KR102151203B1

KR102151203B1 - 세포 배양용 지지체 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR102151203B1
Application number: KR1020190170537A
Authority: KR
Inventors: 이희재; 금준호; 장하림; 김민영; 송상현; 정태근
Original assignee: 주식회사 씨위드
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-09-02
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: US12448596B2; US20230014960A1; EP4079838A4; WO2021125529A1; EP4079838A1

Abstract

본 발명은 세포 배양용 지지체에 대한 것으로 해조류의 탈세포화를 통해 추출한 알지네이트(alginate)와 셀룰로오스(cellulose)로 복합 조성된 하이드로젤 구조를 가지며 제조가 간단하면서도 저비용으로도 세포를 안정적으로 성장시킬 수 있는 세포 배양용 지지체가 제공된다.

Description

세포 배양용 지지체 및 그 제조 방법{SCAFFOLD FOR CELL CULTURE AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 세포 배양용 지지체 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 세포가 성장하는데 있어서 지지 역할이 가능한 세포 배양용 지지체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

생명과학에서 가장 기본적으로 수행하는 세포 배양은 세포 간의 신호전달, 세포분화 등에 대한 연구의 기본 바탕으로서 생명체에 대한 이해뿐 아니라 질병을 정복하기 위한 실험을 위해 필수적인 부분이다. 요즈음 세포 배양은 이와 같은 생명체의 기능이나 인체 질환을 위한 연구범위에서 확장되어 식용 가능한 세포를 성장하는데 까지 매우 광범위하게 이용되고 있다.

세포 배양을 통해 세포가 성장하기 위해서는 기본적으로 세포가 안정적으로 안착될 수 있는 영역이 필요하며 폴리스티렌(polystyrene) 혹은 유리(glass)로 조성된 2차원 페트리 디쉬(petri dish)를 사용하는 것이 일반적이다.

하지만, 2차원으로 성장한 세포의 경우 실질적으로 생체 조직과 매우 다르다는 근본적인 이유로 인하여 최근에는 세포를 3차원인 매스(mass) 형태로 성장시키기 위한 요구가 많아짐에 따라 3차원 세포 배양용 지지체에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

3차원 세포 배양용 지지체는 생체적합성, 생체활성, 생체역학성 등의 기본적 요건을 갖추어야 한다. 즉, 세포 배양용 지지체와 세포가 접착이 잘 일어나야 하고, 세포 배양용 지지체가 세포의 성장을 충분히 지지해야 하고, 세포 배양용 지지체에 의한 산소와 영양분 공급에 제한이 없어야 하며, 세포 배양용 지지체가 노폐물을 배출하기 위한 열린 구조를 가지는 것을 기본적 요건으로 한다.

이러한 기본적 요건을 만족하는 세포 배양용 지지체를 제조하는 방법으로는 입자 침출법 (particulate leaching), 유화동결 건조법(emulsion freeze-drying), 고압기체 팽창법(high pressure gas expansion), 상분리법(phase separation), 전기방사법(electrospining)이 있다.

이렇게 제조된 세포 배양용 지지체는 인공적으로 합성된 폴리머를 주된 성분으로 하여 하이드로젤 형태로 시중에 판매되고 있다. 하지만, 비교적 고가의 세포 배양용 지지체는 이를 필수로 사용해야 하는 연구소나 해당 분야에서 경제적인 부담 요인이 될 수밖에 없기 때문에 매우 제한적으로 사용되고 있다.

현재 세포 배양용 지지체의 이용 분야는 생명과학을 연구하는 전문 실험실을 넘어 푸드테크(Foodtech) 즉, 동물의 희생없이 세포 배양을 통해 성장된 배양육(cultured-meat)을 만드는 분야에 까지 활용되고 있는 상황이다. 특히, 이러한 푸드테크 기술은 가축 사육 과정에서 발생하는 환경 오염과 동물 희생에 따른 윤리 문제를 해결할 근미래의 식량 기술인 바 푸드테크 기술의 기본 초석이 될 세포 배양용 지지체는 세포의 성장 환경 개선 및 제조 단가 절감을 위해 지속적으로 연구개발이 필요한 분야이다.

