KR102162400B1

KR102162400B1 - 생체 투여 가능한 수용액 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR102162400B1
Application number: KR1020187032677A
Authority: KR
Inventors: 다이 야마노우치; 요시아키 다치바나; 고스케 다치바나
Original assignee: 시그마 테크놀로지 유겐가이샤; 다이 야마노우치
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2020-10-06
Anticipated expiration: 2037-05-11
Also published as: US20200338000A1; CN109415686A; EP3456815A1; WO2017195852A1; US20190298653A1; JPWO2017195852A1; EP3456815B1; KR20180130568A; EP3456815A4; CN109415686B; JP6751876B2

Abstract

말초 세포에 산소를 충분히 공급하는 기능을 갖고, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 손상 또는 장애가 적고, 세포를 보호하는 효과가 충분히 높고, 안정적인 효과가 지속하여 얻어지는 생체 투여 가능한 수용액 및 그 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 산소 나노 버블을 포함하고, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 상기 산소의 나노 버블의 평균 입경 및 밀도가 각각 30 nm 이하 및 1 ㎖ 당 10¹⁶ 개 이상, 바람직하게는 1 ∼ 10 nm 및 1 ㎖ 당 10¹⁷ 개 이상이다. 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 용존 산소를 포함하는 수용액을, 2 이상의 관통 소공을 둘레 방향으로 갖는 통의 외부로부터 그 관통 소공을 통해 대기압 이상의 압력으로 분사시키고, 상기 통의 직경 방향 단면과 평행한 동일 평면상에서 상기 통의 중심에 수격이 집중하도록 충돌시켜 발생시킨 산소 나노 버블을 포함한다.

Description

생체 투여 가능한 수용액 및 그 제조 방법

본 발명은, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 손상 또는 장애가 적어, 세포를 보호하는 효과가 높은 생체 투여 가능한 수용액 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

마이크로·나노 버블은, 비특허문헌 1 에 기재되어 있는 바와 같이, (a) 기포 직경이 작은 것, (b) 상승 속도가 느린 것, (c) 마찰 저항을 저감하는 것, (d) 기포 내 압력이 높은 것, (e) 기액계면이 큰 것, (f) 가스의 용해량이 큰 것, (g) 용해, 수축을 수반하는 것과, 및 (h) 기포 표면이 부 (負) 로 대전하고 있는 것 등 여러 가지 특징을 갖는다. 특히, 나노 버블은 입경이 1 ㎛ 미만으로 매우 작아, 나노 버블을 포함하는 액체에서는 육안 확인을 할 수 없고 무색 투명하게 되는 것, 입자경이 작아질수록 부력이 점성력에 비해 매우 작아지기 때문에, 상면으로 부상하지 않고 액체 중에 초미세 버블인 채로 장기간 존재할 수 있는 것 등이 알려져 있다. 나노 버블은, 이들 특징을 이용하여 의료 분야에 대한 응용이 기대되고 있다.

예를 들어, 특허문헌 1 에는, 기포 직경이 1 ∼ 1000 nm, 바람직하게는 50 ∼ 500 nm 인 산소 나노 버블을 포함하여 이루어지는 수액이 제안되어 있다. 상기 특허문헌 1 에 기재된 발명은, 적혈구와 접합하고 있는 「접합형 산소」와, 적혈구에 용해되어 있는 「용해형 산소」에 있어서, 말초 세포에 산소를 공급할 수 있는 「용해형 산소」의 비율이 매우 작아, 그 부족분을 보충하기 위해서 산소 함량이 높은 수액을 제공하는 것이다. 이 수액은, 「뇌 저온 요법」, 「뇌의 무혈 수술」 또는 「말초 순환 부전증에 대한 치료」에의 사용을 목적으로 하고 있고, 래트를 이용한 뇌의 선택적 냉각법에 적용할 때에, 산소 나노 버블을 함유하지 않는 수액 (링거액) 에 비해 높은 산소 분압을 얻을 수 있다. 그리고, 상기 특허문헌 1 의 실시예 1 에는, 산소 나노 버블 함유 생리 식염수를, 특허문헌 2 에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있는 것이 기재되어 있다.

또, 특허문헌 3 에는, 동적 광 산란법으로 구해지는 개수 평균 직경이 300 nm 이하인 기포를 포함하는 나노 버블수를 유효 성분으로 하는 NK (내추럴 킬러) 활성 증강제의 존재하에서 배양하여 조정되는 NK 활성 증강 림프구, NK 활성 증강 단핵구, 또는 세포 면역 제제를 함유하는 수액 제제가 제안되어 있다. 상기 특허문헌 3 에 기재된 발명은, 동적 산란법에 있어서 개수 평균 직경이 300 nm 이하인 미세 기포를 포함하는 나노 버블수에, NK 활성을 증강시키는 작용이 있는 것을 알아내어 이루어진 것이고, 실제로 체적 평균 입경이 0.3734 ㎛ (373.4 nm), 개수 평균 직경이 0.2995 ㎛ (299.5 nm) 인 산소 나노 버블을 사용하여 NK 활성의 증강이 확인되어 있다.

또한, 특허문헌 4 에는, 심혈관 질환 또는 상태의 치료용 약제의 조정을 위해서 사용하는 계면 동전적으로 개변된 수성 유체로서, 평균 직경이 약 100 nm 미만인 산소 함유 나노 버블이 이온 수성류 (水性流) 중에서 안정적으로 형성되고, 대전 안정화한 산소 함유 나노 구조의 이온 수용액을 포함하는 수성 유체가 개시되어 있다. 그리고, 상기 이온 수용액에는 식염수를 포함하는 것이 기재되어 있다.

한편, 나노 버블을 포함하는 수액이나 생리 식염수는, 상기와 같은 치료 목적뿐만 아니라, 암의 치료 또는 예방을 위한 약제로서의 검토도 실시되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 5 에는 실시예 1 에 있어서, 오존 나노 버블수 및 산소 나노 버블수와 오존 나노 버블수를 혼합한 염분 농도가 0.3 질량％ 인 나노 버블수를 암의 치료 또는 예방에 적용하는 것이 제안되어 있다. 이때에 사용하는 나노 버블수는, 상기 특허문헌 2 에 기재된 방법에 의해 제조하는 것이 기재되어 있다.

일본 공개특허공보 2011-1271호 일본 공개특허공보 2005-246294호 일본 공개특허공보 2010-75180호 일본 공표특허공보 2013-538803호 일본 공개특허공보 2009-84258호

츠게 히데키, 「마이크로 버블·나노 버블의 기초」, Bull. Soc. Sea Water Sci., Jpn., 2010년, 제64권, p4-10

산소 나노 버블을 포함하는 수용액은, 종래부터 생리 식염수, 수액 또는 세포 배양액 등의 생체 투여 가능한 수용액에 적용하는 것이 검토되고 있고, 산소 공급능의 향상이나 각종 치료에 대해 어느 정도의 효과가 보이고 있다. 그러나, 그 효과는 기대된 것보다 작고, 또 효과의 편차가 보이고 안정적으로 지속되지 않는 점에서, 의료 효율 및 안전성과 안심의 확보 등의 점에서 구체적인 적용이 진척되고 있지 않는 것이 실정이다. 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 생리 식염수, 수액 또는 세포 배양액에 적용하기 위해서는, 효과가 명확하게 나타나고, 또한 그 효과가 안정적으로 지속하여 얻어지는 것이 필요 불가결한 조건이 된다.

상기 생체 투여 가능한 수용액에 있어서, 생리 식염수는, 수액, 각종 첨가제를 포함하는 수혈 또는 주사용 약제의 용매로서 사용되는 점에서 특히 유용하다. 그 때문에, 말초 세포에 산소를 충분히 공급하는 기능을 가져, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 손상 또는 장애가 적고, 세포를 보호하는 효과를 높일 수 있는 생리 식염수의 요구는 매우 높다.

상기 특허문헌 1 에 기재되어 있는 수액은, 산소 나노 버블의 기포 직경이 1 ∼ 1000 nm 로 규정되어 있지만, 수액을 제조하기 위해서 실제로 검토된 생리 식염수에 포함되는 산소 나노 버블의 기포 직경은 50 ∼ 500 nm 이다. 상기 특허문헌 1 에는, 산소 나노 버블을 함유하지 않는 수액 (링거액) 에 비해 높은 산소 분압이 관측되는 것이 기재되어 있지만, 그 효과는 정량적으로 검증된 것이 아니고, 실제로 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호하는 효과를 충분히 갖는 것인지 여부가 분명하지 않다. 본 발명자 등의 검토에 의하면, 생리 식염수 등의 생체 투여 가능한 수용액에 포함되는 산소 나노 버블의 기포 직경이 50 nm 이상이면, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호하는 효과가 거의 얻어지지 않아, 산소 나노 버블을 포함하지 않는 생리 식염수와 비교해 우위차가 거의 없는 것이 확인되었다. 또, 상기 특허문헌 1 에 기재된 발명과 동일한 방법으로 제조되는 상기 특허문헌 2 에 기재된 산소 나노 버블수에 있어서도, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호하는 효과가 충분히 얻어지지 않는 것이 밝혀졌다.

상기 특허문헌 3 에 기재된 수액 제제는, 동적 광 산란법으로 구해지는 개수 평균 직경이 300 nm 이하인 산소 기포를 갖지만, 실제로 실시예로서 검토된 산소 나노 버블의 기포 직경은 개수 평균 직경이 299.5 nm 이다. 그 때문에, 상기 특허문헌 1 및 2 와 동일하게, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호하는 효과를 충분히 갖는 것인지 여부가 분명하지 않다. 기포 직경이 50 nm 이상인 산소 나노 버블을 갖는 생리 식염수를 사용하여 본 발명자들이 실시한 상기 검토 결과를 감안하면, 상기 특허문헌 3 에 기재된 발명도, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호하는 효과를 얻는 것이 어렵다.

또, 상기 특허문헌 4 에 기재된 수성 유체는, 평균 직경이 약 100 nm 미만인 산소 함유 나노 버블이 이온 수성류 중에서 안정적으로 형성되는 것이지만, 산소 함유 나노 버블의 평균 직경에 대해서는 실제로 측정이 실시되어 있지 않고, 0.22 및 0.1 미크론 필터를 통과했을 때의 용해 산소 측정 결과로부터, 산소 함유 나노 버블의 평균 직경을 100 nm 미만이라고 추정하고 있는 것에 불과하다. 또한, 상기 특허문헌 4 에는 수성 유체에 포함되는 산소 함유 나노 버블의 밀도가 기재되어 있지 않아, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호하는 효과를 충분히 발휘하는 수성 유체인지 여부가 분명하지 않다.

또한, 상기 특허문헌 5 에 개시되어 있는 바와 같이, 나노 버블수는 암의 치료 또는 예방에 효과가 있다고 기대되고 있지만, 안정적으로 지속하여 현저한 효능이 얻어지고 있지 않기 때문에 나노 버블수의 효능에 대해서는 의문시되고 있어, 구체적인 치료에 대한 적용이 진척되고 있지 않는 것이 현상황이다. 이것은, 종래부터 사용되고 있는 나노 버블수는 기포 직경이 최소여도 50 nm 이기 때문에, 온도나 보관 상태 등의 사용 환경에 따라서는 나노 버블이 급속히 소실되기 쉽고, 또한 생체 내의 세포나 혈관에의 흡수성 또는 침투성의 점에서도 충분히 기능하고 있지 않기 때문이라고 본 발명 등은 생각하였다. 상기 특허문헌 5 의 발명에 있어서도, 사용하는 나노 버블수는 상기 특허문헌 2 에 기재된 방법으로 제작되고 있고, 그 기포 직경은 50 nm 이상이다.

