KR102434006B1 - 항비만 활성을 갖는 유산균을 함유하는 식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항비만 활성을 갖는 유산균을 함유하는 건강기능식품 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것으로, 유사한 효능을 갖는 것으로 알려진 타 유산균에 비해 우수한 비만 예방 및 치료 효능을 나타낸다는 장점이 있다.

Description

항비만 활성을 갖는 유산균을 함유하는 식품 조성물{Food composition containing lactobacillus with anti-obesity activity}

본 발명은 항비만 활성을 갖는 유산균을 함유하는 식품 조성물에 관한 것이다.

생활수준의 향상으로 인해 현대사회는 지방과 당분의 섭취는 늘고 섬유질의 섭취는 줄어든 식사 문화가 정착되고 있으며, 특히 외식 문화가 발달함에 따라 고단백 위주의 식단 선호 현상이 두드러지고 있다. 그럼에도 오히려 육체적 활동은 줄어드는 방향으로 현대인의 생활 습관이 변화하고 있으며, 이에 따라 비만 인구가 급속히 늘고 있는 것이 현실이다. 고열량 식품의 섭취가 증가하고 섬유질 섭취가 줄어들면서 비만, 특히 복부 비만이 사회적으로 심각한 문제로 떠오르고 있다.

비만은 음식물 섭취와 에너지 사용의 불균형으로 초래되는 질병으로, 지방조직이 과잉 증가한 상태를 의미하며, 최근에는 비만, 당뇨, 이상지혈증, 고혈압 등으로 묶어 대사증후군(metabolic syndrome)으로 부르고 있다. 이러한 비만의 유해성은 비만 그 자체로 지방조직에 의한 복부의 압박으로 인하여 변비와 소화불량, 위장장해 등을 일으키는 것뿐만 아니라, 이로 인해 많은 성인병들의 위험요소가 된다는데 더 큰 문제가 있다. 비만은 당뇨, 고혈압, 관상동맥질환 및 암과의 직접적으로 연관되어 있는 것으로 알려져 있으며 WHO에서는 비만을 21세기 만성질환으로 규정하고 있다. 국내 성인의 유병률은 2030년에 50% 이상까지 급증하리라 예상하고 있으며 따라서 국가 및 개인적 경제부담이 크게 증가할 것으로 분석된다. 이에 국내외에서 비만을 예방하고 치료하는 연구에 많은 관심과 투자가 이루어지고 있다.

현재 비만과 비만으로부터 야기되는 다양한 합병증의 위험성들이 증가하면서 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 비만 치료제에 대한 관심이 증가하고 있으나, 확실한 치료효과를 나타내는 비만 치료제는 미미한 상태이다. 더욱이, 이러한 비만치료제로 사용되는 약은 입 마름, 감각이상, 변비, 불면, 메스꺼움, 현기증, 불면증 등 다양한 부작용을 가지고 있어, 이를 대체할 수 있는 인체 친화성이 높은 비만치료제의 개발이 요구되고 있다.

이에, 비만치료제를 대체할 수 있는 천연물질로서의 프로바이오틱 유산균에 관한 연구들이 진행되고 있으며, 특히 장내 미생물 균총과 비만의 상관관계에 관한 다양한 연구결과들이 발표되었으며, 몇몇 프로바이오틱스 유산균들이 항비만 효과를 가진다는 문헌들이 발표되고 있는바, 성인 및 소아까지 간편하게 섭취하여 비만을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 개선된 항비만 활성을 갖는 유산균에 대한 연구가 필요하다.

본 발명은 항비만 활성을 갖는 유산균을 함유함으로써, 성인 및 소아까지 간편하게 섭취하여 비만을 예방, 치료할 수 있는 식품 또는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 수탁번호 KCCM11983P로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 4B15 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 다른 측면은 수탁번호 KCCM11983P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 4B15 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 성인 및 소아까지 간편하게 섭취하여 비만을 예방, 치료할 수 있는 건강기능식품 및 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 및 도 2는 Oil red O 염색 실험을 통해 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 지방 축적 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리에 의해 3T3-L1 세포에서 중성지방의 축적이 억제됨을 확인한 결과이다.
도 4는 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리에 의해 3T3-L1 세포에서 중성지방의 분해가 촉진되어 유리 지방산이 생성됨을 확인한 결과이다.
도 5는 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리에 의해 3T3-L1 세포에서 각종 비만 조절 인자의 mRNA 발현량이 조절됨을 확인한 결과이다.
도 6은 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리에 의해 마우스의 조직에서 지방의 축적이 억제되고 지방세포의 크기가 감소됨을 확인한 결과이다.
도 7은 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리에 의해 마우스의 혈청에서 중성지방, 총 콜레스테롤 및 렙틴의 함량이 감소함을 확인한 결과이다.
도 8은 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리에 의해 마우스의 여러 조직에서 각종 비만 조절 인자의 mRNA 발현량이 조절됨을 확인한 결과이다.
도 9 내지 도 11은 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리에 의해 마우스의 장관 내 미생물 군집의 변화를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 유산균을 포함하는 조성물

본 발명의 일 측면은 유산균을 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 4B15 균주일 수 있고, 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11983P로 기탁된 균주로서, 항비만 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하여 위장에서도 죽지 않고 생존한 상태로 장까지 도달할 수 있고, 장 부착능이 우수하여 장에 도달하였을 때 장내에 잘 정착될 수 있는 효과가 있다.

또한, 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)나, 우레아제(urease), 젤라티나아제(gelatinase) 등과 같은 장내 유해효소를 생산하지 않을 뿐만 아니라, 지방세포에 독성을 나타내지 않는다.

한편, 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 D-아라비노오스, 리보오스, D-갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, 덜시톨, 만니톨, 소르비톨, N-아세틸 글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스쿨린, 살리신, 셀로비오스, 트레할로오스, 멜레지토오스, β-겐티오비오스, D-타가토오스, L-푸코오스, 글루코네이트 등의 당을 이용할 수 있는 한편, 글리세롤, 에리트리톨, L-아라비노오스, D-자일로스, L-자일로스, 안도니톨, β-메틸-자일로사이드, L-소르보오스, 람노오스, 이노시톨, α-메틸-D-글루코사이드, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 사카로오스, 이눌린, D-라피노오스, 아미돈, 글리코겐, 자일리톨, D-투라노오스, D-릭소오스, D-푸코오스, D-아라비톨, L-아라비톨, 2-케토-글로코네이트, 5-케토-글루코네이트 등의 당을 이용하지 못하는 특징이 있다.

또한, 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 콜레스테롤 저감화능 우수할 뿐만 아니라, PAR-γ, C/EBPα, SREBP-1, FAS, FABP 등과 같은 비만 조절 인자의 유전자의 발현을 조절하여, 세포 내 지질의 축적을 감소시키는 활성이나, 세포 내의 지질의 분해를 촉진하는 활성이 우수한 특징이 있다. 이를 통해, 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 체중이 증가되는 정도를 저감시킬 수 있는 효과도 나타낸다.

