; Watanabe et al., 2012). 단일 증폭에 부가하여, 디옥세테인의 플루오로포어과의 테더링은 또한 방출광의 적색-전이 및 색 조절을 가능하게 한다; 이는 바이오 영상 응용분야에서 중대한 요구사항이다(Matsumoto et al., 2008; Loening et al., 2010; Branchini et al., 2010; McCutcheon et al., 2012; Jathoul et al., 2014; Steinhardt et al., 2016).
본원에서는 화학발광 프로브 기재의 샤프 (Schaap)의 아다만틸리덴-디옥세테인의 화학발광을 증가시키는 두 가지 접근법이 개시된다.
한 가지 접근법에 따르면 화학발광 방출이 간접적 경로 (본원에서 연구 1)을 통해 증폭되는 샤프 (Schaap)의 아다만틸리덴-디옥세테인 기재의 프로브는 링커를 통해 분석물-반응성 보호기의 메타 위치에 형광 염료에 컨쥬게이션된다. 반응식 2에 나타난 바와 같이 (위쪽 패널), 이렇게 수득된 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트는 활성화시에 분해되어 중간체 V와 같은 벤조에이트 유도체를 생성하며, 그리고 그 화학발광 방출은 여기된 벤조에이트로부터 형광염료로의 에너지 전달 기전을 통해 생리적 조건에서 상당히 증폭된다.
연구 1은 이와 같은 플루오로포어-테더링된 디옥세테인 화학발광 프로브의 제조를 위한 간단하고 실질적인 합성 경로를 보여주고 있다. 상기 합성의 효율성은 Hartwig-Miyaura C-H 보릴화, 뒤이은 스즈키 커플링 및 디옥세테인으로의 산화 에 의한 디옥세테인 전구체의 후기 단계 관능화를 기초로 한다. 수득된 전구체는 임의의 플루오로포어-아민 유도체와 컨쥬게이션이 될 수 있게 준비된 반응성 NHS-에스터-디옥세테인으로 구성된다. 플루오로포어-테더링된 디옥세테인 프로브의 화학발광 방출은 에너지 전달 기전을 통해, 종전의 디옥세테인 프로브와 비교하여 상당이 증폭되었다. 본원의 합성된 프로브는 여기된 테더링된 플루오로포어의 방출 파장에 맞출 수 있는 다양한 색을 생산하였다. 예시된 합성방법을 사용하여, 베타 갈락토시다제에 의해 활성화되며 초록(형광물질) 및 NIR (QCY) 형광 염료에 컨쥬게이트된 두 개의 플루오로포어-테더링된 디옥세테인 프로브가 합성되었다. 양 프로브는 모두 베타 갈락토시다제에 의해 활성화된 후 주사에 의해 인비보 영상에서 화학발광을 제공할 수 있었다; 그러나 복강 주사 후 화학발광 영상은 단지 NIR 프로브로만 관찰 가능하였다. 이들은 첨가제가 필요없는 샤프의 디옥세테인-기재의 화학발광 프로브에 의해 생성된 첫번째 인비보 이미지이다. 이러한 NIR 프로브는 내인성 베타 갈락토시다제의 활성을 기반으로 하는, 화학발광 현미경에 의한 세포의 영상화또한 가능할 수 있었다.
Hartwig-Miyaura C-H 보릴화에 의한 디옥세테인 전구체 관능화 후 수득된 전구체는 본원에서 화학식 I의 화합물로 언급되고, 추가의 스즈키 커플링 및 산화 후에 수득된 화합물은 화학식 IIa/IIb의 화합물로 언급된다. 본원에서 플루오로포어-테더링된 디옥세테인 기재의 화학발광 프로브는 화학식 IIIa/IIIb의 화합물 (또는 컨쥬게이트)로 언급된다.
화학발광 방출이 직접적 방식의 기전을 통해 증폭되는 다른 접근법(본원에서 연구 2)에 따르면, 샤프의 아다만틸리덴-디옥세테인 프로브는 아크릴레이트 및 아크릴로니트릴 전자-끌기 그룹과 같은 * 수용기를 갖는 페놀고리의 오르쏘 위치에 치환되어 벤조에이트 종(species)의 방출 특징을 증가시킨다 (반응식 2, 아래 패널). 우리가 아는 한은, 디옥세테인 화학발광 프로브의 방향족 모이어티에 대한 전자 수용체 치환기 영향은 생리적 연관성이 있는 pH에서 종전에 연구된 적이 없었다.
연구 2는 이러한 생리적 조건에서 고 효율을 갖는 화학발광 프로브의 제조를 개시한다. 가장 좋은 프로브의 화학발광 양자 수율은 시중에서 구입가능한 표준 아다만틸리덴-디옥세테인 프로브와 비교하여 세자리수 보다 컸다. 중요하게도, 제조된 프로브 중 하나는 내인성 β-갈락토시다제 활성을 기초로 높은 품질의 화학발광 세포 이미지를 제공할 수 있었고, 이는 직접적 화학발광 방식의 방출로 비-루시페린 저분자 기재 프로브를 사용하여 달성된 최초의 세포-영상을 입증하는 것이다. 본 연구의 화학발광 프로브는 본원에서 화학식 IVa/IVb로 언급된다.
반응식 2: 형광 염료로의 에너지 전달에 의해 수득된 간접적 화학발광 증폭 대 치환기 효과에 의해 수득된 직접적 화학발광 모드
일부 양태에서, 따라서 본 발명은 본원에 정의된 화학식 IIIa/IIIb의 플루오로포어-테더링된 디옥세테인-기재 화학발광 프로브, 및 본원에서 정의된 바와 같은 화학식 I 및 IIa/IIb의 화합물로 언급되는 상기 화합물의 제조를 위한 중간체; 그리고 본원에서 정의된 바와 같은 화학식 IVa/IVb의 π* 수용 기-포함 디옥세테인 기재의 화학발광 프로브를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 담체, 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 담체, 및 화학식 IIIa/IIIb의 컨쥬게이트 또는 화학식 IVa/IVb의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 진단은 물론 리포터 유전자, 효소 및 화학 분석물의 인비보 영상에 사용될 수 있다.
도 1은 1.5 units/mL β-갈락토시다제 존재 중에서 PBS, pH 7.4 에서 기록된 λmax=470 nm에서 1μM 프로브의 화학발광 방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 보통의 실내 조명 조건에서 프로브 1, 2 및 3의 분해를 나타낸다. 프로브 (300 μM)는 실온에서 PBS (100 mM), pH 7.4에서 배양되었다.
도 3은 가시광에 의해 유도된 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트 분해 경로를 제시한 것이다.
도 4는 프로브 1 및 플루오레신 유도체 2b의 1:1 혼합물 1 μM (패널 A)의 λmax=470 nm, 535 nm; (패널 B) 프로브 2, λmax=535 nm; (패널 C) 프로브 1 및 QCy 유도체 3b의 1:1 혼합물, λmax=470 nm; 및 (패널 D) 프로브 3, λmax=714 nm의 화학발광 방출 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼은 1.5 units/mL β-갈락토시다제 (연속선)의 존재 중에서 PBS (100 mM), pH 7.4에서 기록되었다. 점선은 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다 (DCL-직접 화학발광).
도 5는 (패널 A-C) 1.5 units/mL β-갈락토시다제의 존재 및 부재 중에서 PBS (100 mM), pH 7.4에서 1 μM (A) 프로브 1, (B) 프로브 2, 및 (C) 프로브 3의 화학발광 동역학 프로파일이다. 패널 D-F는 β-갈락토시다제 존재 중에서 (D) 프로브 1, (E) 프로브 2, 및 (F) 프로브 3에서 방출된 총 광자 수 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 1h의 기간에 걸쳐 상이한 농도의 β-갈락토시다제 존재 중에서 PBS (100 mM), pH 7.4에서 10 μM 프로브 2로부터 방출된 총 광을 나타낸다. 그래프 안의 그래프는 가장 낮은 농도의 β-갈락토시다제와 배양시 프로브 2로부터 방출된 광을 나타낸다.
도 7A-7D는 (7A) β-갈락토시다제 (gal)의 존재 및 부재 중에서 PBS, pH 7.4에서 배양된 1 μM 프로브 1, 2 및 3에서 수득된 용액 이미지; (7B) β-갈락토시다제를 포함하는 용액에서 수득된 신호 강도를 정량; (7C) 프로브 2 및 3의 피하주사 [1.5 units/mL β-갈락토시다제와의 30분 선 배양 후 또는 선 배양 없이, PBS (100 mM), pH 7.4 중의 1 μM, 50 μL] 후 15분에 수득된 전신 영상; 및 (7D)β-갈락토시다제 존재 중의 전신 이미지의 신호 강도 정량 (정량 데이터는 세 마리의 마우스를 이용한 영상 반복 실험을 기초로 한다)를 나타낸다.
도 8은 프로브 2 및 3 [1.5 units/mL β-갈락토시다제와의 30분 선배양 후 또는 선배양 없이 PBS (100 mM), pH 7.4의 1 μM, 50 μL]의 복강 주사 15분 후에 수득된 전신 이미지를 나타낸다.
도 9는 전달된 광 이미지 (패널 a) 및 HEK293-LacZ를 안정적으로 발현하는 세포의 화학발광 현미경 사진; 및 전달된 광 이미지 (패널 c) 및 HEK293-WT 세포의 화학발광 현미경 사진(패널 d)을 나타낸다. 이미지는 프로브 3 (5 μM)을 포함하는 세포 배양 배지에서 20분 배양 후에 수득되었다.
도 10은 전달된 광 이미지 (패널 a) 및 HEK293-LacZ를 안정적으로 발현하는 세포의 화학발광 현미경 사진 (패널 b)으로, 상기 세포는 포름알데하이드 (4%에서 20분)으로 고정되었다. 이미지는 프로브 3 (5 μM)을 포함하는 세포 배양 배지에서 20분 배양 후에 수득되었다.
도 11은 PBS 7.4 (5% DMSO) 중의 벤조에이트 6a, 7a, 8a 및 9a [50 μM]의 흡광도 (O.D., 실선) 및 형광 (FLU, 점선) 스펙트럼을 나타낸다 (여기 파장=290/400 nm).
도 12A-12B는 실온에서 1.5 units/mL β-갈락토시다제의 존재 중에서 PBS, pH 7.4 (10% DMSO) 중의 프로브 5, 6, 7, 8 및 9 [1 μM]의 화학발광 동역학 프로파일 및 총 방출 광자 (12B)를 나타낸다 (12A; 내부의 그래프는 프로브 5의 동역학 프로파일을 나타낸다).
도 13A-13B는 PBS 7.4 (10% DMSO) 중의 Emerald-II™ 인핸서 (10%)와 함께 또는 없이, 1.5 units/mL β-갈락토시다제 존재 중에서 프로브 5 [1 μM]의 화학발광 동역학 프로파일 (왼쪽 패널), 및 방출된 총 광자를 계측한 결과 (오른쪽 패널) (13A); 및 1.5 units/mL β-갈락토시다제 존재 중에서 PBS 7.4 (10% DMSO) 중의 프로브 9 [1 μM] 및 Emerald-II™ enhancer (10%)를 포함하는 프로브 5 [1 μM]의 화학발광 동역학 프로파일(13B)(왼쪽 패널) 및 방출된 총 광자를 계측한 결과 (오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 14는 수성조건에서 가시광선의 밝은 초록 화학발광을 생성하는 과산화수소 (프로브 10) 및 알칼라인-포스파타제 (AP) (프로브 11) 검출용의 수용성 화학발광 프로브를 나타낸다. 왼쪽- pH 10에서 수성 조건에서 과산화수소와 배양시 프로브 10 (1 mM; 왼쪽 바이알)에 의해 관찰된 광 방출을 Luminol (1 mM; 오른쪽 바이알)에 의해 관찰된 광과 비교, 프로브 12는 GSH 검출용 화학발광이다.
도 15A-15B는 (15A) 과산화수소 (1 mM), 알칼라인 포스파타제 (AP) (1.5 EU/ml) 또는 글루타치온 (1 mM)의 존재 중에서 프로브 10 (100 μM), 프로브 11 (10 μM) 및 프로브 12 (10 μM)로부터 방출된 총 광을 나타낸다. 측정은 RT에서 10% DMSO를 포함하는 pH 7.4의 PBS (100 mM)에서 수행되었으며; (15B) 다양한 농도의 상응하는 자극제의 존재 중에서, 1h에 걸쳐 10% DMSO를 포함하는 pH 7.4의 PBS (100 mM) 중의 프로브 10 (500 μM), 프로브 11 (500 μM) 및 프로브 12 (10 μM)에서 방출된 총 광을 나타낸다. 각 프로브에 대하여 검출 한계 (블랭크 대조군+3SD)가 결정되었다.
도 16은 (a) 전달된 광 이미지 및 (b) HEK293-LacZ 안정적 세포주의 화학발광 현미경 사진; 및 (c) 전달된 광 이미지와 (d) HEK293-WT 세포의 화학발광 현미경 사진을 나타낸다. 이미지는 프로브 7 (5 μM)을 포함하는 세포배양 배지에서 20분 배양 후에 촬영되었다. 이미지는 60x 대물렌즈 및 40s 노출시간에서 LV200 Olympus 현미경으로 촬영되었다.
한 양태에서, 본원은 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다:
상기 식에서,
R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C18)알킬, 또는 (C3-C7)시클로알킬에서 선택되고;
R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R3 은 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스파이로 또는 가교된 사이클릭 또는 폴리사이클릭 고리를 형성하고;
R5 및 R6 은 각각 H, (C1-C18)알킬, (C2-C18)알케닐, (C2-C18)알키닐, (C3-C7)시클로알킬, 또는 아릴로부터 선택되고, 또는 R5 및 R6 은 이들이 부착되는 산소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 H, 또는 예컨대 할로겐, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 및 -SO2R10 와 같은 전자수용기;
R10 은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬이고; 및
Q 는 예컨대 -CH3, -CH2OCH3, -C(=O)C(CH3)3, -CH2-CH=CH2, TBDMS, TBDPS, 벤질, 및 2-니트로-4,5-디메톡시벤질과 같은 보호기이고;
본원에서 용어 "알킬" 은 전형적으로 선형 또는 분지형의 e.g., 1-18 탄소 원자를 갖는 탄화수소 라디칼을 의미하고 그리고 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 아이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 2,2-디메틸프로필, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함한다. 본원에서 용어 "알케닐" 및 "알키닐" 은 전형적으로 선형 및 분지형의 각각 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 e.g., 2-18 탄소 원자를 갖는 탄화수소 라디칼을 의미하고, 그리고 에테닐, 프로페닐, 3-부텐-1-일, 2-에테닐부틸, 3-옥텐-1-일 등, 및 프로피닐, 2-부틴-1-일, 3-펜틴-1-일 등을 포함한다.
본원에서 용어 "알킬렌" 은 선형 또는 분지형의 e.g., 1-18 탄소 원자를 갖는 이가의 탄화수소 라디칼을 언급하는 것이고; 및 용어 "알케닐렌" 및 "알키닐렌" 은 전형적으로 선형 또는 분지형의 각각 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 가지고, e.g., 2-18 탄소 원자르르 갖는 이가의 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬렌의 예로는 이로 한정하는 것은 아니나, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 2-메틸프로필렌, 펜틸렌, 2-메틸부틸렌, 헥실렌, 2-메틸펜틸렌, 3-메틸펜틸렌, 2,3-디메틸부틸렌, 헵틸렌, 옥틸렌, n-트리데카닐렌, n-테트라데카닐렌, n-펜타데카닐렌, n-헥사데카닐렌, n-헵타데카닐렌, n-옥타데카닐렌, n-노나데카닐렌, 아이코사닐렌, 헤니코사닐렌, 도코사닐렌, 트리코사닐렌, 테트라코사닐렌, 펜타코사닐렌 등을 포함한다. 알케닐렌의 비 제한적 예로는 2-, 3-, 4-, 5- 및 6-트리데카닐렌, 테트라데카닐렌 예컨대 미리스톨레일렌(myristoleylene), 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 및 7-펜타데세닐렌, 헥사데세닐렌 예컨대 팔미톨레일렌, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8-헵타데세닐렌, 옥타데세닐렌 예컨대 올레일렌, 리놀레일렌, α-리놀레일렌, 등을 포함하고, 그리고, 알키닐렌의 비제한적 예로는 트리덱-6-이닐렌, 운덱-4-이닐렌 등을 포함한다.
본원에서 용어 "시클로알킬" 은 e.g., 하나 이상의 알킬 기로 치환될 수 있는, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 등과 같은 e.g., 3-7개 탄소원자를 갖는 모노시클릭 또는 바이시클릭의 포화된 탄화수소 기를 의미한다. 본원에서 용어 "시클로알킬렌" 및 "시클로알케닐렌" 은 각각 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 가지며 e.g., 3-7 개 탄소 원자를 갖는 모노시클릭 또는 바이시클릭의 탄화수소 기를 의미한다.
본원에서 용어 "헤테로시클릭 고리" 는 포화 또는 불포화될 수 있는, 즉, 하나 이상의 불포화 결합을 포함하는, 황, 산소, 질소 및 보론으로부터 선택되는 적어도 세 개의 헤테로원자 및 적어도 두 개의 탄소 원자를 포함하는 e.g., 5-12 개 원자의 모노- 또는 폴리-시클릭의 비-방향족 고리를 의미한다. 5- 또는 6-원헤테로시클릭 고리가 바람직하다. 상기 헤테로시클릭 고리는 e.g., 하나 이상의 알킬기로 상기 고리의 임의의 탄소원자에서 치환될 수 있다. 이러한 라디칼의 비-제한적 예로는 4,5-디-tert-부틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 및 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐을 포함한다.
본원에서 용어 "아릴" 은 이로 제한하는 것은 아니나, 페닐, 나프틸, 페난트릴 및 비페닐과 같은 단일 고리 또는 축합된 다수의 고리로 구성되는 6-14, 탄소 원자를 갖는 방향족 카르보시클릭 기를 의미한다. 상기 아릴은 할로겐, (C1-C8)알킬, -O-(C1-C8)알킬, -COO(C1-C8)알킬, -CN, 및 -NO2 로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있다. 본원에서 용어 "아릴렌-디일" 은 e.g., 페닐렌 및 나프틸렌의 임의의 고리 원자로부터 추가의 수소 원자의 제거에 의해 본원에서 정의된 바와 같은 아릴로부터 유래된 이가의 라디칼을 언급한다.
본원에서 용어 "헤테로아릴" 은 N, O, 또는 S로부터 선택되는 하나 내지 세 개, 바람직하게 1-2 개의 헤테로원자를 포함하는 e.g., 5-10-원의 모노- 또는 폴리-시클릭 헤테로방향족 고리로부터 유래된 라디칼을 언급한다. 모노-시클릭 헤테로아릴의 예로는 이로 제한하는 것은 아니나, 피롤릴, 퍼릴, 씨에닐, 씨아지닐, 피라졸릴, 피라지닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 씨아졸릴, 이소씨아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 1,2,3-트리아지닐, 1,3,4-트리아지닐, 및 1,3,5-트리아지닐을 포함한다. 폴리시클릭 헤테로아릴 라디칼은 바람직하게 두 개의 링, 예컨대 이로 제한하는 것은 아니나, 벤조퍼릴, 이소벤조퍼닐, 벤조씨에닐, 인돌릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 이미다조[1,2-α]피리딜, 벤즈이미다졸릴, 벤즈씨아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 피리도[1,2-α]피리미디닐 및 1,3-벤조디옥시닐을 포함한다. 상기 헤테로아릴은 할로겐, (C1-C8)알킬, -O-(C1-C8)알킬, -COO(C1-C8)알킬, -CN, 및 -NO2 로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있다. 폴리시클릭 헤테로아릴이 치환될때, 상기 치환은 임의의 카르복실릭 및/또는 헤테로시클릭 고리에서 일어날 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 용어 "헤테로아릴렌디일" 은 상기 임의의 고리 원자로부터 추가의 수소 원자의 제거에 의해 본원에서 정의된바와 같은 "헤테로아릴" 로부터 유래된 이가의 라디칼을 나타낸다.
