KR102164196B1

KR102164196B1 - 새로운 스테로이드 기반 양친매성 화합물 및 이의 활용

Info

Publication number: KR102164196B1
Application number: KR1020190043046A
Authority: KR
Inventors: 채필석; 무하매드에산; 다스 마나벤드라
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2020-10-12
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: KR20190119543A

Abstract

본 발명은 새롭게 개발한 스테로이드 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이 화합물은 기존의 화합물보다 다양한 구조와 특성을 지닌 막단백질들을 세포막에서 효율적으로 추출하고 이를 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 신약 개발에 밀접한 관계가 있는 만큼 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이다.

Description

새로운 스테로이드 기반 양친매성 화합물 및 이의 활용 {Novel steroid -based amphiphiles and uses thereof}

본 발명은 새롭게 개발한 스테로이드 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다.

막단백질(membrain proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자(bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 세포막으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.

막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 많은 막단백질들은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하는 경향이 있기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다. 따라서 새로운 구조를 통한 새롭고 우수한 특성을 지니는 새로운 양쪽성 물질 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 스테로이드를 소수성기로 갖는 양친매성 화합물을 개발하였고, 이 화합물의 막단백질 안정화 특성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

S. Newstead et al., Protein Sci. 17 (2008) 466-472. S. Newstead et al., Mol. Membr. Biol. 25 (2008) 631-638.

본 발명의 목적은 화학식 1 내지 화학식 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1 내지 화학식 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1 내지 3에서,

상기 화학식 내의 점선은 단일결합 또는 이중결합을 표시할 수 있고;

상기 L¹ 은 직접결합,

또는

로, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수일 수 있고, 상기 X⁴는 산소와 연결된 당류(saccharide)일 수 있으며;

상기 X²및 X³은 각각 독립적으로 수소 또는 산소와 연결된 당류일 수 있고, 그리고

상기 X¹은 산소와 연결된 당류일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "당류(saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분된다.

상기 구체예에서 사용된 당류는 단당류(monosaccharide), 이당류(disaccharide)일 또는 오당류일 수 있으며, 구체적으로 글루코스(glucose), 말토오스(maltose) 또는 글루코스 중심의 가지친 오당류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 스테로이드 계열 소수성기는 우선 다수의 고리가 판상으로 연결되어 표면적이 넓고 소수성 밀도가 높은 것이 특징이며 이는 소수성 효과에 기여함으로써 막단백질 안정화에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 소수성이 높은 소수성기에 맞는 친수성기로 친수성 밀도가 높은 두 개의 말토오즈를 붙이거나 고밀도의 오당류를 사용하여 소수성-친수성 밸런스가 잘 맞는 양친매성 분자를 설계하였다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 소수성기인 스테로이드계 화합물 및 친수성기인 당류를 연결하는 링커를 가질 수 있다. 본 발명자들은 상기 링커의 길이를 조절하여 양친매성 분자의 전체의 유연성(flexibility)을 조절함으로써 막 단백질과 유연하게 상호작용하도록 설계하였다. 상기 링커는 치환 또는 비치환된 알킬렌기일 수 있으며, 치환된 알킬렌기는 당류가 결합된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 화합물은 상기 L¹ 은 직접결합이며; 상기 X²및 X³중 하나는 수소이고, 다른 하나는 산소와 연결된 당류이며; 그리고 상기 X¹은 산소와 연결된 당류일 수 있다.

구체적으로, 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 화합물은 상기 L¹ 은

이고, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며; 상기 X²및 X³은 수소이며; 그리고 상기 X¹은 산소와 연결된 당류일 수 있다.

이고, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이고, 상기 X⁴는 산소와 연결된 당류(saccharide)이며; 상기 X²및 X³은 수소이고; 그리고 상기 X¹은 산소와 연결된 당류일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1 내지 3에서 상기 L¹ 은 직접결합이며; 상기 X²및 X³중 하나는 수소이고, 다른 하나는 산소와 연결된 당류이며; 그리고 상기 X¹은 산소와 연결된 글루코스일 수 있는 화합물을 "GDNs (glyco-diosgenin analogs) "로 명명하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 화학식 1 내지 3에서, 상기 L¹ 은 직접결합 또는

이고, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며; 상기 X²및 X³은 수소이며; 그리고 상기 X¹은 산소와 연결된 글루코스 중심의 가지친 오당류인 화합물을 각각 "SPSs (steroid-based penta-saccharides)" 또는 "SPS-Ls (steroid-based penta-saccharides with linker)"로 명명하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 화학식 1 내지 3에서, 상기 L¹ 은 상기 L¹ 은

이고, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이고, 상기 X⁴는 산소와 연결된 말토오스이며; 상기 X²및 X³은 수소이고; 그리고 상기 X¹은 산소와 연결된 말토오스인 화합물을 "SMAs (Steroids-based maltosides amphiphiles)"로 명명하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 하기 화학식 4 내지 화학식 22 중에서 선택되는 하나일 수 있다:

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

[화학식 18]

[화학식 19]

[화학식 20]

[화학식 21]

[화학식 22]

본 발명의 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

구체적으로, 상기 추출은 막단백질을 세포막으로부터 추출하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 공존하여 극성, 비극성 용매 모두에 친화성을 가질 수 있는 분자를 의미한다. 계면활성제나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 수용액에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수성기가 내부로 집합하고 친수성기가 표면에 노출된 둥글거나 타원 형태의 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 크게 증가한다.

CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001 내지 1 mM일 수 있으며, 구체적으로 구체적으로 0.0001 내지 0.5 mM, 보다 더 구체적으로 0.0005 내지 0.4 mM 일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

기존에 막단백질 연구에 주로 사용되고 있는 DDM의 경우 임계 미셀 농도가 0.17 mM인 것과 비교하여 본 구체예의 대부분의 SPSs 및 SPS-Ls는 작은 CMC 값을 가지고 있다. 따라서, SPSs 또는 SPS-Ls는 낮은 농도에서도 미셀이 용이하게 형성되므로, 적은 양을 사용하여 막단백질을 효과적으로 연구 분석할 수 있어 DDM 보다 활용측면에서 유리하다 할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출(extraction)"이란 막단백질을 세포막(membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화(solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화(stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화(crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 분석(analysis)"이란 막단백질의 구조 또는 기능을 분석하는 것을 의미한다. 상기 구체예에서, 막단백질의 분석은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 전자현미경(electron microscopy) 또는 핵자기공명 (nuclear magnetic resonance)을 이용하여 막단백질의 구조를 분석할 수 있다.

상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

상기 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 10 nm일 수 있고, 구체적으로 2.0 nm 내지 6.0 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란 (dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.

상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부의 소수성으로 막단백질과 결합할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 세포막으로부터 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 것이 가능하다.

상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 3)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1 내지 화학식 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:

1) 티코제닌(ticogenin), 디오스제닌(diosgenin), 콜레스테롤(Cholesterol), 콜레스탄올(Cholestanol) 또는 시토스테롤(Sitosterol)의 스테로이드의 2번 및 3번 탄소에 시스(cis) 또는 트랜스(tans) 하이드록시를 도입하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1 내지 3에서,

상기 화학식 내의 점선은 단일결합 또는 이중결합을 표시하고,

상기 L¹ 은 직접결합이며;

상기 X¹및 X²은 산소와 연결된 당류이고, X³은 수소이다.

상기 방법에 의해 합성된 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 4 내지 5 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 구체예에서, 3단계의 합성 단계를 거쳐 간단한 방법으로 화합물을 합성할 수 있으므로, 막단백질 연구를 위한 화합물을 용이하게 경제적으로 생산이 가능하다.

1) 티코제닌(ticogenin), 디오스제닌(diosgenin), 콜레스테롤(Cholesterol), 콜레스탄올(Cholestanol) 또는 시토스테롤(Sitosterol)의 스테로이드의 3번 및 6번 탄소에 하이드록시를 도입하는 단계;

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1 내지 3에서,

상기 L¹ 은 직접결합이며;

상기 X¹및 X³은 산소와 연결된 당류이고, X²는 수소이다.

상기 방법에 의해 합성된 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 6의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 3)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:

1) 티코제닌(ticogenin), 디오스제닌(diosgenin), 콜레스테롤(Cholesterol), 콜레스탄올(Cholestanol) 또는 시토스테롤(Sitosterol)의 스테로이드의 3번 탄소의 하이드록시에 치환 또는 비치환된 알킬렌기 링커를 도입하거나 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 알킬렌기 링커가 도입된 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및

3) 상기 단계 1)의 글리코실레이션 생성물 또는 단계 2)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1 내지 3에서,

상기 L¹ 은 직접결합,

또는

로, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이고, 상기 X⁴는 산소와 연결된 당류(saccharide)이며;

상기 X²및 X³은 수소이고; 그리고

상기 X¹은 산소와 연결된 당류이다.

상기 방법에 의해 합성된 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 7 내지 22 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1 내지 화학식 3 중 하나로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1 내지 3에서,

상기 L¹ 은 직접결합,

또는

상기 X¹은 산소와 연결된 당류일 수 있다.

상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 4 내지 22 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬과 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 LHI-RC, LeuT (Leucine transporter), β₂AR (human β₂ adrenergic receptor), MelB_st (melibiose permease) 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예들에 따른 스테로이드 기반의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.

막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

또한, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 쉽게 구할 수 있는 출발물질로부터 간단한 방법으로 합성이 가능하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.

도 1는 본 발명의 실시예 1에 따른 GDNs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 SPSs 및 SPS-Ls의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에 따른 SMAs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 4는 GDNs, SPSs 또는 SPS-Ls의 DLS 프로파일을 도시한 것이다.
도 5는 GDNs, SPSs 또는 SPS-Ls의 DLS 프로파일을 도시한 것이다.
도 6은 GDNs, SPSs 또는 SPS-Ls의 DLS 프로파일을 도시한 것이다.
도 7은 SMAs의 DLS 프로파일을 도시한 것이다.
도 8은 CMC + 0.04 wt%의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA (scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 13일 동안 상온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다:
도 9는 CMC + 0.04 wt%의 SMAs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA (scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 14일 동안 상온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다:
도 10은 GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 DDM에 의한 β₂AR의 안정성에 대한 효과를 5일간 일정 간격으로 측정한 결과이다. 단백질 리간드 결합 특성은 [³H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.
도 11은 CMC + 0.2 wt%의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 DDM에 의한 β₂AR의 안정성에 대한 효과를 초기 30분에 측정한 결과이다. 단백질 리간드 결합 특성은 [³H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.
도 12은 GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 DDM을 1.5 wt% 농도로 사용하여 MelB_St 단백질을 3개의 온도(65, 70, 75 ℃)에서 추출 후, 90분 동안 같은 온도에서 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelB_St 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB_St 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과 및 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB_St 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플(Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram); 및
(b) DDM, SPS-3 또는 SPS-3L 에 의해 용해된 MelB_St의 기능이 유지되는지 여부를 확인한 결과
도 13은 SMAs 또는 DDM을 1.5 wt% 농도로 사용하여 MelB_St 단백질을 4개의 온도(0, 45, 55 또는 65℃)에서 추출 후, 90분 동안 같은 온도에서 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelBSt 단백질의 양을 측정한 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과이다:
도 14는 GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 DDM을 1.5 wt% 농도로 사용하여 MelB_St 단백질을 23 ℃에서 추출 후, 90분 동안 같은 온도에서 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelB_St 단백질의 양을 측정한 결과이다

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> GDNs 의 합성 방법

<1- 1>디오스제닌의 하이드로제네이션

디오스제닌의 2번, 3번 또는 6번 탄소에 하이드록시기를 도입하였다.

<1-2> 말토실레이션(maltosylation)반응의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 d)

실시예 1-1에서 생성된 화합물, 2,4,5-콜리딘(collidine) (1.0 당량) 및 AgOTf (2.4 당량)의 혼합물을 무수 CH₂Cl₂ 에서 -45 ℃에서 교반하였다. 무수 CH₂Cl₂에서 페르벤조일레이티드 말토실브로마이드/ 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드 (perbenzoylated maltosylbromide/ perbenzoylated glucosylbromide) 용액을 이 현탁액에 30분간 적가하였다. -45 ℃에서 30분 동안 교반을 계속한 후, 반응 혼합물의 온도를 0 ℃로 증가시키고 1시간 동안 계속 교반하였다. 반응 완결 후 (TLC로 나타냄), 피리딘을 첨가하여 반응을 켄칭시킨 후, CH₂Cl₂로 희석하여 셀라이트상에서 여과하였다. 여과액을 1 M 수용성 Na₂S₂O₃ 용액(40mL), 0.1 M HCl 수용액(40mL) 및 염수(2 x 40mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 회전 증발기로 용매를 제거하였다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 흰 고체인 목적하는 화합물을 수득하였다.