나아가, 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는, 장내 미생물총의 종을 다양하고 풍부하게 하는 효과가 있고, 유해균의 비율은 감소시키고 유익균의 비율을 증가시키는 효과가 있다.

특히, 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 비만과 양의 상관관계에 있는 미생물총의 비율을 감소시키는 효과가 있다. 구체적으로, 상기 '장내 미생물총'은 사람 또는 동물의 소장이나 대장 내에 존재하는 미생물들의 집락을 의미하며, 구체적으로 상기 소장이나 대장 내에서 생물 활성을 가지며 존재하는 미생물의 종류, 각 미생물의 수, 비율 등을 종합적으로 의미한다. 상기 '장내 미생물총의 개선'은 상기 장내 미생물 균총의 변화에 따라 사람 또는 동물의 성장, 면역, 대사, 소화, 피부 상태, 질환의 예방 또는 완화 등이 호전되거나 보다 이롭게 되도록 하는 것을 의미한다. 인간의 장내 미생물총에는 Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Verrucomicrobia 등의 문에 속하는 미생물들이 분포하는데, 기존의 연구에 따르면 야생형 쥐에게 고지방의 식이를 제공한 경우에 Firmicutes 문의 미생물이 증가하고 Bacteroidetes 문의 미생물이 감소하는 방향으로 장내 미생물총이 변화하는 것으로 보고되어 있다. 특히, 같은 열량을 섭취하더라도 비만안 생쥐의 장내 미생물을 공급 받은 무균 생쥐가 정상인 생쥐로부터 장내 미생물을 공급 받은 생쥐보다 체중이 더 증가하는 것으로 보고되어 있는바, 이러한 결과로부터 장내 미생물총이 에너지 축적과 비만 발생에 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 비만인 사람의 장내 미생물총에서도 Firmicutes/Bacteroidetes의 비율이 증가하는 것으로 관찰되는데, 저탄수화물 식이나 저지방 식이를 공급하면 Bacteroidetes의 분율이 증가하는 것으로 알려져 있는바, 장내 미생물총 중 Bacteroidetes 문의 증가와 Firmicutes 문의 억제는 비만을 비롯한 지질 관련 대사성 질환의 예방 및 치료에 매우 중요한 영향이 있음을 알 수 있다.

상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 장내 미생물총의 종을 다양하고 풍부하게 하는 한편, Bacteroidetes 문의 미생물의 비중을 증가시키고 Firmicutes 문의 미생물의 비중을 감소시키는바, 장내 미생물총을 개선하는 효과가 있고, 이를 통해 비만 등과 같은 지질 관련 대사성 질환을 겪고 있거나 그 전단계에 있는 개체에서 해당 증상을 예방, 개선 또는 치료하는데 이용될 수 있다.

상기 유산균을 포함하는 조성물은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함할 수 있고, 이때 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 10⁵ CFU/g 이상, 10⁶ CFU/g 이상, 예컨대 10⁷ CFU/g 이상의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 배양액은 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 배양하여 수득되는 것으로, 상기 균주의 세포를 포함하는 배양액 자체이거나 이의 농축물 또는 건조물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 조성물을 섭취한 사람 또는 동물의 장내에서 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주가 생존하여 성장하거나 활성을 가질 수 있도록 포함되는 것이라면 어떠한 형태로 가공된 것이든 포함될 수 있다.

상기 농축물은 상기 배양액의 고형분 농도를 높인 것으로, 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 세포 농도가 증가된 것일 수 있다. 상기 농축물은 진공농축, 판형농축, 박막농축 등에 의해 농축된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 예컨대 공지의 농축기를 이용하여 40℃ 내지 60℃의 온도에서 수행할 수 있다. 상기 농축물의 농도에 따라 본 발명의 조성물에 포함되는 배양액의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

상기 건조물은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 분무건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등의 방법을 통해 건조된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 세포를 포함하는 배양액을 동결건조시킨 동결건조물을 이용할 경우, 이를 포함하는 조성물을 제형화, 포장, 보관하는 등에 있어 유리한 장점이 있으며, 장기간 보존할 수 있으면서도 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 생물 활성을 손상시키지 않는 장점이 있다.

본 발명의 상기 유산균을 포함하는 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 담체, 부형제 및/또는 첨가제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제, 젤(예컨대, 하이드로젤) 또는 동결건조제제의 형태일 수도 있으며, 상기 첨가제로 분산제, 안정화제 또는 동결보호제를 추가적으로 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 동결건조제제의 경우, 상기 균주를 동결보호제와 함께 동결건조하여 분말의 형태로 사용하는 것을 포함하며, 상기 동결보호제는 탈지분유, 말토덱스트린, 덱스트린, 트레할로스, 말토오스, 유당, 만니톨, 사이클로덱스트린, 옥수수 전분, 글리세롤, 치커리 추출물 및/또는 꿀일 수 있다. 또한, 보존 담체와 혼합하여 흡착시킨 후 건조시켜 고체화하여 사용하는 것을 포함하며, 상기 보존 담체는 규조토, 활성탄 및/또는 탈지강일 수 있다.

본 발명의 상기 유산균을 포함하는 조성물은 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 상기 담체, 부형제 또는 첨가제 중 어느 하나와 혼합하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.

상기 균주, 담체, 부형제 및 첨가제에 대한 설명은 전술한 바와 같다. 상기 첨가제로 동결보호제를 이용하는 경우, 상기 유산균을 포함하는 조성물은 상기 균주와 동결보호제를 혼합하고, 상기 혼합물을 -45℃ 내지 -30℃에서 동결하는 과정을 거친 후, 30℃ 내지 40℃에서 건조하여 분쇄기로 갈아 동결건조된 분말 형태로 제조되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 동결하는 과정은 -45℃ 내지 -30℃의 온도 조건, 5 내지 50 mTorr의 압력 조건에서 65 내지 75 시간 동안 진공동결하는 과정일 수 있다.

본 발명의 조성물에 동결보호제가 더 포함될 경우, 상기 조성물이 동결 건조되는 과정에서 상기 균주의 손상이나 사멸이 억제될 수 있으며, 동결건조된 형태의 조성물은 보관, 유통, 저장 과정에서 유리한 장점이 있다. 또한, 상기 동결건조된 형태의 조성물은 분말의 형태로 섭취될 수 있으며, 이 경우 체내에서 상기 조성물 내 균주가 성장 또는 대사하면서 이의 활성을 나타낼 수 있다.

2. 유산균을 포함하는 조성의 용도

본 발명의 또 다른 측면은 상기 유산균을 포함하는 조성물의 비만 예방, 치료 또는 개선 용도를 제공한다.

