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KR102126951B1 - 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법 - Google Patents

디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법 Download PDF

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KR102126951B1
KR102126951B1 KR1020190119159A KR20190119159A KR102126951B1 KR 102126951 B1 KR102126951 B1 KR 102126951B1 KR 1020190119159 A KR1020190119159 A KR 1020190119159A KR 20190119159 A KR20190119159 A KR 20190119159A KR 102126951 B1 KR102126951 B1 KR 102126951B1
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권수연
이임상
손승주
이광우
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씨제이제일제당 주식회사
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Abstract

본 출원은 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 활성이 약화된 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법{A modified polypeptide of dihydrodipicolinate reductase and a method for L- threonine using the same}
본 출원은 디하이드로디피콜린산 리덕타제 (dihydrodipicolinate reductase) 활성이 약화된 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌(threonine)을 생산하는 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 속(the genus Corynebacterium) 미생물, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 L-라이신 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다 (대한민국 등록특허 제10-0838038호).
한편, L-아미노산 중에서 L-라이신, L-트레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글리신은 아스파테이트 유래 아미노산이며, 아스파테이트로부터 L-라이신 및 기타 아스파테이트 유래 아미노산으로의 생합성 분지(branch)에 작용하는 공통 전구체인 아스파틸 세미알데하이드(Aspartyl semialdehyde)를 호모세린(homoserine)으로 효과적으로 전환시켜 주는 것이 L-쓰레오닌의 합성 수준에 영향을 미칠 수 있다.
디하이드로디피콜린산 리덕타제 (dihydrodipicolinate reductase)는 미생물의 라이신 생합성 경로에 작용하는 효소로써, 미생물의 쓰레오닌 생합성과 라이신 생합성의 공통된 전구체인 아스파틸 세미알데하이드(Aspartyl semialdehyde)로부터 라이신을 생합성하기 위한 경로로 보내주는 데 있어 디하이드로디피콜산 신테이즈(dihydrodipicolinate synthase) 바로 다음으로 작용하는 중요한 효소이다.
라이신 생합성의 전구체인 디아미노피멜산(diaminopimelate)의 경우 미생물의 세포벽을 구성하는 펩티도글리칸(peptidoglycan)의 형성에 사용되기 때문에, 디아미노피멜산(diaminopimelate) 생성 경로 중에 작용하는 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 코딩하는 dapB 유전자를 결손 시 미생물의 세포벽의 합성이 저해되므로, 균주의 생장이 저해된다.
따라서, L-쓰레오닌 생산능 향상을 위해서는, L-라이신의 생합성 경로에 작용하는 유전자를 결손하기 보다는 적절한 수준으로 줄이기 위한 접근이 여전히 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 균주의 성장속도의 지연 없이 L-라이신의 생산량은 감소하면서 L-쓰레오닌 생산량은 높이고자 예의 노력 연구한 결과, 특정한 수준으로 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 약화시킨 신규한 변이형 폴리펩티드를 이용할 경우 미생물의 성장이 유지될 뿐만 아니라 L-쓰레오닌의 생산량이 증가됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 변이형 폴리펩티드를 포함하는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 이용한 L-쓰레오닌(Threonine)을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 L-쓰레오닌(Threonine)을 생산하기 위한 상기 미생물의 용도를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 변이형 폴리펩티드를 제공한다.
구체적으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 변이형 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 서열과 동일한 서열을 변이 대상의 기준서열로 하며, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 더욱 구체적으로, 상기 아미노산의 치환은 13번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함하는 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 제공한다.
상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 변이형 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 서열과 동일한 서열일 수 있다. 그 예로, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 13번째 아미노산이 아스파라긴(Asparagine), 쓰레오닌(Threonine), 시스테인(Cysteine), 타이로신(Tyrosine), 세린(Serine), 라이신(Lysine) 또는 글루타민(Glutamine)으로 치환된 것인, 변이형 폴리펩티드 일 수 있다. 그 예로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98%이상의 동일성 또는 상동성을 가지는 아미노산 서열에서 13번째 아미노산이 아스파라긴으로 치환된, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공한다.
이때, 상기 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열은 서열번호 51로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3 또는 서열번호 53의 아미노산 서열로 이루어 질 수 있다.
