KR102307603B1

KR102307603B1 - 비피도박테리움 롱검 rapo (kctc13773bp)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102307603B1
Application number: KR1020200151618A
Authority: KR
Inventors: 박명수; 지근억; 김성은; 김혜윤; 오리라; 허지원
Original assignee: 주식회사 비피도
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2021-10-05
Anticipated expiration: 2040-11-13
Also published as: EP4226930A4; CN116782948A; EP4226930A1; US20250262253A1; WO2022103138A1

Abstract

본 발명은 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 면역관문억제제(면역항암제)와 함께 사용하면, 면역관문억제제의 부작용은 줄이고 효과는 더욱 활성화되어 암을 예방 또는 치료하는데 탁월한 효과를 발휘한다.

Description

비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 {Composition with Bifidobacterium longum RAPO (KCTC13773BP) for preventing or treating cancer}

비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 면역관문억제제(면역항암제)와 함께 사용하면, 면역관문억제제의 부작용은 줄이고 효과는 더욱 활성화하여 면역이 더욱 활성화됨으로써 암을 예방 또는 치료하는데 탁월한 효과를 발휘할 수 있는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 암 환자 발생이 지속적으로 증가하는 추세로 우리나라 역시 2016년 22만 9180명이 새로 암환자로 진단받아, 전년도에 비해 1만 2638명 (5.8%)이 증가하였다. 특히 유방암은 5대 주요 발생 암 종에 속하며 2017년 사망원인통계에 따르면 암사망률 1위(여성)를 기록하였다 (중앙암등록본부, 2018).

1세대 화학항암제를 시작으로 1990년대 말에는 2세대 항암제인 표적치료제가 개발되었고 이후 2011년부터 면역항암제가 개발 및 승인되어 활발하게 사용 중이다. 미국의 식품의약품안전처 (Food and Drug Administration; FDA)는 2014년 'Anti-PD1' 면역관문억제제인 Pembrolizumab과 Nivolumab을 전이성 흑색종, 비소세포폐암 및 다양한 종양의 치료제로 승인하여 현재까지도 적용 범위를 넓히고 있다. 이후 'Anti-PDL1' 면역관문억제제인 Atezolizumab, Durvalumab, Avelumab 등도 FDA 승인을 받아 그 이용이 확대되고 있다 (Miwa S, Shirai T, Yamamoto N, et al . Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019;2019:7035045).

면역관문억제제 (immune checkpoint inhibitors)는 암 세포를 직접 사멸시키지 않고 체내 면역체계를 활성화시켜 암 세포를 공격할 수 있도록 도움을 주는 면역항암제를 일컬으며, 세포를 직접적으로 사멸시키는 기존의 화학항암요법 (chemotherapy)과는 달리 암 환자들의 삶의 질을 저하시키는 탈모, 빈혈, 골수 기능 억제 등 항암화학요법에 의한 부작용이 적은 차세대 항암제로 각광받고 있다.

하지만, 최근 임상연구 결과 면역관문억제제 치료 시 효과가 잘 나타나는 환자 (responders)와 효과가 나타나지 않는 환자 (non-responders)가 존재하고 (Darvin P, Toor SM, Sasidharan Nair V, Elkord E. Immune checkpoint inhibitors: recent progress and potential biomarkers. Exp Mol Med. 2018;50(12):165), 특히 면역관문억제제 단독 투여 시 환자가 약물에 반응할 확률이 낮다는 문제점이 제기되었다 (Wei SC, et al, . Fundamental mechanisms of immune checkpoint blockade therapy. Cancer Discov . 2018;8(9):1069-1086). 면역관문억제제는 면역체계를 활성화하는 기전으로 작용하기 때문에 기존 화학항암요법이나 표적치료제와 달리 적용 가능한 환자군이 많다는 장점이 있지만 T세포의 활성이 과하게 증가하여 면역체계의 균형이 깨지면서 부작용 (immune-related adverse events; irAEs)이 일어날 수 있다. 2019년 발표된 연구에 따르면, 면역관문억제제의 대표적인 부작용으로 대장염, 폐렴, 간염, 심근염, 갑상선염, 뇌하수체염, 신장염, 피로, 설사, 발진 등이 보고되었다 (Aratani Y et al., 2018; Baxi S et al., 2018; El Rayes T et al., 2015; Hong F et al., 2015). 따라서, 면역관문억제제의 치료 효과를 높이고 부작용을 줄이기 위한 병용요법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

장내 미생물의 항상성은 체내 면역체계와의 지속적인 상호작용에 의해 유지되며, 이러한 미생물의 균형이 깨지면 (dysbiosis), 암을 포함한 만성질환의 원인이 될 수 있다고 알려졌다. 따라서, 장내 미생물이 항암치료의 효과에 미치는 영향에 대한 파마바이오틱스 분야 연구가 최근 주목받고 있다 (Cogdill AP et al. The impact of intratumoral and gastointestinal microbiota on systemic cancer therapy. Trends immunol. 2018;39(11):900-920).

2018년 MD Anderson Cancer Center는 장내 미생물 조성이 흑색종의 면역관문억제제에 대한 효과에 미치는 영향을 보고하였다. Anti-PD1 immunotherapy를 받는 흑색종 환자 중 responders와 non-responder의 장내 미생물을 fecal microbiota transplantation (FMT)을 통해 각각 germ free 마우스에게 공급한 결과, responders의 FMT를 실시한 마우스는 CD8+ T세포가 증가하고, 항암제에 대한 반응도 증가하여 암 성장이 유의적으로 감소하였다 (Gopalakrishnan V, Spencer CN, Nezi L, et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 2018;359(6371):97-103).

2015년 Science에 발표된 University of Chicago 그룹의 연구에 의하면 흑색종 세포주 B16.F10 cell line으로 유도된 마우스 xenograft model에게 Anti-PDL1 mAb 처리 시 특히 responders에게서 비피더스균의 조성이 많음을 확인하였다. 이후 non-responders에게 이들 비피더스균 공급 시 INF-γ과 CD8+ T세포가 증가하고 암 세포의 성장이 억제됨을 관찰하여 프로바이오틱스가 면역세포의 활성을 증가시켜 면역관문억제제의 반응성 및 항암효과 향상에 기여한다는 사실을 밝혔다 (Sivan A, Corrales L, Hubert N, et al. Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD-L1 efficacy. Science. 2015;350(6264):1084-1089).

대한민국 등록특허 제10-2040117호 (등록일자 2019. 10. 29), 발명의 명칭: 비피도박테리움 비피덤 MG731 균주 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.

Cogdill AP et al. The impact of intratumoral and gastointestinal microbiota on systemic cancer therapy. Trends immunol. 2018;39(11):900-920. Gopalakrishnan V, Spencer CN, Nezi L, et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 2018;359(6371):97-103. Sivan A, Corrales L, Hubert N, et al. Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD-L1 efficacy. Science. 2015;350(6264):1084-1089.