상기 비만의 예방, 치료 또는 개선은, 체중의 감소, 체중의 증가를 억제하는 것, 지방 조직 무게의 감소, 지질(예컨대, 트리글리세리드, HDL, LDL을 포함하는 콜레스테롤)의 감소 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유산균을 포함하는 조성물은 의약품, 식품 또는 사료일 수 있다. 상기 유산균을 포함하는 조성물은 상기 조성물이 의약품일 경우, 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있고, 상기 조성물이 식품일 경우, 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품이거나 또는 일반 식품일 수 있으며, 상기 조성물이 사료일 경우, 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물일 수 있다.

본 발명은 상기 락토바실러스 람노서스 4B15 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 또는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.본 발명의 일 구현예에 따른 건강기능식품 조성물 또는 식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물 또는 식품 조성물은 체중의 증가 또는 지방의 축적을 억제하거나, 장내 미생물총을 개선할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 장기간 섭취하는 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품이나 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품이나 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 유제품, 발효유 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품이나 식품을 모두 포함한다.

특히, 상기 건강기능식품은 영양 공급 이외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품으로, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 수 있다. 상기 건강기능식품은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형도 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어난 장점이 있다.

본 발명의 건강기능식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같으며, 비만 예방 또는 개선을 목적으로 사료첨가제 조성물로 첨가할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.

본 발명에서 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 일 구현 예에서, 상기 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물이 포함하는 상기 균주는 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.

이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 레밍턴의 약학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 비만의 억제 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선치료, 호르몬치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 오염물질에 의해 유발되는 질환의 치료제 또는 피부 노화 개선을 위한 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 일례로 본 발명의 펩타이드를 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.0001 ㎍ 내지 500 mg, 예컨대 0.01 ㎍ 내지 100 mg 투여할 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 예컨대 하루 2회 내지 3회 분할 투여될 수 있다.

본 발명은 상기 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 비만 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 대상은 사람 또는 사람을 제외한 동물일 수 있으며, 비만이 아닌 상태이거나 비만인 상태일 수 있다. 상기 대상이 비만이 아닌 상태인 경우, 상기 약학 조성물을 대상에게 약학적으로 유효한 양만큼 투여하여 비만을 예방할 수 있고, 상기 대상이 비만인 상태인 경우, 상기 약학 조성물을 대상에게 약학적으로 유효한 양만큼 투여하여 비만을 치료할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제형, 투여 방법, 투여량 및 조성물에 함유되는 유효성분의 농도는 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

유산균 균주의 분리 및 생육

실험군 균주로 신생아 분변에서 분리하여 2017년 2월 28일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11983P로 기탁한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 4B15 균주와 대조군 균주로 대표적인 상업용 균주인 락토바실러스(Lactobacillus rhamnosus) GG, 균주(ATCC53103)를 각각 확보하여, MRS 액체배지(broth)에서 3차례 계대한 다음, 10⁹ CFU/mL의 농도로 조절하여 보관하며 이후의 실험에 사용하였다.

유산균 균주의 특성 확인

[2-1] 소화액 내성 평가

실험군 균주와 대조군 균주의 소화액에 대한 내성을 확인하기 위하여, Zielinska et al.(2015)의 문헌(Curr Microbiol., 70, 183-194 (2015))에 설명된 실험 방법에 따라 상기 두 균주의 내산성과 내답즙성을 측정하였다.

구체적으로, 상기 두 균주 각각을 MRS 배지에서 18시간 동안 배양한 다음, 상기 배양액의 1%를 1N의 HCl이 포함된 pH3.0의 50mM PBS에 접종하고 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음, MRS 고체배지(MRS agar) 상에서 주입평판법(pour-plating method)로 생존 콜로니의 개수를 측정하여 내산성을 평가하였다.

또한, 상기 배양액의 1%를, 1%의 황소담즙(oxgall)이 포함된 pH7.0의 50mM PBS에 각각 접종하고 37℃에서 6시간 동안 배양한 다음, 내산성과 동일한 방법(주입평판법)으로 생존 콜로니의 개수를 측정하여 내담즙성을 평가하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실험균 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 내산성과 내담즙산이 매우 우수한 것으로 확인되었고, 특히 대조군 균주에 비해 훨씬 높은 내산성을 나타내는 것으로 확인되었다.

		실험군 균주 (4B15)	대조군 균주 (GG)
내산성	0h (Log CFU/mL)	7.12	6.72
	2h (Log CFU/mL)	7.18	5.95
	생존률(%)	100.8	88.5
내담즙성	0h (Log CFU/mL)	7.12	6.72
	6h (Log CFU/mL)	7.08	8.61
	생존률(%)	99.4	128.1

[2-2] 장 부착능 평가

먼저, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 인간 대장암 세포인 HT-29 세포를 10% FBS가 첨가된 McCOY's 5A 배지로 상기 세포가 단일층(monolayer)을 형성할 때까지 배양하였다. 그 후, 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주 및 대조군 균주 각각을 10⁸ CFU/mL의 농도로 조절하여, 상기 HT-29 세포에 처리하고 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음, PBS로 5번 세척하고, 트립신-EDTA를 처리하여 상기 HT-29 세포에 부착된 유산균을 모은 뒤, MRS 고체배지에 도말하여 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 균의 수를 측정하여 하기 표 2에 기재하였다.

		실험군 균주 (4B15)	대조군 균주 (GG)
장 부착능	0h (Log CFU/mL)	7.93	7.97
	2h (Log CFU/mL)	6.39	5.23
	잔존률(%)	80.6	65.6

그 결과, 상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 대조군 균주에 비해 15% 정도 향상된 장 부착능을 나타내는 것으로 확인되었다.

[2-3] 콜레스테롤 저하능 평가

0.2%의 타우로콜산나트륨(sodium taurocholate)을 MRS broth에 첨가하고 멸균하여 제조한 MRS-THIO 배지 9mL에, 에탄올에 10mg/mL의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 1mL를 0.45μm 크기로 필터링하여 첨가하고, 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주 및 대조군 균주 각각의 배양액의 1%를 접종한 뒤, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 20시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 5400Xg에서 7분간 원심분리하고, 그로부터 얻은 상등액 2mL에 97% 에탄올 3mL과 50% KOH 2mL을 첨가하여 60℃의 수조(water bath)에서 10분간 처리하였다. 그런 다음, 5mL의 헥산을 첨가하고 30초 동안 강하게 교반한 다음 15분간 정치하여 층을 분리시켰다. 이중 헥산층을 분리해 내고, 질소 가스를 처리하여 분리된 헥산층에서 헥산을 제거한 다음, 4mL의 OPA(o-phtalaldehyde)(아세트산에 0.55mg/mL의 농도로 용해)를 첨가하고 10분간 반응시킨 후, 다시 2mL의 농황산을 첨가하고 교반한 후, 550nm에서 흡광도를 측정하여 하기 표 3에 기재하였다.

	실험군 균주 (4B15)	대조군 균주 (GG)
콜레스테롤 저하율(%)	61.3±1.1	38.4±0.4

그 결과, 상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 대조군 균주에 비해 20% 이상 향상된 콜레스테롤 저하능을 나타내는 것으로 확인되었다.