본 발명은, 상기한 종래의 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 생리 식염수 등의 생체 투여 가능한 수용액에 포함되는 산소 나노 버블의 평균 입경이 종래 기술보다 작고, 또한 그 밀도가 높은 경우에, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호하는 효과가 충분히 얻어진다는 검증에 근거하여, 생체 투여 가능한 수용액에 포함되는 산소 나노 버블의 평균 입경을 보다 작게 할 뿐만 아니라, 산소 나노 버블의 밀도에 대해서도 높게 하는 방향으로 최적화함으로써, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 손상 또는 장애가 적고, 세포를 보호하는 효과, 및 혐기성 환경하에서 일어나기 쉬운 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하는 효과를 높게 함과 함께, 그들의 효과가 안정적으로 지속하여 얻어지는 생체 투여 가능한 수용액 및 그 제조 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명은, 생리 식염수 등의 생체 투여 가능한 수용액에 포함되는 산소 나노 버블의 평균 입경을 50 ㎛ 미만으로 작게 하고, 또한 산소 나노 버블의 밀도를 높게 하는 방향으로 규정함과 함께, 그러한 성상과 특성을 갖는 산소 나노 버블의 형성 방법을 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법으로서 적용함으로써 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 알아내어 본 발명에 도달하였다.

즉, 본 발명의 구성은 이하와 같다.

[1] 본 발명은, 산소 나노 버블을 포함하는 생체 투여 가능한 수용액으로서, 빙포매법 (氷包埋法) 에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 상기 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도가 각각 30 nm 이하 및 1 ㎖ 당 10¹⁶ 개 이상인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액을 제공한다.

[2] 본 발명은, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 상기 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도가 각각 1 ∼ 10 nm 및 1 ㎖ 당 10¹⁷ 개 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [1] 에 기재된 생체 투여 가능한 수용액을 제공한다.

[3] 본 발명은, 상기 생체 투여 가능한 수용액이, 상기 생체 투여 가능한 수용액의 100 질량부에 대해 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 포함하는 생리 식염수인 것을 특징으로 하는 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 생체 투여 가능한 수용액을 제공한다.

[4] 본 발명은, 상기 생체 투여 가능한 수용액이, 5 ％ 포도당액을 첨가한 저장 (低張) 복합 전해질액, 링거액, 고칼로리액 및 헤파린을 포함하는 생식액의 군에서 선택되는 어느 수액인 것을 특징으로 하는 상기 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 생체 투여 가능한 수용액을 제공한다.

[5] 본 발명은, 상기 생체 투여 가능한 수용액이, 세포 배양액인 것을 특징으로 하는 상기 [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 생체 투여 가능한 수용액을 제공한다.

[6］본 발명은, 상기 생체 투여 가능한 수용액이, 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하기 위해서 생체 내에의 투여 또는 경구 섭취에 의해 사용하는 수용액인 것을 특징으로 하는 상기 [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 생체 투여 가능한 수용액을 제공한다.

[7] 본 발명은, 용존 산소를 포함하는 수용액을, 2 이상의 관통 소공을 둘레 방향으로 갖는 통의 외부로부터 그 관통 소공을 통해 대기압 이상의 압력으로 분사시킬 때에, 상기 통의 직경 방향 단면과 평행한 동일 평면상에서 대향하도록 배치된 상기 2 이상의 관통 소공의 각각의 개구부로부터 분사한 용존액을 상기 통의 중심에 수격이 집중하도록 충돌시킴으로써 발생시킨 산소 나노 버블을 함유하고, 그 산소 나노 버블은, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 평균 입경 및 밀도가 각각 30 nm 이하 및 1 ㎖ 당 10¹⁶ 개 이상인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[8] 본 발명은, 상기 산소 나노 버블에 있어서, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 평균 입경 및 밀도가 각각 1 ∼ 10 nm 및 1 ㎖ 당 10¹⁷ 개 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [7] 에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[9] 본 발명은, 기체 및 액체를 각각 흡인하는 수단과, 상기 기체 및 상기 액체를 동시에 가압하여 반송하는 수단과, 그 반송된 기체를 포함하는 상기 액체를 새로운 산소와 혼합시킴으로써 용존 산소를 부화시키기 위한 기액 혼합조와, 그 기액 혼합조에 있어서 기액 혼합 상태에 있는 용존액을 사용하여 나노 버블을 발생시키기 위해서, 공동 (空洞) 의 통, 그 통의 둘레 방향으로 2 이상의 관통 소공의 각각의 개구부가 상기 통의 직경 방향 단면과 평행한 동일 평면상에서 대향하도록 배치된 상기 2 이상의 관통 소공, 및 상기 통의 적어도 편단부 (片端部) 에 나노 버블 토출구를 갖고, 상기 관통 소공은 그 관통 소공의 단면 중심부를 지나는 연장선 모두가 상기 통의 중심에서 교차하도록 배치되는 분사 노즐을 구비하는 나노 버블 발생 수단에 의해 상기 산소의 나노 버블을 발생시키는 것을 특징으로 하는 상기 [7] 또는 [8] 에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[10] 본 발명은, 상기 관통 소공이, 상기 통의 직경 방향 단면과 평행한 동일 평면상에서 대향하도록, 상기 통의 둘레 방향 등간격으로 4 개 이상 8 개 이내로 형성되고, 상기 통의 공동에 통하는 부분의 구멍 직경이 0.1 ∼ 0.5 mm 인 것을 특징으로 하는 상기 [7] ∼ [9] 중 어느 하나에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[11] 본 발명은, 상기 생체 투여 가능한 수용액이, 상기 생체 투여 가능한 수용액의 100 질량부에 대해 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 포함하는 생리 식염수인 것을 특징으로 하는 상기 [7] ∼ [10] 중 어느 하나에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[12] 본 발명은, 상기 [11] 에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법에 있어서, 상기 용존 산소를 포함하는 수용액으로서 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 함유하는 수용액을 사용함으로써 생리 식염수를 제조하는 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[13] 본 발명은, 상기 [11] 에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법에 있어서, 상기 용존 산소를 포함하는 수용액으로서 염화나트륨을 포함하지 않는 수용액을 사용하여, 상기 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 제조한 후, 상기 산소 나노 버블을 포함하는 수용액에 염화나트륨을 상기 생리 식염수의 100 질량부에 대해 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 배합함으로써 생리 식염수를 제조하는 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[14] 본 발명은, 상기 생체 투여 가능한 수용액이, 칼륨 및 칼슘 중 적어도 1 종의 원소, 5 ％ 포도당액, 아미노산 그리고 헤파린의 군에서 선택되는 적어도 어느 첨가제를 함유하여 제조되는 수액인 것을 특징으로 하는 상기 [7] ∼ [13] 중 어느 하나에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[15] 본 발명은, 상기 생체 투여 가능한 수용액이, 세포를 배양하기 위해서 사용하는 세포 배양액으로서 제조되는 것을 특징으로 하는 상기 [7] ∼ [14] 중 어느 하나에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

[16］본 발명은, 상기 생체 투여 가능한 수용액이, 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하기 위해서 생체 내에의 투여 또는 경구 섭취에 의해 사용하는 수용액인 것을 특징으로 하는 상기 [7] ∼ [14] 중 어느 하나에 기재된 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 종래보다 작은 평균 입경을 갖는 산소 나노 버블이 대량으로 포함됨으로써, 말초 세포에 산소를 충분히 공급하는 기능을 가져, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 손상 또는 장애가 적고, 세포를 보호하는 효과를 높일 수 있다. 또한, 세포를 보호하는 효과가 장기간에 걸쳐 안정적으로 얻어질 뿐만 아니라, 그 효과의 편차를 대폭 저감할 수 있다.

또한, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은 기포 직경이 30 nm 이하이고, 바람직하게는 1 ∼ 10 nm 로 종래보다 작기 때문에, 나노 버블의 수명이 온도나 보관 상태 등의 사용 환경에 의해 영향을 받는 일이 작고, 또한 생체 내의 세포나 혈관 등에의 나노 버블수의 흡수성 또는 침투성이 우수하다. 그 때문에, 혐기성 환경하에서 일어나기 쉬운 암 세포의 증식 및 비대화를 억제하는 효과를 안정적으로 계속해 얻을 수 있다.

또, 본 발명에 의한 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법은, 종래의 나노 버블 발생 장치와 비교해, 30 nm 이하의 평균 입경을 갖는 산소 나노 버블을 대량으로, 또한 안정적으로 발생시킬 수 있으므로, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 손상 또는 장애가 적어, 세포를 보호한다는 효과, 및 혐기성 환경하에서 일어나기 쉬운 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하는 효과를 장기에 걸쳐 안정적으로 얻을 수 있는 생체 투여 가능한 수용액을 용이하게 제조할 수 있다. 그러한 효과를 갖는 생체 투여 가능한 수용액은, 종래 기술로는 제조하는 것이 곤란하고, 본 발명의 제조 방법에 의해 비로소 얻을 수 있다.

도 1 은 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액을 제조하기 위한 산소 나노 버블 발생 장치를 나타내는 정면도 및 사시도이다.
도 2 는 도 1 에 나타내는 산소 나노 버블 발생 장치에 있어서, 산소 나노 버블을 발생시키는 노즐 형상 및 처리액을 분사하는 노즐 헤더의 예를 각각 나타내는 도면이다.
도 3 은 도 2 에 나타내는 액 충돌 노즐 (12) 의 1 개의 형상을 나타내는 도면이다.
도 4 는 참고예 1 의 공기 나노 버블수 및 나노 버블을 포함하지 않는 물에 대해, 그것들 아모르퍼스빙의 전자현미경 이미지의 사진 및 나노 버블의 입도 분포를 나타내는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 실시예 1 의 산소 나노 버블수에 대해, 아모르퍼스빙의 전자현미경 이미지의 사진을 나타내는 도면이다.
도 6 은 동적 광 산란법으로 측정한 실시예 1 의 산소 나노 버블수의 버블 입경을 개수 분포로 나타내는 도면이다.
도 7 은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 에 있어서, 혐기성 환경하에 두기 전과 방치 후에서의 세포의 형태 변화를 나타내는 사진 촬영도이다.
도 8 은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 에 있어서, 세포 장애 시에 누출되는 효소 (LDH) 의 양을 혐기성 환경하에 두기 전과 방치 후에 각각 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 에 있어서, 세포 발육력 (cell viability) 을 혐기성 환경하에 두기 전과 방치 후에 각각 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은 본 발명의 실시예 1 과 비교예 2 에 있어서, 혐기성 환경하에 방치 후에 촬영한 세포의 형태 변화를 나타내는 사진 촬영도이다.
도 11 은 본 발명의 실시예 1 과 비교예 2 에 있어서, 혐기성 환경하에 방치 후에 측정한 세포 생존율을 나타내는 도면이다.
도 12 는 본 발명의 실시예 3 과 비교예 3 에 있어서, 암 세포의 배양을 실시했을 때에 사용한 시판되는 저산소 배양 키트를 나타내는 도면이다.
도 13 은 본 발명의 실시예 3 과 비교예 3 에 있어서, O₂ 농도가 약 1 ％ 인 저산소 분위기에서 6 시간 및 24 시간 유치한 후의 HIF-1a 및 HSC70 의 각 단백질의 유도 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 는 도 12 의 (a) 에 있어서 검게 나타나 있는 부분의 면적을 화상 처리에 의해 수치화할 때의 순서를 나타내는 도면이다.

