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KR102311300B1 - 칼륨 이온 항상성 교란을 통해 소포체 스트레스 매개 세포 자멸사를 유도하는 나선형 폴리펩타이드 기반 칼륨 이오노포어 - Google Patents

칼륨 이온 항상성 교란을 통해 소포체 스트레스 매개 세포 자멸사를 유도하는 나선형 폴리펩타이드 기반 칼륨 이오노포어 Download PDF

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KR102311300B1
KR102311300B1 KR1020200045779A KR20200045779A KR102311300B1 KR 102311300 B1 KR102311300 B1 KR 102311300B1 KR 1020200045779 A KR1020200045779 A KR 1020200045779A KR 20200045779 A KR20200045779 A KR 20200045779A KR 102311300 B1 KR102311300 B1 KR 102311300B1
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KR
South Korea
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cancer
pharmaceutical composition
cells
aip
peptide compound
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KR1020200045779A
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English (en)
Inventor
김유천
이대용
하종훈
Original Assignee
한국과학기술원
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Abstract

본 발명은 칼륨 이온의 항상성 교란을 통해 소포체 스트레스 매개 세포 자멸사를 유도하는 나선형 폴리펩타이드 기반 이오노포어, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈관 신생 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

칼륨 이온 항상성 교란을 통해 소포체 스트레스 매개 세포 자멸사를 유도하는 나선형 폴리펩타이드 기반 칼륨 이오노포어{A Helical Polypeptide-Based Potassium Ionophore Induces Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Apoptosis by Perturbing Ion Homeostasis}
본 발명은 칼륨 이온의 항상성 교란을 통해 소포체 스트레스 매개 세포 자멸사를 유도하는 나선형 폴리펩타이드 기반 이오노포어, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈관 신생 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 세포가 무한히 증식해 정상적인 세포의 기능을 방해하는 질병으로, 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 통제되지 못하고 과다하게 증식하며, 주위 조직이나 장기에 침입하여 정상 조직의 파괴를 초래한다. 암이 발생하는 부위는 제한되지 않으며, 암이 발생하는 원인은 아직도 정확히 밝혀진 바 없다. 지금까지 알려진 바에 따르면 정상적인 세포의 유전자에 돌연변이가 생겨서 나타난다고 알려져 있다. 유전자 발현의 이상은 모든 암의 공통적인 특징인 조절불능의 세포 성장 및 탈분화와 밀접하게 관련되어 있다. 다수의 암 연구에 따르면, 특정 암을 갖는 개체의 게놈에서는 일반적으로 종양 억제유전자로 불리며 정상적으로는 무분별한 세포의 분열과 과잉 성장을 억제하는 기능을 하는 열성유전자의 발현이 감소되며, 정상세포를 암세포로 변형시키는 능력을 갖는 종양유전자가 과다발현된다. 따라서, 유전자 발현과 암의 발병 또는 진행과의 관계에 기초하여 정상세포 대비 암세포에서 특이적으로 과발현되거나 또는 그 발현이 억제되는 유전자를 탐색하면 암 진단이나 치료의 표적을 개발할 수 있다.
지난 수십 년간 암을 정복하기 위해 세포주기나 세포 자멸사(apoptosis)의 조절과 발암유전자나 종양억제유전자를 포함하는 새로운 표적을 모색함에 있어서 눈에 띄는 발전을 거듭해 왔음에도 불구하고 암의 발생률은 문명이 발달됨에 따라 증가하고 있다. 현재, 암환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 40여종의 강한 세포독성을 보이는 항암물질 투여에 의한 화학요법에 의존하고 있는데, 이들 치료법도 대부분 조기 암환자나 특정 암에만 국한되어 암으로 인한 사망은 계속 증가하고 있는 추세이다.
현재 사용되고 있는 항암제들은 효소제제나 백신 등의 생물학적 제제, 순수합성 의약품 및 천연물 유래의 의약품 등으로 크게 구분할 수 있다. 이 중 유전자, 효소, 백신 등을 이용한 항암제는 실용단계에 있는 상태가 아니며, 화학요법에 의해 개발된 많은 항암제는 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에, 암 치료 시에 문제점으로 지적되고 있다. 또한 항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하기도 하지만, 때로는 정상세포에 대해서 독성을 나타내기도 한다. 따라서 항암제의 이 같은 독성의 작용기전을 밝히기 위하여 많은 연구가 수행되고 있고, 근래에는 세포 배양 기술이 급격히 발달함에 따라 각종 세포를 배양한 후, 여러 독성물질을 투여함으로써 이들의 세포독성에 대한 기전을 세포 수준에서 규명하려는 연구도 활발히 진행되고 있다.
한편, 칼륨의 전기화학적 구배는 활성 수송 메커니즘에 따라 칼륨 양이온의 수송을 구동하는 칼륨 채널로 조절되며, 예를 들어, 세포 외 K+ 수준은 5mV, 세포 내 K+ 수준은 150mV로 조절될 수 있다. 이러한 막전위의 분극은 세포 성장, 물질 대사 및 세포 자멸사와 같은 다양한 생물학적 반응에 관여한다. 따라서, 칼륨 항상성의 교란을 유도하는 물질의 개발은 세포 자멸사를 유발하는 새로운 전략이 될 수 있다.
혈관 신생(angiogenesis)이란 기존의 혈관으로부터 새로운 모세혈관이 만들어지는 것을 뜻한다. 정상적인 생리조건에서는 거의 일어나지 않는 엄격히 조절되는 현상이나 수정란 발생과정에서 배아가 발달될 때와 성인의 경우 상처가 치유될 때 그리고 여성의 생식주기에서 생식기계통의 변화 등에서 일어난다. 성인의 경우 모세혈관의 내 피세포는 상대적으로 잘 분열하지 않으며 분열속도는 보통 수개월 내지 수년이다. 혈관 신생은 여러 종류의 세포 와 수용성 인자 및 세포외 기질(extracellular matrix) 성분과의 상호작용에 의한 복잡한 과정으로 일어나며 아 직 그 작용 기전이 완전히 규명되어 있지 않다. 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 거의 모든 세포에서 분비되며, 종양의 침투성과 깊은 관계가 있다. 직접적인 혈관형성인자 외에도 비특이적 인자들인 aFGF, bFGF, TGF, EGF, PDGF, MMP, 혈소판-유래 내피세포 성장인자(platelet-derived endothelial cell growth factor), 안지오제닌(angiogenin), IL-8, MIP, PF4 등이 혈관 형성에 관여한다. 또한, VEGF의 발현 및 작용기전에 대한 연구와 함께 이를 조절하는 상위의 신호전달 과정을 저해함으로써 신생혈관형성을 억제할 수 있는 것에 대한 연구가 활발하다(오중협, et al. "VEGF에 의한 각막 신생혈관 생성 및 MMP-2, 9, TIMP-1, 2, flk-1의 발현." (2001): 1053-1062.).
본 발명의 목적은, 칼륨 이온의 항상성 교란을 통해 소포체 스트레스 매개 세포 자멸사를 유도하는 펩타이드 화합물과, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 펩타이드 화합물을 포함하고, 혈관 신생 관련 단백질의 발현을 하향 조절하며, 혈관내피세포 마커인 CD31의 발현을 억제할 수 있는 혈관 신생 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112020039083199-pat00001
(상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-12-크라운 4-에터, 1-아자-15-크라운 5-에터, 1-아자-18-크라운 6-에터, 4,10-디아자-12-크라운 4-에터, 4,10-디아자-15-크라운 5-에터 또는 4,13-디아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임).
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112020039083199-pat00002
(상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-12-크라운 4-에터, 1-아자-15-크라운 5-에터, 1-아자-18-크라운 6-에터, 4,10-디아자-12-크라운 4-에터, 4,10-디아자-15-크라운 5-에터 또는 4,13-디아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임).
일 측에 따르면, 상기 암은 유방암, 폐암, 난소암, 골육종, 대장암, 식도암, 십이지장암, 간암, 신장암, 췌장암, 위암, 두경부암, 흑색종, 후두암, 갑상선암, 자궁경부암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 펩타이드 화합물은 칼륨 이온 수송 활성을 가질 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 펩타이드 화합물은 소포체 스트레스에 의한 세포 자멸사를 유발할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조성물은 항암제와 병용하여 투여될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 항암제는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클 로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴 (lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴 (cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신 (dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루 비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C(mitomycin C) 및 블레오마이신(bleomycin); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 테니포시드 (teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물을 포함하는, 혈관 신생 억제용 약학적 조성물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112020039083199-pat00003
(상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-12-크라운 4-에터, 1-아자-15-크라운 5-에터, 1-아자-18-크라운 6-에터, 4,10-디아자-12-크라운 4-에터, 4,10-디아자-15-크라운 5-에터 또는 4,13-디아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임).
