KR102438301B1

KR102438301B1 - 결합 부위를 결정하기 위한 방법 및 키트

Info

Publication number: KR102438301B1
Application number: KR1020197030289A
Authority: KR
Inventors: 세르게이 필렛스카이; 엘레나 필렛스카; 프란세스코 칸파로타; 돈 존스
Original assignee: 유니버시티 오브 레스터
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2038-03-19
Also published as: AU2018244638A1; PL3602067T3; SG11201908785SA; CA3056191A1; DK3602067T3; KR20190128687A; NZ757464A; EP3602067A1; US11796545B2; US20200033356A1; WO2018178629A1; JP7095899B2; ES2910005T3; JP2020515835A; GB201704823D0; PT3602067T; AU2018244638B2; EP3602067B1

Abstract

본 발명은 단백질의 특성 및 분석을 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 방법은 단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위해 제공되고, 상기 방법은 단백질을 복수의 모노머와 접촉시키고, 상기 모노머를 중합시켜 단백질:폴리머 복합체를 생성하는 단계; 상기 복합체에서 상기 단백질을 분해하여 펩타이드:폴리머 복합체를 생성하는 단계; 상기 펩타이드:폴리머 복합체를 분리하는 단계; 및 상기 펩타이드를 서열화하는 단계를 포함하고, 상기 펩타이드는 결합 파트너에 대한 결합 부위에 해당한다.

Description

결합 부위를 결정하기 위한 방법 및 키트

본 발명은 단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하는 분야에 관한 것이다. 본 발명은 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 방법, 및 그러한 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

단백질학은 세포 및 조직에 의해 발현되는 단백질의 구조 및 기능에 대한 연구이고, 단백질이 작은 의약 분자 및 치료용 항체에 대한 주요 표적이기 때문에, 실질적으로 중요하다[1]. 항체에 대한 단백질의 결합 부위의 식별은 신규 진단의 개발에 도움이 될 수 있다[2]. FDA 및 EMEA 가이드라인은 의약 및 규제 파일링에 대한 그 타겟 사이에 상호작용 부위의 분자 분석을 요구한다[3]. 또한, 결합 부위의 이해는 특허로 상업적인 생성물을 보호하는데 유용하다. 불행하게도, 분자 정보에서 단백질 구조를 정의하고 결합 부위를 식별하는 것은 특히 어려운 과제를 구성한다.

항체, B 세포 또는 T 세포에 특이적으로 결합하는 단백질 부분을 에피토프라고 한다. 항체 및 에피토프의 아미노산 서열 사이에 비-공유 상호작용에 의해, 항체는 에피토프와 상호작용하고, 대응하는 항체에 대한 에피토프를 식별하는 과정을 에피토프 맵핑이라고 한다. 단백질-항체 복합체의 구조를 해결하기 위한 에피토프 맵핑은 X-선 결정학 및 NMR 분석에 의해 달성될 수 있다[4, 5, US2004185506(HEAVNER GEORGE A)]. 그러나, 결정학이 구조가 알려져야 하는 많은 양의 항체가 필요한 반면, NMR 분석은 항원의 구조의 지식을 요구하기 때문에, 이러한 기술들은 매우 힘들고 비용이 많이 든다. 또한, 많은 단백질-단백질 복합체는 NMR 및 X-선 분석에 부적합한 것으로 입증되고, 단백질-항체 및 펩티드-항체 결정을 만드는 것은 종종 어렵다[2, 6].

대안적으로, 에피토프 맵핑은 조합 접근에 의해 수행될 수 있고, 이는 각각 펩타이드 서열에 결합된 표지된 항체를 가진 펩타이드 어레이를 사용하여 달성될 수 있다. 단백질 가수 분해물로부터 미지의 (표적) 에피토프의 존재 하에, 항체는 변위되고, 어레이의 후방 분석은 항체가 변위되었는지 식별을 허용할 것인바, 펩타이드 서열이 결정될 수 있다(WO 2001088538, DUMAS DAVID P). 다른 조합 접근은 단백질의 예상되는 모든 결합 영역을 포함하도록 설계된 대규모 펩타이드 세트를 스크리닝하고 면역 반응을 유발하는 펩타이드를 발견하는 것을 포함한다(US2009226471, BENAROYA RES INST AT VIRGINIA). 유사한 접근은 표적 단백질에 결합할 수 있는 고정화 항체를 사용한다. 그 다음, 용액 내 펩타이드의 라이브러리를 고정화 항체에 첨가하고, 고정화 항체에 결합하는 펩타이드가 확인되면, 서열은 전체 표적 단백질의 것과 계산적으로 정렬된다(WO 2004092741, UNIV MONTANA STATE). 일반적으로 사용되는 다른 실험 방법에는 질량 분석과 결합된 단백질-항체 복합체의 파지 디스플레이 및 단백질분해를 포함한다[2, 7]. 잠재적인 에피토프 맵핑을 위한 모든 기존 실험적인 접근의 문제점은 그들이 입수하기 어렵거나, 그 품질 및 성능이 맵핑에 충분하지 않은 항체를 요구한다는 점이다.

항체-항원 사이에 상호작용을 예측하여 잠재적인 에피토프의 결정을 가능하게 하는 다른 방법은 US2014100834 (MACROMOLTEK)에 기술 된 것과 같은 분자 모델링 및 컴퓨터 시뮬레이션에 기초한다. 단일-구조-기반 예측 도구[11]와 함께, 그들의 유전자 프로파일을 기반으로 항원을 스크리닝하는 소프트웨어[8] 및 B-세포 에피토프 데이터베이스를 기반으로 단백질-단백질 도킹 방법[9, 10]을 포함하는, 에피토프 스크리닝을 위한 다양한 종류의 실리코 제품이 최근에 등장하였다[2]. 추가적인 접근은 전체 항원을 스캔하고 가장 가능성 있는 에피토프 영역을 예측할 수 있는 웹-기반 도구를 포함한다[12].

그러나, 이러한 방법이 항상 정확한 것은 아니고 단백질 구조에 대한 자세한 정보를 요구한다. 대안으로, 분자 임프린팅 방법은 펩타이드의 작은 라이브러리가 단백질 (크레아틴키나제)의 형태적 에피토프인지를 평가하는데 사용되었고, 그 방법은 여전히 단백질에 대한 정보 및 후보 에피토프 서열의 사전 지식을 요구한다[13].

따라서, 단백질 표적 상에 그 항체 또는 항원 결합 단편과 같은, 결합 파트너에 대한 결합 부위 또는 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수 있는 향상된 방법 및 물질을 제공할 필요가 있다.

1. Imai, K., Takaoka, A. 2006 Nature Reviews Cancer, 6 (9), 714. 2. Ahmad, T.A., Eweida, A.E., Sheweita, S.A. 2016 Trials in Vaccinology, 5, 71. 3. Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use, U.S. Food and Drug Administration, Docket No. 94D-0259. 4. Gershoni, J.M., Roitburd-Berman, A., Siman-Tov, D.D., Freund, N.T., Weiss, Y. 2007, BioDrugs, 21 (3), 145. 5. Abbott, W.M., Damschroder, M.M., Lowe, D.C. 2014, Immunology, 142 (4), 526. 6. Conte, L.L., Chothia, C., Janin, J. 1999, Journal of Molecular Biology, 285 (5), 2177 7. Suckau, D., Kφhl, J., Karwath, G., Schneider, K., Casaretto, M., Bitter-Suermann, D., Przybylski, M. 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87 (24), 9848. 8. Ansari, H.R., Raghava, G.P.S. 2013, Methods in Molecular Biology, 993,129 9. Mandell, J.G., Roberts, V.A., Pique, M.E., Kotlovyi, V., Mitchell, J.C., Nelson, E., Tsigelny, I., Ten Eyck, L.F. 2001, Protein Engineering, 14 (2), 105. 10. Schneidman, E., Still, S., Berry II, M.J., Bialek, W. 2003, Physical Review Letters, 91 (23), 2387011. 11. Kulkarni-Kale, U., Bhosle, S., Kolaskar, A.S. 2005, Nucleic Acids Research, 33 (SUPPL. 2). 12. Rubinstein, N.D., Mayrose, I., Martz, E., Pupko, T. 2009, BMC Bioinformatics, 10, art. no. 1471, p. 287 13. Tai, D. F.; Ho, Y.F.; Wu, C. H.; Lin, T. C.; Lu, K. H.; Lin, K. S. Analyst, 2011, 136, 11, 2230. 14. Piletsky, S.A., Piletska, E.V., Chen, B., Karim, K., Weston, D., Barrett, G., Lowe, P., Turner, A.P.F. 2000, Analytical Chemistry, 72 (18), 4381. 15. Kennedy, J.H., Kricka, L.J., Wilding, P. 1976, Clinica Chimica Acta, 70 (1), 1. 16. Yang, J., Yan, R., Roy, A., Xu, D., Poisson, J., Zhang, Y. 2014, Nature Methods, 12 (1), 7. 17. Vita, R., Overton, J.A., Greenbaum, J.A., Ponomarenko, J., Clark, J.D., Cantrell, J.R., Wheeler, D.K., Gabbard, J.L., Hix, D., Sette, A., Peters, B. 2015, Nucleic Acids Research, 43 (D1), D405. 18. Hashimoto M., Rockenstein E., Crews L., Masliah E. (2003). Role of protein aggregation in mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Neuromolecular Med., 4, 21-36. 19. Talesa, V. N. Mechanisms of Ageing and Development 2001, 122, 1961-1969. 20. Perry, E. K.; Tomlinson, B. E.; Blessed, G.; Bergmann, K.; Gibson, P. H.; Perry, R. H. British Medical Journal, 1978, 2, 1457-1459. 21. Canfarotta F., Poma A., Guerreiro A., Piletsky A. (2016). Solid-phase synthesis of molecularly imprinted nanoparticles (MIP NPs) for diagnostic applications. Nature Protocols, 11, 443-455.

본 발명은 단백질의 특성 및 분석을 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다.