<1-3> 탈보호기화 반응 ( deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 1의 단계 e)

이는 Chae, P. S. 등의 합성 방법 (Nat Meth 2010, 7, 1003.)에 따랐다. Zemplen's 조건하에 데-O-벤조일화(de-O-benzoylation)를 수행하였다. O-protected 화합물을 무수 CH₂Cl₂로 용해시킨 다음 MeOH를 지속적인 침전이 나타날때까지 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 0.5M의 메탄올성 용액(methanolic solution)인 NaOMe를 최종 농도가 0.05 M이 되도록 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 Amberlite IR-120 (H+ form) resin을 이용하여 중화시켰다. 여과하여 resin을 제거하고, MeOH로 세척하고, 진공 조건(in vacuo)에서 여과물로부터 용매를 제거하였다. 잔류물은 실리카 겔 크로마토그래피(MeOH:CH₂Cl₂)로 정제하여 백색 고체의 목적 화합물을 수득하였다.

< 제조예 1> GDN - 1 의 합성 방법

GDN-1 의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-5>의 합성 방법에 따라 GDN-1의 화합물을 합성하였다.

<1-1> 티코제닌(화합물 A)의 합성(도 1의 단계 a)

활성 탄소 (500mg)상의 팔라듐 (10 %)을 HOAc (250mL)에 혼합된 디오스제닌 (5.0g) 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 수소 대기 (2bar) 하에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 용매를 회전 증발기로 제거하여 목적하는 티코제닌 (화합물 A)을 98 % 수율로 수득하였다.

<1-2> 화합물 B의 합성(도 1의 단계 b)

화합물 B는 참고문헌(S. K. Upadhyay, C. C. Creech, K. L. Bowdy, E. D. Stevens, B. S. Jursic and D. M. Neumann, Bioorg . Med . Chem . Lett . 2011, 21, 2826-2831)에 따라 동일한 조건으로 제조하였다.

<1-3> 화합물 C의 합성(도 1의 단계 c)

메탄올 (10 mL) 및 화합물 B (0.5 g)의 디클로로메탄 (10 mL) 용액 및 수산화나트륨 (2.4 당량)을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물에 산성 수지-Dowex (~1 g)를 첨가하고, 이 현탁액을 실온에서 15 분 동안 교반하였다. 수지를 여과하여 분리하고, 용매를 회전 증발기로 제거하여 화합물 C를 98 % 수율로 수득하였다.

¹ H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.38 (q, J =8.0 Hz, 1H), 3.79 (br s, 1H), 3.75 (br s, 1H), 3.45-3.42 (m, 1H), 3.31-3.30 (m, 4H), 1.98-1.10 (m, 26H), 1.01 (s, 3H), 0.95 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.79-0.78 (m, 7H); ¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 110.7, 82.4, 72.3, 71.2, 68.0, 64.0, 57.8, 56.8, 43.1, 41.9, 41.4, 41.0, 40.3, 37.1, 36.1, 33.7, 32.8, 32.6, 31.6, 30.0, 29.5, 22.0, 17.7, 17.2, 15.0, 14.8.

<1-4> 말토실레이션(maltosylation)반응의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 d)

실시예 1-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 GDN-1a를 83% 수율로 수득하였다.

¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.12-7.68 (m, 28H), 7.57-7.20 (m, 42H), 6.15 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 5.77-5.63 (m, 6H), 5.28-5.19 (m, 4H), 4.83-4.29 (m, 14H), 3.79-3.34 (m, 6H), 1.91-1.08 (m, 16H), 0.96 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.86-0.83 (m, 6H), 0.77 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 0.66 (s, 3H), 0.59 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 165.9 (2C), 165.8, 165.5, 165.2, 165.1, 165.0 (2C), 133.7, 133.6, 133.5, 133.4, 133.3, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3 (2C), 129.0, 128.8 (2C), 128.7, 128.6, 128.5, 128.3 (2C), 109.3, 100.5, 99.9, 96.4, 96.3, 80.9, 75.9, 74.9, 74.8, 73.1, 72.8, 72.7, 72.6, 71.1, 71.0, 70.0, 69.2 (2C), 63.6, 63.4, 62.6, 62.2, 56.1, 54.7, 41.7, 40.5, 39.9, 38.7, 38.5, 35.2, 34.3, 31.9, 31.7, 31.6, 30.4, 29.7, 28.9, 27.6, 20.4, 17.3, 16.5, 14.6, 13.5.

<1-5> 탈보호기화 반응 ( deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 1의 단계 c)

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 GDN-1을 94% 수율로 수득하였다.

¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.17 (d, J =4.0 Hz, 2H), 4.38-4.34 (m, 2H), 4.30 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.96 (br s, 1H), 3.92-3.71 (m, 7H), 3.67-3.16 (m, 24H), 1.97-1.86 (m, 4H), 1.73-1.10 (m, 20H), 0.98 (s, 3H), 0.95 (d, J =8.0 Hz, 3H), 0.78 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 110.7, 103.8, 103.7, 103.0, 98.3, 82.4, 81.5, 81.4, 78.2, 78.1, 76.8, 76.7, 76.3, 75.2, 74.9 (2C), 74.8, 74.3, 71.6, 68.0, 64.0, 62.9, 62.4, 57.9, 56.4, 55.0, 43.0, 41.9, 41.4, 40.6, 40.3, 36.8, 36.2, 33.6, 32.8, 32.6, 31.7, 31.6, 30.0, 29.4, 21.9, 17.7, 17.2, 15.0, 14.4; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₁H₈₄O₂₄ [M+Na]⁺1081.5431, observed 1081.5428.

< 제조예 2> GDN -2의 합성

GDN-2 의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <2-1> 내지 <2-3>의 합성 방법에 따라 GDN-2의 화합물을 합성하였다.

<2-1> 화합물 E의 합성

티코제닌으로부터 화합물 E를 참고문헌(S. K. Upadhyay, C. C. Creech, K. L. Bowdy, E. D. Stevens, B. S. Jursic and D. M. Neumann, Bioorg . Med . Chem . Lett. 2011, 21, 2826-2831.)에 따라 동일한 조건으로 제조하였다.

¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 4.38 (q, J = 8.2 Hz, 1H), 3.95 (br s, 1H), 3.77 (br s, 1H), 3.49-3.45 (m, 1H), 3.37 (t, J =10.8 Hz, 1H), 2.17 (br s, 1H), 1.98-1.09 (m, 33H), 0.95 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.81 (s, 3H), 0.78 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.76 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 119.5, 81.0, 69.4, 69.3, 67.0, 62.3, 56.4, 54.4, 41.8, 41.1, 40.8, 40.2, 38.3, 37.2, 34.6, 34.5, 32.2, 32.0, 31.6, 30.5, 29.9, 29.0, 27.8, 20.9, 17.4, 16.7, 14.7, 12.7.

<2-2> GDN -2a의 합성

실시예 1-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 GND-2a를 87%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.13-7.68 (m, 27H), 7.57-7.19 (m, 44H), 6.94 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 6.77-6.71 (m, 2H), 6.18-5.66 (m, 8H), 5.40-5.31 (m, 4H), 4.92-3.34 (m, 19H), 1.90-1.08 (m, 34H), 0.87 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.90-0.80 (m, 10H), 0.77 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.61 (s, 3H), 0.53 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.4, 165.9 (2C), 165.8, 165.5, 165.2, 165.1, 164.8, 133.7, 133.5, 133.4, 133.3, 130.1, 130.0, 129.9, 129.7, 129.6, 129.5 (2C), 129.3, 129.0, 128.8 (2C), 128.7, 128.6, 128.2 (2C), 109.3, 98.7, 98.2, 96.6, 95.5, 75.7, 74.8, 74.8, 73.1, 72.8, 72.7, 72.2, 71.1, 71.0, 70.5, 70.0, 69.3, 68.9, 63.8, 62.7, 62.2, 55.4, 53.1, 41.7, 40.4, 39.2, 38.6, 38.5, 34.1, 32.9, 32.1, 31.8, 31.5, 31.6, 30.4, 30.2, 29.8, 28.9, 27.2, 22.8, 21.2, 20.4, 19.9, 17.3, 16.5, 14.6, 14.3, 12.8.

<2-3> GDN -2의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 GDN-2를 95%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 5.54 (d, J = 4.0 Hz, 4H), 4.99-4.97 (m, 7H), 4.57-4.33 (m, 8H), 4.03 (br s, 1H), 3.73-3.04 (m, 31H), 3.02-3.00 (m, 4H), 2.50 (br s, 1H), 1.89-1.11 (m, 24H), 0.75 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.72-0.68 (m, 10H); ¹³ C NMR (100 MHz, DMSO-d₆): δ 118.4, 103.5, 100.9, 80.2, 79.9, 79.7, 76.9, 76.4, 76.2, 76.1, 75.1, 73.7, 73.5, 73.3, 72.5, 69.9, 65.9, 61.9, 60.8, 60.7, 55.6, 53.7, 41.1, 36.3, 34.0, 31.8, 30.9, 29.8, 28.5, 27.1, 17.1, 16.3, 14.7; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₁H₈₄O₂₄ [M+Na]⁺1081.5431, observed 1081.5428.

< 제조예 3> GDN -3의 합성

GDN-3 의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <3-1> 내지 <1-5>의 합성 방법에 따라 GDN-2의 화합물을 합성하였다.

<3-1> 화합물 F의 합성

THF에 혼합된 1M BH₃ (3.6 mL, 3.6 mmol)을 0 ℃, 아르곤 대기하에서 건조 THF (50 mL)에 혼합된 디오스제닌 (500 mg, 1.2 mmol)의 용액에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. NaOH (10 N, 8 mmol)를 0 ℃에서 45 분에 걸쳐 첨가하였다. 이어서, 30 % 과산화수소 (0.75 mL, 6.5 mmol)를 첨가하고, 격렬한 교반을 실온에서 3 시간 동안 지속하였다. CH₂Cl₂ (120 mL)로 추출하고, 혼합된 추출물을 1N HCl, 포화 NaHCO₃ 및 염수로 연속적으로 세척하고 건조시키고 (무수 Na₂SO₄), 여과하고 진공하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토 그래피로 정제하여 백색 고체의 화합물 F를 93% 수율로 수득하였다.

<3-2> GDN -3a의 합성

실시예 1-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 GDN-3a를 88%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.10-7.74 (m, 28H), 7.57-7.03 (m, 44H), 7.05 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 6.77-6.12 (m, 2H), 5.94-5.81 (m, 6H), 5.37-5.12 (m, 4H), 4.94-3.19 (m, 18H), 2.08-1.08 (m, 34H), 0.87 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.90-0.80 (m, 10H), 0.77 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.68 (s, 3H), 0.53 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 167.0, 166.1, 165.9 (2C), 165.4, 165.2, 164.7, 133.8, 133.5, 133.4 (2C), 133.3, 130.1, 130.0 (2C), 129.8, 129.6, 129.5, 129.3 (2C), 129.0, 128.8 (2C), 128.6 (2C), 128.2 (2C), 109.3, 99.1, 98.9, 97.6, 95.5, 75.7, 74.8, 74.8, 74.1, 72.8, 72.7, 72.2, 71.1, 71.0 (2C), 69.3, 68.7, 63.5, 62.2, 62.1, 55.4, 53.0, 41.9, 40.0, 39.2, 38.6, 38.5, 38.4, 34.1, 32.9, 32.2, 31.8, 31.7, 31.5, 31.6, 30.4, 30.2, 29.9, 27.2, 22.8, 21.3, 20.0, 19.9, 17.4, 16.4, 14.6 (2C), 12.8.

<3-3> GDN -3의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 GDN-3을 96%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.16 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.39-4.34 (m, 1H), 4.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.87-3.19 (m, 34H), 2.61 (br s, 1H), 2.23-2.20 (m, 1H), 2.02-1.41 (m, 28H), 0.95 (d, J =8.0 Hz, 3H), 0.90 (s, 3H), 0.80 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 110.6, 103.0, 102.8, 102.3, 98.3, 93.9, 82.4, 82.3, 81.9, 81.5, 81.4, 79.9, 78.2, 78.1, 77.9, 76.8, 75.2, 75.1, 75.0, 74.8, 74.4, 74.2, 73.5, 72.5, 71.8, 71.7, 71.6, 68.0, 62.8, 62.3, 57.6, 57.4, 55.8, 55.0, 43.0, 42.0, 41.9, 41.7, 40.9, 40.0, 37.0, 36.0, 33.0, 32.5, 31.7, 31.5, 31.4, 30.6, 30.0, 26.5, 22.1, 17.7, 17.2, 16.3, 15.1; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₁H₈₄O₂₄ [M+Na]⁺1081.5431, observed 1081.5428.

< 실시예 2> SPSs 또는 SPS - Ls의 합성 방법

SPSs 또는 SPS-Ls의 합성 스킴을 도 2에 나타내었다. 하기 <2-1> 내지 <2-2>의 합성 방법에 따라 SPSs 3종 및 SPS-Ls 3 종의 화합물을 합성하였다.