따라서, 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로 본 발명은 해조류의 탈세포화를 통해 추출한 복합 소재를 이용하여 3차원 세포 성장이 가능한 세포 배양용 지지체 및 그 제조 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 해결과제는 이상에서 언급한 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적들 및 다른 특징들을 달성하기 위한 본 발명의 일 관점에 따르면, 해조류의 탈세포화를 통해 추출한 알지네이트(alginate)와 셀룰로오스(cellulose)로 복합 조성된 하이드로젤 구조를 가지는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 해조류는 미역, 다시마, 파래, 톳, 말, 풀가사리 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 본 발명의 목적들 및 다른 특징들을 달성하기 위한 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 처리대상 해조류를 전처리하는 단계; 전처리된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계; 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계; 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS(phosphate buffered saline)로 워싱하는 단계; 상기 워싱된 수질부를 젤화하는 단계; 및 상기 젤화된 수질부를 동결 건조하여 세포 배양용 지지체를 형성하는 단계를 포함하는 세포 배양용 지지체 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 전처리하는 단계는 1~3%(w/v)의 염화나트륨(NaCl)을 증류수에 녹여 전처리용액을 생성하는 단계; 상기 해조류를 전처리용액에 침지하고 오존 처리하는 단계; 및 상기 해조류를 예정된 크기로 절단하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 상기 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계의 수용액 농도는 1~5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 상기 젤화 단계는 상기 워싱된 수질부를 0.5~10%(w/v)의 염화칼슘(CaCl₂) 수용액에 침지하는 단계; 상기 침지하는 단계에서 예정된 시간 이후 PBS로 워싱하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 상기 침지하는 단계와 상기 워싱하는 단계를 적어도 2번 이상 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 상기 동결 건조가 완료된 상기 지지체를 멸균하는 단계; 및 상기 지지체를 예정된 형태로 제작하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 본 발명의 목적들 및 다른 특징들을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 세포 배양용 지지체를 마련하는 단계; 상기 세포 배양용 지지체 상부에 시드 세포액을 살포하는 단계; 및 상기 시드 세포액에　포함된　시드　세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양용 지지체를 이용한 세포 배양 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 살포하는 단계에서 살포되는 상기 시드 세포액에　포함된　시드　세포는 1*10⁶~1*10⁸ cells/mL를　포함하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 세포 배양용 지지체 및 그 제조 방법은 다음과 같은 효과를 제공한다.

본 발명은 해조류가 주 성분으로 조성된 세포 배양용 지지체를 통해 다양한 세포가 안정적으로 성장할 수 있는 최적의 환경을 조성해 줄 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 식용 가능한 세포를 배양하여 최종적으로 취식자가 섭취하는 단계에서 세포 배양용 지지체를 제거하지 않고 성장이 완료된 세포와 함께 섭취가 가능하기 때문에 세포 배양용 지지체에 대한 제거 공정에 소모되는 비용을 없애줄 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 해조류를 이용한 탈세포화 공정을 통해 세포 배양용 지지체를 제조하는 것이 가능하기 때문에 세포 배양용 지지체의 생산 단가를 대폭 줄여 가격 경쟁력을 높여 줄 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1 은 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체의 제조 방법을 설명하기 위한 공정 순서도.
도 2 는 도 1 의 절단 단계를 거친 미역 개체 사진.
도 3a 및 도 3b 는 도 1 의 SDS 처리 단계 전후의 현미경 사진.
도 4 는 피질부가 분리된 수질부의 현미경 사진.
도 5 는 도 1 의 PBS 워싱 중인 미역 개체의 수질부 사진.
도 6a 및 도 6b 는 도 1 의 젤화 단계 전후의 수질부 사진.
도 7a 및 도 7b 는 도 1 의 제조 방법을 통해 생성된 세포 배양용 지지체를 조성하는 알지네이트와 셀룰로오스로 복합 조성된 하이드로젤 구조를 설명하기 위한 개략도.
도 8 은 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체에서 배양되는 시드 세포의 성장 단계를 설명하기 위한 도면.