따라서, 본 발명의 제 1 측면에서,

- 단백질을 복수의 모노머와 접촉시키고, 상기 모노머를 중합시켜 단백질:폴리머 복합체를 생성하는 단계;

- 상기 복합체에서 상기 단백질을 분해하여 펩타이드:폴리머 복합체를 생성하는 단계; 및

- 상기 펩타이드:폴리머 복합체를 분리하는 단계; 및 선택적으로, 상기 펩타이드를 서열화하는 단계를 포함하고, 상기 펩타이드는 결합 파트너에 대한 결합 부위에 해당하는, 단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 방법이 제공된다.

유리하게, 제1 측면의 방법은 결합 부위 후보인 펩타이드 서열의 실험적 식별을 위한 단백질 구조 또는 항체의 이용 가능성에 대한 정보를 요구하지 않는다. 특성 및 분석은 단백질 표면 상에 노출된 아미노산 서열과 관련된 정보를 획득하기 위한 것일 수 있다. 유도된 정보는 단백질 상에 결합 부위의 식별에 유용하고, 이는 항체, 압타머, 아피머, 작은 의약 분자, MIP 또는 다른 천연 또는 합성 수용체와 같은, 결합 파트너의 결합에 적합할 수 있다. 이들 서열에 대한 정보는 분자 임프린팅 및 서열화 기술을 사용하여 획득될 수 있다. 이들 아미노산 서열에 대한 지식은 연구, 진단 또는 치료 용도를 위해, 고친화성 항체 또는 다른 천연 또는 합성 수용체와 같은, 결합 파트너를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

표적 단백질로서 언급될 수 있는, 본 발명의 방법이 수행되는 단백질은 아미노산 모노머의 사슬 또는 펩타이드를 포함하는 성분을 포함하는 임의의 분자 또는 조성물일 수 있다. 상기 단백질은 단일 또는 다중-도메인 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 핵산(DNA 및/또는 RNA), 보조인자, 보결분자단, 보조-기질, 무기 이온, 비타민 또는 당과 같은, 다른 성분과의 복합체에 있을 수 있다. 상기 단백질은 자연적으로 발생하는 표준 아미노산, 자연적으로 발생하는 비-표준 아미노산, 또는 비-자연적으로 발생하는 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 번역 후 변형 또는 합성 변형을 포함하는, 변형을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 자연적으로 발생하는 단백질이거나, 자연에서 발견되지 않은 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 세포 표면 상에 노출된 단백질, 세포외 단백질, 세포내 단백질, 항체, 비-면역글로불린 단백질, 당단백질, 인산화 단백질, 핵단백질, 리포단백질, 글루코사 미노글라이칸, 점막단백질, 합성 단백질, 또는 단백질-DNA 및 단백질-당류 복합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 단백질은 병리학 상태 또는 질병 상태의 바이오마커일 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 단백질은 혼합물로 또는 별도로 사용될 수 있다. 다른 구현예는 2개 이상 단백질의 어레이를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 효소 억제제, 의약 분자 또는 다른 단백질과의 복합체이다.

바람직한 구현예에서, 상기 단백질은 상기 단백질 표면 상에 노출된 하나 이상의 서열 및 노출되지 않은 버리드(buried) 서열을 포함하는 접힌 단백질이다.

일부 구현예에서, 상기 단백질은 다당류, 실리카, 유기 또는 무기 폴리머, 금속, 또는 그 조합을 포함하는 표면과 같은, 고체 표면 상에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 상기 고체 표면은 비드, 자성 비드, 어레이, 도파관의 표면, 섬유, 멤브레인, 모세관 또는 의도된 응용에 적합한 임의의 다른 표면의 형태일 수 있다. 상기 고정화는 예를 들어, 본원에 개시된 단백질:폴리머 복합체의 분리인, 차후 분리 단계를 보조하기 위한 것일 수 있다.

결정되기 위한 상기 결합 부위는 표적 단백질의 표면 상에 노출된 아미노산 서열에 해당 할 수 있다. 상기 결합 부위는 항체, 압타머, 아피머, 작은 의약 분자, MIP, 천연 수용체, 합성 수용체, 또는 그 임의의 조합에 의해 결합될 수 있는 표적 단백질의 영역에 해당할 수 있다. 상기 결합 부위는 예를 들어, 항체(즉, 결합 파트너)가 결합할 수 있는 에피토프, 또는 B 세포와 상호작용하는 에피토프인, 에피토프일 수 있고, 이러한 경우에, 상기 방법은 에피토프 맵핑의 방법으로 서술될 수 있다. 상기 결합 부위는 본 발명의 방법에 의해 식별되기 위한 결합 부위를 위해, 결합 부위 및/또는 단백질의 사전 지식이 요구되지 않다는 점에서, 신규 결합 부위일 수 있다.

결합 파트너는 표적 단백질에 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 조성물일 수 있다. 잠재적인 결합 파트너는 항체, 압타머, 아피머, 작은 의약 분자, MIP, 천연 수용체, 합성 수용체, 또는 그 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 상기 표적 단백질을 복수의 모노머와 접촉시키는 단계를 포함한다. 복수의 모노머는 하나의 타입의 모노머, 또는 상이한 타입의 모노머의 혼합물일 수 있다. 상기 모노머의 중합은 분자 임프린티드 폴리머(MIP)의 생성을 초래할 수 있다. 복수의 모노머 또는 모노머 혼합물은 분자 임프린티드 폴리머의 형성에 적합한 임의의 형태 또는 조성물을 취할 수 있다. 상기 접촉은 임의의 방식일 수 있거나, 분자 임프린티드 폴리머의 형성에 적합한, 임의의 조건 하일 수 있다. 상기 복수의 모노머는 비닐 모노머, 알릴 모노머, 아세틸렌, 아크릴레이트, 메타크릴 레이트, 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 클로로아크릴레이트, 이타코네이트, 트리 플루오로메틸아크릴레이트, 아미노산의 유도체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 또는 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 모노머를 포함할 수 있다. 상기 표적 단백질은 상기 복수의 모노머와 접촉될 때, 용액 내에 있거나 고체 표면 상에 고정화될 수 있다. 상기 표적 단백질의 고정화를 위한 고체 표면은 본원에 개시된 바와 같은, 임의의 조성 또는 형태일 수 있다.

상기 복수의 모노머는 가교-결합 모노머를 선택적으로 포함할 수 있다. 가교-결합 모노머는 결과적인 폴리머의 구조를 안정화시키기 위해 선택적으로 사용되는바, 상기 단백질 표적의 것에 결합된 상태로 남는다. 폴리머의 합성에 적합한 가교제의 전형적인 예시는 에틸렌 글라이콜 메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 메틸렌 비스아크릴아마이드, 에틸렌 비스아크릴아마이드 및 N,N'-비스아크릴로일피페라진을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가교-결합제의 기능은 이중 결합을 함유하는 입자 또는 전구체 폴리머, 또는 기능성 모노머에 결합될 수 있는 부착된 다중 기능성을 가진 입자 또는 폴리머에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 특정 시스템에 적합한 모노머 및 가교제를 선택할 수 있었다.

현재 개시된 방법과 함께 사용하기에 적합한, 가능한 모노머의 농도 및 모노머의 조합의 광범위한 범위가 있다. 잠재적인 범위 및 하위 범위가 본원에 개시되어 있지만, 당업자는 이들 범위가 단지 가이드일 뿐이고, 현재 청구된 방법과 함께 사용하기에 적합한 임의의 복수의 모노머가 적합하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 복수의 모노머 또는 모노머 혼합물은 분자 임프린티드 폴리머의 형성에 적합한 임이의 형태 또는 조성물을 취할 수 있다.

상기 모노머는 중합 혼합물 내 약 0.01 내지 80 중량%, 선택적으로 약 0.1 내지 80 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

상기 모노머 혼합물은 수용액 또는 적절한 유기 용매 내에서 제조될 수 있다. 상기 용액 또는 용매는 선택적으로 개시제, 또는 선택적으로 완충 염을 포함할 수 있다.

상기 모노머의 각각 타입의 농도는 반응 혼합물에서 의도된 최종 농도에 따라 달라질 수 있다. N-이소프로필아크릴아마이드(NIPAM), 메틸렌 비스아크릴아마이드(MBAA), tert-부틸아크릴아마이드, 아크릴산, 또는 3-아미노 프로필 메타크릴레이트에 대해 서술된 다음 농도는 예를 들어, 상기 표적 단백질을 포함하는 혼합물의 0.7 ml를 가진 모노머성 혼합물의 10 ml의 조합에 의한 반응 혼합물을 형성하기 위해 사용되고; 이러한 예시는 순전히 예시적인 것이고 최종 반응 부피에서 허용가능한 농도를 나타내기 위한 것이다.

상기 복수의 모노머는 NIPAM을 포함할 수 있다. 상기 NIPAM은 0.001 mg/ml 내지 100 mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 10 mg/ml, 0.05 mg/ml 내지 5 mg/ml, 또는 0.1 mg/ml 내지 1 mg/ml로 존재할 수 있다.

상기 복수의 모노머는 메틸렌비스아크릴아마이드(MBAA)를 포함할 수 있다. 상기 MBAA는 0.0001 mg/ml 내지 10 mg/ml, 0.001 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.005 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml로 존재할 수 있다.

상기 복수의 모노머는 tert-부틸아크릴아마이드를 포함할 수 있다. 상기 tert-부틸아크릴아마이드는 0.001 mg/ml 내지 100 mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 10 mg/ml, 0.05 mg/ml 내지 5 mg/ml, 또는 0.1 mg/ml 내지 1 mg/ml로 존재할 수 있다.

상기 복수의 모노머는 아크릴 또는 메타크릴산을 포함할 수 있다. 상기 아크릴 또는 메타크릴산은 0.001 mg/ml 내지 100 mg/ml로 존재할 수 있다.