<2-1> 당화 반응 기질의 합성(화합물 B1-B4)

건조 피리딘 (15 mL) 및 건조 CHCl₃ (15 mL)에 혼합된 콜레스탄올(화합물 A1), 콜레스테롤(화합물 A2), 시토스테롤(화합물 A3) 또는 디오스제닌(화합물 4)(38 mmol)에 0 ℃에서 p-톨루엔설포닐클로라이드 (54 mmol)로 처리하였다. 촉매량의 DMAP도 첨가하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 12 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 묽은 HCl 수용액, 포화 염수 용액 및 물로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na₂SO₄상에서 건조시켰다. 용매를 진공 증발기로 제거하고 클로로포름 및 메탄올을 사용하여 재결정시켰다. 잔류물 (13 mmol)을 무수 다이옥산 (20 mL)에 용해시키고 1,3-프로판 디올 (0.32 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 110 ℃에서 4 시간 동안 환류시켰다. 용액을 냉각시키고 용매를 진공에서 제거하였다. 백색 잔류물을 CH₂Cl₂에 용해시킨 후, 유기층을 NaHCO₃, 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄상에서 건조시켰다. 최종적으로, 생성물을 n-헥산/에틸아세테이트로 추출하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 B1, B2, B3 또는 B4를 수득하였다.

<2-2> 당화 반응 ( SPSs 또는 SPS - Ls의 합성)

상기 화합물 A1-A4 또는 화합물 B1-B4로부터 일반적인 당화 반응(실시예 1-2) 및 탈보호기 반응(실시예 1-3)을 통하여 SPSs 또는 SPS-Ls를 합성하였다.

< 제조예 4> SPS -1의 합성

<4-1> 화합물 1의 합성

화합물 A1로부터 실시예 1-2 및 1-3의 일반적인 당화 반응 및 탈보호기 반응에 따라 화합물 1을 88%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, (CD₃)₂SO): δ 4.89 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.52-4.40 (m, 2H), 3.66 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 3.50-3.41 (m, 3H), 3.19-3.11 (m, 1H), 3.10-3.00 (m, 1H), 2.41-2.18 (m, 2H), 2.02-1.77 (m, 5H), 1.61-0.80 (m, 34H), 0.70 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, (CD₃)₂SO): δ 97.0, 76.4, 73.2, 72.9, 71.8, 70.3, 61.0, 56.2, 55.7, 49.5, 41.8, 40.2, 39.9, 39.8, 36.6, 36.3, 35.6, 35.2, 31.4, 31.3, 27.7, 27.4, 27.4, 23.9, 23.2, 22.6, 22.4, 20.5, 19.1, 18.5, 11.9.

<4-2> SPS -1a의 합성

화합물 1로부터 실시예 1-2의 일반적인 당화 반응에 따라 SPS-1a를 75%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.17-7.78 (m, 24H), 7.79-7.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.58-7.12 (m, 46H), 5.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.93-5.81 (m, 3H), 5.71-5.69 (m, 2H), 5.61-5.42 (m, 6H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.98-4.92 (m, 2H), 4.88-4.79 (m, 2H), 4.68-4.4.35 (m, 12H), 4.22-4.03 (m, 4H), 3.88-3.85 (m, 2H), 3.39-3.20 (m, 10H), 2.85 (br s, 1H), 2.75 (br s, 1H), 1.96 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.01 (m, 40H), 0.99 (s, 3H), 0.91 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 6H), 0.68 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 165.9, 165.5, 165.3, 165.2, 165.1, 164.9, 133.7, 133.3, 133.2, 130.2, 130.1, 129.9, 129.6, 129.4, 129.1, 128.9, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 100.1, 100.0, 99.9, 99.8, 98.6, 78.9, 73.4, 73.0, 71.9, 69.7, 65.3, 56.9, 56.3, 50.1, 42.5, 39.9, 39.7, 39.4, 37.4, 37.0, 36.4, 35.9, 32.1, 31.9, 29.9, 28.4, 28.2, 24.4, 23.9, 23.0, 22.7, 21.2, 19.5, 18.9, 12.4, 12.2, 11.6.

<4-3> SPS -1의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SPS-1을 90%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.20 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.20 (q, J = 12.0 Hz, 2H), 4.04-4.01 (m, 1H), 3.93-3.80 (m, 6H), 3.70-3.54 (m, 6H), 3.50-3.14 (m, 26H), 1.97 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 1.82-1.75 (m, 1H), 1.71-1.47 (m, 8H), 1.37-1.20 (m, 14H), 1.13-0.80 (m, 26H), 0.65 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 105.4, 104.8, 103.3, 102.4, 98.7, 82.7, 79.8, 79.0, 78.5, 78.3, 78.2, 78.0, 77.8, 77.7, 77.1, 75.8, 75.5, 75.2, 75.1, 72.0, 71.8, 71.5, 63.1, 63.0, 62.7, 58.3, 57.7, 55.9, 51.8, 50.0, 43.6, 41.3, 40.8, 38.5, 37.9, 37.5, 37.3, 33.4, 31.2, 29.5, 29.3, 29.0, 25.5, 25.0, 23.3, 23.1, 22.5, 20.0, 19.4, 12.9, 12.6; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₇H₉₈O₂₆ [M+Na]⁺1221.6244, observed 1221.6247.

< 제조예 5> SPS -2의 합성

<5-1> 화합물 2의 합성

화합물 A2로부터 실시예 1-2 및 1-3의 일반적인 당화 반응 및 탈보호기 반응에 따라 화합물 2을 90%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, (CD₃)₂SO): δ 5.36 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.52-4.40 (m, 2H), 3.66 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 3.50-3.41 (m, 3H), 3.19-3.11 (m, 1H), 3.09-3.00 (m, 1H), 2.41-2.18 (m, 2H), 2.02-1.77 (m, 5H), 1.61-0.80 (m, 34H), 0.69 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz(CD₃)₂SO): δ 140.7, 121.1, 96.9, 76.4, 73.2, 72.8, 71.8, 70.4, 61.0, 56.2, 55.6, 49.5, 41.8, 40.2, 39.9, 39.8, 36.6, 36.2, 35.6, 35.2, 31.4, 31.3, 27.7, 27.4, 27.4, 23.9, 23.2, 22.6, 22.4, 20.6, 19.1, 18.5, 11.7.

<5-2> SPS -2a의 합성

화합물 2로부터 실시예 1-2의 일반적인 당화 반응에 따라 SPS-2a를 76%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.17-7.78 (m, 24H), 7.79-7.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.58-7.12 (m, 46H), 5.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.93-5.81 (m, 3H), 5.71-5.69 (m, 2H), 5.61-5.42 (m, 8H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.93-4.92 (m, 2H), 4.88-4.79 (m, 2H), 4.67-4.4.35 (m, 12H), 4.22-4.03 (m, 4H), 3.88-3.85 (m, 2H), 3.39-3.20 (m, 10H), 2.85 (br s, 1H), 2.75 (br s, 1H), 1.96 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.01 (m, 40H), 0.99 (s, 3H), 0.91 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 6H), 0.67 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 165.9, 165.8, 165.4, 165.3, 165.1, 165.0, 164.8, 164.5, 140.7, 133.5, 133.3, 133.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.0, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 121.6, 100.1, 100.0, 99.9, 99.8, 98.6, 78.9, 73.4, 73.0, 71.9, 69.7, 65.3, 56.9, 56.3, 50.1, 42.5, 39.9, 39.7, 39.4, 37.4, 37.0, 36.4, 35.9, 32.1, 31.9, 28.4, 28.2, 24.4, 23.9, 23.0, 22.7, 21.2, 19.5, 18.9, 12.0.

<5-3> SPS -2의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SPS-2을 90%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.34 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.22 (q, J = 12.0 Hz, 2H), 4.05-4.02 (m, 1H), 3.96-3.80 (m, 6H), 3.71-3.55 (m, 6H), 3.45-3.16 (m, 26H), 2.33-2.30 (m, 2H), 2.03-1.83 (m, 6H), 1.59-1.25 (m, 12H), 1.16-0.80 (m, 24H), 0.69 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.9, 105.4, 104.7, 103.3, 102.4, 98.7, 82.7, 79.8, 79.0, 78.5, 78.3, 78.2, 78.0, 77.8, 77.7, 77.1, 75.8, 75.5, 75.2, 75.1, 72.0, 71.8, 71.5, 63.1, 63.0, 62.7, 58.3, 57.7, 51.8, 50.0, 43.6, 41.3, 40.8, 38.5, 37.9, 37.5, 37.3, 33.4, 31.2, 29.5, 29.3, 29.0, 25.5, 25.0, 23.3, 23.1, 22.4, 20.0, 19.4, 12.9, 12.5; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₇H₉₆O₂₆ [M+Na]⁺ 1219.6080, observed 1219.6085.

< 제조예 6> SPS -3의 합성

<6-1> 화합물 3의 합성

화합물 A3으로부터 실시예 1-2 및 1-3의 일반적인 당화 반응 및 탈보호기 반응에 따라 화합물 3을 88%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, (CD₃)₂SO): δ 5.36 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.83 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.76 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.54-4.40 (m, 2H), 3.66 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 3.50-3.41 (m, 3H), 3.20-3.11 (m, 1H), 3.09-3.00 (m, 1H), 2.41-2.18 (m, 2H), 2.02-1.77 (m, 5H), 1.61-0.80 (m, 34H), 0.68 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, (CD₃)₂SO): δ 141.5, 121.3, 96.9, 76.4, 73.2, 72.8, 71.8, 70.4, 61.0, 56.2, 55.6, 49.5, 41.8, 40.2, 39.9, 39.8, 36.6, 36.2, 35.6, 35.2, 31.4, 31.3, 29.9, 29.7, 27.7, 27.4, 27.4, 23.9, 23.2, 22.6, 22.4, 20.6, 19.1, 18.5, 14.1, 11.7.

<6-2> SPS -3a의 합성

화합물 3로부터 실시예 1-2의 일반적인 당화 반응에 따라 SPS-3a를 78%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.17-7.78 (m, 24H), 7.79-7.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.58-7.12 (m, 46H), 5.97 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.93-5.81 (m, 3H), 5.71-5.69 (m, 2H), 5.61-5.42 (m, 8H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.93-4.92 (m, 2H), 4.88-4.79 (m, 2H), 4.67-4.4.35 (m, 12H), 4.22-4.03 (m, 6H), 3.88-3.85 (m, 2H), 3.39-3.20 (m, 10H), 2.85 (br s, 1H), 2.75 (br s, 1H), 1.96 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.01 (m, 45H), 0.99 (s, 3H), 0.91 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 6H), 0.69 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.1, 165.9, 165.4, 165.3, 165.2, 165.1, 165.0, 164.7, 164.4, 140.7, 133.6, 133.2, 130.2, 129.9, 129.7, 129.6, 129.5, 129.3, 129.1, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 121.6, 100.1, 100.0, 99.9, 99.8, 98.6, 78.9, 73.4, 73.0, 72.0, 69.9, 63.7, 57.0, 56.2, 45.9, 42.5, 39.9, 36.7, 36.4, 34.1, 32.0, 31.9, 29.3, 28.5, 27.9, 26.2, 24.5, 23.2, 21.2, 20.0, 19.5, 19.2, 19.0, 18.9, 12.0, 11.5.

<6-3> SPS -3의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SPS-3을 91%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.33 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.20 (q, J = 12.0 Hz, 2H), 4.04-4.01 (m, 1H), 3.96-3.80 (m, 6H), 3.70-3.54 (m, 6H), 3.44-3.14 (m, 26H), 2.32-2.30 (m, 2H), 2.03-1.83 (m, 6H), 1.59-1.25 (m, 15H), 1.16-0.80 (m, 26H), 0.68 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.9, 105.4, 104.7, 103.3, 102.4, 98.7, 82.7, 79.8, 79.0, 78.5, 78.3, 78.2, 78.0, 77.8, 77.7, 77.1, 75.8, 75.5, 75.2, 75.1, 72.0, 71.8, 71.5, 63.1, 63.0, 62.7, 58.3, 57.7, 51.8, 50.0, 47.3, 43.6, 41.3, 40.8, 38.5, 37.9, 37.5, 37.3, 35.2, 33.3, 31.2, 30.5, 29.5, 29.2, 29.0, 27.2, 25.5, 25.0, 23.3, 23.1, 22.4, 20.3, 19.5, 12.9, 12.5; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₉H₁₀₀O₂₆ [M+Na]⁺1247.6401, observed 1247.6406.