면역력 강화 등 체내 유익한 작용을 하는 프로바이오틱스 (probiotics)와 면역관문억제제의 병용요법 효과에 대한 연구가 파마바이오틱스 (pharmabiotics = pharmaceutical + probiotics) 측면에서 그 중요성이 강조되고 있으나, 지금까지 다양한 암종에서의 이와 관련된 연구는 아직 미비한 실정이다. 이에 본 발명은 프로바이오틱스와 Anti-PD1 면역관문억제제 병용요법이 항암치료 효과에 미치는 영향에 대해 확인하고자 하였다.

본 발명은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 본 발명 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)은 항암 외에 면역증진의 효과를 나타내는 것일 수 있다.

상기 본 발명 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 암은, 일 예로 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양, 신경 모세포종, 표피암종 및 이의 전이암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)를 포함하며, 면역항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 본 발명 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 면역항암제는, 바람직하게 anti-PD1, anti-PDL1, anti-CTLA, anti-Tim3 및 anti-LAG3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 본 발명 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP) 균주와 면역항암제는 바람직하게 하나의 제형으로 동시에 투여되거나, 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다.

상기 본 발명 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)는, 바람직하게 면역항암제의 부작용을 저감시킬 수 있다.

본 발명은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)를 포함하는 암 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)를 포함하는 암 예방 또는 개선을 위한 동물용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)가 항암제로 사용될 수 있음을 확인하였다. 더욱이 면역관문억제제(면역항암제)와 함께 본 발명의 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)를 병용 사용하면 면역관문억제제의 부작용은 줄이고 효과는 더욱 활성화되어, 암을 예방 또는 치료하는데 탁월한 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 체중 변화를 보여준다.
도 2는 종양 부피 (tumor volume)의 변화를 보여준다.
도 3은 혈청 내 AST와 ALT의 농도를 보여준다.
도 4는 혈청 내 BUN과 크레아틴의 농도를 보여준다.
도 5는 혈청 내 LDH의 농도를 보여준다.
도 6은 종양 조직의 IHC (PDL1) 염색 이미지 (A) 및 IHC scores (B)이다.
도 7은 종양 내 PDL1 mRNA 발현 결과이다.
도 8은 비장 내 CD4+ (A), CD8+ (B) 세포의 Flow cytometry 분석 결과 및 CD3+ 세포에서 CD8/CD4 ratio (C)이다.
도 9는 비장 내 NKT 세포의 Flow cytometry 분석 결과이다.
도 10은 비장 내 NK 세포의 Flow cytometry 분석 결과이다.
도 11은 비장 내 CD3+ 세포에서 the DC (A), MDSC (B) 및 macrophage (C)의 Flow cytometry 분석 결과이다.
도 12는 종양 내 CD3+ 세포에서 CD4+ (A), CD8+ (B)의 Flow cytometry 분석 결과 및 CD3+ 세포에서 CD8/CD4 ratio (C)이다.
도 13은 종양 내 NK 세포의 Flow cytometry 분석 결과이다.
도 14는 종양 내 DC 세포의 Flow cytometry 분석 결과이다.
도 15는 종양 내 M1 (A), M2 (B)의 Flow cytometry 분석 결과 및 M2/M1 ratio (C)이다.
도 16은 종양 내 IFNγ mRNA 발현 결과이다.
도 17은 종양 내 TNFα mRNA 발현 결과이다.
도 18은 종양 내 CXCL9 mRNA 발현 결과이다.
도 19는 종양 내 CCL2 mRNA 발현 결과이다.
도 20은 종양 내 IL10 (A), TGFβ (B) 및 Arg1 (C) mRNA 발현 결과이다.
도 21은 종양 내 HMGB1 mRNA 발현 결과이다.
도 22는 종양 내 CRT mRNA 발현 결과이다.
도 23은 종양 내 CD80 mRNA 발현 결과이다.
도 24는 종양 내 CD86 mRNA 발현 결과이다.
도 25는 종양 내 IL1β (A), IL12 (B) 및 Gzmb (C) mRNA 발현 결과이다.
도 26은 마우스 xenograft 모델에서 본 발명 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO 균주와 면역 체크포인트 억제제들의 컴비네이션 효과와 관련된 분자 메커니즘을 요약해서 보여준다.

본 발명은 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주는 대한민국 특허등록번호 제10-2074445호 (등록일자: 2020. 01. 13)에서 등록받은 바가 있다.

본 발명의 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주는 균주 자체, 균주의 배양액, 또는 균주를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물 (Cytoplasmic fraction)을 포함하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명은 유효량의 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주를 암 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자 또는 인간 또는 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 인간을 제외한 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 등을 포함한다.

본 발명의 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주는 항암 외에 면역증진 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 일 예로 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양, 신경 모세포종, 표피암종 또는 이의 전이암일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주 및 면역항암제를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주를 포함하며, 면역항암제를 더 포함할 수 있는 것이다. 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주와 면역항암제는 바람직하게 하나의 제형으로 동시에 투여되거나, 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 면역항암제는 일 예로 면역관문 억제 기능을 갖는 anti-PD1, anti-PDL1, anti-CTLA, anti-Tim3, antiLAG3일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 본 발명 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP)는, 바람직하게 면역항암제의 부작용을 저감시킬 수 있다.

본 발명은 비피도박테리움 롱검 RAPO (KCTC13773BP) 균주를 포함하는 암 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물 또는 동물용 사료 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 일 예로 건강기능식품, 유제품 등일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지 않는다. 또한, 사료 조성물은 펠렛 등 당업계에 널리 알려진 다양한 방법으로 제조될 수 있으나, 특정의 제형으로 반드시 한정되는 것은 아니다. 이들 제형에 대한 구체적인 설명은 생략하기로 한다.

한편, 면역관문억제제는 암 세포를 직접 사멸시키지 않고 체내 면역시스템의 강화를 통해 항암효과를 나타내는 차세대 항암제로서 다양한 암종에서 적용이 가능하지만 반응군 (responders)과 비반응군 (non-responders)이 극명하게 나뉘는 단점을 가지고 있다. 따라서, 이러한 면역관문억제제의 치료 효과를 증진시키기 위한 병용요법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있으며 최근 들어 장내 미생물 조성이 면역관문억제제의 치료와 관련이 있는 것으로 보고되어 있다.

이에 본 발명에서는 마우스 유방암 모델에게 면역관문억제제 단독투여와 면역관문억제제, 비피더스균의 병용치료를 실시하여 병용요법을 통한 면역관문억제제 항암 치료 증진 효과 및 관련 분자 기전을 규명하고 바이오마커들을 발굴하고자 하였다. 하기 본 발명의 실험을 통해서 본 발명의 하기 효과가 실험적으로 확인되었다.