상기 복수의 모노머는 3-아미노프로필 메타크릴레이트를 포함할 수 있다. 상기 3-아미노프로필 메타크릴레이트는 0.0001 mg/ml 내지 10 mg/ml, 0.001 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.005 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml로 존재할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 복수의 모노머는 인산 완충 식염수(PBS), 암모늄 포르메이트, 또는 아세테이트를 포함하는 용액에 있다. 이러한 혼합물은 질소로 선택적으로 퍼지될 수 있다. 질소 퍼지는 1 분 내지 10 시간, 2 분 내지 1 시간, 또는 약 5 분 내지 20 분일 수 있다.

특히 구현예에서, 상기 복수의 모노머는 NIPAM, 메틸렌 비스아크릴아마이드(MBAA), tert-부틸아크릴아마이드, 아크릴산, 3-아미노프로필 메타크릴레이트, 및 PBS를 포함하는 탈산소화 모노머성 혼합물에 포함된다.

다수의 가능한 혼합물 및 모노머의 조합이 가능하고, 본 발명은 상기에 제한되지 않는다. 분자 임프린티드 폴리머를 형성하는데 적합한, 모노머의 임의의 혼합물, 및 농도의 임의의 조합은 본 발명에 사용되기에 적합할 것이다.

일부 구현예에서, 상기 모노머 혼합물은 상기 폴리머 내로 혼입되는 자성 나노입자를 바람직하게 함유한다. 일부 구현예에서, 표적 단백질의 존재 하에 폴리머는 지정된 고체 표면 상에 그래프팅함으로써 형성된다[14]. 그래프팅은 임의의 고체 표면, 예를 들어, 다당류, 실리카, 유기 또는 무기 폴리머, 금속, 또는 그 조합을 포함하는 표면에 부착을 포함할 수 있다. 상기 고체 표면은 임의의 형태, 예를 들어, 비드, 자성 비드, 어레이, 도파관의 표면, 섬유, 멤브레인. 또는 모세관으로부터 선택될 수 있는 고체 표면의 형태일 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 표적 단백질은 상기 표적 단백질에 대한 친화성을 가지는 사전-형성된 폴리머와 바람직하게 접촉하게 된다. 이러한 경우에, 추가 중합이 요구되지 않는다. 상기 사전-형성된 폴리머는 상이한 단백질, 리간드를 위해 또는 단백질-단백질 또는 단백질-리간드 복합체의 부분을 위해 형성된 MIP일 수 있다. 상기 리간드는 작은 의약 분자, 펩타이드, 당류, 단백질, 또는 당업계에 공지된 다른 표적일 수 있다.

상기 모노머는 중합되어 상기 표적 단백질과 함께 단백질:폴리머 복합체를 생성한다. 상기 모노머의 중합은 화학적으로, 열적으로 또는 광학적으로 개시될 수 있다. 상기 열적 개시는 열의 적용일 수 있다. 상기 광학적 개시는 광-개시일 수 있다. 상기 광학적 개시는 UV 또는 가시광선의 사용일 수 있다. 상기 폴리머는 자유 라디칼 중합 리빙 중합, 이온 중합, 또는 중축합에 의해 합성될 수 있다. 중합의 몇몇 상이한 형태는 벌크 중합, 현탁 및 에멀젼에서의 중합, 침전 중합, 리빙 중합, 그래프팅 또는 당 업자에게 공지된 임의의 다른 형태를 포함하는 본 발명과 함께 사용하기에 적합하다. 상기 합성된 폴리머의 물리적 형태는 고체 미립자, 층 또는 코팅, 분말 또는 모놀리스, 미세- 또는 나노 입자일 수 있다.

상기 모노머 혼합물의 최적 조성물 및 중합 반응의 조건은 단백질 표적의 고유 구조를 보존하는 것이다. 리빙 중합의 일부 예시는 이니퍼터 중합, 나이트록사이드-매개 중합, 원자-이동 라디칼 중합 및 가역성 부가-단편화 사슬-이동 중합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전통적인 라디칼 중합과 대조적으로 리빙 중합의 이점은 전자가 단백질과 상호작용하기 위한 넓은 접촉 면적을 갖는 낮은 속도로 생성하는 나노입자를 계속한다는 점이다.

상기 중합 반응을 종결시키고 폴리머 나노- 및 미세입자의 형성을 유도하기 위한 현재 개시된 방법과 함께 사용하기에 적합한 반응 조건은 (i) 개시제 및 모노머 사이의 화학량론적 비를 사용하는 것; (ⅱ) 반응을 냉각시키거나, UV 또는 다른 조사를 중지하는 것; (ⅲ) 예컨대, 여과 또는 크로마토그래피에 의해 상기 성장하는 폴리머 사슬과의 접촉으로부터 모노머를 제거하는 것; (iv) 상기 반응에 억제제를 첨가하는 것; (v) 희석 용액에서 중합을 수행하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

종래 자유-라디칼 생성 중합 개시제는 중합을 개시하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 개시제의 예시는 OO-t-아밀-O-(2에틸헥실)모노퍼옥시카보네이트, 디 프로필퍼옥시디카보네이트, 및 벤조일퍼옥사이드와 같은 퍼옥사이드 뿐만 아니라 아조비스이소부티로나이트릴, 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)디하이드로 클로라이드, 2,2'-아조비스(이소부티르아마이드)디하이드레이트 및 1,1'-아조비스 (사이클로헥산 카보나이트릴)과 같은 아조 화합물을 포함한다. 개시제의 예시는 디티오카바밀기를 갖는 광-이니퍼터, 또는 아조 화합물을 포함한다. 적합한 개시제의 다른 예시는 N,N,N',N",N"- 펜타메틸디에틸렌트리아민과 복합체화된 Cu(I)Br을 가진 2-브로모프로피오나이트릴, Cu(I)Cl/PMDETA를 가진 폴리스티렌 브로모 마크로 개시제; CuCl/비피리딘을 가진 에틸 2-브로모이소부티레이트; 1,4-비스(2,6-디 이소프로필페닐)아세나파텐디이민니켈(II) 디브로마이드; 테트라에틸티우람 디설파이드와 조합된 2,2-디메톡시-2-페닐아세페논; 테트라페닐 비포스핀; 디-tert-부틸 퍼옥사이드와 같은 3 차 퍼옥사이드; SmMe(C5Me5)2(THF); TiCl4와 접합된 스티렌계 에폭사이드; 메틸스티렌 테트라머 디소듐; MoOCl4-n-BuSn-EtOH; HCl/ZnCl2; 메틸 p-톨루엔설포네이트; 2,10,15,20-테트라페닐포르피나토 알루미늄 메틸; 3-메틸-1,1-디페닐펜틸리튬; THF 내 부틸리튬; 몰리브덴 알킬리딘 화합물; 이작용성 오가노란타나이드(Ⅲ); Mo(CH-t-Bu)(NAr)(OCMe3)2 및 Mo(CHCPhMe2)(NAr) (OCMe(CF3)2)2; HI/I2; 메틸알루미녹산 또는 페닐 보레이트 중 하나와 조합 된 Zr, Ti 및 Hf 복합체; Pd, Ni, Fe 또는 Co의 디이미드 복합체; 균질한 Ta, Ti, Mo, W 카르벤 복합체; 메탈로센형 또는 비-메탈로센형 복합체로 구성된 희토류 금속 복합체; 양이온성 모노사이클로펜타디에닐 지르코늄 아세타미디네이트 복합체; 구리 매개된 리빙 중합을 위한 개시제로서 1개 또는 2개 하이드록실기를 가진 에스테르화 플루오르화 텔로머; Yb[C(SiMe3)3]2를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 개시제는 상기 모노머의 약 0.01 내지 20 중량%, 바람직하게 0.05 내지 15 중량%, 또는 보다 바람직하게 0.1 내지 10 중량 %의 양으로 중합 혼합물에 존재할 수 있다. 상기 개시제는 상기 모노머의 약 0.2 내지 5 중량%의 양으로 중합 혼합물에 바람직하게 존재한다.

특히 구현예에서, 상기 개시 용액을 사용하여 상기 복수의 모노머의 중합을 개시할 수 있다. 이러한 용액은 TEMED 및/또는 과황산 암모늄(APS)을 포함할 수 있다. TEMED는 0.001㎍/mL 내지 1 mg/mL의 개시 용액에서 농도일 수 있다. APS는 0.1 ㎍/μL 내지 1000 ㎍/μL의 개시 용액에서 농도일 수 있다.

상기 개시 용액은 PBS 또는 다른 완충 염을 포함할 수 있다. 상기 버퍼의 역할은 중합 동안 단백질 표적의 의도된 형태를 유지 또는 제어하는 것이다.

상기 폴리머 생성물은 적어도 100 Da, 500 Da, 또는 1000 Da의 질량을 가진 입자를 포함할 수 있다. 상기 폴리머 생성물은 적어도 10 kDa, 50 kDa 또는 100 kDa의 질량을 가진 입자를 포함할 수 있다.

상기 폴리머 생성물은 크기가 10nm 내지 100μm, 1μm 내지 100μm, 5μm 내지 50μm, 10μm 내지 30μm, 또는 15μm 내지 25μm 인 입자를 포함할 수 있다. 상기 폴리머 생성물의 바람직한 형태는 가용성 또는 콜로이드 형태로 존재할 수 있는 크기가 500Da-20μm인 입자이다.

일부 구현예에서, 상기 폴리머 생성물은 자성 코어를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 합성된 폴리머는 선형 또는 가교-결합이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리머는 상기 표적 단백질에 공유적으로 연결된다.

일 구현예에서, 상기 방법은 상기 펩타이드:폴리머 복합체를 생성하기 위한 상기 단백질:폴리머 복합체에서 단백질의 분해 전에, 상기 단백질:폴리머 복합체를 분리하는 단계를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.