본 발명에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시예에 불과하므로, 본 발명의 권리범위는 본문에 설명된 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 제시된 목적 또는 효과는 특정 실시예가 이를 전부 포함하여야 한다거나 그러한 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 본 발명의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.

이하, 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체를 설명하기로 한다.

본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체는 해조류의 탈세포화를 통해 추출한 알지네이트(alginate)와 셀룰로오스(cellulose)로 복합 조성된 하이드로젤 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.

해조류에는 알지네이트와 셀룰로오스가 서로 얽혀 반-젤(half-gel) 상태를 유지하며, 이후 다시 설명하겠지만, 셀룰로오스는 치밀한 그물망 구조를 가지며 알지네이트는 점성의 분자를 가지기 때문에 식물성 세포와 동물성 세포가 성장할 수 있는 최적의 환경을 제공한다. 또한, 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체 제조 방법으로 제조된 하이드로젤 구조는 고체상(solid phase)을 가지기 때문에 기존의 젤 상태의 다른 기재보다 생산자가 원하는 형태로 변형이 용이하여 세포 성장에 필요한 형태로 가공 및 상품화에 매우 적합하다.

도 1 은 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체의 제조 방법을 설명하기 위한 공정 순서도이다.

설명에 앞서, 본 발명의 실시예에 따른 해조류는 미역, 다시마, 파래, 톳, 말, 풀가사리 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 이하, 설명의 편의를 위하여 미역의 탈세포화를 통해 세포외기질을 추출하여 세포 배양용 지지체를 제조하는 것을 일례로 한다.

도 1 을 참조하면, 세포 배양용 지지체의 제조 방법은 해조류 전처리 단계(S100), SDS 처리 단계(S200), 피질부 분리 단계(S300), PBS 워싱 단계(S400), 젤화 단계(S500), 동결 건조 단계(S600), 멸균 단계(S700), 제작 단계(S800)를 포함한다.

우선, 해조류 전처리 단계(S100)는 처리 대상인 미역 개체의 탈세포화 공정을 유도하기 위한 전처리 공정으로서 전처리용액 생성 단계(S110), 오존 처리 단계(S120), 절단 단계(S130)를 포함한다.

여기서, 전처리용액 생성 단계(S110)는 미역 개체의 조직을 적절히 팽윤시키기 위한 전처리용액을 생성하는 공정이다. 전처리용액은 1~3%(w/v)의 염화나트륨(NaCl)을 증류수에 녹여 생성하며, 바람직하게는 염화나트륨의 농도가 1~2%(w/v)인 전처리용액을 만들어 사용한다.

만약, 염화나트륨(NaCl)의 농도가 너무 높으면 삼투압으로 인하여 침지된 미역 개체의 조직이 너무 팽윤되기 때문에 미역 개체에 손상이 일어나며, 염화나트륨(NaCl)의 농도가 너무 낮으면 침지된 미역 개체가 충분히 팽윤되지 않거나 미역 개체의 층 구조를 분리하기 위한 후 공정이 불가능하다.

오존 처리 단계(S120)는 미역 개체를 전처리용액에 침지하고, 오존 처리를 하는 공정이다. 이때, 미역 개체는 오존에 1분~1분 30초 가량 조사되며 이러한 공정을 통해 미역 개체 표면에 존재하는 미생물에 대한 살균이 이루어 진다.

절단 단계(S130)는 미역 개체를 예정된 크기로 절단하는 공정이다. 절단 단계(S130)를 통해 미역 개체는 도 2 와 같이 예컨대, 예정된 크기의 사각형이나 원형 모양을 가질 수 있으며, 절단되는 미역 개체의 크기와 형태는 최종적으로 제조되는 세포 배양용 지지체의 목적에 따라 달라질 수 있다.

