KR102214865B1 - 파이토글리코겐 나노입자와 이를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

파이토글리코겐 함유 식물 재료에서 정제된 파이토글리코겐 나노입자의 조성물이 제공된다. 파이토글리코겐 나노입자의 조성물은 단분산성이다. 파이토글리코겐 함유 식물 재료에서 조성물을 분리하는 방법이 제공되고, 이 방법은, 미량여과 및 한외여과의 단계를 포함하지만, 파이토글리코겐 재료를 열화시키는 화학, 효소 또는 열 처리의 사용을 방지한다.

Description

파이토글리코겐 나노입자와 이를 제조하는 방법{PHYTOGLYCOGEN NANOPARTICLES AND METHODS OF MANUFACTURE THEREOF}

관련 출원에 대한 상호 참조

이 출원은, 2013년 4월 26일 출원된 미국 특허 출원 제 61/816,686호로부터 우선권을 주장하고, 그 내용은 여기 완전히 포함된다.

기술 분야

본 발명은, 파이토글리코겐(phytoglycogen) 나노입자와, 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

파이토글리코겐과 글리코겐은, α-1,6-글루코시딕 결합을 통해 크게 분지된 α-1,4-글루칸 사슬로 이루어진 글루코오스의 다당류로, 이는 식물과 동물 세포에서 에너지 저장 매체로 작용한다. 글리코겐은 동물 조직에 20 ~ 200㎚의 직경을 갖는 조밀한 입자 형태로 존재한다. 글리코겐은 또한 미생물, 예를 들어, 세균과 효모균에 축적하는 것으로 밝혀진다. 파이토글리코겐은 그 구조와 물리적 특성의 양쪽 면에서 글리코겐과 유사한 다당류이고, 식물에서 기원한다.

글리코겐과 파이토글리코겐은 "매우 다분산성인" 또는 이종 물질(heterogeneous material)로 간주된다. 일반적으로 글리코겐은 공지된 제조물(preparation)에 대해서 상응하는 큰 다분산성을 갖고 10⁶ 내지 10⁸ 달톤의 분자량을 갖는다. 동물과 식물 조직 및 추출된 글리코겐/파이토글리코겐 제조물의 투과 전자 현미경검사(transmission electron microscopy)(TEM) 관찰은 이러한 다당류의 미립자 성질을 밝혀내었다. 일반적으로 보고된 글리코겐 또는 파이토글리코겐 입자 직경은 20 ~ 300㎚의 범위에 있고 연속적 또는 다절성(multinodal) 크기 분포 중 어느 하나를 갖는다. 작은, 20 ~ 30㎚ 입자는 β-입자라고 불리고, 큰, 100 ~ 300㎚ 입자는 α-입자라고 불린다. α-입자는 응집(aggregation) 또는 군집화(clustering)[1]에 의해 β-입자로 이루어질 것으로 간주된다.

가장 흔하게는 생물학적 시료에 축적된 전체 글리코겐의 양을 정량할 목적으로, 드물게는 글리코겐을 하나의 제품으로 용도에 사용할 목적으로, 생물(living organism)에서 글리코겐과 파이토글리코겐을 분리하기 위해 여러 방법이 개발되었다.

가장 흔하게 사용된 방법은, 글리코겐을 축적하는 그 능력 때문에, 동물 조직, 특히 해양 동물, 특히 연체동물로부터의 추출이다. 예를 들어, 미국 특허 5,734,045는, 고온의 알칼리 추출에 이어, 중화 및 생성된 용액을 양이온 수지로 처리하는 것을 사용하여 홍합으로부터 단백질 미함유 글리코겐을 제조하기 위한 공정을 개시한다. 글리코겐은, 예를 들어, 특허 출원 WO/1997/021828에 기술된 바와 같이 효모균의 발효를 통해 또한 생성될 있다. 미국 특허 7,670,812는, 효소의 혼합물을 저 분자량의 덱스트린에 노출시켜 글리코겐과 같은 다당류의 생합성 생산을 위한 공정을 기술한다. 사탕 옥수수와 찹쌀은 글리코겐의 공급원으로 사용될 수 있다; 예를 들어, 찹쌀의 낟알로부터 글리코겐을 분리하는 공정을 기술하는 특허 출원 EP0860448B1을 참조한다.

글리코겐/파이토글리코겐 분리의 주요 단계는, 일반적으로, 분쇄(pulverization)/그라인딩(grinding)/밀링(milling) 등을 통한 바이오매스 분해(biomass disintegration); 수상 안으로 글리코겐 추출; 여과 및/또는 원심분리를 통한 불용성 고체 입자의 분리; 미세하게 분산되거나 용해화된 지질, 단백질, 및 저 분자량의 오염물의 제거; 및 농축과 건조를 포함한다.

제 2 추출 단계에서 글리코겐의 수득율을 높이기 위해, 추출은 흔히 상승된 온도에서 수행되고/수행되거나 알칼리성 또는 산성 용액을 사용하여 수행된다. 이러한 절차는, 고온 농축된(20 ~ 40%) 알칼리 용액[2,3], 차가운 산성[4] 또는 끓는 물[5]로 분쇄된 생물학적 재료를 초기 처리하는 것을 포함한다.

글리코겐 분리/정제의 종래 방법에 사용된 절차는, 저 분자량 생성물의 상당한 증가 및 분자의 화학적 변화와 함께, 글리코겐 구조의 상당한 가수분해를 가져온다.

냉수 추출[6]과 같이 더 부드러운 추출 절차가 개발되었고, 생성된 생성물은 글리코겐 자연 상태의 세밀한 표현일 것으로 주장되었다. 그러나, 냉수 추출에 의해 생성된 공지된 글리코겐 제조물은 매우 다분산성이다 [7,1].

미세하게 분산된 단백질, 지질, 핵산, 및 다른 다당류로부터 미정제(crude) 글리코겐 추출물을 정제하는 단계를 수행하기 위한 여러 단계가 알려져 있다. 단백질과 핵산은, 데옥시콜레이트(deoxycholate)(DOC) 트리클로아세트산(TCA), 다가 양이온, 및/또는 효소(프로테아제, 뉴클레아제) 처리를 이용한 선택적 침전을 통해 제거될 수 있다. 또한, 염석(예를 들어, 황산 암모늄으로) 또는 이온 교환에 의해 단백질을 제거하는 방법이 사용되었다. 단백질을 제거하는 다른 일반적인 방법은, 보통 65 ~ 100℃에서의 열 응고(thermal coagulation)에 이은, 원심분리 또는 여과이다. 파이토글리코겐 추출물의 단백질을 응고시키기 위해 고압살균(autoclaving)(1 atm에서 121℃)이 또한 사용되었다[8]. 또한, 단백질과 지질은 페놀-물 추출로 제거될 수 있다.

국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/019977(Yao)은 파이토글리코겐을 포함하는 추출물을 얻는 방법을 교시하고, 상기 방법은, 한외여과(ultrafiltration)를 포함하지만, 수성 추출물이 효소 처리(파이토글리코겐 및 뿐만 아니라 다른 다당류를 모두 열화시키는)를 거치도록 하는 단계를 또한 포함한다. 야오(Yao)는 베타-전분분해(amylolysis), 즉, 베타-아밀라제를 사용하는 효소 가수분해를 거치게 하여 파이토글리코겐 재료의 점도를 낮추는 방법을 제공한다. 야오의 방법에 의해 수득된 "정제 파이토글리코겐" 재료는, 파이토글리코겐뿐만 아니라, 베타-덱스트린 및 다른 다당류의 소화 생성물을 포함하는 파이토글리코겐의 유도체를 포함한다. 야오의 방법은 추출물을 100℃까지 가열하는 단계를 더 필요로 한다 (야오의 예 1 참조).

미국 특허 5,895,686은, 물 또는 물을 함유하는 용매(실온에서)에 의해 쌀에서 파이토글리코겐을 추출하고 열 변성(thermal denaturation) 및 TCA 침전에 의해 단백질을 제거하는 방법을 개시한다. 생성물은, 상응하여 높은 다분산성 및 큰 수용액 점도를 가지면서, 다절성 분자량 분포를 갖는다. 이러한 특성은, 식물 재료의 글리코겐 제조물에 상당한 양의 아밀로펙틴과 아밀로오스의 존재뿐만 아니라, 글리코겐 추출 공정 동안 글리코겐 열화에 기인할 수 있다.