일 측에 따르면, 상기 펩타이드 화합물은 CD31의 발현을 억제할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 펩타이드 화합물은 VEGF(vascular endothelial growth factor), MMP-2(Matrix metalloproteinase-2) 및 MMP-9(Matrix metalloproteinase-9)를 포함하는 혈관 신생 관련 단백질의 발현 수준을 하향 조절할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조성물은 당뇨병성 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관 신생 관련 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 화합물은 세포질 내로 칼륨 이온을 수송할 수 있으며, 그 결과로 칼륨 이온 항상성을 교란하여 소포체 스트레스를 유도할 수 있다. 결과적으로, 이러한 소포체 스트레스는 카스파아제 경로와 무관하게 세포 자멸사(apoptosis)를 유발하게 된다.
이와 같이, 본 발명의 펩타이드 화합물은 세포 자멸사 유도를 통해 암 세포의 성장을 강하게 억제하므로, 암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드 화합물은 혈관 신생 관련 단백질인 MMP-2, MMP-9, VEGF의 발현을 하향 조절하고, CD31의 발현을 억제하므로, 혈관 신생을 저해할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 칼륨 이온의 항상성 교란에 의해 유발된 소포체 스트레스 매개 세포 자멸사의 메커니즘을 도식화한 것이다.
도 2는, 본 발명의 펩타이드 화합물의 구조(a), 각 AIP의 CD 스펙트럼(b), PBFI 로딩된 LUVs를 이용하여 AIP, 발리노마이신, DMSO 및 HEPES의 칼륨 이온 수송 역학을 나타낸 것(c), AIP 처리 후 세포 내 칼륨(d), 나트륨(e), 염소(f), 칼슘(g) 이온의 수준을 시간에 따라 측정한 결과, 칼륨 이온 및 칼슘 이온 채널 차단제의 존재 하에서 상대적인 칼륨(h) 및 칼슘(i) 이온 수준을 측정한 것이다.
도 3은 세포 내 AIP를 CLSM으로 추적한 것으로, a는 0.5, 1, 3, 6시간에서 지질 세포막에 결합한 AIP를 시각화한 것(적색: WGA, 녹색: AIP, 청색: DAPI, 스케일 바; 10μm)이고, b는 AIP의 표적인 세포 내 소기관, 미토콘드리아, 소포체 및 리소좀(스케일 바; 10μm)을 시각화한 것이며, c는 미토콘드리아, 소포체 및 리소좀에서 AIP의 동일 위치에 대한 계수(Colocalization coefficient)를 Manders and Pearson 방법으로 측정하여 비교한 것이다.
도 4는 소포체 스트레스가 세포 자멸사를 유도하는 신호 전달 경로를 나타낸 것(a), AIP(0.25 μM) 처리 후 상대적인 칼페인 활성(b), CLSM을 이용하여 AIP 처리 0.5, 1, 6, 12 시간 후에 측정한 상대적인 CHOP 발현 수준(c), 소포체 스트레스 관련 단백질의 웨스턴 블롯팅 결과(d), 소포체 스트레스 경로는 카스파아제 의존 경로에 의해 조절되지 않음을 확인하기 위한 웨스턴블롯팅 결과로, ZVAD-FMK(40 μM)의 존재, 부재 하에서 대조군과 AIP2를 처리한 경우를 비교한 것(e)(스케일바; 10 μm), ZVAD-FMK(40 μM)의 존재, 부재 하에서 CHOP의 면역 형광 이미지(f)를 나타낸다. **p <　0.01, ***p　<　0.005, ****p < 0.0001
도 5는 AIP(0.25 μM) 처리 후 ROS를 시각화한 것(스케일바; 20 μm)(a), ROS를 정량화 한 것(b), GSH 수준(%)을 정량화 한 것(c), 미토콘드리아 막 전위의 탈분극을 JC-1로 분석한 것(d), 칼세인-AM-양성인 세포의 변화로 표현한 미토콘드리아 전이 기공 분석 결과(d), 세포 자멸사 관련 단백질 (Bcl-2, Cyto C: cytochrome C, C.cas-3: cleaved caspase-3, Cas-3: caspase-3, C.PARP-I: cleaved PARP-I)의 면역 블롯팅 결과(e), Ac-DEVD-p-니트로아닐린, 카스파아제-3 기재를 이용하여 405nm에서의 흡광도로 정량화한 카스파아제-3 활성(g), FITV-아넥신 V, PI 염색 후 유세포 분석으로 평가한 세포사멸 비율(h)이다. **p <　0.01, ***p　<　0.005, ****p < 0.0001
도 6의 a, b는 종양 이식된 마우스 모델에 HEPE와 AIP(2 mg/kg)를 처리한 후 종양 부피 및 체중을 나타낸 것이고(AIP1, AIP2, AIP3: n = 6, AIP4: n = 4, 종양 부피; S.E., 체중; S.D.), c는 23일 째에 희생된 마우스의 절제된 종양 조직의 광학 이미지, d는 종양 섹션의 H&E, TUNEL, CHOP, 및 c.cas-3: cleaved caspase-3에 대한 면역조직화학 분석 결과를 나타낸다(모든 이미지는 광학 현미경(배율: 400X)으로 촬영됨). e 및 f는 세포 자멸사 관련 단백질에 대한 종양 조직의 면역 블롯팅 분석 결과, g는 DAPI(청색 형광), Mitotracker Red(적색 형광)로 염색한 종양 조직을 사용하여 cyto C(녹색 형광) 및 AIF (녹색 형광)의 면역 형광 이미지를 나타낸다(CLSM, 배율: 400X). *p < 0.05, ****p < 0.0001
도 7은 혈관 마커 CD31에 대한 종양 섹션의 면역조직화학 분석 결과이다(광학 현미경 배율: 400X)
도 8은 in vitro에서 혈관 신생 관련 단백질((VEGF: vascular endothelial growth factor, MMP-2: matrix metalloproteinase-2, MMP-9: matrix metalloproteinase-9)의 면역 블롯팅 결과이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112020039083199-pat00004
(상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-12-크라운 4-에터, 1-아자-15-크라운 5-에터, 1-아자-18-크라운 6-에터, 4,10-디아자-12-크라운 4-에터, 4,10-디아자-15-크라운 5-에터 또는 4,13-디아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임)
상기 식에서, x, y, z는 반복단위 수를 의미하는 것이며, 구체적으로 x, y는 30, 31, 32, 33, 34, 35, z는 58, 59, 60, 61, 62일 수 있다.
상기 펩타이드 화합물은 크라운 에터 모이어티에 의해 수용성을 나타내고, 칼륨 수송 특성을 가진다. 또한, 테트라메틸암모늄기 및 탄화수소 사슬은 지질 원형질막과 폴리펩타이드의 상호작용이 가능하게 하므로, 상기 펩타이드 화합물은 생체 내에서 칼륨 이오노포어(ionophore)로서 작용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “이오노포어(ionophore)”는 친수성의 이온과 결합하여 이온이 세포막을 통과하여 이동할 수 있게 하는 물질로서, 세포막 통과를 용이하게 하도록 지용성을 가지는 물질을 의미한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112020039083199-pat00005
(상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-12-크라운 4-에터, 1-아자-15-크라운 5-에터, 1-아자-18-크라운 6-에터, 4,10-디아자-12-크라운 4-에터, 4,10-디아자-15-크라운 5-에터 또는 4,13-디아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임).
상기 암은 유방암, 폐암, 난소암, 골육종, 대장암, 식도암, 십이지장암, 간암, 신장암, 췌장암, 위암, 두경부암, 흑색종, 후두암, 갑상선암, 자궁경부암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 기재한 바와 같이, 상기 펩타이드 화합물은 칼륨 이온 수송 활성을 가지므로 칼륨 이온 항상성을 교란시킬 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 화합물은 교란된 칼륨 이온 항상성을 유발하여 소포체 스트레스를 자극하고, 결과적으로 세포 자멸사를 유발할 수 있다.
상기 암은 폐암 또는 유방암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 약학적 조성물은 대장암, 간암, 췌장암, 두경부암, 전립선암, 난소암, 흑색종, 후두암, 자궁경부암, 신장암, 식도암, 위암, 갑상선암 등의 암 치료에 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 안정화제, 방부제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성성분 외에 서방성 목적으로 사용되는 기제를 포함하여 활성성분의 방출이 천천히 일어나도록 서방형 제제로 제조될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대， 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분， 셀를로스 유도체， 마그네슘 스테아레이트， 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러， 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한， 비경구 투여용 담체는 물， 적합한 오일， 식염수， 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸 -또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제， 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다.　