이러한 분리 단계는 반응 혼합물 내에 상기 단백질:폴리머 복합체의 순도 또는 농도의 증가를 수반할 수 있다. 대안적으로, 상기 분리 단계는 오염물로부터 상기 단백질:폴리머 복합체의 분리를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분리 단계는 세척 단계 또는 세척 단계들을 포함할 수 있다. 상기 분리 단계는 미반응 모노머 및/또는 유리 단백질로부터 상기 단백질:폴리머 복합체의 분리를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 분리 단계는 수행되지 않거나, 상기 분리 단계는 미반응 모노머 및/또는 유리 단백질로부터 상기 단백질:폴리머 복합체의 분리를 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 상기 합성된 폴리머와 단백질의 복합체는 미반응 모노머 및 초미세여과, 초원심분리, 전기영동, 초음파처리, 크로마토그래피 분리, 세척, 요소 첨가, 구아니딘, 자기력의 사용, 또는 그 임의의 조합에 의한 임의의 이전 반응의 다른 성분 또는 생성물로부터 분리된다. 결합되지 않은 모노머로부터 상기 폴리머-단백질 복합체의 분리를 용이하게 하기 위해, 상기 단백질 또는 폴리머는 고체 지지체(마이크로어레이 또는 다중-웰 플레이트를 포함하는, 비드 또는 매트릭스와 같은)(US6365418, ZYOMYX INC), 및 [15] 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 작용제에 연결될 수 있다. 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 폴리머 또는 단백질을 고체 지지체에 연결하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 상기 분리 단계는 요구되지 않는다.

본 발명의 방법은 복합체에서 상기 단백질을 분해하여 펩타이드:폴리머 복합체를 생성하는 단계를 포함한다. 상기 분해는 후속 분석에 적합한 펩타이드 단편(예컨대, 에피토프)을 생성할 수 있고, 예를 들어, 상기 펩타이드 단편은 후속 서열화에 적합할 수 있다. 분해는 상기 복합체를 미반응 모노머로부터 분리하거나 분리하지 않고 상기 단백질:폴리머 복합체 상에서 수행될 수 있다. 상기 분해는 부분 분해일 수 있다. 상기 부분 분해는 상기 폴리머에 결합 펩타이드가 분해되지 않도록 하는 것일 수 있다. 상기 부분 분해는 상기 폴리머에 결합되지 않은 단백질의 부분이 폴리머와의 복합체로부터 분리되도록 하는 것일 수 있다. 상기 분해 단계는 하나 이상의 단백질 절단제의 첨가를 포함하거나, 단백질 절단 처리를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분해는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 상기 분해는 단백질분해를 포함할 수 있고, 하나 이상의 프로테아제와 같은, 하나 이상의 단백질분해 촉매에 의해 매개될 수 있다. 상기 분해는 부분 단백질분해일 수 있다.

단백질 절단제로서 사용될 수있는 프로테아제의 예시는 키모트립신, 트립신, 써모리신, V8 프로테아제, 엔도프로테이나제 인자 Xa 프로테아제, 트롬빈, 엔테로키나아제, V5 프로테아제, 또는 토바코 에치 바이러스 프로테아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단백질 절단제는 폴리펩타이드 및 펩타이드 결합을 절단하는 화학적 물질 또는 화합물과 같은, 화학적 절단제일 수 있다. 화학적 절단제의 비-제한적인 예시는 시아 노겐 브로마이드 및 하이드록시아민을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 포스파타아제(예컨대, 알칼리성 포스파타아제, 산 포스파타아제, 단백질 세린 포스파타아제, 단백질 티로신 포스파타아제, 단백질 트레오닌 포스파타아제 등), 리파아제, 및 다른 효소는 단백질 절단제에 추가로 채용될 수 있다.

또한, 마이크로파는 단백질 절단을 개시하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 단백질 절단제가 사용된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 단백질 절단제는 단일 단백질과 관련하여 사용되고(예컨대, 프로테아제 또는 화학적 절단제의 2개 이상의 타입)과 관련하여 사용되고, 이는 상기 언급된 절단제 또는 처리제의 임의의 조합을 포함 할 수 있다.

상기 분해 단계의 형태 및 조건은 상기 선택된 단백질 절단제에 의존할 것이다. 각각 단백질 절단제에 요구되는 반응 조건은 당업계에 공지되어 있다. 상기 온도 및 배양 시간은 당업계에서 표준 기술에 따라 조정될 수 있다.

상기 방법은 상기 펩타이드:폴리머 복합체를 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 분리 단계는 반응 혼합물 내에서 상기 펩타이드:폴리머 복합체의 순도 또는 농도의 증가를 수반할 수 있다. 대안적으로, 상기 분리 단계는 오염물로부터 상기 펩타이드:폴리머 복합체의 분리를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분리 단계는 세척 단계 또는 세척 단계들을 포함할 수 있다. 상기 분리 단계는 미결합 단백질, 미결합 펩타이드, 또는 절단제로부터 상기 펩타이드:폴리머 복합체의 분리를 수반할 수 있다. 상기 분리 단계는 상기 분해 단계의 다른 성분 또는 생성물로부터의 분리를 수반할 수 있다.

일부 구현예에서, 펩타이드 단편과 합성된 폴리머의 복합체는 미결합 펩타이드 및 절단제 및 초미세여과, 초원심분리, 전기영동, 초음파처리, 크로마토그래피 분리, 세척, 요소 첨가, 구아니딘, 자기력의 사용, 또는 그 임의의 조합의 사용에 의한 분해 단계의 다른 성분 또는 생성물로부터 분리된다.

바람직한 구현예에서, 상기 방법은 상기 펩타이드:폴리머 복합체의 분리 후, 상기 펩타이드:폴리머 복합체로부터 결합 펩타이드를 방출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방출 단계는 상기 폴리머로부터 상기 결합 펩타이드를 용출시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 결합 펩타이드를 방출하는 방법의 예시는 온도, pH, 이온 강도, 세제, 또는 그 임의의 조합의 변화와 같은 종래 용출 조건의 사용을 포함한다. 선택적으로, 펩타이드는 활용된 후속 서열화 기술에 따라, 후속 서열화 분석을 위해 탈염될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 분리 단계는 요구되지 않는다. 예를 들어, 상기 펩타이드:폴리머 복합체는 상기 펩타이드 서열의 결정의 단계에서 직접적으로 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 방출된 펩타이드는 서열화 단계에서 사용하기에 적합할 수 있거나, 서열화 단계에서 사용하기에 적합하도록 처리될 수 있다.

일부 구현예에서, 유리 단백질은 단백질 절단제로 처리되어 펩타이드 단편이 생성된다. 이들 단편은 합성된 폴리머와 접촉하여 폴리머-폴리펩타이드 복합체의 형성을 허용한다. 상기 미결합 단편은 초미세여과, 초원심분리, 전기영동, 초음파처리, 크로마토그래피 분리, 세척, 요소 첨가, 구아니딘, 자기력의 사용, 또는 그 임의의 조합에 의해 상기 폴리머로부터 제거된다. 상기 결합 펩타이드는 온도, pH, 이온 강도, 세제, 또는 그 임의의 조합의 변화와 같은 종래 용출 조건을 사용하여 상기 폴리머-펩타이드 복합체로부터 방출될 수 있다. 일반적으로, 펩타이드는 후속 서열화 분석을 위해 탈염될 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 펩타이드를 서열화하는 단계를 바람직하게 포함할 수 있다. 이러한 서열화 단계는 당업계에 공지된 펩타이드 서열화 기술로서 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드는 에드만 분해법, 질량 분석법, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI)를 이용한 질량 분석법, 전자분무 이온화(ESI) 소스, 임의의 대기압 이온화 기술 또는 탠덤 질량 분석기 분석(MS/MS), 임의의 다른 적합한 방법, 또는 그 임의의 조합에 의해 서열화될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 펩타이드 서열은 상기 분리 단계 및/또는 상기 방출 단계 없이 상기 펩타이드와 중합체의 복합체로부터 직접적으로 유도된다. 다른 구현예에서, 상기 펩타이드의 서열은 펩타이드:폴리머 복합체로부터 방출된 후에 결정된다.

바람직한 구현예에서,

- 상기 펩타이드:폴리머 복합체를 분리하는 단계를 포함하는 단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 상기 분리된 펩타이드:폴리머 복합체는 결합 파트너에 대한 상기 단백질의 결합 부위를 결정하는데 적합한 복합체이다.

가장 바람직한 구현예에서,

- 상기 단백질:폴리머 복합체를 분리하는 단계;

- 상기 복합체에서 상기 단백질을 분해하여 펩타이드:폴리머 복합체를 생성하는 단계;

- 상기 펩타이드:폴리머 복합체를 분리하는 단계;

- 상기 펩타이드:폴리머 복합체로부터 결합 펩타이드를 방출하는 단계; 및

- 상기 방출된 펩타이드를 서열화하는 단계를 포함하고, 상기 방출된 펩타이드는 결합 파트너에 대한 결합 부위에 해당하는, 단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 제2 측면에서, 단백질 상에 결합 파트너에 대한 신규 결합 부위를 결정하기 위해 적합한 조성물을 생성하기 위한, 선택적으로, 상기 결합 부위는 항체가 결합하는 에피토프인, 분자 임프린티드 폴리머(MIP)의 용도를 제공한다.

상기 제2 측면의 용도는

- 단백질:MIP 복합체를 형성하는 단계;

- 상기 복합체에서 상기 단백질을 분해하여 펩타이드: MIP 복합체를 생성하는 단계; 및

- 상기 펩타이드: MIP 복합체를 분리하는 단계를 바람직하게 포함한다.

상기 펩타이드는 결합 파트너에 대한 결합 부위에 해당한다.