유산균 균주의 효소 활성 확인

[3-1] α-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성 평가

실험군 균주와 대조군 균주가 α-글루코시다아제의 효소 활성을 얼마나 저해하는지 확인하였다. 이를 위해, 먼저 pH7.0인 0.1M의 SPB(sodium phosphate buffer) 9mL에 300mg의 rat intestinal acetone powder를 첨가하고, 얼음수조(ice water bath에서 30초간 12회에 걸쳐 음파파쇄(sonication)한 후, 4℃에서 13000rpm으로 30분간 원심분리하였고, 상등액을 회수하여 조(crude) 효소를 제조하였다. 한편, pH7.0인 0.1M의 SPB(sodium phosphate buffer) 0.9mL에 30mg의 PNPG(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)를 첨가하여 기질을 제조하였다. 그런 다음, 상기 조 효소 50μL 및 상기 기질 250μL에 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주 및 대조군 균주 각각의 배양액 50μL를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시키고, 다시 100℃에서 5분 동안 가열하여 효소의 활성을 중지시킨 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 아카보즈(acarbose)를 사용하였으며 α-글루코시다아제의 효소 활성에 대한 저해율(%)은 하기 수학식 1로 계산하여 하기 표 4에 기재하였다.

[수학식 1]

	실험군 균주 (4B15)	대조군 균주 (GG)
α-글루코시다아제의 효소 활성 저해율(%)	31.1±3.0	14.0±1.3

그 결과, 상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 대조군 균주에 비해 25% 이상 향상된 α-글루코시다아제 저해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

[3-2] 효소 활성 평가

API ZYM kit(Meriuex)를 이용하여 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주와 대조군 균주의 효소 활성을 평가하였다. 먼저, 상기 실험군 균주와 대조군 균주를 각각 10⁹ CFU/mL의 농도로 희석하여 API ZYM 스트립(strip)에 분주하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, ZYM A 시약(reagent)과와 ZYM B 시약을 처리하여 효소 활성에 따른 색깔 변화를 확인하였다. 효소 활성에 따른 변색 정도를 1~5점으로 나누어 평가하였고, 그 결과를 하기 표 5에 기재하였다. 1점은 효소 활성이 나타나지 않은 것을 의미하고, 5점은 효소 활성이 최대인 것을 의미한다.

한편, 우레아제의 활성 평가는 우레아제 평판 배지(urea 2%, sodium chloride 0.5%, monopotassium phosphate 0.2%, peptone no.3 0.1%, glucose 0.1%, phenol red 0.0012%, agar 1.5%)를 제조한 후, 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주와 대조구 균주를 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음, 배지의 색이 붉은색으로 변하는지 여부를 관찰함으로써 확인하였다. 그리고 젤라티나아제의 활성 평가는 젤라틴 배지(beef extract 0.3%, peptone no.3 0.5%, gelatin 12%, MRS broth 5.5%)를 제조한 후, 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주와 대조구 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음, 배양이 완료된 배지를 4℃에서 보관하면서 배지가 가수분해되었는지 여부를 관찰함으로써 확인하였다. 그리고 상기 두 효소에 대한 활성 확인 결과를 하기 표 5에 함께 기재하였다.

효소	실험군 균주 (4B15)	대조군 균주 (GG)
Control	1	1
Alkaline phosphatase	4	3
Esterase	3	3
Esterase Lipase	3	3
Lipase	3	3
Leucine arylamidase	5	5
Valine arylamidase	5	5
Cystine arylamidase	4	3
Trypsin	1	2
α-chymotrypsin	3	3
Acid phosphatase	3	3
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase	4	4
α-galactosidase	2	3
β-galactosidase	5	5
β-glucuronidase	1	1
α-glucosidase	2	3
β-glucosidase	5	5
N-acetyl-b-glucosaminidase	1	2
α-mannosidase	1	1
α-fucosidase	4	5
Urease	-	-
Gelatinase	-	-
+: positive, -: negative

[3-2] 당 이용성 평가

API CHL50 키트를 이용하여 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주의 당 이용성을 평가하였고, 그 결과를 하기 표 6에 기재하였다.

당	반응 결과	당	반응 결과
Blank	-	에스쿨린	+
글리세롤	-	살리신	+
에리트리톨	-	셀로비오스	+
D-아라비노오스	w	말토오스	-
L-아라비노오스	-	락토오스	-
리보오스	w	멜리비오스	-
D-자일로스	-	사카로오스	-
L-자일로스	-	트레할로오스	+
안도니톨	-	이눌린	-
β-메틸-자일로사이드	-	멜레지토오스	+
D-갈락토오스	+	D-라피노오스	-
D-글루코오스	+	아미돈	-
D-프럭토오스	+	글리코겐	-
D-만노오스	+	자일리톨	-
L-소르보오스	-	β-겐티오비오스	+
람노오스	-	D-투라노오스	-
덜시톨	+	D-릭소오스	-
이노이톨	-	D-타가토오스	+
만니톨	+	D-푸코오스	-
소르비톨	+	L-푸코오스	w
α-메틸-D-만노사이드	-	D-아라비톨	-
α-메틸-D-글루코사이드	-	L-아라비톨	-
N-아세틸 글루코사민	+	글루코네이트	w
아미그달린	+	2-케토-글루코네이트	-
알부틴	+	5-케토-글루코네이트	-
+: positive, w: weakly positive, -: negative

인 비트로( in vitro )에서 유산균 균주의 항비만 효능 평가

[4-1] 세포독성 확인

마우스 유래 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 96웰 플레이트에 2.5ㅧ10⁴ cells/well의 밀도로 분주하여 3일 동안 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주 및 대조군 균주를 10⁶~10⁷ CFU/mL의 농도로 조절하여 상기와 같이 배양한 3T3-L1 세포에 접종하고, 48시간 배양한 후, MTT 시약을 처리하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 실험군 균주와 대조군 균주를 10⁶~10⁷ CFU/mL의 농도로 처리한 경우 모두 3T3-L1 세포의 생존률이 90% 이상인 것으로 확인되었다.

상기와 같은 결과로부터 실험군 균주가 3T3-L1 세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있는바, 이하에서는 상기 실시예 1에서 준비한 실험군 균주와 대조군 균주를 모두 10⁶ CFU/mL 및 10⁷ CFU/mL의 농도로 처리하여 실험을 진행하였다.

[4-2] 지방세포의 배양 및 유산균 균주의 처리

마우스 유래 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 24웰 플레이트에 4ㅧ10⁵ cells/well의 밀도로 분주하여 10% BCS(Bovin calf serum)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 세포밀도(confluency)가 100%로 될 때까지 배양한다. 세포밀도가 100%가 된 후 2일 더 배양한 다음, 10% FBS를 포함하는 DMEM에 0.5mM의 3-이소부틸-1-베틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 1uM의 덱사메타손(dexamethasone) 및 1ug/mL의 인슐린이 첨가된 MDI 배지로 배지를 교체하면서 실시예 1에서 준비한 실험군 균주 및 대조군 균주를 농도별로 처리하여 2일 더 배양하였다. 그리고 10% FBS를 포함하는 DMEM에 1ug/mL의 인슐린이 첨가된 배지로 배지를 교체하고 2일 더 배양하였다. 다시 10% FBS를 포함하는 DMEM로 배지를 교체하고 2일 더 배양하기를 2차례 반복하여, 유산균 처리 후 총 8일에 걸쳐 배양을 진행함으로써 지방전구세포를 지방세포로 분화시켰다.