본 출원에서 "디하이드로디피콜린산 리덕타제 (dihydrodipicolinate reductase, Ec 1.3.1.26)”는 미생물에 있어 아스파테이트 유래 아미노산인 L-메티오닌, L-쓰레오닌, L-이소류신, L-라이신 생합성의 공통 중간물질인 아스파틸 세미알데하이드(Aspartyl semialdehyde)를 하이드로디피콜린산 신테이즈(dihydrodipicolinate synthase) 효소를 통해 2,3-디하이드로디피콜린산 (2,3-dihydeopicolinate)로 전환하고, 이를 NADPH를 이용하여 라이신 생합성의 전구체인 Piperidine 2,6-dicarboxylate로 전환하여 라이신 생합성을 촉매하는 효소를 의미한다.
본 출원에서 디하이드로디피콜린산 리덕타제는 상기 전환 활성을 가지는 단백질이라면 유래에 상관없이 포함될 수 있으며, 임의의 유기체(식물 및 미생물 등)로부터 유래하는 효소를 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제는 코리네박테리움 속 미생물 유래의 서열과 동일하고, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 유래의 서열과 동일할 수 있다.
본 출원에서 코리네박테리움 클루타미쿰 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제는 상기 미생물 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제와 동일한 서열 역시 포함됨을 의미한다.
예를 들면, 서열번호 1 또는 이와 98% 이상의 동일성 또는 99%이상의 동일성을 갖는 서열일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 이와 같은 서열은 그 예로, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열로 구성되는 단백질, 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에 있어서, 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 그 방법의 예로는 단백질 발현에 통상적으로 널리 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에서 단백질을 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서의 "디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 폴리펩티드"는 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열, 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본원의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 해당된다.
구체적인 예를 들어, 본원의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 60%, 70%, 80%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질 또는 폴리펩티드에 상응하는 생물학적 활성을 나타내는 아미노산 서열이라면, 13번째 위치의 아미노산 서열 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드도 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 본 출원에서의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제일 수 있다. 보다 구체적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 아미노산 서열(서열번호 1) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 아미노산 서열(서열번호 51)일 수 있다. 상기 서열을 갖는 디하이드로디피콜린산 리덕타제는 서로 상동성 또는 동일성을 보이며, 디하이드로디피콜린산 리덕타제로서 상응하는 효능을 나타내므로 본 출원의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 포함됨은 자명하다.
상기 "상동성" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이", "변이형" 또는 "변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻한다. 구체적으로는 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 단백질에 상응하는 아미노산 서열상에서 하나 이상의 아미노산이 변이되어 그 활성이 야생형, 천연형 또는 비변이형과 비교하여 약화된 변이체를 의미할 수 있다.
본 출원에서 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드는, "변이형 디하이드로디피콜린산 리덕타제", "변이된 디하이드로디피콜린산 리덕타제", "디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이체 단백질", "변이형 디하이드로디피콜린산 리덕타제 단백질" 또는 "디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이체"로 혼용될 수 있다. 한편, 이러한 변이체는 비자연적인 (non-naturally occurring) 것일 수 있다.
본 출원에서 변이는 일반적으로 효소를 개량하기 위한 방법으로 당업계의 알려진 공지된 방법들이 제한없이 사용될 수 있으며, 이에는 합리적 설계(rational design)와 유도 진화(directed evolution) 등의 전략이 있다. 예를 들어, 합리적 설계 전략에는 특정 위치의 아미노산을 위치-지정 돌연변이도입(site-directed mutagenesis 또는 site-specific mutagenesis)하는 방법 등이 있고, 유도 진화 전략에는 무작위적 변이(random mutagenesis)를 일으키는 방법 등이 있다. 또한, 자연적인 돌연변이에 의해 외부의 조작 없이 돌연변이된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드는 분리된 것이거나, 재조합 단백질일 수 있으며, 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 "디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드"는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드로서, 상기 아미노산의 치환은 13번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함하는 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 제공한다.
구체적으로는 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 13번째 아미노산에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(Asparagine), 쓰레오닌(Threonine), 시스테인(Cysteine), 타이로신(Tyrosine), 세린(Serine), 라이신(Lysine) 또는 글루타민(Glutamine)으로 치환된 것인, 변이형 폴리펩티드 일 수 있다. 일 구체예로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98%이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 13번째 아미노산에 상응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴으로 치환된, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공한다. 이때, 상기 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열은 서열번호 51로 이루어진 것일 수 있다.