(1) 면역관문억제제와 본 발명 비피더스균의 병용치료가 종양 크기에 미치는 영향

면역관문억제제인 Anti-PD1과 비피더스 균인 Bifidobacterium longum RAPO를 병용하여 치료한 군이 치료를 진행하는 동안 가장 낮은 tumor volume을 나타내는 경향을 보였으며 (도 2), carcass weight 또한 Anti-PD1 단독치료를 진행한 군에 비해 높은 경향을 나타냈다 (표 3). 이는 면역관문억제제와 Bifidobacterium longum RAPO의 병용요법을 통해 면역관문억제제의 항암 치료 증진 효과의 가능성을 보여주는 것이다.

(2) 면역관문억제제와 본 발명 비피더스균의 병용치료가 부작용 완화 효과에 미치는 영향

각 그룹 별 조직 무게를 비교한 결과, 간의 무게가 Anti-PD1군이 다른 그룹들에 비해 증가하는 경향을 보인 반면 Anti-PD1 + RAPO군에서 Anti-PD1군에 비해 감소하는 경향을 보였다 (표 4). 간의 무게 증가는 간의 대사 이상 및 섬유화, 염증 발생을 의미하는 것으로 보고된 바 있으므로 (Lee JE, Kang SJ, Choi SH, Song CH, Lee YJ, Ku SK. Fermentation of Green Tea with 2% Aquilariae lignum Increases the Anti-Diabetic Activity of Green Tea Aqueous Extracts in the High Fat-Fed Mouse. Nutrients. 2015;7(11):9046-9078. Published 2015 Nov 3. doi:10.3390/nu7115447), 면역관문억제제로 인해 발생할 수 있는 간의 비대를 면역관문억제제와 비피더스균의 병용요법을 통해 완화시킬 수 있는 가능성을 확인하였다. 또한, Anti-PD1 + RAPO군의 대장 길이가 Anto-PD1군에 비해 유의적으로 긴 것을 확인하였다 (표 6). 대장 길이의 감소는 대장염 마우스 모델에서 관찰되는 대표적인 특징으로, 본 연구의 결과를 통해 면역관문억제제 치료 시 부작용으로 대장염의 위험이 증가하며 면역관문억제제와 비피더스균의 병용치료가 면역관문억제제 투여로 인한 부작용 완화 효과에 기여할 수 있는 가능성을 확인한 것이다.

추가적으로, 면역관문억제제와 비피더스균의 병용치료를 통한 부작용 완화 효과를 확인하고자 각 그룹의 혈청에서 여러 가지 생화학 지표를 확인한 결과, BUN의 농도가 Anti-PD1 + RAP군이 Anti-PD1 군에 비해 감소하는 경향이 나타났으며 (표 8, 도 4), Anti-PD1 군에서는 혈중 LDH의 농도가 증가하는 경향을 보인 반면 Anti-PD1 + RAPO 그룹에서 감소하는 경향을 보였다 (표 9, 도 5). 면역관문억제제 중 anti-PD1 약물을 통해 치료를 받는 환자들의 16~37% 정도는 면역관문억제제로 인한 피로감을 느끼는 것으로 보고되고 있으며, 이러한 피로도는 단순히 부작용 중 하나로 여겨지기도 하지만 내분비선 관련 부작용 발생과 관련이 있는 것으로 알려져 있으므로 혈중 LDH 농도 측정을 통해 더 큰 부작용의 발생 여부를 알아볼 수 있었다 (Naidoo J, Page DB, Li BT, et al. Toxicities of the anti-PD-1 and anti-PD-L1 immune checkpoint antibodies [published correction appears in Ann Oncol. 2016 Jul;27(7):1362]. Ann Oncol. 2015;26(12):2375-2391. doi:10.1093/annonc/mdv383). 또한, 신장에서 urea를 제거할 수 있는 기능이 떨어질수록 혈중 BUN의 농도가 올라가게 되기 때문에 (Edelstein C. L. (2008). Biomarkers of acute kidney injury. Advances in chronic kidney disease, 15(3), 222-234. https://doi.org/10.1053/j.ackd.2008.04.003), 본 실험 결과를 통해 면역관문억제제 투여와 동시에 비피더스균을 섭취하면 면역관문억제제로 인한 신장의 기능 악화 및 피로감을 완화시킬 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.

(3) 면역관문억제제와 본 발명 비피더스균의 병용치료가 종양 조직 내 PDL1 발현에 미치는 영향

각 그룹의 종양 조직 내 PDL1 발현의 차이를 IHC와 qRT-PCR를 통해 확인한 결과, Anti-PD1 + RAPO군이 다른 세 그룹에 비해 유의적으로 PDL1의 발현이 증가하였다 (도 7). 한 연구에 따르면, PDL1의 level이 PD1/PDL1 therapy의 반응성을 직접적으로 알아볼 수 있는 바이오마커로 사용될 수 있으며 실제 비소세포성폐암 환자 중 면역관문억제제 치료를 받은 환자 중 progression-free survival과 ovarall survival이 높은 환자에게서 암 세포내 PDL1의 발현이 높은 것을 확인하였다. 또한, 종양에서 PDL1의 과발현은 IFNγ를 분비하는 tumor infiltrating lymphocyte와 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Darvin P, Toor SM, Sasidharan Nair V, Elkord E. Immune checkpoint inhibitors: recent progress and potential biomarkers. Exp Mol Med. 2018 Dec 13;50(12):1-11). 따라서 IHC와 qRT-PCR 결과들을 통해 면역관문억제제와 Bifidobacterium longum RAPO를 병용하여 치료했을 때 종양 내 PDL1의 발현을 증가시켜 면역관문억제제의 반응성을 높일 수 있는 것으로 판단되었다.