기체의 마이크로 나노 버블을 발생시키는 기술로는, 상기 비특허문헌 1 에 기재되어 있는 바와 같이, 선회 액류식, 스태틱 믹서식, 벤투리식, 가압 용해식, 세공식 등의 여러 가지 방법이 종래부터 제안되어 있다. 또, 상기 특허문헌 1 및 2 에 기재되어 있는 바와 같이, 수용액 중에 포함되는 산소를 함유하는 미소 기포에 물리적 자극, 예를 들어 수중 방전에 의한 충격파 등을 가함으로써, 보다 미세한 산소 나노 버블 (기포 직경 50 ∼ 500 nm) 을 발생시키는 방법도 제안되어 있다. 그러나, 이들 종래의 나노 버블 발생 방법으로 얻어지는 기포 직경은, 가장 작은 것이라도 50 nm 정도가 한도이다. 또한, 100 nm 이하의 기체 나노 버블은 가시광 및 자외광의 파장보다 작은 직경을 갖는 매우 미세한 입자이기 때문에, 입경을 정밀하게 측정할 수 있는 측정 기술이 확립되어 있지 않아, 기체의 나노 버블을 포함하는 수용액으로서 일반적으로 불리는 것은, 수십 nm 이하의 입자경을 갖는 나노 버블의 존재를 명확하게 증명하는 것이 곤란하였다.

본 발명자 등은, 종래의 마이크로 나노 버블 발생 방법으로 얻어지는 가장 작은 기포 직경으로서 50 nm 를 갖는 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수를 사용하여, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에서 세포를 보호하는 효과를 검증하였다. 검증은, 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수를 세포 배양액에 50 ％ 혼합한 상태에서, 혐기성 (저산소) 자극하에서 세포 형태의 변화 및 세포 손상의 정도를 정성적 및 정량적으로 측정하여, 실제로 세포의 보호가 어느 정도 실시될 수 있는지를 조사함으로써 실시하였다. 그 결과, 세포의 손상 정도는, 산소 나노 버블을 포함하지 않는 생리 식염수와 비교해 효과의 우위차가 거의 없고, 50 nm 이상의 기포 직경을 갖는 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수에서는 세포의 큰 세포 손상이 보이고, 세포 장애가 큰 것이 밝혀졌다. 따라서, 세포를 보호하는 효과에 대해서는, 생리 식염수에 포함되는 산소 나노 버블의 입경으로서 일반적으로 1000 nm 미만, 500 nm 미만, 300 nm 미만 또는 100 nm 미만이라고 규정하는 것만으로는 충분하지 않은 것이 분명해졌다.

본 발명은, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 보호 효과를 검증하는 상기 결과로부터, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호하는 효과가, 생리 식염수에 포함되는 산소 나노 버블의 평균 입경을 종래 방법보다 더욱 작고, 또한 그 밀도를 높게 함으로써 충분히 얻어지는 것이 아닐까라는 사상에 기초하여, 그러한 성상 및 특성을 갖는 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수를 제조할 수 있는 방법에 대해 시행 착오로 검토를 실시하고, 실현 가능한 방법을 찾아냄으로써 이루어진 것이다. 그리고, 실제로 그 방법에 의해 제조되는 생리 식염수를 세포 배양액으로서 사용함으로써, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에서 세포를 보호하는 효과가 확인되었다. 또한, 검증 결과에 대해서는, 후술의 실시예에 있어서 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서 사용하는 생리 식염수에 포함되는 산소 나노 버블의 크기는, 평균 입경으로 규정할 수 있다. 평균 입경이 작은 것일수록 나노 레벨로 포함되는 버블의 양이 많고, 그것보다 큰 입경을 갖는 버블의 양이 적어지는 경향이 있다. 마이크로·나노 버블의 크기는, 입도 분포 (입경의 표준 편차) 에 의해서도 영향을 받지만, 그 영향은 작고, 생리 식염수에 포함되는 나노 버블은, 평균 입경이 50 nm 미만의 오더이고, 가능한 한 작은 평균 입경을 가질 필요가 있다.

본 발명에 있어서, 산소 나노 버블은, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 평균 입경이 30 nm 이하이고, 바람직하게는 1 nm 이상이고 10 nm 이하이다. 산소 나노 버블의 평균 입경이 30 nm 이하일 때에, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 손상 또는 장애가 적고, 세포를 보호하는 효과가 높은 상태에서 안정적으로 지속하여 얻어진다. 또한, 10 nm 이하이면, 현저하게 큰 효과를 얻을 수 있다. 한편, 세포를 보호하는 효과는, 산소 나노 버블의 평균 입경이 1 nm 미만이어도 포화하는 경향이 있고, 산소 나노 버블 발생 장치를 제조할 때의 기술적인 허들의 높이를 고려하면 경제성 및 메인터넌스 용이성의 관점에서, 평균 입경은 1 nm 이상으로 규정하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 산소 나노 버블의 평균 입경뿐만 아니라, 또한 생리 식염수 등의 생체 부여 가능한 수용액 1 ㎖ 중에 포함되는 개수, 즉 산소 나노 버블의 밀도를 높은 값으로 규정할 필요가 있다. 이것은, 산소 나노 버블의 평균 입경을 30 nm 이하로 매우 작게 함으로써 버블의 보존 안정성 및 입경 유지성의 향상을 도모하는 한편으로, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에서 세포를 보호하는 기능을 충분히 발휘할 수 있도록, 생리 식염수 등의 생체 부여 가능한 수용액 1 ㎖ 중에 포함되는 산소의 총량을 높게 할 필요가 있기 때문이다.

본 발명에서 사용하는 생리 식염수 등의 생체 부여 가능한 수용액에 포함되는 산소 나노 버블의 밀도는, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 밀도가 생리 식염수 등의 생체 부여 가능한 수용액 1 ㎖ 당 10¹⁶ 개 이상일 필요가 있고, 바람직하게는 10¹⁷ 개/㎖ 이상이다. 본 발명에서 이용하는 산소 나노 버블은, 원래 평균 입경이 매우 작기 때문에, 그 밀도가 10¹⁶ 개 미만이면, 단위 체적당의 생체 부여 가능한 수용액에 포함되는 산소 농도가 희박해지기 때문에, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에서 세포를 보호하는 효과를 충분히 얻을 수 없다. 저산소성 또는 혐기성의 자극하에서 세포를 보호하는 효과는, 산소 농도가 높을수록 커진다. 또한, 산소 나노 버블의 평균 입경이 1 ∼ 10 nm 인 경우에는, 생체 부여 가능한 수용액에 포함되는 산소의 농도를 충분히 확보하기 위해, 산소 나노 버블의 밀도가 10¹⁷ 개/㎖ 이상인 것이 바람직하다.

마이크로 나노 버블의 입경의 측정 방법으로는, 종래부터 여러 가지 방법이 알려져 있다. 그것들 중에서 나노 버블의 계측법은, 광학적인 관찰이 곤란하기 때문에, 예를 들어 미산란광을 이용하는 광 산란법, 레이저 회절·산란법, 액 중의 버블 입자의 브라운 운동을 관측하는 나노 입자 트래킹 해석법, 세공 전기 저항법 (콜 카운터법), 동적 광 산란법, MEMS (Micro Electro-Mechanical Systems) 의 빔을 이용하는 공진식 질량 측정법 등이 제안되어 있다. 이들 방법 이외에도, 제타 전위 측정에 의한 나노 버블의 입자경을 구하는 방법이나 스핀 트랩제를 사용하여 전자 스핀 공명법 (ESR) 에 의한 나노 버블의 존재를 확인하는 방법이 제안되어 있다.

본 발명 등은, 상기 이외의 마이크로·나노 버블 계측법으로서, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정하는 방법을 제안하고 있다 (일본 특허출원 2014-230407호를 참조). 이 방법은, 액체를 비정질의 고상 상태로 하고, 상기 비정질의 고상 상태에 있는 액체에 포함되는 초미세 버블을 투과형 전자현미경을 사용하여 관찰함으로써, 액 중에 포함되는 초미세 버블 및 그 분포 상태를 직접적으로 화상으로서 관측하고 해석할 수 있다. 그 때문에, 10 nm 미만의 입경을 갖는 초미세 버블을 고정밀도로 측정할 수 있다. 또, 이 방법은, 산소 나노 버블의 평균 입경 외에도, 입경 분포 및 밀도를 구할 수 있기 때문에, 본 발명에 있어서 규정하는 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도는, 이 방법으로 측정하여 구한 것이다.

빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정하는 방법은, 마이크로그리드 또는 마이크로메시에 유지한 액체를 시료로서 이용하고, 에너지가 10 ∼ 300 킬로 일렉트론 볼트 (keV) 인 투과형 전자현미경에 의해, 관찰 시에 사용하는 전자선의 수를 1 ∼ 10⁵ 전자/Å² 로 설정하여 측정이 실시된다.

또한, 본 발명에서 사용하는 산소 나노 버블수의 버블 입경은, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정하는 방법 이외에도, 예를 들어 동적 광 산란법 (광자 상관법) 에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 오오츠카 전자 제조의 입경·분자량 측정 시스템 (모델 번호 : ELSZ-2000S) 또는 제타 전위·입경·분자량 측정 시스템 (모델 번호 : ELSZ-2000ZS) 등의 측정 장치를 사용하여, 특수한 데이터 처리를 실시함으로써 10 nm 이하의 버블 직경의 측정이 가능해진다. 여기서, 특수한 데이터 처리란, 예를 들어 측정의 적산 횟수를 늘리고, 측정 시에 불확정 난반사하는 데이터만을 삭제함으로써 안정적으로 존재하는 입자만을 추출하고, 그 입경을 측정하는 방법이다.

본 발명자 등이 검토를 실시한 결과, 동적 광 산란법에 의한 측정 방법으로도, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정하는 방법과 동일한 입경 측정 결과가 얻어지는 것을 확인할 수 있었다. 양자의 측정 방법의 대비에 대해서는, 후술의 실시예 1 에 있어서 구체적인 데이터를 나타내면서 설명한다. 그러나, 동적 광 산란법은 측정 입자가 내실인지, 또는 중공인지를 명확하게 구별하는 것이 매우 어렵다. 또한, 산소 나노 버블의 밀도에 대해서도 고정밀도 측정을 실시하는 것이 기술적인 제약을 받아 곤란하다. 그에 대해, 본 발명과 같이 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정하는 방법은, 전자현미경에 의해 측정 입자가 내실인지 중공인지를 명확하게 구별하여 관측할 수 있을 뿐만 아니라, 산소 나노 버블의 밀도도 고정밀도로 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 산소 나노 버블 직경의 측정 방법으로서, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정하는 방법을 채용한다.