미국 특허 5,597,913과 5,734,045는, 실질적으로 질소 화합물을 함유하지 않고 단백질과 핵산에서 그 순도의 표시로 당을 줄이는 글리코겐을 생성하는 절차를 기술한다. 이러한 특허는 높은 pH의 용액에서 선택된 조직을 끓이는 단계를 사용하는 것을 교시한다.

본 발명의 소유자에게 양도된 미국 특허 출원 공개 번호 US 20100272639A1은, 세균(bacteria)과 조개류 바이오매스(shell fish biomass)로부터 글리코겐을 분리하는 공정을 제공한다. 세균은, 이 공정이 아밀로펙틴 및 아밀로오스와 같은 다른 고 분자량의 다당류를 갖지 않고 조개류 또는 동물 조직과 연관된 병원성 세균, 기생균(parasite), 바이러스, 및 프라이온(prion)을 함유하지 않는 바이오매스를 산출하도록 수행될 수 있기 때문에 바람직한 것으로 교시된다. 개시된 공정은, 일반적으로, 프렌치 프레싱(French pressing) 또는 화학 처리에 의한 세포 분해; 원심분리에 의한 불용성 세포 성분의 분리; 효소 처리에 이어서 미정제 다당류와 리포다당류(lypopolysaccharide)(LPS)를 함유하는 추출물을 생성하는 투석 또는, 대안적으로, 페놀-물 추출에 의해 세포 용해물(cell lyzate)로부터 단백질과 핵산을 제거하는 것; 약산 가수분해에 의하거나 또는 불용성 LPS 생성물의 침전을 일으키는 다가 양이온의 염을 이용한 처리에 의한 LPS의 제거; 한외여과 및/또는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 글리코겐이 풍부한 분율(fraction)의 정제; 적절한 유기 용매 또는 한외여과 또는 초원심분리(ultracentrifugation)에 의해 얻어질 수 있는 농축 글리코겐 용액을 이용한 글리코겐의 침전; 및 글리코겐의 분말을 생성하기 위한 동결 건조의 단계들을 포함한다. 세균 바이오매스(bacterial biomass)로부터 분리된 글리코겐은 MWt 5.3 ~ 12.7 × 10⁶ Da을 특징으로 했고, 직경 35 ~ 40㎚ 입자 크기를 가졌으며, 단분산성이었다 (PDI = M_n/M_w = 1.007 ~ 1.03).

일 실시예에는, 파이토글리코겐 함유 식물 재료에서 얻어진 파이토글리코겐 나노입자의 조성물이 기술되어 있고, 파이토글리코겐 나노입자는 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정되는 0.3 미만의 다분산성 지수를 갖는다. 일 실시예에서, 파이토글리코겐 나노입자는 DLS에 의해 측정되는 0.2 미만의 다분산성 지수를 갖는다. 일 실시예에서, 파이토글리코겐 나노입자는 DLS에 의해 측정되는 0.1 미만의 다분산성 지수를 갖는다.

일 실시예에서, 파이토글리코겐 나노입자는 약 30㎚ 내지 약 150㎚의 평균 입자 직경을 갖는다. 일 실시예에서, 파이토글리코겐 나노입자는 약 60㎚ 내지 약 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는다.

일 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 조성물은 약 30㎚ 내지 약 150㎚의 평균 입자 직경을 갖는 80% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함한다. 일 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 조성물은 약 30㎚ 내지 약 150㎚의 평균 입자 직경을 갖는 90% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함한다. 일 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 조성물은 약 30㎚ 내지 약 150㎚의 평균 입자 직경을 갖는 99% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함한다. 일 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 조성물은 약 60㎚ 내지 약 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는 80% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함한다. 일 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 조성물은 약 60㎚ 내지 약 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는 90% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함한다. 일 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 조성물은 약 60㎚ 내지 약 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는 99% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함한다.

일 실시예에서, 파이토글리코겐 함유 식물 재료는 옥수수, 쌀, 보리, 수수, 또는 그 조합으로부터 얻어진다. 일 실시예에서, 파이토글리코겐 함유 식물 재료는 표준형(su) 또는 당질 증량제(surgary extender)(se) 형 사탕 옥수수이다. 일 실시예에서, 파이토글리코겐 함유 식물 재료는 유숙기(milk stage) 또는 황숙기(dent stage) 옥수수 알갱이로부터 얻어진다.

일 실시예에서, 조성물은 분말이다. 다른 실시예에서, 조성물은 파이토글리코겐 나노입자의 수성 분산액이다.

본 명세서에서는 다음을 포함하는 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법이 또한 기술된다: a. 분해된 파이토글리코겐 함유 식물 재료를 약 0 내지 약 50℃의 온도에서 물에 잠그는 단계; b. 수성 추출물을 얻기 위해 단계(a.)의 생성물을 고체-액체 분리를 거치도록 하는 단계; c. 약 0.05㎛ 내지 약 0.15㎛의 최대 평균 공극 크기(pore size)를 갖는 미량여과 재료(microfiltration material)를 통해 단계(b.)의 수성 추출물을 통과시키는 단계; 및 d. 단계(c.)의 여과액(filtrate)을 한외여과를 거치게 하여 약 300 kDa 미만의 분자량을 갖는 불순물을 제거하여, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 수성 조성물을 얻는 단계.

방법의 일 실시예에서, 파이토글리코겐 함유 식물 재료는 곡물(cereal)이다. 일 실시예에서, 곡물은 옥수수, 쌀, 보리, 수수 또는 그 혼합물이다. 일 실시예에서, 파이토글리코겐 함유 식물 재료는 표준형(su) 또는 당질 증량제(se) 형의 사탕 옥수수이다. 일 실시예에서, 파이토글리코겐 함유 식물 재료는, 표준형(su) 또는 당질 증량제(se) 형 사탕 옥수수의 유숙기 또는 황숙기 알갱이이다.

일 실시예에서, 방법은, (e.) 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 수성 조성물을, 아밀로수크로오스, 글리코실전달효소(glycosyltransferase), 분지 효소(branching enzyme) 또는 그 임의의 조합을 사용하는 효소 처리를 거치게 하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 방법은, (e.1) 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 수성 조성물을 건조시켜 실질적으로 단분산성인 파이토글리코겐 나노입자의 건조된 조성물을 산출하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 방법은, 단계(c) 또는 단계(d) 전에 흡착성 여과 보조제를 첨가하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 흡착성 여과 보조제는 규조토(diatomaceous earth)이다.

일 실시예에서, 고체-액체 분리 단계는 10 내지 30분의 기간 동안 단계(a.)의 생성물을 교반하는 단계를 필요로 한다.

방법의 일 실시예에서, 단계(d.)의 한외여과는 500 kDa 미만의 분자량을 갖는 불순물을 제거한다.

일 실시예에서, 단계(c.)는, (c.1) 약 10㎛ 내지 약 40㎛의 최대 평균 공극 크기를 갖는 제 1 미량여과 재료; (c.2) 약 0.5㎛ 내지 약 2.0㎛의 최대 평균 공극 크기를 갖는 제 2 미량여과 재료; 및 (c.3) 약 0.05㎛ 내지 약 0.15㎛의 최대 평균 공극 크기를 갖는 제 3 미량여과 재료를 통해, 단계(b.)의 수성 추출물을 통과시키는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 방법은, 단계(b)의 생성물을 원심분리하는 단계를 더 포함한다.

본 명세서에는, 기술된 방법에 따라 제조된 실질적으로 단분산성인 나노입자의 조성물이 또한 기술된다.

일 실시예에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 막 형성제로 사용된다. 일 실시예에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 약물 전달제로 사용된다.

도 1은, 파이토글리코겐 나노입자의 개략도를 나타내는 도면.
도 2는, DLS를 사용하여 예 1에 따라 분리된 파이토글리코겐의 입자 크기 분포를 나타내는 도면.
도 3은, DLS를 사용하여 예 2에 따라 분리된 파이토글리코겐의 입자 크기 분포를 나타내는 도면.
도 4는, 본 발명의 실시예에 기재된 수중 단분산 파이토글리코겐 나노입자의 분산액에 대해 점도 대(對) 농도(w/w %)를 나타내는 도면.