상기 희석제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유, 땅콩유와 같은 식물성유 등의 비수성 용매나 염수(바람직하게는 0.8%의 염수), 완충 매질을 포함한 물(바람직하게는 0.05M의 인산염 완충액) 등의 수성 용매 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 무수 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 안정화제로는 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트, 글루코스 등의 탄수화물이나 분유, 혈청 알부민, 카제인 등의 동물성, 식물성 또는 미생물성 단백질 등의 단백질을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방부제로는 티메로살, 메르티올레이트, 젠타마이신, 네오마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 테트라사이클린, 페니실린, 스트렙토마이신, 폴리믹신 B 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있으며, 예를 들어 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여 방법으로는 정맥내， 근육내， 동맥내， 골수내, 경막내 심장내， 경피， 피하， 복강내， 비강내, 장관, 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 요법에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다.　 이는 제제화 방법, 투여경로 치료횟수 뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 증상, 투여시간 및 방법 등 다양한 요인들을 고려하여 결정될 수 있다. 이러한 점을 고려할 때, 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 있어 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물 이외에 공지된 항암제를 포함하거나, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 항암치료와 병용될 수 있다. 다른 항암치료에는 화학요법, 방사선치료, 호르몬 치료, 면역치료 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되거나, 병용될 수 있는 항암제는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클 로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴 (lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴 (cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신 (dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루 비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C(mitomycin C) 및 블레오마이신(bleomycin); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 테니포시드 (teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물을 포함하는, 혈관 신생 억제용 약학적 조성물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112020039083199-pat00006
(상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-12-크라운 4-에터, 1-아자-15-크라운 5-에터, 1-아자-18-크라운 6-에터, 4,10-디아자-12-크라운 4-에터, 4,10-디아자-15-크라운 5-에터 또는 4,13-디아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임).
본 명세서에서 용어 "혈관 신생(angiogenesis)"은 기존 혈관의 내피세포가 세포외 기질을 분해하고, 이동, 분열, 및 분화하여 새로운 모세혈관을 형성하는 현상을 의미하며, 이는 림프관신생(lymphangiogenesis)과는 구별되는 의미이다.
하기 실시예에서 기재한 바와 같이, 상기 펩타이드 화합물은 CD31의 발현을 억제할 수 있으며, VEGF(vascular endothelial growth factor), MMP-2(Matrix metalloproteinase-2) 및 MMP-9(Matrix metalloproteinase-9)를 포함하는 혈관 신생 관련 단백질의 발현 수준을 하향 조절할 수 있다.
따라서, 상기 혈관 신생 억제용 약학적 조성물은 당뇨병성 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관 신생 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 >
다음의 제조예에서, 화학식 1의 화합물 제조를 위한 중간체의 제조에 관한 예를 설명한다.
제조예 1. 폴리 ( N ε -- Cbz -L-리신-랜덤- N ε - TFA -L-리신)
Figure 112020039083199-pat00007
N ε 　 -Cbz-L-리신N-카복시안하이드라이(NCA) 및　N ε -TFA-L-리신 NCA를 기존 문헌에 기술된 바에 따라 제조하였다.　 글러브 박스에서,　N ε 　 -TFA-L-리신 NCA (1.75 g, 6.53mmol) 및　 N ε 　 -Cbz-L-리신NCA (3.00 g, 9.79mmol)을 헥사메틸디실라잔(22.6　μ　L, 0.108　mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (50 μL)　과 무수 DMF(20 mL) 중에서 용해시켰다. 중합은 실온에서 48 시간 동안 수행하였다.　 점성이 있는 용액을 과량의 탈이온수로 침전시키고, 백색 분말은 탈 이온수로 3회 세척하고, 백색 분말을 동결 건조하여 폴리(N ε -Cbz-L-리신-랜덤- N ε -TFA-L-리신)(3g)을 얻었다. GPC로 측정한 결과, 반복 단위 및 이의 다분산 지수는 각각 대략 150 및 1.07이었다.　 Cbz-리신 및 TFA-리신은 각각 NMR 분광으로 확인된 바와 같이 각각 대략 60 및 90이었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.30 (m, 3H), 8.40-7.80 (m, 5H), 7.30-7.00 (m, 8H), 4.95 (m, 4H), 2.00-1.00 (m, 40H).
제조예 2. 폴리 ( N ε - Cbz -L-리신-랜덤-L-리신)
Figure 112020039083199-pat00008
TFA 보호기는 탄산 칼슘을 이용하여 마일드한 염기 조건에서 제거하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.30-7.00 (m, 8H), 4.95 (m, 4H), 2.00-1.00 (m, 40H).
제조예 3. 폴리 ( N ε - Cbz -L-리신-랜덤- 하이드록시벤조일 -L-리신)
Figure 112020039083199-pat00009
폴리(N ε -Cbz-L-리신-랜덤-L-리신) (1.00 g)을 트리에틸아민 (리신 잔기 6당량) 및 4-아세토벤조일 클로라이드(리신 잔기 5당량)와 무수 DMF(10 ㎖) 중에서 용해시켰다.　 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반 하였다.　 미반응 시약을 제거하고 중간 생성물을 분리하기 위해, 혼합물을 과량의 포화 탄산나트륨 용액으로 침전시켰다.　 갈색 고체를 진공 여과로 분리하고, 탈이온수로 3회 세척하였다.　 갈색 고체를 1N NaOH 용액에 현탁시켜 에스테르기를 탈보호하고 에스테르 교환 반응을 실온에서 밤새 수행하였다.　 침전물이 관찰될 때까지 탁한 용액을 35wt% HCl 용액으로 천천히 처리하였다. 　갈색 분말을 여과로 분리하고, 탈 이온수로 3 회 세척하였다.　 갈색 분말을 동결건조하여 폴리(N ε -Cbz-L-리신-랜덤-하이드록시벤조일-L-리신)(0.93 g)을 얻었다.　 NMR 분광법에 의해 측정된 바와 같이,　변형 정도는　90%를 초과했다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.85 (m, 3H), 8.10 (m, 8H), 7.60 (m, 6H), 7.20 (m, 8H), 6.70 (m, 6H), 4.95 (m, 4H), 2.00-1.00 (m, 40H).
제조예 4. 폴리 ( N ε - Cbz -L-리신-랜덤-4-(5- 브로모펜톡시 ) 벤조일 -L-리신)
Figure 112020039083199-pat00010
폴리(N ε -Cbz-L-리신-랜덤-L-리신)(0.6 g)은, 탄산 칼륨(0.96 g, 70 mmol) 및 1,5-디브로모펜탄(페놀 모이어티 15당량)과 무수 DMF(10 ㎖) 중에서 용해시켰다. 반응 혼합물을 90　℃에서 1 일 동안　교반 하였다.　 혼합물을 디에틸에테르로 침전시키고 3회 세척하여 과량의 미반응 시약을 완전히 제거하였다.　 미정제 생성물을 탈 이온수로 세척하여 동결 건조 전에 염을 제거하고, 폴리(N ε -Cbz-L-리신-랜덤-4-(5-브로모펜톡시)벤조일-L-리신)을 얻었다. 　변형 정도는 피크의 소실(페놀의 -OH)로 인해 거의 100 %였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.10 (m, 8H), 7.60 (m, 6H), 7.20 (m, 8H), 6.70 (m, 6H), 4.95 (m, 4H), 2.00-1.00 (m, 70H).
제조예 5. 폴리 ( N ε - Cbz -L-리신-랜덤-4-(1-아자-18-크라운- 6에터펜톡시 ) 벤조일 -L-리신-랜덤-4-(5-트리메틸암모늄펜톡시)벤조일-L-리신)
Figure 112020039083199-pat00011
첫번째 단계에서, 1-아자-18-크라운-6(브롬기 1당량)를 폴리(N ε -Cbz-L-리신-랜덤-4-(5-브로모펜톡시)벤조일-L-리신)이 용해된 DMF 용액(10 ㎖)에 첨가하였다. 90℃에서 1일 동안 치환 반응을 수행하였다.　 그 후, 요오드화 나트륨 (브롬기의 3당량)이 함유된 트리메틸아민 용액(브롬기의 3 당량, 아세토니트릴 중 2M)을 첨가하여 트리메틸 암모늄 모이어티를 형성하였다.　 반응 혼합물을 포화 탄산나트륨 용액으로 침전시키고, 황색 침전물을 원심 분리로 분리하였다.　 분말을 탈이온수로 세척하고　동결 건조하여 폴리(N ε -Cbz-L-리신-랜덤-4-(1-아자-18-크라운-6에터펜톡시)벤조일-L-리신-랜덤-4-(5-트리메틸암모늄펜톡시)벤조일-L-리신)을 얻었다. 　총 변형도는 71.3% (1-아자-18-크라운-6의 35.1%, 트리메틸 암모늄 모이어티의 36.2 %)였으며, NMR 분광법으로 의해 정량화되었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.10 (m, 8H), 7.60 (m, 6H), 7.20 (m, 8H), 6.70 (m, 6H), 4.95 (m, 4H), 3.45 (m, 22H), 2.95 (m, 10H), 2.00-1.00 (m, 70H).