일정	처리
	2 days more incubation after 100% confluence
0일~2일	microorganism treatments with MDI media (10% FBS in DMEM) *preparation of MDI reagent 1) M: 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine 2) D: 1 uM dexamethasone 3) I: 1 ug/mL insulin
2일~4일	1ug/mL insulin with 10% FBS in DMEM
4일~6일	10% FBS in DMEM
6일~8일	10% FBS in DMEM

[4-3] Oil Red O staining 평가

먼저, 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정에서 세포내에 축적되는 지질(lipid)의 함량을 측정하기 위하여 Oil red O 염색 실험을 실시하였다. 상기 실시예 [4-2]에서 분화가 완료된 지방세포를 PBS로 2번 세척하고, 1mL의 10% 포름알데히드를 처리하여 10분 동안 반응시켰다. 포름알데히드를 흡인(suction)해 낸 뒤, 다시 1mL의 포름알데히드를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 포름알데히드를 포름알데히드를 제거하고, 3차 증류수로 2번 세척하였고, 다시 1mL의 60% 이소프로판올을 처리하여 5분 동안 반응시킨 후 조심스럽게 제거하여 완전히 건조시켰다. 그런 다음, 1mL의 Oil Red O 사용 용액(working solution)을 처리하여 1시간 동안 반응시킨 후 Oil Red O 사용 용액을 제거하였다. 그리고 다시 3차 증류수로 빠르게 4번 세척한 후, 실험군 균주와 대조군 균주를 10⁷ CFU/mL의 농도로 처리한 지방세포를 대상으로 현미경을 통해 염색 정도를 관찰하였고, 실험군 균주와 대조군 균주를 10⁶ CFU/mL 및 10⁷ CFU/mL의 농도로 처리한 각각의 지방세포를 이소프로판올로 용출하여 520nm에서 흡광도를 측정함으로써 지방세포 내 지질의 축적 정도를 상대적으로 비교하였고, 그 결과를 각각 도 1 및 도 2에 도시하였다.

그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 유산균을 처리하지 않은 음성 대조군의 경우 지방전구세포가 지방세포로 분화함에 따라 지방세포 내에 지질이 많이 축적되어 붉은색으로 염색된 부분이 많은데 반해, 실시예 1에서 준비한 실험군 균주와 대조군 균주를 처리한 경우에는 분화된 지방세포 내에 축적되는 지질의 양이 훨씬 감소되어 붉은색으로 염색된 부분이 상대적으로 적음을 시각적으로 확인할 수 있다.

또한, 도 2에 따르면, 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 대조군 균주에 비해 지질 축적을 더욱 감소시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

[4-3] 중성지방(triglyceride, TG)과 유리 지방산(free fatty acid)의 함량 측정

비만은 크게 지방세포의 수가 증가하는 증식성(hyperplastic) 비만과, 지방세포의 크기가 증가하는 비대성(hypertrophic) 비만으로 나뉘어진다. 이 중, 비대성 비만의 경우에는 축적된 중성지방이 지방세포에 저장되어 지방세포의 크기가 비대해짐으로써 야기되는 것인데, 그렇기 때문에 중성지방의 흡수를 억제하는 것은 비대성 비만을 예방 또는 치료하는 하나의 접근법일 수 있다.

또한, 지방분해(lipolysis) 단계에서 중성지방은 글리세롤과 유리 지방산으로 가수분해되는 바, 지방의 분해를 촉진하는 것 역시 비대성 비만을 예방 또는 치료하는 또 다른 접근법일 수 있고, 이는 지방세포 내에 존재하는 유리 지방산의 함량을 확인함으로써 알 수 있다.

따라서, 상기 실시예 [4-2]에서 분화가 완료된 지방세포를 대상으로, 유산균의 처리가 중성지방의 축적을 얼마나 감소시킬 수 있는지, 그리고 지방분해를 얼마나 촉진할 수 있는지 확인하였다.

[4-3-1] 중성지방의 함량 측정

상기 실시예 [4-2]에서 분화가 완료된 지방세포를 5% NP-40 수용액으로 균질화시킨 후 80~100℃의 수조에서 5분간 가열하고, 실온에서 식힌 다음 한번 더 가열하였다. 그런 다음, 13000rpm으로 2분간 원심분리하여 상등액을 회수하고, 상기 회수된 상등액 25uL와 Triglyceride assay buffer 25uL를 96웰 플레이트에 분주하였다. 각 웰에 2uL의 리파아제(lipase)를 첨가하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, 50 uL의 Reaction Mix(Triglyceride assay buffer 46uL, Triglyceride probe 2uL, Triglyceride enzyme mix 2uL)를 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 다음, 570nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 도시하였다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 경우에 중성지방의 농도가 낮아지는 것으로 확인되었다. 상기와 같은 결과로부터 락토바실러스 람노서스 4B15 균주가 중성지방의 축적을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있다.

[4-3-2] 유리 지방산의 함량 측정

상기 실시예 [4-2]에서 분화가 완료된 지방세포에 1%(w/v) Triton X-100(in chloroform solution) 200uL를 첨가하여 균질화시킨 후, 13,000ㅧg로 10분간 원심분리하여 유기상(organic phases) 분획을 회수하였다. 상기 회수된 유기상을 50℃로 풍건(air dry)하여 클로로포름을 제거하고, 진공에서 30분간 더 건조하여 클로로포름을 완전히 제거한 다음, 200uL의 fatty acid assay buffer를 첨가하고 5분 동안 반응시켜 상기 지방세포 내의 유리 지방산을 녹여내었다. 상기와 같이 녹여낸 유리 지방산 샘플 50uL를 96웰 플레이트에 분주하고, 2uL의 ACS 시약을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 50uL의 Master Reaction Mix 용액(44uL Fatty acid assay buffer, 2uL fatty acid probe, 2uL enzyme Mix, 2uL Enhancer)을 첨가하여 37℃에서 30분간 교반시킨 다음, 570nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 도시하였다.