본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 통상적인 생리 식염수와 동일하게, 삼투압이 혈액 또는 체액에 합치하도록 기본적으로 0.9 질량％ 의 염화나트륨을 포함함으로써 생리 식염수로서 사용할 수 있다. 본 발명의 생리 식염수에 있어서, 염화나트륨의 함유량은, 어느 정도의 편차가 있어도 허용되고 있다. 그러나, 염화나트륨의 함유량이 0.9 질량％ 로부터 극단적으로 멀어지는 경우에는 사용이 크게 제한된다. 따라서, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액을 생리 식염수로서 사용하는 경우에는, 염화나트륨을 생리 식염수의 100 질량부에 대해 0.85 ∼ 0.95 질량％ 의 범위에서 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 생리 식염수는, 인체의 장기 또는 생체 내 반응의 산화 환원 전위에 맞추기 위해서 산화 환원 전위를 조정하는 경우에는, 수소 나노 버블이나 다른 전해질 용액을 소량 혼입시켜도 된다. 또, 생리 식염수의 pH 를 조정하기 위해, 전해질 등으로 이루어지는 pH 조정제를 첨가해도 된다.

또, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 다음과 같은 각종 첨가제를 포함하는 수액으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생리 식염수에, 5 ％ 포도당액을 소정 양으로 첨가한 저장 복합 전해질액, 칼륨이나 칼슘을 첨가한 링거액, 포도당이나 아미노산을 첨가한 고칼로리액, 헤파린을 첨가한 생식액이다. 본 발명의 수액을 제조하는 경우에는, 통상 본 발명에서 얻어지는 생리 식염수를 용매로서 사용하지만, 반드시 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 의 범위에서 포함하는 생리 식염수를 사용하는 것으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 수액을 생체에 투여할 때, 수액의 삼투압을 혈액 또는 체액에 엄밀하게 맞출 필요가 반드시 없는 경우에는, 염화나트륨의 함유량을 저감하거나, 혹은 염화나트륨을 전혀 함유하지 않는 수용액, 또는 염화나트륨의 함유량을 늘린 수용액을 사용하고, 상기 각종 첨가제를 함유시킨 것을 수액으로서 사용해도 된다.

본 발명의 생리 식염수 또는 수액은, 혈관 평활근 세포 등의 각종 세포를 배양하기 위한 수용액으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 운동 중이나 운동 후의 저혈당 상태나 저산소 상태에 있어서의 세포 장애의 저감을 도모하고, 심근경색, 뇌경색 및 그 밖의 순환 혈류 장애에 의한 세포 장애에 대한 보호를 높이고 싶을 때에 큰 효과를 얻을 수 있다.

또, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 저산소 농도의 혐기성 분위기하에서 일어나는 암의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하기 위해서 생체에 투여 또는 경구 섭취하는 수용액으로서 사용할 수 있다. 종래부터 암 세포는 혐기성 분위기하에서 증식하기 쉬운 것이 알려져 있어, 암 세포의 주위를 산소 농도가 높은 호기성으로 함으로써, 그 증식 및 비대화가 억제되는 것이 아닐까라고 생각되고 있었다. 그 때문에, 예를 들어 상기 특허문헌 5 에 개시되어 있는 바와 같이, 기포 직경이 50 nm ∼ 500 nm 인 나노 버블수를 암 치료용으로서 사용하는 것이 제안되었다. 그러나, 생체 내의 정상인 세포나 혈관의 표면에 존재하는 구멍 직경은 30 nm 이하, 구체적으로는 수 nm ∼ 수십 nm 의 범위이기 때문에, 산소 또는 오존의 나노 버블수 내에 존재하는 기포 직경이 50 nm 이상으로는, 생체 내의 세포 또는 혈관 내부로의 흡수성 또는 침투성이 반드시 충분하다고는 할 수 없었다. 또한, 생체는 통상 35 ∼ 37 ℃ 로 약간 고온으로 유지되고 있기 때문에, 나노 버블의 기포 직경이 커질수록, 버블의 대직경화가 가속되고 버블 소실이 촉진되는 점에서, 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하는 효과가 충분히 얻어지지 않았다. 만일, 그 효과가 있었다고 해도 안정적으로 지속되는 것은 아니었다.

그에 대해, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액에 포함되는 나노 버블은, 기포의 평균 입경이 30 nm 이하, 바람직하게는 1 ∼ 10 nm 이고, 또한 버블의 밀도가 매우 높기 때문에, 생체 내 세포 내에의 흡수성 또는 침투성이 우수함과 함께, 그 기포 직경으로 존재하는 나노 버블의 수명이 상대적으로 길어진다. 그것에 의해, 종래의 오존 나노 버블수 또는 오존과 산소의 나노 버블수를 병용한 경우에 비해, 본 발명과 같이 산소 나노 버블만을 포함하는 수용액이어도 암 세포의 주변 환경을 산소 농도가 높은 호기성으로 장기간 유지하는 것이 가능해져, 암의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하는 효과가 높아진다. 또한, 그 효과를 상대적으로 긴 기간에 걸쳐서 지속하는 것이 가능해진다. 이와 같이, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 암의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하기 위한 약제로서의 기능을 가지고 있어, 그러한 암 치료 등의 의료 분야에 있어서 바람직한 수용액이다.

다음으로, 본 발명의 생리 식염수를 제조하기 위한 산소 나노 버블 발생 장치에 대해 도면을 이용하여 설명한다.

도 1 은 본 발명에서 사용하는 산소 나노 버블 발생 장치의 일례를 나타내는 도면이고, 기본적인 구성은 일본 특허 제5555892호에 기재되어 있는 장치와 동일하다. 도 1 에 있어서 (a) 및 (b) 는, 각각 산소 나노 버블 발생 장치의 정면도와 사시도이다. 도 1 에 나타내는 산소 나노 버블 발생 장치 (1) 에 있어서, 2 가 벨로우즈 실린더 펌프, 3 이 기액 혼합조, 4 가 펌프 컨트롤러, 5 가 압력 센서, 6 이 마이크로·나노 버블 발생용 노즐 장착부, 7 이 액 흡인관, 8 이 기체 흡인구, 9 가 기체 흡인 조정 밸브이다.

이들은, 도 1 의 (b) 에 나타내는 사시도와 같이 배치한다. 접액부를 불소 수지로 제작한 벨로우즈 실린더 펌프 (2) 에서 7 의 액 흡인관, 9 의 기체 흡인 조정 밸브를 사용하여 기체량을 조정해 펌프 내부에 액과 기체를 혼합한 상태에서 흡인하고 벨로우즈 내부에서 교반, 용존시켜, 압축액 중에 산소를 용존시킨다. 본 발명에 있어서는, 벨로우즈 실린더 펌프 (2) 는 메탈 프리이면 되고, 불소 수지 이외의 플라스틱, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 범용 플라스틱, 폴리아세탈, 폴리아미드, 폴리카보네이트 및 변성 폴리페닐렌에테르 등의 엔지니어링 플라스틱, 폴리에테르술폰, 폴리페닐렌술파이드, 폴리에테르에테르케톤 및 액정 폴리머 등의 슈퍼 엔지니어링 등 중 적어도 1 종을 사용해도 된다. 그 경우, 펌프뿐만 아니라, 액 형성부에도 불소 수지를 비롯하여 상기 각종 플라스틱을 사용하는 것에 의해, 신뢰성이 높은 청정한 산소 나노 버블 발생 장치로 할 수 있다. 또, 본 발명에 있어서, 엄밀한 메탈 프리화에 의한 세정이나 살균이 요구되지 않는 경우에는, 상기 플라스틱뿐만 아니라, 금속이나 세라믹스를 사용해도 된다.

다음으로, 기액 혼합조 (3) 에 기체와 액을 펌프 (2) 로 교반하여 압송한다. 펌프 (2) 는, 주로 압축 공기 기동식 벨로우즈 실린더 펌프를 사용하지만, 전동식의 것이어도 된다. 기액 혼합조 (3) 의 기체와 액은, 펌프 (2) 로부터의 압력을 받고 있어, 기체가 용존하기 쉬워진다. 요컨대 기체와 액체를 펌프 (2) 로부터 압송하는 압력을 5 의 압력 센서로 체크하고 있다. 이 방법에 의해 용존 기체의 양을 많게 하여 나노 버블의 발생량을 증가시킬 준비를 실시한다. 본 발명의 산소 나노 버블 발생 시스템은 펌프 (2) 로서 벨로우즈 실린더 펌프를 사용하는 것이 실용적이지만, 용도에 따라 종래부터 송액 펌프로서 공지된 피스톤 펌프, 플런저 펌프 또는 다이어프램 등의 왕복동 펌프나, 기어 펌프, 편심 펌프 또는 나사 펌프, 캐스케이드 펌프, 베인 펌프 등의 회전 펌프 등을 적용할 수 있다.

압송되어 기액 혼합조 (3) 로 들어간 액은 산소와 혼합되어, 산소를 액의 내부에 용존시키고 나서 나노 버블 발생용 노즐 장착부 (6) 로 보낸다. 나노 버블 발생용 노즐 장착부 (6) 는, 용존한 산소를 직경이 30 nm 이하, 바람직하게는 1 nm ∼ 10 nm 의 크기의 산소 나노 버블을 대량으로 제조하는 노즐과 접속하는 부분이다.

이때, 5 의 압력 센서로 노즐 (6) 과 기액 혼합조 (3) 간의 액 압력의 변동을 보고 기액의 용존 상태를 감시한다. 이렇게 함으로써 안정적인 나노 버블용 발생 노즐에 필요한 일정한 압력 상태를 실현한다.

도 1 의 (a) 및 (b) 에 나타내는 본 발명에서 사용하는 산소 나노 버블 발생 장치를 사용하여 실시하는 공정은 다음과 같다. 액 흡인관 (7), 기체 (산소) 흡인구 (8) 및 기체 흡인 조정 버블 (9) 을 사용하여 실시하는 것이 기체·액체 흡인 공정이다. 압력은, 압력 센서 (5) 로 조정한다. 다음으로, 벨로우즈 실린더 펌프 (2) 를 사용하여 산소를 함유하는 기체를 포함하는 액체를 가압하는 공정이 기체·액체 가압 공정이다. 계속해, 가압된 상기 기체를 포함하는 액체를 새로운 산소와 혼합시키기 위해서, 펌프 컨트롤러 (4) 및 기액 혼합조 (3) 를 사용하여 실시하는 공정이 용존 기체 부화 공정이다. 그 후, 후술하는 본 발명의 발생 노즐을 산소 나노 버블 발생용 노즐 장착부 (6) 에 접속하고 나서 산소 나노 버블을 발생시킨다. 이 공정을 용존 기체 미세화 공정이라고 부르지만, 산소 나노 버블은, 2 이상의 관통 소공을 갖는 통의 외부로부터 그 관통 소공을 통하여 대기압 이상의 압력으로 분사하고, 상기 통의 내부의 일점에서 충돌시킴으로써 발생시킬 수 있다.

본 발명에서 사용하는 산소 나노 버블 발생 장치에 있어서는, 공기가 포함되는 통상적인 액체를 진공하에서 탈기 처리함으로써 액체 중에 포함되는 공기를 가능한 한 제거한 상태로 한 액체를 사용해도 된다. 탈기 처리 후의 액체는, 기체 흡입구 (8) 로부터 흡인한 산소 및/또는 용존 기체 부화 공정에 있어서 새로운 산소와 각각 혼합된 후, 본 발명에서 사용하는 버블 발생 노즐을 사용하여 산소 나노 버블의 발생을 실시함으로써, 산소 나노 버블을 포함하는 액체로서 사용된다. 이 방법은, 산소를 혼합하기 전에 액체를 탈기함으로써, 후에 실시하는 산소의 혼합 및 용존 공정에서 액체 중의 산소 농도를 보다 높이는 효과가 얻어지는 점에서 본 발명의 제조 방법에 있어서 바람직하게 채용된다.