제조예 6. 폴리 (L-리신-랜덤-4-(1-아자-18-크라운-6 에테르펜톡시 ) 벤조일 -L- 리신-랜덤-4-(5- 트리메틸암모늄펜톡시 ) 벤조일 -L-리신) (AIP)
Figure 112020039083199-pat00012
N ε 　 -Cbz 보호기는 HBr을 이용한 산가수분해로 탈보호하여 AIP를 얻었다. 그 결과, 벤질기를 나타내는 피크가 완전히 제거되었다 (100 % 탈보호).　(도 S7)
AIP: 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.50 (m, 8H), 6.70 (m, 12H), 3.60-3.30 (m, 22H), 3.20-2.80 (m, 10H), 2.00-1.00 (m, 70H).
Figure 112020039083199-pat00013
다음으로, DMF(5ml)에 용해된 아세트산, 부티르산, 헥산산 또는 옥탄산을 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드(EDC) HCl (카복실산기의 3당량) 및 NHS (2당량의 카복실산기)를 사용하여 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 형태로 전환시켰다. 대응하는 R-NHS 에스테르(리신 잔기의 3당량)를 TEA로 가용화하고, 이를 AIP 용액(2mL, 탈이온수 중 1.2 mg/mL)에 천천히 부었다. 아미드화 반응을 실온에서 1일 동안 수행하였다. 이에 대한 생성물을 원심 분리로 분리한 후, 탈이온수로 3회 세척하였다. 폴리펩티드를 0.1N HCl(100 μL)로 처리하여 생성물에 양자를 가하고, 탈이온수로 투석하여 동결 건조 전에 과량의 HCl을 제거하여 아미드화를 진행했다.
AIP1 - 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.50 (m, 8H), 6.70 (m, 12H), 3.60-3.30 (m, 22H), 3.20-2.80 (m, 10H), 2.00-1.00 (m, 76H).
AIP2 - 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.50 (m, 8H), 6.70 (m, 12H), 3.60-3.30 (m, 22H), 3.20-2.80 (m, 10H), 2.00-1.00 (m, 84H).
AIP3 - 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.50 (m, 8H), 6.70 (m, 12H), 3.60-3.30 (m, 22H), 3.20-2.80 (m, 10H), 2.00-1.00 (m, 92H).
AIP4 - 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.50 (m, 8H), 6.70 (m, 12H), 3.60-3.30 (m, 22H), 3.20-2.80 (m, 10H), 2.00-1.00 (m, 100H).
이하 실시예에서 'AIP(Apoptosis-inducing polypeptides)'는 특별한 언급이 없는 한, 제조예 6에서 제조된 펩타이드 화합물 AIP1 ~ AIP4 화합물을 가리킨다(도 1의 a 참조).
실시예 1. 폴리펩타이드(AIP)의 2차 구조 결정
CD 분광계 (J-815 분광편광계 150-L타입, 일본 JASCO)를 사용하여 실온에서 200 내지 260 nm 범위의 경로 길이가 0.02 mm인 석영셀을 사용하여 2 차 단백질 구조를 확인하였다(도 2의 b).　 CD 스펙트럼은 100 nm/min 스캐닝, 1 nm 밴드 폭, 4 초 응답 시간, 1.0 nm 데이터 피치 및 10 축적으로 기록되었다.　 상기 제조예 6에서 제조된 AIP 샘플을 탈이온수에 용해시키고, 모든 농도를 1 mg/mL로 조정하였다.
도 2의 b를 참고하면, AIP는 탄화수소 사슬의 길이에 관계없이 온전한 나선형 구조를 가지는 것을 알 수 있다.
실시예 2. 칼륨 이온 수송 활성 평가
AIP의 칼륨 이온 수송 역학을 확인하기 위해, PBFI(potassium-binding benzofuran isophthalate)가 로딩된 LUV를 이용하였다. 인지질 박막(20mg/mL EYPC 클로로포름 용액 중 3mL)을 준비하였다. 　칼륨 유입은 LUV 용액(10mM HEPES, 100mM Et4NCl 및 75μM PBFI　중　2　mL)을 HEPES 완충용액(10 mM HEPES 및 100 mM KCl)에 대해 투석시켰다.　 상기 제조예 6에서 제조한 AIP들(0.25μM), DMSO (10μL)　및 발리노마이신(0.25μM)을　t　=30 초로　LUV 용액에 첨가하였다.　 시간에 따른 형광 강도를 330초 동안 형광 분석기로 측정하였다(λ　 ex=340nm의　λ em =500nm, 시간 간격=1초;　Gemini XPS 마이크로플레이트 리더, MOLECULAR DEVICES, USA).　 PBFI 유입(%)은 다음의 식을 이용하여 산출하였다(F t - F 0)/(F s - F 0) X 100 (%).
그 결과, 도 2의 c에 나타낸 바와 같이, PBFI 형광 강도는 AIP를 처리한 직후 급격히 상승하였고, 발리노마이신 역시 LUV로 칼륨을 유발시켰으나, 유입AIP와 비교하여 유입속도는 다소 지연되었다. 상기 결과를 통해 AIP는 칼륨에 대한 높은 선택성으로 칼륨 이온을 신속하게 수송할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 세포 내 이온 농도 측정
NCI-H460 세포(96-웰 플레이트에서 10,000 세포/웰)를 PBFI-AM, 9SBFI-AM (0.04% 플루로닉 F127-함유 PBS 중 0.9μM, ThermoFisher Scientific, USA), Fluo-3 AM(DMSO 중 0.9μM, Thermo Scientific, USA) 또는 MQAE (20μL,　0.04% 플루로닉 F127-함유 PBS 중 0.9μM, Santa Cruz Biotech, USA)으로 1.5시간(PBFI-AM, SBFI-AM) 또는 30분(Fluo-3 AM, MQAE) 동안 사전 염색하였다. 그 다음, PBS로 세 번 세척했다.　 AIP(0.25　μM)로　처리하기 전에 DMEM을 각 웰에 첨가하였다.　 각각의　형광 강도를 형광분석계(PBFI-AM, SBFI-AM;　λ　 ex=340 nm,　λ　 em=500nm, Fluo-3 AM;　λ　 ex=506 nm,　λ em=526, MQAE;　λ　 ex=350 nm,　λ　 em=460 nm)(Gemini XPS 마이크로 플레이트 리더, MOLECULAR DEVICES, USA)로 미리 정해진 시점에서 측정하였다.　
칼륨 이온 채널 차단제의 존재 하에서 세포 내 칼륨 수준을 검출하기 위해, NCI-H460 세포를 PBFI-AM 염색 후, AIP(0.25 μM), 테트라에틸암모늄클로라이드(1mM, Tokyo Chemical Industry Co., LTD., Japan) 및 세슘클로라이드(1mM, Daejung Chemical, Korea)로 함께 처리하였다.　 세포 내 칼륨 수준(%)은　F sample/F cont 　X100(%)으로 표현되었다. 　
칼슘 이온 채널 차단제의 존재 하에서 세포 내 칼슘 수준을 검출하기 위해, NCI-H460 세포를 Fluoro-3 AM 염색 후, AIP(0.25 μM) 및 칼슘 채널 차단제((+)-시스-딜티아젬　HCl(1μM, Tokyo Chemical Industry Co. LTD., Japan) 또는 베라파밀 HCl(1μM, Tokyo Chemical Industry Co., LTD., Japan　)와 함께 처리하였다.　　　세포 내 칼슘 수준 (%)은 F sample/F cont 　X100(%)으로 표현되었다.