< 제조예 7> SPS -4의 합성

<7-1> 화합물 4의 합성

화합물 A4로부터 실시예 1-2 및 1-3의 일반적인 당화 반응 및 탈보호기 반응에 따라 화합물 4을 90%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD): δ 5.37 (d, J =3.1 Hz, 1H), 4.42 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.84 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.47 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.45-3.20 (m, 5H), 2.41 (d, J = 13.2 Hz, 1 H), 2.27 (m, 1H), 2.05-0.92 (m, 23H), 1.03 (s, 3H), 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.81 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.80 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃/CD₃OD): δ 141 .7, 123.0, 110.9, 102.5 , 82.3, 80.3, 77.8, 77.2, 74.9, 71 .6, 68.2, 63.3, 63.1, 57.8, 51 .4, 42.9, 41.6, 41 .0, 40.0, 38.5, 38.1, 33.3, 33.0, 32.7, 32.6, 31 .5, 30.8, 30.0, 22.1, 20.5, 18.2, 17.5, 15.6.

<7-2> SPS -4a의 합성

화합물 4로부터 실시예 1-2의 일반적인 당화 반응에 따라 SPS-4a를 75%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.16-7.77 (m, 24H), 7.72-7.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.58-7.15 (m, 46H), 5.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.90-5.82 (m, 3H), 5.71-5.69 (m, 3H), 5.61-5.42 (m, 8H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.98-4.92 (m, 2H), 4.88-4.79 (m, 2H), 4.69-4.4.35 (m, 12H), 4.22-4.03 (m, 4H), 3.87-3.85 (m, 2H), 3.40-3.18 (m, 12H), 2.85 (br s, 1H), 2.75 (br s, 1H), 1.96 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.01 (m, 42H), 0.99 (s, 3H), 0.91 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 6H), 0.70 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.1, 166.0, 165.7, 165.9, 165.8, 165.7, 165.4, 165.3, 165.2, 165.1, 165.0, 164.8, 164.3, 140.7, 133.6, 133.4, 133.3, 133.2, 133.1, 130.2, 130.1, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.3, 129.0, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 121.3, 109.4, 101.5, 100.4, 100.3, 100.2, 99.9, 80.9, 73.1, 72.4, 72.2, 72.0, 69.8, 66.9, 63.5, 62.2, 56.7, 50.0, 41.7, 40.4, 39.9, 36.8, 31.5, 31.4, 30.4, 28.9, 20.9, 19.5, 17.3, 16.4, 14.7.

<7-3> SPS -4의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SPS-4을 90%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.33 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.36 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 4.22 (q, J = 12.0 Hz, 2H), 4.04-4.01 (m, 1H), 3.96-3.80 (m, 6H), 3.70-3.54 (m, 6H), 3.44-3.14 (m, 26H), 2.36 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 2.01-1.80 (m, 6H), 1.75-1.39 (m, 12H), 1.28-0.93 (m, 12H), 0.79 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.7, 110.7, 105.3, 104.7, 103.2, 102.4, 98.6, 82.6, 82.3, 79.7, 78.4, 78.1, 77.9, 77.8, 77.6, 77.0, 75.7, 75.5, 75.2, 75.0, 71.9, 71.7, 71.3, 67.9, 63.8, 63.1, 62.9, 62.7, 62.6, 57.9, 51.7, 50.0, 43.0, 41.5, 41.3, 41.0, 38.4, 38.1, 33.3, 32.9, 32.5, 31.5, 30.0, 28.9, 22.1, 20.1, 17.6, 16.9, 15.1; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₇H₉₂O₂₈ [M+Na]⁺1247.5673, observed 1247.5670.

< 제조예 8> SPS -1L의 합성

<8-1> 화합물 1L의 합성

화합물 B1로부터 실시예 1-2 및 1-3의 일반적인 당화 반응 및 탈보호기 반응에 따라 화합물 1L을 90%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 4.26 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.01-3.96 (m, 1H), 3.87-3.84 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.70-3.64 (m, 2H), 3.53-3.49 (m, 3H), 3.37-3.12 (m, 6H), 2.01(d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.88-0.82 (m, 42H), 0.69 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 104.7. 78.2, 78.0, 75.5, 75.2, 71.7, 68.3, 65.9, 62.9, 58.1, 57.8, 56.1, 43.9, 41.6, 41.0, 40.8, 37.5, 37.3, 37.1, 37.0, 34.1, 33.5, 31.7, 29.9, 29.5, 29.3, 27.0, 25.4, 25.1, 23.4, 23.2, 22.1, 19.4, 12.8, 12.1.

<8-2> SPS - 1La의 합성

화합물 1L로부터 실시예 1-2의 일반적인 당화 반응에 따라 SPS-1La를 80%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.24 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.15-7.78 (m, 24H), 7.72-7.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.58-7.12 (m, 46H), 5.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.92-5.82 (m, 3H), 5.71-5.69 (m, 2H), 5.61-5.42 (m, 6H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.98-4.92 (m, 2H), 4.88-4.79 (m, 2H), 4.68-4.4.35 (m, 12H), 4.22-4.03 (m, 4H), 3.88-3.85 (m, 2H), 3.37-3.18 (m, 14H), 2.85 (br s, 1H), 2.75 (br s, 1H), 1.96 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.01 (m, 42H), 0.99 (s, 3H), 0.91 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 6H), 0.67 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 165.9, 165.8, 165.3, 165.2, 165.0, 164.8, 164.5, 133.5, 133.3, 133.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.0, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 100.1, 100.0, 99.9, 99.8, 98.6, 78.9, 73.4, 73.0, 71.9, 69.7, 65.3, 56.9, 56.3, 50.1, 42.5, 39.9, 39.7, 39.4, 37.4, 37.0, 36.4, 35.9, 32.1, 32.0, 29.9, 28.6, 28.4, 28.2, 24.4, 23.9, 23.0, 22.7, 21.2, 19.5, 18.9, 12.0, 11.6.

<8-3> SPS -1L의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SPS-1L을 92%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.06 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.37 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.25 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.98-3.39 (m, 3H), 3.88-3.83 (m, 6H), 3.71-3.63 (m, 6H), 3.55-3.47 (m, 4H), 3.38-3.18 (m, 28H), 2.01 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.88-1.76 (m, 4H), 1.70-1.02 (m, 26H), 0.94-0.86 (m, 10H), 0.82 (s, 3H), 0.68 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 105.4, 104.8, 103.3, 102.5, 100.1, 82.3, 78.5, 78.2, 78.1, 77.8, 77.7, 75.6, 75.2, 72.0, 71.7, 71.5, 67.0, 66.3, 66.0, 63.0, 62.6, 58.1, 57.8, 56.0, 43.9, 41.6, 41.0, 40.8, 37.5, 37.3, 37.1, 37.0, 34.2, 33.5, 32.9, 31.2, 29.9, 29.5, 29.3, 27.0, 25.4, 25.1, 23.9, 23.4, 23.1, 22.1, 19.3, 15.6, 12.7, 12.1; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₆₀H₁₀₄O₂₇ [M+Na]⁺1279.6663, observed 1279.6659.

< 제조예 9> SPS -2L의 합성

<9-1> 화합물 2L의 합성

화합물 B2로부터 실시예 1-2 및 1-3의 일반적인 당화 반응 및 탈보호기 반응에 따라 화합물 2L을 90%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.36 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.25 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.01-3.96 (m, 1H), 3.87-3.84 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.70-3.64 (m, 2H), 3.53-3.49 (m, 3H), 3.37-3.12 (m, 6H), 2.01 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.88-0.83 (m, 42H), 0.72 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.8, 104.6. 78.2, 78.0, 75.5, 75.2, 71.7, 68.3, 65.9, 62.9, 58.1, 57.8, 56.1, 51.8 43.6, 41.6, 41.0, 40.8, 37.5, 37.3, 37.1, 37.0, 34.1, 33.5, 31.7, 29.9, 29.5, 29.3, 27.0, 25.4, 25.1, 23.4, 23.2, 22.1, 19.4, 12.8, 12.5.

<9-2> SPS - 2La의 합성

화합물 2L로부터 실시예 1-2의 일반적인 당화 반응에 따라 SPS-2La를 80%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.24 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.16-7.78 (m, 24H), 7.72-7.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.55-7.12 (m, 46H), 5.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.91-5.80 (m, 3H), 5.72-5.69 (m, 2H), 5.61-5.42 (m, 8H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.99-4.92 (m, 2H), 4.87-4.79 (m, 2H), 4.68-4.4.35 (m, 12H), 4.22-4.03 (m, 4H), 3.88-3.85 (m, 2H), 3.37-3.18 (m, 14H), 2.85 (br s, 1H), 2.75 (br s, 1H), 1.96 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.01 (m, 42H), 0.99 (s, 3H), 0.91 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 6H), 0.67 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 165.9, 165.8, 165.3, 165.2, 165.0, 164.8, 164.5, 141.2, 133.5, 133.3, 133.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.0, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 121.6, 100.1, 100.0, 99.9, 99.8, 98.6, 78.9, 73.4, 73.0, 71.9, 69.7, 65.3, 56.9, 56.3, 50.1, 42.5, 39.9, 39.7, 39.4, 37.4, 37.0, 36.4, 35.9, 32.1, 32.0, 29.9, 28.6, 28.4, 28.2, 24.4, 23.9, 23.0, 22.7, 21.2, 19.5, 18.9, 12.0.

<9-3> SPS -2L의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SPS-2L을 92%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.37 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.95 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.38 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.29 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.98-3.39 (m, 3H), 3.88-3.83 (m, 6H), 3.71-3.63 (m, 6H), 3.55-3.47 (m, 4H), 3.38-3.18 (m, 28H), 2.10 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.88-1.76 (m, 4H), 1.70-1.02 (m, 26H), 0.94-0.86 (m, 10H), 0.72 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.1, 122.9, 104.9, 103.9, 103.3, 102.5, 82.4, 80.8, 79.9, 78.3, 78.2, 77.9, 76.1, 75.8, 75.3, 75.2, 75.1, 71.8, 71.6, 71.5, 68.3, 66.1, 63.0, 62.9, 62.7, 58.3, 57.7, 51.8, 43.6, 41.3, 40.8, 40.4, 38.6, 38.1, 37.5, 37.3, 33.4, 33.2, 31.7, 29.7, 29.5, 29.3, 25.47, 25.1, 23.3, 23.1, 22.3, 20.1, 19.4, 12.5; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₆₀H₁₀₂O₂₇ [M+Na]⁺1277.6506, observed 1277.6503.

< 제조예 10> SPS -3L의 합성

<10-1> 화합물 3L의 합성

화합물 B3로부터 실시예 1-2 및 1-3의 일반적인 당화 반응 및 탈보호기 반응에 따라 화합물 3L을 87%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.36 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.25 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.01-3.96 (m, 1H), 3.87-3.84 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.70-3.64 (m, 2H), 3.53-3.49 (m, 3H), 3.37-3.12 (m, 6H), 2.01 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.20-0.86 (m, 47H), 0.72 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.8, 104.6. 78.2, 78.0, 75.5, 75.2, 71.7, 68.3, 65.9, 62.9, 58.1, 57.8, 56.1, 51.8 43.6, 41.6, 41.0, 40.8, 38.6, 37.5, 37.3, 37.1, 37.0, 35.2, 34.1, 33.5, 31.7, 30.5, 29.9, 29.5, 29.3, 27.0, 25.4, 25.1, 24.3, 23.4, 23.2, 22.1, 20.3, 20.1, 19.6, 19.4, 12.5.

<10-2> SPS - 3La의 합성

화합물 3L로부터 실시예 1-2의 일반적인 당화 반응에 따라 SPS-3La를 78%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.24 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.15-7.78 (m, 24H), 7.72-7.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.59-7.12 (m, 46H), 5.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.92-5.82 (m, 3H), 5.72-5.69 (m, 2H), 5.61-5.42 (m, 8H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.98-4.92 (m, 2H), 4.87-4.79 (m, 2H), 4.68-4.4.35 (m, 12H), 4.22-4.03 (m, 4H), 3.88-3.85 (m, 2H), 3.37-3.18 (m, 14H), 2.85 (br s, 1H), 2.75 (br s, 1H), 1.96 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.01 (m, 47H), 0.99 (s, 3H), 0.91 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 6H), 0.68 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 160.0, 165.9, 165.8, 165.3, 165.2, 165.0, 164.8, 164.5, 141.2, 133.5, 133.3, 133.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.0, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 121.6, 100.1, 100.0, 99.9, 99.8, 98.6, 78.9, 73.4, 73.0, 72.0, 69.7, 65.3, 56.9, 56.3, 50.1, 42.5, 39.9, 39.7, 39.4, 37.4, 37.0, 36.4, 35.9, 32.1, 32.0, 29.9, 28.6, 28.4, 28.2, 24.4, 23.9, 23.0, 22.7, 21.2, 19.5, 18.9, 12.0, 11.5.