도 2 에 도 1 의 세정 장치에 있어서, 산소 나노 버블을 발생시키는 노즐 형상 및 처리액을 분사하는 노즐 헤더의 예를 각각 나타낸다. 도 2 에 있어서, (a) 및 (b) 는, 각각 노즐 헤더 (10) 의 단면도 및 상면도이다. 도 2 의 (a) 는, (b) 의 D-D 단면을 나타내고 있다.

도 2 의 (a) 및 (b) 에 나타내는 바와 같이, 노즐 헤더 (10) 는, 처리액을 분사하기 위한 분사 노즐 (11) 및 산소 나노 버블을 토출시키기 위한 액 충돌 노즐 (12) 과 대 (臺) (13) 로 구성되어 있고, 액 충돌 노즐 (12) 의 1 개 또는 2 개 이상을 13 의 대 상에 장착 배치한다. 여기서, 액 충돌 노즐 (12) 이, 산소 나노 버블을 발생시키는 노즐 형상의 예이다.

도 3 은, 도 2 의 (a) 에 나타내는 노즐 헤더 (10) 의 액 충돌 노즐 (12) 을 배치한 부분의 확대도이다. 도 3 에 나타내는 바와 같이, 12 의 액 충돌 노즐의 1 개의 형상에 있어서, 12a 의 작은 구멍은 12 의 중심을 향해 형성되어 있다. 이 작은 구멍 (12a) 를 지나, 고압으로 들어간 액을 액 충돌 노즐 (12) 의 중심 부분에서 충돌시켜 나노 버블을 발생시키고, 화살표 Q 로 나타내는 방향으로 분사한다. 실험의 결과, 액의 속도 V 를 컨트롤하면, 발생한 나노 버블의 양이 많고, 또한 버블의 수명이 길어지는 것을 알 수 있었다. 속도 V 의 기준으로서, 25 m/초를 초과하는 속도가 되면 안정적인 나노 버블 발생 노즐이 된다.

도 2 및 도 3 에 있어서 액 충돌 노즐 (12) 로부터 분사한 수용액 (Q) 은, 예를 들어 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수를 제조할 때에, 다음의 2 가지 방법에 따라 조정한다. 제 1 방법은, 도 1 에 나타내는 액 흡인관 (7) 에 의해 흡인하는 액으로서, 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 함유하는 수용액을 사용하고, 그 수용액에 산소를 용존시킨 후에 분사 노즐 (11) 로부터 분사하여 얻어지는 기액 혼합액을 그대로 생리 식염수로 하는 방법이다. 또, 제 2 방법에 있어서는, 도 1 에 나타내는 액 흡인관 (7) 에 의해 흡인하는 액으로서 염화나트륨을 포함하지 않는 수용액 (순수를 포함한다) 을 사용하여, 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 제조한 후, 상기 산소 나노 버블을 포함하는 수용액에, 염화나트륨을 상기 생리 식염수의 100 질량부에 대해 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 배합함으로써 생리 식염수로서 사용한다.

또, 상기 수용액 (Q) 을 수액으로서 조정하는 경우도, 도 1 에 나타내는 액 흡인관 (7) 에 의해 흡인하는 액으로서, 칼륨 및 칼슘 중 적어도 1 종의 원소, 5 ％ 포도당액, 아미노산 그리고 헤파린의 군에서 선택되는 적어도 어느 첨가제를 미리 함유하는 수용액을 사용하고, 그 수용액에 산소를 용존시킨 후에 분사 노즐 (11) 로부터 분사하여 얻어지는 기액 혼합액을 그대로 수액으로서 사용할 수 있다. 이때, 필요에 따라 염화나트륨을 동시에 함유시켜도 된다. 이 방법 이외에도, 도 1 에 나타내는 액 흡인관 (7) 에 의해 흡인하는 액으로서 상기 첨가제를 포함하지 않는 수용액을 사용하고, 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 제조한 후, 상기 산소 나노 버블을 포함하는 수용액에, 상기 첨가제를 소정 함유량으로 배합함으로써 수액으로서 사용한다. 이때, 상기 첨가제를 포함하지 않는 수용액으로는, 순수뿐만이 아니라 염화나트륨을 포함하는 생리 식염수를 사용해도 된다.

액 분사 노즐 (11) 로부터의 수류를 이용하여 산소 나노 버블을 제작하는 방법에 대해 설명한다. 고속 제트액 분사 노즐 (11) 로부터 나온 벨로우즈 실린더 펌프 (2) 로 이루어지는 고압 펌프의 토출 압력 (대기압 이상) 상태로부터 압력을 급격하게 해방하므로, 산소가 용존하는 액이 서로 격돌하고, 그 수격력에 의해 작렬하는 힘으로 기체를 용존한 액을 부숴 산소 나노 버블을 대량으로 포함하는 상태로 한다. 단 해방하는 방법에 따라서는, 산소 나노 버블의 발생량이 적어져 버리는 경우가 있지만, 본 발명에 의한 방법과 장치에 의해 산소 나노 버블을 대량으로 발생시킬 수 있다.

본 발명의 생리 식염수에 포함되는 산소 나노 버블은, 예를 들어 도 2 및 도 3 에 나타내는 바와 같은 구조를 갖는 액 충돌 노즐 (12) 을 사용함으로써, 기액 혼합 상태에 있는 용존액을 분사할 때의 압력이 대기압 (약 0.1 MPa) 이상이면, 산소 나노 버블의 발생량을 종래와 동등 이상으로 할 수 있다. 또한, 이 압력을 0.2 MPa 이상으로 설정함으로써, 충분한 양으로 발생시킨 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수를 제조할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 있어서는 용존액의 분사 압력의 하한값을 0.2 MPa 로 종래보다 낮게 할 수 있기 때문에, 금속 오염의 영향을 없애기 위해서 바람직한 펌프, 예를 들어 불소 수지로 제작한 압축 공기 구동식 또는 전동식의 벨로우즈 실린더 펌프 (2) 를 사용하는 것이 가능해진다. 산소 용존액의 분사 압력의 상한값은 특별히 규정되지 않지만, 분사 압력의 증대에 수반하는 산소 나노 버블 발생 장치 (1) 의 부하를 저감하고 싶은 경우에는 1.0 MPa 이하로 설정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 생리 식염수를 제조할 때에 사용하는 산소 나노 버블 발생 장치의 노즐은, 대기압 이상, 바람직하게는 0.2 MPa 이상이라는 종래보다 낮은 압력으로도 용존액의 제트류를 분사할 수 있도록 설계한다. 기체 용존액의 제트류의 분사 및 충돌에 의해 얻어지는 수격력을 F 로 한다. 수격력 F 는, 액의 밀도를 ρ, 작은 구멍의 크기를 S, 액의 속도를 V 로 할 때, F = ρSV² 의 관계가 성립된다. F 를 최적값으로 하기 위해서는, 구멍의 크기 S 와 속도 V 의 관계를 고려한 최적 설계가 필요로 된다.

본 발명에서 사용하는 산소 나노 버블 발생 장치에 있어서는, 도 2 및 도 3 의 12 로 나타내는 액 충돌 노즐이 갖는 관통공의 직경 S, 즉 작은 구멍 (12a) 의 직경이 0.1 ∼ 0.5 mm 인 것이 바람직하고, 또한 0.2 ∼ 0.4 mm 인 것이 보다 바람직하다. 여기서, 액 충돌 노즐 (12) 의 구멍 (12a) 의 직경이 0.1 mm 미만이면, 입경이 작은 미세 산소 버블의 생성량은 증가하는 경향이 있지만, 1 nm 이상의 입경을 갖는 버블의 생성량이 급격하게 적어지기 때문에, 산소 나노 버블의 발생량이 저하하여, 산소 나노 버블의 밀도 저하가 현저해진다. 또, 액 충돌 노즐 (12) 의 구멍 (12a) 의 직경이 0.5 mm 를 초과하면, 1 nm 이상의 입경을 갖는 버블의 총생성량은 증가하지만, 반대로 10 nm 이하의 소립경 버블의 생성량이 급격하게 감소하기 때문에, 평균 입경의 증대에 수반하여 산소 나노 버블의 안정성이 급격하게 저하하여, 본 발명의 효과를 충분히 발휘할 수 없다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 산소 나노 버블의 평균 입경을 30 nm 이하로 작게 하고, 산소 나노 버블의 밀도를 생리 식염수 1 ㎖ 당 10¹⁶ 개 이상으로 대량으로 하기 위해서, 액 충돌 노즐 (12) 의 관통 소공 직경은 0.1 ∼ 0.5 mm 의 범위에서 형성하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 액 충돌 노즐 (12) 의 관통 소공 직경을 0.2 ∼ 0.4 mm 의 범위에서 형성함으로써, 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도를 각각 1 ∼ 10 nm 및 생리 식염수 1 ㎖ 당 10¹⁷ 개 이상으로 할 수 있다.

동일한 효과는, 사방으로부터 중심을 향하여 발사하여 센터에 수격을 집중시킴으로써 속도를 보다 높일 수 있어, 평균 입경이 보다 작은 산소 나노 버블을 대량으로 발생시킬 수 있다. 그 때문에, 사방으로부터의 수격을 실시하는 경우에는, 물 분사의 속도가 동일한 경우, 관통공의 구멍의 개수에 따라 보다 큰 효과를 얻을 수 있다. 예를 들어, F = ρSV² 이므로 관통 소공이 4 구멍 있고, 그것들이 중심으로 집중되는 경우에는, 중심으로 모이는 힘 F = 4ρSV² 가 되어, 관통공의 구멍의 개수가 2 인 경우와 비교해 2 배의 수격력이 얻어진다. 이와 같이 액이 충돌하여 중심에 수격을 집중시키는 데에 노즐의 작은 구멍의 개수를 많게 하면, 유량이 많아지기 때문에 액의 충돌하는 에너지가 높아진다. 산소 나노 버블의 발생량은 액의 충돌하는 에너지가 커지면, 보다 작은 평균 입경을 갖는 산소 나노 버블을 대량으로 발생시킬 수 있다.

본 발명에 있어서는, 액 충돌 노즐 (12) 의 관통 소공 직경을 0.1 ∼ 0.5 mm 로 규정함으로써, 산소 용존액의 속도 V 가 상승하여, 발생하는 산소 나노 버블의 평균 입경을 작게 할 수 있는 효과가 얻어진다. 또한 산소 나노 버블의 밀도도 동시에 높게 할 필요가 있기 때문에, 액 충돌 노즐 (12) 의 관통 소공의 개수는, 액 충돌 노즐 (12) 의 통의 둘레 방향 등간격으로 4 개 이상 8 개 이내로 형성하는 것이 바람직하다. 액 충돌 노즐 (12) 의 관통 소공의 개수가 3 개 이하이면, 산소 나노 버블의 밀도의 저하가 현저해진다. 또, 관통 소공의 개수가 9 개 이상인 경우는, 산소 나노 버블의 밀도 향상의 효과가 포화할 뿐만 아니라, 액 충돌 노즐 (12) 의 관통 소공의 위치 맞춤을 실시할 때에 고정밀도가 요구되기 때문에, 액 충돌 노즐 (12) 의 제조가 매우 곤란해진다.