그 결과, AIP를 처리한 군에서는 세포 내 칼륨 수준이 점진적으로 감소하였으나(도 2의 d), 나트륨과 염소 이온은 시간이 경과되어도 일정한 수준으로 유지되었고(도 2의 e 및 f), 세포 내 칼슘 농도는 점차적으로 증가하여, 칼륨 항상성 교란에 의해 칼슘이 세포질 내로 유입된 것을 확인할 수 있었다(도 2의 g).
또한, 칼륨 채널 차단제인 염화 세슘, 테트라에틸암모늄클로라이드를 AIP와 함께 첨가한 경우에도 AIP의 PBFI-AM 형광 수준이 유지되므로(도 2의 h), AIP가 칼륨 채널을 이용하지 않고, 스스로 칼륨 항상성을 교란시킬 수 있음을 알 수 있다. 한편, 칼슘 채널 차단제를 첨가한 경우에는 칼슘 채널 차단제가 없는 경우에 비해 급격히 칼슘 수준이 감소하여(도 2의 i), 칼륨 항상성의 교란은 칼슘 이온을 세포질로 운반하는 칼슘 채널을 활성화시키는 것으로 유추할 수 있다.
실시예 4. 세포 내 AIP의 추적
NCI-H460 세포 (24 웰 플레이트에서 80000 세포/웰)를 24웰 플레이트의 커버 슬립에 씨딩한 후, 1일 동안 안정화시켰다. 　PBS로 3 회 세척한 후 FITC로 표지 된 AIP(25nM)를 각 웰에 첨가한 다음, 0.5, 1, 3, 6 시간 동안 추가로 인큐베이션 하였다.　 각 웰을 PBS로 세번 조심스럽게 헹구었다. 그 다음, 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 10분 동안 고정시켰다.　 WGA　염색 용액의 Alexa Fluor 555 컨쥬게이트(PBS 중　5μg/mL, ThermoFisher Scientific, USA)를 각 웰에 5분 동안 첨가한 후, 세포를 DAPI 염색(300 nM) 전에 PBS로 3회 세척하였다).　 세포 이미지를 CLSM (LSM 800 META, ZEISS, Germany)로 얻었다.
그 결과, 도 3의 a에 나타낸 바와 같이 AIP의 녹색 형광은 3시간 후까지 적색 형광과 점진적으로 중첩되었으며, 이는 AIP 분자가 지질 세포막과 정전기적으로 상호작용함을 의미한다. 6시간 후에는 녹색 형광 신호가 지질막보다 세포질에서 관찰되었다.
다음으로, AIP의 세포 소기관에 대한 타겟팅 능력을 평가하기 위해, 미토콘들이ㅏ, 소포체 및 리소좀을 염색하여 시각화 하였다. NCI-H460 세포(24 웰 플레이트에서 80000 세포/웰)를 24 웰 플레이트의 커버 커버 슬립에 씨딩한 후, 1일 동안 안정화시켰다.　 리소좀, 미토콘드리아 및 소포체의 시각화를 위해, 세포를 Lysotracker deep red (50nM, ThermoFisher Scientific, USA), Mitotracker deep red (450 nM, ThermoFisher Scientific, USA) 또는 ER tracker Red (100 nM, ThermoFisher Scientific, USA)로 사전 염색하였다. 　세포 외 녹색 형광이 트리판블루 (PBS 중 0.1wt%)로 ??칭되기 전에 염색된 세포를 3 시간 동안 FITC-표지된 AIP(25 nM)로 처리하였다.　 미토콘드리아 시각화를 위해, 세포를 DAPI 염색 (300nM) 전에 4% 파라포름알데히드용액으로 고정시켰다.　 리소좀 및 ER 추적의 경우, 세포를　Hoechst 33258 염색　(PBS에서 5μg/mL, ThermoFisher Scientific, USA) 이후,　4 % FBS-포함 DMEM으로 처리하였다.　 세포를　CLSM(LSM 800 META, ZEISS, Germany)으로 시각화 하였다. Pearson and Manders colocalization 계수의 값은 ZEISS 현미경 소프트웨어 ZEN2로 정량화 하였다.　 오차 막대는 세가지 다른 이미지를 기반으로 S.D.로 나타냈다.
그 결과, 내재화된 AIP는 녹색 형광이 적색 형광과 중첩되지 않아 미토콘드리아, 소포체, 리소좀과 colocalization되지 않는 것으로 확인되었고(도 3의 b), Colocalization 계수 값 역시 모두 음의 범위에 있었기 때문에, AIP가 미토콘드리아와 리소좀을 표적으로 하지 않는다는 것을 알 수 있었다(도 3의 c). 소포체의 경우 AIP의 Manders 계수 값은 0.5를 약간 초과하였으나 Pearson 계수 값을 기준으로 하면 소포체에 위치하지 않았다. 이상의 결과는 본 발명의 AIP는 세포 소기관을 타겟팅하는 능력을 갖지 않고, 세포질에 남아있음을 시사한다.
실시예 5. 칼페인 활성 분석
NCI-H460 세포(6웰 플레이트에서 500,000 세포/웰)를 AIP(0.25μM)로 24시간 동안 처리하였다. 　세포를 차가운 RIPA 완충액으로 용해시킨 후, 세포 용해물을 원심 분리하여 세포 잔해물을 제거하였다. 　단백질 농도는 BSA를 표준으로 하여 BCA 키트를 사용하여 결정된 1mg/mL로 조정하였다.　 칼페인(calpain) 활성 분석은 시판 키트 (Bio-Vision, USA)로 측정하였다.　 추출된 단백질(50　μg)을 칼페인 기재(AC-LLY-AFC)와 혼합한 후 37℃의 어둠속에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다(총 부피는 100μL로 조절).　 칼페인 활성은 형광 분광 광도계로 측정하였다(λ ex =400nm;　λ em = 　505)(Gemini XPS 마이크로 플레이트 리더, MOLECULAR DEVICES, USA).
그 결과, AIP를 처리한 경우, 세포 내 칼슘 수준의 상승에 의해 미처리군에 비해 칼페인 활성이 증가한 것으로 확인되었다(도 4의 b).
실시예 6. 소포체 스트레스 신호 전달 경로 분석
NCI-H460 세포(6-웰 플레이트에서 500000 세포/웰)를 1일 동안 AIP(0.25　μM)로 처리하였다.　 단백질을 0.1% 프로테아제 억제제(Sigma Aldrich, USA) 및 포스파타제억제제 칵테일(Sigma Aldrich, USA)과 차가운 RIPA 완충액을 사용하여 추출하였다. 　단백질을 PVDF막(0.2μm 기공 크기PVDF 막, Roche, Swiss)으로 옮기기 전에 50 μg의 단백질을 소듐도데실설페이트-폴리아크릴 아마이드겔(SDS-PAGE)의 각 웰에 로딩하여 전기 영동을 수행하였다. 　PVDF 막을 1시간 동안 차단하고, 1차 항체로 처리하였다(인산화된 단백질에 대해 0.05% Tween 20(TBST)용액을 갖는 5wt% BSA 트리스-버퍼 식염수; 일반 단백질에 대해 5wt% 탈지유 TBST 용액).　 세포 자멸사 관련 단백질의 경우, c.caspase-3(1000:1, 항-토끼 폴리클로날, Cell Signaling Technology, USA), caspase-3(1500:1, 항-토끼 폴리클로날, Cell Signaling Technology, USA), PARP-1(6000:1, 항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK), Bcl-2 (1000:1, 항-토끼 폴리클로날, Santa Cruz Biotech, USA) 및 GAPDH(6000 : 1, 항-토끼 폴리클로날, Santa Cruz Biotech, USA)를 사용하였다. 소포체 스트레스 관련 단백질의 경우, calnexin (6000:1, 항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK), IRE1α(3000:1, 항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK), p-IRE1α(4000:1 , 항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK), PERK (3000:1, 항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK), p-PERK (항-토끼 모노클로날, Cell Signaling Technology, USA), ATF-6(3000:1 , 항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK), caspase-12 (2000:1, 항-토끼 모노클로날, Cell Science Technology, USA), ATF-4(2000:1, 항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK), p-elF2α (4000:1, 항-토끼 폴리클로날, Cell Signaling Technology, USA), elF2α (4000:1, 항-토끼 폴리클로날, Cell Signaling Technology, UK), JNK(4000:1, 항-토끼 폴리클로날, Cell Signaling Technology, UK), p-JNK (4000:1, 항-토끼 폴리클로 날, Cell Science Technology, USA), CHOP (3000:1, 항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK)　를 1차 항체로 사용하였다. 　일반적인 단백질을 위한 1차 항체 용액은 0.05% Tween 20(TBST) 용액과 함께 5wt% 탈지유 트리스-버퍼 식염수 중에서 제조하였다.　 인산화된 단백질을 위한 1 차 항체는 5wt% BSA TBS-T 용액 중에서 희석하였다.　 반응은 4 ℃에서 밤새 수행하였다.　 2차 항체로서 사용된 HPR-접합 항-토끼 항체는 4℃에서 밤새 인큐베이션하기 전에 상응하는 PVDF막에 첨가하였다.　 블롯 신호는 증강 화학 발광(Enhanced chemiluminescent, ECL) 시약(GE Healthcare, USA)으로 시각화 하였다.