<10-3> SPS -3L의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SPS-3L을 91%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.38 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.96 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.98-3.39 (m, 3H), 3.88-3.83 (m, 6H), 3.71-3.63 (m, 6H), 3.55-3.47 (m, 4H), 3.38-3.18 (m, 28H), 2.38 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.10 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.88-1.76 (m, 4H), 1.70-1.02 (m, 28H), 0.94-0.86 (m, 10H), 0.72 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.1, 122.9, 104.9, 103.9, 103.3, 102.5, 82.4, 80.8, 79.9, 78.3, 78.2, 77.9, 76.1, 75.8, 75.3, 75.2, 75.1, 71.8, 71.6, 71.5, 68.3, 66.1, 63.0, 62.9, 62.7, 58.3, 57.7, 51.8, 43.6, 41.3, 40.8, 40.4, 38.6, 38.1, 37.5, 37.3, 35.3, 33.4, 33.2, 30.5, 29.7, 29.5, 27.3, 25.5, 24.3, 22.3, 20.3, 20.1, 19.6, 19.5, 12.5, 12.4; HRMS (FAB ⁺ ): calcd. for C₆₂H₁₀₆O₂₇ [M+Na]⁺1305.6819, observed 1305.6824.

< 제조예 11> SPS -4L의 합성

<11-1> 화합물 4L의 합성

화합물 B4로부터 실시예 1-2 및 1-3의 일반적인 당화 반응 및 탈보호기 반응에 따라 화합물 4L을 88%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.37 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.42-4.36 (m, 1H), 4.25 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.01-3.96 (m, 1H), 3.87-3.84 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.70-3.64 (m, 2H), 3.53-3.49 (m, 3H), 3.45-3.43 (m, 6H), 3.37-3.12 (m, 6H), 2.39 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.18-0.95 (m, 37H), 0.76 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.6, 110.7, 104.6, 82.3, 80.6, 78.2, 78.0, 75.2, 71.8, 68.1, 67.9, 66.2, 63.9, 62.9, 57.9, 55.0, 51.8, 43.0, 41.0, 40.3, 38.5, 38.2, 33.3, 32.9, 32.8, 32.5, 31.6, 30.0, 29.6, 24.4, 22.1, 20.0, 17.6, 16.9, 15.1.

<11-2> SPS - 4La의 합성

화합물 4L로부터 실시예 1-2의 일반적인 당화 반응에 따라 SPS-4La를 78%의 수율로 수득하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.15-7.77 (m, 24H), 7.72-7.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.58-7.12 (m, 46H), 5.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.92-5.82 (m, 3H), 5.71-5.69 (m, 3H), 5.61-5.42 (m, 8H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.98-4.92 (m, 2H), 4.88-4.79 (m, 2H), 4.69-4.4.35 (m, 12H), 4.22-4.03 (m, 4H), 3.87-3.85 (m, 2H), 3.37-3.18 (m, 14H), 2.85 (br s, 1H), 2.75 (br s, 1H), 1.96 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.01 (m, 47H), 0.99 (s, 3H), 0.91 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.88-0.84 (m, 6H), 0.70 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 166.0, 165.9, 165.8, 165.2, 165.1, 164.6, 141.2, 133.5, 133.2, 133.1, 133.0, 130.3, 130.0, 129.9, 128.8, 129.8, 129.7, 129.6, 129.3, 129.2, 129.0, 128.9, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 121.2, 109.4, 109.3, 101.2, 101.1, 100.0, 99.9, 99.8, 80.9, 79.0, 72.9, 72.4, 72.3, 72.2, 67.0, 66.4, 62.2, 56.6, 53.6, 50.1, 41.7, 40.4, 39.9, 39.4, 37.2, 37.1, 32.2, 31.9, 31.7, 31.5, 30.5, 30.4, 28.6, 20.9, 19.5, 17.3, 16.4, 14.7.

<11-3> SPS -4L의 합성

실시예 1-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SPS-4L을 91%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.36 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.36 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.26 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.04 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.95-3.36 (m, 3H), 3.88-3.83 (m, 6H), 3.71-3.63 (m, 6H), 3.55-3.47 (m, 4H), 3.38-3.18 (m, 28H), 2.36 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.13 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.01-1.80 (m, 7H), 1.74-1.35 (m, 12H), 1.29-1.12 (m, 5H), 1.0 (s, 3H), 0.93 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 0.78 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.7, 110.7, 105.1, 104.9, 103.9, 103.3, 102.5, 82.3, 80.7, 79.9, 78.2, 78.1, 77.9, 75.8, 75.3, 75.2, 75.0, 71.8, 71.6, 71.4, 69.7, 68.3, 68.0, 66.1, 63.9, 63.1, 62.7, 57.9, 51.7, 43.0, 41.5, 41.1, 40.4, 38.5, 38.2, 33.3, 33.0, 32.9, 32.6, 31.7, 31.6, 30.0, 29.7, 22.1, 20.1, 17.6, 16.9, 15.7, 15.1; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₆₀H₉₈O₂₉ [M+Na]⁺1305.6091, observed 1305.6089.

< 실시예 3> SMAs 의 합성 방법

SMAs 의 합성 스킴을 도 3에 나타내었다. 하기 <3-1> 내지 <3-3>의 합성 방법에 따라 SMA-As 3종, SMA-Es 2종 및 SMA-Ds 3종의 화합물을 합성하였다.

<3-1-1> 화합물 A의 합성(도 3의 단계 i, ii)

톨루엔 (2 mL)에 혼합된 토실레이트 콜레스테롤 (2 mmol) 및 2-프로펜-1-올/3- 부텐-1-올 또는 4-펜텐-1-올 (40 mmol)의 혼합물을 80-90 ℃ 에서 4 시간 동안 질소하에서 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, CH₂Cl₂ (30 mL)를 혼합물에 첨가 하였다. 혼합물을 염수 (30 mL)로 세척하였다. 분리 후, 추가 20 mL의 CH₂Cl₂를 유기층에 첨가하였다. 이어서, 유기층을 염수 (30 mL)로 세척하고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 실온에서 주변 대기하에서 5:3:1 아세톤/물 /tert-부틸 알콜 혼합물 내에서 격렬히 교반하였다. 여기에 물 (1.10 mmol)에 혼합된 N-메틸모르폴린 N- 옥사이드 (NMO)의 50 wt. % 용액을 첨가한 후 OsO₄ (0.25 mol-%)를 첨가하였다. 시작 물질이 TLC 분석에 따라 사라졌을 때, 용매를 50 ℃에서 진공하에 제거하였다. 잔류물을 진공하에 톨루엔으로 40 ℃에서 2 회 증발시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 에틸 아세테이트-헥산으로 용출시키는 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물 A를 수득하였다.

<3-1-2> 화합물 B의 합성 (도 3의 단계 iii, iv)

2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올/2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-에탄올 또는 3-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올 (12.9 밀리몰)의 용액에 NaH (광유 중 60 %, 26 밀리몰)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 30 분 동안 교반하였다. 이어서, THF (10 mL) 중의 콜레스테릴 토실레이트 (16 mmol)또는 디오스제닐 토실레이트(16 mmol)를 반응 혼합물에 적가하였다. 첨가 후, 혼합물을 질소하에 밤새 환류시키고, 실온으로 냉각시켰다. 과량의 NaH는 물을 조심스럽게 혼합물에 첨가함으로써 제거하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂ (50 mL)로 희석하고, 물 및 염수로 세척하고, 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 중간 잔류물을 20 ml의 THF-수용액 (15:5)에 p-톨루엔술폰산 (160 mg)과 함께 용해시키고, 생성된 용액을 밤새 환류시켰다. CH₂Cl₂로 2 회 추출한 후, 물로 1 회 세척하고, 염수 용액으로 1 회 세척하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트-헥산으로 용출시키는 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물 B를 수득하였다.

<3-2> 말토실레이션(maltosylation)반응의 일반 합성 절차 (도 3의 단계 v)

실시예 3-1에서 생성된 화합물, 2,4,5-콜리딘(collidine) (1.0 당량) 및 AgOTf (2.4 당량)의 혼합물을 무수 CH₂Cl₂ 에서 -45 ℃에서 교반하였다. 무수 CH₂Cl₂에서 페르벤조일레이티드 말토실브로마이드/ 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드 (perbenzoylated maltosylbromide/ perbenzoylated glucosylbromide) 용액을 이 현탁액에 30분간 적가하였다. -45 ℃에서 30분 동안 교반을 계속한 후, 반응 혼합물의 온도를 0 ℃로 증가시키고 1시간 동안 계속 교반하였다. 반응 완결 후 (TLC로 나타냄), 피리딘을 첨가하여 반응을 켄칭시킨 후, CH₂Cl₂로 희석하여 셀라이트상에서 여과하였다. 여과액을 1 M 수용성 Na₂S₂O₃ 용액(40mL), 0.1 M HCl 수용액(40mL) 및 염수(2 x 40mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 회전 증발기로 용매를 제거하였다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 흰 고체인 목적하는 화합물을 수득하였다.

<3-3> 탈보호기화 반응 ( deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 3의 단계 vi)

< 제조예 12> SMA -A1의 합성

<12-1> 화합물 A1의 합성

실시예 3-1-1의 합성 절차에 따라 화합물 A1을 85%수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 3.86-3.82 (m, 1H), 3.73-3.62 (m, 2H), 3.55 (br s, 1H), 3.50-3.41 (m, 2H), 3.05 (br s, 2H), 1.97-1.94 (m, 1H), 1.83-1.74 (m, 2H), 1.62-0.97 (m, 28H), 0.90-0.85 (m, 10H), 0.77 (s, 3H), 0.64 (s, 3H) ); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 75.1, 70.8, 69.8, 64.6, 56.6, 56.4, 54.4, 42.7, 40.2, 39.8, 39.7, 36.3, 36.0, 35.9, 36.6, 33.1, 32.9, 32.1, 28.7, 28.4, 28.2, 25.8, 24.3, 24.0, 22.9, 22.7, 20.9, 18.8, 12.2, 11.5.

<12-2> SMA - A1a의 합성

실시예 3-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 SMA-A1a를 85%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.21-7.98 (m, 10H), 7.91-7.70 (m, 18H), 7.54-7.12 (m, 42H), 6.23-6.15 (m, 2H), 5.80-5.69 (m, 6H), 5.35-5.22 (m, 4H), 4.82-4.66 (m, 4H), 4.57-4.30 (m, 10H), 3.95-3.82 (m, 2H), 3.72-3.68 (m, 2H), 3.23 (br s, 1H), 3.01-2.95 (m, 1H), 2.85-2.77 (m, 1H), 1.97-1.94 (m, 1H), 1.83-1.74 (m, 2H), 1.62-0.97 (m, 28H), 0.92-0.85 (m, 10H), 0.76 (s, 3H), 0.64 (s, 3H) ); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.5, 165.3, 165.2, 165.0, 133.5, 133.3, 133.2, 130.1, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.0, 128.9, 128.5, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 101.0, 96.4, 74.6, 74.5, 73.4, 73.1, 72.8, 72.6, 71.0, 69.3, 63.6, 62.6, 60.5, 56.5, 56.3, 54.0, 42.7, 40.1, 39.6, 36.3, 35.9, 35.8, 35.7, 35.6, 32.0, 28.4, 28.1, 24.3, 24.0, 22.9, 22.7, 20.8, 18.8, 14.3, 12.2, 11.4, 11.3.

<12-3> SMA -A1의 합성

실시예 3-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SMA-A1를 92%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.18 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.66 and 4.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.45 and 4.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.12-4.05 (m, 2H), 3.93-3.80 (m, 8H), 3.72-3.51 (m, 10H), 3.47-3.39 (m, 5H), 3.35-3.25 (m, 4H), 2.03 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.87-1.80 (m, 2H), 1.61-1.01 (m, 28H), 0.96-0.89 (m, 10H), 0.84 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 105.0, 104.6, 104.5, 104.0, 103.0, 98.3, 93.9, 81.6, 81.5, 81.3, 79.4, 78.7, 77.8, 76.8, 76.7, 76.3, 76.1, 75.2, 75.1, 75.0, 74.9, 74.5, 74.3, 71.6, 69.1, 62.9, 62.4, 58.1, 58.0, 57.8, 56.0, 55.9, 43.9, 41.6, 40.9, 40.8, 37.5, 37.3, 37.1, 37.0, 34.1, 34.0, 33.5, 29.8, 29.5, 29.3, 26.9, 26.7, 25.4, 25.1, 19.8, 12.8, 11.9; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₄H₉₄O₂₃ [M+Na]⁺ 1133.6084, observed 1133.6079.