또, 본 발명에서 사용하는 산소 나노 버블 발생 장치에 있어서는, 액 충돌 노즐 (12) 의 형상은, 12a 의 소공을 4 ∼ 8 개로 둘레 방향으로 등간격으로 형성하는 뿐만 아니라, 예를 들어 액 충돌 노즐 (12) 의 길이 방향으로 2 단 이상으로 병행하여 관통 소공의 구멍을 형성하여, 액의 수격이 발생하는 장소를 2 지점 이상으로 해도 된다. 그것에 의해 나노 버블을 대량으로 발생시키는 것이 가능해지므로, 노즐의 소형화와 효율화에는 유효한 방법이다. 또한, 4 개 이상의 소공으로부터 액을 동시에 토출시킴으로써 수격의 강도를 증가시킬 수 있으므로, 액의 속도 V 를 올리지 않아도 30 nm 이하의 평균 입경을 갖는 산소 나노 버블을 대량으로 발생시킬 수 있다. 그 때문에, 고압으로 액을 토출시키는 펌프가 필요하지 않게 되어, 부담이 적기 때문에, 공업적으로는 매우 유익한 기술이고, 에너지 효율이 양호한 노즐의 개발이 가능하다.

실시예

이하에 있어서, 본 발명에 근거하는 실시예를 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되지 않는다.

＜참고예 1＞

일본 특허 제5555892호에 개시된 방법에 따라 나노 버블수 제조 장치 ΣPM-5 (벨로우즈 펌프식) (시그마 테크놀로지 유한회사 제조) 에 의해 공기 나노 버블수를 제조하고, 순수에 의해 100 배로 희석하여 측정용 시료로서 사용하였다. 액 분사 노즐로서, 도 2 에 나타내는 액 충돌 노즐 (12) 을 갖는 것을 사용하였다. 액 충돌 노즐 (12) 에 형성하는 관통 소공의 구멍은, 액 충돌 노즐 (12) 을 구성하는 통의 직경 방향 단면과 평행한 동일 평면상에서 대향하도록, 상기 통의 둘레 방향 등간격으로 6 개로 형성되어 있고, 상기 통의 공동에 통하는 부분의 구멍 직경이 0.3 mm 이다. 또, 참고용 시료로서 나노 버블 제조 전의 순수를 사용하였다. 나노 버블 제조 전의 순수는, 나노 버블을 포함하지 않는 물에 상당한다.

시료 급속 동결 장치 Vitrobot Mark IV (FEI 사 제조) 에 의해 제조 직후의 상기 공기 나노 버블수를 급속 동결하여 나노 버블을 아모르퍼스빙 중에 포매한 시료를 제작하고, 관찰용 시료로 하였다. 시료 두께는 200 nm 이다. 한편, 나노 버블을 포함하지 않는 물 (순수) 에 대해서도 동일한 시료 급속 동결 장치에 의해 급속 동결하여 참고용 시료로 하였다. 시료 두께는 200 nm 이다. 300 keV 의 전자 에너지를 갖는 크라이오 투과형 전자현미경 Titan Krios (FEI 사 제조) 를 사용하여, 시료 온도 약 80 K 에 있어서 아모르퍼스빙 중에 포매된 나노 버블을 직접 관찰하였다. 관찰에 사용하는 전자선은, Low dose 기술에 의해 20 전자/Å² 정도이고, 촬영 중의 시료 온도의 상승은 거의 없었다.

도 4 에, 공기 나노 버블을 포함하는 순수를 동결한 아모르퍼스빙 및 순수 (나노 버블을 포함하지 않는 물) 를 동결한 아모르퍼스빙에 대해 전자현미경 이미지의 사진을 나타낸다. 또, 공기 나노 버블수에 대해서는, 전자현미경 사진 아래에 버블의 입도 분포 (사이즈 분산을 나타내는 히스토그램) 를 나타낸다.

도 4 의 좌측에 나타내는 전자현미경 이미지의 사진은, ΣPM-5 에 의해 제조 후, 즉시 관찰된 공기 나노 버블이고, 사진 중에 관찰되는 원형의 콘트라스트가 나노 버블이다. 화상 처리의 결과, 평균 입경은 7 nm 이다. 히스토그램의 측정에 사용한 아모르퍼스빙의 체적은 3.2 × 10^-14 cc (400 nm × 400 nm × 200 nm 두께) 이고, 그 중에 버블은 약 260 개 포함되어 있다. 100 배로 희석한 나노 버블수를 관찰하고 있는 점에서, 이 나노 버블수의 공기 나노 버블의 농도는, 8.1 × 10¹⁷개/cc(㎖) (81 경개/cc(㎖)) 라고 평가된다. 그에 대해, 도 4 의 우측에 나타내는 전자현미경 이미지의 사진은 아모르퍼스빙이고 콘트라스트의 변화는 없고, 버블이 포함되지 않은 물인 것을 확인할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 의한 측정 방법 및 측정 장치에 의해, 물에 포함되는 나노 버블의 존재를 직접적으로 화상으로서 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 나노 버블의 입자경, 개수, 입도 분포 및 형태에 관한 정보를 취득할 수 있다.

＜실시예 1＞

공기 대신에 산소를 사용하는 것 이외에는, 상기 참고예 1 과 동일한 장치와 방법에 의해 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 제조하였다. 본 실시예에 의한 산소 나노 버블수는, 크라이오 투과형 전자현미경 Titan Krios (FEI 사 제조) 를 사용하고, 참고예 1 과 동일한 조건과 방법에 의해 평균 입경 및 밀도를 측정하였다. 도 5 에, 산소 나노 버블을 포함하는 순수를 동결한 아모르퍼스빙에 대해 전자현미경 이미지의 사진을 나타낸다.

도 5 에 있어서, 사진의 중앙부 부근에 실선의 원으로 둘러싼 영역에는 평균 입경은 3 nm 인 어두운 콘트라스트가 보인다. 또, 사진의 하부 부근에 점선의 원으로 둘러싼 영역에는 어두운 콘트라스트가 연속적으로 이어져 배열되어, 선과 같이 관찰되는 부분이 존재하고 있지만, 이것도 산소 나노 버블이다. 이 결과로부터, 3 nm 의 평균 입경을 갖는 산소 나노 버블은, 고립하여 존재하는 것이 아니라, 일부 응집한 배열을 취하는 것이 명확해졌다. 이 아모르퍼스빙의 체적 1.8 × 10^-14 cc (300 nm × 300 nm × 200 nm 두께) 중에는 산소 나노 버블이 360 개 포함되어 있는 것을 알 수 있고, 산소 나노 버블수를 100 배로 희석한 물을 사용하여 관찰하고 있는 점에서, 이 나노 버블수의 산소 나노 버블의 밀도는, 2 × 10¹⁸ 개/cc(㎖) (200 경개/cc(㎖)) 라고 평가된다.

도 6 에는, 참고로 오오츠카 전자 제조의 입경·분자량 측정 시스템 (ELSZ-2000S) 을 사용하여 동적 광 산란법으로 측정한 본 실시예의 산소 나노 버블수의 버블 입경을 개수 분포로 나타낸다. 도 6 에 나타내는 개수 분포는, 상기에서 서술한 바와 같이 특수한 데이터 처리를 실시한 후의 측정 결과이다. 도 6 에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 산소 나노 버블은, 입경이 1 ∼ 10 nm 의 좁은 범위에서 분포하고 있고, 도 5 에 나타내는 결과와 대략 동일한 입도 분포가 얻어지고 있다. 또, 평균 입경으로서 3 ㎛ 에 가까운 값을 갖는 것이 용이하게 간파된다. 이와 같이, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정을 실시하는 본 발명의 측정 방법은, 산소 나노 버블수의 버블 입경을 정확하게 측정할 수 있는 것이 동적 광 산란법과의 대비로부터도 확인할 수 있었다.

이와 같이 하여 제조된 산소 나노 버블을 포함하는 물에, 염화나트륨의 함유량이 생리 식염수 100 질량부에 대해 0.9 질량％ 가 되도록 배합함으로써 본 실시예의 생리 식염수를 제조하였다. 이 생리 식염수를 실시예 1 로 한다.

＜비교예 1＞

상기 참고예 1 에서 검토한 산소 나노 버블을 발생시키기 전의 순수에, 염화나트륨을 상기 생리 식수의 100 질량부에 대해 0.9 질량％ 로 배합함으로써 비교예 1 의 생리 식염수를 제조하였다.

이상과 같이 하여 제조된 산소 나노 버블을 포함하는 세포 배양액 (실시예 1) 및 산소 나노 버블을 포함하지 않는 세포 배양액 (비교예 1) 을 사용하고, 혐기성 (저산소) 의 자극하에서 세포 형태의 변화 및 세포 손상의 정도를 정성적 및 정량적으로 측정하여, 세포의 보호를 어느 정도 실시할 수 있는지를 검증하였다. 검증은, 이하의 방법으로 실시하였다.

실시예 1 및 비교예 1 의 생리 식염수를 사용하여 세포 배양액을 제조하고, 12 시간 혐기성 환경하에서 혈관 평활근 세포의 배양을 실시하고, 혐기성 환경하에 두기 전과 방치 후에서의 세포의 형태 변화를 사진 촬영하여 비교하였다. 또, 세포가 장애를 받는 경우에는 세포 장애 시에 누출되는 효소 (LDH) 의 양이 많아지기 때문에, 혐기성 환경하에 두기 전과 방치 후에서의 LDH 의 양을 측정하였다. LDH 는, 이 양이 많을수록 세포 장애가 높은 것을 의미한다. 또한, 미토콘드리아의 기능 (MTT Assay) 의 비교를 실시하기 위해, 혐기성 환경하에 두기 전과 방치 후에서의 세포 발육력 (cell viability) 을 측정하였다. cell viability 는, 이 값이 낮을수록 세포 장애가 높은 것을 의미한다.

실시예 1 및 비교예 1 의 각 생리 식염수에 대해 세포의 형태 변화를 사진 촬영한 결과, LDH 의 양의 측정 결과, 및 cell viability 의 측정 결과를, 각각 도 7, 도 8 및 도 9 에 나타낸다. 도 7 에 있어서, 「검증 전」은 통상적인 세포 배양액 중에 보이는 혈관 평활근 세포의 형태를 나타내고, 「비교예 1 (전)」 및 「실시예 1 (전)」은 혐기성 환경하에 두기 전을, 「비교예 1 (후)」 및 「실시예 1 (후)」은 12 시간 혐기성 환경하에 방치 후를, 각각 의미한다.

도 7 에 나타내는 바와 같이, 실시예 1 은 혐기성 환경하 12 시간 방치 후에도 세포 형태가 유지되는 데에 대해, 비교예 1 에서는 세포가 작아지고 죽어가고 있는 것을 알 수 있다. 또, 도 8 에 나타내는 LDH 량의 측정 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1 은 비교예 1 과 비교해, 혐기성 환경하 12 시간 방치 후에 있어서 LDH 의 유출이 우위로 적어져 있다. 도 9 에 나타내는 cell viability 의 값에 대해서도, 실시예 1 은 비교예 1 과 비교해, 혐기성 환경하에 두기 전과 12 시간 방치 후의 차가 작아, 미토콘드리아의 기능이 유지되고 있는 것을 나타내고 있다.