(4) 면역관문억제제와 본 발명 비피더스균의 병용치료가 면역 세포 활성에 미치는 영향

면역관문억제제와 비피더스균의 병용치료 시 면역 세포의 활성을 확인하기 위해 비장 조직과 종양 조직에서 Flow cytometry 실험을 진행한 결과, Anti-PD1 + RAPO군의 비장 내 CD8/CD4 비율이 다른 그룹에 비해 증가하는 경향이 나타났다 (도 8의 C). 세포 독성을 갖는 CD8 T cell은 종양 억제와 관련하여 tumor-specific antigen에 반응하여 anti-PD1을 이용한 항암 치료에서 직접적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 (Leclerc M, Voilin E, Gros G, Corgnac S, de Montpreville V, Validire P, Bismuth G, Mami-Chouaib F. Regulation of antitumour CD8 T-cell immunity and checkpoint blockade immunotherapy by Neuropilin-1. Nat Commun. 2019 Jul 26;10(1):3345), CD8/CD4 비율의 증가를 통해 면역관문억제제와 비피더스균의 병용치료시 anti-PD1의 치료 효과를 증진시킬 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. 또한, NKT cell의 활성은 exhausted CD8 T cell을 재활성화시켜 antitumor immunity를 증가시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Bae EA, Seo H, Kim BS, Choi J, Jeon I, Shin KS, Koh CH, Song B, Kim IK, Min BS, Han YD, Shin SJ, Kang CY. Activation of NKT Cells in an Anti-PD-1-Resistant Tumor Model Enhances Antitumor Immunity by Reinvigorating Exhausted CD8 T Cells. Cancer Res. 2018 Sep 15;78(18):5315-5326). Anti-PD1 + RAPO군이 Anti-PD1군에 비해 NKT cell이 유의적으로 증가한 것을 확인하였으므로 (도 9), 면역관문억제제와 함께 비피더스균의 병용치료 시 비장 조직 내 NKT 세포와 같은 면역 세포의 활성을 통해 면역관문억제제의 치료 효과가 증진된 것으로 판단할 수 있었다.

종양 조직 내 Flow cytometry 실험을 통해 Anti-PD1 + RAPO군이 Anti-PD1군에 비해 NK cell이 다소 증가하는 경향을 나타내었다 (도 13). 종양 미세환경에서 NK cell은 다양한 암종에서 긍정적인 치료 예후와 밀접한 관련이 있으며 종양 세포를 직접적으로 공격할 수 있는 능력을 가지고 있고 NK cell에 의해 tumor cell의 전이가 일차적으로 억제될 수 있는 것으로 알려져 있다 (Larsen SK, Gao Y, Basse PH. NK cells in the tumor microenvironment. Crit Rev Oncog. 2014;19(1-2):91-105. doi:10.1615/critrevoncog.2014011142). 따라서 Anti-PD1과 Bifidobacterium longum RAPO를 병용하여 치료를 진행할 경우 종양 조직 내 anti-tumor 역할을 갖는 NK cell이 증가하여 면역관문억제제의 치료 효과를 극대화시킬 수 있을 것으로 사료되었다.

(5) 면역관문억제제와 비피더스균의 병용치료가 tumor associated macrophages (TAM)에 미치는 영향

최근 면역관문억제제의 저항성에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며 특히 이는 tumor associated macrophages 등과 같은 tumor-associated myeloid cell infiltrates와 관련이 있을 것이라는 가능성이 제기되었다 (Pathria P, Louis TL, Varner JA. Targeting tumor-associated macrophages in cancer. Trends Immunol. 2019;40(4):310-327). Tumor associated macrophages (TAMs)는 크게 M1과 M2, 두 가지 종류로 분화하게 되는데, 전자의 경우 antigen presentation, pro-inflammatory cytokine 분비 등의 역할을 하고, 후자는 anti-inflammatory cytokine 분비 및 면역 억제 역할을 하는 macrophage이다. 즉, tumor 환경에서는 M1이 anti-tumor, M2는 pro-tumor의 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Lu D, Ni Z, et al. Beyond T cells: understanding the role of PD-1/PD-L1 in tumor-associated macrophages. J Immunol Res. 2019;2019:1919082. Huang Y, Snuderl M, Jain RK. Polarization of tumor-associated macrophages: a novel strategy for vascular normalization and antitumor immunity. Cancer cell. 2011;19(1):1-2). 본 발명의 연구 결과, 종양 조직 내 M2 macrophage와 M2/M1 macrophage의 비율이 Anti-PD1 + RAPO군에서 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (도 15).

또한, 종양 조직에서 qRT-PCR을 통해 TAM 관련 마커들을 확인한 결과, Anti-PD1 + RAPO군이 Anti-PD1군에 비해 M1 macrophage와 관련된 IFNγ, TNFα, CXCL9, IL1β의 유전자 발현은 모두 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며 M2 macrophage와 관련된 IL10와 Arg1는 유의적으로 감소, TGFβ와 CCL2는 감소하는 경향을 나타내는 것으로 확인하였다 (도 16~20). 이러한 결과를 통해 면역관문억제제와 비피더스균의 병용치료 시 TAM이 anti-tumor의 방향으로 활성화되고 pro-tumor의 pathway는 억제되어 항암 치료 효과를 증진시킬 수 있을 것으로 사료되었다.

(6) 면역관문억제제와 비피더스균의 병용치료가 immunogenic cell death (ICD)에 미치는 영향

Tumor microenvironment에서 ICD는 anti-tumor immune system을 일으키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 죽은 암세포에서 분비된 DAMPs를 통해 DC 표면의 수용체와 리간드를 끌어들여 성숙한 표현형으로 전환하도록 활성화시켜 DC의 항원에 대한 식작용 및 암세포 사멸을 증가시킴으로써 anti-tumor activity가 활발하게 진행되는 것으로 알려져 있다 (Zhou J , Wang G, et al. Immunogenic cell death in cancer therapy: present and emerging inducers. J cell mol med. 2019;23(8):4854-4865).

항암화학요법, 방사선치료법, 그리고 면역관문억제제를 이용한 항암 치료에서 ICD가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 이러한 ICD 과정에 장내 미생물 조성이 영향을 주는 것으로 알려져 있다 (Chen W, Wang S, Wu Y, Shen X, Guo Z, Li Q, Xing D. Immunogenic cell death: A link between gut microbiota and anticancer effects. Microb Pathog. 2020 Apr;141:103983.). 2018년 Nature Communications에 발표된 연구에 의하면, 환자 유래의 prostate-specific 미생물인 CP1이 암 세포의 ICD 활성을 통하여 anti-PD1을 이용한 면역관문억제제의 anti-cancer effect를 증가시키고 survival 또한 증가한 것이 확인되었다 (Anker JF, Naseem AF, Mok H, Schaeffer AJ, Abdulkadir SA, Thumbikat P. Multi-faceted immunomodulatory and tissue-tropic clinical bacterial isolate potentiates prostate cancer immunotherapy. Nat Commun. 2018 Apr 23;9(1):1591). 이처럼 장내 미생물은 면역 반응을 통해 ICD에 영향을 주며 궁극적으로는 면역관문억제제의 반응성과 밀접한 연관이 있는 것으로 사료되었다.