< 제조예 13> SMA -A2의 합성

<13-1> 화합물 A2의 합성

실시예 3-1-1의 합성 절차에 따라 화합물 A2을 85%수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 3.93-3.88 (m, 1H), 3.64-3.51 (m, 5H), 2.86 (br s, 2H), 1.96-1.92 (m, 1H), 1.84-0.99 (m, 32H), 0.90-0.85 (m, 10H), 0.76 (s, 3H), 0.64 (s, 3H) ); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 75.1, 72.4, 72.2, 66.7, 66.6, 66.4, 56.6, 56.4, 54.3, 42.7, 40.1, 39.9, 39.8, 39.7, 36.4, 36.0, 35.9, 35.6, 33.1, 33.0, 32.9, 32.1, 28.8, 28.4, 28.9, 28.2, 25.8, 24.3, 24.0, 22.9, 22.7, 20.9, 18.8, 12.2, 11.5.

<13-2> SMA - A2a의 합성

실시예 3-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 SMA-A2a를 85%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.20-7.98 (m, 10H), 7.91-7.70 (m, 18H), 7.54-7.12 (m, 42H), 6.23-6.15 (m, 2H), 5.80-5.69 (m, 6H), 5.35-5.22 (m, 4H), 4.82-4.66 (m, 4H), 4.57-4.30 (m, 10H), 3.95-3.82 (m, 2H), 3.72-3.67 (m, 2H), 3.23 (br s, 1H), 3.01-2.94 (m, 1H), 2.85-2.77 (m, 1H), 1.96-1.92 (m, 1H), 1.84-0.99 (m, 32H), 0.91-0.85 (m, 10H), 0.76 (s, 3H), 0.65 (s, 3H) ); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.5, 165.3, 165.2, 165.0, 133.5, 133.3, 133.2, 130.1, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.0, 128.9, 128.5, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 101.0, 96.4, 70.1, 69.2, 63.6, 62.6, 60.4, 56.5, 56.3, 54.1, 42.6, 39.6, 39.5, 36.3, 35.9, 35.8, 35.5, 32.7, 32.0, 28.3, 28.1, 24.3, 23.9, 22.9, 22.7, 21.1, 18.8, 14.3, 12.2, 11.4, 11.3.

<13-3> SMA -A2의 합성

실시예 3-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SMA-A2를 92%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.18 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.65 and 4.51 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.10-4.07 (m, 2H), 3.92-3.78 (m, 8H), 3.70-3.51 (m, 10H), 3.47-3.37 (m, 5H), 3.32-3.25 (m, 4H), 2.03 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.78 (m, 2H), 1.70-1.01 (m, 30H), 0.96-0.89 (m, 10H), 0.84 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 104.8, 104.7, 104.5, 104.2, 103.0, 98.3, 93.9, 81.9, 81.5, 81.4, 81.3, 78.1, 77.9, 76.7, 76.6, 75.5, 75.2, 74.8, 74.4, 74.2, 73.6, 73.1, 71.7, 71.6, 64.5, 65.2, 62.8, 62.3, 58.1, 57.8, 56.0, 43.9, 41.6, 41.1, 40.9, 40.8, 37.5, 37.3, 37.1, 37.0, 34.2, 33.9, 33.6, 33.5, 29.9, 29.5, 29.3, 27.2, 26.9, 25.4, 25.2, 23.4, 23.1, 22.0, 19.4, 12.8, 12.1; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₅H₉₆O₂₃ [M+Na]⁺ 1147.6240, observed 1147.6235.

< 제조예 14> SMA -A3의 합성

<14-1> 화합물 A3의 합성

실시예 3-1-1의 합성 절차에 따라 화합물 A3을 85%수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 3.70-3.65 (m, 1H), 3.60-3.41 (m, 4H), 3.25-3.20 (m, 1H), 1.97-1.92 (m, 1H), 1.84-0.99 (m, 34H), 0.90-0.85 (m, 10H), 0.76 (s, 3H), 0.64 (s, 3H) ); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 79.0, 72.1, 68.2, 66.8, 56.6, 56.5, 54.5, 44.9, 42.7, 40.2, 39.6, 37.1, 36.3, 35.9, 35.6, 34.9, 34.8, 32.2, 31.1, 28.9, 28.4, 28.3, 28.1, 26.8, 26.7, 24.3, 24.0, 22.9, 22.7, 21.4, 18.8, 12.4, 12.2.

<14-2> SMA - A3a의 합성

실시예 3-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 SMA-A3a를 85%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.21-7.98 (m, 10H), 7.91-7.70 (m, 18H), 7.54-7.12 (m, 42H), 6.23-6.15 (m, 2H), 5.80-5.69 (m, 6H), 5.35-5.22 (m, 4H), 4.82-4.66 (m, 4H), 4.57-4.30 (m, 10H), 3.95-3.82 (m, 2H), 3.72-3.65 (m, 2H), 3.23 (br s, 1H), 3.01-2.94 (m, 1H), 2.85-2.77 (m, 1H), 1.97-1.92 (m, 1H), 1.84-0.99 (m, 34H), 0.90-0.84 (m, 10H), 0.76 (s, 3H), 0.66 (s, 3H) ); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.5, 165.3, 165.2, 165.0, 133.5, 133.3, 133.2, 130.1, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 101.0, 96.4, 78.2, 71.4, 70.0, 69.2, 69.1, 60.3, 56.5, 56.3, 54.4, 44.8, 42.6, 40.1, 39.5, 36.9, 36.2, 35.8, 35.7, 35.5, 34.9, 32.2, 28.9, 28.3, 28.2, 28.0, 24.2, 23.8, 22.9, 22.6, 21.3, 21.0, 18.8, 14.2, 12.3, 12.2, 11.5.

<14-3> SMA -A3의 합성

실시예 3-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SMA-A3을 94%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.17 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.65 and 4.51 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.39 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.10-4.07 (m, 2H), 3.94-3.78 (m, 8H), 3.72-3.51 (m, 10H), 3.48-3.36 (m, 5H), 3.32-3.25 (m, 4H), 2.03 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.90-1.78 (m, 2H), 1.72-1.01 (m, 32H), 0.96-0.89 (m, 10H), 0.84 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 104.8, 104.7, 104.6, 104.2, 103.0, 98.3, 93.9, 81.9, 81.5, 81.4, 81.3, 78.1, 77.9, 76.7, 76.6, 75.5, 75.2, 74.8, 74.4, 74.2, 73.6, 73.1, 71.7, 71.6, 64.6, 65.2, 62.8, 62.3, 58.1, 57.8, 56.0, 43.9, 41.6, 41.1, 40.9, 40.8, 37.5, 37.3, 37.1, 37.0, 34.2, 33.9, 33.6, 33.5, 29.9, 29.5, 29.3, 27.2, 26.9, 25.5, 25.2, 23.4, 23.1, 22.0, 19.4, 12.7, 12.1; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₆H₉₈O₂₃ [M+Na]⁺ 1161.6397, observed 1161.6393.

< 제조예 15> SMA -E1의 합성

<15-1> 화합물 B1의 합성

실시예 3-1-2의 합성 절차에 따라 화합물 B1을 80%수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.32 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.90-3.50 (m, 5H), 3.20-3.12 (m, 1H), 2.50-2.46 (m, 1H), 2.01-1.85 (m, 5H), 1.62-1.29 (m, 12H), 1.20-1.09 (m, 8H), 1.03-0.88 (m, 16H), 0.68 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 140.1, 121.5, 79.8, 72.2, 71.8, 70.8, 69.8, 64.6, 56.6, 56.4, 54.4, 42.7, 40.2, 39.8, 39.7, 36.3, 36.0, 35.9, 36.6, 33.1, 32.9, 32.1, 28.7, 28.4, 28.2, 25.8, 24.3, 24.0, 22.9, 22.7, 20.9, 18.8, 12.2.

<15-2> SMA - E1a의 합성

실시예 3-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 SMA-E1a를 84%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.18-7.98 (m, 10H), 7.90-7.70 (m, 18H), 7.54-7.12 (m, 42H), 6.23-6.15 (m, 2H), 5.80-5.69 (m, 6H), 5.35-5.22 (m, 4H), 4.82-4.66 (m, 5H), 4.57-4.30 (m, 10H), 3.95-3.82 (m, 2H), 3.72-3.68 (m, 2H), 3.23 (br s, 1H), 3.01-2.95 (m, 1H), 2.50-2.46 (m, 1H), 2.01-1.85 (m, 5H), 1.62-1.29 (m, 12H), 1.20-1.09 (m, 8H), 1.03-0.88 (m, 16H), 0.68 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.5, 165.2, 165.1, 165.0, 164.9, 140.6, 133.4, 133.1, 129.9, 129.7, 128.4, 128.3, 121.5, 100.5, 96.6, 79.4, 73.3, 73.1, 72.8, 71.3, 70.0, 69.8, 69.2, 69.1, 68.2, 63.5, 62.6, 60.4, 56.8, 56.2, 50.2, 50.1, 42.4, 39.8, 39.6, 36.7, 36.6, 36.3, 35.8, 31.9, 31.8, 28.3, 28.0, 24.3, 23.8, 22.9, 22.6, 21.0, 18.8, 12.2.

<14-3> SMA -E1의 합성

실시예 3-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SMA-E1을 93%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.37 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.53-4.48 (m, 1H), 4.42 and 4.38 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.08-3.99 (m, 2H), 3.92-3.75 (m, 8H), 3.70-3.60 (m, 10H), 3.58-3.35 (m, 5H), 3.30-3.24 (m, 4H), 2.42-2.36 (m, 1H), 2.20-1.85 (m, 5H), 1.61-1.29 (m, 12H), 1.20-1.10 (m, 8H), 1.03-0.88 (m, 16H), 0.73 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.1, 122.9, 104.9, 104.6, 104.3, 103.0, 81.3, 77.9, 77.8, 76.8, 76.7, 75.2, 74.9, 74.8, 74.3, 71.6, 62.9, 62.4, 58.3, 57.7, 51.8, 43.6, 41.3, 40.8, 40.2, 38.5, 38.1, 37.5, 37.3, 33.4, 33.2, 29.5, 29.4, 29.3, 25.5, 25.1, 23.3, 23.1, 22.3, 20.0, 19.4, 12.5; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₄H₉₂O₂₃ [M+Na]⁺ 1131.5927, observed 1131.5930.

< 제조예 16> SMA -E3의 합성

<16-1> 화합물 B2의 합성

실시예 3-1-2의 합성 절차에 따라 화합물 B2을 80%수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.33 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.90-3.50 (m, 5H), 3.20-3.12 (m, 1H), 2.48-2.45 (m, 1H), 2.02-1.85 (m, 5H), 1.62-1.30 (m, 16H), 1.20-1.09 (m, 8H), 1.03-0.88 (m, 16H), 0.67 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 140.6, 121.8, 79.4, 72.1, 68.2, 66.8, 56.6, 56.5, 54.5, 44.9, 42.7, 40.2, 39.6, 37.1, 36.3, 35.9, 35.6, 34.9, 34.8, 32.2, 31.1, 28.9, 28.4, 28.3, 28.1, 26.8, 26.7, 24.3, 24.0, 22.9, 22.5, 21.4, 18.9, 12.1.

<16-2> SMA - E3a의 합성

실시예 3-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 SMA-E3a를 84%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.16-7.98 (m, 10H), 7.90-7.70 (m, 18H), 7.54-7.12 (m, 42H), 6.23-6.15 (m, 2H), 5.80-5.69 (m, 6H), 5.35-5.22 (m, 4H), 4.82-4.66 (m, 5H), 4.57-4.30 (m, 10H), 3.95-3.82 (m, 2H), 3.72-3.68 (m, 2H), 3.23 (br s, 1H), 3.01-2.95 (m, 1H), 2.50-2.46 (m, 1H), 2.01-1.85 (m, 5H), 1.62-1.29 (m, 14H), 1.20-1.09 (m, 10H), 1.03-0.88 (m, 16H), 0.67 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.3, 166.1, 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.5, 165.2, 165.1, 165.0, 164.9, 140.6, 133.4, 133.1, 129.9, 129.7, 128.4, 128.3, 121.5, 100.5, 96.6, 79.4, 73.3, 73.1, 72.8, 71.3, 70.0, 69.8, 69.2, 69.1, 68.2, 63.5, 62.6, 60.4, 56.8, 56.2, 50.2, 50.1, 42.4, 39.8, 39.6, 36.8, 36.7, 36.6, 36.3, 35.8, 31.9, 31.8, 28.3, 28.0, 24.3, 23.8, 22.9, 22.6, 21.0, 18.8, 14.2, 12.2.

<16-3> SMA -E3의 합성

실시예 3-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SMA-E3을 94%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.37 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.53-4.48 (m, 1H), 4.42 and 4.38 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.10-3.99 (m, 2H), 3.92-3.74 (m, 8H), 3.70-3.60 (m, 10H), 3.58-3.35 (m, 5H), 3.30-3.24 (m, 4H), 2.42-2.35 (m, 1H), 2.20-1.85 (m, 5H), 1.61-1.25 (m, 16H), 1.20-1.10 (m, 8H), 1.03-0.88 (m, 16H), 0.73 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.1, 122.8, 103.1, 98.3, 81.6, 81.4, 77.9, 76.8, 75.3, 75.2, 74.9, 74.3, 71.6, 67.0, 62.8, 62.5, 58.3, 57.7, 51.8, 43.6, 41.3, 40.8, 40.4, 38.6, 38.1, 37.5, 37.2, 33.4, 33.2, 29.6, 29.5, 29.3, 25.4, 25.1, 22.3, 20.0, 19.4, 15.6, 12.5; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₆H₉₆O₂₃ [M+Na]⁺ 1159.6240, observed 1159.6234.