상기 단백질은 본원에 개시된 바와 같이 임의의 것, 예를 들어 접힌 단백질일 수 있고, 이는 용액 내에 있거나 고체 표면 상에 고정화될 수 있다. 상기 고체 표면은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 조성물 또는 형태일 수 있고, 예를 들어, 다당류, 실리카, 유기 또는 무기 폴리머, 금속, 또는 그 조합을 표면으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 고체 표면은 임의의 형태, 또는 비드, 자성 비드, 어레이, 도파관의 표면, 섬유, 멤브레인. 또는 모세관으로부터 선택될 수 있는 형태일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 복합체는 사전-형성된 MIP 및 상기 단백질 사이에 형성될 수 있다. 상기 사전-형성된 폴리머는 상이한 단백질, 리간드를 위해 또는 단백질-단백질 또는 단백질-리간드 복합체의 부분을 위해 형성된 MIP일 수 있다. 상기 리간드는 작은 의약 분자, 펩타이드, 당류, 단백질, 또는 당업계 공지된 다른 표적일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 단백질:MIP 복합체는 상기 단백질을 복수의 모노머와 접촉시킨 다음, 상기 모노머의 중합을 개시함으로써 형성된다. 상기 복수의 모노머는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 조성물일 수 있고, 가교 모노머 및/또는 자성 나노 입자를 바람직하게 포함할 수 있다.

상기 개시의 방법 및 개시를 위한 임의의 요구되는 시약은 본원에 개시된 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 모노머의 중합은 화학적으로; 열적으로, 예를 들어, 열의 사용에 의해; 또는 광학적으로, 예를 들어, UV 또는 가시광선의 사용에 의해 개시될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 단백질:MIP 복합체는 분해 단계 전에 분리될 수 있다. 상기 분리의 방법은 본원에 개시된 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 초미세여과, 초원심분리, 전기영동, 초음파처리, 크로마토그래피 분리, 세척, 요소 첨가, 구아니딘, 자기력의 사용, 또는 그 임의의 조합에 의할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 단백질:MIP 복합체에서 상기 단백질의 분해는 상기 복합체에서 단백질의 부분 단백질분해를 포함하고, 상기 폴리머에 결합되지 않은 단백질의 부분이 상기 폴리머와의 복합체로부터 분리된다. 상기 분해 단계, 및 임의의 요구되는 시약은 본원에 개시된 임의의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 상기 분해 단계는 프로테아제와 같은, 하나 이상의 단백질 절단제의 사용을 포함할 수 있다.

상기 펩타이드:MIP 복합체는 상기 분해 단계 후에 분리된다. 상기 분리의 방법은 본원에 개시된 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 초미세여과, 초원심분리, 전기영동, 초음파처리, 크로마토그래피 분리, 세척, 요소 첨가, 구아니딘, 자기력의 사용, 또는 그 임의의 조합에 의할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 결합 펩타이드는 상기 펩타이드:MIP 복합체로부터 방출될 수 있다. 이러한 방출은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 방법 또는 형태에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 방출 단계는 온도, pH, 이온 강도, 세제, 또는 그 임의의 조합의 변화와 같은 종래 용출 조건을 사용한 상기 결합 펩타이드의 방출을 포함한다.

일 구현예에서, 상기 펩타이드:MIP 또는 상기 방출된 펩타이드는 상기 결합 펩타이드의 서열화를 결정하는 단계에서 활용될 수 있다. 이러한 단계는 본원에 서술된 바와 같은 임의의 서열화 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열화 단계는 에드만 분해법, 질량 분석법, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI)를 이용한 질량 분석법, 전자분무 이온화(ESI) 소스, 대기압 이온화 기술 또는 탠덤 질량 분석기 분석(MS/MS), 또는 그 임의의 조합의 사용을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 단백질 상에 결합 파트너에 대한 신규 결합 부위를 결정하기 위해 적합한 조성물을 생성하기 위한 분자 임프린티드 폴리머(MIP)의 용도가 제공되고, 상기 용도는

- 표적 단백질을 복수의 모노머와 접촉시키고, 상기 모노머의 중합을 개시하여 상기 단백질:MIP 복합체를 형성하는 단계;

- 상기 단백질:MIP 복합체를 분리하는 단계;

- 상기 복합체에서 상기 단백질을 분해하여 펩타이드:MIP 복합체를 생성하는 단계;

- 상기 펩타이드:MIP 복합체를 분리하는 단계;

- 상기 펩타이드:MIP 복합체로부터 결합 펩타이드를 방출하는 단계; 및

- 선택적으로, 상기 방출된 펩타이드를 서열화하는 단계를 포함하고, 상기 방출된 펩타이드는 결합 파트너에 대한 결합 부위에 해당한다.

특히 구현예에서, 단백질 상에 결합 파트너에 대한 신규 결합 부위를 결정하기 위해 적합한 조성물을 생성하기 위한 사전-형성된 분자 임프린티드 폴리머(MIP)의 용도가 제공되고, 상기 용도는

- 표적 단백질 또는 단백질-리간드 복합체를 사전-형성된 MIP와 접촉시켜 단백질:MIP 또는 단백질-리간드-MIP 복합체를 형성하는 단계;

- 상기 복합체를 분리하는 단계;

- 상기 펩타이드:MIP 복합체를 분리하는 단계;

본 발명의 제3 측면에서, 단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 키트가 제공되고, 상기 키트는

- 표적 단백질을 접촉하고 모노머를 중합하여 단백질:폴리머 복합체를 형성하기 위해 적합한 복수의 모노머; 및

- 하나 이상의 단백질 절단제를 포함한다.

다른 구현예에서, 단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 키트가 제공되고, 상기 키트는 임의의 본원의 방법을 사용하기에 적합한 성분을 포함한다.

예를 들어, 키트는 본원에 개시된 바와 같이, 사용자가 단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 임의의 방법을 수행할 수 있도록 하는 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 표적 단백질을 접촉하고 상기 모노머를 중합하여 단백질:폴리머 복합체를 형성하기 위해 적합한 모노머 혼합물을 바람직하게 포함한다. 상기 모노머 혼합물은 1종의 모노머, 2 종 이상의 모노머, 가교 모노머, 또는 그 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 모노머 혼합물은 본원에 개시된 임의의 복수의 모노머를 포함할 수 있다.

선택적으로, 상기 모노머 혼합물은 자석 나노입자를 포함할 수 있거나, 자성 나노입자는 상기 키트의 분리 성분일 수 있다. 상기 모노머 혼합물은 표적 단백질과의 복합체에서 분자 임프린티드 폴리머를 형성하기 위해 적합한 혼합물일 수 있다. 복수의 모노머는 사용 전에 하나 이상의 용매, 용액, 또는 버퍼와 조합되도록 안정한 형태로 공급될 수 있다. 또한, 하나 이상의 용매, 용액 또는 버퍼가 상기 키트에 포함되거나, 상기 키트의 일부를 형성하지 않을 수 있다.

선택적으로, 상기 모노머 혼합물은 중합을 개시하기 위한 하나 이상의 개시제를 포함 할 수 있거나, 상기 하나 이상의 개시제는 상기 키트의 분리 성분을 형성할 수 있다. 하나 이상의 개시제는 본원에 개시된 임의의 개시제 또는 개시제의 혼합물일 수 있다. 상기 개시제는 사용 전에 하나 이상의 용매, 용액, 또는 버퍼와 조합되도록 안정한 형태로 공급될 수 있다. 또한, 하나 이상의 용매, 용액 또는 버퍼가 상기 키트에 포함되거나, 상기 키트의 일부를 형성하지 않을 수 있다.

상기 키트는 상기 표적 단백질의 고정화에 적합한 고체 표면을 포함하는 물질을 선택적으로 포함할 수 있다. 상기 고체 표면은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 조성물 일 수 있다. 예를 들어, 다당류, 실리카, 유기 또는 무기 폴리머, 금속, 또는 그 조합을 포함하는 표면으로부터 선택된다. 상기 고체 표면은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 비드, 자성 비드, 어레이, 도파관의 표면, 섬유, 멤브레인. 또는 모세관으로부터 선택된 형태이다.

본 발명의 키트는 하나 이상의 단백질 절단제를 선택적으로 포함할 수 있다. 상기 단백질 절단제는 본원에 개시된 임의의 단백질 절단제, 예를 들어 하나 이상의 효소 또는 하나 이상의 화학적 절단제일 수 있다. 상기 하나 이상의 효소는 프로테아제, 예를 들어 트립신일 수있다.

상기 단백질 절단제는 하나 이상의 적절한 버퍼, 용매, 또는 용액을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 용매, 용액, 또는 버퍼는 상기 단백질 절단제의 다른 성분으로부터 분리 될 수 있고, 예를 들어, 효소 및 적합한 버퍼가 상기 키트의 분리 성분을 형성할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 용매, 용액, 또는 버퍼는 상기 키트와 함께 공급되지 않을 수 있다.

상기 키트는 분리 또는 정제를 위한 물질을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 단백질:폴리머 복합체의 분리에 사용되거나, 펩타이드:폴리머 복합체의 분리에 사용되기 위한 물질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 초미세여과 및/또는 원심분리를 위한 물질을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 하나 이상의 필터 또는 원심분리 필터(예컨대, 적절한 여과 멤브레인을 가진 원심분리 카트리지)를 포함 할 수 있다. 하나 이상의 필터는 20 kDa 내지 1 μm 원심 분리 필터, 또는 바람직하게는 50 kDa 원심분리 필터 일 수 있다. 상기 키트는 컬럼, 예를 들어 조성물의 정제 또는 탈염에 사용하기 위한 컬럼, 또는 분석 컬럼을 포함할 수 있다.

상기 키트는 조성물의 자성 분리 또는 조성물의 자성 정제에 적합한 자석 및/또는 용기를 선택적으로 포함할 수 있다.

상기 키트는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 버퍼 또는 용액을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 표적 단백질을 복수의 모노머와 접촉시키고 모노머를 중합하여 단백질:폴리머 복합체를 생성하기 위해 적합한 조건을 형성하는데 적합한 하나 이상의 용액 또는 버퍼를 포함할 수있다. 상기 키트는 상기 단백질:폴리머 복합체에서 단백질의 분해를 수행하여 펩타이드:폴리머 복합체를 생성하기 위해 적합한 하나 이상의 용액 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 키트는 단백질:폴리머 복합체를 분리하기 위해 적합한 하나 이상의 용액 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 펩타이드: 중합체 복합체를 분리하기 위해 적합한 하나 이상의 용액 또는 버퍼를 포함 할 수 있다. 상기 키트는 상기 펩타이드:폴리머 복합체로부터 상기 펩타이드 용출에 적합한 하나 이상의 용액 또는 버퍼를 포함 할 수 있다. 상기 키트는 후속 서열화를 위해 상기 펩타이드:폴리머 복합체 또는 상기 방출된 펩타이드를 제조하기 위해 적합한 하나 이상의 용액 또는 버퍼를 포함할 수 있다.