본원에서 용어 "할로겐" 할로겐을 언급하는 것이고, 그리고 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 포함하나, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로이다.
본원에서 용어 "아미노산" 은 천연 또는 비-천연의 아미노산 일 수 있는, 아민 및 카르복실 산 작용기를 모두 포함하는 유기 화합물을 일컫는 것이다. 자연에서 나타나는 22개의 아미노산은 아스파르트산 (Asp), 타이로신 (Tyr), 루이신 (Leu), 트립토판 (Trp), 알지닌 (Arg), 발린 (Val), 클루탐산 (Glu), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 세린 (Ser), 알라닌 (Ala), 글루타민 (Gln), 글라이신 (Gly), 프롤린 (Pro), 트레오닌 (Thr), 아스파라진 (Asn), 라이신 (Lys), 히스티딘 (His), 이소루이신 (Ile), 시스테인 (Cys), 셀레노시스테인 (Sec), 및 피롤리신 (Pyl) 이다. 다른 아미노산의 비-제한적 예로는 시트룰린 (Cit), 디아미노프로피온산 (Dap), 디아미노부티르산 (Dab), 오르니틴 (Orn), 아미노아디프산, β-알라닌, 1-나프틸알라닌, 3-(1-나프틸)알라닌, 3-(2-나프틸)알라닌, γ-아미노부티르산 (GABA), 3-(아미노메틸) 벤조산, p-에티닐-페닐알라닌, p-프로파길-옥시-페닐알라닌, m-에티닐-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아이오도페닐알라닌, p-아지도페닐알라닌, p-아세틸페닐알라닌, 노르루이신 (Nle), 아지도노르루이신, 6-에티닐-트립토판, 5-에티닐-트립토판, 3-(6-클로로인돌릴)알라닌, 3-(6-브로모인돌릴)알라닌, 3-(5-브로모인돌릴)알라닌, 아지도호모알라닌, p-클로로페닐알라닌, α-아미노카프릴산, O-메틸-L-타이로신, N-아세틸갈락토사민-α-트레오닌, 및 N-아세틸갈락토사민-α-세린을 포함한다.
본원에서 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합, 즉 하나의 아미노산의 카르복실 기가 다른 아미노산의 아미노기와 반응하여 형성된 공유결합에 의해 연결된 e.g.,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 짧은, 아미노산 단량체 (잔기)의 사슬을 언급하는 것이다. 본원에서 용어 "펩타이드 모이어티" 는 카르복실 기, 즉, 펩타이드의 말단 카르복실 기 또는 측쇄 카르복실 기로부터 수소 결합의 제거 후의 본원에서 정의된 바와 같은 펩타이드 모이어티를 언급한다. 이러한 펩타이드 모이어티의 예로는, 이로 제한하는 것은 아니나, 아미노산 서열 Phe-Lys, Cit-Val, Gly-Phe-Leu-Gly, Asp-Glu-Val-Asp-, 또는 Gly-Gly-Pro-Nle을 포함하는 펩타이드 모이어티, 또는 변형된 아미노산 서열 카르복시벤질(Cbz) 보호된-Ala-Ala-Asn-에틸렌디아민을 포함한다.
본원에서 화학식 I의 화합물과 관련되어 사용된 용어 "보호기" 는 예컨대 이로 제한하는 것은 아니나, 벤조일, 벤질, 메톡시메틸 에테르, β-메톡시에톡시메틸 에테르, 메톡시트리틸 (4-메톡시페닐) 디페닐메틸), 디메톡시트리틸 (bis-(4-메톡시페닐)페닐메틸), p-메톡시벤질 에테르, 메틸씨오메틸 에테르, 피발로일, 트리틸 (트리페닐메틸 라디칼), 2-니트로-4,5-디메톡시벤질, 및 실릴 에테르, e.g., 트리메틸실릴 (TMS), TBDMS, 트리-이소-프로필실릴옥시메틸 (tri-iso-propylsilyloxymethyl, TOM), 트리이소프로필실릴 (triisopropylsilyl, TIPS), 및 TBDPS 에테르를 포함한다. 이러한 보호기의 예는 구체적으로 -CH3, -CH2OCH3, -C(=O)C(CH3)3, -CH2-CH=CH2, TBDMS, TBDPS, 벤질, 및 2-니트로-4,5-디메톡시벤질이다.
본원에서 용어 "전자 수용기" 는 높은 전자 친화도를 갖는 원자 기를 언급한다. 이러한 기의 비 제한적 예로는 할로겐, -NO2, -SO2R, -CN, -C(=O)R, -C(=O)OR 및 C(=O)NR2 (상기 식에서 R 은 각각 독립적으로 e.g., 수소, 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬, 또는 (C4-C10)아릴)을 포함한다. 이러한 전자수용기는 구체적으로 할로겐, -NO2, -SO2R, -CN, -C(=O)R, 및 -C(=O)OR (상기 식에서 R은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬임)을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 I의 화합물에서, R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C1-C4)알킬, 보다 바람직하게 메틸 또는 에틸인 화학식 I의 화합물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 I의 화합물에서, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬인 화학식 I의 화합물을 제공한다. 다른 구현예에서, R2 및 R3 는 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬이고, 그리고 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성한다. 이러한 특정 구현예에서, R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 I의 화합물에서, R5 및 R6 는 각각 독립적으로 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C3-C6)알킬, 더욱 바람직하게 이소프로필, 그리고 이들이 부착되는 산소 원자와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하는, 화학식 I의 화합물을 제공한다. 특정 구현예에서, R5 및 R6 은 각각 이소프로필이고, 그리고 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐을 형성한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 I의 화합물에서, 적어도 하나 (i.e., 한 개, 두 개 또는 세 개)의 R7, R8 및 R9 은 H이고, 그리고 나머지의 R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 전자 수용기이다. 이와 같은 특정 구현예에서, R7, R8 및 R9 은 각각 H 이다. 이와 같은 다른 특정 구현예에서 R7 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 그리고 R8 및 R9 은 각각 H 이고; 또는 R8 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 그리고 R7 및 R9 은 각각 H 이고; 또는 R9 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 그리고 R7 및 R8 은 각각 H 이고, 상기 전자수용기는 특히 할로겐, -NO2 또는 -CN 이다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 I의 화합물로서, R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C1-C4)알킬, 더욱 바람직하게 메틸 또는 에틸이고; R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬이고, 그리고 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하고; R5 및 R6 는 각각 독립적으로 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C3-C6)알킬, 더욱 바람직하게 이소프로필이고, 그리고 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고; 및 적어도 하나의 R7, R8 및 R9 은 H 이고, 그리고 나머지 R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 할로겐, -NO2 또는 -CN 으로부터 선택되는 전자 수용기인, 화학식 I의 화합물을 제공한다. 이러한 특정 구현예에서, R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; 또는 R5 및 R6 은 각각 이소프로필이고, 및 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐을 형성한다. 이러한 특정 구현예에서, R1 은 메틸이고; R2 및 R3 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R5 및 R6 은 각각 이소프로필이고, 및 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐을 형성하고; R7, R8 및 R9 는 H 이고; 및 Q 은 TBDMS (화합물 I-1)이다.
다른 양태에서, 본원은 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물을 제공한다:
상기 식에서,
R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C18)알킬, 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되고;
R2 및 R3 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되고, 또는 R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 형성하고;
R4 는 아래 표 1에 나타난 바와 같은 보호기이고;
Pep 은 적어도 두 개의, 이들의 카복실 기를 통해 연결된, 아미노산으로 구성된 펩타이드 모이어티이고;
L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커이고, 상기 링커는 각각 독립적으로 (C1-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 방향족 고리에서 선택적으로 치환되고, 상기 식에서 M은 결여되거나 또는 -O- 또는 -NH-이고, 그리고 별표는 상기 Y기에 부착되는 지점을 나타내고, 단 M 이 -O- 또는 -NH- 인 것은, R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 이 아닌 것을 조건으로 하며,
Y 는 결여되거나 또는 -O- 이고, 단 Y 는 -O- 인 것은 R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 이 아니고 그리고 L 은 결여되는 것이 아닌 것을 조건으로 하고,
R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 예컨대 H, 또는 할로겐, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 및 -SO2R10과 같은 전자 수용기이고;
R10 은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬이고;
X 는 화학식 -X1-X2-의 링커로, 상기 식에서 X1 은 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, (C2-C18)알키닐렌, (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알케닐렌, (C6-C14)아릴렌-디일, (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일, 헤테로아릴렌디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-헤테로아릴렌디일로부터 선택되고, 상기 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, (C2-C18)알키닐렌, (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알케닐렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일은 각각 독립적으로 할로겐, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고, 그리고 상기 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, 또는 (C2-C18)알키닐렌은 S, O 또는 N으로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자 및/또는 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 선택되는 적어도 하나의 기로 추가로 선택적으로 인터럽트되고; 그리고 X2 는 결여되거나 또는 -C(O)- 이고; 및
R14 은 예컨대 -O-(C1-C18)알킬, -N3, -C≡CH, N-숙시니미딜옥시, 3-설포-N-숙시니미딜옥시, 펜타플루오로페닐옥시, 4-니트로페닐옥시, N-이미다졸릴, 및 N-1H- 벤조[d][1,2,3]트리아졸옥시와 같은 반응성 기이다.
표 1: 화학식 IIa/IIb, IIIa/IIIb 및 IVa/IVb의 화합물과 관련된 특정 보호/케이징(caging) 기
본원에서 화학식 IIa/IIb와 관련되어 사용된 용어 "보호기" 는 화학식 I의 화합물과 관련되어 정의된 알콜 보호기를 언급하는 것이고, 또한 그 탄소 원자를 통해 연결된 모노사카리드 모이어티와 같은 효소로 절단될 수 있는 기를 포함하는 특정의 절단 가능한 기를 언급하는 것이다. 이러한 보호기는 추가로, 화학식 IIIa/IIIb 및 IVa/IVb의 화합물과 관련되어, "케이징 기"로 언급된다. 구체적 보호기/케이징 기는 표 1에 개시된 것이다.
본원에서 화학식 IIa/IIb의 화합물과 관련되어 사용된 용어 "반응 기" 는 플루오로포어의 반응기 (i.e., 아민, 카르복실 산, 설프하이드릴, 히드록실, 또는 알데하이드 기)와 반응할 수 있는 임의의 기를 언급하는 것이다. 이러한 기의 예로는 이로 제한하는 것은 아니나, -O-(C1-C18)알킬, -N3, -C≡CH, N-숙시니미딜옥시, 3-설포-N-숙시니미딜옥시, 펜타플루오로페닐옥시, 4-니트로페닐옥시, N-이미다졸릴, 및 N-1H- 벤조[d][1,2,3] 트리아졸옥시 (표 2 참조)를 포함한다.
표 2: 화학식 IIa/IIb의 화합물과 관련된 특정 반응기
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물에서, 상기 R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C1-C4)알킬, 더욱 바람직하게 메틸 또는 에틸인 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물에서, 상기 R2 및 R3 는 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬인, 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물을 제공한다. 다른 구현예에서, R2 및 R3 는 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬이며, 그리고 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성한다. 이러한 특정 구현예에서, R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성한다.
특정 구현예에서, 본원의 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물에서, 하나 이상 ( (i.e., 한 개, 두 개 또는 세 개)의 R7, R8 및 R9 은 H이고, 그리고 나머지 다른 R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이다. 일부 이러한 특정 구현예에서, R7, R8 및 R9 은 각각 H 이다. 다른 이러한 특정 구현예에서, R7 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 그리고 R8 및 R9 는 각각 H; 또는 R8 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 그리고 R7 및 R9 은 각각 H; 또는 R9 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 그리고 R7 및 R8 은 각각 H 이며, 여기에서 상기 전자 수용기는 특히 할로겐, -NO2 또는 -CN인, 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물에서, 상기 X1 은 각각 독립적으로 할로겐, COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는, (C1-C18)알킬렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일인 화합물을 제공하며, 여기에서 상기 R10 은 H, 그리고 상기 (C1-C18)알킬렌은 S, O 또는 N으로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자 및/또는 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일인 적어도 하나의 기로 추가로 선택적으로 인터럽트되고; 및 X2 은 -C(O)-이다. 이러한 특정 구현예에서, X1 은 (C6-C14)아릴렌-디일 또는 (C1-C4)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이며 여기에서 상기 (C6-C14)아릴렌-디일은 e.g., 페닐렌, 나프틸렌, 페난트릴렌, 또는 비페닐렌이고; 및 X2 는 아릴렌-디일의 임의의 탄소 원자에 연결된 -C(O)- 이다. 특정 구현예에서, X 는 링커:
로, i.e., X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌 이고, 그리고 X2 는 -C(O)- 이다.
특정 구현예에서, 본원의 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물에서 R14 은 N-숙시니미딜옥시, 또는 3-설포-N-숙시니미딜옥시인 화합물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본원의 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물에서, R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C1-C4)알킬, 더욱 바람직하게 메틸 또는 에틸; R2 및 R3 는 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되고, 그리고 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하고; 적어도 하나의 R7, R8 및 R9 은 H 이고, 및 나머지 R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 할로겐, -NO2 또는 -CN 으로부터 선택되는 전자 수용기이고; X 는 화학식 -X1-X2-의 링커로, 상기 X1 은 각각 독립적으로 할로겐, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는, (C1-C18)알킬렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 그리고 상기 (C1-C18)알킬렌은 S, O 또는 N에서 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자 및/또는 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 선택적으로 추가로 인터럽트되고; 그리고 X2 는 -C(O)- 이고; 및 R14 은 N-숙시니미딜옥시, 또는 3-설포-N-숙시니미딜옥시인 화합물을 제공한다.
이러한 특정 구현예에서, R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하거나; 또는 X 는 화학식 -X1-X2- 의 링커로, 여기에서 상기 X1 은 (C6-C14)아릴렌-디일 또는 (C1-C4)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 여기에서 상기 (C6-C14)아릴렌-디일은 페닐렌, 나프틸렌, 페난트릴렌 또는 바이페닐렌이고; 및 X2 는 아릴렌-디일의 임의의 탄소 원자에 연결된 -C(O)- 이다. 다른 이러한 특정 구현예에서, R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; 및/또는 X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고 및 X2 는 -C(O)- 이다. 이러한 구현예의 구체적 예는 다음 화합물 이다: R1 은 메틸이고; R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; 및 X2 는 -C(O)-, e.g., 적어도 하나의 R7, R8 및 R9 은 H이고 그리고 나머지 R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 할로겐인 이러한 화합물.
특정 구현예에서, 본원은 상술한 임의의 구현예에서 정의된 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물로, 여기에서 (i) Y 는 -O-, L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커로, 상기 식에서 M 은 -O- 또는 -NH-, 및 R4 는 보호기이고; 또는 (ii) Y 는 결여되고, L 은 결여되고, 및 R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2인, 화합물을 제공한다.
구체적 구현예에서, R1 은 메틸이고; R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R7, R8 및 R9 은 H이고; Y 는 -O-; L 은 결여되고; R4 는 TBDMS 이고; X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; X2 는 -C(O)-ㅍ이고; 및 R14 은 N-숙시니미딜옥시 (화합물 IIa-1 및 IIb-1, 표 3)이다.
표 3: 본원에 개시된 구체적 화학식 IIa/IIb의 화합물
다른 양태에서, 본원은 화학식 IIIa 또는 IIIb의 컨쥬게이트를 제공한다:
상기 식에서,
R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C18)알킬, 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되고;
R2 및 R3 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R3 은 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 형성하고;
R4 는 예컨대 표 1에 개시된 것과 같은 케이징 기;
Pep 은 두 개 이상의, 그 카르복실 기에 의해 연결된 아미노산 잔기로 구성되는 모이어티;
L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커로, 상기 링커는 각각 독립적으로 (C1-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 방향족 고리에서 선택적으로 치환되고, 여기에서 M 은 결여되거나 또는 -O- 또는 -NH- 이고, 그리고 별표는 상기 Y 기에 부착되는 점을 나타내고, 단 M 이 -O- 또는 -NH- 인 것은, R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 이 아닌 것을 조건으로 하고;
Y 는 결여되거나 또는 -O- 이며, 단 Y 가 -O- 인 것은 R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 이 아니고, 그리고 L 은 결여되지 않은것을 조건으로 하고,
R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 H, 또는 할로겐, -NO2, -CN, -COOR10, -CH(=O), -C(=O)R10 및 -SO2R10와 같은 전자 수용기이고
R10 은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬이고;
X 는 화학식 -X1-X2- 의 링커로, 여기서 상기 X1 은 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, (C2-C18)알키닐렌, (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알케닐렌, (C6-C14)아릴렌-디일, (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일, 헤테로아릴렌디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-헤테로아릴렌디일로부터 선택되고, 상기 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, (C2-C18)알키닐렌, (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알케닐렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일은 각각 독립적으로 할로겐, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고, 그리고 상기 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, 또는 (C2-C18)알키닐렌은 S, O 또는 N으로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자, 및/또는 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의해 선택적으로 추가로 인터럽트되고; 그리고 X2 은 결여되거나 또는 -C(O)- 이고; 및
Z 는 플루오로포어의 모이어티 또는 그 유도체임.
본원에서 용어 "플루오로포어"는 전형적으로 수 개의 회합된 방향족 기, 또는 수개의 π 결합을 갖는 시클릭 또는 평면 분자를 포함하는 형광 화합물로, 광 여기시에 광을 재-방출할 수 있다. 플루오로포어의 비제한적 카타고리는 플루오레신-기재의 화합물 (플루오레신 아날로그), 로다민-기재의 화합물(로다민 아날로그), 쿠마린-기재의 화합물 (쿠마린 아날로그), 시아닌 예컨대 Cy5, Cy5.5, Cy5.18, Cy7, Cy7.18, 및 QCy, 및 보론-디피로메틴(BODIPY)-기재의 화합물을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIIa 또는 IIIb의 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 식에서 R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C1-C4)알킬, 더욱 바람직하게 메틸 또는 에틸이다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIIa 또는 IIIb의 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 식에서 R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬이다. 다른 구현예에서, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬이고, 및 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성한다. 특히 이러한 일 구현예에서, R2 및 R3 은 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIIa 또는 IIIb의 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 식에서 적어도 하나 (i.e., 한 개, 두 개 또는 세 개)의 R7, R8 및 R9 은 H 이고, 및 나머지 다른 R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이다. 특히 이러한 일 구현예에서, R7, R8 및 R9 각각은 H 이다. 특히 이러한 다른 구현예에서, R7 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 및 R8 및 R9 은 각각 H 이고; 또는 R8 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 및 R7 및 R9 은 각각 H 이고; 또는 R9 은 상기 정의한 바와 같은 전자수용기이고, 및 R7 및 R8 은 각각 H 이고, 여기에서 상기 전자 수용기는 특히 할로겐, -NO2 또는 -CN 이다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIIa 또는 IIIb의 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 식에서 X1 은 각각 독립적으로 할로겐, COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는, (C1-C18)알킬렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 여기에서 R10 은 H이고, 상기 (C1-C18)알킬렌은 S, O 또는 N로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자 및/또는 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 추가로 인터럽트되고; 그리고 X2 는 -C(O)- 이다. 특히 이러한 일 구현예에서, X1 은 (C6-C14)아릴렌-디일 또는 (C1-C4)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 여기에서 상기 (C6-C14)아릴렌-디일은, e.g., 페닐렌, 나프틸렌, 페난트릴렌, 또는 비페닐렌 이고; 및 X2 는 상기 아릴렌-디일의 임의의 탄소 원자에 연결된 -C(O)- 이다. 특정 구현예에서, X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌 이고 및 X2 는 -C(O)- 이다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIIa 또는 IIIb의 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 식에서, 플루오로포어 Z 는 본원에서 Z1으로 명명된 BODIPY 유도체, Z2로 명명된 플루오레신 유도체, Z3로 명명된 Cy5 유도체, 또는 Z4로 명명된 QCy 유도체로부터 선택된다 (표 4).