< 제조예 17> SMA -D1의 합성

<17-1> 화합물 C1의 합성

실시예 3-1-2의 합성 절차에 따라 화합물 C1을 80%수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.34 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.42 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 3.84 (br s, 1H), 3.72-3.68 (m, 1H), 3.62-3.45 (m, 4H), 3.40-3.28 (m, 4H), 3.22-3.12 (m, 1H), 2.38-2.30 (m, 1H), 2.25-2.15 (m, 1H), 2.04-1.43 (m, 15H), 1.29-0.96 (m, 12H), 0.78 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 140.6, 121.7, 109.4, 80.9, 79.8, 70.9, 69.7, 66.9, 64.2, 62.2, 56.6, 50.2, 41.7, 40.4, 39.8, 39.1, 37.2, 37.1, 32.2, 31.9, 31.5, 30.4, 28.9, 28.4, 20.9, 19.5, 17.2, 16.4, 14.6.

<17-2> SMA - D1a의 합성

실시예 3-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 SMA-D1a를 85%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.18-7.96 (m, 10H), 7.90-7.64 (m, 18H), 7.53-7.10 (m, 42H), 6.23-6.12 (m, 2H), 5.86-5.62 (m, 8H), 5.35-5.23 (m, 4H), 5.12-4.68 (m, 6H), 4.59-4.27 (m, 13H), 4.10 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 3.95-3.82 (m, 2H), 3.50-3.35 (m, 4H), 3.05-2.96 (m, 1H), 1.96-1.88 (m, 2H), 1.80-1.25 (m, 15H), 1.22-0.80 (m, 12H), 0.77 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.5, 165.1, 165.0, 133.5, 133.3, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.2, 128.9, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 109.4, 96.5, 80.9, 73.3, 72.8, 72.4, 70.9, 70.1, 69.2, 69.1, 68.2, 66.9, 63.5, 62.6, 62.1, 56.5, 50.0, 41.6, 40.3, 36.8, 36.7, 32.0, 31.8, 30.3, 19.3, 17.2, 16.3, 14.6. 14.1.

<17-3> SMA -D1의 합성

실시예 3-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SMA-D1을 94%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.37 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.52-4.46 (m, 1H), 4.42-4.36 (m, 2H), 4.07-4.01 (m, 2H), 3.92-3.77 (m, 8H), 3.70-3.62 (m, 10H), 3.53-3.40 (m, 5H), 3.30-3.18 (m, 4H), 2.42-2.34 (m, 1H), 2.22-2.16 (m, 1H), 2.03-1.88 (m, 5H), 1.74-1.40 (m, 12H), 1.19 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.03 (s, 4H), 0.97 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 0.81 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.07, 122.7, 122.6, 110.6, 104.8, 104.5, 104.3, 104.2, 102.9, 98.2, 93.9, 82.3, 81.9, 81.5, 81.3, 81.2, 81.1, 77.9, 77.8, 77.7, 76.7, 76.6, 75.9, 75.2, 75.1, 74.9, 74.8, 74.7, 74.3, 74.2, 73.5, 71.7, 71.6, 71.5, 67.9, 66.9, 63.8, 62.8, 62.4, 62.3, 57.9, 51.7, 43.0, 41.5, 41.0, 40.2, 38.5, 38.2, 33.3, 32.9, 32.5, 31.5, 30.1, 29.5, 29.4, 22.1, 20.1, 17.7, 16.9, 15.6, 15.1; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₄H₈₈O₂₅ [M+Na]⁺ 1159.5512, observed 1159.5515.

< 제조예 18> SMA -D2의 합성

<18-1> 화합물 C2의 합성

실시예 3-1-2의 합성 절차에 따라 화합물 C2을 80%수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.33 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.42 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 3.84 (br s, 1H), 3.72-3.68 (m, 1H), 3.64-3.45 (m, 4H), 3.40-3.28 (m, 4H), 3.22-3.12 (m, 1H), 2.38-2.30 (m, 1H), 2.25-2.15 (m, 1H), 2.06-1.43 (m, 17H), 1.29-0.96 (m, 12H), 0.79 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 140.7, 121.6, 109.4, 80.9, 79.5, 71.6, 66.9, 66.5, 65.9, 62.2, 56.6, 50.2, 41.7, 40.4, 39.9, 39.1, 39.0, 37.2, 37.1, 33.2, 32.2, 31.9, 31.5, 31.4, 30.4, 28.9, 28.5, 28.4, 20.9, 19.5, 17.3, 16.4, 14.6.

<18-2> SMA - D2a의 합성

실시예 3-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 SMA-D2a를 85%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.16-7.96 (m, 10H), 7.90-7.64 (m, 18H), 7.53-7.10 (m, 42H), 6.22-6.12 (m, 2H), 5.86-5.62 (m, 8H), 5.35-5.23 (m, 4H), 5.12-4.68 (m, 6H), 4.59-4.27 (m, 13H), 4.10 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 3.95-3.82 (m, 2H), 3.50-3.35 (m, 4H), 3.05-2.96 (m, 1H), 1.96-1.88 (m, 2H), 1.80-1.25 (m, 17H), 1.22-0.80 (m, 12H), 0.78 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.3, 166.1, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.5, 165.1, 165.0, 133.5, 133.3, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.2, 128.9, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 109.4, 96.5, 80.9, 73.3, 72.8, 72.4, 70.9, 70.1, 69.2, 69.1, 68.2, 66.9, 63.5, 62.6, 62.1, 56.5, 50.0, 41.6, 40.3, 36.8, 36.7, 32.0, 31.7, 30.2, 19.3, 17.2, 16.3, 14.6. 14.2.

<18-3> SMA -D2의 합성

실시예 3-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SMA-D2을 94%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.37 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.42-4.36 (m, 2H), 4.07-4.01 (m, 2H), 3.96-3.76 (m, 8H), 3.70-3.62 (m, 10H), 3.53-3.40 (m, 5H), 3.30-3.18 (m, 4H), 2.42-2.34 (m, 1H), 2.22-2.16 (m, 1H), 2.03-1.88 (m, 5H), 1.74-1.40 (m, 14H), 1.19 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.03 (s, 4H), 0.97 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 0.80 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.6, 110.6, 104.5, 102.9, 99.5, 98.2, 93.9, 82.3, 81.8, 81.4, 81.3, 81.2, 80.6, 77.9, 77.8, 77.7, 76.7, 75.9, 75.1, 74.8, 74.3, 74.2, 73.5, 71.7, 71.6, 71.5, 68.5, 67.9, 63.8, 62.8, 62.4, 62.3, 57.9, 51.7, 50.0, 43.0, 41.5, 41.02, 40.3, 38.5, 38.2, 33.3, 32.9, 32.5, 31.5, 29.9, 29.6, 22.1, 20.0, 17.6, 16.9, 15.1; HRMS (FAB ⁺ ): calcd. for C₅₅H₉₀O₂₅ [M+H]⁺ 1151.5849, observed 1151.5846.

< 제조예 19> SMA -D3의 합성

<19-1> 화합물 C3의 합성

실시예 3-1-2의 합성 절차에 따라 화합물 C3을 80%수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.33 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.42 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 3.84 (br s, 1H), 3.72-3.68 (m, 1H), 3.64-3.45 (m, 4H), 3.40-3.28 (m, 4H), 3.22-3.12 (m, 1H), 2.38-2.30 (m, 1H), 2.25-2.15 (m, 1H), 2.06-1.43 (m, 19H), 1.29-0.96 (m, 12H), 0.79 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 140.8, 121.6, 109.4, 80.9, 79.5, 71.6, 66.9, 66.5, 65.9, 62.2, 56.6, 50.2, 41.7, 40.4, 39.9, 39.1, 39.0, 37.2, 37.1, 33.2, 32.2, 31.9, 31.5, 31.4, 30.4, 28.9, 28.5, 26.7, 28.4, 21.2, 21.0, 19.5, 17.3, 16.4, 14.6.

<19-2> SMA - D3a의 합성

실시예 3-2의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 SMA-D3a를 85%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.18-7.96 (m, 10H), 7.90-7.64 (m, 18H), 7.53-7.10 (m, 42H), 6.23-6.10 (m, 2H), 5.86-5.62 (m, 8H), 5.35-5.23 (m, 4H), 5.12-4.66 (m, 6H), 4.59-4.27 (m, 13H), 4.10 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 3.95-3.82 (m, 2H), 3.50-3.35 (m, 4H), 3.05-2.96 (m, 1H), 1.96-1.88 (m, 2H), 1.82-1.25 (m, 19H), 1.22-0.80 (m, 12H), 0.77 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.5, 165.1, 165.0, 133.5, 133.3, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.2, 128.9, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 109.4, 96.5, 80.9, 73.3, 72.8, 72.4, 70.9, 70.1, 69.2, 69.1, 68.2, 66.9, 63.5, 62.6, 62.1, 56.5, 50.0, 41.6, 40.3, 39.8, 36.8, 36.7, 32.0, 31.8, 30.3, 19.3, 17.2, 16.3, 14.6. 14.3.

<19-3> SMA -D3의 합성

실시예 3-3의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 SMA-D3을 94%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.37 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.42-4.35 (m, 2H), 4.07-4.01 (m, 2H), 3.96-3.76 (m, 8H), 3.70-3.62 (m, 10H), 3.53-3.40 (m, 5H), 3.30-3.18 (m, 4H), 2.42-2.35 (m, 1H), 2.22-2.16 (m, 1H), 2.03-1.88 (m, 5H), 1.74-1.40 (m, 16H), 1.19 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.03 (s, 4H), 0.97 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 0.79 (s, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 142.2, 122.6, 110.7, 104.6, 104.3, 103.0, 98.3, 93.9, 82.3, 81.9, 81.5, 77.9, 77.8, 76.8, 76.6, 75.9, 75.2, 74.8, 74.4, 74.2, 73.6, 71.7, 71.6, 67.9, 67.0, 63.8, 62.8, 62.5, 62.4, 62.3, 57.9, 51.8, 43.0, 41.5, 41.0, 40.3, 38.5, 38.2, 33.3, 32.9, 32.8, 32.6, 31.5, 30.0, 29.6, 26.9, 22.1, 20.0, 17.6, 16.9, 15.5, 15.1; HRMS ( FAB ⁺ ): calcd. for C₅₆H₉₂O₂₅ [M+Na]⁺ 1187.5825, observed 1187.5831.

< 실험예 1> GDNs , SPSs , SPS - Ls 및 SMAs 의 특성

상기 실시예 1 내지 3의 합성 방법에 따라 합성된 제조예 1 내지 19의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs 의 특성을 확인하기 위하여, GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs 의 분자량(M.W.), 임계미셀농도(critical micellar concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; R _h)을 측정하였다.

구체적으로, 임계미셀농도(CMC)는 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제(1.0 wt%)에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(R _h)은 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자(detergent)인 DDM과 비교하여 표 1에 나타내었다.

	MW	CMC (μM)	CMC (wt%)	R_h (nm)^a
GDN-1	1081.2	~ 330	~0.036	5.4±0.2
GDN-2	1081.2	~ 270	~0.029	6.3±0.5
SPS-1	1199.4	~2	~0.0002	3.4±0.1
SPS-2	1197.4	~3	~0.0003	3.4±0.2
SPS-3	1225.4	~2	~0.0002	3.5±0.1
SPS-4	1225.3	~150	~0.018	3.1±0.2
SPS-1L	1257.5	~1	~0.0001	4.1±0.1
SPS-2L	1255.5	~3	~0.0004	4.9±0.1
SPS-3L	1283.5	~0.8	~0.0001	4.9±0.1
SPS-4L	1283.4	~200	~0.026	3.9±0.0
GDN	1165.3	~18	~0.0021	3.9±0.1
SMA-A1	1111.32	~4	~0.0004	3.8±0.06
SMA-A2	1125.35	~2	~0.0002	4.0±0.15
SMA-A3	1139.38	~0.8	~0.00009	5.7±0.16
SMA-E1	1109.31	~2	~0.0002	4.3±0.19
SMA-E3	1137.36	~0.7	~0.00008	6.5±0.12
SMA-D1	1137.27	~20	~0.0023	3.9±0.14
SMA-D2	1151.30	~12	~0.0014	3.9±0.12
SMA-D3	1165.33	~4	~0.0005	4.2±0.04
DDM	510.62	~170	~0.0087	3.4±0.03

^a Molecular weight of detergents. ^b Detergent hydrodynamic radius measured at 0.5 wt% detergent concentration by dynamic light scattering (DLS).