본 발명에서 ICD와 관련된 마커들의 유전자 발현을 종양 조직에서 qRT-PCR을 통해 확인한 결과, DAMPs의 종류인 HMGB1과 CRT의 유전자 발현이 Anti-PD1 + RAPO군이 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 증가하였다. 또한 병용치료 시 mature DC의 마커인 CD80과 ICD의 활성에 의해 분비되는 IL1β, IL12, IFNγ의 발현이 유의적으로 증가하고 Gzmb 발현은 증가하는 경향을 확인하였다 (도 21~25). 이상과 같은 연구 결과를 통해 면역관문억제제와 함께 Bifidobacterium longum RAPO를 병용치료 시 ICD가 활성화되어 anti-tumor의 면역이 더욱 활성화되는 것을 확인할 수 있었다.

도 26은 마우스 xenograft 모델에서 본 발명의 Bifidobacterium longum RAPO 균주와 면역 체크포인트 억제제들의 컴비네이션 효과와 관련된 분자 메커니즘을 요약해서 보여준다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1: 본 발명 Bifidobacterium의 Anti-PD1 면역관문억제제의 치료 효과 증진 확인]

1. 실험 방법

가. 실험동물

5주령의 암컷 BALB/c mice는 중앙실험동물 (Central Lab. Animal Inc. Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 22±1 ℃의 온도와 12/12시간의 명암주기에서 chow diet와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 1주 간의 적응기 이후 AIN-76A diet를 공급하였으며, 4T1 mouse breast cancer cell line을 피하 주사하여 유방암 동물모델을 유도한 뒤 군당 평균 체중이 유사하도록 무작위로 선출하여 다음과 같이 5군으로 분류하였다: ① 대조군 (Normal Control; NC), ② 종양 대조군 (Tumor Control; TC), ③ 비피더스 단독 투여군 (Bifidobacterium longum RAPO; RAPO), ④ 면역관문억제제 투여군 (Anti-PD1), ⑤ 병용치료군 (Anti-PD1 + Bifidobacterium longum RAPO; Anti-PD1 + RAPO).

유방암 세포주 투여 후 tumor volume이 50-150 mm³에 도달하였을 때 Anti-PD1 그룹과 Anti-PD1 + RAPO 그룹은 면역관문억제제인 Anti-PD1 (Bioxcell)을 phosphate buffered saline (PBS)에 녹여 한 마리당 200 μg씩 복강 내 주사를 통하여 1회/3일 간격으로 공급하고 RAPO 그룹과 Anti-PD1 + RAPO 그룹은 Anti-PD1 첫 번째 투여 2일 전부터 Bifidobacterium longum RAPO를 매일 경구 투여하였다 (1×10⁹ CFU/mouse). 실험 기간 동안 체중, 식이섭취량 및 종양 크기를 주 2-3회 일정한 시간에 측정하였다. 마취제를 흡입시켜 실험동물의 움직임을 방지하고 고통을 최소화하여 심장채혈을 통해 안락사시켰다. 혈액은 심장 채혈하여 3,000 rpm, 4℃, 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 조직은 적출 후 식염수에 세척한 뒤 물기를 제거하여 무게를 측정하였다. Flow Cytometry 실험을 위한 비장과 종양 조직을 일부 잘라내어 ice에 담긴 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에 담고 남은 조직은 액체질소로 급속 냉동시켜 -80℃ deep freezer에 보관하였다.

나. Serum biochemical parameter 측정

마우스의 혈액에서 분리한 혈청은 AU480 (Beckman Coulter, USA)을 이용하여 각 지표를 분석하였으며, aspartate aminotransferse (AST), alanine aminotransferase (ALT)와 lactate dehydrogenase (LDH)는 international federation of clinical chemistry (IFCC) 표준법에 따라 시험을 진행하였다. Blood urea nitrogen (BUN)은 urease를 이용한 효소법을 이용하였고, creatinine은 Jaffe법을 이용하여 분석하였다.

다. 종양 조직 내 Immunohistochemistry (IHC) staining을 통한 PD-L1 발현 관찰

종양 조직의 일부를 식염수로 세척한 뒤 10% 포르말린에 고정시켜 파라핀 절편을 제작하고 PD-L1 antibody (eBioscience)를 이용하여 IHC staining을 실시하였다. 염색된 종양 결절은 광학현미경 (Aperio Sanscope AT, Aperio image Scope(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA)으로 관찰해 PD-L1 발현 정도를 판독하였다.

라. 종양 및 비장 조직의 Flow Cytometry 분석

마우스에게서 얻은 일정량의 종양 조직과 비장을 DMEM에 넣고 cell strainer와 1ml syringe를 이용하여 걸러주었다. 이 과정을 통해 얻은 cells은 RBC lysis buffer 처리를 하고 PBS로 2번 세척하였다. FACS staining buffer에 재혼합하고 CD3, CD4, CD8a, CD45, CD11b, F4/80, CD206, CD38, NKp46, Gr1, CD103과 I-A/I-E 항체를 혼합하여 4℃에서 30분간 방치한 후 FACS 분석을 실시하였다.

마. 종양 조직의 RT-qPCR 분석을 통한 면역 관련 유전자의 발현 비교

일정량의 종양 조직에 각각 Trizol 용액을 넣고 균질화시킨 후에 chloroform을 넣고 원심 분리하였다. 수거된 pellet에 70% DEPC ethanol을 첨가한 후 원심 분리하여 pellet을 얻고 air dry 시킨 후 DEPC를 넣어 RNA의 순도를 확인하고 0.25 ug/ul로 정량하였다. 정량 후 cDNA synthesis kit (Genepole, Seoul, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA, primer, SYBR kit (Genepole, Seoul, Korea)를 혼합한 뒤 7500 ABI real-time PCR system을 이용하여 측정하였다.

2. 실험 결과

가. 체중, 식이섭취량 및 Tumor volume

(1) 체중변화 및 군 간 최종체중 비교

대조군 (NC), 종양대조군 (TC), Bifidobacterium longum RAPO 투여군 (RAPO), 면역관문억제제 단독투여군 (Anti-PD1), 면역관문억제제와 Bifidobacterium longum RAPO 병용치료군 (Anti-PD1 + RAPO)의 체중 변화를 관찰한 결과와 희생 직전 체중을 비교한 결과를 도 1과 표 1에 각각 제시하였다. 유방암세포 4T1을 inoculation한 후 면역관문억제제를 투여한 15일 중 마지막 날인 day 15에 NC군이 다른 네 그룹에 비해 체중이 유의적으로 낮았다 (P=0.0385) (도 1, 표 1).

최종 체중

Group	Body weight (g)
NC	18.02±0.32^b
TC	19.13±0.17^a
RAPO	18.83±0.25^a
Anti-PD1	19.24±0.27^a
Anti-PD1 + RAPO	18.97±0.26^a
P-value	0.0385

주) Values are presented as the mean ± SEM. Means with different superscript letter are significantly different at P < 0.05. n = 15 per group, except for NC (n = 10).