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IIIa 또는 IIIb의 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 식에서 R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C1-C4)알킬, 더욱 바람직하게 메틸 또는 에틸이고; R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되고, 그리고 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하고; 적어도 하나의 R7, R8 및 R9 은 H 이고, 및 나머지 다른 R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 할로겐, -NO2 또는 -CN로부터 선택되는 전자 수용기이고; X는 화학식 -X1-X2- 의 링커로, 여기에서 X1 은 (C1-C18)알킬렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일로, 이들은 각각 독립적으로 할로겐, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고, 및 상기 (C1-C18)알킬렌은 S, O 또는 N로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자 및/또는 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 선택되는 하나 이상의 기로 추가로 선택적으로 인터럽트되고; 및 X2 는 -C(O)- 이다.
표 4: Z1-Z4로 명명된 플루오로포어 모이어티
이러한 특정 일 구현예에서, R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; 또는 X 는 화학식 -X1-X2- 의 링커로, 여기에서 X1 은 (C6-C14)아릴렌-디일 또는 (C1-C4)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 여기에서 상기 (C6-C14)아릴렌-디일은 페닐렌, 나프틸렌, 페난트릴렌 또는 비페닐렌이고; 및 X2 는 상기 아릴렌-디일의 임의의 탄소 원자에 연결된 -C(O)-이다. 이러한 추가의 특정 구현예에서, R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; 및/또는 X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고, 및 X2 는 -C(O)- 이다. 이러한 구현예의 구체적 예는 다음과 같은 화합물이다: R1 은 메틸이고; R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; 그리고 X2 는 -C(O)- e.g.,적어도 하나의 R7, R8 및 R9 은 H 이고, 및 나머지 다른 R7, R8 및 R9 은 각각 독립적으로 할로겐인 그러한 화합물.
표 5: 본원에 개시된 구체적인 화학식 IIIa/IIIb 의 컨쥬게이트
특정 구현예에서, 본원은 상술한 임의의 구현예에서 정의된 바와 같은 화학식 IIIa 또는 IIIb의 화합물을 제공하며, 여기에서 (i) Y 는 -O-, L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커로, 여기에서 M 은 -O- 또는 -NH-, 및 R4 는 케이징 기이거나; 또는 (ii) Y 는 결여되고, L 은 결여되고, 및 R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 이다.
이러한 구체적 구현예에서, R1 은 메틸; R2 및 R3 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌; X2 는 -C(O)-; Z 는 Z1, Z2, Z3 또는 Z4로부터 선택되고; 및 (i) R7, R8 및 R9 는 H; Y 는 -O-; L 은 결여되고; 및 R4 는 TBDMS (화합물 IIIa-1-4 여기에서 Z 는 각각 Z1-Z4 ; 및 IIIb-1-4 여기에서 Z 는 각각 Z1-Z4); 또는 (ii) R7 은 Cl; R8 및 R9 는 H; Y 는 -O-; L 은 결여되고; 및 R4 는 갈락토실 (화합물 IIIa-5-8 여기에서 Z 는 각각 Z1-Z4; 및 IIIb-5-8 여기에서 Z 는 각각 Z1-Z4). 본원에서 구체적 화합물은 표 5에 기재되어 있다. Z 는 각각 Z2 또는 Z3 인 화합물 IIIb-6 및 IIIb-7 은 연구 1에서 각각 프로브 2, 및 3으로 또한 언급된다.
다른 양태에서, 본원은 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물을 제공한다:
상기 식에서
R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C18)알킬, 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되고;
R2 및 R3 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 형성하고;
R4 는 H, 또는 표 1에 개시된 것과 같은 케이징 기이고;
Pep 은 두 개의 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 그 카복실기에 의해 연결된 펩타이드 모이어티이고;
L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커이고, 이는 방향족 고리에서 각각 독립적으로 (C1-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되고, 여기에서 M은 결여되거나 또는 -O- 또는 -NH- 이고, 그리고 별표는 상기 Y 기에 부착되는 점을 나타내고, 단 R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2가 아닌 경우 M 은 -O- 또는 -NH-이고, 단 R4 가 H인 경우 L 은 결여되고;
Y 는 결여되거나 또는 -O- 이고, 단 Y 는, R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 이 아니고 그리고 L은 결여되지 않은 경우, -O- 인 것을 조건으로 하고;
R7 은 H, 또는 각각 독립적으로 상기 -Y-L-R4 기의 ortho 또는 para 에 부착되는, 할로겐, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 및 -SO2R10 과 같은 적어도 하나의 전자 수용기를 나타내고;
R10 은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬; 및
A 는 상기 -Y-L-R4 기의 ortho 또는 para 에 부착되는 -CN, 또는 -CH=CH-E 와 같은 π* 수용기이고, 여기에서 E 는 -CN, -COOH, -COO(C1-C18)알킬 예컨대 -COO(C1-C8)알킬 또는 -COO(C1-C4)알킬, 4-피리디닐, 메틸피리디니움-4-일, 3,3-디메틸-3H-인돌일, 또는 1,3,3-트리메틸-3H-인돌-1-이움-2-일 이다.
표 6: 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물과 관련된 특정 π* 수용기
본원에서 용어 "π* 수용기" 는 전자를 받아들일 수 있는 π 수용 시스템을 포함하는 임의이 기를 언급한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물을 제공하며, 여기에서 R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C1-C4)알킬, 더욱 바람직하게 메틸 또는 에틸이다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물을 제공하며, 여기에서 R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬이다. 다른 구현예에서, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬이고, 및 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성한다. 이러한 특정 일 구현예에서, R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성한다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물을 제공하며, 여기에서 R7 은 H, 또는 상기 -Y-L-R4 기의 ortho 또는 para에 부착되는 할로겐 또는 -CN 으로부터 선택되는 전자 수용기이다. 이러한 특정 일 구현예에서, R7 은 상기 -Y-L-R4 기의 ortho에 부착된 할로겐, e.g., Cl, 또는 -CN 이다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물을 제공하며, 여기에서 A 는 상기 -Y-L-R4 기의 ortho에 부착된 -CH=CH-E 이고, 여기에서 E 는 -CN, -COOH, -COO(C1-C8)알킬, e.g., -COO(C1-C4)알킬 예컨대 -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -COOCH(CH3)2, 또는 -COOC(CH3)3, 4-피리디닐, 메틸피리디니움-4-일, 3,3-디메틸-3H-인돌일, 또는 1,3,3-트리메틸-3H-인돌-1-이움-2-일 이다. 이러한 특정 구현예에서, E 는 -CN, -COOH, -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -COOCH(CH3)2, 또는 -COOC(CH3)3이다.
특정 구현예에서, 본원은 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물을 제공하며, 여기에서, R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬, 바람직하게 (C1-C4)알킬, 더욱 바람직하게 메틸 또는 에틸이고; R2 및 R3 는 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되고, 및 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하고; R7 은 H, 또는 -Y-L-R4 기의 ortho 또는 para에 부착된 할로겐 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기; 및 A 는 상기 -Y-L-R4 기의 ortho에 부착된 -CH=CH-E 로, 여기에서 E 는 -CN, -COOH, -COO(C1-C8)알킬, 4-피리디닐, 메틸피리디니움-4-일, 3,3-디메틸-3H-인돌일, 또는 1,3,3-트리메틸-3H-인돌-1-이움-2-일 이다. 이러한 구현예는 특히 R1 은 메틸; R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R7 은 H, 또는 상기 -Y-L-R4 기의 ortho에 부착된 할로겐 또는 -CN 으로부터 선택되는 전자 수용기이고; 및 E 는 -CN, -COOH, 또는 -COO(C1-C4)알킬 예컨대 -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -COOCH(CH3)2, 또는 -COOC(CH3)3 인 그러한 화합물이다. 이러한 구현예에는 더욱 특히, E 는 -CN, -COOH, -COOCH3, 또는 -COOC(CH3)3., i.e., A 는 상기 -Y-L-R4 기의 오르쏘에 부착된, 각각 아크릴로니트릴, 아크릴산, 메틸아크릴레이트 또는 tert-부틸 아크릴레이트 치환체인 그러한 화합물이다.
특정 구현예에서, 본원에서 상술한 임의의 구현예에서 정의된 바와 같은 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물을 제공하며, 여기에서 (i) Y 는 -O-; L 은 결여되고; 및 R4 는 H 이고; (ii) Y 는 -O-; L 은 결여되거나 또는 위에서 정의된 바와 같은 화학식 L1, L2 또는 L3 의 링커이고, 여기에서 M 은 -O- 또는 -NH- 이고; 및 R4 는 예컨대 표 1에 개시된 것과 같은 케이징 기 e.g., 포스포네이트 이고, 다만 상기 케이징 기는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 이 아닌 것을 조건으로 하고, (iii) Y 는 -O-; L 은 위에서 정의된 바와 같은 화학식 L1, L2 또는 L3 의 링커로, 여기에서 M 은 결여되고; 및 R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2; 또는 (iv) Y 는 결여되고; L 은 결여되고; 및 R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2이다.
이러한 구체적 구현예에서, 본원에 개시된 화합물은 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물로, 여기에서 R1 은 메틸; R2 및 R3 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R7 은 상기 -Y-L-R4 기 ortho에 부착된 Cl 또는 H 이고; A 는 상기 -Y-L-R4 기 ortho에 부착된 -CH=CH-E; 및 (i) E 는 -COOC(CH3)3; Y 는 -O-; L 은 결여되고; 및 R4 는 갈락토실 (e.g., 화합물 IVa-1, IVa-2, IVb-1 및 IVb-2); (ii) E 는 -COOCH3 또는 -CN; Y 는 -O-; L 은 결여되고; 및 R4 는 H (e.g., 화합물 IVa-3, IVa-4, IVa-5, IVa-6, IVb-3, IVb-4, IVb-5 및 IVb-6); (iii) E 는 -COOCH3 또는 -CN; Y 는 -O-; L 은 L1 여기에서 M 은 -O-; 및 R4 는 갈락토실 (e.g., 화합물 IVa-7, IVa-8, IVa-9, IVa-10, IVb-7, IVb-8, IVb-9 및 IVb-10); (iv) E 는 -COOCH3; Y 는 -O-; L 은 L1 여기에서 M 은 -NH-; 및 R4 는 2,4-디니트로벤젠 설포네이트 (e.g., 화합물 IVa-11, IVa-12, IVb-11 및 IVb-12); (v) E 는 -COOH; Y 은 결여되고; L 은 결여되고; 및 R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 (e.g., 화합물 IVa-13, IVa-14, IVb-13 및 IVb-14); 또는 (vi) E 는 -COOH; Y 는 -O-; L 은 결여되고; 및 R4 는 포스포네이트 (e.g., 화합물 IVa-15, IVa-16, IVb-15 및 IVb-16)이다. 본원에 개시된 구체적 화합물은 표 7에 기재되어 있다. 화합물 IVb-7, IVb-8, IVb-9, IVb-10, IVb-13, IVb-15 및 IVb-11 은 연구 2에서 또한 각각 프로브 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 언급된다.
표 7: 본원에 기술된 화학식 IVa/IVb 의 구체적 화합물.
추가의 양태에서, 본원은 담체 및 각각이 상술한 구현예에 정의된 바와 같은, 본원에 개시된 디옥세테인-기재의 화학발광 프로브, i.e., 화학식 IIIa/IIIb의 플루오로포어-테더링된 디옥세테인-기재의 화학발광 프로브 또는 화학식 IVa/IVb의 π* 수용 기-함유 화학발광 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다.
구체적 구현예에서, 본원의 조성물은 표 5에 나열된 것으로부터 선택되는 화학식 IIIa/IIIb의 화학발광 프로브, 또는 표 7에 나열된 것으로부터 선택되는 화학식 IVa/IVb의 화학발광 프로브를 포함한다.
본원에 개시된 것과 같이, 본원에 따른 조성물은 따라서 진단 및/또는 인비보 영상에 사용될 수 있다. 촉박된 화학발광 방출은 생물학적 분석대상물(analytes)의 고감도 판독을 제공할 수 있다. 화학발광은 광에 의한 여기를 필요로 하지 않기 때문에, 작용기의 광활성 및 자가형광으로 인한 배경값을 현저하게 낮출 수 있다. 생물발광, i.e., 루시퍼라제와 같은 생물발광 효소를 발현하는 살아있는 시스템 유래의 화학발광 은 유전적으로 변형된 유기체를 이용하여 생물학적 파라미터의 전임상 분석에 널리 적용될 수 있음이 밝혀진 반면, 저분자 화학발광은 야생형 동물에 사용될 수 있어 임상 영상에서 흥미진진한 기회를 열고 있다.
본원의 조성물은 따라서 그 중에서도 약학조성물일 수 있으며, 여기에서 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다.
상술한 바와 같이, 본원에 개시된 화학식 IIIa/IIIb 및 IVa/IVb의 화학발광 프로브는 절단가능한 케이징 기(R4), e.g., 효소로 절단가능한 기를 가지고 있으며, 여기에서 관심있는 분석대상물에 의해 e.g., 상기 효소 절단 기를 절단 할 수 있는 효소의 존재 중에서, 상기 절단가능한 기의 제거는 화학여기 과정을 거쳐 분해되어 여기된 중간체를 생산하는 불안정한 페놀레이트-디옥세테인 종을 생성하고, 상기 여기된 중간체는 광을 방출하고 그 기저 상태로 붕괴된다.
케이징 기로서 β-갈락토실을 갖는, 본원에 예시된 특정한 화학발광 프로브는 플루오로포어-테더링된 디옥세테인-기재의 화학발광 프로브 2 및 3, 및 π* 수용 기-함유 화학발광 프로브 6-9이고, β-갈락토시다제의 존재 vs 부재 중에서 그들의 화학발광 동역학 프로파일은 연구 1 및 2에 개시되어 있다. 연구 2에 예시된 추가의 프로브는 케이징 기로서, 각각 알칼라인-포스포타제 및 GSH를 검출할 수 있는 포스포네이트 또는 2,4-디니트로벤젠 설포네이트를 갖는 π* 수용 기-함유 화학발광 프로브 11 및 12, 및 케이징 기로서 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐을 갖는, 과산화수소를 검출할 수 있는 π* 수용 기-함유 화학발광 프로브 10이다.
기타 화학발광 프로브는 두 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 펩타이드 모이어티, e.g., 표 1에 개시된 것과 같은 펩타이드-모이어티-함유 케이징 기를 가질 수 있다. 이러한 펩타이드 모이어티는 특정 효소에 의해 절단가능한 아미노산 서열을 포함 할 수 있으며, 이러한 케이징 기를 포함하는 프로브는 따라서 상기효소의 존재의 검출에 사용될 수 있다.
이러한 효소의 한 특정 예로는 세포내 단백질 분해에서 중요한 역활을 하며, 전암 병변 및 다양한 병리 상태 및 암, e.g., 종양 내피 세포 및 많은 다른 종양 세포의 라이소좀에서 과발현되는 라이소좀 시스테인 프로테아제인 카텝신 B이다 (Miller et al., 2009). 카뎁신 B-절단가능한 펩타이드는 이로 한정하는 것은 아니나 Phe-Lys, Cit-Val, 또는 Gly-Phe-Leu-Gly의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다. 이러한 효소의 다른 특정 예는 카뎁신 K로, 이는 주로 파골세포에서 발현되며 골종양에서 세포외적으로 과발현되는, 골리모델링 및 재흡수에 관여하는 라이소좀 시스테인 프로테아제이다 (Segal et al., 2009). 카뎁신 K-절단가능한 펩타이드는, 이로 제한하는 것은 아니나, Gly-Gly-Pro-Nle 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 효소의 추가의 구체적 예로는 레구마인으로, 이는 종양 세포에서 과발현되는 라이소좀 효소이다 (Stern et al., 2009). 레구마인-절단가능한 펩타이드는 이로 제한하는 것은 아니나, 변형된 아미노산 서열 Cbz-Ala-Ala-Asn-에틸렌디아민을 포함한다.
본원에 따른 약학 조성물은 통상의 기술, e.g., 레밍턴: The Science 및 Practice of Pharmacy, 19th Ed., 1995.에 기재된 것과 같은 기술로 제조될 수 있다. 본원의 조성물은 활성성분 i.e., 디옥세테인-기재의 화학발광 프로브를 액상 담체, 미분된 고체 담체,또는 모두와 e.g.,균일하며 충분하게 혼합하여 제조될 수 있고, 필요하면 상기 산물을 목적하는 제형으로 형태를 만들수 있다. 본원의 조성물은 액체, 고체 또는 반고체 형태일 수 있으며, 추가로 약학적으로 허용가능한 충진제, 담체, 희석제 또는 아주번트, 및 기타 불활성 성분 및 부형제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본원의 약학 조성물은 나노입자로 제형화된다.
본원에 따른 약학 조성물은 임의의 적절한 투여 경로 용으로 제형화 될 수 있으며, e.g. 정맥내, 동맥내, 경막내, 흉강내, 기관내, 복강내, 근육내 또는 피하 투여와 같은 비경구 투여용, 국소 투여, 경구 또는 장관내 투여, 또는 흡입 투여용의 임의의 적절한 투여 경로용으로 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 조성물은 정맥내 또는 복강내 투여용, 또는 e.g.,피하에 이식된 알젯 펌프를 이용한 피하 투여용으로 제형화된다.
본원의 약학 조성물은 멸균의 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있으며, 이는 적절한 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균된 주사 제제는 비-독성의 비경구 투여에 적합한 희석제 또는 용매 중의 멸균의 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 채용가능한 허용가능한 매체 및 용매는 e.g., 물, 링거 용액 및 등장 소디움클로라이드 용액을 포함한다.
본원의 프로브의 화학발광 방출은 기술분야에 알려진 임의의 기술 또는 절차를 이용하여 검출될 수 있다.