본 명세서에서 사용되는 "파이토글리코겐"은, 11 ~ 12의 평균 사슬 길이를 갖는, 식물 재료에서 얻어진 α-D 글루코오스 사슬의 나노입자를 가리키는데, 1→4 결합을 갖고 분지점은 1→6에서 생기며 약 6% 내지 약 13%의 분지화도(branching degree)를 갖는다.

일 실시예에서, 고 분자량 글루코오스 동종 중합체의 단분산 나노입자의 조성물이 제공된다. 일 실시예에서, 단분산 파이토글리코겐 나노입자의 조성물이 제공된다.

동적 광 산란(DLS) 기술에 의해 결정된 다분산성 지수(PDI)는, 평균 직경에 대한 표준 편차의 비의 제곱으로 정의된다: PDI = (σ/d)². 또한, PDI는 중합체의 분자량의 분포를 통해서도 표현될 수 있고, M_w 대 M_n의 비로 정의될 수 있으며, 이 식에서, M_w는 중량 평균 몰 질량이고, M_n은 수 평균 몰 질량이다 (이후, 이 PDI 측정은 PDI^*로 불린다). 첫 번째 경우에 단분산 재료는 제로(0.0)에 가까운 PDI를 갖고, 두 번째 경우에 1.0을 갖는다. 일 실시예에서, DLS에 의해 측정되는 약 0.3 미만, 약 0.2 미만, 약 0.15 미만, 약 0.10 미만, 0.07 미만 또는 0.05 미만의 PDI를 갖는 파이토글리코겐 나노입자의 조성물이 제공된다. 일 실시예에서, SEC MALS에 의해 측정되는 약 1.3 미만, 약 1.2 미만, 약 1.15 미만, 약 1.10 미만, 또는 1.05 미만의 PDI^*를 갖는 파이토글리코겐 나노입자의 조성물이 제공된다.

단분산성은, 조성물의 나노입자가 단분산성이면 표면 변형과 유도체화(derivatization)가 훨씬 더 예측 가능하게 일어나는 것을 포함하는 등의 많은 이유로 유리하다. 크기(size)는 또한 생물 조직에서 나노입자의 분포와 축적에 영향을 미치고, 뿐만 아니라 약물 동태학(pharmacokinetics)에도 영향을 미친다. 또한, 좁은 크기 분포는, 진단 조사(diagnostic probe), 촉매제, 나노스케일의 박막, 및 제어 유동학과 같은 이러한 용도에 매우 중요하다.

직경의 평균 값과 분포(분산성)를 포함하는 나노입자 크기는 이 기술 분야에 알려진 방법으로 측정될 수 있다. 이러한 것은 일차적으로 DLS와 현미경검사 기술, 예를 들어, TEM, 및 원자력 현미경검사를 포함한다.

일 실시예에서, 약 30 내지 약 150㎚, 일 실시예에서, 약 60 내지 약 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는 파이토글리코겐 나노입자의 단분산 조성물이 제공된다. 이러한 나노입자는 종래 조성물에서 보인 군집화된 α-입자와 반대되는 개별 입자이다.

일 실시예에서, 파이토글리코겐 나노입자는 곡물로 제조된다. 일 실시예에서, 파이토글리코겐은 옥수수, 쌀, 보리, 수수 또는 그 혼합물로 제조된다.

사용된 변종들은 파이토글리코겐을 함유해야만 한다. 하나의 변종이 파이토글리코겐을 함유하는지는 공지된 기술을 사용하여 이 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 또한, 많은 변종에 대해서는, 공개된 문헌에 의해 변종이 파이토글리코겐을 함유하는지 확인한다.

일 실시예에서, 조성물은 사탕 옥수수{제아 메이스 변종 사카라타(Zea mays var. saccharata)와 제아 메이스 변종 루고사(Zea mays var. rugosa)}에서 얻어진다. 일 실시예에서, 사탕 옥수수는 표준(su) 형 또는 당질 강화(se) 형이다.

일 실시예에서, 조성물은 사탕 옥수수의 황숙기 또는 유숙기 알갱이로부터 얻어진다.

일 실시예에서, 파이토글리코겐 나노입자의 단분산 조성물은 실질적으로 순수하다. 일 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 한 조성물은, 약 30㎚ 내지 약 150㎚의 직경 크기를 갖는 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%의 파이토글리코겐 나노입자로 이루어진다. 다른 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 한 조성물은, 약 30㎚ 내지 약 150㎚의 직경 크기를 갖는 적어도 약 99%의 파이토글리코겐 나노입자로 이루어진다. 일 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 한 조성물은, 약 60㎚ 내지 약 110㎚의 직경 크기를 갖는 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%의 파이토글리코겐 나노입자로 이루어진다. 다른 실시예에서, 건조 중량을 기준으로 한 조성물은, 약 60㎚ 내지 약 110㎚의 직경 크기를 갖는 적어도 약 99%의 파이토글리코겐 나노입자로 이루어진다.

일 실시예에서, 조성물은 다른 다당류를 실질적으로 함유하지 않는다. 일 실시예에서, 조성물은 약 10% 미만의 다른 다당류를 함유한다. 일 실시예에서, 조성물은 약 5% 미만의 다른 다당류를 함유한다. 일 실시예에서, 조성물은 약 1% 미만의 다른 다당류를 함유한다.

글리코겐

글리코겐과 파이토글리코겐은, α-1→6-글리코시드 결합(glycosidic bond)을 통해 부착되는 분지(branch)를 갖고, α-1→4-글리코시드 결합에 의해 연결된 글루코오스 잔류물의 선형 사슬로 이루어진다. 서로 다른 공급원의 포유류 글리코겐의 화학 분석은, 그 평균 사슬 길이가 13개 이하(~13) 잔류물임을 암시한다 [9]. 도 1에 도시된 바와 같이, 글리코겐 모델을 위해 허용된 모델은 내부 사슬을 갖고, 이 내부 사슬은 보통 두 개의 분지점과, 분지되지 않은 외부 사슬을 함유할 것이다. 전체 트리형 중합체는 단백질 글리코게닌(G)의 단일 분자에 고정된다.

글리코겐 분자의 밀도는 단(tier)의 개수에 따라 기하급수적으로 증가한다. 글리코겐 분자에 13번째 단을 추가하는 것은 글루코오스 잔류물의 불가능한 밀도를 추가하여, 12개의 단을 이론상의 최대로 하는 것으로 계산되었다 [9]. 중요한 특징은, 이러한 방식으로 완전하게 형성된 임의 분자의 가장 바깥쪽 단은 분지되지 않은 A-사슬로서 분자의 총 글루코오스 잔류물 중 ~ 45 ~ 50%를 함유하는 반면, 처음 8개의 안쪽 단은 총 글루코오스 중 5% 이하만을 함유할 것이라는 점이다. 따라서, 이 모델에서 전체 크기의 글리코겐 분자는, 총 53000개 이하의 글루코오스 잔류물, 107 kDa 이하의 분자 질량, 및 25㎚ 이하의 직경에 대해서, 12개의 단으로 이루어질 것이다. 글루코오스 잔류물로 주로 이루어지지만, 글리코겐은 다른 미량의 성분, 특히 글루코사민과 인산염을 함유할 수 있다 [1]. 수학적인 모델링은, 글리코겐 분자의 구조적인 특성이 세 개의 파라미터, 즉, 분지도(branching degree)(r), 단의 개수(t), 및 각 사슬에서 글루코오스 잔류물의 개수(gc)에 의존함을 보여주었다 [9, 10, 11, 12, 13].

성장 메커니즘에 의해 제안된 글리코겐 분자의 구 형상에도 불구하고, 분자를 특정 한계 이상으로 성장시키면, 분지도와 사슬 길이가 최종 단에서 퇴화하기 때문에 구조적인 균질성을 상실한다.

파이토글리코겐

글리코겐과 파이토글리코겐은 매우 유사한 구조를 갖지만, 이러한 다당류의 기능적인 목적에는 주요한 차이가 있다. 동물과 세균에서 글리코겐은 신속한 회전(turnover)을 위해 최적화된 단기간의 "연료" 저장으로 작용하는 것으로 의미된다.