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 경우에 유리 지방산의 농도가 현저히 높아지는 것으로 확인되었고, 특히 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주가 대조군 균주에 비해 우수한 지방분해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

[4-4] 비만 조절 인자의 유전자 발현 수준 확인

지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정은 C/EBP(CCAAT/enhancer binding protein)의 일종인 C/EBPβ와 C/EBPδ를 중심으로 조절되는 초기 분화와 PPAR-γ(peroximal proliferator activated receptor-γ)와 C/EBPα를 중심으로 조절되는 후기 분화로 나누어진다. 특히, PPAR-γ와 C/EBPα는 후기 분화 과정에서 지방생성을 조절하는 핵심 조절 인자인데, 이들은 지방세포로의 분화 초기에 발현이 유도되어 지방세포로의 분화 과정에서 그 발현이 크게 증가하여 SREBP-1(sterol regulatory element binding protein-1), FAS(fatty acid synthase), FABP(free fatty acid binding protein), 렙틴(leptin) 등과 같은 다양한 지방세포 특이적 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 지방의 축적을 유도한다. 따라서, 상기 실시예 [4-2]에서 분화가 완료된 지방세포를 대상으로, 유산균의 처리가 상기 비만 조절 인자의 발현을 얼마나 억제할 수 있는지 확인하였다.

상기 실시예 [4-2]에서 분화가 완료된 지방세포를 대상으로 GeneJET RNA purification kit(Thermo- scientific)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 상기와 같이 추출한 RNA는 Maxima H minus first strand cDNA synthesis Kit(Thermo scientific)을 이용하여 cDNA로 합성하였으며, TaqMan Fast advanced Master Mix(Thermo Scientific)와 하기 표 8에 기재된 프라이머쌍을 이용하여 qRT-PCR을 수행함으로써, 지방세포 특이적 유전자인 PPAR-γ, C/EBPα, SREBP-1, FAS 및 FABP의 mRNA 발현량을 측정하고, 그 결과를 도 5에 도시하였다.

유전자	방향	프라이머 서열 (5'->3')
Ppar -γ	정방향	GCT TCC ACT ATG GAG TTC ATG CT
	역방향	CCG GCA GTT AAG ATC ACA CCT AT
C/ EBPα	정방향	AGG TGC TGG AGT TGA CCA GT
	역방향	CAG CCT AGA GAT CCA GCG AC
SREBP	정방향	AAG CAA ATC ACT GAA GGA CCT GG
	역방향	AAA GAC AAG GGG CTA CTC TGG GAG
Fas	정방향	TCT GGG CCA ACC TCA TTG GT
	역방향	GAA GCT GGG GGT CCA TTG TG
FABP	정방향	AGT GAA AAC TTC GAT GAT TAC ATG AA
	역방향	GCC TGC CAC TTT CCT TGT G
GAPDH	정방향	TCC TGC ACC ACC AAC TGC TTA G
	역방향	TGC TTC ACC ACC TTC TTG ATG TC

그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 경우에 비만 조절 인자의 유전자 발현 수준이 현저히 낮아지는 것으로 확인되었다. 특히, PPAR-γ, C/EBPα, FABP의 경우에는, 실험군 균주인 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리하였을 때, 대조군 균주를 처리하는 것보다 그 유전자의 발현이 더욱 억제되는 것으로 확인되었다.

인 비보( in vivo )에서 유산균 균주의 항비만 효능 평가

[5-1] 실험동물 및 처치

㈜오리엔트바이오로부터 5주령의 수컷 C57BL/6N 마우스 15마리를 구입하고, 제어된 환경에 수용하여 1주일 동안 환경순화(acclimation)시킨 후, 하기 표 9와 같이 3개의 군으로 나누었다.

군	식이	처리
음성 대조군 (n=5) (ND)	정상 식이	식이와 함께 PBS를 투여함
양성 대조군 (n=5) (HFD)	고지방 식이	식이와 함께 PBS를 투여함
실험군 (n=5) (HFD+Pro)	고지방 식이	PBS에 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 108 CFU/day의 농도로 현탁시켜 함께 투여함
*정상 식이: 탄수화물 68%, 단백질 21%, 지방 11.5%, 비타민 혼합물 1% *고지방 식이: 탄수화물 35%, 단백질 20%, 지방 45%(콩기름 5.5% 및 라드(lard) 39.5%), 비타민 혼합물 1%

케이지당 2~3마리의 마우스를 수용시켰고, 식이와 음수는 자유롭게 섭취할 수 있게 하였으며, 10주 동안 실험을 진행하였으며, 그 동안 락토바실러스 람노서스 4B15 균주는 하루에 한번 동일한 시간에 경구투여(oral gavage)하였다.

[5-2] 체중 증가율 확인

상기 실시예 [5-1]의 실험 기간 동안 일주일에 한번 일정한 시간에 마우스들의 체중을 측정하였다. 체중 증가율(%)은 0주차와 10주차에 해당하는 체중 값으로 하기 수학식 2에 따라 산출되었고, 그 결과를 표 9에 기재하였다.

[수학식 2]

(Wt_10w는 10주차의 체중 값이고, Wt_0w는 0주차의 체중 값임)

또한, 상기 실시예 [5-1]에서 10동안 실험을 진행한 다음, 상기 마우스들을 18시간 동안 절식시키고 에테르로 마취시킨 후 희생시켰다. 희생된 마우스의 부고환 지방(epididymal fat)과 서혜부 지방(inguinal fat)으로부터 백색 지방 조직(white adipose tissue, WAT)을 적출하여 무게를 측정하여 하기 표 10에 함께 기재하였고, 부고환 지방은 디지털 카메라(NX-300M, 삼성)로 촬영하여 크기를 비교하여 도 6에 도시하였다.

군	체중 증가율(%)	지방 무게(g)
음성 대조군 (ND)	27.9±3.5	1.2±0.2
양성 대조군 (HFD)	58.3±6.7	3.5±0.4
실험군 (HFD+Pro)	49.7±7.7	2.6±0.6

상기 표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)의 경우에, 고지방 식이만을 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에 비해 체중 증가율이나 내장 지방의 증가 정도가 훨씬 낮아지는 것으로 확인되었다.

아울러, 도 6에 도시된 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)의 경우에는 부고환 지방의 크기가 정상 식이를 섭취시킨 음성 대조군(ND)의 경우와 비슷하여, 고지방 식이만을 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에 비해 훨씬 작은 것으로 확인되었다. 또한, 지방세포의 크기 역시 실험군(HFD+Pro)의 경우에 정상 식이를 섭취시킨 음성 대조군(ND)의 경우와 비슷하여, 고지방 식이만을 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에 비해 훨씬 작은 것으로 확인되었다.

[5-3] 혈청 내 지질 함량 확인

상기 실시예 [5-2]에서 희생시킨 모든 마우스를 대상으로 심장 천공법(cardiac puncture)으로 혈액을 채취하였고, 채취한 혈액 시료를 혈청 분리 튜브(serum separating tube)에 담아 4℃에서 2,339ㅧg로 10분간 원심분리한 다음, 상등액(혈청)을 회수하였다. 상기와 같이 얻어진 혈청에서 화학 분석기(BS-200E, Mindray, China)로 혈청 중성지방과 총 콜레스테롤의 함량을 측정하였고, Mouse/Rat Leptin ELISA Kit(Morinaga institute of biological science, Inc, Yokohama, Japan)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 혈청 렙틴의 함량을 측정하였고, 그 결과를 도 7에 도시하였다.