주) Standard error of mean (SEM)

(2) 식이섭취량

각 군 별 평균 식이섭취량을 관찰한 결과를 표 2에 제시하였다. 모든 군에게 AIN-76A diet를 제공하고 식이섭취의 차이를 관찰한 결과, Anti-PD1 + RAPO군이 다른 네 그룹에 비해 식이섭취량이 유의적으로 감소하였으며, NC군이 TC군에 비해 식이섭취량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다 (P<.0001).

식이섭취량

Group	Food intake (g/day)
NC	2.22±0.01^b
TC	2.31±0.02^a
RAPO	2.27±0.01^ab
Anti-PD1	2.27±0.02^ab
Anti-PD1 + RAPO	2.15±0.02^c
P-value	<.0001

(3) Tumor volume 변화

본 실험 4T1 xenograft 모델의 tumor volume 변화를 도 2에 나타냈다. Anti-PD1를 투여하기 시작한 날을 기준으로 tumor volume을 측정한 결과, Day 9에는 TC군이 다른 세 그룹에 비해 tumor volume이 유의적으로 증가하였다 (P=0.0005), Day 12에는 Anti-PD1 + RAPO군의 tumor volume이 TC군과 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 감소하여 네 군 중 tumor volume 평균값이 가장 작은 것을 관찰하였고, RAPO군의 경우 TC군에 비해 tumor volume이 유의적으로 감소하였다 (P<.0001). Day 15에는 TC군에 비해 다른 세 군의 tumor volume이 모두 유의적으로 감소함을 확인하였다 (P=0.0005) (도 2).

나. 해부 후 조직 무게 비교

암 세포를 주입한 네 그룹 간 carcass weight (동물 희생 후 종양을 제거한 시체 무게)와 암의 무게를 비교한 결과를 표 3에 나타내었다. Carcass weight는 각 군 간 유의적인 차이가 관찰되지 않았으나, Bifidobacterium longum RAPO를 투여한 RAPO군과 Anti-PD1 + RAPO군에서 carcass weight이 증가하는 경향을 보였다. 암의 무게는 유의적인 차이를 확인할 수 없었다 (표 3).

Carcass and tumor weights

Group	Carcass (g)	Tumor (g)
TC	18.29±0.42	0.56±0.05
RAPO	18.75±0.32	0.45±0.06
Anti-PD1	18.13±0.24	0.48±0.02
Anti-PD1 + RAPO	18.71±0.29	0.55±0.05
P-value	0.4742	0.3049

주) Values are presented as the mean ± SEM. n = 7 per group.

군 별 뇌, 폐, 간과 신장의 무게를 나타낸 낸 결과를 표 4에 나타내었다. 뇌와 신장의 무게는 모든 군에서 유의적인 차이를 확인할 수 없었다. 폐와 간의 무게는 암 세포를 주입한 네 그룹 모두 NC군에 비해 무게가 유의적으로 증가한 것을 확인하였다 (폐, P=0.0443; 간, P<.0001). 간의 무게가 Anti-PD1군이 다른 그룹들에 비해 증가하는 경향을 보인 반면, Anti-PD1 + RAPO군에서 Anti-PD1군에 비해 감소하는 경향을 보였다 (표 4).

뇌, 폐, 간 및 신장 무게

Group	Brain (g)	Lung (g)	Liver (g)	Kidney (g)
NC	0.40±0.00	0.13±0.00^b	0.69±0.01^b	0.25±0.00
TC	0.43±0.03	0.16±0.00^a	0.85±0.02^a	0.26±0.00
RAPO	0.39±0.01	0.16±0.00^a	0.85±0.04^a	0.27±0.01
Anti-PD1	0.41±0.01	0.16±0.01^a	0.94±0.04^a	0.26±0.01
Anti-PD1 + RAPO	0.41±0.01	0.16±0.01^a	0.89±0.03^a	0.26±0.01
P-value	0.4605	0.0443	<.0001	0.6312

주) Values are presented as the mean ± SEM. Means with different superscript letter are significantly different at P < 0.05. n = 7 per group.

군 간 심장, 비장 그리고 흉선의 무게를 나타낸 결과를 표 5에 나타내었다. 심장과 흉선의 무게는 군 간 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 비장의 무게는 NC군에 비해 나머지 네 그룹에서 유의적으로 증가하였다 (P<.0001) (표 5).

심장, 비장 및 흉선 무게

Group	Heart (g)	Spleen (g)	Thymus (g)
NC	0.09±0.00	0.09±0.00^b	0.05±0.00
TC	0.10±0.00	0.66±0.03^a	0.05±0.00
RAPO	0.10±0.00	0.57±0.03^a	0.05±0.00
Anti-PD1	0.09±0.00	0.65±0.06^a	0.04±0.00
Anti-PD1 + RAPO	0.09±0.00	0.65±0.03^a	0.05±0.00
P-value	0.4968	<.0001	0.3459

다섯 그룹의 소장과 대장의 무게, 대장의 길이를 나타낸 결과를 표 6에 나타냈다. 소장의 무게와 대장의 무게에서는 군간 유의적인 차이를 확인할 수 없었으나, 대장의 길이가 Anti-PD1군에서 유의적으로 짧아진 반면 Anti-PD1 + RAPO군은 Anti-PD1군보다 대장 길이가 길어진 것을 확인하였다 (P=0.0151) (표 6).

소장 무게, 대장 무게 및 대장 길이

Group	Small intestine weights (g)	Colon weights (g)	Colon length (cm)
NC	0.80±0.03	0.16±0.01	8.97±0.16^a
TC	0.84±0.04	0.13±0.01	8.89±0.24^a
RAPO	0.87±0.03	0.13±0.01	8.16±0.39^ab
Anti-PD1	0.84±0.02	0.13±0.01	7.66±0.30^b
Anti-PD1 + RAPO	0.78±0.02	0.14±0.01	8.60±0.27^a
P-value	0.2776	0.1482	0.0151

다.　Serum biochemical parameter 측정

앞서 대장길이 결과를 통해 면역관문억제제 및 비피더스균 병용요법 시 면역항암제로 인해 발생할 수 있는 다양한 부작용의 완화 효과의 가능성을 확인하여 이에 대해 더 규명하고자 실험동물의 혈청에서 aspartate aminotransferse (AST), alanine aminotransferase (ALT), blood urea nitrogen (BUN), creatinine, lactate dehydrogenase (LDH)의 농도를 측정하였다.