이상의 결과로부터, 혈관 평활근 세포에 있어서는 실시예 1 (산소 나노 버블을 포함하는 세포 배양액) 이 혐기성 (저산소성) 의 자극으로부터 세포 및 미토콘드리아를 보호하는 기능이 매우 높은 것이 확인되었다. 본 검증에서는 예로서 혈관 평활근 세포를 사용했지만, 혈관 평활근 세포로 한정하지 않고, 모든 세포에 대해 동일한 결과가 얻어질 것이라 추찰할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수는 저혈당 상태에 있어서의 세포 장애를 저감할 수 있기 때문에, 운동 중 또는 운동 후에 있어서의 저혈당 상태에서의 세포 장애 저감 효과를 기대할 수 있다. 또, 본 발명의 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수는 저산소 상태에 있어서의 세포 장애를 저감할 수 있기 때문에, 심근경색, 뇌경색 및 그 밖의 순환 혈류 장애에 의한 세포 장애에 대한 보호 효과도 기대된다.

＜비교예 2＞

상기 특허문헌 2 에 개시된 방법에 따라, 기포 직경 50 ∼ 500 nm 를 갖는 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 제조하고, 이 수용액을 사용하여 세포 배양액을 제조하였다. 이 세포 배양액을 비교예 2 로 한다. 비교예 2 의 세포 배양액에 대해 세포 독성을 확인하기 위해, 먼저 통상 환경하에서 하룻밤 혈관 평활근을 배양하였다. 비교로서 통상적인 세포 배양액, 및 상기 실시예 1 에서 제조한 산소 나노 버블을 함유하는 세포 배양액을 사용하였다. 세포 상해의 지표로서, 세포 형태의 변화 및 세포 손상의 정도를 정성적 및 정량적으로 측정하고, 세포의 보호를 어느 정도 실시할 수 있는지를 검증하고, 세포의 보호 정도를 상기 실시예 1 의 생리 식염수와 비교하였다. 검증은, 실시예 1 과 동일한 방법으로 실시하고, 혐기성 환경하에 방치 후에서의 세포의 형태 변화의 관찰과 함께, 미토콘드리아의 기능을 측정하는 시험 (MTT assay) 으로서, 혐기성 환경하에 방치 후의 세포 생존율을 측정하였다.

실시예 1 및 비교예 2 의 각 세포 배양액에 대해 세포의 형태 변화를 사진 촬영한 결과 및 MTT assay 에 의한 세포 생존율의 측정 결과를, 각각 도 10 및 도 11 에 나타낸다. 도 10 에 있어서, 상단의 좌측에 나타내는 「통상적인 세포 배양액」의 사진도는, 산소 나노 버블을 포함하지 않는 세포 배양액이고, 혐기성 환경하에 두기 전의 상태의 것이다. 또, 도 10 에 있어서 상단 중앙 및 상단 우측은, 혐기성 환경하에서 하룻밤 방치 후의 세포의 형태 변화를 나타내는 사진도이다. 한편, 도 10 에 있어서 하단 중앙 및 하단 우측은, 세포를 포함하지 않는 배양액만을 사용하고, 혐기성 환경하에서 하룻밤 방치 후의 배양액의 변화를 촬영했을 때의 사진도이다.

도 10 의 상단에 나타내는 사진으로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1 은 혐기성 환경하에서 하룻밤 방치 후여도 세포 형태가 유지되고 있고, 배양액 세포 독성이 보이지 않았다. 그에 대해, 비교예 2 (기포 직경 50 ∼ 500 nm 를 갖는 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 함유하는 세포 배양액) 는 매우 강한 세포 독성을 나타내고, 하룻밤 방치 후에는 거의 모든 세포가 사멸하였다. 또, 도 10 의 하단에 나타내는 배양액만의 사진에 있어서, 실시예 1 은 침전물이 없는 데에 대해, 비교예 2 에서는 배양액 중에 침전물이 많이 존재하고 있는 것이 관측되었다. 이와 같이, 비교예 2 에서는 배양액 중의 단백 등이 응집하는 작용이 일어나, 세포 독성이 인정되는 결과가 된 것이라고 생각하고 있다. 이 결과는, 도 11 에 나타내는 세포 생존율의 측정 결과로부터도 용이하게 판독할 수 있다. 즉, 실시예 1 은, 혐기성 환경하에서 하룻밤 방치 후에 있어서 세포 생존율이 방치 전과 비교해 변화가 없는 데에 대해, 비교예 2 는, 세포 생존율의 큰 저하가 보였다. 이상의 결과로부터, 평균 입경이 30 nm 이하, 바람직하게는 1 ∼ 10 nm 인 산소 나노 버블을, 1 × 10¹⁶이상, 바람직하게는 1 × 10¹⁷ 이상의 밀도로 대량으로 포함하는 본 발명의 생리 식염수를 사용함으로써, 세포 독성이 억제되어, 비로소 생체에 안전하게 투여할 수 있는 것이 확인되었다.

＜실시예 2＞

수용액으로서, 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 함유하는 수용액을 사용하는 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 장치를 사용하여 동일한 방법 및 조건에서 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수를 제조하였다. 이 생리 식염수는, 산소 나노 버블을 발생시킨 후에 염화나트륨을 첨가하지 않고, 그대로 생리 식염수로서 사용하였다. 본 실시예에 의한 산소 나노 버블을 포함하는 생리 식염수는, 크라이오 투과형 전자현미경 Titan Krios (FEI 사 제조) 를 사용하고, 상기와 동일한 조건과 방법에 의해 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도를 측정한 결과, 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도는, 각각 3 nm 및 2 × 10¹⁸ 개/cc(㎖) 인 것이 확인되었다. 본 실시예의 생리 식염수를 실시예 2 로 한다.

이와 같이 하여 얻어진 실시예 2 의 생리 식염수를 사용하여 제조한 세포 배양액으로, 혐기성 (저산소) 의 자극하에서 세포 형태의 변화 및 세포 손상의 정도를 정성적 및 정량적으로 측정하고, 세포의 보호를 어느 정도 실시할 수 있는지를 검증하고, 세포의 보호 정도를 상기 실시예 1 의 생리 식염수와 비교하였다. 검증은, 실시예 1 과 동일한 방법으로 실시하고, 혐기성 환경하에 두기 전과 방치 후에서의 세포의 형태 변화의 관찰과 함께, 세포 장애 시에 누출되는 효소 (LDH) 의 양 및 세포 발육력 (cell viability) 의 값을 각각 측정하였다.

검증의 결과, 실시예 2 의 세포 배양액은, 실시예 1 과 동일한 데이터가 얻어지고, 세포 독성이 인정되지 않았다. 이와 같이, 본 발명의 생리 식염수를 사용하여 제조한 세포 배양액은, 염화나트륨의 첨가가 산소 나노 버블을 발생시키는 공정의 전후에 의해 영향을 받지 않는 것이 밝혀지고, 혐기성 (저산소성) 의 자극하에 있어서 세포를 보호한다는 효과는 양자 모두 동일하게 얻어지는 것을 확인하였다.

＜실시예 3＞

본 실시예에 있어서, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액을 사용하여 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하는 효과에 대해 검증을 실시하였다. 구체적으로는, 실시예 1 과 동일한 방법으로 제조된 평균 입경이 3 nm 인 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 사용하여 혈청과 배지를 갖는 세포 배양액을 제조하고, 이 세포 배양액을 주입한 유리제의 세포 배양용 웰 플레이트 중에, 암 세포로서 폐 편평상피판 세포주 EBC-1 의 폐암 세포를 넣은 후, 저산소 상태에서 소정 시간 유치할 때에 상기 폐암 세포에 의해 유도되는 단백 (HIF-1a) 의 발현 정도를 조사하였다.

도 12 에, 암 세포의 배양을 실시했을 때에 사용한 시판되는 저산소 배양 키트를 나타낸다. 도 12 에 나타내는 바와 같이, 이 저산소 배양 키트는 라인 A 및 라인 B 의 각 선을 따라 클립 (14, 15) 이 설치되어 있고, 가스 배리어성 파우치 봉투 (16) 의 내부를 2 개의 공간으로 구분함으로써, 각각의 공간을 클립 (14, 15) 에 의해 밀폐 상태로 유지할 수 있다. 라인 A 의 안쪽에는 O₂ 센서 (17) 가 배치되고, 그 O₂ 센서 (17) 의 바로 옆에는 배양액을 채운 세포 배양용 웰 플레이트 (18) 를 재치 (載置) 하고, 라인 A 와 라인 B 사이에는, 가스 농도 조정제 (19) 를 넣는다. 가스 농도 조정제 (19) 는 사용 시에 알루미늄 봉투로부터 개봉하여 꺼내고, 라인 A 보다 입구 근처에 두고, 라인 B 에 설치한 클립 (14) 을 사용하여 밀봉한다. 그것에 의해, 가스 배리어성 파우치 봉투 (16) 내부의 O₂ 가 단시간에 흡수되어, 저산소 환경이 창출된다. 가스 배리어성 파우치 봉투 (16) 의 내부의 O₂ 농도는, O₂ 센서 (17) 의 눈금을 감시하여, 희망하는 O₂ 농도에 접근한 시점에서 세포 배양용 웰 플레이트 (18) 내부의 공기를 가스 배리어성 파우치 봉투 (16) 의 내부의 공기와 교체한다. 그리고, O₂ 농도가 희망하는 값보다 약간 낮아진 시점에서, 라인 A 에 설치하는 클립 (15) 에 의해 봉쇄하여 O₂ 의 흡수를 정지시킨다. 라인 A 와 라인 B 사이의 공간 내의 O₂ 농도는, 라인 A 에 설치하는 클립 (15) 을 사용하여 조정할 수 있다. 본 실시예에 있어서는, 라인 A 와 라인 B 사이의 공간 내의 O₂ 농도가 약 1 ％ 가 되도록 조정하였다.

저산소 분위기에서 유치할 때에 상기 폐암 세포에 의해 유도되는 단백 (HIF-1a) 의 발현 정도는 웨스턴 블로팅 (Western Blotting) 법에 의해 측정하였다. 웨스턴 블로팅법이란, 전기 영동의 우수한 분리능과 항원 항체 반응의 높은 특이성을 조합하여, 단백질 혼합물로부터 특정 단백질을 검출하는 수법이고, 단백질의 검출이나 해석에 이용되는 공지된 측정 방법이다. 본 실시예에서는, 상기 폐암 세포에 의해 유도되는 단백 (HIF-1a) 에 추가하여, 세포 배양용 웰 플레이트 중의 시료에 확실하게 단백질이 포함되어 있는 것, 및 웨스턴 블로팅법에서 사용되는 총단백량이 일정한 것을 확인할 목적으로, 단백 발현의 컨트롤 (기준) 로서 상기 폐 편평상피판 세포주 EBC-1 에 포함되는 HSC70 의 단백질에 대해서도 측정을 실시하였다.

＜비교예 3＞

실시예 3 에 있어서, 산소 나노 버블을 포함하는 수용액 대신에, 산소 나노 버블을 전혀 포함하지 않는 수용액을 사용한 것 이외에는, 실시예 3 과 동일한 방법으로, 상기 폐암 세포에 의해 유도되는 단백 (HIF-1a) 의 발현을 검증하였다. 상기 폐암 세포에 의해 유도되는 단백 (HIF-1a) 의 발현 측정 방법은, 실시예 3 과 동일한 웨스턴 블로팅법으로 실시하였다. 이 검증예를 비교예 3 으로 한다.