그 결과, 도 4의 d에 나타낸 바와 같이, 절단된 카스파아제-12가 AIP 처리 후 검출었고, 이는 활성화된 칼페인이 카스파아제-12를 활성화시킴을 시사한다. 또한, 웨스턴블롯팅 결과, AIP 처리시 IRE1α 및 PERK 신호 전달 경로가 활성화되고, 소포체 스트레스를 개시하는 ATF-6의 해리가 발생하였다. 또한, 도 4의 c에 나타난 바와 같이, AIP의 처리에 따라 CHOP의 발현 수준이 증가하였고, 시간이 지날수록 CHOP의 발현 수준이 점진적으로 증가한 것으로 나타났다. 따라서, AIP는 소포체 스트레스를 유발하는 능력을 가지고 있는 것으로 볼 수 있다.
특히, AIP2에서 PERK 및 IRE1α 신호 전달 경로의 활성화가 강하게 나타나, 소포체 스트레스 유도 효과가 가장 뛰어났으며, 그에 따라 CHOP 발현 수준을 현저히 증가시키는 것으로 확인되었다.
다음으로, 소포체 스트레스가 카스파아제에 의해 조절되는지 확인하기 위해, 카스파아제 억제제를 처리한 조건에서 소포체 매개 단백질을 검출하였다. NCI-H460 세포(24 웰 플레이트에서 80,000 세포/웰)를 커버슬립 상에 씨딩하고, AIP(0.25 μM)로 1, 6, 12, 24 시간 동안 처리하였다. 　카스파아제 억제제의 존재 하에서, CHOP 활성을 조사하기 위해, AIP(0.25μM)로 하루 동안 인큐베이션 하기 전에 세포를 ZVAD-FMK(40μM)로 전 처리하였다.　 그 후, 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 15분 동안 고정시켰다.　 PBS로 3회 워싱한 후　세포를 1차 항체 용액(1% 소 혈청 알부민 (BSA), PBST 중 0.3% 트리톤X-100 및 항-토끼 CHOP; 1000:1)과 4℃에서 밤새 인큐베이션 하기 전에, 블로킹 용액(1% BSA, 0.05 % Tween 20 (PBST)을 갖는 포스페이트 완충 식염수 중 0.3% 트리톤X-100)으로 1 시간 동안 처리하였다. Alexa Fluor 488-태그된 2차 항체 용액(1 % BSA, PBS 중 0.3% 트리톤X-100 및 염소 항-토끼; 1000:1)을 2시간 동안 처리하였다.　 마지막 단계에서, 세포를 10분 동안 DAPI(PBS중 300 nM)로 염색하였다.　 면역 형광 이미지는　CLSM(LSM 800 META, ZEISS, Germany)에　의해 수득하였다. 정량 분석을 위해, 핵 내 하나의 세포의 각 산술평균 녹색 형광 강도는 ZEISS 2011 software (임의로 선택된 5개의 세포)에 의해 정량화되었다.　 CHOP(C/-EBP homologous protein)의 시간-의존적 상대 발현은　F sample 　대　F cont의 비율로 계산되었다.
그 결과, 소포체 스트레스 경로는 ATF-6 및 JNK의 활성화를 제외하고는, 카스파아제의 활성화와 독립적으로 작용하였다(도 4의 e). 또한, 모든 AIP 처리군에서 CHOP 발현 수준이 카스파아제 억제제인 ZVAD-FMK의 존재에 영향을 받지 않으므로(도 4의 f), AIP에 의해 유발된 소포체 스트레스는 카스파아제에 의해 조절되는 것이 아니라는 것을 유추할 수 있다.
실시예 7. 세포 내 ROS 및 GSH 수준 분석
세포 내 ROS 수준의 정량을 위해, NCI-H460 세포를 웰 당 10000 세포로 96- 웰 플레이트 상에 씨딩하고 90 % 컨플루언시에 도달하도록 1일 동안 배양하였다.　 세포를 AIP 용액(PBS 중 0.25 및 0.75μM)을 함유하는 DMEM으로 24시간 동안 처리하였다.　 ROS-민감성 형광 염료 및 2',7'-디클루로디하이드로플루오레신 디아세테이트 (DCFH-DA, 20　μL,　DMSO 중 100　μM, Sigma-Aldrich, USA)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션 하였다.　 세포를 PBS로 3번 워싱하기 전에　세포 내 ROS 수준을 형광 분광계 (λ　 ex=495nm,　λ em=529 nm)로 측정하였다. 　상대적인 ROS 수준은　F sample 대 F control 의 비로 표현되었다.
추가로, ROS 수준을 시각화하기 위해 NCI-H460 세포 (100000 세포/웰)를 24-웰 플레이트용 커버슬립 상에 씨딩하고, 12시간 동안 AIP(61.25nM)로 처리하였다.　 ROS 이미징을 위해, DCFH-DA(100μL)를 각 웰에 첨가하였다. 　과량의 시약을 제거하기 위해, 세포를 Hoechst 33258 염색(PBS 중 5μg/mL, ThermoFisher Scientific, USA에서).　 핵 염색 후, 원하지 않는 세포 사멸을 방지하기 위해 10% FBS-함유 DMEM (500μL)을 세포에 첨가하였고, 모든 이미지는 CLSM(LSM 800 META, ZEISS, Germany)으로 즉시 촬영하였다.
NCI-H460 세포(12 웰 플레이트에서 150000 세포/웰)를 1일 동안 인큐베이션 하였다.　 AIP(PBS 중 0.25μM)를 각 웰에 첨가하고 세포를 RIPA 완충액으로 용해시키기 전에 추가로 24시간 동안 4℃에서 인큐베이션　하였다. 　세포 용해물을 원심 분리하여 상청액을 얻고, 엘만 시약 (20μL, 0.75mM DTNB, Sigma Aldrich, USA)을 상청액에 첨가하였다.　 GSH의 양은 405 nm에서 흡광도 마이크로 플레이트 리더로 정량화 하고,　무처리 군과 비교하여 GSH 수준을 측정하였다.
그 결과, AIP를 처리하는 경우, AIP를 처리하지 않은 대조군에 비해 ROS 수준이 상당히 증가하였고(도 5의 a, b), 이는 산화 환경이 점차 강화되는 것을 의미한다. 또한, AIP 처리 시 세포 내 글루타티온(GSH) 수준은 감소하므로(도 5의 c), 과도한 ROS의 생성에 의해 GSH가 감소한 것을 알 수 있었다.
실시예 8. 미토콘드리아 분석
미토콘드리아의 기능 장애를 확인하기 위해 미토콘드리아 막전위의 탈분극에 대한 분석을 수행하였다. NCI-H460 세포를 10,000 개의 세포를 96 웰 플레이트에 씨딩하여 1일 동안 배양하고, AIP(PBS 중 0.25 및 0.75μM)를 함유하는 무혈성 배지로 교체하였다. 24시간 후, 세포를 JC-1(10μL, DMSO 중 100μg/mL, Invitrogen, USA)으로 30분 동안 처리하고, 세포를 PBS로 3회 헹구었다. 형광은 형광분광계(J-모노머: λ ex =485nm, λ em =530nm; J-집합체: λ ex =535nm, λ em =590nm)(Gemini XPS 마이크로 플레이트 리더, MOLECULAR DEVICES, USA). 적색/녹색 형광 비(R)는 형광 강도 (590/530nm)의 비율로 계산하였다. 상대적인 미토콘드리아 막 탈분극은 R sample 대 R control 의 비율로 계산하였다.
그 결과, 상대적인 J-모노머/J-집합체 비율은 대조군에 비해 낮게 나타나, 산화 스트레스가 심각한 미토콘드리아 손상을 초래한 것으로 확인되었다(도 5의 d).