광학 분자 영상은 종양의 경계(margin) 검출에 있어서 고도의 민감도 및 특이성을 제공하는 유망한 기술이다. 나아가, 존재하는 임상적 응용은 광학적 분자 영상이 외과의사가 정교한 수술을 하도록 가이드하는데 있어 강력한 수술중 도구로서, 근치절체 및 생존율 향상을 가능하게 할 수 있음을 입증하였다. 형광 가이드하에서 최소 침습적인 외과 수술용에 사용되는 임상적으로 허가된 기구의 예는 다빈치 수술 시스템이다 (Haber et al., 2010). 이 기구는 환자 몸 내부의 확실하고 확대된 시야를 제공하기 위한 3D HD 비전 시스템을 갖추고 있어 외과의사로 하여금 전통적인 복강경 검사법과 유사하게, 수 개의 작은 구멍을 통해 복잡하고 일상적인 수술을 수행할 수 있게 한다. 부가하여, 시스템 : The Hamamatsu's Photodynamic Eye (PDE™), Artemis™ 및 Novadaq SPY™ (Novadaq Technologies Inc., Toronto, Canada) (Chi et al., 2014)은 이미 유방암, 간전이 및 바이패스 그라프트 수술에 적용되어 왔다. Fluobeam®, FLARE™ 및 GXMI Navigator를 포함하는 여러 개의 기존 수술중(intraoperative) NIR 형광 분자 영상 시스템이 임상시험에서 평가되었다. 이들은 수술의 편리성, 이미지 평가 향상 및 검출 깊이를 증가시키는 데 있어서, 중요한 역활을 해왔다(Chi et al., 2014).
최근 들어, IR 범위에서 광학 형광 영상용의 카메라 및 레이저 개발에 있어서 큰 진전이 있어왔다 (Mieog et al., 2011; Troyan et al., 2009). 이와 병행하여, 심박출량, 간기능 및 간 혈류를 결정, 및 눈 형광촬영법을 위한 예컨대 ICG 및 메틸렌 블루와 같은 저 MW 유기 염료가 임상에서 광범위하게 사용되고 있다. 2015년에, 형광 영상 시스템 Xiralite® 이 손(염증 및 관류-관련된 질환용)의 미세순환을 보기위해 FDA의 허가를 득하였다.
본원은 이제 하기의 비-제한적 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예
연구 (study) 1. 디옥세테인 -플루오로포어 컨쥬게이트에 의한 화학발광 신호의 현격한 향상: 센싱 및 영상용 색 조정이 가능한 턴온 (turn-ON) 화학발광 프로브
실험
일반적 사항 . 무수 조건이 요구되는 모든 반응은 아르곤 대기하에서 수행되었다. 모든 반은 다른 언급이 없으면 RT에서 수행되었다. 화합물 및 용매는 분석용 시약 (A.R.) 등급이거나 표준 기술에 의해 정제되었다. TLC: 실리카 겔 플레이트 Merck 60 F254: 화합물은 UV 광으로 조사하여 가시화하였다. 플래시(Flash) 크로마토그래피(FC): 실리카 겔 Merck 60 (입자크기 0.040-0.063 mm), 용리액은 괄호에 기재됨. RP-HPLC: C18 5u, 250×4.6mm, 용리액은 괄호에 기재됨. 제조용 (Preparative) RP-HPLC: C18 5u, 250×21mm, 용리액은 괄호에 기재됨. 1H-NMR 스펙트럼은 400 MHz 에서 작동된 Bruker Avance를 사용하여 기록되었다. 13C-NMR 스펙트럼은100 MHz 에서 작동된 Bruker Avance를 사용하여 기록되었다. 화학적 이동은 잔류 용매에 대한 δ 스케일로 ppm으로 보고되었다 (CDCl3: 1H-NMR은 δ=7.26 및 13C-NMR은 77.16, DMSO-d6: 1H-NMR 은 δ=2.50 및 13C-NMR은 39.52). 질량 스펙트럼은 Waters Xevo TQD로 측정되었다. 형광 및 화학발광은 Molecular Devices Spectramax i3x 로 기록되었다. 마이크로플레이트 및 마우스의 이미지는 BioSpace Lab PhotonIMAGER™ 에서 기록되었다. 염 및 용매를 포함하는 모든 시약은 Sigma-Aldrich 에서 구입하였다.
화합물 1b . 2-클로로-3-하이드록시벤즈알데하이드 (1a, 2000 mg, 12.77 mmol)를 20 ml의 메탄올에 용해하였다. 트리메틸 오르쏘포르메이트 (2.24 ml, 20.44 mmol) 및 테트라부틸암모늄 트리브로마이드 (308 mg, 0.64 mmol)를 추가하고, 상기용액을 RT에서 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 반응 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc (100 ml)으로 희석하고, 그리고 0.01M NaHCO3 (100 ml)으로 세척하였다. 유기상은 Na2SO4 상에서 건조하였고, 감암하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 80:20) 2460 mg (95% 수율)의 무색의 오일을 수득하였다.
화합물 1c . 페놀 1b (2450 mg, 12.09 mmol) 및 이미다졸 (1650 mg, 24.24 mmol)을 15ml의 DCM에 용해하였다. TBSCl (2180 mg, 14.46 mmol)을 추가하고, 그리고 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 백색의 침전물을 여과하여 걸러내고, 용매를 감암하에서 증발하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 95:5) 3600 mg (94% 수율)의 무색 오일을 수득하였다.
화합물 1d . 아세탈 1c (3500 mg, 11.04 mmol) 및 트리메틸 포스파이트 (1.7 ml, 14.41 mmol)를 30ml의 DCM에 용해하였다. 반응 혼합물을 0℃ 로 냉각하고, 그리고 티타늄(IV) 클로라이드 (1.45 ml, 13.22 mmol) 를 적가하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 상기 용액을 0℃의 포화된 NaHCO3 (130 ml) 수용액으로 부어 넣었다. 교반 10분 후에, 100ml의 DCM를 추가하고, 상을 분리하였다. 유기상은 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 40:60) 4010 mg (92% 수율) 의 무색의 오일을 수득하였다.
화합물 1e . 포스포네이트 1d (3950 mg, 10.0 mmol)를 -78℃의 아르곤 대기하에서 25ml의 무수 THF에 용해하였다. LDA (2.0 M in THF, 6 ml, 12 mmol)를 추가하고, 상기 용액을 20분간 교반하였다. 20ml의 THF 중의 2-아다만타논 (2250 mg, 14.98 mmol) 용액을 추가하고, -78℃에서 15분간 교반 후에, 반응을 RT로 올라가도록 하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc (150 ml)에 희석하고 브린 (150 ml)으로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 95:5) 3560 mg (85% 수율) 의 백색 고체를 수득하였다.
화합물 1f. 화합물 1e (3500 mg, 8.35 mmol)를 30ml의 THF에 용해하였다. 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (1.0 M in THF, 9.2 ml, 9.2 mmol)을 추가하고, 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc (150 ml)로 희석하고, 1M HCl (100 ml)로 세척하였다. 유기 상은 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 85:15) 2420 mg (95% 수율)의 백색 고체를 수득하였다.
반응식 3: 화합물 1b-1f의 합성
화합물 1g . 페놀 1f (1500 mg, 4.92 mmol)를 5ml의 DCM 및 10ml의 퀴놀린에 용해하였다. 아세토브로모-α-D-갈락토스 (2430 mg, 5.91 mmol) 및 실버 카르보네이트 (1760 mg, 6.38 mmol)를 추가하고, 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 DCM (120 ml)으로 희석한 한 후 셀라이트에서 여과하였다. 여과물을 1M HCl (2×100 ml) 및 브린 (100 ml)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 70:30) 2720 mg (87% 수율) 의 백색 고체를 수득하였다.
화합물 1h . 화합물 1g (2000 mg, 3.15 mmol), bis(피나콜라토)디보론(1440 mg, 5.67 mmol), (1,5-사이클로옥타디엔)(메톡시)이리디움(I) 다이머 (42 mg, 0.063 mmol) 및 BBBPY (34 mg, 0.127 mmol)를 봉해진 시험관에서 20ml의 무수 THF에 용해하였다. 반응 혼합물을 80℃ 에서 2 시간 동안 교반하였고, 1H-NMR (1g의 방향족 하이드로젠은 사라지고, 7.48 및 7.43 ppm 에서 두 개의 방향족 하이드로젠이 나타남)로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 증발시켰다. 정제되지 않은 산물을 실리카 겔 컬럼(Hex:EtOAc 65:35) 2130 mg (89% 수율)에 통과시켜 백색 고체를 수득하였고, 상기 고체는 추가의 정제없이 다음 단계에 사용되었다.
화합물 1j . 아릴보로네이트 에스터 1h (2100 mg, 2.76 mmol), 벤질 브로마이드 1i (Jacobson et al., 1988) (950 mg, 3.04 mmol) 및 포타슘 카르보네이트 (950 mg, 6.87 mmol)를 20ml의 무수 1,4-디옥산에 용해하였다. 상기 용액을 아르곤 버블링을 이용하여 상기 용액의 가스를 철저하게 제거하였고, 이어서 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(0) (320 mg, 0.28 mmol)을 추가하였다. 상기 플라스크를 봉한 후 용액을 120℃ 에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 증발시켰다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 40:60) 950 mg (40% 수율) 의 백색 고체를 수득하였다.
반응식 4: 화합물 1g-1k의 합성
화합물 1k . 에놀 에테르 1j (250 mg, 0.29 mmol) 및 수 밀리그램의 메틸렌 블루를 20ml의 DCM에 용해하였다. 노란 광을 조사하면서, 상기 용액에 산소 방울을 불어 넣었다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 35:65) 238 mg (92% 수율) 의 백색 고체를 수득하였다. 상기 산물은 디아스테레오머 혼합물로 분리되었다.
프로브 1 . 에놀 에테르 1g (100 mg, 0.157 mmol) 및 수 밀리그램의 메틸렌 블루를 10ml의 DCM에 용해하였다. 노란 광을 조사하면서, 상기 용액에 산소 방울을 불어 넣었다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에 농축시키고, 정제되지 않은 산물을 실리카 겔 컬럼(Hex:EtOAc 60:40)에 통과시켜 메틸렌 블루를 제거하였다. 용매를 증발시키고 산물을 MeOH (3ml)에 용해하였다. 포타슘 카르보네이트 (87 mg, 0.63 mmol)를 추가하고, 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 반응을 RP-HPLC로 모니터하였다. RP-HPLC (30-100% ACN in water, 20 min) 정제로 67 mg (85% 수율) 의 백색 고체를 수득하였다. 상기 산물은 디아스테레오머 혼합물로 분리되었다.
반응식 5: 프로브 1의 합성
화합물 2b . 플루오레신 이소씨오시아네이트 2a (150 mg, 0.385 mmol) 및 N-Boc-에틸렌디아민 (68 mg, 0.42 mmol)을 2ml의 DMF에 용해하였다. 세 방울의 Et3N 를 추가하고, 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 증발시켰다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 25:75) 192 mg (91% 수율)의 오렌지색 고체를 수득하였다.
화합물 2c . 화합물 2b (40 mg, 0.073 mmol)를 2ml의 TFA 및 DCM의 1:1 혼합물에 용해하였다. 반응물을 RT에서 교반하였고, TLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 제거하였고 상기 산물을 추가의 정제없이 다음 단계에 사용하였다.
반응식 6: 화합물 2b-2c 및 프로브 2 의 합성
프로브 2 . 아민-관능화 플루오레신 2c (41 mg, 0.073 mmol) 및 NHS 에스테르 1k (65.5 mg, 0.073 mmol)를 1ml의 DMF의 용해하였다. 플라스크를 알루미늄 포일로 덮어 어두운 곳에 보관하고 2 방울의 Et3N 을 추가하였다. 반응물을 RT에서 교반하였고 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 증발시키고, 그 결과 수득된 노란색의 고체를 1.5ml의 MeOH에 용해하였다. 포타슘 카르보네이트 (40 mg, 0.29 mmol)를 추가하고, 슈가 아세테이트의 제거는 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 산물을 RP-HPLC (물 중의 30-100% ACN, 20 min)로 정제하여 57 mg (74% 수율)의 노란색 고체를 수득하였다. 상기 산물은 디아스테레오머의 혼합물로 분리되었다.
화합물 3b . 화합물 3a (Karton-Lifshin et al., 2012) (180 mg, 0.30 mmol), N-Boc-에틸렌디아민 (96 mg, 0.60 mmol) 및 2-(1H- 벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로니움 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) (228 mg, 0.60 mmol)을 3ml의 DMF에 용해하였다. 트리에틸아민 (120 μL, 0.86 mmol)을 추가하고, 반응 혼합물을 RT에서 교반하였다. 반응은 RP-HPLC (10-90% ACN in water, 20 min)로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 증발시켰다. 정제되지 않은 산물을 5ml의 H2O, 수 방울의 MeOH 및 수 방울의 AcOH에 용해하였다. RP-HPLC (10-90% ACN in water, 20 min) 로 정제하여 187 mg (84% 수율)의 노란색 고체를 수득하였다.
화합물 3c . 화합물 3b (60 mg, 0.081 mmol)를 2ml의 TFA 및 DCM의 1:1 혼합물에 용해하였다. 반응을 RT에서 교반하였고, RP-HPLC (10-90% ACN in water, 20 min)로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 제거하였고, 상기 산물을 추가의 정제없이 다음 단계에 사용하였다.
프로브 3 . 아민-관능화 QCy 3c (60 mg, 0.081 mmol) 및 NHS 에스테르 1k (72.5 mg, 0.081 mmol)를 1ml의 DMF에 용해하였다. 플라스크를 알루미늄 포일로 덮어 어둡게 보관하였으며 2 방울의 Et3N을 추가하였다. 반응을 RT에서 교반하였고, RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 증발시키고, 그 결과 생성된 노란색의 고체를 1.5ml의 MeOH에 용해하였다. 포타슘 카르보네이트 (45 mg, 0.33 mmol)를 추가하고, 슈가 아세테이트의 제거는 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 산물을 RP-HPLC (30-100% ACN in water, 20 min)로 정제하여 83 mg (82% 수율)의 노란색 고체를 수득하였다. 산물은 디아스테레오머의 혼합물로 분리되었다
반응식 7: 화합물 3b-3c 및 프로브 3의 합성
인비보 평가. 모든 동물 실험은 텔-아비브 대학의 규정, 세클러 의과대학의 규정 및 기관 동물관리 및 사용에 관한 커미티에 의해 승인된 규정을 준수하여 수행되었다.
6마리의 7 주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Harlan Laboratories Israel Ltd., Jerusalem, Israel)를 케타민(100 mg/kg) 및 자일라진(12 mg/kg)을 피하 주사하여 마취하였다. 이어 β-갈락토시다제의 존재 또는 부재 중에서 PBS 7.4 용액에서 미리 30분 동안 배양된 50 μL 의 본원의 프로브 용액을 마우스에게 복강 또는 피하 주사하였다. 상기 마우스를 영상하고 화학발광은 생체의 비침습적인 생발광 영상 시스템(Photon Imager; Biospace Lab, Paris, France)으로 15분까지 모니터하였다. 이미지는 Photo-Acquisition software (Biospace Lab)로 수득하고, M3Vision Software (Biospace Lab)로 분석하였다.
광학 영상은 다른 영상 기법 (e.g.,방사선 촬영, 자기 공명 영상 및 초음파)와 비교하여 수 개의 장점을 가진다. 형광 분자 프로브는 NIR 범위에서 다른 파장과 비교하여 보다 우수한 공간 분해능 및 보다 우수한 깊이 침투력을 보유한다. 생체 조직에서 신호 침투 및 검출의 한계를 결정하기 위해 인비보 영상이 필요하다. 이러한 데이터는 인비트로 방법으로 수득할 수 없다. 이러한 예비실험은 개념 증명의 관점에서 우리의 새로운 프로브를 최소한의 수의 동물을 사용하여 평가한다. 실험 종료시 마우스는 경추 탈구로 안락사시켰다.
β- 갈락토시다제 활성의 화학발광 현미경 영상. 화학발광 이미지는 EMCCD 카메라가 장착된 Olympus LV200 도립 현미경(Hamamatsu C9100-13)을 사용하여 수득하였다. HEK293 LacZ 안정적 발현 세포 (amsbio SC003) 및 HEK293-WT 세포 (대조군)은 35mm 바닥 페트리디쉬에서 37℃ 에서 24h 동안 배양되었다. 세포 배양 배지를 5 μM 의 프로브 3를 포함하는 Molecular Probe® Live Cell Imaging Solution으로 교체하였다. 세포를 37℃ 에서 추가로 20분동안 더 배양하였다. 그 후, 20분의 노출시간으로 영상으로 기록하였다.
결과 및 논의
플루오로포어 - 테더링된 디옥세테인 프로브의 디자인 및 합성 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트의 일반적 구조 및 그 활성화 기전은 반응식 8에 기재되어 있다. 목적하는 분석물에 의한 촉발제의 제거로 CIEEL 기전이 개시되고, 이는 여기된 벤조에이트로부터 염료로의 에너지 전달을 유도하여, 본원 플루오로포어의 여기가 초래된다. 따라서, 광 방출은 그 상응하는 파장에서 방출성이 높은 종 (본원 플루오로포어)로부터 발생하여야 한다.
본 발명자들은 플루오로포어의 페놀 고리로의 모듈식 부착을 가능하게 하는 실용적인 합성 경로를 개발하고자 하였다. 디옥세테인은 일반적으로 일중항 산소의 이중결합과의 반응에 의해 제조된다. 일중항 산소의 생산 조건이 언제나 플루오로포어의 존재와 양립할 수 있는 것이 아니기 때문에, 본 발명자들은 디옥세테인의 제조 후에 플루오로포어의 부착을 가능하게 하는 후기 단계 관능화 화학을 개발하였다. β-갈락토시다제의 활성화 (하나의 모델 효소로서) 를 위해 디자인된 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트의 합성법은 반응식 9에 개시되어 있다. 시중의 알데하이드 1a를 트리메틸 오르쏘포르메이트로 보호하여 아세탈 1b를 만들고, 이어 TBSCl로 페놀기를 추가로 보호하여 화합물 1c를 제조하였다. 후자는 트리메틸포스파이트와 반응하여 포스포네이트 1d를 생산하고, 이는 Wittig-Horner 반응을 통해 2-아다만타논과 축합되어 에놀 에테르 1e를 생산하였다. 1e의 TBS 기의 탈보호로 페놀 1f가 생산되었고, 이는 브로모-갈락토스 유도체로 알킬화되어 화합물 1g가 생산되었다. 1g의 Hartwig-Miyaura C-H 보릴화 (Ishiyama et al., 2002)로 페닐보론산 에스테르 1h를 수득하였고, 이는 Suzuki 커플링 반응을 통해 벤질 브로마이드 1i와 커플링되어 화합물 1j를 수득 하였다. 일중항 산소에 의한 1j의 산화는 NHS- 에스테르 - 관능화된 디옥세테인 1k를 제공하였다. 이 NHS- 에스테르는 다양한 아민 관능화 된 염료와 쉽게 반응하여 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트 1m을 생산한다.
반응식 8: 디옥세테인-테더링된 플루오로포어의 화학발광 활성화 경로
반응식 9에 제시된 합성 방법에 따라 본 발명자는 β-갈락토시다제 활성의 모니터링을 위해 세가지의 상이한 화학발광 프로브 (프로브 1-3, 반응식 5-7 참조)을 제조하였다. 프로브 2 및 3은 각각 형광 염료 플루오레신 및 QCy (Karton-Lifshin et al., 2011; Karton-Lifshin et al., 2012)으로 테더링된 디옥세테인으로 구성된다. 프로브 1은 테더링된 염료가 없는 기본 Schaap-디옥세테인이다. β-갈락토시다제 기질의 절단 후에 방출된 페놀의 pKa를 감소시키기 위해 페놀 고리에 클로린 치환체가 도입되었다. 이러한 pKa는 디옥세테인의 화학여기 경로가 생리학적 조건하에서 일어날 수 있도록 하여야 한다.