식물에서 주요 에너지 공급원은 전분으로, 이는 잎, 줄기, 씨, 뿌리 등에 저장된다. 글리코겐과 반대로, 전분은 장기간의 에너지 전략으로, 이는 식물이 불리한 기후 상황 동안에도 생존할 수 있도록 한다. 전분은 두 가지 유형의 폴리글루칸인, 아밀로펙틴(크게 분지되어 있는)과 아밀로오스(분지가 거의 없이 거의 선형인)를 함유한다. 서로 다른 공급원의 전분에서 두 성분의 함량에는 큰 변화가 있지만, 아밀로펙틴은 일반적으로 저장 전분에서 주요 성분으로 간주되고 약 65 내지 85 중량%를 차지한다.

아밀로펙틴은 탠덤 연결 군집(tandem linked cluster)(각각 길이가 약 9 ~ 10㎚)으로 이루어진 한정된 구조를 갖고, 여기서, 선형 α-1,4-글루칸 사슬은 α-1,6-글루코시드 결합을 통해 크고 일정하게 분지된다. 아밀로펙틴 분지에 의해 형성된 반결정성 구조는 생물학적 및 경제학적으로 중요한데, 이 구조가 식물이 탄소를 고 밀도(~ 1.6 g/㎤)로 저장할 수 있도록 하기 때문이다 [14].

아밀로펙틴은 네 가지 종류의 효소, 즉, 가용성 전분 신타아제(SS), 전분 분지 효소(starch branching enzyme)(BE), ADP 글루코오스 파이로포스포릴라아제(glucose pyrophosphorylase), 및 전분 탈분지 효소(starch debranching enzyme)(DBE)의 다중 이소형(multiple isoform)에 의해 합성된다. 이러한 것은 글리코겐 합성에 관여하는 동일한 4 종류의 효소이다.

이는 아밀로펙틴과 글리코겐 구조 사이의 유사성을 설명한다: 양쪽은 α-1,6-분지를 갖는 α-1,4-폴리글루칸이다. 그러나, 아밀로펙틴에서 평균 사슬 길이(g_c)는 20 ~ 25로, 글리코겐에서보다 약 두 배 더 길고, 반면에 분지화도(r)는 약 1.5 ~ 2배 더 낮다.

이소아밀라아제(ISA)의 돌연변이 및, 이에 따른, 탈분지 활성의 결핍은 파이토글리코겐에 의한 아밀로펙틴의 부분적인 치환을 일으킨다. 이러한 파이토글리코겐 축적 식물의 가장 일반적인 예는 옥수수, 쌀, 및 다른 곡물의 당질 1 (su) 돌연변이이다.

파이토글리코겐은, 11 ~ 12의 평균 사슬 길이 및 유사한 분지화도를 갖는 글리코겐과 구조적으로 유사하고, 일반적으로 10⁶ ~ 10⁸ Da의 분자량을 갖는다. 그러나, 보고된 글리코겐보다 더 큰 입자는, 더 낮은 분지화도 및/또는 더 낮은 구조적 균질성을 암시한다. 글리코겐이 매우 최적화된 대사 생성물인 반면, 파이토글리코겐은 아밀로펙틴 합성에서 교란(derangement)의 결과인 점을 감안하면, 파이토글리코겐의 더 낮은 구조적 균질성은 예상되지 않는다.

본 발명자는, 파이토글리코겐 조성물의 보고된 다분산성이 사실상 부분적으로 파괴적 분리 방법 때문이고, 관찰된 다분산성은 단백질, 지질, 및 다른 다당류와 같은 미세하게 분산된 오염물의 존재로부터 추가 발생할 수 있음을 실험적으로 결정하였다. 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여, 본 발명자는 파이토글리코겐의 단분산 조성물을 제조하였다.

단분산 파이토글리코겐을 제조하는 방법

앞에서 논의된 바와 같이, 글리코겐/파이토글리코겐 분리의 주요 단계는, 일반적으로, 1. 분쇄/그라인딩/밀링 등을 통한 바이오매스 분해; 2. 수상 안으로 글리코겐 추출; 3. 여과 및/또는 원심분리를 통한 불용성 고체 입자(고형물)의 분리; 4. 미세하게 분산되거나 용해화된 지질, 단백질, 및 저 분자량의 오염물의 제거; 및 5. 농축과 건조를 포함한다. 일부 작업은 결합될 수 있다 (예를 들어, 밀링과 추출).

일 실시예에서, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법은 다음을 포함한다:

a. 분해된 식물 재료를 약 0℃ 내지 약 50℃, 일 실시예에서는, 약 4℃ 내지 약 20℃의 온도에서 물에 잠그는 단계;

b. 수성 추출물을 얻기 위해 단계(a.)의 생성물을 고체-액체 분리를 거치도록 하는 단계;

c. 단계(b.)의 수성 추출물을, 적절하게는 다단계 여과 공정에서, 그렇지만 적어도, 약 0.1㎛의 최대 평균 공극 크기를 갖는 미량여과 재료를 통해 여과하는 단계;

d. 단계(c.)의 여과액을 한외여과를 거치게 하여 약 300 kDa 미만, 일 실시예에서는 약 400 kDa 미만, 일 실시예에서는 약 500 kDa 미만의 분자량을 갖는 불순물을 제거하여, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물을 얻는 단계.

일 실시예에서, 방법은, 단계 b의 생성물을 원심분리하는 단계를 더 포함한다.

수성 분산액은 다음으로 실질적으로 단분산성인 파이토글리코겐 나노입자의 조성물을 산출하기 위해 건조될 수 있다.

일 실시예에서, 식물 재료는 곡물이다. 일 실시예에서, 식물 재료는 옥수수, 쌀, 보리, 수수 또는 그 혼합물이다. 일 실시예에서, 식물 재료는 사탕 옥수수(제아 메이스 변종 사카라타와 제아 메이스 변종 루고사)의 알갱이이다. 일 실시예에서, 사탕 옥수수의 유숙기 또는 황숙기 숙성 알갱이가 사용된다.

파이토글리코겐의 수득율은, 여러 실시예에서, 식물 재료 중 약 5% 내지 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%의 건조 중량이다. 파이토글리코겐의 정확한 수득율은, 변종 및 숙성 단계를 포함해서, 사용된 식물 재료에 의존할 것이다. 옥수수의 경우, 발명자는, 유숙기 알갱이 숙성에 대해 35 ~ 40%, 황숙기 숙성에 대해 20 ~ 30%의 알갱이 건조 중량의 범위에 있는 수득율을 얻었다. 이전에 보고된 파이토글리코겐의 높은 다분산성이 주어지면, 단분산 파이토글리코겐의 이러한 수득율은 예상되지 않았다.

분해된 식물 재료를 제조하는 방법은 이 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 바이오매스 분해의 방법은, 생체 물질의 그라인딩, 밀링, 또는 분쇄 단계를 포함한다. 식물 재료는 약 0.5㎜ 미만의 평균 입자 크기로 적절하게 분해된다.

일 실시예에서, 냉수 추출은 10 ~ 30분 동안 적절한 교반에 의해 수행된다. 일 실시예에서, 냉수 추출은 약 0℃ 내지 약 50℃의 온도에서 수행된다. 일 실시예에서, 냉수 추출은 약 4℃ 내지 약 20℃의 온도에서 수행된다. 교반의 최적의 기간, 온도, 및 교반 속도는 분해된 바이오매스의 성질에 의존하고, 동일한 것을 결정하는 것은 이 기술 분야의 당업자의 범위 내에 있다.

냉수 추출에서 생기는 수성 추출물은 미정제 불용성 고체를 분리하기 위해 원심분리된다. 적절하게, 추출물은 약 3,000 내지 약 6,000×g에서 선택적으로 원심분리된다. 적절하게, 추가 원심분리는 약 6,000 내지 약 12,000×g에서 원심분리에 의해 수행되고, 이는 미정제 파이토글리코겐 추출물로부터 부분적으로 미세하게 분산된 단백질과 지질을 분리한다.