하나 이상의 용액 또는 버퍼는 암모늄 및 포름산과 같은, 단백질 표적의 의도된 형태를 유지하고 펩타이드 서열을 방지하지 않기 위해 유용한 염을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다. 상기 하나 이상의 용액 또는 버퍼는 PBS, 암모늄 포르메이트 또는 아세테이트를 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다. 상기 하나 이상의 용액 또는 버퍼는 물, 예를 들어, 초순수 및/또는 LC-MS 등급 물을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다. 상기 하나 이상의 용액 또는 버퍼는 포름산을 포함할 수 있고, 상기 포름산은 0.01% 내지 1%, 0.05% 내지 0.5%, 또는 바람직하게는 대략 0.1%의 농도일 수 있다. 상기 하나 이상의 포름산 버퍼는 LC-MS 등급 물을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 포름산 버퍼는 아세토나이트릴을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 키트는 본원에 서술된 본 발명의 임의의 방법에 따라 상기 키트 성분의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 상기 키트는 적합한 포장 상태에 있을 수 있다. 적합한 포장은 바이알(vials), 병(bottles), 병(jars), 플렉서블 포장(예컨대, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 비닐백) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 용기 및 상기 용기 상에 또는 이와 관련된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다. 상기 키트는 본원에 개시된 임의의 방법 단계를 위한 반응 용기로서 사용하기에 적합한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 키트는

- 표적 단백질을 접촉하고 모노머를 중합하여 단백질:폴리머 복합체를 형성하기 위해 적합한 복수의 모노머;

- 중합을 개시하기 위해 적합한 개시제;

- 하나 이상의 효소를 포함하는 하나 이상의 단백질 절단제; 및

- 분리 단계에 사용하기에 적합한 하나 이상의 카트리지를 포함할 수 있다.

상기 키트는

- 하나 이상의 버퍼를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.

상기 키트는

- 라벨 또는 설명서를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 제4 측면에서, 펩타이드 서열화로부터 유래된 정보를 사용하여 고안된 조성물 및 생성물이 제공된다.

잠재적인 결합 부위가 확인되면, 결합 파트너는 알려진 기술을 사용하여 고안되고 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 잠재적인 항체의 결합에 적합한 에피토프의 식별을 유도할 수 있고, 이러한 부위에 대한 항체는 일상적인 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, MIP는 식별된 결합 부위에 결합하는 것에 생성될 수 있다. 상기 표적 단백질은 의학적으로 관련된 단백질일 수 있으므로, 새롭게 고안된 결합 파트너는 의약에 사용하기에 관련될 수 있다.

일 구현예에서, 식별된 펩타이드 서열은 면역원, 예를 들어, 4개 내지 20 개 아미노산을 포함하는 면역원을 고안하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 식별된 펩타이드 서열은 항체(예컨대, 인간, 인간화, 마우스, 토끼, 키메릭 등)를 생성하는데 사용된다. 항체는 예를 들어 하이브리도마에 의한 생산, 재조합 생산, 또는 동물의 사용을 포함하는 당업계 공지된 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다. 면역원은 당업계 공지 된 방법을 사용하여 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MIP, 압타머, 아피머 또는 다른 천연 또는 합성 수용체를 생성하는데 사용된다. 펩타이드 서열 또는 펩타이드 서열에 대한 본 발명 정보의 일부 구현예에서, 자체에서 사용되나, 진단 및 치료 응용, 맞춤 의학, 이미징, 약물 전달, 백신 개발 또는 프로테오믹스 연구에 제한되지 않는다.

본원에 서술된 모든 특징(임의의 수반되는 청구범위, 요약 및 도면을 포함하는), 및/또는 그렇게 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는 그러한 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 상기 임의의 측면들과 조합될 수 있다.

본 발명의 이점은 단백질, 단백질 구조 또는 임의의 후보 결합 부위에 대한 사전 지식 없이, 결합 부위인 펩타이드 서열을 실험적으로 결정할 수 있는 능력에 있다. 따라서, 상기 방법은 완전히 신규 결합 부위를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 요구되는 복잡성, 비용, 및/또는 시간으로 인해 생성이 불가능하거나 어려울 수 있는, 항체와 같은 복합 시약의 사용을 요구하지 않는다.

본 발명을 더 잘 이해하고, 그 구현예들이 어떻게 수행될 수 있는지를 보여주기 위해, 예를 들어, 첨부 도면을 참조할 것이다:
도 1은 본 발명의 방법의 구현예의 개략도를 나타낸다. 나타낸 구현예는 단백질 표면 상에 노출된 펩타이드 서열의 식별을 위해 분자의 임프린팅 및 질량 분석법을 사용한다.

이제, 본 발명은 다음 비-제한적인 실시예, 및 도 1을 참고하여 특히 추가적으로 설명될 것이다.

실시예 1 - 분자 임프린티드 폴리머를 사용한 에피토프 맵핑

도 1을 참고하면, 단백질 또는 폴리펩타이드와 같은, 임의의 단백질성 물질일 수 있는, 항원 2가 도시되어 있다. 항원 2는 내부 영역 14의 표면 상에 노출된, 2개 에피토프 4, 6을 가지고, 이러한 에피토프 4, 6은 본 방법이 항체, 압타머, 아피머, 작은 의약 분자, MIP 또는 다른 천연 또는 합성 수용체와 같은, 결합 파트너의 결합 부위로서 식별하고자 한다. 이들 에피토프 4, 6에 대한 서열 정보는 분자 임프린팅 및 서열화 기술을 사용하여 획득될 수 있다. 이들 아미노산 서열에 대한 지식은 연구, 진단, 또는 치료 용도를 위해, 고친화성 항체, 또는 다른 천연 또는 합성 수용체와 같은, 결합 파트너를 생성하는데 차후에 사용될 수 있다.

본 방법의 일 구현예에서, 항원 2는 복수의 모노머와 접촉한 다음, 이는 중합되어 분자 임프린티드 폴리머(MIP) 나노입자 8을 생성하고, 에피토프 4와 복합체를 형성하여 에피토프 6이 노출되도록 한다(도 1의 상단 참고). 결과적인 복합체는 MIP 나노입자 8로 도시된다. 동일한 반응 용기에서, 또한, 항원 2는 복수의 모노머와 접촉 한 다음, 이는 중합되어 분자 임프린티드 폴리머(MIP) 나노입자 10을 생성하고, 에피토프 6과 복합체를 형성하여 에피토프 4가 노출되도록 한다(도 1의 하단 참고). 결과적인 복합체는 MIP 나노입자 10으로 도시된다.

2 개 MIP 나노입자 8, 10을 생성한 다음, 항원 2는 효소로 분해되고, 이는 내부 영역 14 및 에피토프 6를 분해하여 에피토프 4만 MIP 나노입자 8와 복합체를 형성하게 하거나(도 1의 상단 참고), 내부 영역 14 및 에피토프 4를 분해하여 에피토프 6만 MIP 나노입자 10과 복합체를 형성하게 한다(도 1의 하단 참고). 그 다음, 에피토프:MIP 복합체 8, 10은 질량 분석법을 사용하여 분석되어 에피토프 4 및 에피토프 6의 서열을 결정할 수 있다.

실시예 2 - AchE의 에피토프 맵핑

실시 예 1에 서술된 방법을 입증하기 위해, 단백질 표면 상에 펩타이드 에피토프 서열의 식별을 위한 표적은 electric eel Electrophorus electricus(Sigma, C-3389)로부터 아세틸 콜린 에스테라아제(AChE) 효소였다. AChE 4.4 mg을 PBS 2 mL에 용해시켰다. 샘플 0.7 mL을 탈산소화된 모노머성 혼합물(NIPAM 19.5 mg, 메틸렌 비스아크릴아마이드(MBAA) 3 mg, tert-부틸아크릴아마이드 15 mg, H₂O 1 mL 내에 아크릴산 μL의 용액 50 μL, 및 3-아미노프로필 메타크릴레이트 3 mg을 인산 완충 식염수(PBS) 1mL에 용해시켰고, 20 분 동안 질소로 퍼지시켰음) 10mL와 혼합하였고, PBS 400μL에 용해된 과황산 암모늄(APS) 12 ㎎ 및 TEMED 6 μL 의 새롭게 준비된 용액 100 μL를 첨가함으로써 중합을 개시하였다. 상온(20 ℃)에서 1 시간 동안 중합을 수행하였다. 미반응 기능성 모노머 및 저-친화성 입자를 제거하기 위해, 3500 rpm에서 30 분 동안 50 kDa 원심분리 필터를 통해 중합된 샘플을 여과시켰다. PBS 10 mL를 첨가하였고, 10 분 동안 배양하였으며, 상기한 바와 같이 원심분리 필터를 통과시켰다.