반응식 9: 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트의 합성전략
디옥세테인 -염료 컨쥬게이트의 광-유도 분해. 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트의 합성에 대하여 연구하면서, 본 발명자들은 예기치 않은 현상에 접하였다. 비록 프로브 1 은 광안정적인 것으로 보이나, 프로브 2 및 3 은 통상 실내 조명 조건에서 분해되는 것처럼 보였다. 본 발명자는 프로브의 광안정성을 통상 실내 조명하에서 수용액 (PBS, pH 7.4) 중에서 측정하였다. 상기 광-유도된 분해는 RP-HPLC로 수 시간에 걸쳐 모니터되었다 (도 2).
프로브 1은 12h 기간에 걸쳐 광에 영향을 받지 않았다. 프로브 3은 프로브 2 보다 상당히 더 높은 광안전성을 나타냈다. 프로브 2의 광-유도 분해 반감기는 45 min 이었고, 반면 프로브 3의 반감기는 약 6 h이었다. 용액이 암조건에서 보관된 경우에는 어떤 프로브도 분해되지 않는 것으로 관찰되었다. 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트의 광유도된 분해의 가능한 기전은 여기된 염료로부터 퍼옥시-디옥세테인 결합으로의 전자 전달이 관여할 수도 있다 (Wakimoto et al., 2015). 도 3은 가능한 광-유도 분해 기전을 나타낸다. 컨쥬게이트 I의 플루오로포어는 가시광에 의해 여기되어 여기된 종 II을 형성한다. 상기 여기된 플루오로포어의 LUMO로부터 O-O 퍼옥사이드 결합의 안티결합 σ* 오비탈로의 전자 전달은 결합 절단 및 뒤이은 디옥세테인의 벤조에이트 III 및 아다만타논으로의 분해를 초래한다. 프로브 2 및 3의 관찰된 광 불안정성은 종전의 보고된 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트 합성 방법에 대하여, 본원의 후기 관능화 방법의 장점을 설명한다. 에놀 에테로의 디옥세테인으로의 산화는 일반적으로 광원 및 광민감제에 의해 산소로부터 생성된 일중항 산소에 의해 수행된다. 이러한 조건은, 플루오로포어의 컨쥬게이션 후에 적용되면, 디옥세테인의 분해를 초래할 수도 있다. 본 발명자는 디옥세테인의 제조 후에만 플루오로포어의 부착을 하도록 하는 후기 관능화 화학을 사용하여 광-유도된 분해를 피할 수 있었다.
디옥세테인-염료 컨쥬게이트 vs. 디옥세테인 및 염료의 혼합물에 대하여 관찰된 에너지 전달. 본 발명자는 먼저 β-갈락토시다제로 활성화시, 프로브 1 및 염료의 1;1 혼합물과 비교하여 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트에서 에너지 전달의 효율성을 평가하고자 하였다. 수득한 화학발광 방출 스펙트럼은 도 4에 기재되어 있다. 플루오레신의 경우, 470 및 535 nm의 파장에서 두 개의 최대 방출이 디옥세테인-염료 혼합물에서 수득되었다 (도 4, 패널 A). 상기 파장은 각각 프로브 1의 직접 화학발광 및 에너지 전달로부터 초래된 플루오레신 방출에 상응한다. 반면 프로브 2 (디옥세테인-플루오레신 컨쥬게이트)는, β-갈락토시다제에 의해 활성화시, 분해되어 독점적으로 535 nm에서 최대 방출파장을 갖는 초록 광을 방출하였다 (도 4, 패널 B). 프로브의 상기 관찰된 화학발광 스펙트럼은 그 형광 스펙트럼 (점선)과 거의 동일하였다; 이는 플루오레신 수용체로의 완전한 에너지 전달을 나타낸다. QCy의 경우, 디옥세테인-염료 혼합물에 대하여 단지 최대 파장 470nm의 파란색 방출만이 관찰되었다 (도 4, 패널 C). 이러한 방출은 프로브 1의 직접적 화학발광에 해당된다. 반면, 프로브 3 (QCy-테더링된 디옥세테인)는 분해되어 최대 방출 파장이 714nm인 NIR 광을 방출하였다(도 4, 패널 D). 유사하게, 프로브 2에 대하여 관찰된 바와 같이, 프로브 3의 화학발광 스펙트럼은 이의 플루오레신 스펙트럼과 거의 동일한 것으로 나타났다 (점선). 이러한 관찰은 반응식 8에 도시된 에너지 전달 기전을 명백하게 뒷받침하며, 디옥세테인 및 염료 사이의 공유 컨쥬게이션의 중요성을 적절하게 증명한다.
프로브 1, 2 및 3에 대하여 측정된 화학발광 파라미터 및 및 이들의 β- 갈락토시다제의 검출 및 영상 능력. 다음으로 본 발명자는 β-갈락토시다제의 존재 및 부재 중에서, 시간의 함수로서, 프로브의 광방출을 측정하였다. 프로브는 β-갈락토시다의 존재 중에서 초기 신호가 최대로 증가한 후 제로까지 느리게 감소하는 전형적인 화학발광 동역학 프로파일을 나타냈다 (도 5, 패널 A-C). β-갈락토시다제의 부재 중에서는 프로브로부터 광 방출은 관찰되지 않았다. 도 5, 패널 D-F 은 각 프로브에서 방출된 총 광 카운트를 나타낸다. 프로브 1, 2 및 3에 대하여 수득된 측정 화학발광 파라미터는 표 8에 요약되어있다.
프로브 2 및 3의 화학발광 양자 수율 (φ CL)을 공지된 표준법 대로 프로브 1의 것을 사용하여 계산하였다 (Edwards et al., 1994). 프로브 2 및 3 은 프로브 1에서 나타난 방출보다 상당히 더 높은 광 방출을 나타냈다 (프로브 2 는 114-배 및 프로브 3은 27-배). 부가하여, 프로브 2 및 3 은 동일한 조건에서 광 방출 반감기가 더 길었다.
표 8: 프로브 1-3에 대하여 수득된 화학발광 파라미터
프로브 2는 다른 프로브보다 더 밝은 화학발광을 나타냈는데 이는 이의 에너지 전달이 여기된 플루오레신 종 (90% 플루오레신 양자 수율을 갖는 염료)으로 초래되기 때문이다. 본 발명자는 따라서 프로브 2를 선택하였으며, β-갈락토시다제를 검출하는 이의 능력을 검증하였다 (도 6). 프로브를 상이한 농도의 β-갈락토시다제와 배양하고 1 h의 기간에 걸쳐 총 화학발광 방출을 수집하였다. 효소 농도 및 통합된 화학발광 신호사이에 선형 상관성이 관찰되었으며, 이는 효소 농도의 정량을 가능하게 한다. 본 발명자는 4.0×10-3 units/mL의 검출 한계(블랭크 대조군+3 SD)를 결정하였다.
β-갈락토시다제 활성을 영상하는 프로브 2 및 3의 능력은 프로브 1을 대조군으로 사용하여 처음에는 수용액(PBS, pH 7.4)에서 측정하였다(도 7A). β-갈락토시다제의 부재 중에서, 화학발광은 어떤 프로브에서도 관찰되지 않았다; 그러나, 효소의 존재 중에서, 프로브 2 및 3은 프로브 1의 강도와 비교하여 훨씬 더 강한 광을 방출하였다 (프로브 2의 경우 약 100배, 및 프로브 3의 경우 약 25 배, 도 7B). 프로브 2 및 3을 인비보에서 추가의 평가를 위해 선별하였다; 주목할 만하게도, 프로브 3은 NIR 영역내에서 광을 방출한다. 이 영역의 광은 NIR 광자는 유기성 조직을 침투하기 때문에, 인비보 영상에 최적이다 (Weissleder, 2001; Gnaim 및 Shabat 2014; Kisin-Finfer et al., 2014; Redy-Keisar et al., 2014; Redy-Keisar et al., 2015a-b). 프로브 2 및 3을 β-갈락토시다제와 인큐베이션 하였고, 이어 마우스에 피하주사하였다. 이러한 조건하에서, 명확한 화학발광 이미지가 양쪽 프로브 모두에서 수득되었다(도 7C); 그러나, 프로브 3에서 수득된 신호강도가 프로브 2에서 수득된 것과 비교하여 약 6-배 더 높았다 (도 7D). β-갈락토시다제와 미리 배양되지 않은 경우는 프로브로부터 화학발광 신호가 수득되지 않았다.
프로브 2 및 3의 인비보에서 화학발광 신호를 추가로 비교하기 위해, 상기 프로브 (β-갈락토시다제와의 엑스비보에서 배양 및 배양을 하지 않음)를 마우스에 복강 주사하였다. 놀랍게도 프로브 3은 인비보 이미지에서 강한 화학발광을 나타낸 반면, 프로브 2에서는 화학발광 신호가 관찰되지 않았다 (도 8). 이러한 관찰은 프로브 2에 의해 생산된 초록색 파장의 화학발광 vs. 프로브 3에 의해 생산된 NIR 화학발광의 인비보 영상의 장점을 명백하게 증명한다.
인비보 영상에서 Schaap's 디옥세테인을 사용하는 종전의 예 (Cao et al., 2015; Cao et al., 2016; Liu 및 Mason, 2010)에서, 계면활성제-염료 어덕트(Emerald-II enhancer)를 화학발광 신호의 검출이 가능하게 하기위해, 주사되는 용액에 추가하였다. 인비보 영상을 위해 다-성분 시스템을 사용하는 것은 특히 동물을 전신 치료시에 명백한 한계가 있다. 본 발명자가 도 8에서 증명하였듯이, β-갈락토시다제로의 엑스비보 활성화 및 마우스로의 복강 투여 후에, QCy-테더링된 디옥세테인 (프로브 3)로부터 밝은 이미지가 수득되었다. 여기에서 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트가 인비보 영상에서 턴-온 화학발광 프로브로서 작용할 수 있다는 개념의 증명 확립하였다. 다음 단계에서, 본 발명자는 프로브가 암 및 염증과 같은, 실제 병리학적 상태를 이미지할 수 있는 능력에 대하여 연구하고자 하였다. 다만 실제 내인성 활성에 기초한 영상을 증명하기 위해, 본 발명자는 다음으로 β-갈락토시다제를 내인성으로 과발현하는 세포를 영상하고자 하였다.
프로브 3에 의한 화학발광 현미경을 이용한 세포 영상 . 형광 현미경은 세포 영상을 위한 널리 알려진 확립된 방법이지만, 생발광 현미경은 최근에 등장하였다 (Bauer, 2013). 기계의 개량으로 올림퍼스에서 LV200 현미경을 개발하였다. 이 현미경의 셋업은 단일 세포의 해상도로 발광 프로브의 위치를 알아내고 정량할 수 있는 능력을 현저하게 향상시켰다. 지금까지는 단지 루시페린만이 루시페라제 유전자가 전달이입된 세포를 영상하는 프로브인 것으로 증명되었다. 본 발명자는 LV200 현미경을 사용하여 β-갈락토시다제를 과발현하는 세포를 영상화하는 프로브 3의 능력을 평가하고자 하였다. HEK293 (LacZ로 전달이입됨) 및 HEK293-WT (대조군) 세포를 프로브 3과 인큐베이션하고, 이이서 20× 대물렌즈 (NA 0.75)를 사용하여 LV200로 영상하였다 (도 9). 프로브 3은 HEK293-LacZ 세포의 화학발광 이미지를 생산할 수 있었고(도 9, 패널 b), 반면 HEK293-WT 세포에서는 화학발광 신호가 전혀 관찰되지 않았다 (도 9, 패널 d).
이미지의 품질을 향상시키기 위해, HEK293-LacZ 세포를 4% 포름알데하이드로 고정하고, 0.1% Triton X-100으로 투과성있게 만들었다. 상기 세포를 이어 프로브 3과 인큐베이션하고, 60× 대물렌즈 (NA 1.42)를 사용하여 현미경으로 촬영하였다. 도 10 (패널 a, 투과 광; 패널 b, 화학발광)에서 보는 바와 같이, 세포는 뚜렷한 화학발광 방출을 나타내며 가시화 되었다.
비록 수득된 이미지의 품질이 아직 높지는 않지만, 본 발명자가 아는 한, 이러한 결과는 루시페린과 관련되지 않은 턴-온 저분자 프로브에 의해 생산된 첫번째 화학발광 세포 이미지이다. 이러한 방법은 본원 프로브의 촉발 기(트리거)를 다른 적절한 분석물에 반응성인 기질로 대체함으로써 세포에서 다른 효소적/화학적 반응의 영상을 가능하게 하는 것이다. 본 연구에서 개발된 합성 전략은 다양한 화학발광 프로브의 편리한 합성을 가능하게 한다. 예를 들면, 리파아제 또는 에스터라제 프로브가 β-갈락토오스 촉발 기 대신에 적절한 에스테르 촉발 기를 도입하여 제조될 수 있다. 유사하게, 프로테아제 프로브도 촉발 기질로서 짧은 특이적 펩타이드를 사용하여 합성될 수 있다. 물론, 특정 기질의 도입은 다른 기질의 도입과 비교하여 더 힘들수도 있다; 하지만, 오르쏘고날 보호기의 사용은 합성의 어려움을 해결하는데 도움을 줄 것이다.
결론
요약하면, 본 발명자는 간단하고 실용적인 턴-온 플루오로포어-테더링된 디옥세테인 화학발광 프로브의 합성 방법을 개발하였다. 본 합성이 효율성은 Hartwig-Miyaura C-H 보릴화에 의한 디옥세테인 전구체의 후기 관능화, 뒤이은 후속적 스즈키 커플링 및 디옥세테인으로의 산화에 기초한 것이다. 상기 수득된 중간체는 임의의 플루오로포어-아민 유도체와 컨쥬게이션할 준비가 된 반응성 NHS-에스테르-디옥세테인으로 구성되어 있다. 본 발명자는 또한 디옥세테인-플루오로포어 컨쥬게이트의 광-유도 분해 현상을 보고하였으며, 이는 본원의 합성 방법의 장점을 부각하는 것이다. 플루오로포어테더링된 디옥세테인 프로브의 화학발광 방출은 에너지전달 기전을 통해 고전적 디옥세테인 프로브와 비교하여 현저하게 증폭되었다. 본원의 합성된 프로브는 여기된 테더링된 플루오로포어의 방출 파장에 매치되는 다양한 색의 빛을 생산하였다. 본원의 합성 경로를 사용하여, 본원에서는 β-갈락토시다제에 의해 활성화되도록 디자인되고, 초록(플루오레신) 및 NIR(QCy) 형광 염료로 컨쥬게이션 된 두 개의 플루오로포어-테더링된 디옥세테인 프로브를 합성하였다. 이 두 개의 프로브는 모두 β-갈락토시다제에 의해 활성화 후 피하 주사 후 인비보 화학발광 이미지를 제공할 수 있었다. 그러나 복강 주사 후의 화학발광 이미지는 NIR 프로브에서만 관찰되었다. 이러한 결과는 어떤 첨가제의 필요없이 Schaap's 디옥세테인-기재의 화학발광 프로브에 의해 생산된 최초의 인비보 이미지이다. NIR 프로브는 내인성 β-갈락토시다제 활성을 기반으로 하여, 화학발광 현미경을 이용하여 세포를 영상할 수 있었다. 이러한 프로브는 리포터 유전자, 효소 및 화학 분석물의 인비보 영상에 사용될 수도 있다. 본 발명자들은 본원의 디옥세테인-테더링된 빌딩 블락을 위한 실용적인 합성 방법론이 다수의 적용에 적합한 다양한 화학발광 프로브의 제조에 유용할 것으로 기대한다.
연구 2. 비-루시페린 기재의 저분자 프로브를 이용한 화학발광 세포 영상: 방출성 종(species)에 미치는 치환체의 놀라운 효과
실험
일반적 사항 . 무수 조건을 요구하는 모든 반응은 아르곤 대기 하에서 수행되었다. 모든 반응은 다른 언급이 없으면 RT에서 수행되었다. 화합물 및 용매는 A.R. 등급 또는 표준 기술로 정제되었다. TLC: 실리카 겔 플레이트 Merck 60 F254: 화합물은 UV 광으로 조사하여 가시화되었다. 컬럼 크로마토그래피: 실리카 겔 Merck 60 (입자 크기 0.040-0.063 mm), 용리액은 괄호에 기재. RP-HPLC: C18 5u, 250×4.6 mm, 용리액은 괄호에 기재. 제조용 RP-HPLC: C18 5u, 250×21 mm, 용리액은 괄호에 기재. 1H-NMR 스펙트럼은 400MHz에서 작동하는 Bruker Avance로 기록되었다. 13C-NMR 스펙트럼은 100 MHz에서 작동하는 Bruker Avance로 기록되었다. 화학 시프트는 잔류 용매에 대해 δ 스케일상에서 ppm으로 보고되었다 (CDCl3: δ=7.26 for 1H-NMR 및 77.16 for 13C-NMR, DMSO-d6: δ=2.50 for 1H-NMR 및 39.52 for 13C-NMR). 질량 스펙트럼은 Waters Xevo TQD로 측정되었다. 형광 및 화학발광은 Molecular Devices Spectramax i3x로 기록되었다. 형광 양자 수율은 Hamamatsu Quantaurus-QY을 이용하여 결정되었다. 염 및 용매를 포함하는, 모든 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
벤조에이트 5a . 2-클로로-3-하이드록시벤즈알데하이드 (1a, 312 mg, 2 mmol)는 MeOH (5 mL)에 용해되었다. 옥손 (Oxone) (615 mg, 2 mmol) 및 In(OTf)3 (112 mg, 0.22 mmol)를 RT에서 첨가하였다. 반응혼합물을 가열하여 환류하고 그리고 RP-HPLC로 모니터하였다. 반응이 종료된 후에, 상기 혼합물을 여과하고, 여과된 반응혼합물을 회전 증발기를 이용하여 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피(Hex:EtOAc 30:70)를 이용하여 정제하여 백색 고체로서 벤조에이트 5a를 수득하였다 (339 mg, 92% 수율).
반응식 10: 벤조에이트 5a 합성
화합물 4b . EtOH (4 mL) 중의 교반된 벤조에이트 4a　(1.52 g, 10 mmol) 용액에 I2　(1.02 g, 4 mmol)를 한 번에 추가하였다. 반응물을 가열 환류시키고 HIO3 (352 mg, 2 mmol) 수용액(2 mL)을 추가하였다. 상기 혼합물을 1시간 동안 환류한 후에 RT로 온도를 낮추었다. 상기 산물을 여과하여 회수하고 물로 세척하여 백색 고체의 화합물 4b를 수득하였다 (2.11 g, 76% 수율).
화합물 4c . 톨루엔 (100ml) 중의 화합물 4b (1.39 g, 5 mmol) 및 TEMP (1.52 μl, 0.05 mmol)의 혼합물을 100℃ 로 가열하였다. 이어, 톨루엔 (50ml)에 용해된 SO2Cl2 (404 μl, 5 mmol)를 적가하였다. 상기 혼합물을 100℃ 에서 1시간 동안 교반하였다. 종료시, 상기 반응물은 RT로 냉각하고, 상기 산물을 여과하여 회수하고 톨루엔으로 세척하여 백색의 고체로서 화합물 4c를 수득하였다 (1.12 g, 72% 수율).