원심분리 다음에 상청액(supernatant)의 여과가 이어진다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 다단계 여과 및 한외여과가 수행되고, 이는 놀랍게도, 대부분의 단백질, 지질, 및 오염 다당류(아밀로오스와 아밀로펙틴을 포함하는)를 임의의 화학, 효소 또는 열 처리 없이 제거하여, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 산출하는 것으로 밝혀졌다. 미량여과는 0.1㎛의 최종 매체 공극 크기를 갖는 단계에서 적절하게 수행된다. 일 실시예에서, 미량여과는, a) 일 실시예에서, 약 5㎛ 내지 약 50㎛, 일 실시예에서, 약 10㎛ 내지 약 40㎛, 일 실시예에서, 약 15㎛ 내지 약 35㎛, 일 실시예에서, 약 20㎛ 내지 약 30㎛, 일 실시예에서, 약 25㎛; b) 일 실시예에서, 약 5㎛ 내지 약 2.0㎛, 일 실시예에서, 약 1.0㎛; c) 일 실시예에서, 약 0.05㎛ 내지 약 0.15㎛, 일 실시예에서, 0.1㎛의 매체 공극 크기를 갖고 연속적으로 수행된다. 일 실시예에서, 규조토와 같은 흡착성 여과 보조제가 원심분리 전에 파이토글리코겐 추출물에 첨가될 수 있다. 일 실시예에서, 흡착성 여과 보조제는 약 2 ~ 10%(중량/부피), 일 실시예에서, 약 3 ~ 5%(중량/부피)의 양으로 사용된다.

미량여과의 최종 여과액은 한외여과를 거치고, 이 한외여과는 여과액으로부터 염, 단백질, 및 당(예를 들어, 덱스트린, 글루코오스, 스크로오스 또는 말토오스)을 포함하는 저 분자량의 오염물을 제거한다. 한외여과는 약 300 내지 500 kDa의 분자량 차단(cut off)(MWCO)을 갖는 교차 유동 여과(CFF)에 의해 적절하게 수행된다.

미량여과와 한외여과의 여러 방법이 이 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고, 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다.

선택적으로, 한외여과에 이어, 파이토글리코겐을 함유하는 수성 분산액은 다분산성을 줄이기 위해 효소 처리를 거칠 수 있다. 적절하게, 이것은 아밀로수크로오스, 글리코겐 신타아제, 글리코실전달효소, 및 분지 효소 또는 그 임의의 조합으로 처리될 수 있다. 그러나, 아밀로펙틴과 아밀로오스(예를 들어, 베타-아밀라아제)를 소화시키는 효소는, 파이토글리코겐 나노입자의 정제된 조성물보다, 다양하게 열화되는 폴리글루칸의 용액을 산출하기 때문에 회피되어야 한다.

파이토글리코겐 분산액은 CFF 한외여과의 공정에 의해 농축될 수 있다(30%까지). 대안적으로, CFF 한외여과에 이어, 파이토글리코겐은 아세톤, 메탄올, 프로판올 등, 바람직하게는 에탄올과 같은 적절한 유기 용매로 침전될 수 있다. 방법은, 적절하게는 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 파이토글리코겐 추출물을 건조시키는 단계를 더 포함한다. 강하 막 증발기(falling film evaporator), 상승 막 증발기(rising film evaporator), 분무 건조, 동결 건조, 드럼 건조(drum drying), 또는 그 조합 등의 사용과 같은, 여러 표준 농축 및/또는 건조 방법은 파이토글리코겐 분산액을 탈수하고/탈수하거나 파이토글리코겐 생성물의 고체 형태를 수거하기 위해 사용될 수 있다.

예에 나타난 바와 같이, 생성된 파이토글리코겐 재료는, DLS에 의해 측정되는 0.07 정도로 낮은 다분산성 지수를 갖는, 사용된 출발 식물 재료에 따라, 30㎚ 내지 150㎚의 입자 직경을 특징으로 한다.

고 순도 재료와 그 단분산성을 보장하는 열쇠는 미세한 미량여과와 한외여과의 조합이다.

나노입자의 화학적 작용화( functionalization )

본 발명의 실시예는, 화학적으로 작용화된 표면 및/또는 다수의 분자와 결합된 나노입자를 갖는 나노입자와 분자를 포함한다. 화학 작용화는 합성의 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, March, 고급 유기 화학, 제 6판, 윌리, 2007년을 참조한다. 작용화(functionalization)는 입자의 표면에서, 또는 입자의 표면과 내부 모두에서 실행될 수 있지만, 상술된 바와 같이 단일 분지 동종 중합체로서 글리코겐 분자의 구조는 유지된다.

이러한 작용화된 표면 기는, 친핵성 및 친전자성 기, 산성 및 염기성 기(예를 들어, 카르보닐기, 아민기, 티올기, 카르복시기 또는 이와 다른 산성 기를 포함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 아미노기는 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 아미노기일 수 있다. 본 명세서에 기술된 나노입자는 비닐기 및 알릴기와 같은 불포화 기로 또한 작용화될 수 있다.

분리 및 정제되는 나노입자는, 직접 작용화되거나 또는 간접 작용화될 수 있고, 이 경우, 하나 이상의 중간 링커(linker) 또는 스페이서(spacer)가 사용될 수 있다. 나노입자는, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 이상의 작용화 단계를 포함하는 하나 이상의 작용화 단계를 거칠 수 있다.

작용화 나노입자는, 생체 분자, 소 분자, 치료제, 마이크로- 및 나노입자, 약학적으로 활성인 부분, 거대 분자, 진단 라벨, 킬레이트제, 분산제, 전하 조절제, 점도 조절제, 계면활성제, 응고제(coagulation agent), 및 응집제(flocculant), 뿐만 아니라 이러한 화학 화합물의 여러 조합과 같이, 여러 용도에 중요한 여러 바람직한 분자와 추가 결합될 수 있다.

다당류 작용화 또는 유도체화를 위해 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 접근법은, C-2, C-3, C-4 및/또는 C-6 위치에서 글루코오스 하이드록실기의 선택적 산화에 의한, 카르보닐기의 도입이다. 과옥소산염(periodate)(예를 들어, 과옥소산 나트륨), 브롬, 디메틸 설폭사이드/아세틱 무수물(DMSO/Ac₂O)[예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,683,298호], 데스-마틴 퍼아이오디난(Dess-Martin periodinane) 등과 같은, 사용될 수 있는 넓은 범위의 산화제가 있다.

카르보닐기로 작용화될 때 본 명세서에 기술된 나노입자는 일차 또는 이차 아민기를 갖는 화합물과 용이하게 반응성이 있다. 이는, 환원제{예를 들어, 붕소수화 나트륨(sodium borohydrate)}를 이용하여 아민으로 추가 환원될 수 있는 이민 형성을 일으킨다. 그래서, 환원 단계는 이민 중간체보다 더 안정한 아미노-생성물을 제공하고, 또한 하이드록실기의 반응하지 않은 카르보닐을 변환한다. 카르보닐의 제거는 비-표적 분자(예를 들어, 플라스마 단백질)와 유도체화 나노입자의 비-특이성 상호작용의 가능성을 크게 줄인다.

카르보닐 화합물과 아미노 화합물의 반응 및 환원 단계는 하나의 용기(동일한 반응 혼합물에 투입된 적절한 환원제를 갖는)에서 동시에 수행될 수 있다. 이 반응은 직접 환원 아미노화(amination)로 알려져 있다. 여기에서, 카르보닐기, 예를 들어, 시아노붕소수화 나트륨(sodium cyanoborohydrate) 존재 하에 선택적으로 이민을 환원시키는 임의의 환원제가 사용될 수 있다.

카르보닐-작용화 나노입자로부터 아미노-작용화 나노입자를 제조하기 위해, 임의의 암모늄염 또는 일차 또는 이차 아민 함유 화합물, 예를 들어, 아세트산 암모늄, 염화 암모늄, 히드라진(hydrazine), 에틸렌디아민, 또는 헥산디아민이 사용될 수 있다. 이 반응은 물 또는 수성 극성 유기 용매, 예를 들어, 에틸 알코올, DMSO, 또는 디메틸포름아미드에서 수행될 수 있다.

본 명세서에 기술된 나노입자의 환원성 아미노화는 다음의 두 단계 공정을 사용하여 또한 이루어질 수 있다. 첫 번째 단계는, 알릴화(allylation), 즉, 환원제, 예를 들어, 붕소수화 나트륨의 존재 하에 알릴 할로겐과의 반응에 의해 하이드록실기를 알릴기로 변환시키는 것이다. 두 번째 단계에서, 알릴기는 2작용 아미노티올 화합물, 예를 들어, 아미노에탄티올과 반응한다.