단백질에 결합된 MIP 나노 입자를 트립신(Bovine pancrease, Sigma, T9201) 0.5 mg을 함유하는 PBS 5 mL에서 재구성하였고, 36시간 동안 상온에서 배양하였다. 분해된 AChE 및 트립신의 유리 단편을 3500 rpm에서 15 분 동안 50kDa 원심분리 카트리지를 사용한 샘플의 원심분리한 후, PBS로 2 X 5 mL 세척함으로써 제거 하였다. MIP에 결합 펩타이드를 온수 2 X 1 mL를 사용하여 폴리머로부터 분리하였고, 동결건조시켰으며, 0.1% 포름산에서 재구성하였다. 펩타이드를 Waters 2G-V/M Symmetry C18 트랩 컬럼(180 μm x 20 mm, 5 μm) 상에 초기 로딩하여 Waters Acquity HSS T3 분석 UPLC 컬럼(75 μm x 250mm, 1.8μm) 상에 용출하기 전에, 펩타이드를 탈염시키고 크로마토그래피적으로 초점을 맞추었다. Waters 2G-V / M 대칭 C18 트랩 컬럼(180 μm x 20 mm, 5 μm)에 초기에 로딩하여 펩티드를 용출하기 전에 Waters Acquity HSS T3 분석 UPLC 컬럼(75 μm x x 250mm, 1.8μm). 단일 펌프 트래핑을 3 분 동안 5 μL/ 분의 유속으로 99.9 % 용매 A 및 0.1 % 용매 B와 함께 사용하였다. 용매 A는 0.1 % 포름산을 함유하는 LC-MS 등급의 물이고, 용매 B는 0.1 % 포름산을 함유하는 아세토나이트릴이었다.

분석 컬럼의 경우, 유속을 0.3 μL/분으로 설정하고 온도를 40 ℃로 유지하였다. 펩타이드가 트랩 컬럼으로부터 용출됨에 따라, 50 분 런타임 구배 용출이 개시되었다. 다음과 같은 구배를 사용하였다: 0 분-3 % B, 30 분-40 % B, 32 분-85 % B, 40 분-85 % B 및 41 분-3 % B. NanoAcquity UPLC는 Waters Synapt G2 HDMS 질량 분석기에 결합되었다. 기기는 양성 전기분무 이온화(ESI) 모드에서 작동되었다. 모세관 전압은 2.4 kV, 콘 전압은 30 V로 설정되었다. PicoTip 이미터(New Objective, US, 10μm 내부 직경)는 나노스테이지 프로브에 사용되었다. 180 mL/분의 헬륨 가스 유량 및 2.5 mbar의 압력을 가진 90 mL/분의 이온 이동성 분리기 질소 가스 유량을 사용 하였다. IMS 파 속도는 650 m/s로, IMS 파 높이는 40 V로 설정되었다.

HDMSE 획득 동안, 4V의 낮은 충돌 유도된 해리(CID) 에너지가 전달 이온 가이드를 가로 질러 인가되었다. 높은 CID 에너지 획득을 위해 20 내지 40 V의 램프가 적용되었다. CID 가스로서 아르곤을 사용하였다. Lockspray는 785.8427 m/z의 [Glu1]-피브리노펩타이드(GFP)를 사용한 크로마토그래피 실행 전반에 걸쳐 질량 정확도를 제공하였다. MassLynx 4.1을 사용하여 데이터를 획득하였다. ProteinLynx Global SERVER (PLGS) (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, USA)를 사용하여 모든 로우 데이터를 처리하였다. 정렬, 피크 피킹, 펩타이드 및 단백질 식별 및 제한된 상류 통계에 대한 데이터를 조립하는데 PLGS를 사용하였다. Uniprot Electrophorus electricus 데이터베이스에 대해 데이터를 검색하였다(2016 년 12 월 다운로드).

표 1은 분자 임프린팅 및 질량 분석법을 사용하여 발견 된 I-TASSER 모델 [16]에서 가장 널리 알려진(≥40 % 피크 강도) 펩타이드 서열을 보여준다. 본원에서 식별된 서열은 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 자원(IEDB) 검색도구 http://www.iedb.org [17]를 사용하여 발견된 것들과 일치한다. 임프린팅 방법은 3개 알려진 에피토프 중 2개를 정확하게 식별하였다. 4 개 다른 서열은 아세틸콜린 에스테라아제에 대한 에피토프로서 이전에 확인되지 않았다.

분자 임프린팅 및 질량 분석법을 사용하여 발견된 I-TASSER 모델에서 가장 널리 알려진(≥40 % 피크 강도) 펩타이드 서열 및 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 자원(IEDB)을 사용하여 발견된 펩타이드 서열.

펩타이드 서열 위치	분자 임프린팅 및 질량 분석법을 사용하여 발견된 I-TASSER 모델에서 펩타이드 서열	에피토프 데이터베이스(IEDB)에서 발견된 펩타이드 서열
200 - 217	LALQWVQDNIHFFGGNPK (서열번호 1)
313 - 320	FRFSFVPV (서열번호 2)	FRFSFVPV (인간) (서열번호 7)
218 - 243	QVTIFGESAGAASVGMHLLSPDSRPK (서열번호 3)	GESAGAA¹²(장어(eel)) (서열번호 8)
375 - 382	EDFLQGVK (서열번호 4)
526 - 532		YWANFAR (인간) (서열번호 9)
533 - 547	TGNPNINVDGSIDSR (서열번호 5)
549 - 559	RWPVFTSTEQK (서열번호 6)

실시예 3 - 자성 비드를 사용한 AChE의 에피토프 맵핑

NIPAM 19.5 mg, 메틸렌 비스아크릴아마이드(MBAA) 3 mg, tert-부틸아크릴아마이드 15 mg, H₂O 1 mL 내 아크릴산 22 μL의 용액 50 μL, 3-아미노프로필 메타크릴레이트 3 mg를 인산 완충 식염수(PBS)에 용해시켰고, 20분 동안 질소로 퍼지시켰다. 중합 전에, 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트로 개질된, 산화철 나노입자(10-30 nm 직경) 10 mg을 모노머성 혼합물 10 mL에 첨가하였고, 5분 동안 질소로 퍼지시켰다. AChE(Sigma, C-3389) 5 mg을 모노머성 혼합물 10 mL에 용해시켰고, 5분 동안 질소로 퍼지시켰다. PBS 400 ㎕ 에 용해된 과황산 암모늄(APS) 12 ㎎ 및 TEMED 6 ㎕ 의 새롭게 준비된 용액 100 ㎕를 첨가함으로써 중합을 개시하였다. 상온(20 ℃)에서 1 시간 동안 중합을 수행하였다.

자석을 사용하여 자성 물질을 수집하였고, PBS 3X 10 mL로 세척하였다. PBS 내 트립신(Bovine pancrease, Sigma, T9201) 1 mg의 용액 10 mL를 첨가하고 3 일 동안 상온(20℃)에서 배양함으로써 결합 AChE를 가진 수집된 자성 물질을 처리하였다. 자석을 사용하여 펩타이드에 결합된 자성 입자를 수집하였고, 냉수 3X 10mL로 세척하였다. 온수(90 ℃) 3x 1mL를 사용하여 자성 입자로부터 특정 펩타이드를 용출시켰다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 용출된 펩타이드를 서열화하였다.

실시예 4 -분자 임프린팅에 의해 식별된 AChE 에피토프의 서열의 분석

Electrophorus electricus (Ee) AChE 서열 중 오직 4개: 200-217 LALQWVQDNIHFFGGNPK(서열번호 1), 218-243 QVTIFGESAGAASVGMHLLSPDSRPK(서열번호 3), 313-320 FRFSFVPV (서열번호 2), 및 526-532 YWANFAR(서열번호 9)은 인간(h) AChE와 일치하다. 이들 서열의 부분은 항-AChE 항체에 대한 알려진 에피토프이다[18-20].

다음 서열: 209-215 (hAChE) LALQWVQ(서열번호 10), 231-247 (hAChE) FGESAGAASVGMHLLSP(서열번호 11), 326-333 (hAChE) FRFSFVPV(서열번호 7), 및 526-532 (hAChE) YWANFAR(서열번호 9) EeAChE 및 hAChE 모두에 대해 일치한다.

MIP에서 식별된 펩타이드 서열, 및 알려진 에피토프와의 그들의 상관 관계

분자 임프린팅 연구에서 식별된 서열	알려진 에피토프의 서열[1-3]
LALQWVQDNIHFFGGNPK (서열번호 1)	LLDQRLALQW (서열번호 12)
QVTIFGESAGAASVGMHLLSPDSRPK (서열번호 3)	TLFGESAGAA (서열번호 13); KTVTIFGESAGGASVGMHILSPGSR (서열번호 14)
FRFSFVPV (서열번호 7)	VFRFSFVPV (서열번호 15)
EDFLQGVK (서열번호 4)
YWANFAR (서열번호 9)	YWANFAR (서열번호 9)
TGNPNINVDGSIDSR (서열번호 5)
RWPVFTSTEQK (서열번호 6)

실시예 5 - AChE에 대해 식별된 에피토프에 대한 MIP 나노입자의 합성 및 특성

2 개 글라이신 잔기 및 말단 시스테인으로 구성된 링커를 포함하는, 상응하는 펩타이드를 템플릿으로 사용하기 위해 먼저 합성하였고, 아민 유도체화된 유리 비드의 표면 상에 고정시켰다. Canfarotta et al.에서 서술된 고체-상 접근[21]은 MIP 나노입자 합성에 적합하였다. AChE의 각각 에피토프에 대해 임프린티드 나노MIP의 친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기기(MP-SPR Navi 220A NAALI)를 사용하여 평가하였다. 이들 실험을 위해, MIP 나노입자를 센서 표면 상에 공유적으로 고정화시켰고, 동역학적 적정을 수행하여 각각 주사로 단백질의 농도를 증가시켰다. 모든 MIP는 낮은 나노몰 범위에서 K_D 값으로 AChE에 대해 우수한 친화성을 나타내었다(표 3). 중요하게는, 변성 AChE에 주로 존재하는 에피토프를 위해 합성된 MIP 나노입자는 본래 AChE에 결합할 수 있었다(표 3).