도 7에 도시된 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)의 경우에는 중성지방의 함량, 총 콜레스테롤의 함량 및 렙틴의 함량이 모두 정상 식이를 섭취시킨 음성 대조군(ND)의 경우와 비슷하여, 고지방 식이만을 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에 비해 훨씬 낮은 것으로 확인되었다.

[5-4] 지방 조직 내에서 비만 조절 인자의 유전자 발현 수준 확인

[5-4-1] mRNA의 확보 및 cDNA 합성

상기 실시예 [5-2]에서 마우스를 희생시켜 얻은 백색 지방 조직(white adipose tissue, WAT)과, 상기 희생된 마우스에서 추가로 적출하여 얻은 간 조직과 갈색 지방 조직(brown aidpose tissue, BAT)을 mRNA 추출을 위해 RNAlater(Qiagen, Hilden, German)에 저장하였다.

먼저, 간과 BAT를 대상으로 RNease mini kit(Qiagen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 mRNA를 추출하였다. 상기 두 조직을 각각 스테인리스 스틸 비드가 포함되어 있는 microcentrifuge tube에 넣고, TissueLyser LT(Qiagen)으로 용해 및 균질화시켰다. 그런 다음, 그 용출물을 원심불리시킨 후 상등액을 새로운 microcentrifuge tube에 옮겨 담고, 에탄올을 첨가하여 혼합하였다. 상기 혼합물을 회수 튜브(collection tube)에 위치한 RNeasy Mini spin 컬럼으로 옮겨 원심분리시키고, 통과액을 제거한 후, 세척과 원심분리 과정을 2차례 더 반복하였다. 그런 다음, RNase가 없는 물을 상기 컬럼에 첨가하고 원심분리하여 RNA를 용출시켜내었다. 상기와 같이 용출된 mRNA는 -20℃에서 보관하여 후속 실험에 이용하였다.

다음으로, WAT를 대상으로 RNeasy lipid tissue mini kit(Qiagen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 mRNA를 추출하였다. WAT 샘플 100mg을 QIAzol Lysis Reagent에 넣고 TissueLyser LT(Qiagen)으로 용해 및 균질화시켰다. 그런 다음, 클로로포름을 첨가하여 혼합하고 저온에서 원심분리하여 층을 분리시켰다. 상부 수성 상(upper aqueous phase)을 조심스럽게 회수하여 에탄올과 혼합하였고, 상기 간과 BAT에서 mRNA를 얻은 과정과 같은 방법으로 세척 및 용출 과정을 수행하여 mRNA를 수득하였다.

상기와 같이 얻어진 mRNA로부터 QuantiTect Reverse Transcription kit(Qiagen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 합성하였다. 상기와 같이 수득한 mRNA 샘플 1μg에 2μL의 gDNA Wipeout buffer(Qiagen)를 첨가하고 42℃에서 2분 동안 반응시켜 mRAN 샘플로부터 gDNA를 제거한 다음, cDNA 합성을 위한 반응물(1μL의 Quantiscript reverse transcriptase, 4μL의 5ㅧQuantiscript RT buffer, 1μL의 RT Primer mix)을 첨가하고 다시 42℃에서 15분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 반응물을 95℃에서 3분 동안 반응시켜 Quantiscript reverse transcriptase를 불활성화시킴으로써, cDNA의 합성을 완료하였다.

[5-4-2] 백색 지방 조직 내에서 비만 조절 인자의 유전자 발현 수준 확인

상기 실시예 [5-4-1]에서 합성한 WAT의 cDNA를 대상으로, 하기 표 11에 기재된 바와 같은 프라이머쌍을 이용하여 qRT-PCR을 수행함으로써, 지방세포 특이적 유전자인 PPAR-γ의 mRNA 발현량을 측정하고, 그 결과를 도 8의 A에 도시하였다.

유전자	방향	프라이머 서열 (5'->3')	출처
Ppar -γ	정방향	GCT TCC ACT ATG GAG TTC ATG CT	Lu et al., 2013
	역방향	CCG GCA GTT AAG ATC ACA CCT AT
Cpt -2	정방향	GCC TGC TGT TGC GTG ACT G	Yoo et al., 2013
	역방향	TGG TGG GTA CGA TGC TGT GC
Ucp -1	정방향	GTG AAG GTC AGA ATG CAA GC	Inokuma et al., 2006
	역방향	AGG GCC CCC TTC ATG AGG TC
Ucp -2	정방향	GGC TGG TGG TGG TCG GAG AT
	역방향	CCG AAG GCA GAA GTG AAG TG
SREBP	정방향	AAG CAA ATC ACT GAA GGA CCT GG	Schupp et al., 2013
	역방향	AAA GAC AAG GGG CTA CTC TGG GAG
chREBP	정방향	AGA TGG AGA ACC GAC GTA TCA	Gao, Bu, Ma, & Liu, 2013
	역방향	ACT GAG CGT GCT GAC AAG TC
GAPDH	정방향	TCC TGC ACC ACC AAC TGC TTA G	Hsu et al., 2013
	역방향	TGC TTC ACC ACC TTC TTG ATG TC

도 8에 도시된 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)의 경우에 PPAR-γ의 mRNA 발현량이 고지방 식이만을 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에 비해 낮은 것으로 확인되었다.

[5-4-3] 간 조직 내에서 비만 조절 인자의 유전자 발현 수준 확인

상기 실시예 [5-4-1]에서 합성한 간의 cDNA를 대상으로, 상기 표 11에 기재된 바와 같은 프라이머쌍을 이용하여 qRT-PCR을 수행함으로써, 지방세포 특이적 유전자인 SREBP-1와 간 세포에서 당 대사 조절을 통한 지방합성에 관여하는 chREBP(carbohydrate responsive element binding protein)의 mRNA 발현량을 측정하고, 그 결과를 도 8의 B에 도시하였다.

도 8에 도시된 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)의 경우에 SREBP-1와 chREBP의 mRNA 발현이 모두 정상 식이를 섭취시킨 음성 대조군(ND)의 경우와 비슷하여, 고지방 식이만을 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에 비해 훨씬 낮은 것으로 확인되었다.

[5-4-4] 갈색 지방 조직 내에서 비만 조절 인자의 유전자 발현 수준 확인

상기 실시예 [5-4-1]에서 합성한 BAT의 cDNA를 대상으로, 상기 표 11에 기재된 바와 같은 프라이머쌍을 이용하여 qRT-PCR을 수행함으로써, 지방산을 분해하고 에너지로 전환하는 지방산의 β-산화 과정에 필수적으로 필요한 효소인 Cpt-2(carnitine palmitoyl transferase 2)와 미토콘드리아막에서 산화적 인산화의 과정에서 발생되는 수소 이온이 ATP의 합성에 이용되지 못하도록 하여 에너지를 열로 낭비되도록 하여 체지방을 감소시키는 역할을 하는 Ucp-1(Uncoupling protein 1)의 mRNA 발현량을 측정하고, 그 결과를 도 8의 C에 도시하였다.