아미노-작용화 나노입자는 추가 변형될 수 있다. 예를 들어, 아미노기는 카르보닐 화합물(알데히드와 케톤), 카르복시산과 그 유도체(예를 들어, 염화 아실, 에스테르), 숙신이미딜 에스테르, 이소티오시아네이트, 염화 설포닐 등에 반응성이 있다.

특정 실시예에서, 본 명세서에 기술된 나노입자는 시안화(cyanylation) 공정을 사용하여 작용화된다. 이 공정은 다당류 하이드록실(hydroxyls) 상에 이미도카보네이트와 시아네이트 에스테르의 형성을 일어나게 한다. 이러한 기는 매우 온화한 조건 하에 일차 아민과 용이하게 반응하여, 공유 결합을 형성한다. 브롬화 시안(cyanogen bromide), 및 바람직하게는 1-시아노-4-디에틸아미노-피리디늄(CDAP)과 같은 시안화제(cyanylation agent)가 나노입자의 작용화를 위해 사용될 수 있다.

작용화 나노입자는, 카르보닐 또는 아미노기에 결합할 수 있는 작용기를 갖는 화학 화합물에 직접 부착될 수 있다. 그러나, 어떤 용도에 대해서는, 예를 들어, 중합체 스페이서 또는 링커를 포함하는 스페이서 또는 링커를 통해 화학 화합물을 부착하는 것이 중요할 수 있다. 이러한 것은, 아미노, 카르보닐, 설프하이드릴(sulfhydryl), 숙시미딜(succimidyl), 말레이미딜(maleimidyl), 및 이소시아네이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 작용기를 갖는 호모- 또는 헤테로-2작용성 링커, 예를 들어, 디아미노헥산, 에틸렌 글리코비스(설포숙시미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디설포숙시미딜 타르타레이트(설포-DST), 디티오비스(설포숙시미딜프로피오네이트)(DTSSP), 아미노에탄티올 등일 수 있다.

나노입자/결합( conjugation )을 위한 화학적 화합물과 조절제

특정 실시예에서, 본 명세서에 기술된 나노입자를 변형하기 위해 사용될 수 있는 화학적 화합물은, 생체 분자, 소 분자, 치료제, 마이크로- 및 나노입자, 약학적으로 활성인 부분, 거대 분자, 진단 라벨, 킬레이트제, 분산제, 전하 조절제, 점도 조절제, 계면활성제, 응고제, 및 응집제, 뿐만 아니라 이러한 화학적 화합물의 여러 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시예에서, 본 명세서에 기술된 나노입자를 변형하기 위해 화학적 화합물로 사용된 생체 분자는, 효소, 수용체, 신경전달물질(neurotransmitter), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 세포 반응 화학적 화합물{성장 인자 및 화학주성 인자(chemotactic factor)와 같은}, 항체, 백신, 합텐(hapten), 독소(toxin), 인터페론, 리보자임(ribozyme), 안티센스 약제(antisense agent), 및 핵산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시예에서, 본 명세서에 기술된 나노입자의 소 분자 조절제는, 촉매로 유용할 수 있고 금속-유기 착물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것일 수 있다.

특정 실시예에서, 나노입자를 위한 조절제로 사용된 약학적으로 유용한 부분은, 소수성 조절제, 약물 동력학 조절제(pharmacokinetic modifier), 생물학적으로 활성인 조절제, 및 검출 가능 조절제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시예에서, 나노입자는, 광 흡수, 광 방출, 형광, 발광, 라만 산란, 형광 공명 에너지 전달, 및 전자발광 특성을 갖는 화학적 화합물로 변형될 수 있다.

특정 실시예에서, 나노입자의 진단 라벨은, 감마 신티그래피(gamma scintigraphy)와 양전자 방출 단층 촬영술(positron emission tomography)(PET)을 위한 진단용 방사성 의약품 또는 방사성 동위원소, 자기 공명 영상법(MRI)을 위한 조영제(contrast agent)(예를 들어, 상자성 원자와 초상자성 나노결정), 컴퓨터 단층 촬영술을 위한 조영제, X-선으로 영상을 촬영하기 위한 조영제, 초음파 진단 방법을 위한 조영제, 중성자 활성화를 위한 약제, 및 여러 광학 절차에서 X-선, 초음파, 전파와 마이크로파, 형광단(fluorophore) 등을 반사, 산란 또는 영향을 미칠 수 있는 다른 부분을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 진단용 방사성 의약품은, 감마-방출 방사성 핵종(radionuclide), 예를 들어, 인듐-111, 테크네튬(technetium)-99m, 및 요오드-131 등을 포함한다. MRI(자기 공명 영상법)를 위한 조영제는, 자기 화합물, 예를 들어, 상자성 이온, 철, 망간, 가돌리늄, 란탄 계열 원소(lanthanide), 유기 상자성 부분, 및 초상자성, 강자성(ferromagnetic) 및 반강자성(antiferromagnetic) 화합물, 예를 들어, 철 산화물 콜로이드, 페라이트(ferrite) 콜로이드 등을 포함한다. 컴퓨터 단층 촬영술 및 이와 다른 X-선에 기초한 영상 방법을 위한 조영제는, X-선을 흡수하는 화합물, 예를 들어, 요오드, 바륨 등을 포함한다. 초음파에 기초한 방법을 위한 조영제는, 초음파를 흡수, 반사 및 산란시킬 수 있는 화합물, 예를 들어, 에멀션, 결정, 가스 버블 등을 포함한다. 다른 예는, 붕소 및 가돌리늄과 같이 중성자 활성화에 유용하 물질을 포함한다. 또한, X-선, 초음파, 전파, 마이크로파, 및 진단 절차에서 유용한 이와 다른 선을 반사, 굴절, 산란, 또는 이와 다르게 영향을 미칠 수 있는 라벨이 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 조절제는, 상자성 이온 또는 기를 포함한다.

특정 실시예에서, 다작용성 유도체를 제조하기 위해 두 개 이상의 서로 다른 화학적 화합물이 사용된다. 예를 들어, 첫 번째 화학적 화합물은 항체 및 앱타머(aptamer)와 같은 잠재적인 특정 결합 생체 분자의 목록으로부터 선택되고, 다음으로, 두 번째 화학적 화합물은 잠재적인 진단 라벨의 목록으로부터 선택된다.

특정 실시예에서, 본 명세서에 기술된 나노입자는 이 기술 분야에 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 무기 나노재료를 제조하기 위한 템플릿(template)으로 사용될 수 있다 (예를 들어, 나노바이오테크놀러지 II, 에즈 머킨과 니메이어, 윌리-VCH, 2007 참조). 이것은, 전하를 띤 작용기를 갖는 나노입자의 작용화에 이어, 여러 양이온, 예를 들어, 금속, 반도체의 용액에서 작용화 나노입자의 인큐베이션(incubation)을 포함할 수 있는 광물화(mineralization)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 광물화된 나노입자는 다음에 정제되고 의료 진단, 센서, 광학, 전자공학 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 여러 용도에 사용될 수 있다.

조성물

일 실시예에서, 나노입자 조성물은 한외여과의 단계 후에 얻어지는 수성 추출물의 형태이다.

일 실시예에서, 나노입자 조성물은 건조되고 조성물은 분말이다.

본 발명의 건조된 나노입자 조성물은 물, 글리세린, 및 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 일부 유기 용매에서 쉽게 용해/분산될 수 있다. 일 실시예에서, 조성물은 물 또는 용매에 분산된 건조된 나노입자를 포함한다. 단분산 나노입자 조성물은 이전의 글리코겐 조성물과 비교해서 독특한 유동학적 특성을 갖는다. 본 발명의 나노입자 조성물의 수성 분산액은 25 중량%의 농도까지 큰 점도를 나타내지 않는다. 비교로, 야오(Yao)(WO 2013/019977)의 "순수한 파이토글리코겐"은 15.2 w/w에서 3.645 Pas(3645±315 mPas)의 점도를 나타낸다.

일 실시예에서, 조성물은 제조 일자로부터 적어도 24개월 동안 실온에서 저장 안정성이 있다.