반응식 11: 화합물 4b 및 4c의 합성
일반적 방법: 메틸 아크릴레이트와 요오드페놀의 Heck 반응 ( 벤조에이트 6a 및 7a) . 요오드페놀 (1eq), 메틸 아크릴레이트 (3eq) 및 Et3N (4.2eq)을 무수 ACN에 용해하였다. 이어 Pd(OAc)2 (0.05eq) 및 P(o-tol)3 (0.01eq) 를 추가하였다. 상기 플라스크를 밀봉하고 120℃에서 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. (Hex:EtOAc 80:20). 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc 로 희석하고 포화 NH4Cl 로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(Hex:EtOAc 85:15)로 정제하여 상응하는 페놀 아크릴레이트를 수둑하였다.
벤조에이트 6a . 화합물 4b (200 mg, 0.72 mmol)는 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로서 수득되었다 (130 mg, 77% 수율).
벤조에이트 7a . 화합물 4c (200 mg, 0.64 mmol)는 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로서 수득되었다 (115 mg, 67% 수율).
반응식 12: 벤조에이트 6a 및 7a의 합성
일반적 방법: 요오드페놀과 아크릴로니트릴의 Heck 반응 ( 벤조에이트 8a 및 9a) . 요오드페놀 (1eq), 아크릴로니트릴 (3eq) 및 Et3N (1.5eq)을 무수 ACN 에 용해하였다. 이어 Pd(OAc)2 (0.05eq)를 추가하고, 플라스크를 밀봉하였다. 혼합물을 마이크로웨이브로 120℃로 가열하였다. 반응은 TLC(Hex:EtOAc 80:20)로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc 로 희석하고 NH4Cl로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(Hex:EtOAc 80:20)로 정제하여 페놀 아크릴레이트를 수득하였다.
벤조에이트 8a . 화합물 4b (200 mg, 0.72 mmol)는 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (118 mg, 81% 수율).
벤조에이트 9a . 화합물 4c (200 mg, 0.64 mmol) 는 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (1.04 mg, 69% 수율).
반응식 13: 벤조에이트 8a 및 9a의 합성
화합물 4e . 3-하이드록시벤즈알데하이드 디메틸 아세탈 4d (Gopinath et al., 2002) (2580 mg, 15.36 mmol) 및 이미다졸 (1568 mg, 23.04 mmol) 을 15ml의 DCM에 용해하였다. TBSCl (2764 mg, 18.42 mmol) 를 추가하고, 상기 용액을 RT 에서 30분 동안 교반하였고 TLC로 모니터하였다. 종료시, 백색 침전물을 여과하여 걸러내고, 용매를 감압하에서 증발하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 95:5) 화합물 4e 를 무색의 오일로 수득하였다 (4070 mg, 94% 수율).
화합물 4f . 아세탈 4e (4070 mg, 14.43 mmol) 및 트리메틸 포스파이트 (2.56 ml, 21.65 mmol)을 40ml의 DCM에 용해하였다. 반응 혼합물을 0℃ 로 냉각하고, 티타늄(IV) 클로라이드 (2.38 ml, 21.65 mmol)를 적가하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 상기 용액을 포화된 0℃의 NaHCO3 (130 ml) 수용액에 부어 넣었다. 10 분 교반 후에, 100ml의 DCM 을 추가하여 상을 분리하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 30:70) 화합물 4f를 무색의 오일로 수득하였다 (3745 mg, 72% 수율).
화합물 4g . 포스포네이트 4f (3745 mg, 10.38 mmol)를 -78℃에서 아르곤 대기하에서 25ml의 무수 THF에 용해하였다. LDA (2.0 M in THF, 6 ml, 12 mmol)를 추가하고 상기 용액을 20분간 교반하였다. 20ml의 THF 중의 2-아다만타논 (1863 mg, 12.46 mmol) 용액을 추가하고 -78℃에서 15분간 교반 후에, 반응의 온도를 올려 실온이 되게 하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc (150 ml)로 희석하고 브린 (150 ml)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 95:5) 화합물 4g 를 무색의 오일로 수득하였다 (3200 mg, 80% 수율).
화합물 4h . 화합물 4g (3200 mg, 8.3 mmol)를 30ml의 THF에 용해하였다. 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (1.0 M in THF, 9.2 ml, 9.2 mmol) 을 추가하고, 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc (150 ml) 로 희석하고, 1M HCl (100 ml)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 85:15) 화합물 4h 를 백색의 고체로 수득하였다 (2130 mg, 95% 수율).
화합물 4i . 화합물 4h (2130 mg, 7.9 mmol) 을 150ml의 톨루엔에 용해하고 및 0℃로 냉각하였다. N-요오드숙신이미드 (1777 mg, 7.9 mmol) 를 나누어서 추가하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 반응을 포화된 Na2S2O3로 ??칭하고 EtOAc (250 ml)로 희석하고, 브린(200 ml)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 실리칼 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 85:15) 화합물 4i를 백색의 고체로 수득하였다 (2439 mg, 78% 수율).
반응식 14: 화합물 4e-4i 합성
화합물 4j . 화합물 1f (2420 mg, 7.9 mmol) 150ml의 톨루엔에 용해하고 및 0℃로 냉각하였다. N-요오드숙신이미드 (1777 mg, 7.9 mmol) 를 나누어서 추가하였다. 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 증발시켰다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 80:20) 화합물 4j를 백색의 고체로 수득하였다 (1531 mg, 45% 수율).
반응식 15: 화합물 4j 합성
일반적 방법: 메틸 아크릴레이트와 요오드페놀의 Heck 반응 (화합물 6c 및 7c) . 요오드페놀 (1eq), 메틸 아크릴레이트 (3eq), 및 Et3N (1.5eq) 을 무수 ACN에 용해하였다. 이어 Pd(OAc)2 (0.05eq) 및 P(o-tol)3 (0.01eq) 을 추가하였다. 플라스크를 밀봉하고 용액을 120℃에서 교반하였다. 반응은 TLC (Hex:EtOAc 80:20)로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc에 희석하고 포화된 NH4Cl로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농출하였다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피 (Hex:EtOAc 85:15)로 정제하여 상응하는 페놀 아크릴레이트를 수득하였다.
화합물 6c . 화합물 4i (395 mg, 1 mmol) 는 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 흐린 노란색의 고체로서 수득되었다 (248 mg, 70% 수율).
화합물 7c . 화합물 4j (430 mg, 1 mmol) 는 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 흐린 노란색의 고체로서 수득되었다 (271 mg, 70% 수율).
반응식 16: 화합물 6c-7c 합성
일반적 방법: 아크릴로니트릴 (화합물 8c 및 9c)과 요오드페놀의 Heck 반응 요오드페놀 (1eq), 아크릴로니트릴 (3eq) 및 Et3N (1.5eq) 무수 ACN에 용해하였다. 이어 Pd(OAc)2 (0.05eq) 를 추가하고 플라스크를 밀봉하였다. 혼합물을 마이크로웨이브로 조사하여 120℃ 로 가열하였다. 반응은 TLC (Hex:EtOAc 80:20)로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고 포화된 NH4Cl로 세척하였다. T유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피 (Hex:EtOAc 80:20)로 정제하여 상응하는 페놀 아크릴레이트를 수득하였다.
화합물 8c . 화합물 4i (200 mg, 0.5 mmol) 는 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 흐린 노란색의 고체로서 수득되었다 (129 mg, 80% 수율).
화합물 9c . 화합물 4j (200 mg, 0.45 mmol) 는 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 흐린 노란색의 고체로서 수득되었다 (77 mg, 48% 수율).
반응식 17: 화합물 8c-9c 합성
페놀 5b . 에놀 에테르 1f (100 mg 0.3 mmol) 및 수 밀리그램의 메틸렌 블루를 20ml의 DCM에 용해하였다. 상기 용액에 노란색 빛을 조사하면서 산소 방울을 불어 넣었다. 상기 용액은 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료 후, 반응 혼합물을 감압하에서 증발시켜 농축하였다. 비정제 산물은 제조용 RP-HPLC (물 중의 ACN 구배)로 정제하였다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다.
반응식 18: 페놀 5b 합성
일반적 방법: 디옥세테인 형성 (화합물 6b-9b) . 에놀 에테르 및 수 밀리그램의 메틸렌 블루를 20ml의 DCM에 용해하였다. 상기 용액에 노란색 빛을 조사하면서 산소 방울을 불어 넣었다. 반응은 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료 후, 반응 혼합물을 감압하에서 증발시켜 농축하였다. 비정제 산물은 제조용 RP-HPLC (물 중의 ACN 구배)로 정제하였다.
페놀 6b . 화합물 6c (90 mg, 0.25 mmol) 은 일반적 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (70 mg, 71% 수율).
페놀 7b . 화합물 7c (60 mg, 0.15 mmol) 은 일반적 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (20 mg, 31% 수율).
페놀 8b . 화합물 8c (100 mg, 0.31 mmol) 은 일반적 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (55 mg, 50% 수율).
페놀 9b . 화합물 9c (120 mg, 0.35 mmol) 은 일반적 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (52 mg, 38% 수율).
반응식 19: 페놀 6b-9b 합성
화합물 4l . 화합물 4k (Redy-Keisar et al., 2014) (1.0 g, 2.2 mmol) 및 NaI (1.0 g, 6.7 mmol)을 2 mL ACN 에 용해하고, 0℃로 냉각하였다. 10 분 후에, TMS-Cl (837μl, 6.7 mmol)을 추가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 30분 동안 교반하고, TLC (Hex:EtOAc 70:30)로 모니터하였다. 종료 후에, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 포화된 NH4Cl로 세척하였다. 유기 층을 분리하여 브린으로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 증발시켰다. 비정제 산물은 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(Hex:EtOAc 70:30) 로 정제하여 화합물 4l을 백색의 고체로 수득하였다 (1.08 g, 87% 수율).
반응식 20: 화합물 4l 합성
S N 2, 벤질 에테르 형성 (화합물 6d-9d) 의 일반적 방법 . 에놀 에테르 (1eq)를 1 mL 드라이 DMF 에 용해하고 0℃로 냉각하였다. K2CO3 (1.2eq) 를 추가하고 상기 용액을 0℃ 에서 10 분 동안 교반한 후 화합물 4l (1eq) 을 추가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 RT에서 교반하고, TLC (Hex:EtOAc 50:50)로 모니터하였다. 종료 후에, 반응 혼합물을 EtOAc (100 ml) 로 희석하고 포화된 NH4Cl (100 ml)로 세척하였다. 유기상을 분리하여 브린으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 증발시켰다. 비정제 산물을 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(Hex:EtOAc 50:50)로 정제하였다.
화합물 6d . 화합물 6c (100 mg, 0.28 mmol) 는 일반적 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (186 mg, 84% 수율).
화합물 7d . 화합물 7c (200 mg, 0.51 mmol) 는 일반적 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (273 mg, 65% 수율).
화합물 8d . 화합물 8c (129 mg, 0.4 mmol) 는 일반적 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (263 mg, 87% 수율).
화합물 9d . 화합물 9c (77 mg, 0.22 mmol) 는 일반적 방법에 따라 반응되었다. 반응물을 흐린 노란색의 고체로 수득되었다 (160 mg, 90% 수율).
프로브 5 . 이는 갈락토스 모이어티로부터 아세틸 기의 제거 및 이중 결합의 탈산소화에 의해, 반응식 9의 화합물 1g로부터 합성되었다.
반응식 21: 프로브 5의 분자 구조
아세테이트 탈보호 및 디옥세테인 형성 ( 프로브 6- 9)의 일반적 방법. 아세테이트 보호된 슈가-에놀-에테르를 MeOH (3 ml)에 용해하였다. 포타슘 카르보네이트 (4.2eq) 를 추가하고 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 반응은 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc (100 ml)로 희석하고 브린(100 ml)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 농축하였다. 비정제 산물은 정제하지 않고 추가로 반응되었다. 상기 비정제 산물 및 수 밀리그램의 메틸렌 블루를 20ml의 DCM에 용해하였다. 상기 용액을 노란 빛으로 조사하면서, 상기 용액에 산소 방울울 불어 넣었다. 반응은 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료 후, 반응 혼합물을 감압하에서 증발시켜 농축하였다. 비정제 산물은 제조용 RP-HPLC (물 중의ACN 구배)로 정제되었다.
프로브 6 . 화합물 6d (133 mg, 0.22 mmol) 은 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (64 mg, 63% 수율).
프로브 7 . 화합물 7d (273 mg 0.33 mmol) 은 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (90 mg, 40% 수율).
프로브 8 . 화합물 8d (130 mg 0.17 mmol) 은 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (69 mg, 65% 수율).
프로브 9 . 화합물 9d (160 mg, 0.2 mmol) 은 일반적인 방법에 따라 반응되었다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다(61 mg, 46% 수율).
화합물 10a . 에놀 에테르 6c (500 mg, 1.41 mmol) 및 트리에틸아민 (0.49 ml, 3.5 mmol)을 5ml의 DCM에 용해하고 0℃로 냉각하였다. 트리플루오로메탄설포닉 안하이드라이드 (0.29 ml, 1.7 mmol) 를 추가하였다. 반응 혼합물을 TLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 DCM (100 ml)로 희석하고 브린 (100ml)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 80:20) 화합물 7a 를 노란색 오일로 수득하였다 (562 mg, 82% 수율).
반응식 22: 화합물 6d-9d 및 프로브 6-9 합성
화합물 10b . 화합물 10a (562 mg, 1.16 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(589 mg, 2.32 mmol), 포타슘 아세테이트 (341 mg, 3.48 mmol), [1,1′-bis(디페닐포스피노) 페로세네 디클로로팔라듐(II) (170 mg, 0.23 mmol)을 20ml의 드라이 디옥산에 용해하고 아르곤 하에서 120℃ 에서 교반하였다. 반응은 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc (100 ml) 로 희석하고, 브린으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 70:30) 화합물 10b를 노란색 오일로 수득하였다(441 mg, 82% 수율).
프로브 10 . 보란 (Borane) 10b (441 mg, 0.95 mmol), NaOH (114 mg, 2.8 mmol) 을 5ml의 4:1 THF:H2O 용액에 용해하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 밤새 교반하고 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc (100 ml) 로 희석하고, 0.5M HCl (100 ml)의 포화 용액으로 세척하였다. 유기상을 분리하고, 브린으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 증발시켰다. 비정제 잔류물을 및 수 밀리그램의 메틸렌 블루를 20ml의 DCM에 용해하였다. 상기 용액을 노란 빛으로 조사하면서 상기 용액에 산소 방울을 불어 넣었다. 반응은 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 용매를 감압하에서 농축하고, 산물은 제조용 RP-HPLC (물 중의 ACN 구배)로 정재하였다. 산물은 백색의 고체로 수득되었다 (201 mg, 47% 수율).
반응식 23: 화합물 10a-10b 및 프로브 10 합성
화합물 11a . 에놀 에테르 6c (200 mg, 0.56 mmol)를 2ml의 DCM 에 용해하고 DMAP (136 mg, 1.12 mmol) 를 추가하고 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 트리알릴 포스파이트 (0.25 ml, 1.23 mmol)를 2ml의 DCM에 용해하고 0℃로 냉각하였다. 아이오다인 (284 mg, 1.12 mmol) 을 추가하고 반응이 균질하게 될때까지 교반하였다. 상기 아이오다인 용액을 페놀 용액에 파이펫으로 넣었다. 상기 반응은 TLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 DCM (100 ml) 로 희석되고 브린 (100 ml)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (Hex:EtOAc 70:30) 화합물 11a 를 노란색의 오일로 수득하였다 (162 mg, 56% 수율).
프로브 11 . 포스페이트 11a (166 mg, 0.3 mmol)를 1ml의 ACN에 용해하였다. 피롤리딘 (0.153 ml, 1.86 mmol), 트리페닐 포스파인 (16 mg, 0.06 mmol), 테트라키스(트리페닐포스파인) 팔라듐(0) (17 mg, 0.015 mmol)을 추가하고, 상기 용액을 RT에서 교반하였다. 종료 후, 침전물을 여과하여 ACN으로 3회 세척하여 노란빛의 고체를 수득하였다. 비정제 고체 및 NaOH (30 mg, 0.76 mmol)를 2ml의 4:1 THF:H2O 용액에 용해하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 밤새 교반하였고, RP-HPLC로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 1M HCl(aq)로 중화하였고, 용매를 감압하에서 증발시켰다. 비정제 잔류물 및 수 밀리그램의 메틸렌 블루를 20ml의 DCM에 용해하였다. 상기 용액에 노란색 광을 조사하면서 산소를 불어넣었다. 상기 용액을 RP-HPLC로 모니터하였다. 종료 후에, 용매를 감압하에서 농축하였고, 산물을 RP-HPLC (10-75% ACN, 암모늄 카르보네이트 5 mM 완충액, 20 min) 로 정제하여 프로브 11을 백색 고체로 수득하였다(41 mg, 35% 수율).
반응식 24: 화합물 11a 및 프로브 11의 합성
화합물 12a . 디에틸 아조디카르복실레이트 (95 μl, 0.6 mmol) 를 0℃의 3ml의 THF 중의 화합물 4m (Redy-Keisar et al., 2014) (184 mg, 0.5 mmol), 화합물 6c (177 mg, 0.5 mmol) 및 트리페닐포스파인 (157 mg, 0.6 mmol)의 냉각된 혼합물에 추가하였다. 반응은 TLC(Hex:EtOAc 80:20)로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 EtOAc 로 희석하고 포화된 NH4Cl로 세척하였다. 상기 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔에서 컬럼 크로마토그래피 (Hex:EtOAc 80:20)로 정제하여 화합물 12a를 흐린 노란색의 고체로 수득하였다. (274 mg, 78% 수율).
프로브 12 . 화합물 12a (274 mg, 0.39 mmol) 및 수 밀리그램의 메틸렌 블루를 20ml의 DCM에 용해하였다. 상기 용액에 노란색 빛을 조사하면서 산소 방울을 불어 넣었다. 반응은 TLC (Hex:EtOAc 80:20)로 모니터하였다. 종료시, 반응 혼합물을 감압하에서 증발하여 농축하였다. 비정제 산물을 실리카 겔에서 컬럼 크로마토그래피(Hex:EtOAc 80:20)로 정제하여 프로브 12 를 수득하였다 (255 mg, 89% 수율).
반응식 25: 화합물 12a 및 프로브 12 합성
화학발광 현미경을 이용한 β- 갈락토시다제 활성 영상
화학발광 이미지는 EMCCD 카메라 (Hamamatsu C9100-13)가 장착된 Olympus LV200 도립 현미경으로 수득하였다. HEK293 LacZ 안정적 세포 (amsbio SC003) 및 HEK293-WT 세포 (대조군)을 35mm 유리 바닥 페트리 디쉬에서 37℃에서 24 시간동안 배양하였다. 세포 배양 배지를 5μM의 프로브 4를 포함하는 Molecular Probe® Live Cell Imaging Solution 배지로 교환하였다. 세포를 37℃에서 추가로 20분간 배양하였다. 그 후, 이미지를 40초의 노출시간을 두고 촬영하였다.