대부분의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 SMAs의 CMC 값 (0.0008 내지 0.33 mM)은 DDM의 CMC 값 (0.17 mM)과 비교하여 상당히 작았다. 따라서, GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 SMAs는 낮은 농도에서도 미셀이 용이하게 형성되므로, DDM 보다 적은 양을 사용하고도 동일하거나 우월한 효과를 나타낼 수 있다.

한편, DLS를 통해 GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 SMAs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포를 조사한 결과, GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 SMAs는 오직 하나의 군집의 미셀을 나타내었으므로, 이는 미셀 균질성이 높음을 나타낸다 (도 4 내지 6).

이러한 결과로부터 본 발명의 대부분의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 SMAs는 DDM보다 낮은 CMC 값을 가져 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로 자가조립경향성이 DDM 보다 훨씬 크다는 점, 상기 화합물에 의해 형성된 미셀은 균질성이 높다는 점을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2> GDNs , SPSs , SPS - Ls 및 SMAs 의 LeuT 막단백질 구조 안정화 능력 평가

호열성 박테리아 아퀴펙스 아에오리쿠스(Aquifex aeolicus) 유래 와일드 타입 LeuT (leucine transporter)를 이전에 설명된 방법에 의해 정제하였다 (G. Deckert 등의 Nature 1998, 392, 353-358). LeuT를 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41 (DE3)에서 발현시켰다 (발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA로부터 제공받음). 요약하면, 박테리아 멤브레인의 분리 및 1% (w/v) DDM에서 용해화 후에, 단백질을 Ni² ⁺-NTA 수지 (Life Technologies, Denmark)에 결합시키고, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05%(w/v) DDM 및 300 mM 이미다졸(imidazole)에서 용리하였다. 그 후에, 정제된 LeuT (약 1.5 mg/ml)는 상기와 동등한 버퍼에서 DDM 및 이미다졸을 제외하고, DDM (control), GDNs(GDN, GDN-1, 또는 GDN-2), SPSs(SPS-1, SPS-2, SPS-3 또는 SPS-4), SPS-Ls(SPS-1L, SPS-2L, SPS-3L 또는 SPS-4L) 또는 SMAs(SMA-As, SMA-Es 또는 SMA-Ds)이 최종 농도 CMC + 0.04 wt%로 보충된 버퍼로 10배 희석하였다. 단백질 샘플은 상온에서 10일 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 동안 일정한 간격으로 원심분리하고, 단백질 특성을 SPA를 사용하여 [³H]-Leucine 결합 능력을 측정함에 의하여 확인하였다. SPA는 450 mM NaCl 및 GDNs, SPSs 또는 SPS-Ls (또는 DDM)을 함유하는 상기 언급한 농도의 버퍼에서 5 μL 의 단백질 샘플로 수행하였다. SPA 반응은 20 nM [³H]-Leucine 및 1.25 mg/ml copper chelate (His-Tag) YSi beads (Perkin Elmer, Denmark)의 존재하에 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 전체 [³H]-Leucine 결합도는 MicroBeta liquid scintillation counter (Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다.

도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, DDM에 용해된 LeuT의 초기 기질 결합 활성은 본 발명의 다른 양친매성 화합물과 비교하여 우수하지만, 시간이 지남에 따라 급격히 활성이 떨어짐을 확인할 수 있었다. 장기간 기질 결합 활성을 비교한 결과, SMA-A3 및 SMA-D3을 제외한 대부분의 SMAs는 12일이상의 인큐베이션 기간 동안 LeuT의 기질 결합 특성을 유지하는 효과가 DDM보다 현저히 우수함을 확인하였다.

< 실험예 3> GDNs , SPSs , SPS - Ls 및 SMAs의

₂ AR 막단백질 구조 안정화 능력 평가

GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs에 의한 인간

₂ 아드레날린성 수용체 (

₂AR), G-단백질 연결 수용체(GPCR) 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. 즉, DDM으로 정제된 수용체는 CHS (cholesteryl hemisuccinate) 없이 각각의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs만을 함유하는 버퍼 용액 또는 CHS와 DDM을 함유하는 버퍼 용액으로 희석시켰다. 최종 화합물 농도는 CMC+0.2 wt%이었으며, 수용체의 리간드 결합 특성은 [³H]-디하이드로알프레놀올 ([³H]-DHA)의 결합에 의해 측정하였다.

구체적으로, 방사성 리간드 결합 시험은 다음과 같은 방법을 이용하였다.

₂AR는 0.1% DDM을 사용하여 정제하였으며 (D. M. Rosenbaum 등, Science, 2007, 318, 1266-1273.), 약 10 mg/ml (약 200 μM)로 최종 농축하였다. DDM으로 정제된

₂AR를 사용하여 0.2% 양친매성 화합물 (DDM, GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs)에서 0.5 mg/ml BSA로 보충된 10 nM [³H]-Dihydroalprenolol (DHA)를 함유하는 마스터 결합 혼합물을 제조하였다. DDM, GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs로 정제된 수용체는 상온에서 30분 동안 10 nM의 [³H]-DHA와 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 G-50 컬럼에 로딩하고, 통과액을 1 ml 바인딩 버퍼 (0.5 mg/ml BSA로 보충된 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl)로 수집하고, 그리고 15 ml 섬광 유체(scintillation fluid)로 채웠다. 수용체-결합된 [³H]-DHA는 섬광 카운터 (Beckman)로 측정했다. [³H]-DHA의 결합도는 컬럼 그래프로 나타내었다.

도 10 및 11에 나타난 바와 같이, 수용체의 리간드 결합 특성을 유지하는 데 있어서 대부분의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs는 초기 활성면에서 DDM과 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다. 5일간 장기간 수용체 리간드 결합 특성에 있어서는 GDNs 및 SPS-Ls은 DDM 보다 현저히 우수한 효과를 나타내었으며, 특히 SPS-1L의 효과가 우수함을 확인하였다.

< 실시예 4> GDNs , SPSs , SPS - Ls 및 SMAs의 MelB _st 막단백질 구조 안정화 능력 평가

GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs에 의한 MelB_St (Salmonella typhimurium melibiose permease) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다.

구체적으로, 플라스미드 pK95△AHB/WT MelBSt/CH10를 사용하여 C-말단에 10-His tag를 가지는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 유래 와일드 타입 MelBSt (melibiose permease)를 E. coli DW2 균주 (△melB및 △lacZY)에서 발현시켰다. A. S. Ethayathulla 등의 논문 (Nat. Commun. 2014, 5,　3009)에 기재된 방법에 따라 세포 성장 및 멤브레인 준비를 수행했다. 단백질 검정은 Micro BCA 키트(Thermo Scientific, Rockford, IL)로 수행했다. 용해화 버퍼 (50 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM melibiose)에서 MelB_St를 함유하는 멤브레인 샘플(최종 단백질 농도는 10 mg/mL^- ¹)을 1.5 wt% DDM, GDNs, SPSs, SPS-Ls 또는 SMAs와 혼합하였다. 생성된 샘플을 23°C에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 불용성 물질을 제거하기 위하여, 30분 동안 4℃에서 TLA-100 rotor가 구비된 Beckman Optima? MAX 초원심분리기로 355,590g에서 초원심분리를 수행하였다. 초원심분리하지 않은 멤브레인 단백질 20 μg을 미처리된 멤브레인 또는 초원심분리 후 동량의 상기 화합물들의 추출물에 적용하고, 처리된 샘플은 동등 부피로 각각의 웰에 로딩하였다. 로딩된 샘플을 SDS-15% PAGE로 분석하고, 그 다음 Penta-His-HRP 항체 (Qiagen, Germantown, MD)로 면역블로팅하여 시각화하였다. 신규 양친매성 화합물에서 MelB_St의 열 안정성을 평가하기 위해 개별 화합물로 23 ℃에서 추출한 멤브레인 추출물을 3 가지 다른 온도 (65, 70 및 75 ℃)에서 추가로 90 분 동안 열처리하고 초원심분리 후 SDS-15 % PAGE 및 및 Western blotting으로 분석하였다. MelB_St는 ImageQuant LAS 4000 Biomolecular Imager (GE Healthcare Life Science)에 의해 SuperSignal West Pico 화학 발광 기질을 사용하여 검출하였다.

도 12 내지 14에 나타난 결과와 같이, 23℃의 비교적 낮은 온도에서는 DDM이 다른 신규 화합물보다 유사하거나 우수한 효과를 나타내지만, 65℃이상의 고온에서 대부분의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs가 DDM보다 우수한 MelB_st 가용화 능력을 나타내었다.

특히, 높은 온도(55℃ 이상)에서는 DDM가 MelB_st 을 전혀 가용화하지 못하는 반면에, 대부분의 GDNs, SPSs, SPS-Ls 및 SMAs는 55℃ 이상에서도 MelB_st 가용화 능력을 유지함을 확인하였다..

추가로, SPS-3 및 SPS-3L은 DDM과 비교하여, MelB_St 뿐만 아니라, 이보다 안정성이 떨어지는 상동체인 MelB_Ec에 대해서도 단백질의 가용 능력 및 상기 막단백질의 기능을 유지하는 능력이 우수함을 확인하였다 (도 12(b)).

Claims

하기 화학식 1 내지 화학식 3 중 어느 하나의 화학식으로 표시되는 화합물:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1 및 2에서,
상기 화학식 내의 점선은 단일결합 또는 이중결합을 표시하고;
상기 L¹ 은 직접결합,
또는
이며, 여기서, 상기 *는 스테로이드 화합물과의 결합위치를 나타내고, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이고, 및 상기 X⁴는 산소와 연결된 말토오스이며;
상기 X²및 X³은 각각 독립적으로 수소 또는 산소와 연결된 말토오스이고; 그리고
상기 X¹은 산소와 연결된 말토오스 또는 산소와 연결된 글루코즈 중심의 가지친(branched) 오당류(pentasaccharide)이고,
상기 화학식 3에서,
상기 화학식 내의 점선은 단일결합을 표시하고;
상기 L¹ 은 직접결합이며;
상기 X²및 X³은 각각 독립적으로 수소 또는 산소와 연결된 말토오스이고; 그리고
상기 X¹은 산소와 연결된 말토오스이다.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 화학식 1 및 화학식 2에서, 상기 L¹ 은
이고; 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며; 및 상기 X²및 X³은 수소인 화합물.
제 1항에 있어서, 화학식 1 및 화학식 2에서, 상기 L¹ 은
이고; 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며; 및 상기 X⁴는 산소와 연결된 말토오스이며; 및 상기 X²및 X³은 수소인 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 4 내지 9, 11 내지 13, 및 15 내지 19 중 하나인 화합물:
[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

[화학식 18]

[화학식 19]

.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001 내지 1 mM인 화합물.
제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 용해화용 조성물.
제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 추출용 조성물.
제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 안정화용 조성물.
제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 결정화용 조성물.
제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 분석용 조성물.
제 9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것인 조성물.
제 9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막단백질은 LeuT (Leucine transporter), β₂AR (human β₂ adrenergic receptor), MelB_st(melibiose permease) 또는 이들의 2 이상의 조합인 조성물.
1) 티코제닌(ticogenin) 또는 디오스제닌(diosgenin)의 스테로이드의 2번 및 3번 탄소에 시스(cis) 또는 트랜스(tans) 하이드록시를 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 3]

상기 화학식 3에서,
상기 화학식 내의 점선은 단일결합을 표시하고;
상기 L¹ 은 직접결합이며;
상기 X¹및 X²은 산소와 연결된 말토오스이고; 및
X³은 수소이다.
1) 티코제닌(ticogenin) 또는 디오스제닌(diosgenin)의 스테로이드의 3번 및 6번 탄소에 하이드록시를 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 3]

상기 화학식 3에서,
상기 화학식 내의 점선은 단일결합을 표시하고;
상기 L¹ 은 직접결합이며;
상기 X¹및 X³은 산소와 연결된 말토오스이고; 및
X²는 수소이다.
1) 콜레스테롤(Cholesterol), 콜레스탄올(Cholestanol) 또는 시토스테롤(Sitosterol)의 스테로이드의 3번 탄소의 하이드록시에 치환 또는 비치환된 알킬렌기 링커를 도입하거나 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 알킬렌기 링커가 도입된 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 글리코실레이션 생성물 또는 단계 2)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계; 를 포함하는, 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에서,
상기 L¹ 은 직접결합,
또는
이고, 여기서 상기 *는 스테로이드 화합물과 결합하는 지점을 나타내고, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이고, 및 상기 X⁴는 산소와 연결된 말토오스이며;
상기 X²및 X³은 수소이고; 그리고
상기 X¹은 산소와 연결된 말토오스 또는 산소와 연결된 글루코스 중심의 가지친 오당류이다.