산업상 적용 가능성

본 명세서에 기재된 단분산 파이토글리코겐 나노입자의 조성물은 광범위한 식품, 개인 위생, 산업 및 의료 용도에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 유동학, 수분 보유, 및 표면 특성을 조절하기 위해 첨가제로 사용될 수 있다. 용도의 예는, 막 형성, 탄수화물의 저 혈당 지수(glycemic index) 공급원, 조직감 개선제(texture enhancer), 피부 충전제, 비타민 및 이와 다른 감광성 생리 활성 화합물을 위한 안정제. 안료 증량제, 의료용 윤활제와 부형제, 약물 전달제를 포함한다. 본 발명의 조성물은 선케어 제제의 UV 차단을 개선하고, 생리 활성 및 이와 다른 광 불안정성 화합물(photolabile compound)(자외선 차단제, 비타민, 및 의약품과 같은)의 광안정성을 향상시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 명칭이 "다작용성 글리코겐과 파이토글리코겐 첨가제"인 국제 특허 출원에 여러 용도가 상세하게 기술되어 있고, 이 출원은 동일 출원인에 의해 함께 동시에 출원되고 그 내용은 참조로 완전히 포함되어 있다.

본 명세서에 개시된 단분산 파이토글리코겐 나노입자는 막 형성제로 특히 유용하다. 나노입자는 단분산성이기 때문에, 균일하고 밀집된(close-packed) 막이 가능하다. 조성물은 낮은 수분 활성(water activity)을 갖는 안정한 막을 형성한다. 수분 활성은, 재료가 물을 결합시킬 수 있는 정도와, 또한 물 분자가 재료 내에서 이동할 수 있는 정도의 특징을 규정한다. 수분 활성은 식품 산업에서 중요한데, 이 식품 산업에서는, 그 건조상태에 따라 증가하는 제품의 물리적 강도와, 흔히 더 높은 수분 함량에 따라 증가하는 제품의 맛 사이에서 균형을 찾는 것이 필요하다. 수분 활성의 조절은 여러 구조적으로 다른 성분, 예를 들어, 머핀의 크기와 머핀 상부의 당 코팅을 함유하는 식료품에서 특히 중요하다. 본 발명의 조성물은 식료품의 서로 다른 성분 사이에서 장벽 막(barrier film)으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 식료품이 비교적 건조하면, 본 발명의 단분산 파이토글리코겐 나노입자의 농축된 수용액은, 다른 성분이 제 1 성분과 접촉하게 되어 건조되기 전에, 식료품 성분의 표면 위로 분무될 수 있다. 식료품이 상당량의 수분을 이미 함유하는 경우에 대해, 파이토글리코겐 나노입자의 미세한 분말은 연속 막이 형성될 때까지 제 1 식품 성분의 표면 위에 뿌려질 수 있고, 이후에 제 2 성분이 접촉하게 된다. 조성물은 장벽 막을 형성하고, 하나의 식품 성분에서 다른 식품 성분으로 물 분자의 확산을 실질적으로 감소시킨다. 특성을 형성하는 이러한 장벽 막은, 성분 사이에서 물의 확산이 바람직하지 않은, 약물과 비타민 알약의 제조에 또한 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 본 명세서에서 개시된 단분산 파이토글리코겐 나노입자의 조성물은 약물 전달을 위해 사용된다. 단분산 파이토글리코겐 나노입자는 비독성이고, 공지된 알레르기 항원성이 없으며, 인체의 글리코겐 분해 효소(glycogenolytic enzyme)(예를 들어, 아밀라제와 포스포릴라제)에 의해 열화될 수 있다. 효소에 의한 열화의 생성물은 글루코오스의 비독성, 중성 분자이다. 나노입자는, 약물과 직접 결합되거나 또는 분자 스페이서 또는 테터(tether)를 통해 결합될 수 있기 때문에 수용량(capacity)을 운반하는 우수한 화학적 화합물을 나타낸다. 약물-결합된 나노입자는, 엽산(folic acid), 항체 또는 앱타머와 같은 특정한 조직 표적화 분자로 추가 변형될 수 있다. 낮은 다분산성은 균일한 유도체화와 약물 분산, 및 관련된 예측 가능한 약물 동태학을 허용한다. 마지막으로, 조밀한 구형 분자, 중성 전하, 및 큰 소수성은 효율적인 세포 흡수(cell uptake)와 연관되어 있다.

예 1. 사탕 옥수수 알갱이로부터 글리코겐( 파이토글리코겐 )의 추출

1㎏의 냉동 사탕 옥수수 알갱이(75% 수분 함량)는 20℃에서 2ℓ의 탈이온수와 혼합되고, 3분 동안 3000 rpm의 블렌더에서 분쇄되었다. 곤죽(mush)은 4℃에서 15분 동안 12,000×g에서 원심분리되었다. 혼합된 상청액 분율(supernatant fraction)은 0.1㎛ 공극 크기를 갖는 막 필터를 사용하여 CFF를 거쳤다. 여과액은, 500kDa의 MWCO를 갖는 막을 사용하고 실온 및 6의 투석부피(diavolume)에서 배치 정용여과(batch diafiltration)에 의해 추가 정제되었다. {투석부피는, 정용여과 동안 작업 안으로 들어온 총 mQ 물 부피 대(對) 농축물 부피(retentate volume)의 비이다.}

농축물 분율(retentate fraction)은 95% 에탄올 2.5 부피와 혼합되고 4℃에서 10분 동안 8,000×g에서 원심분리되었다. 농축물은 95% 에탄올 2.5 부피와 혼합되고 4℃에서 10분 동안 8,000×g에서 원심분리되었다. 파이토글리코겐을 함유하는 펠릿은 24시간 동안 50℃에서 오븐 안에서 건조된 다음 45 메시로 분쇄되었다. 건조된 파이토글리코겐의 중량은 97g이었다.

DLS 측정에 따라, 생성된 파이토글리코겐 나노입자는 83.0㎚의 입자 크기 직경과 0.081의 다분산성 지수를 가졌다 (도 2).

예 2.

황숙기에 수확된 NK199 변종의 건조된 옥수수 알갱이 250g이 0.5㎜ 미만의 입자 크기로 분쇄되었다. 20분 동안 적절한 교반 하에 20℃에서 냉수 추출이 수행되었다. 불용성 성분은 8,000×g에서 원심분리에 의해 침전되었다. 다단계 미량여과는 10.0, 1.0, 및 0.1㎛의 여과 매체 공극 크기로 상청액 상에서 수행되었다. 교차 유동 여과(정용여과)는 300kDa의 MWCO로 실온 및 6의 투석부피에서 수행되었다. 농축물(retentate)은 95% 에탄올 2.5 부피와 혼합되고 4℃에서 10분 동안 8,000×g에서 원심분리되었다. 파이토글리코겐을 함유하는 펠릿은 24시간 동안 50℃에서 오븐 안에서 건조된 다음 45 메시로 분쇄되었다. 건조된 파이토글리코겐의 중량은 17.5g이었다.

DLS 측정에 따라, 생성된 파이토글리코겐 나노입자는 63.0㎚의 입자 크기 직경과 0.053의 다분산성 지수를 가졌다 (도 3).

예 3. 본 발명의 옥수수 알갱이 파이토글리코겐의 특징 규정

본 발명의 예 2에서와 같이 제조된 파이토글리코겐 나노입자는 DLS에 의해 특징이 규정되고 그 결과는 표 1에 제공된다. 모든 품종(cultivar)은 표준(su) 형이다.

품종	알갱이 건조 중량에 대한 수득율(%)	입자 크기 (㎚)	다분산성 지수
컨트리 젠틀맨(Country Gentlemen) 슈거 닷(Sugar Dots) 주빌리(Jubilee) 스토웰 에버그린(Stowell's Evergreen) NK199 허니 앤 크림(Honey and Cream) 실버 퀸(Silver Queen) 골든 반탐(Golden Bantam) 퀴키(Quickie) 얼리비 옐로우(Earlivee Yellow) 얼리 썬글로우(Early Sunglow) G90 세네카 호리즌(Seneca Horizon) 로치프(lochieff) 버터 앤 슈거(Butter and Sugar)	24.78 28.02 27.25 27.47 28.46 32.64 27.20 35.71 31.43 31.81 23.79 29.01 25.55 30.11 30.05	68.8 69.4 66.9 66.6 63 68.8 68.5 68.1 63.9 77.5 69.6 67.1 73.3 66.5 75.3	0.103 0.081 0.086 0.071 0.053 0.103 0.129 0.098 0.118 0.107 0.099 0.087 0.109 0.107 0.075

생성된 파이토글리코겐 나노입자는 0.071 내지 0.129의 다분산성 지수를 갖고, 평균 다분산성 지수는 0.10이었다.