(1) 간 기능 지표 (AST, ALT)

간의 기능 이상을 알아볼 수 있는 AST와 ALT의 농도를 표 7과 도 3에 각각 나타내었다. AST와 ALT는 간의 손상 정도를 알아볼 수 있는 혈액 효소 바이오마커로서 염증이 생기면 간세포가 파괴되면서 간 내에 존재하던 AST와 ALT가 유리되어 혈액 내에 존재하게 된다. 따라서, serum AST와 ALT이 증가할수록 간의 손상도가 높다는 것을 의미하며, 특히 ALT의 경우 다른 조직에서보다 간에서 가장 많이 존재하므로 혈중 ALT 농도가 높을수록 간의 손상과 더 연관이 있다 (Toita, R., Kawano, T., Fujita, S., Murata, M., & Kang, J. H. (2018). Increased hepatic inflammation in a normal-weight mouse after long-term high-fat diet feeding. Journal of toxicologic pathology, 31(1), 43-47).

본 실험 결과, 혈중 AST와 ALT 농도는 네 그룹 간 유의한 차이를 보이지 않았으나 혈중 AST 농도는 Anti-PD1군에서 다소 감소하는 경향을 보였으며 혈중 ALT 농도는 RAPO군에서 증가하는 경향을 보였다 (표 7).

혈청(serum) AST and ALT 수준

Group	AST (U/L)	ALT (U/L)
TC	101.42±9.94	16.75±1.38
RAPO	103.38±9.40	20.60±1.08
Anti-PD1	94.95±2.51	18.60±0.75
Anti-PD1 + RAPO	113.40±4.93	18.60±0.75
P-value	0.8031	0.7702

주) Values were expressed as mean ± SEM. n = 4-5 per group.

(2) 신장 기능 지표 (BUN, Creatinine)

신장의 기능을 알아볼 수 있는 혈청 BUN과 크레아틴의 농도를 표 8과 도 4에 각각 나타내었다. 일반적으로 급성 신부전을 진단하는 방법인 BUN과 혈중 크레아틴 농도를 네 그룹에서 확인한 결과, 두 가지 지표 모두 네 그룹 간 유의미한 차이를 확인할 수 없었으나 BUN의 농도가 비피더스균을 섭취한 RAPO군과 Anti-PD1 + RAPO군에서 감소하는 경향을 보였다 (표 8).

혈청 BUN 및 크레아틴 수준

Group	BUN (mg/dl)	creatinine (mg/dl)
TC	15.74±1.05	0.40±0.00
RAPO	14.73±1.63	0.40±0.00
Anti-PD1	15.33±0.15	0.40±0.00
Anti-PD1 + RAPO	14.58±0.64	0.40±0.00
P-value	0.8168	0.5272

주) Values were expressed as mean ± SEM. n = 4-5 per group.

(3) 피로 관련 지표 (LDH)

피로 관련 지표인 혈중 LDH 농도를 도 5에 나타내었다. 네 그룹의 혈중 LDH 농도를 측정한 결과, Anti-PD1 그룹에서 증가하는 경향을 보였으며 Anti-PD1 치료와 함께 비피더스균을 섭취할 경우 혈중 LDH 농도가 감소하는 경향을 나타냈다 (표 9).

혈청 LDH 농도

Group	LDH (U/L)
TC	1234.20±126.12
RAPO	1291.80±128.71
Anti-PD1	1347.75±20.93
Anti-PD1 + RAPO	1186.40±154.84
P-value	0.6482

주) Values were expressed as mean ± SEM. n = 4-5 per group.

라. 종양 조직 내 Immunohistochemistry (IHC) 염색을 통한 PDL1 발현 관찰

면역관문억제제 중 해당 예비실험에 사용된 Anti-PD1은 tumor microenvironment 내 PD-L1의 발현이 높을수록 Anti-PD1 면역관문억제제에 의한 항암효과가 증가하는 경향이 있는 것으로 알려져 있다 (Eno J. Immunotherapy through the years. J Adv Pract Oncol. 2017;8(7):747-753.). 이처럼 Anti-PD1의 효과를 예측할 수 있는 바이오마커인 종양 조직에서의 PDL1의 발현을 IHC 염색을 통해 확인한 결과, Anti-PD1 + RAPO군의 종양 조직에서 PD-L1 발현이 나머지 군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인하였다 (P=0.0120) (도 6).

뿐만 아니라, 종양 조직에서 RT-qPCR를 실시하여 PDL1 mRNA 발현을 확인한 결과 역시 Anti-PD1 + RAPO군에서의 PDL1 유전자 발현이 다른 군들에 비해 유의적으로 증가하였다 (P=0.0181) (도 7).

마. 비장 및 종양 조직의 Flow Cytometry 분석

면역관문억제제와 프로바이오틱스의 병용치료가 항암치료 관련 면역세포의 발현에 미치는 영향을 검증하기 위해 비장과 암 조직에서 세포를 추출하여 Flow Cytometry를 실시한 결과를 다음과 같이 제시한다.

(1) 비장 조직의 Flow Cytometry 결과

비장 조직 내의 CD4+ CD3+ T cells과 CD8+ CD3+ T cells은 군 간 유의미한 차이가 없었으나, Anti-PD1 + RAPO군이 Anti-PD1군에 비해 CD8/CD4 T cell의 비율이 높은 경향을 관찰할 수 있었다 (도 8의 C).

비장 세포의 natural killer T cell (NKT cell)을 확인한 결과, Anti-PD1 + RAPO군은 RAPO군과 Anti-PD1군에 비해 NKT cell이 유의적으로 증가하였으며 (P<.0001) (도 9), Natural killer cell (NK cell)의 경우 종양(tumor)을 접종( inoculation)한 네 그룹이 NC군에 비해 모두 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (P=0.0063) (도 10).

비장 조직 내 dendritic cell (DC), myeloid-derived suppressor cell (MDSC), macrophage를 확인한 결과를 도 11에 나타내었다. DC와 macrophage는 모든 군간 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, tumor를 inoculation한 TC, RAPO, Anti-PD1과 Anti-PD1 + RAPO군이 NC군에 비해 MDSC가 유의적으로 증가한 것을 확인하였다 (P<.0001) (도 11의 B).

(2) 종양 조직의 Flow Cytometry 결과

종양 조직에서 CD4+ CD3+ T cells, CD8+ CD3+ T cells과 CD8/CD4 ratio 모두 군 간 유의미한 차이를 확인할 수 없었다 (도 12).

종양 조직 내 NK cell을 확인한 결과, RAPO군이 TC군과 Anti-PD1군에 비하여 NK cell의 유의적인 증가를 확인할 수 있었고, Anti-PD1 + RAPO군은 Anti-PD1에 비해 NK cell이 다소 증가하는 경향을 확인하였다 (P=0.131) (도 13).

종양 조직의 DC는 RAPO군, Anti-PD1군과 Anti-PD1 + RAPO군이 TC군에 비해 유의적으로 증가하였다 (P=0.0007) (도 14).