다시 도 1을 참조하면, 음이온성 세정제인 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 처리 단계(S200)는 해조류 전처리 단계(S100)에서 전처리된 미역 개체를 SDS 수용액에 침지하는 공정이다. 사용하는 SDS 수용액의 농도는 통상적으로 1~5%(w/v) 범위를 유지하며, 미역 개체를 침지하는 경우에는 바람직하게는 1~2%(w/v)의 농도인 SDS 수용액을 사용한다. 상기 SDS 세정제외에도 Triton X-100, PEG(polyethylene glycol) 등의 음이온성 세정제 중 어느 하나로 처리하는 것도 가능하다.

여기서, 도 3a 는 미역 개체를 SDS 수용액에 침지하기 전의 현미경 사진이며, 도 3b 는 미역 개체를 SDS 수용액에 침지한 후의 현미경 사진이다. 도 3a 및 도 3b 에서 볼 수 있듯이 미역 개체의 피질(cortex) 조직은 SDS의 처리 전후와 비교하여 견고함이 무너진 것을 볼 수 있다.

다시 도 1 을 참조하면, 피질부 분리 단계(S300)는 음이온성 세정제로 처리 후 미역 개체의 피질부(cortex layer)를 분리하기 위한 공정이다. 피질 분리 단계(S300)는 미역 개체가 침지된 SDS 수용액을 15~30분간 천천히 흔들면서 진행되며, 이러한 과정을 통해 미역 개체에 치밀하게 배열된 피질부와 느슨한 셀룰로오스 구조의 수질부(medullar layer)가 서로 분리된다.

도 4 는 피질부가 분리된 수질부의 현미경 사진이다. 이후 다시 설명하겠지만, 이 수질부는 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체의 하이드로젤 구조의 기초가 된다.

다시 도 1 을 참조하면, PBS(phosphate buffered saline) 워싱 단계(S400)는 피질부 분리 단계(S300)에서 피질부를 제거하고 남은 수질부를 PBS로 워싱(washing)하는 공정이다. 그리고 도 5 는 PBS 워싱 중인 미역 개체의 수질부이다.

다시 도 1 을 참조하면, 젤화 단계(S500)는 PBS 워싱 단계(S400)에서 워싱된 수질부를 젤화시키기 위한 공정으로서 침지 단계(S510), 워싱 단계(S520)를 포함한다.

여기서, 침지 단계(S510)는 수질부를 염화칼슘(CaCl₂) 수용액에 침지하는 공정이다. 수용액의 염화칼슘(CaCl₂) 농도는 0.5~10%(w/v) 범위가 바람직하고, 침지 시간은 1~10분 정도가 적당하다. 3차원 세포 지지체의 종류 및 배양되는 세포의 종류에 따라 처리 농도와 처리 시간은 달라질 수 있다.

이 과정을 통해 수용액 상의 Ca²⁺ 양이온은 알지네이트의 가교(cross-linking)에 사용되며, 가교 정도에 따라 젤의 강성도(stiffness)가 달라지게 된다.

이어서, 워싱 단계(520)는 침지 단계(S510)에서 예정된 시간이 지난 다음 침지된 수질부를 꺼내어 PBS로 워싱하는 공정이다.

젤화 단계(S500)와 관련하여 침지 단계(S510)과 워싱 단계(S520) 이후 수질부는 도 6a 와 같이 투명한 젤 상태가 되며, 침지 단계(S510)와 워싱 단계(S520)를 다시 반복하게 되면 수질부에 불투명한 피막이 벗겨져 투명한 구조체가 되고 최종적으로 젤화가 완성되면 도 6b 와 같은 모양을 띄게 된다.

다시 도 1 을 참조하면, 동결 건조 단계(S600)는 젤화 단계(S500)에서 젤화된 수질부를 동결 건조하는 공정으로서, 젤화된 수질부는 통상의 동결건조기를 이용하여 1일 정도 동결 건조되어 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체의 기본 타입인 지지체로 완성된다.