예 3. 본 발명의 옥수수 알갱이 파이토글리코겐의 특징 규정

황숙기에 수확된, se 및 sh 형의 옥수수 알갱이를 사용하는 본 발명의 예 2에서와 같이 제조된 파이토글리코겐 나노입자의 특징이 규정되고 그 결과는 표 2에 제공된다.

품종	유형	알갱이 건조 중량에 대한 수득율(%)	입자 크기 (㎚)
나바조(Navajo) 웰컴(Welcome) 스피디 스위트(Speedy Sweet) 플리트 바이컬러(Fleet Bicolor) 헤드 스타트(Head Start) 알라딘(Aladdin) 센서(Sensor) 실버 킹(Silver King) 센서 디렉터블(Delectable) 컬러로우(Colorow) 브로케이드(Brocade) 트리니티(Trinity) 템프테이션(Temptation) 쉬바(Sheba) A 구어메이 오브세션(Gourmet Obsession) 구어메이 2281 디보우션(Devotion)	se 이색 se 노랑 se 이색 se 이색 se 노랑 se 이색 se 이색 se 백색 se 이색 se 이색 se 노랑 se 이색 se 이색 se 이색 sh sh sh sh	5.4 7 7.2 9.5 17.3 20.4 21.4 25.8 21.1 20.1 24 20 17.6 14.2 0 0 0 0	95.2 98.7 60.3 95.1 88 92.1 84.3 88.1 102.8 91.1 100.4 115 95.8 94.2 - - - -

예 4.

본 발명의 건조된 나노입자 조성물은 5 내지 30 w/w%의 여러 농도에서 물에 용해되었다. 결과는 도 4에 도시된다. 제공된 용액은 25 중량%의 농도까지 큰 점도가 없이 투명하였다. 점도는 25% w/w를 초과하는 농도에 대해서 크게 증가하였다. 20% w/w를 초과하는 농도에 대해서, 용액은 강력한 전단 감소(shear thinning) 특성을 나타내었다.

참고 문헌

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11. 멜렌데즈 등, (1998) 그 구조적인 균질성에 영향을 미치는 글리코겐 합성에서 물리적인 제약: 2차원적인 접근 방법. Biophys. J. 75:106~114.

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14. 톰슨(Thompson), 디.비. (2000) Carbohydr. Res. 43: 223~239.

Claims (34)

1. 파이토글리코겐 함유 식물 재료(phytoglycogen-containing plant material)에서 얻어진 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물에 있어서,
   상기 파이토글리코겐 함유 식물 재료는, 표준형(su) 또는 당질 증량제(surgary extender)(se) 형 사탕 옥수수로부터 얻어지고, 상기 파이토글리코겐 나노입자는, 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정되는 0.3 미만의 다분산성 지수(polydispersity index)를 갖는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 파이토글리코겐 나노입자는, DLS에 의해 측정되는 0.2 미만의 다분산성 지수를 갖는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 파이토글리코겐 나노입자는, DLS에 의해 측정되는 0.1 미만의 다분산성 지수를 갖는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 파이토글리코겐 나노입자는, 30㎚ 내지 150㎚의 평균 입자 직경을 갖는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 파이토글리코겐 나노입자는, 60㎚ 내지 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
6. 제 4항에 있어서, 건조 중량을 기준으로 상기 조성물은, 30㎚ 내지 150㎚의 평균 입자 직경을 갖는 80% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 건조 중량을 기준으로 상기 조성물은, 30㎚ 내지 150㎚의 평균 입자 직경을 갖는 90% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 건조 중량을 기준으로 상기 조성물은, 30㎚ 내지 150㎚의 평균 입자 직경을 갖는 99% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
9. 제 5항에 있어서, 건조 중량을 기준으로 상기 조성물은, 60㎚ 내지 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는 80% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
10. 제 9항에 있어서, 건조 중량을 기준으로 상기 조성물은, 60㎚ 내지 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는 90% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 건조 중량을 기준으로 상기 조성물은, 60㎚ 내지 110㎚의 평균 입자 직경을 갖는 99% 이상의 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
12. 제 1항에 있어서, 상기 파이토글리코겐 함유 식물 재료는 유숙기(milk stage) 또는 황숙기(dent stage) 옥수수 알갱이로부터 얻어지는, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
13. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 분말인, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
14. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 파이토글리코겐 나노입자의 수성 분산액인, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
15. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 막 형성제인, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
16. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약물 전달제인, 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 조성물.
17. 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법에 있어서,
    a. 분해된 파이토글리코겐 함유 식물 재료를 0 내지 50℃의 온도에서 물에 잠그는 단계;
    b. 수성 추출물을 얻기 위해 단계(a.)의 생성물을 고체-액체 분리를 거치도록 하는 단계;
    c. 0.05㎛ 내지 0.15㎛의 최대 평균 공극 크기(pore size)를 갖는 미량여과 재료(microfiltration material)를 통해 단계(b.)의 수성 추출물을 통과시키는 단계; 및
    d. 단계(c.)의 여과액(filtrate)을 한외여과(ultrafiltration)를 거치게 하여 300 kDa 미만의 분자량을 갖는 불순물을 제거하여, 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정되는 0.3 미만의 다분산성 지수(polydispersity index)를 갖는 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 수성 조성물을 얻는 단계를
    포함하는, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
18. 제 17항에 있어서, 상기 파이토글리코겐 함유 식물 재료는 곡물(cereal)인, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 곡물은, 옥수수, 쌀, 보리, 수수 또는 그 혼합물인, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 파이토글리코겐 함유 식물 재료는, 표준형(su) 또는 당질 증량제(se) 형 사탕 옥수수인, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
21. 제 20항에 있어서, 상기 파이토글리코겐 함유 식물 재료는, 표준형(su) 또는 당질 증량제(se) 형 사탕 옥수수의 유숙기 또는 황숙기 알갱이인, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
22. 제 17항에 있어서, (e.) 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 수성 조성물을, 아밀로수크로오스, 글리코실전달효소(glycosyltransferase), 분지 효소(branching enzyme) 또는 그 임의의 조합을 사용하는 효소 처리를 거치게 하는 단계를 포함하는, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
23. 제 17항에 있어서, 단계(c) 또는 단계(d) 전에 흡착성 여과 보조제를 첨가하는 단계를 더 포함하는, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
24. 제 23항에 있어서, 상기 흡착성 여과 보조제는 규조토(diatomaceous earth)인, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
25. 제 17항에 있어서, 상기 고체-액체 분리 단계는, 10 내지 30분의 기간 동안 단계(a.)의 생성물을 교반하는 단계를 포함하는, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
26. 제 17항에 있어서, 단계(d.)의 상기 한외여과는 500 kDa 미만의 분자량을 갖는 불순물을 제거하는, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
27. 제 17항에 있어서, 단계(c.)는, (c.1) 10㎛ 내지 40㎛의 최대 평균 공극 크기를 갖는 제 1 미량여과 재료; (c.2) 0.5㎛ 내지 2.0㎛의 최대 평균 공극 크기를 갖는 제 2 미량여과 재료; 및 (c.3) 0.05㎛ 내지 0.15㎛의 최대 평균 공극 크기를 갖는 제 3 미량여과 재료를 통해, 단계(b.)의 수성 추출물을 통과시키는 단계를 포함하는, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
28. 제 17항에 있어서, 단계(b)의 생성물을 원심분리하는 단계를 더 포함하는, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
29. 제 17항에 있어서, (e.1) 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 포함하는 수성 조성물을 건조시켜 단분산성인 파이토글리코겐 나노입자의 건조된 조성물을 산출하는 단계를 더 포함하는, 단분산 파이토글리코겐 나노입자를 제조하는 방법.
30. 제 17항에 기재된 방법에 따라 제조된 단분산성인 나노입자를 포함하는 조성물.
    
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