종양 조직 내 M1 macrophage (anti-tumor)와 M2 macrophage (pro-tumor)를 확인한 결과를 도 15에 나타냈다. M1 macrophage는 군 간 유의적인 차이를 확인할 수 없었으나 RAPO군에서 증가하는 경향을 나타냈다. M2 macrophage는 Anti-PD1 + RAPO군이 TC군과 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (P=0.0249) (도 15의 B). 또한, M2/M1 macrophage ratio를 확인한 결과 RAPO군이 TC군과 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 감소하였고 Anti-PD1 + RAPO군이 TC군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인하였으며 (P=0.0105), Anti-PD1 + RAPO군은 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 감소하였다 (P=0.0075) (도 15의 C).

바. 종양 조직 내 항암 증진 효과 관련 유전자 발현 측정 결과

(1) Tumor associated macrophages (TAM) 및 면역 관련 유전자 발현 측정

Tumor microenvironment에서 anti-tumor의 역할을 하는 M1의 마커로 알려진 사이토카인 중 interferon gamma (IFNγ), tumor necrosis factor alpha (TNFα), C-X-C motif chemokine lignad 9 (CXCL9)의 종양 조직 내 mRNA expression을 RT-qPCR을 이용하여 측정한 결과를 도 16~18에 나타냈다.

종양 조직에서의 IFNγ mRNA expression은 Anti-PD1 + RAPO군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었고 (P=0.0223) (도 16), TNFα 유전자 발현은 Anti-PD1 + RAPO군이 TC군과 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 증가하였으며 RAPO군은 TC군에 비해 유의적인 증가를 나타내었다 (P=0.0078) (도 17).

종양 조직에서 CXCL9의 유전자 발현은 Anti-PD1 + RAPO군이 TC군과 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 증가하였다 (P=0.0028) (도 18). 또한, M1 macrophage에 의해 분비되는 사이토카인으로 알려진 interleukin 1β (IL1β)와 interleukin 12 (IL12)의 종양 조직 내 유전자 발현을 확인하였을 때 Anti-PD1 + RAPO군에서 다른 그룹에 비해 유의적으로 증가하였다 (IL1β, P=0.0002; IL12, P=0.0330) (도 25의 A, 25의 B).

Pro-tumor 역할을 갖고 있는 M2의 마커로 알려져 있으며 monocytes와 myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)의 회복(recruitment)를 촉진하여 tumor growth와 metastasis를 증가시키는 C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2)와 M2이 분비하는 것으로 알려진 사이토카인 중 interleukin 10 (IL10), arginase 1 (Arg1)과 transforming growth factor β (TGFβ)의 mRNA expression 정도를 암 조직 내에서 RT-qPCR을 통해 확인한 결과를 도 19 및 20에 나타냈다. 그 결과, CCL2의 유전자 발현은 군 간 유의미한 차이를 확인할 수 없었으나 Anti-PD1 + RAPO군에서 해당 유전자 발현이 감소하는 경향을 나타냈다 (도 19).

RAPO군과 Anti-PD1 + RAPO군이 TC군과 Anti-PD1군에 비해 종양 조직에서의 IL10 mRNA 발현이 감소하는 경향을 나타냈으며 특히 Anti-PD1 + RAPO군이 Anti-PD1군에 비해 IL10의 유전자 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (P=0.0394) (도 20의 A). 종양 조직 내 TGFβ의 유전자 발현을 확인한 결과, 군 간 유의적인 차이를 확인할 수 없었으나 Anti-PD1 + RAPO군이 RAPO군과 Anti-PD1군에 비해 다소 감소하는 경향이 있었다 (도 20의 B). 또한, 종양 조직에서 Arg1 mRNA 발현은 TC과 Anti-PD1 + RAPO군에서 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 감소하였다 (P=0.0445) (도 20의 C).

(2) Immunogenic cell death (ICD) 관련 유전자 발현 측정

종양 미세환경 (Tumor microenvironment)에서 죽은 암세포에서 분비되는 damage-associated molecular patterns (DAMPs)는 dendritic cells (DCs)를 성숙시켜 항암 효과를 증진시키는 것으로 알려져 있는데 이 DAMPs 중 high mobility group B1 (HMGB1), careticulin (CRT)의 유전자 발현을 종양 조직에서 확인하였으며 그 결과를 도 21 및 22에 나타내었다. Anti-PD1 + RAPO군의 종양 조직에서 HMGB1의 유전자 발현이 TC군과 Anti-PD1군에 비해 유의적으로 증가하였다 (P=0.0271) (도 21). 또한, CRT mRNA 발현 역시 Anti-PD1 + RAPO군에서 유의적인 증가를 나타내었다 (P=0.0345) (도 22).

ICD를 통해 활성화된 DC의 마커로 알려진 CD80과 CD86의 종양 조직 내 mRNA 발현을 확인한 결과를 도 23 및 24에 나타냈다. 종양 조직 내 CD80 유전자 발현이 Anti-PD1 + RAPO군이 다른 군에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인하였으며 (P=0.0225) (도 23), CD86의 유전자 발현에는 군 간 유의적인 차이는 없었으나 Anti-PD1 + RAPO군이 다른 그룹들에 비해 증가하는 경향을 나타내었다 (도 24).

성숙하여 활성화된 DC가 분비하는 것으로 알려진 사이토카인 중 IL1β, interleukin 12 (IL12)와 ICD로 인해 강화된 면역 세포가 암 세포를 사멸시키기 위해 분비하는 Granzyme B (Gzmb)의 종양 조직 내 유전자 발현을 확인한 결과를 도 25에 나타내었다. IL1β의 종양 조직 내 유전자 발현이 Anti-PD1 + RAPO군이 다른 군들에 비해 유의적으로 증가한 것으로 나타났고 (P=0.0002) (도 25의 A), Anti-PD1 + RAPO군의 종양 조직에서 IL12 mRNA 발현 역시 유의적으로 증가하였음을 확인하였다 (P=0.0330) (도 25의 B). 종양 조직 내 Gzmb의 유전자 발현은 Anti-PD1 + RAPO군이 TC군과 RAPO군에 비해 유의적으로 증가하였으며 Anti-PD1군에 비해서는 다소 증가한 경향을 보였다 (P=0.0416) (도 25의 C). 뿐만 아니라, ICD의 증가로 인해 분비되는 사이토카인 중 하나인 IFNγ의 유전자 발현 역시 Anti-PD1 + RAPO군에서 유의적으로 증가한 것을 앞서 확인한 바가 있다 (P=0.0223) (도 16).

Claims

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비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP) 및 anti-PD1 면역항암제를 포함하며,
상기 anti-PD1 면역항암제의 간, 대장 및 신장에 대한 부작용이 저감된 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제4항에 있어서,
비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) RAPO (KCTC13773BP) 균주와 anti-PD1 면역항암제는 하나의 제형으로 동시에 투여되거나, 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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