이렇게 완성된 지지체는 추가적으로 멸균 단계(S700)와 제작 단계(S800)를 거친다. 여기서, 멸균 단계(S700)는 동결건조된 지지체를 과산화수소(H2O2)를 이용한 증기멸균 또는 UV 살균을 통해 지지체를 멸균하는 공정이고, 제작 단계(S800)는 이렇게 멸균된 지지체를 세포배양에 적합한 형태로 변형하는 공정이다. 이 때 형태는 원형, 사각형 등 다양한 형태로 만들 수 있다.

결국, 상술한 제조 방법을 통해 원하는 형태의 세포 배양용 지지체를 얻는 것이 가능하다.

한편, 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체는 관절혈관그물(vascular network)을 모사할 수 있기 때문에 3차원 조직체의 크기가 커지더라도 저산소(hypoxia)에 따른 문제가 발생하지 않는다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체는 간단한 탈세포화 공정만으로도 알지네이트와 셀룰로오스로 복합 조성된 하이드로젤 구조를 가지는 것이 가능하다.

도 7a 및 도 7b 는 도 1 의 제조 방법을 통해 생성된 세포 배양용 지지체를 조성하는 알지네이트와 셀룰로오스로 복합 조성된 하이드로젤 구조를 설명하기 위한 개략도이다.

여기서, 도 7a 는 알지네이트와 셀룰로오스로 복합 조성된 하이드로젤 구조의 기본적 형태이며, 도 7b 는 알지네이트와 셀룰로오스로 복합 조성된 하이드로젤 구조에 인장력을 가한 경우의 형태이다.

도 7a 에서 볼 수 있듯이 알지네이트와 셀룰로오스로 복합 조성된 하이드로젤 구조는 그물망 구조를 가지고 있기 때문에 상대적으로 질기고 단단한 물리적 특성을 가지고 있으며, 도 7b 와 같이 물리적 인장력을 인가하더라도 그물망의 결속이 쉽게 해제되지 않는다.

특히, 도 7b 와 같이 물리적 인장력이 가해진 알지네이트와 셀룰로오스로 복합 조성된 하이드로젤은 한 방향으로 정렬이 이루어지기 때문에 이후 여기에 살포될 세포들의 정렬이 가능하고 이는 예컨대, 근육과 같은 특정 세포종의 기능적 분화(differentiation)에 도움을 준다. 그리고 이는 성장이 완료된 배양육의 식감을 높일 수 있는 요인이 된다.

한편, 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체는 상부에 시드 세포가 들어있는 시드 세포액를 살포하여 시드 세포를 배양하는 지지체로 사용하는 것이 가능하다. 이때, 시드 세포액에　포함된　시드　세포는 1*10⁶~1*10⁸ cells/mL　이상이며，이는 성장이 완료된 세포의 사용 목적에 따라 달라질 수 있다.

이어서，　이렇게　살포된　시드　세포는　모세관　현상으로　인하여　알지네이트와　셀룰로오스로 복합 조성된 하이드로젤의　공극　사이로　자연스럽게　침투하는　것이　가능하다．

도 8 은 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체에서 배양되는 시드 세포의 성장 단계를 설명하기 위한 도면이다.

도 8 을 참조하면, 세포 배양용 지지체에 살포된 시드 세포는 1일차, 4일차, 18일차, 30일차 순으로 세포 배양용 지지체와 완전히 융화되어 조직체의 크기가 점점 커지는 것을 알 수 있으며, 30일차에는 근육다발이 분화되는 것도 볼 수 있다(화살표).

결론적으로, 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체는 해조류의 탈세포화 공정을 통해 추출한 알지네이트(alginate)와 셀룰로오스(cellulose)의 복합체로 구현이 가능하며, 이렇게 구현된 저비용의 세포 배양용 지지체를 통해 다양한 세포를 안정적으로 성장시키는 것이 가능하다.