도 8에 도시된 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)의 경우에 Cpt-2와 Ucp-1의 mRNA 발현이 모두 정상 식이를 섭취시킨 음성 대조군(ND)나 고지방 식이만을 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에 비해 훨씬 높은 것으로 확인되었다.

[5-5] 장관 내 미생물 분석

생물 군집 분석을 위한 메타게놈 DNA를 분리할 때 주의할 점은 원래의 군집 구조를 그대로 반영할 수 있는 DNA를 얻는 일이다. 장관 내에는 그람 양성균과 그람 음성균이 함께 존재하므로 그람 음성균에 비해 비교적 세포벽이 견고한 그람 양성균의 DNA도 함께 추출할 수 있는 방법이 필요하다. 이를 위해 PowerFecalㄾ DNA Isolation Kit(MO BIO, Germany)를 이용하여 상기 실시예 [5-2]에서 희생시킨 모든 마우스의 장관 내 미생물의 메타게놈 DNA를 추출하였다. DNA 아가로오스 젤 전기영동과 UV spectrophotometer를 이용하여 추출한 유전자의 순도와 양을 확인하였으며, 16S rRNA 유전자의 융합 프라이머(fusion primer)를 이용하여 PCR을 수행함으로써 분리된 DNA의 PCR 유효성을 검증하였다.

[5-5-1] 장관 내 미생물균총의 16S rRNA 유전자 서열 분석

상기 실시예 [5-2]에서 희생시킨 마우스 분변으로부터 PowerFecalㄾ DNA Isolation Kit (MO BIO, Germany)를 이용하여 장관 내 미생물의 메타게놈 DNA를 추출하였다. 상기와 같이 추출한 메타게놈 DNA로부터 16S rRNA 유전자의 HVR(hyper-variable region) 중 V3-V4 영역을 선택적으로 증폭한 후에 DNA 서열을 분석하였다(Chun Lab.에서 Illumina 사의 MiSeq 장비를 이용하여 수행하였다). 상기와 같이 DNA 서열 정보를 확보한 후에, 서열 품질(sequence quality)이 기준에 미달하는 시료를 우선 제거하였으며, 품질 기준을 통과한 시료로부터 키메라(chimera) 서열을 제거하였다. 다음으로, pyrosequencing visualization software인 QIIME pipeline에 기초하여 균총 분석을 진행하였으며, 16S rRNA 유전자 데이터베이스인 Greengenes database(v.13_8)를 이용한 OTU를 검색하였다. 미생물 군집의 다양성 지수를 비교하기 위하여 α-diversity를 분석하였고, 그 결과를 도 9에 도시하였다.

도 9의 A는 종 풍부도(species abundance)를 나타내는 ACE(abundance coverage estimate)와 Chao1 지수를 나타낸 것으로서, 정상 식이르 섭취시킨 음성 대조군(ND)에 비하여 고지방 식이만을 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에서 종 풍부도가 높아지는 경향을 나타내었으며, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)에서는 양성 대조군(HFD)에 비하여 종 풍부도가 감소하였고 이는 음성 대조군(ND)과 비슷한 수치를 나타내는 것을 확인하였다.

도 9의 B는 종 다양성(species diversity)을 나타내는 지표인 Shannon과 Simpson 지수로서, 종 풍부도와 달리 음성 대조군(ND)에 비하여 양성 대조군(HFD)의 종 다양성이 낮아지는 경향을 나타내었으며, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리하는 것이 종 다양성의 변화에 큰 영향을 끼치지는 않는 것으로 확인되었다.

[5-5-2] 장관 내 미생물 군집 분석

상기 확보한 장내 균총의 DNA 서열 정보를 기반으로 통계분석 소프트웨어인 R (v. 3.3.2; R Core Team, Auckland, New Zealand)을 이용하여 다변량 분석을 수행하였다. 그룹간 미생물 분포도의 유의성 검증을 위하여 비모수 균총 데이터를 표준화시킨 후, t-test 및 ANOVA 방법으로 검증하였고, 그 결과를 도 10 및 도 11에 도시하였다.

다변량 분석(discriminant analysis of principal components, DAPC)은 군별 균총의 상대적 분포도(abundance)를 이용하여 각 군 간의 미생물 분포 차이를 거리로 나타낸 것으로서, 도 10에서 보는 바와 같이 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군의 미생물 균총이 음성 대조군(ND)과 다르게 클러스터링(clustering)되는 것으로 보아 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리에 의해 장내 균총의 구성이 변화됨을 확인할 수 있었다.

또한, 문(phylum)과 속(genus) 수준에서 균총을 분석한 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 문 수준에서는 모든 군에서 Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Verrucomicrobia 문이 주로 분포하는 것을 확인하였다. 그 중 대표적으로 비만과 양의 상관관계를 갖는 것으로 알려진 Firmicutes/Bacteroidetes 비율이 고지방 식이를 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에서 증가하는 반면, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)에서는 감소하는 것을 확인하였다. 또한 비만과 음의 상관관계를 가지고 있다고 알려져 있는 Bacteroidetes 문이 실험군(HDF+Pro)에서 상대적으로 높은 비율로 존재하는 것으로 확인되었다. 한편, 속 수준에서는 지방분해 효소 분비를 촉진하는 Bacteroides와 염증이나 비만 예방 효과가 있는 미생물 Akkermansia가 고지방 식이를 섭취시킨 양성 대조군(HFD)에서 감소하는 반면, 락토바실러스 람노서스 4B15 균주를 처리한 실험군(HFD+Pro)에서 높은 비율로 존재하는 것을 확인하였다. 또한 상기와 같은 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 섭취로 인해 대표적 장내 유익 유산균 중 Lactobacillus 속이 높은 비율로 증가하였으며, 양성 대조군(HFD)에서 높은 비율로 존재하는 유해균인 Helicobacter 속이 락토바실러스 람노서스 4B15 균주의 처리로 인해 상당 부분 감소된 것으로 확인되었다.

상기에서는 본 발명의 대표적인 실험예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실험예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (9)

1. 수탁번호 KCCM11983P로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 4B15 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 중성지방의 축적을 억제하거나, 또는 중성지방의 분해를 촉진하는 것인, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 비만의 예방 또는 개선은 PPAR-γ, CREB/P, SREBP-1c, FAS, FABP 및 LPL로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 억제하거나, 또는 HSL의 발현을 촉진하는 것인, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   동결보호제를 더 포함하는 것인, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
5. 수탁번호 KCCM11983P로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 4B15 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 중성지방의 축적을 억제하거나, 또는 중성지방의 분해를 촉진하는 것인, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
6. 수탁번호 KCCM11983P로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 4B15 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 중성지방의 축적을 억제하거나, 또는 중성지방의 분해를 촉진하는 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제

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