도 13 에, O₂ 농도가 약 1 ％ 인 저산소 분위기에서 6 시간 및 24 시간 유치한 후의 실시예 3 및 비교예 3 에 대해, HIF-1a 및 HSC70 의 각 단백질의 유도 결과를 나타낸다. 도 13 에 나타내는［Normoxia］,［Hypoxia 6h］및［Hypoxia 24h］ 는, 각각 저산소 분위기에 유치하기 전 상태, 저산소 분위기에서 6 시간 및 24 시간 유치한 상태를 의미한다. 또, 도면 중에 있어서［Medium］으로 표시한 「O₂」 및 「DW」는 각각 실시예 3 및 비교예 3 을 의미하고, 「O₂」및 「DW」로 표시한 세로의 각 난에, 각각의 검증예에서 측정한 단백질의 발현 결과를 나타내고 있다.

도 13 의 (a) 는 웨스턴 블로팅법에 의한 측정 결과이고, 검게 나타나고 있는 부분이 HIF-1a 및 HSC70 의 각 단백질의 발현을 나타내는 부분이다. 도면 중의 검은 부분이 진할수록 단백질의 발현이 강한 것을 나타내고 있다. 또, 도 13 의 (b) 는, (a) 에 나타내는 도면에 있어서 검게 나타나고 있는 부분의 면적을 산출하고, 콘톨인 HSC70 에 대한 HIF-1a 의 면적비를 구한 데이터이다. 도 13 의 (a) 에 있어서 검게 나타나고 있는 부분의 면적은, 도 14 에 나타내는 바와 같이 화상 처리에 의해 수치화할 수 있다. 도 14 에 있어서, 예를 들어 저산소 분위기에서 재치하기 전의 상태 (Normoxia) 에 주목하면, HIF-1a 의 발현은 거의 관측되지 않고, 면적이 평균 (Mean) 으로서 32.21 로 카운트되고 있는 데에 대해, HSC70 의 발현은 면적 (Mean) 이 226.902 로 카운트되고 있고, HSC70 에 대한 HIF-1a 의 면적비 (Ratio) 는 0.14 인 것은 알 수 있다. 여기서, HSC70 의 발현은 저산소 분위기의 재치 전후에서 큰 변화가 없고, 거의 일정한 것을 알 수 있다. 또한, 저산소 분위기에서 6 시간 및 24 시간 유치한 후의 실시예 3 (O₂) 및 비교예 3 (DW) 에 대해서도 동일한 처리를 실시하고, HSC70 에 대한 HIF-1a 의 면적비 (Ratio) 를 산출하고, Normoxia 의 경우를 1 로 하여 규격화 (Normalize) 함으로써 HSC70 에 대한 HIF-1a 의 면적비를 구한 것이 도 13 의 (b) 에 나타내는 결과이다.

도 13 의 (b) 에 나타내는 바와 같이, Normoxia 의 경우를 1 로 하여 규격화한 경우, 저산소 분위기에서 6 시간 (Hypoxia 6h) 에 있어서는 실시예 3 (O₂) 과 비교예 3 (DW) 간에 HIF-1a 의 발현에 큰 차가 보이지 않았다. 그에 대해, 24 시간 (Hypoxia 24h) 으로 저산소 분위기에서 장시간 유치함으로써 HIF-1a 의 발현에 대한 억제 효과에는 큰 차이가 보이고, 실시예 3 은 비교예 3 에 비해 HIF-1a 의 발현이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있다. 이것은, 저산소 분위기의 6 시간 유치는 유치 시간이 짧기 때문에 산소 나노 버블의 효과가 실질적으로 관측되지 않는 과도기적인 현상을 나타내고 있는 것에 불과하다고 생각되지만, Hypoxia 24h 의 결과로부터 유치 시간의 경과와 함께 산소 나노 버블의 효과가 강해져 오는 것을 나타내고 있다. 도 13 에는 나타내고 있지 않지만, 저산소 분위기에서 48 시간 유치했을 때에도 동일한 방법으로 검증을 실시하였다. 그 결과, 24 시간 유치한 경우와 동등하거나, 그 이상의 억제 효과가 얻어지는 것을 확인하였다. 따라서, 산소 나노 버블을 포함하는 수용액은, 암 세포의 증식을 억제하는 효과를 충분히 갖는 것이라고 추찰할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 말초 세포에 산소를 충분히 공급하는 기능을 갖고, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포의 손상 또는 장애가 적고, 세포를 보호하는 효과, 및 혐기성 환경하에서 일어나기 쉬운 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하는 효과를 높일 수 있다. 또한, 세포를 보호하는 효과가 장기간에 걸쳐 안정적으로 얻어질 뿐만 아니라, 그 효과의 편차를 대폭 저감할 수 있다. 따라서, 생체에의 투여 또는 경구 섭취를 안전하게 실시할 수 있다.

또, 본 발명에 의한 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법은, 종래의 나노 버블 발생 장치와 비교해, 보다 작은 입경을 갖는 산소 나노 버블을 대량으로, 또한 안정적으로 발생시킬 수 있고, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서 세포를 보호한다는 효과, 및 혐기성 환경하에서 일어나기 쉬운 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하는 효과를 장기에 걸쳐 안정적으로 얻을 수 있는 생체 투여 가능한 수용액을 용이하게 제조할 수 있다. 그러한 효과를 갖는 생체 투여 가능한 수용액은, 종래 기술로는 제조하는 것이 곤란하고, 본 발명의 제조 방법에 의해 처음으로 얻어진 것이다.

산업상 이용가능성

따라서, 본 발명의 생체 투여 가능한 수용액은, 생리 식염수 또는 수액으로서 생체에 대한 투여 또는 경구 섭취를 실시하거나, 세포 배양액으로서 사용함으로써, 저산소성 또는 혐기성의 자극하에 있어서의 세포의 보호 그리고 그들의 분위기하에서 일어나기 쉬운 암의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지할 수 있으므로, 다양한 의료 분야에 있어서 그 유용성은 매우 높다.

1 : 산소 나노 버블 발생 장치
2 : 벨로우즈 실린더 펌프
3 : 기액 혼합조
4 : 펌프 컨트롤러
5 : 압력 센서
6 : 마이크로·나노 버블 발생용 노즐 장착부
7 : 액 흡인관
8 : 기체 흡인구
9 : 기체 흡인 조정 밸브
10 : 노즐 헤더
11 : 분사 노즐
12 : 액 충돌 노즐
13 : 대
14 : 클립
15 : 클립
16 : 가스 배리어성 파우치 봉투
17 : O2 센서
18 : 세포 배양용 웰 플레이트
19 : 가스 농도 조정제

Claims

산소 나노 버블을 포함하는 생체 투여 가능한 수용액으로서, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 상기 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도가 각각 1 ~ 30 nm 및 1 ㎖ 당 10¹⁶ 개 이상인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액.
제 1 항에 있어서,
빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 상기 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도가 각각 1 ∼ 10 nm 및 1 ㎖ 당 10¹⁷ 개 이상인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 상기 생체 투여 가능한 수용액의 100 질량부에 대해 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 포함하는 생리 식염수인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 5 ％ 포도당액을 첨가한 저장 복합 전해질액, 링거액, 고칼로리액 및 헤파린을 포함하는 생식액의 군에서 선택되는 어느 수액인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 세포 배양액인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하기 위해서 생체 내에의 투여 또는 경구 섭취에 의해 사용하는 수용액인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액.
산소 나노 버블을 함유하고, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 산소 나노 버블의 평균 입경 및 밀도가 각각 1 ~ 30 nm 및 1 ml 당 10¹⁶ 개 이상인 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법으로서,
미리 탈기 처리된 액체에 산소를 혼합하고, 용존시켜 얻어지는 용존 산소를 포함하는 수용액을, 2 이상의 관통 소공을 둘레 방향으로 갖는 통의 외부로부터 그 관통 소공을 통해 대기압 이상의 압력으로 분사시킬 때에, 상기 통의 직경 방향 단면과 평행한 동일 평면상에서 대향하도록 배치된 상기 2 이상의 관통 소공의 각각의 개구부로부터 분사한 용존액을 상기 통의 중심에 수격이 집중하도록 충돌시킴으로써 상기 산소 나노 버블을 발생시키는 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 산소 나노 버블에 있어서, 빙포매법에 의해 크라이오 투과형 전자현미경으로 측정했을 때의 평균 입경 및 밀도가 각각 1 ∼ 10 nm 및 1 ㎖ 당 10¹⁷ 개 이상인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
산소 및 미리 탈기 처리된 액체를 각각 흡인하는 수단과, 상기 산소 및 상기 액체를 동시에 가압하여 반송하는 수단과, 그 반송된 상기 산소를 포함하는 상기 액체를 새로운 산소와 혼합시킴으로써 용존 산소를 부화시키기 위한 기액 혼합조와, 그 기액 혼합조에 있어서 기액 혼합 상태에 있는 용존액을 사용하여 나노 버블을 발생시키기 위해서, 공동의 통, 그 통의 둘레 방향으로 2 이상의 관통 소공의 각각의 개구부가 상기 통의 직경 방향 단면과 평행한 동일 평면상에서 대향하도록 배치된 상기 2 이상의 관통 소공, 및 상기 통의 적어도 편단부에 나노 버블 토출구를 갖고, 상기 관통 소공은 그 관통 소공의 단면 중심부를 지나는 연장선 모두가 상기 통의 중심에서 교차하도록 배치되는 분사 노즐을 구비하는 나노 버블 발생 수단에 의해 상기 산소 나노 버블을 발생시키는 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
상기 관통 소공은, 상기 통의 직경 방향 단면과 평행한 동일 평면상에서 대향하도록, 상기 통의 둘레 방향 등간격으로 4 개 이상 8 개 이내로 형성되고, 상기 통의 공동에 통하는 부분의 구멍 직경이 0.1 ∼ 0.5 mm 인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 상기 생체 투여 가능한 수용액의 100 질량부에 대해 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 포함하는 생리 식염수인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 상기 생체 투여 가능한 수용액의 100 질량부에 대해 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 포함하는 생리 식염수인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 용존 산소를 포함하는 수용액으로서 염화나트륨을 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 함유하는 수용액을 사용함으로써 생리 식염수를 제조하는 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 용존 산소를 포함하는 수용액으로서 염화나트륨을 포함하지 않는 수용액을 사용하고, 상기 산소 나노 버블을 포함하는 수용액을 제조한 후, 상기 산소 나노 버블을 포함하는 수용액에 염화나트륨을 상기 생리 식염수의 100 질량부에 대해 0.85 ∼ 0.95 질량％ 로 배합함으로써 생리 식염수를 제조하는 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 칼륨 및 칼슘 중 적어도 1 종의 원소, 5 ％ 포도당액, 아미노산 그리고 헤파린의 군에서 선택되는 적어도 어느 첨가제를 함유하여 제조되는 수액인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 세포를 배양하기 위해서 사용하는 세포 배양액으로서 제조되는 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
상기 생체 투여 가능한 수용액이, 암 세포의 증식 및 비대화를 억제 또는 방지하기 위해서 생체 내에의 투여 또는 경구 섭취에 의해 사용하는 수용액인 것을 특징으로 하는 생체 투여 가능한 수용액의 제조 방법.