다음으로, 미토콘드리아의 기능 소실을 확인하기 위해, 미토콘드리아 전이 기공 분석을 수행하였다. NCI-H460 세포(12 웰 플레이트에서 150000세포/웰)를 씨딩한 후 1일 동안 안정화시켰다. 배지를 AIP(0.25μM)를 함유하는 무혈성 배지로 교체하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 그 후, 세포를 HBSS/Ca(1 mL)로 희석하기 전 연속적인 트립신화 및 원심 분리로 분리하였다. 미토콘드리아 전이 기공 분석 키트 (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 칼세인 AM (2μL, HBSS/Ca중 2μM) 및 CoCl2용액(2μL, 식염수 중 80mM)을 모든 세포에 첨가하였다. 세포질 및 미토콘드리아의 칼세인 AM을 제거하기 위해, 이오노마이신(2μL, DMSO 중 100 μM)을 추가하여 완전히 퀸칭된 세포를 제조하였다. 과량의 염색 및 퀸칭 시약을 제거하기 위해 세포를 HBSS/Ca로 워싱 하기 전 37℃에서 15분 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 유세포 분석을 위해 DMEM(300μL)으로 희석하였다. 미토콘드리아 전이 기공의 정도는 세포질만이 퀸칭된 세포(%)와 완전히 퀸칭된 세포(%) 간 차이를 통해 간접적으로 표현되었다.
그 결과, 미토콘드리아 투과성에 비례하는 칼세인-AM의 변화량이 AIP 처리 군에서 현저히 증가하여, 미토콘드리아가 기능을 상실한 것을 확인할 수 있었고(도 5의 e), 특히 AIP2 처리 군에서 미토콘드리아 손상 정도가 심했다.
실시예 9. 세포 자멸사 분석
손상된 미토콘드리아는 카스파아제 의존성 세포 자멸사 신호 전달을 활성화시키므로, 이를 확인하기 위해 카스파아제-3 기질을 사용하여 활성을 평가하였다. NCI-H460 세포 (6-웰 플레이트에서 500000 세포/웰)를 1일 동안　AIP(0.25　μM)로 처리한 후,　세포를 RIPA 완충액으로 용해시켜 단백질을 추출하였다.　 카스파아제 억제제의 존재 하에서 카스파아제 활성을 위해, 세포를 AVA　시리즈(0.25 μM)의 첨가 전에 1시간 동안　ZVAD-FMK(40μM, Santa Cruz Biotech, USA)　로 전 처리하였다. 　세포를 RIPA 완충액으로 용해시켜 단백질을 추출하고, 모든 단백질 샘플 농도를 BCA 키트를 사용하여 1.5mg/mL로 조정하였다.　 카스파아제 활성은 DEVD-p-NA (200 μM)(Abcam, UK)를 첨가하여 정량화하고, 마이크로 플레이트 리더(Multiskan™GO 마이크로 플레이트 분광계, ThermoFisher Scientific, USA)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 검출하여 측정하였다.
그 결과, AIP처리군은 대조군과 달리 카스파아제-3을 절단하여 카스파아제 의존성 세포 자멸사를 일으키며, 카스파아제 억제제인 ZVAD-FMK를 처리했을 때에는 카스파아제-3 활성이 약화되는 것이 확인되었다(도 5의 g).
산화적 스트레스는 세포 자멸사 신호를 강하게 활성화시켜 세포 예정사를 초래하므로, 세포 자멸사 정도를 평가하기 위해 FITC-아넥신 V, 프로피디움요오다이드(PI) 염색으로 세포 자멸사 분석을 수행하였다. NCI-H460세포(12-웰 플레이트에서 150000세포/웰　)를 1 일 동안　AIP(0.25　μM)로 처리한 다음,　세포의　트립신화 전에 PBS로 3회 헹구었다.　 세포 자멸사 분석 키트(Thermo Scientific, USA)를 사용하여, 세포를 결합 완충액(100μL)에 용해된 프로피디움요오다이드(0.2μg 중 100μg/mL) 및 FITC-아 넥신V (5μL)로 염색하고, 실온에서 10분 동안 배양하고, 세포를 DMEM (200μL)으로 희석하였다.　 전-세포 자멸사는　유세포분석(Becton Dickinson and Company, Cytek FACSCalibur, USA)으로 평가하였다.
그 결과, AIP가 처리된 세포에서는 apoptotic한 세포의 비율이 현저히 증가하는 반면, 괴사성 세포의 비율은 낮아 세포 예정사가 유발된 것을 확인할 수 있었다(도 5의 h). 또한, AIP 처리군에서 후기 세포 자멸사는 AIP2에서 가장 강하게 나타났다.
미토콘드리아 의존성 세포 자멸사 경로는 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. NCI-H460 세포 (6-웰 플레이트에서 500000세포/웰)를 1 일 동안　AIP(0.25　μM)　로 처리하였다. 미토콘드리아 및 세포질 분획은 제조사의 지시에 따라 수행되었다(Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells, ThermoFisher Scientific, USA).　 미토콘드리아를 RIPA 완충액으로 용해시켜 단백질을 추출하고,　세포질 및 미토콘드리아 단백질을 동일한 농도로 조정하였다. 사이토 크롬 C(2000:1, 항-토끼 폴리클 날, Abcam, UK) 및 AIF(2000:1, 항-토끼 폴리클로날, Abcam, 영국)의 및 단백질 (50 μg)을 SDS-PAGE 겔에 로딩하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
또한, NCI-H460세포(6-웰 플레이트에서 500000세포/웰)를 1일 동안　AIP2(0.25　μM)와 함께, AIP2 없이 배양하였다.　 카스파아제 억제제의 존재 하에서의 소포체 스트레스를 위해, 세포를 1시간 동안　ZVAD-FMK　(40μM, Santa Cruz Biotech, USA)　로 전 처리하였다. 　전기 영동 후 단백질(50 μg)을 PVDF 막으로 옮겼다.　 대응하는 PVDF 막을 소포체 스트레스 매개 1차 항체(ATF-6, ATF-4, caspase-12 IRE1α, P-IRE1α, PERK, P-PERK, CHOP, elF2α, P-elF2α, JNK 및 P-JNK)로 처리하고,　4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. HPR-접합된 2차 항체 용액은 4℃에서 밤새 인큐베이션 하기 전에 대응하는 PVDF막에 첨가되었다. 　면역 블롯팅 신호는 ECL 시약으로 시각화되었다.
그 결과, Bcl-2의 발현이 현저하게 억제되어 미토콘드리아에 의한 세포 자멸사가 개시됨을 알 수 있었고, AIP를 처리한군에서는 미토콘드리아의 사이토크롬 C 발현은 감소하고, 세포질 사이토크롬 C의 발현은 증가하여 미토콘드리아로부터 사이토크롬 C가 방출되었다는 것이 확인되었다. 이와 같이, 세포질 사이토크롬 C가 증가하면 카스파아제-3 및 PARP-1의 절단이 순차적으로 일어나고, 세포 자멸사가 촉진된다. 또한, AIF(Apoptosis-inducing factor)의 방출이 관찰되어, AIP는 카스파아제 의존성 세포 자멸사도 유도함을 유추할 수 있다(도 5의 f).
실시예 10. 종양 억제 효과
NCI-H460 세포 (5　Ⅹ6　세포)를 6주령의 수컷 balb/c 누드 마우스(n=6)에 피하 주사하였다. 종양의 부피가 50mm3가 되었을 때, HEPES 완충액 및 AIPS(2 mg/kg)를 11일째까지 이틀에 한번 꼬리 정맥 주입으로 투여하였다(각 그룹에서의 주사 횟수: 5).　 종양 부피를 2 일 마다 캘리퍼로 측정하고 다음의 식으로 계산하였다:　부피=길이×폭2　×0.523.　 종양 부피가 2500mm3를 초과하였을 때, HEPES군의 모든 마우스를 희생시켰다.　 모든 군의 종양 성장 및 체중을 23일까지 모니터링 하였다. 다음 단계에서, 모든 마우스를 희생시키고, 주요 조직(폐, 심장, 신장, 비장 및 간)을 수득하여 세포 독성을 평가하였다.　 모든 조직을 10% 포르말린으로 고정하고, 파라핀에 포매하고,　5　㎛ 두께 섹션으로 절단하였다. 　대표 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)에 침지 시키고 ZEISS 광학 현미경으로 시각화 하였다.　
그 결과, AIP를 처리한 군에서는 대조군에 비해 종양 성장이 늦어지고, 체중은 유지되어 AIP가 종양에 대한 독성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 6의 a, b). 특히, AIP2를 처리한 경우 다른 AIP에 비해 종양의 크기가 더 작아 AIP2가 종양 조직을 훨씬 더 많이 공격한다는 점을 알 수 있다(도 6의 c).