AchE에 대해 식별된 에피토프를 사용하여 합성된 MIP 나노입자의 친화성

MIP 나노입자의 합성에 사용된 에피토프	네이티브 AChE에 대한 합성된 MIP 나노입자의 K _D
YWANFAR (서열번호 9) MS 강도* - 네이티브 및 변성된 단백질 모두에서 45%	4.04 nM
FGESAGAASVGMHLLSP (서열번호 11) MS 강도 - 네이티브 단백질에서 86%, 변성된 단백질에서 10%	0.85 nM
FRFSFVPV (서열번호 7) MS 강도 - 변성된 단백질에서 100%, 네이티브 단백질에서 10%	26.3 pM
LALQWVQ (서열번호 10) MS 강도 - 네이티브 및 변성된 단백질 모두에서 100%	0.84 pM

* MS 스펙트럼에서 펩타이드 강도의 상대적인 퍼센트

<110> University of Leicester <120> Methods and kits for determining binding sites <130> 83021PCT1 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Electrophorus electricus <400> 1 Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln Asp Asn Ile His Phe Phe Gly Gly Asn 1 5 10 15 Pro Lys <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Electrophorus electricus <400> 2 Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val 1 5 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Electrophorus electricus <400> 3 Gln Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Gly Met 1 5 10 15 His Leu Leu Ser Pro Asp Ser Arg Pro Lys 20 25 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Electrophorus electricus <400> 4 Glu Asp Phe Leu Gln Gly Val Lys 1 5 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Electrophorus electricus <400> 5 Thr Gly Asn Pro Asn Ile Asn Val Asp Gly Ser Ile Asp Ser Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Electrophorus electricus <400> 6 Arg Trp Pro Val Phe Thr Ser Thr Glu Gln Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Electrophorus electricus <400> 8 Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Tyr Trp Ala Asn Phe Ala Arg 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Gly Met His Leu Leu Ser 1 5 10 15 Pro <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Leu Asp Gln Arg Leu Ala Leu Gln Trp 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Lys Thr Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Met His Ile Leu Ser Pro Gly Ser Arg 20 25 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val 1 5

Claims

단백질 상에 결합 파트너(binding partner)에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 방법으로:
(i) 단백질을 복수의 모노머(monomer)와 접촉시키고, 상기 모노머를 중합시켜 단백질:폴리머 복합체를 생성하는 단계;
(ⅱ) 상기 복합체에서 상기 단백질을 분해(digesting)하여 펩타이드:폴리머(peptide:polymer) 복합체를 생성하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 펩타이드:폴리머 복합체를 분리하는 단계;
를 포함하고,
상기 펩타이드는 결합 파트너에 대한 결합 부위에 해당하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
(iv) 상기 펩타이드를 서열화(sequencing)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단백질은 접힌 단백질(folded protein)이거나 상기 결합 부위는 신규 결합 부위인 것을 특징으로 하는, 방법.
제3항에 있어서,
상기 결합 부위는 항체가 결합하는 에피토프(epitope)인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단백질은 효소 억제제, 약물 분자(drug molecular) 또는 다른 단백질과의 복합체인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 (i) 단계에 의해 생성되는 단백질:폴리머 복합체는 단백질 및 분자 임프린티드 폴리머(molecularly imprinted polymer, MIP) 사이의 복합체인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 복수의 모노머는 가교-결합(cross-linking) 모노머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 복수의 모노머는 자성 나노입자(magnetic nanoparticle)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 (i) 단계는 단백질을 복수의 모노머와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기에서 상기 단백질은 용액 내에 있거나 고체 표면 상에 고정된 것을 특징으로 하는,
방법.
제9항에 있어서,
상기 고체 표면은 다당류, 실리카, 유기 또는 무기 폴리머, 금속 또는 이의 조합물을 포함하는 표면에서 선택되거나; 또는
상기 고체 표면의 형태는 비드, 자성 비드, 어레이(array), 도파관(waveguide)의 표면, 섬유, 멤브레인(membrane) 또는 모세관에서 선택되는;
것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 중합(polymerisation)은 화학적, 열적 또는 광학적으로 개시되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 폴리머(polymer)는
(a) 자성 코어(magnetic core)를 갖거나;
(b) 선형이거나 또는 가교-결합되거나;
(c) 상기 단백질에 공유 결합되거나; 또는
(d) 가용성 형태 또는 콜로이드 형태로 존재하는;
것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질:폴리머 복합체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제13항에 있어서,
상기 단백질:폴리머 복합체의 분리는 한외 여과(ultrafiltration), 초원심분리(ultracentrifugation), 전기영동, 초음파처리, 크로마토그래피 분리, 세척, 요소 첨가, 구아니딘(guanidine), 자기력(magnetic forces) 또는 이의 임의의 조합의 사용을 포함하거나; 또는
상기 단백질 또는 폴리머는 고체 지지체에 연결되어 상기 단백질:폴리머 복합체의 분리를 용이하게 하는;
것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (ⅱ) 분해 단계는 부분적인 단백질분해 반응이어서, 상기 폴리머에 결합되지 않은 상기 단백질의 부분은 상기 폴리머와의 복합체에서 분리되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제15 항에 있어서,
상기 (ⅱ) 분해 단계는 하나 이상의 단백질 절단제(cleaving agent)의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (ⅲ) 단계는 미결합 단백질 또는 미결합 펩타이드에서 상기 펩타이드:폴리머 복합체의 분리를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 (ⅲ) 단계는 한외 여과, 초원심분리, 전기영동, 초음파처리, 크로마토그래피 분리, 세척, 요소 첨가, 구아니딘, 자기력 또는 이의 임의의 조합의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드:폴리머 복합체에서 결합 펩타이드를 방출시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제2항에 있어서,
상기 (iv) 단계는 에드만 분해법(Edman degradation), 질량 분석법(mass spectrometry), 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)를 이용한 질량 분석법, 전자분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 소스, 대기압 이온화 기술 또는 탠덤(tandem) 질량 분석기 분석(MS/MS) 또는 이의 임의의 조합의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
분자 임프린티드 폴리머(MIP)를 이용하여, 단백질 상에 결합 파트너에 대한 신규 결합 부위의 결정에 적합한 조성물의 생산 방법으로서,
상기 방법은 단백질:MIP 복합체를 형성하는 단계를 포함하되;
여기서 상기 단백질:MIP 복합체는 상기 단백질을 복수의 모노머와 접촉시키고 상기 모노머의 중합을 개시함으로써 형성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제21항에 있어서,
상기 결합 부위는 항체가 결합하는 에피토프인 것을 특징으로 하는, 방법.
제21항에 있어서,
상기 방법은:
(i) 상기 복합체에서 상기 단백질을 분해하여 펩타이드:MIP 복합체를 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 펩타이드:MIP 복합체를 분리하는 단계;
를 더 포함하고,
상기 펩타이드는 결합 파트너에 대한 결합 부위에 해당하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제23항에 있어서,
상기 복합체는 사전-형성된 MIP 및 상기 단백질 사이에 형성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
제23항 또는 제24항에 있어서,
상기 (ⅱ) 단계 전에 상기 단백질:MIP 복합체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서,
상기 단백질:MIP 복합체에서 상기 단백질의 분해는 상기 복합체에서 상기 단백질의 부분적인 단백질분해를 포함하여, 상기 폴리머에 결합되지 않은 상기 단백질의 부분은 상기 폴리머와의 복합체에서 분리되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제27항에 있어서,
상기 단백질:MIP 복합체에서 상기 단백질의 분해는 프로테아제(protease)와 같은 하나 이상의 단백질 절단제의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서,
상기 펩타이드:MIP 복합체에서 결합 펩타이드를 방출시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제29항에 있어서,
상기 결합 펩타이드의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
단백질 상에 결합 파트너에 대한 결합 부위를 결정하기 위한 키트로서, 상기 키트는:
(i) 표적 단백질과 접촉하고 모노머를 중합하여 단백질:폴리머 복합체를 형성하기에 적합한 복수의 모노머; 및
(ⅱ) 하나 이상의 단백질 절단제;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제31항에 있어서,
상기 복수의 모노머는 상기 표적 단백질과의 복합체에서 MIP를 형성하기에 적합한 것을 특징으로 하는, 키트.
제31항에 있어서,
상기 중합을 개시하기에 적합한, 하나 이상의 개시제(initiator)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제31항에 있어서,
자성 나노입자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제31항에 있어서,
상기 표적 단백질의 고정에 적합한 고체 표면을 포함하는 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질:폴리머 복합체의 분리에 사용 또는 펩타이드:폴리머 복합체의 분리에 사용하기 위한 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제36항에 있어서,
상기 물질은 한외 여과 또는 원심분리를 위한 것임을 특징으로 하는, 키트.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질 절단제는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는,
키트.
제38항에 있어서,
상기 효소는 프로테아제인 것을 특징으로 하는, 키트.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 모노머는 비닐 모노머, 알릴 모노머, 아세틸렌, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 클로로아크릴레이트, 이타코네이트, 트리플루오로메틸아크릴레이트, 아미노산의 유도체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 메틸렌 비스아크릴아마이드, 에틸렌 비스아크릴아마이드 및 N,N'-비스아크릴로일피페라진, N-이소프로필아크릴아마이드(N-Isopropylacrylamide, NIPAM), tert-부틸아크릴아마이드, 아크릴산, 3-아미노프로필 메타크릴레이트, 메타크릴산 또는 이의 임의의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 모노머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 모노머는 비닐 모노머, 알릴 모노머, 아세틸렌, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 클로로아크릴레이트, 이타코네이트, 트리플루오로메틸아크릴레이트, 아미노산의 유도체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 메틸렌 비스아크릴아마이드, 에틸렌 비스아크릴아마이드 및 N,N'-비스아크릴로일피페라진, N-이소프로필아크릴아마이드(NIPAM), tert-부틸아크릴아마이드, 아크릴산, 3-아미노프로필 메타크릴레이트, 메타크릴산 또는 이의 임의의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 모노머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 모노머는 비닐 모노머, 알릴 모노머, 아세틸렌, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 클로로아크릴레이트, 이타코네이트, 트리플루오로메틸아크릴레이트, 아미노산의 유도체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 메틸렌 비스아크릴아마이드, 에틸렌 비스아크릴아마이드 및 N,N'-비스아크릴로일피페라진, N-이소프로필아크릴아마이드(NIPAM), tert-부틸아크릴아마이드, 아크릴산, 3-아미노프로필 메타크릴레이트, 메타크릴산 또는 이의 임의의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 모노머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.