결과 및 논의
본 연구에서, 페놀레이트 공여체가 페놀 고리의 오르쏘 위치에서 π* 수용 기 예컨대 메틸-아크릴레이트 및 아크릴로니트릴, i.e., 전자 수용체 또는 전자-구인성 기, 및 선택적으로는 페놀 고리의 다른 오르쏘 위치에서 추가적으로 염소로 치환된, Schapp's 아다만틸리덴-디옥세테인 프로브 (반응식 1)에 기반한 화학발광 프로브를 고안하고 합성하였다. Karton-Lifshin et al. (2012) 에 기재된 것을 근거로, 이러한 공여체-수용체 쌍 디자인은 벤조에이트 종의 방출성 특징을 증가시키는 가능성이 있는 것으로 생각되어 졌다. 우리가 알고 있는 한, 디옥세테인 화학발광 프로브의 방향족 모이어티에대한 전자 수용체 치환제의 영향은 생리학적으로 관련성 있는 pH에서 종전에 연구된 적이 없다 (Hagiwara et al., 2013; Matsumoto et al., 1996; Matsumoto et al., 2001; Matsumoto et al., 2002; Matsumoto et al., 2005).
치환체의 영향을 평가하기 위해, 페놀의 오르쏘 및 파라 위치에서 수용체 치환체를 갖는 다수의 페놀-벤조에이트 유도체를 합성하고, 이들의 형광 방출을 PBS 7.4에서 측정하였다. 가장 유의한 효과는 수용체가 페놀의 오르쏘 위치에 편입되었을때 수득되었다. 전자-구인성 기를 광범위하게 스크리닝 한 후, 본 발명자는 염소, 메틸-아크릴레이트 및 아크릴로니트릴 치환체를 선택하여 촛점을 맞추기로 하였다. 생리적 조건에서 화학여기 기전을 가능하게 하기 위해서는, 염소 치환체를 페놀기의 오르쏘 위치에 도입하여야 한다는 것이 종전에 보고되었다. 이러한 전자-구인성 치환체는 보호기의 절단 후 방출된 페놀의 pKa를 감소시킴으로써 생리학적 pH에서 페놀레이트 종의 상대적 농도를 풍부하게 한다. 상기 메틸-아크릴레이트 및 아크릴로니트릴 치환체는 이들의 상응하는 페놀-벤조에이트의 형광 방출에서 가장 높은 증가를 유도하였다. 선별된 페놀-벤조에이트 유도체의 흡광도 및 형광 스펙트럼은 도 11에 기재되어 있고, 이들의 분자 구조 및 분광적 파라미터는 표 9에 요약되어 있다.
시중에서 구입할 수 있는 아다만틸리덴-디옥세테인 프로브의 화학여기에 의해 생산된 방출성 종은 궁극적으로 벤조에이트 4a 또는 5a의 여기 상태이다.이러한 벤조에이트는 생리적 조건에서 어떠한 측정가능한 형광도 제시하지 못한다. 그러나, 페놀 (벤조에이트 6a 및 8a)의 오르쏘 위치의 메틸-아크릴레이트 또는 아크릴로니트릴 치환체의 도입은 각각 550nm 및 525nm 에서 최대 방출 파장을 갖는 강한 형광성 페놀-벤조에이트 유도체(양자 수율; 각각 0.5% 및 7%)를 생산하였다. 다른 오르쏘 위치(벤조에이트 7a) 에서의 추가 치환체로서 염소의 삽입은 방출 파장에 변화 없이, 이의 모 벤조에이트 6a 와 비교하여 형광 방출 강도가 유의적으로 증가하였다 (약 10배). 형광 방출의 강화는 염소 치환체의 전저-구인성 효과로부터 초래된 생리적 조건에서 페놀레이트 종의 농도 증가에 기인한 것이다. 형광 방출에 있어서 유사한 증가효과(약 4-배)가 이의 모 벤조에이트 8a와 비교하여 벤조에이트 9a에 대하여 관찰되었다.
이러한 결과는 디옥세테인 화학발광 루미노포르에서 메틸-아크릴레이트 및 아크릴로니트릴 치환체의 도입 (염소와 함께, 또는 염소 없이)은 방출된 벤조에이트의 방출성 성질을 강화할 수 있음을 나타낸다. 이러한 치환체 효과는 생리적 조건에서 디옥세테인의 화학발광 양자 수율의 상당한 증가로 이어질 것이다.
표 9: PBS 7.4의 선별된 페놀-벤조에이트 유도체에 대하여 측정된 분광 형광 파라미터
이러한 가설을 테스트하기 위하여, 본 발명자는 마스킹 되지 않은 페놀 작용기를 갖는 다섯 종류의 상이한 아다만틸리덴-디옥세테인 루미노포르를 합성하였다 (표 10). 페놀에서 탈양자시, 루미노포르는 화학여기 분해를 거쳐 여기 상태에 있는 상이한 벤조에이트를 생산한다 (표 9에 개시). 다음으로, 본 발명자는 생리적 조건에서 상기 루미노포르의 화학발광 방출 스펙트럼 및 총 광 방출을 측정하였다. 디옥세테인-루미노포르의 분자 구조 및 이들의 화학발광 파라미터는 표 10에 요약되어 있다. 예측한대로, 디옥세테인-루미노포르의 화학발광 방출 스펙트럼은 이들의 상응하는 벤조에이트의 형광 방출 스펙트럼과 중첩된다 (도 11 참조).
표 10: 아다만틸리덴-디옥세테인 5b-9b의 화학발광 파라미터
상기 디옥세테인-루미노포르는 다양한 T 1/ 2 를 갖는 화학발광 지수 분해 동역학 프로파일을 나타냈다. 수용성 조건에서 이의 화학발광 양자 수율 (3.2×10-3 %) 이 알려진 디옥세테인 5b가 참조 화합물로 사용되었다 (Trofimov et al., 1996; Edwards et al., 1994). 상기 언급한 바와 같이, 물에서 디옥세테인 5b의 화학발광 방출은 극히 약했다; 그러나, 디옥세테인-루미노포르 6b, 7b, 8b 및 9b 는 PBS 7.4.에서 탈양자시 매우 강한 화학발광 방출을 나타냈다. 루미노포르 6b (메틸-아크릴레이트 치환체 있음) 는 방출 신호를 나타냈는데, 이는 화학발광 양자 수율이 2.3%인 디옥세테인 5b와 비교하여 이 보다 약 700-배 더 강한 것이다. 루미노포르 7b (메틸-아크릴레이트 및 부가의 염소 치환체가 있음)도 루미노포르 6b와 비교하여 더 빠른 동역학 프로파일을 가지며 유사한 신호 향상을 나타냈다 (T 1/2 이 7 min vs. 23 min). 루미노포르 9b (아크로니트릴 및 부가의 염소 치환체 있음)은 화학발광 방출에 있어 가장 높은 향상을 나타냈다: 화학발광 양자 수율 9.8%의 디옥세테인 5b와 비교하여 약 3000-배. 루미노포르에 염소 치환체가 존재할때 유사하게 빠른 동역학 프로파일이 관찰되었다 (T 1/ 2 가 디옥세테인 9b 는 10 min vs. 디옥세테인 8bsms 22 min).
턴-온 화학발광 프로브는 디옥세테인-루미노포르의 페놀 작용기를 효소 반응성 기질로 마스킹하여 간단하게 제조될 수 있다. 이러한 옵션을 평가하기 위해, 본 발명자는 디옥세테인-루미노포르 5b-9b를 사용하여 다성 종류의 상이한 아다만틸리덴-디옥세테인 프로브를 합성하였고, 여기에서 페놀은 β-갈락토시다제 에 의해 활성화되기에 적합한 촉발 기질로 마스킹되었다 (프로브 5-9, 반응식 21-22 참조). 효소 절단-부위의 입체 방해 (오르쏘-치환체의 결과)를 피하기 위해, 프로브 6-9의 페놀 산소 및 갈락토오즈 기질 사에에 짧은 자가-분해 (immolative)스페이서를 장착하였다 (Amir et al., 2003; Gnaim 및 Shabat, 2014; Sagi et al., 2008). 다음으로, 본 발명자는 β-갈락토시다제의 존재 및 부재에서 상기 프로브의 광 화학발광 방출을 시간의 함수로서 측정하였다. 상기 프로브의 화학발광 신호의 동역학 프로파일 및 그 들의 상대적 방출 강도는 도 12에 개시되어 있다.
상기 프로브는 β-갈락토시다제의 존재 하에서, 초기 신호가 최대까지 증가한 후 서서히 제로로 감소하는 전형적인 화학발광 동역학 프로파일을 나타냈다. 프로브 6-9는 β-갈락토시다제의 존재 중 수용성 조건에서 현저하게 강한 화학발광 신호를 나타냈고, 프로브 5는 매우 약한 방출 (도 12, 내부)을 나타냈다. 프로브 6 는 프로브 5와 비교하여 약 500-배 더 강한 신호를 방출신호를 나타냈다. 프로브 7 (염소 치환체를 가짐) 프로브 6과 비교하여 더 빠른 동역학 프로파일을 가지면 유사한 신호 향상을 나타냈다. 프로브 8과 비교하여 유사한 빠른 동역학 프로파일이 프로브 9에서도 관찰되었다. 프로브 9가 화학발광에서 가장 높은 향상을 나타냈다; 프로브 5와 비교하여 약 1800-배.
상기 신규한 디옥세테인-루미노포르를 이용하여 수득된 화학발광 방출의 놀라운 향상으로 인해 본 발명자들로 하여금 프로브 9의 신호 강도를 시중의 화학발광 분석의 신호 강도와 비교하도록 하였다. 시중에 구입할 수 있는 아다만틸리덴-디옥세테인 기재의 화학발광 프로브가 있다. 그러나, 이러한 프로브의 화학발광 방출은 수용성 조건에서 매우 약하기 때문에, 계면활성제-염료 어덕트 (향상제)가 분석의 신호를 증폭하기 위해 일반적으로 첨가된다. 상기 계면활성제는 방출된 광을 전달하여 부근의 형광 염료를 여기하는 화학발광 반응을 위한 소수성 환경을 제공함으로써 수-유도된 ??칭을 감소시킨다. 그 결과, 저-효율 발광 과정이 수용성 매질에서 현저하게 증폭된다 (Schaap et al., 1989). 시중에서 구입할 수 있는 Emerald-II™ 향상제 (10%) 를 β-갈락토시다제 (in PBS 7.4)의 존재 중에서 프로브 5 에 추가하고, 이의 화학발광 방출을 프로브 6의 것과 비교하였다. 수득된 결과는 도 13에 개시되어 있다. Emerald-II™ 향상제는 프로브 5의 화학발광 방출을 248-배 증폭한다 (도 13A). 놀랍게도, 프로브 9로 수득된 화학발광 방출 신호는 생리적 조건에서 Emerald-II™ 향상제 (10%)가 사용된 프로브 5의 것과 비교하여 8-배 더 강한 것으로 나타났다 (도 13B). 이러한 전례없는 결과는 프로브 9와 같은 단순한 저분자인 디옥세테인 화합물이, 이 성분 시스템 (프로브 5 및 Emerald-II™ 향상제)에 의해 생산된 신호보다 약 한자릿수나 더 큰 화학발광 신호를 생산할 수 있음을 나타낸다. 본원의 프로브가 수용성 조건에서 상대적으로 매우 방출성있는 벤조에이트 종을 생산하기 때문에, Emerald-II™ 향상제의 첨가는 단지 이들의 화학발광 방출에 단지 가벼운 영항만을 미쳤다.
본원의 화학발광 프로브의 활성화는 페놀 모이어티로부터 보호기를 제거하는 것에 기초를 둔다. 따라서, 상이한 페놀-보호기가 다양한 분석물/효소에 대한 촉발 기질로서 도입될 수 있다 (Redy-Keisar et al., 2014). 이러한 모듈성 특징을 증명하기 위해, 본원에서는 과산화수소 분석물(Karton-Lifshin et al., 2011) 및 글루타치온 (GSH) 및 효소 알칼라인 포스파타제 (Schaap et al., 1989) 의 검출을 위해 세 개의 추가의 프로브를 합성하였다. 프로브 10은 보론-에스테르를 과산화수소에 대한 기질로서 가지고 있다. 프로브 11은 알칼라인 포스파타제에 대한 기질로서 인산 기를 가지고 있으며, 프로브 12는 GSH에 대한 기질로서 디나이트로-벤젠-설포닐 기를 가지고 있다 (도 14). 상기 프로브를 페놀 산소의 오르쏘 위치의 메틸 아크릴레이트 치환체 또는 아크릴 산으로 제조하였다. 이온화 가능한 카르복실 기의 존재로 프로브 10 및 11의 수 용해도가 상당히 증가하여, 비교적 높은 농도에서 평가 시험을 수행할 수 있게 하였다. 1 mM (pH 10) 농도에서, 프로브 10 및 11 은 이들의 분석물/효소와 반응으로 밝은 초록색의 발광을 생산하였다. 상술한 바와 같이, 상기 프로브는 활성화시에, 분해되어 여기된 상태의 상응되는 벤조에이트를 방출한다. 상기 아클릴레이트 치환체는 효과적으로 상기 방출된 벤조에이트의 방출성 성질을 증가시켜 맨눈으로 뚜렸하게 볼 수 있는 강한 광 방출을 생산한다. 프로브 12는 적용 가능한 농도 범위가 1-10 μM인 비교적 적절한 수 용해도를 가진다.
프로브 10, 11 및 12의 이들의 상응하는 분석물/효소를 검출하는 민감도 및 선택성을 평가하기 위해, 본원에서는 상기 프로브의 검출 한계 (LOD)를 결정하였다. 상기 프로브는 생리적 조건에서 이들의 선택된 분석물에 대하여 매우 우수한 선택성을 나타냈다 (도 15). 프로브 10은 LOD 값 30nM로 과산화수소를 검출할 수 있었고, 프로브 11은 LOD 값 3.9 μU/ml로 알칼라인-포스파타제를 검출할 수 있었으며, 프로브 12는 LOD 값 1.7 μM로 GSH를 검출할 수 있었다.
화학발광은 동역학 프로파일을 통해 생성되기 때문에, 그 신호 강도는, 절대 수치로, 종종 형광과 비교하여 약하다. 따라서, 화학/바이오-발광 프로브를 단일 세포 해상도로 위치를 결정하고 정량하기 위해, 적절한 현미경 (Olympus의 LV200와 같은 현미경)이 필요하다. 본 발명자들은 본원 프로브의 β-갈락토시다제를 과발현하는 세포를 LV200 현미경으로 영상할 수 있는 능력을 평가하고자 하였다. 초기 세포 투과도에 대한 스크리닝 후에, 프로브 7을 영상 평가 사용에 선별하였다. HEK293 (LacZ로 전달이입됨) 및 HEK293-WT (대조군) 세포를 프로브 7과 배양한 후 LV200로 영상하였다 (도 16). 수득된 영상은 내인성으로 발현되는 β-갈락토시다제에 의한 프로브의 인비트로 활성화를 명백하게 뒷받침한다. 프로브 7는 이미 20초의 노출시간을 갖는 HEK293-LacZ 세포의 고 품질의 화학발광 이미지를 생산할 수 있었다 (도 16b). HEK293-WT 세포에서는 화학발광 신호가 전혀 관찰되지 않았다 (도 16d).
지난 30여년에 걸쳐, 다수의 Schaap's 디옥세테인 기재의 화학발광 프로브의 예가 문헌에 보고되었다 (Bronstein et al., 1989; Stevenson et al., 1999; Sabelle et al., 2002; Richard et al.,2007; Richard et al., 2009; Turan 및 Akkaya, 2014; Cao et al., 2015; Cao et al., 2016; Clough et al., 2016). 이러한 모든 프로브는 그들의 활성화시에 수용성 조건에서 약한 방출 종인, 오리지날 벤조에이트를 방출하도록 디자인되었다. 본 연구에서, 본 발명자들은 생물학적 환경에서 매우 방출성이 있을 화학발광 프로브를 개발하고자 Schaap's 디옥세테인을 재디자인하고자 하였다. 상술한 바와 같이, Schaap's 디옥세테인의 화학발광 효율성은 수득된 여기 상태 벤조에이트의 방출성 특징에 본질적으로 의존한다. 따라서 본 발명자들은 생리학적 조건에서 상이한 벤조에이트의 형광 방출을 조사하고자 하였다. 본 발명자들은 치환체가 물에서 벤조에이트의 형광방출을 증가할 수 있다면, 이는 유사하게 생리적 조건에서 상응되는 디옥세테인 프로브의 화학발광 방출을 강화할 수 있을 것으로 추정하였다. 페놀 산소의 오르쏘 위치의 아크릴레이트 및 아크릴로니트릴 치환체의 수득된 효과는 실로 놀라운 것이었다. 본 발명자들은 세 자릿수를 넘게 향상된, 수용성 조건에서의 사용에 적절한 오늘날 알려진 가장 강력한 화학발광 아다만틸리덴-디옥세테인 프로브를 수득할 수 있었다. 흥미롭게도, 페놀 산소의 파라 위치에의 아크릴레이트 치환체의 도입은 상응되는 벤조에이트의 형광 및 아다만틸리덴-디옥세테인의 화학발광에 단지 보통의 영향만을 초래한다.
시중의 화학발광 분석 신호 향상은 형광 염료 (계면활성제로 형태가 만들어진 미셀안에 국한됨)로의 에너지 전달에 의해, 간접적으로 달성된다. 고 독성을 초래하는 결과로 인해, 이러한 다-성분 프로브 시스템은 세포 영상에 명백하게 적절하지 않다 (Partearroyo et al., 1990). 본 연구에서 제시한 프로브는 직접적 방식의 화학발광 방출 및 합리적 수 용해성을 갖는 저 분자인 단일 성분으로 구성되어 있다. 이러한 특징은 본원의 프로브를 세포 영상 용도에 이상적인 것으로 만든다. 프로브 7은 내인성 β-갈락토시다제 활성에 기초한 훌륭한 화학발광 세포 이미지를 제공할 수 있다. 본 발명자가 아는 한, 이는 직접적 화학발광 방출 방식을 갖는 비-루시페린 저분자 기재의 프로브에 의해 수득된 첫번째 세포 이미지이다.
페놀 벤조에이트의 pKa 값은 본원 프로브의 화학발광 방출에 유의적 영향을 끼치는 다른 요소이다. 본 발명자는 생리학적 조건에서 화학여기 기전을 가능하게 하기 위해, 수득한 페놀 (촉발 기의 제거 후에)의 pKa는 약 8.5 또는 이보다 낮아야만 한다는 것을 관찰하였다. 페놀에 대한 낮은 pKa 값은 프로브가 엔도사이토시스를 통해 세포내오 투과될때 (엔도좀의 pH는 약 6.5 또는 이보다 낮은 것으로 알려져 있음), 인비트로 용도를 목적으로 한 프로브에 있어서 특히 중요할 수 있다. 프로브 7은 약 7.0의 pKa 값을 갖는 페놀로 구성되어 세포 영상 평가를 위해 선택되었다.
디옥세테인 프로브에 상이한 촉발 기질을 장착하기 위한 모듈성 옵션은 사용자로 하여금 본원의 분자를 목적하는 다양한 분석물 또는 효소용의 화학발광 프로브로 제조할 수 있도록 한다. 본 발명자들은 이러한 옵션을 β-갈락토시다제, 알칼라인-포스파타제, 과산화수소 및 범용적 씨올의 검출을 위한 4개의 새로운 화학발광 프로브를 합성하고 평가하여 증명하였다. 이러한 프로브의 수용성 조건에서 관찰된 높은 화학발광 효율은 본원의 프로브를 면역분석 분야에서 생화학적 테스트를 위한 이상적 기질로 만든다.