실시예 11. 면역 조직학적 분석
상기 실시예 10에서 기재한 바와 같이, 이종 이식편을 제조하였다(n=2). 종양 종양 크기가 150mm3에 도달했을 때, HEPES 완충액 및 AI (2mg/kg)를 2 일 마다 정맥 주사하였다(총 주사 횟수: 5). 면역 조직 화학 분석을 위해, 최종 주사 2일 후, 종양 조직을 절제한 후 10% 포르말린 용액으로 고정시키고 상기 실시예 10에 기재한 방법으로 종양 섹션을 제조하였다. 종양 섹션을 H&E 및　TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling)로 염색하였다.　 TUNEL　분석은 제조사의 설명서(Merck, Darmstadt, Germany)에 따라 수행되었다.　 면역 조직 화학 염색을 위해, 종양 섹션을 1차 항체, 절단된 카스파아제-3(항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK), CHOP(항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK)로 처리하고, Dako Envision ™Kit (Dako, Glostrup, Denmark)를 2차 항체로 하여 실온에서 20 분 동안 인큐베이션 하였다. 　Diaminobenzidine/hydrogen peroxidase (Dako)는 색소원 기질로 사용되었다.　 모든 슬라이드는 메이어 헤마톡실린으로 대조 염색되었다.　 면역 형광을 위해, 섹션을 AIF(Abcam,　항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK) 및 사이토크롬 C(Abcam,　항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK)로 처리하고, 2차 항체로 Fluor 488-접합된 항-토끼 IgG(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하였다. 　4,6-디아미디노-2- 페닐인돌(DAPI, Sigma-Aldrich)로 핵을 염색하고, MitoTracker Red (Invitrogen)로 미토콘드리아를 염색하였으며, 모든 면역 조직 화학 이미지는 ZEISS 광학 현미경에 의해 획득되었다.
다음으로, in vivo 웨스턴 블롯팅을 위해, 최종 주사 2 일 후, 절제된 종양 조직을 RIPA 완충액으로 용해시킨 후 균질화 시켰다.　 단백질 샘플의 제조 및 웨스턴 블롯팅은 상기 실시예 6에 기재된 방법으로 수행하였다. 　카스파아제-3(1000:1, 항-토끼 폴리클로날, Santa Cruz biotech, USA)을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재한 것과 동일한 항체를 사용하였다.
그 결과, in vitro 실험과 마찬가지로, 소포체 스트레스 관련 단백질이 다량 생산되거나 인산화되어 AIP가 종양세포에서 소포체 스트레스를 유도하는 것을 확인할 수 있었고, 카스파아제-12가 절단되어 세포 내 칼슘 수준이 증가한 것으로 나타났다. 또한, 활성화된 PERK 경로는 eIf-2α를 인산화하여 ATF-4 및 CHOP의 높은 연속 발현을 유도하였고, IRE-1α의 인산화는 JNK의 인산화를 초래하였다(도 6의 e).
CHOP의 면역화학 이미지에서도, AIP는 CHOP 발현을 자극하는 것으로 확인되어(도 6의 d), 결과적으로 AIP는 종양 세포의 소포체 스트레스를 유도함으로써 세포 자멸사를 개시한다는 것을 알 수 있다.
또한, 세포 자멸사 관련 단백질 검출 결과, 도 6의 f 및 g에 나타난 바와 같이 Bcl-2의 발현은 AIP 처리 군에서 억제되어 미토콘드리아 의존성 세포 자멸사를 유발하였고, 손상된 미토콘드리아가 AIF와 사이토크롬 C를 방출하는 것이 확인되었다. 이와 같이 방출된 사이토크롬 C는 카스파아제-3, PARP-1의 연속적인 절단을 초래하여 세포 자멸사를 가속화하는 것으로 확인되었다(도 6의 d, f).
마지막으로, TUNEL 분석 결과 AIP1, AIP2, AIP3 처리군에서 세포 자멸사가 유발되고, AIP2에서 가장 높은 비율로 세포 자멸사가 유도되었다(도 6의 d).
실시예 12. 혈관 신생 억제 효과
상기 실시예 10에서 기재한 바와 같이, 이종 이식편을 제조하였다(n=2). 종양 종양 크기가 150mm3에 도달했을 때, HEPES 완충액 및 AI (2mg/kg)를 2 일 마다 정맥 주사하였다(총 주사 횟수: 5). 최종 주사 2일 후, 종양 조직을 절제한 후 10% 포르말린 용액으로 고정시키고 상기 실시예 10에 기재한 방법으로 종양 섹션을 제조하였다. 종양 섹션을 H&E 및　TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling)로 염색하였다.　 TUNEL　분석은 제조사의 설명서(Merck, Darmstadt, Germany)에 따라 수행되었다.　 면역 조직 화학 염색을 위해, 종양 섹션을 1차 항체, CD31(항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK)로 처리하고, Dako Envision ™Kit (Dako, Glostrup, Denmark)를 2차 항체로 하여 실온에서 20 분 동안 인큐베이션 하였다. 　Diaminobenzidine/hydrogen peroxidase (Dako)는 색소원 기질로 사용되었다.　 모든 슬라이드는 메이어 헤마톡실린으로 대조 염색되었다.　 면역 형광을 위해, 섹션을 AIF(Abcam,　항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK) 및 사이토크롬 C(Abcam,　항-토끼 폴리클로날, Abcam, UK)로 처리하고, 2차 항체로 Fluor 488-접합된 항-토끼 IgG(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하였다. 　4,6-디아미디노-2- 페닐인돌(DAPI, Sigma-Aldrich)로 핵을 염색하고, MitoTracker Red (Invitrogen)로 미토콘드리아를 염색하였으며, 모든 면역 조직 화학 이미지는 ZEISS 광학 현미경에 의해 획득되었다.
다음으로, 면역 블롯팅을 위해 50μg의 단백질을 SDS-PAGE 겔의 각 웰에 로딩하고, PVDF막(기공 크기 0.2μm PVDF 막, Roche, Swiss)으로 옮겨 전기 영동을 수행하였다.　 PVDF막을 1차 항체 용액(MMP-2; 1000:1, 항-토끼 폴리클로날, Cell Signaling Technology, USA, MMP-9; 1000:1, Cell Signaling Technology, Abcam, USA, VEGF;1000:1, 항-토끼 폴리클로날, SantaCruz Biotech, USA)으로 처리하였다. 그다음, PVDF막을 2차 항체 용액으로 처리하고, 블롯팅 신호를 ECL 시약으로 가시화하였다.
CD31 항체 염색 결과, HEPES군과 비교하, AIP 처리군에서 종양 주위 혈관의 비율이 크게 감소하였고, 이는 AIP가 혈관 신생을 불활성화 하는 것을 시사한다(도 7). 또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, AIP 처리군에서 혈관 신생과 관련된 단백질 VEGF, MMP-2, MMP-9의 발현이 하향 조절되어, AIP의 혈관 신생 억제 능력을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물
    [화학식 1]
    Figure 112021083419248-pat00014

    (상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임).
  2. 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
    [화학식 1]
    Figure 112021083419248-pat00015

    (상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임).
  3. 제2항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 폐암, 난소암, 골육종, 대장암, 식도암, 십이지장암, 간암, 신장암, 췌장암, 위암, 두경부암, 흑색종, 후두암, 갑상선암, 자궁경부암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 펩타이드 화합물은 칼륨 이온 수송 활성을 가지는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 펩타이드 화합물은 소포체 스트레스에 의한 세포 자멸사를 유발하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 항암제와 병용하여 투여되는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항암제는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클 로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴 (lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴 (cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신 (dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루 비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C(mitomycin C) 및 블레오마이신(bleomycin); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 테니포시드 (teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 화합물을 포함하는, 혈관 신생 억제용 약학적 조성물
    [화학식 1]
    Figure 112021083419248-pat00016

    (상기 식 중, R1은 C1-C10의 알킬 카보닐기이고, R2는 1-아자-18-크라운 6-에터이고, x, y는 30 내지 35의 정수이며, z는 58 내지 62의 정수임).
  9. 제8항에 있어서,
    상기 펩타이드 화합물은 CD31의 발현을 억제하는, 혈관 신생 억제용 약학적 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 펩타이드 화합물은 VEGF(vascular endothelial growth factor), MMP-2(Matrix metalloproteinase-2) 및 MMP-9(Matrix metalloproteinase-9)를 포함하는 혈관 신생 관련 단백질의 발현 수준을 하향 조절하는, 혈관 신생 억제용 약학적 조성물.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 당뇨병성 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관 신생 관련 질환의 치료 또는 예방에 이용되는, 혈관 신생 억제용 약학적 조성물.
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