또한, 이 세포 배양용 지지체에서 동물성 식용 세포를 배양하는 경우 소비자는 성장이 완료된 배양육을 섭취하는데 있어서 세포 배양용 지지체의 제거 없이 배양육과 세포 배양용 지지체를 함께 섭취하는 것이 가능하다. 이는 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 지지체의 조성물이 식용 가능한 해조류를 기반으로 하기 때문이다. 따라서, 식용 세포를 배양하여 완제품을 생산하는 측면에서 세포 배양용 지지체에 대한 제거 공정을 배제할 수 있고 이는 그만큼 생산 단가를 줄여 줄 수 있음을 의미한다.

본 명세서에서 설명되는 실시 예와 첨부된 도면은 본 발명에 포함되는 기술적 사상의 일부를 예시적으로 설명하는 것에 불과하다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시 예는 본 발명의 기술적 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이므로, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아님은 자명하다. 본 발명의 명세서 및 도면에 포함된 기술적 사상의 범위 내에서 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 변형 예와 구체적인 실시 예는 모두 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

100 : 해조류 전처리 단계 200 : SDS 처리 단계
300 : 피질부 분리 단계 400 : PBS 워싱 단계
500 : 젤화 단계 600 : 동결 건조 단계
700 : 멸균 단계 800 : 제작 단계

Claims

피질부와 분리된 해조류 수질부의 탈세포화를 통해 세포성분이 제거되고 남겨진 알지네이트(alginate)와 셀룰로오스(cellulose)를 포함하는 하이드로젤 구조를 가지고,
취식자가 섭취가능하며,
상기 해조류는 미역, 다시마, 톳 중 적어도 어느 하나를 포함하는, 세포 배양용 지지체.
제1항에 있어서,
상기 해조류는 미역인 세포 배양용 지지체.
1~3%(w/v)의 염화나트륨(NaCl)을 증류수에 녹여 전처리용액을 생성하는 단계;
처리대상 해조류를 상기 전처리용액에 침지하고 오존 처리하는 단계;
상기 오존 처리된 해조류를 예정된 크기로 절단하여 전처리하는 단계;
상기 전처리된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS(phosphate buffered saline)로 워싱하는 단계;
상기 워싱된 수질부를 젤화하는 단계; 및
상기 젤화된 수질부를 동결 건조하여 세포 배양용 지지체를 형성하는 단계를 포함하는
제1항 또는 제2항의 세포 배양용 지지체 제조 방법.
삭제
제3항에 있어서,
상기 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계의 수용액 농도는 1~5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체 제조 방법.
제3항에 있어서,
상기 젤화하는 단계는
상기 워싱된 수질부를 0.5~10%(w/v)의 염화칼슘(CaCl₂) 수용액에 침지하는 단계;
상기 염화칼슘 수용액에 침지하는 단계에서 예정된 시간 이후 PBS로 워싱하는 단계를 포함하는
세포 배양용 지지체 제조 방법.
제6항에 있어서,
상기 염화칼슘 수용액에 침지하는 단계와 상기 PBS로 워싱하는 단계를 적어도 2번 이상 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체 제조 방법.
제3항에 있어서,
상기 동결 건조가 완료된 상기 지지체를 멸균하는 단계; 및
상기 지지체를 예정된 형태로 제작하는 단계를 더 포함하는
세포 배양용 지지체 제조 방법.
제3항에 있어서,
상기 해조류는 미역, 다시마, 파래, 톳, 말, 풀가사리 중 적어도 어느 하나를 포함하는 세포 배양용 지지체 제조 방법.
제1항 또는 제2항의 세포 배양용 지지체를 마련하는 단계;
상기 세포 배양용 지지체 상부에 시드 세포액을 살포하는 단계; 및
상기 시드 세포액에　포함된　시드　세포를 배양하는 단계를 포함하는
세포 배양용 지지체를 이용한 세포 배양 방법.
제10항에 있어서,
상기 살포하는 단계에서 살포되는 상기 시드 세포액에　포함된　시드　세포는 1*10⁶~1*10⁸ cells/mL를　포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체를 이용한 세포 배양 방법.