결론
요약하면, 본 발명자들은 생리적 조건에서 높은 효율의 수율을 갖는 화학발광 프로브를 수득하기 위한 세로운 분자 방법론을 개발하였다. 본 방법론은 Schapp's 아다만틸리덴-디옥세테인 프로브의 화학여기 경로 동안에 수득된 벤조에이트 종에 미치는 치환체의 형광 방출 효과를 기초로 한 것이다. 본원 프로브의 화학발광 효율에 미치는 놀라운 치환체 효과는 아크릴레이트 및 아크릴로니트릴 전자-구인성 기가 장착되었을 때 수득되었다. 가장 우수한 프로브의 화학발광 양자 수율은 표준 시중에서 구입할 수 있는 표준 아다만틸리덴-디옥세테인 프로브와 비교하여 세 자릿수 보다 더 컸다. 지금까지 바이오/화학-발광 세포 영상은 루시페린 관련 프로브에 국한되었다. 본원의 새로운 프로브 중 하나는 내인성 β-갈락토시다제 활성을 기초로 고 품질의 화학발광 세포 이미지를 제공할 수 있었다. 현재까지 이는 직접적 화학발광 방출 방식을 갖는 비-루시페린 저분자 화합물 기재 프로브로 달성된 첫번째로 증명된 세포-영상이다. 본 연구에 제시된 개념은 감지 및 영상 분야의 다양한 응용을 위해 새로운 효과적인 화학발광 프로브의 추가 개발로 이어질 수 있을 것이다.
참고문헌

Claims (51)

  1. 하기 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물:

    상기 식에서,
    R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬이고;
    R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 형성하고;
    R4 는 H, 또는 하기로부터 선택되는 케이징(caging) 기이고;

    여기서, Pep은 두 개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 모이어티이며, 이의 카복실 기를 통해 연결되고,
    L 은 결여되거나 또는 하기 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커이며, 여기서 상기 링커는 방향족 고리가 (C1-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되고, M 은 결여되거나 또는 -O- 또는 -NH-이고, 별표는 Y 기에 대한 부착점을 나타내며, 단 R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2가 아닌 경우 M 은 -O- 또는 -NH-이고, 단 R4 가 H인 경우 L 은 결여되고;

    Y 는 결여되거나 또는 -O-이고, 단, R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2가 아니며, L 이 결여되지 않은 경우, Y 는 -O-이고;
    R7 은 H이거나 또는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 또는 파라 위치에 각각 독립적으로 부착된, 할로겐, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 및 -SO2R10으로부터 선택되는 적어도 하나의 전자 수용기를 나타내고;
    R10 은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬이고;
    A 는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 또는 파라 위치에 부착된 화학식 -CH=CH-E의 π* 수용기이고, 여기서 E 는 -CN, -COOH, -COO(C1-C18)알킬, 4-피리디닐, 메틸피리디니움-4-일, 3,3-디메틸-3H-인돌일, 또는 1,3,3-트리메틸-3H-인돌-1-이움-2-일임.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (i) R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C4)알킬이거나;
    (ii) R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하거나;
    (iii) R7 은 H, 또는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 또는 파라 위치에 부착된, 할로겐 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기이거나;
    (iv) A 는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 위치에 부착된 -CH=CH-E이고, 여기서 E는 -CN, -COOH, -COO(C1-C8)알킬, 4-피리디닐, 메틸피리디니움-4-일, 3,3-디메틸-3H-인돌일, 또는 1,3,3-트리메틸-3H-인돌-1-이움-2-일인, 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하는, 화합물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    R7 은 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 위치에 부착된, 할로겐 또는 -CN인, 화합물.
  5. 제 2 항에 있어서,
    E 는 -CN, -COOH, 또는 -COO(C1-C4)알킬인, 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C4)알킬이고;
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하며;
    R7 은 H, 또는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 또는 파라 위치에 부착된, 할로겐 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기이고;
    A 는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 위치에 부착된 -CH=CH-E이고, 여기서 E 는 -CN, -COOH, -COO(C1-C8)알킬, 4-피리디닐, 메틸피리디니움-4-일, 3,3-디메틸-3H-인돌일, 또는 1,3,3-트리메틸-3H-인돌-1-이움-2-일인, 화합물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    R1 은 메틸이고; R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R7 은 H이거나 또는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 위치에 부착된, 할로겐 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기이고; E 는 -CN, -COOH, 또는 -COO(C1-C4)알킬인, 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, E 는 -COOCH3 또는 -COOC(CH3)3인, 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    (i) Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 H이거나;
    (ii) Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 포스포네이트이거나;
    (iii) Y 는 -O-이고; L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커이고, 여기서 M 은 -O- 또는 -NH-이고; R4 는 상기 케이징 기이거나;
    (iv) Y 는 결여되고; L 은 결여되고; R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 인, 화합물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    R1 은 메틸이고; R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R7 은 H, 또는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 위치에 부착된 Cl이고; A 는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 위치에 부착된 -CH=CH-E이고;
    (i) E 는 -COOC(CH3)3이고; Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 갈락토실이거나;
    (ii) E 는 -COOCH3 또는 -CN이고; Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 H이거나;
    (iii) E 는 -COOCH3 또는 -CN이고; Y 는 -O-이고; L 은 L1이고, 여기서 M 은 -O-이고; R4 는 갈락토실이거나;
    (iv) E 는 -COOCH3이고; Y 는 -O-이고; L 은 L1이고, 여기서 M 은 -NH-이고; R4 는 2,4-디니트로벤젠 설포네이트이거나;
    (v) E 는 -COOH이고; Y 은 결여되고; L 은 결여되고; R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐이거나;
    (vi) E 는 -COOH이고; Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 포스포네이트인, 화합물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    화합물 IVa-1, IVa-2, IVa-3, IVa-4, IVa-5, IVa-6, IVa-7, IVa-8, IVa-9, IVa-10, IVa-11, IVa-12, IVa-13, IVa-14, IVa-15, IVa-16, IVb-1, IVb-2, IVb-3, IVb-4, IVb-5, IVb-6, IVb-7, IVb-8, IVb-9, IVb-10, IVb-11, IVb-12, IVb-13, IVb-14, IVb-15, 및 IVb-16으로부터 선택되는, 화합물:


    .
  12. 제 10 항에 있어서,
    하기 화학식의 화합물이며, 여기서 R1 은 메틸이고; R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R7 은 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 위치에 부착된 Cl이고; A 는 -Y-L-R4 기에 대해 오르쏘 위치에 부착된 -CH=CH-E이고; E 는 -COOH이고; Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 H인, 화합물:
    .
  13. 하기 화학식 I의 화합물:

    상기 식에서,
    R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬이고;
    R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 형성하고;
    R5 및 R6 은 각각 독립적으로 H, (C1-C18)알킬, (C2-C18)알케닐, (C2-C18)알키닐, (C3-C7)시클로알킬, 또는 아릴로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R6 은 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
    R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 H, 또는 할로겐, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 및 -SO2R10 으로부터 선택되는 전자 수용기이고;
    R10 은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬이고;
    Q 는 벤조일, 벤질, 메톡시메틸 에테르, β-메톡시에톡시메틸 에테르, 메톡시트리틸 ((4-메톡시페닐) 디페닐메틸), 디메톡시트리틸 (비스-(4-메톡시페닐)페닐메틸), p-메톡시벤질 에테르, 메틸씨오메틸 에테르, 피발로일, 트리틸 (트리페닐메틸 라디칼), 2-니트로-4,5-디메톡시벤질, 실릴 에테르, -CH3, -CH2OCH3, -C(=O)C(CH3)3, 또는 -CH2-CH=CH2로부터 선택되는 보호기임.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 실릴 에테르는 트리메틸실릴, tert-부틸디메틸실릴, 트리-이소-프로필실릴옥시메틸, 트리이소프로필실릴, 및 tert-부틸디페닐실릴 에테르로부터 선택되는, 화합물.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    (i) R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C4)알킬이거나;
    (ii) R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하거나;
    (iii) R5 및 R6 은 각각 독립적으로 (C1-C8)알킬이고, 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하거나;
    (iv) R7, R8 및 R9 중 적어도 하나는 H이고, 나머지 R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 할로겐, -NO2, 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기인, 화합물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하는, 화합물.
  17. 제 15 항에 있어서,
    R5 및 R6 은 각각 아이소프로필이고, 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐을 형성하는, 화합물.
  18. 제 13 항에 있어서,
    R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C4)알킬이고;
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하고;
    R5 및 R6 은 각각 독립적으로 (C1-C8)알킬이고, 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
    R7, R8 및 R9 중 적어도 하나는 H이고, 나머지 R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 할로겐, -NO2, 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기인, 화합물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하거나; 또는 R5 및 R6 은 각각 아이소프로필이고, 그들이 부착되는 산소 원자와 함께, 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐을 형성하는, 화합물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    R1 은 메틸이고; R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R5 및 R6 는 각각 아이소프로필이고, 그들이 부착되는 산소 원자와 함께 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐을 형성하고; R7, R8 및 R9 는 H이고; Q 는 TBDMS인, 화합물.
  21. 하기 화학식 IIa 또는 IIb의 화합물:

    상기 식에서,
    R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬이고;
    R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 형성하고;
    R4 는 하기로부터 선택되는 보호기이고;

    여기서, Pep은 두 개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 모이어티이며, 이의 카복실 기를 통해 연결되고,
    L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커이며, 여기서 상기 링커는 방향족 고리가 (C1-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되고, M 은 결여되거나 또는 -O- 또는 -NH-이고, 별표는 Y 기에 대한 부착점을 나타내고, 단 R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2가 아닌 경우, M 은 -O- 또는 -NH-이고;

    Y 는 결여되거나 또는 -O-이고, 단 R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2가 아니고 L 이 결여되지 않는 경우, Y 는 -O-이고;
    R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 H; 또는 할로겐, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 및 -SO2R10 으로부터 선택되는 전자 수용기이고;
    R10 은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬이고;
    X 는 화학식 -X1-X2-의 링커이고, 여기서 X1 은 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, (C2-C18)알키닐렌, (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알케닐렌, (C6-C14)아릴렌-디일, (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일, 헤테로아릴렌디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-헤테로아릴렌디일로부터 선택되고, 상기 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, (C2-C18)알키닐렌, (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알케닐렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일은 할로겐, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고, 상기 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, 또는 (C2-C18)알키닐렌은 S, O 또는 N으로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자; 및/또는 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 각각 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 기에 의해 추가로 선택적으로 개재되고(interrupted); X2 는 결여되거나 또는 -C(O)-이고;
    R14 는 -O-(C1-C18)알킬, -N3, -C≡CH, N-숙시니미딜옥시, 3-설포-N-숙시니미딜옥시, 펜타플루오로페닐옥시, 4-니트로페닐옥시, N-이미다졸일, 및 N-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸옥시로부터 선택되는 반응기임.
  22. 제 21 항에 있어서,
    (i) R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C4)알킬이거나;
    (ii) R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하거나;
    (iii) R7, R8 및 R9 중 적어도 하나는 H이고, 나머지 R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 할로겐, -NO2 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기이거나;
    (iv) X1 은 할로겐, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는, (C1-C18)알킬렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 상기 (C1-C18)알킬렌은 S, O 또는 N으로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자; 및/또는 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기에 의해 추가로 선택적으로 개재되고; X2 는 -C(O)-이거나;
    (v) R14 는 N-숙시니미딜옥시, 또는 3-설포-N-숙시니미딜옥시인, 화합물.
  23. 제 22 항에 있어서,
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하는, 화합물.
  24. 제 22 항에 있어서,
    X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; X2 는 -C(O)-인, 화합물.
  25. 제 21 항에 있어서,
    R1 는 선형 또는 분지형의 (C1-C4)알킬이고;
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하고;
    R7, R8 및 R9 중 적어도 하나는 H이고, 나머지 R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 할로겐, -NO2 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기이고;
    X 는 화학식 -X1-X2-의 링커이며, 여기서 X1 은 할로겐, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는, (C1-C18)알킬렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 상기 (C1-C18)알킬렌은 S, O 또는 N으로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자; 및/또는 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기에 의해 추가로 선택적으로 개재되고; X2 는 -C(O)-이고;
    R14 는 N-숙시니미딜옥시, 또는 3-설포-N-숙시니미딜옥시인, 화합물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    R1 은 메틸이고; R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; X2 는 -C(O)- 인, 화합물.
  27. 제 21 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) Y 는 -O-이고, L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커이고, 여기서 M 은 -O- 또는 -NH-이고, R4 는 상기 보호기이거나;
    (iv) Y 는 결여되고, L 은 결여되고, R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2 인, 화합물.
  28. 제 27 항에 있어서,
    R1 은 메틸이고; R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; R7, R8 및 R9 는 H이고; Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 TBDMS이고; X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; X2 는 -C(O)-이고; R14 는 N-숙시니미딜옥시인, 화합물.
  29. 하기 화학식 IIIa 또는 IIIb의 컨쥬게이트:

    상기 식에서,
    R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C8)알킬이고;
    R2 및 R3 은 각각 독립적으로 분지형의 (C3-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 형성하고;
    R4 는 하기로부터 선택되는 케이징 기이고;

    여기서, Pep은 두 개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 모이어티이며, 이의 카복실 기를 통해 연결되고,
    L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커이며, 여기서 상기 링커는 방향족 고리가 (C1-C18)알킬 또는 (C3-C7)시클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되고, M 은 결여되거나 또는 -O- 또는 -NH-이고, 별표는 Y 기에 대한 부착점을 나타내고, 단 R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2가 아닌 경우, M 은 -O- 또는 -NH-이며;

    Y 는 결여되거나 또는 -O-이며, 단 R4 가 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2가 아니며, L 이 결여되지 않은 경우, Y 는 -O-이고;
    R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 H; 또는 할로겐, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 및 -SO2R10으로부터 선택되는 전자 수용기이고;
    R10 은 각각 독립적으로 H 또는 -(C1-C18)알킬이고;
    X 는 화학식 -X1-X2-의 링커이고, 여기서 X1 은 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, (C2-C18)알키닐렌, (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알케닐렌, (C6-C14)아릴렌-디일, (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일, 헤테로아릴렌디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-헤테로아릴렌디일로부터 선택되고, 상기 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, (C2-C18)알키닐렌, (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알케닐렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일은 할로겐, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고, 상기 (C1-C18)알킬렌, (C2-C18)알케닐렌, 또는 (C2-C18)알키닐렌은 S, O 또는 N로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자; 및/또는 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 추가로 선택적으로 개재되고; X2 는 결여되거나 또는 -C(O)-이고;
    Z 는 플루오레신-기반 화합물; 로다민-기반 화합물; 쿠마린-기반 화합물; Cy5, Cy5.5, Cy5.18, Cy7, Cy7.18, 또는 QCy로부터 선택되는 시아닌 염료; 또는 보론-디피로메텐으로부터 선택되는 플루오로포어의 모이어티임.
  30. 제 29 항에 있어서,
    (i) R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C4)알킬이거나;
    (ii) R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하거나;
    (iii) R7, R8 및 R9 중 적어도 하나는 H이고, 나머지 R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 할로겐, -NO2 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기이거나;
    (iv) X1 은 할로겐, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는, (C1-C18)알킬렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 상기 (C1-C18)알킬렌은 S, O 또는 N으로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자; 및/또는 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기에 의해 추가로 선택적으로 개재되고; X2 는 -C(O)-이거나;
    (v) Z 는 보론-디피로메텐(BODIPY) 기 Z1; 플루오레신-기반 기 Z2 및 Z5; Cy5 기 Z3 및 Z6; 및 QCy 유도체 기 Z4로부터 선택되는, 컨쥬게이트:
    .
  31. 제 30 항에 있어서,
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하는, 컨쥬게이트.
  32. 제 30 항에 있어서,
    X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; X2 는 -C(O)-인, 컨쥬게이트.
  33. 제 29 항에 있어서,
    R1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C4)알킬이고;
    R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 융합된, 스피로 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 형성하고;
    R7, R8 및 R9 중 적어도 하나는 H이고, 나머지 R7, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 할로겐, -NO2 또는 -CN으로부터 선택되는 전자 수용기이고;
    X 는 화학식 -X1-X2-의 링커이고, 여기서 X1 은 할로겐, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (C6-C10)아릴, (C1-C4)알킬렌-(C6-C10)아릴, 헤테로아릴, 또는 (C1-C4)알킬렌-헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는, (C1-C18)알킬렌, (C6-C14)아릴렌-디일, 또는 (C1-C18)알킬렌-(C6-C14)아릴렌-디일이고, 상기 (C1-C18)알킬렌은 S, O 또는 N로부터 선택되는 하나 이상의 동일 또는 상이한 헤테로원자; 및/또는 -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8알킬)-, -N(C6-C10아릴)-, (C6-C10)아릴렌-디일, 또는 헤테로아릴렌디일로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 추가로 선택적으로 개재되고; X2 는 -C(O)-인, 컨쥬게이트.
  34. 제 33 항에 있어서,
    R1 은 메틸이고; R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; X2 는 -C(O)-인, 컨쥬게이트.
  35. 제 29 항에 있어서,
    (i) Y 는 -O-이고, L 은 결여되거나 또는 화학식 L1, L2 또는 L3의 링커이고, 여기서 M 은 -O- 또는 -NH-이고, R4 는 상기 케이징 기이거나;
    (iv) Y 는 결여되고, L 은 결여되고, R4 는 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤아닐 또는 -B(OH)2인, 컨쥬게이트.
  36. 제 35 항에 있어서,
    R1 은 메틸이고; R2 및 R3 은 그들이 부착되는 탄소 원자와 함께 아다만틸을 형성하고; X1 은 -(CH2)-파라-페닐렌이고; X2 는 -C(O)-이고; Z 는 보론-디피로메텐(BODIPY) 기 Z1, 플루오레신-기반 기 Z2 및 Z5, Cy5 기 Z3 및 Z6, 및 QCy 유도체 기 Z4로부터 선택되고:
    ,
    (i) R7, R8 및 R9 는 H이고; Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 TBDMS이거나;
    (ii) R7 은 Cl이고; R8 및 R9 는 H이고; Y 는 -O-이고; L 은 결여되고; R4 는 갈락토실인, 컨쥬게이트.
  37. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 29 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트, 및 담체를 포함하는, 분석물의 존재를 검출하거나 영상화하는 데 사용하기 위한 조성물로서,
    상기 분석물에 노출 시 상기 화합물에 존재하는 케이징 기가 절단되어 불안정한 페놀레이트-디옥세테인 화합물이 생성되고, 이는 화학여기 과정을 거쳐 분해되어 광을 방출하고 그 기저 상태로 붕괴되는 여기된 중간체를 생산하거나, 또는
    상기 분석물에 노출시 상기 컨쥬게이트에 존재하는 케이징 기가 절단되어 페놀레이트-디옥세테인 화합물이 생성되고 화학적으로 시작된 전자 교환 발광(chemically initiated electron exchange luminescence; CIEEL) 기전이 개시되며, 이는 광을 방출하고 그 기저 상태로 붕괴되는 컨쥬게이트의 플루오로포어 모이어티 Z의 여기를 초래하는, 조성물.
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