상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 13번째 아미노산에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로의 치환을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 51의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지며, 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 가지는 것일 수 있다.
상기 변이형 폴리펩티드의 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성은 야생형인 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성보다 약화된 것일 수 있다.
구체적인 예를 들어, 본 출원의 변이형 디하이드로디피콜린산 리덕타제는 서열번호 3 또는 서열번호 53의 아미노산 서열 또는 이와 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질 또는 폴리펩티드에 상응하는 생물학적 활성을 나타내는 아미노산 서열이라면, 13번째 아미노산에 상응하는 위치의 아미노산 이외에, 일부아미노산이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드도 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 이를 포함하는 미생물 내에서 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 야생형 또는 천연형 단백질 또는, 또는 비변형 단백질과 달리, 최종산물인 라이신을 생성하는 활성이 약화된 특징을 가지는 것일 수 있다.
본 출원에서 "약화"란 단백질 또는 폴리펩티드의 기능이 저하되는 것을 의미하는 것으로, 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성이 약화됨으로 인하여 쓰레오닌 생합성과 라이신 생합성의 공통된 전구체인 아스파틸 세미알데하이드로부터 라이신을 생합성하기 위한 경로로 보내주는 기능이 저하되어, 결과적으로 최종산물인 라이신의 생산능력은 감소하게 되는 반면, 쓰레오닌의 생산능력은 증가되어 쓰레오닌 및 쓰레오닌 유래 아미노산의 생산성을 높일 수 있다. 상기 쓰레오닌 유래 아미노산은 쓰레오닌을 전구체로하여 생합성 할 수 있는 아미노산을 의미하며, 쓰레오닌으로부터 생합성 될 수 있는 물질이라면 제한되지 않는다.
또한, 본 출원에서 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제는 기능이 약화될 뿐 저해되는 것은 아니므로 라이신 생합성 전구체인 디아미노피멜산을 생산하는 데에는 문제가 없어 미생물의 세포벽의 합성은 저해되지 않아 균주의 생장에는 문제가 없는 것을 특징으로 한다. 즉, 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 코딩하는 유전자(dapB)를 결손하는 것이 아니라 13번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 변이에 의해 적절한 수준으로 활성을 약화시킬 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 변이형 폴리펩티드에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 포함하는 의미를 가지며, 이의 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 천연뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 출원에서 상기 폴리뉴클레오티드는 세포로부터 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 인위적으로 합성된 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로는 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 일 구체예로, 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 4 또는 서열번호 54의 염기서열 또는 이와 적어도 60%, 70%, 80%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제 단백질 또는 폴리펩티드에 상응하는 생물학적 활성을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이라면, 13번째 아미노산을 코딩하는 염기서열 외의 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드도 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 출원에 포함될 수 있다. 구체적으로, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있어 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 가지는 한 제한없이 포함될 수 있다.
또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴크레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 당업자에게 잘 알려진 방법인 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York) 에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80%, 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다.
본 출원에서 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 또 하나의 양태는, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는, 상기의 벡터가 도입된 형질전환체이다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette) 의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (Ca(H2PO4)2, CaHPO4, 또는 Ca3(PO4)2) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 변이형 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 포함하는 미생물을 제공한다. 구체적으로는 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 포함하는, L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 미생물을 제공한다.
상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 변이형 폴리펩티드는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "미생물"은 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 용어 "쓰레오닌" 또는 "L-쓰레오닌"은 혼용되어 사용될 수 있고, "라이신" 또는 "L-라이신" 또한 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물은 자연적으로 L-아미노산 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-아미노산의 생산능이 없는 모균주에 L-아미노산의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 포함하는 미생물은 서열번호 1 또는 서열번호 51의 아미노산 서열에서 13번째 아미노산이 아스파라긴(Asparagine), 쓰레오닌(Threonine), 시스테인(Cysteine), 타이로신(Tyrosine), 세린(Serine), 라이신(Lysine) 또는 글루타민(Glutamine)으로 치환된 변이형 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 발현하는 미생물일 수 있으며, 일 구체예로, 상기 아미노산 서열에서 13번 아미노산인 아르기닌이 아스파라긴으로 치환된 변이형 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 발현하는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은 13번째 아미노산이 치환된 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 포함함으로서 생장에 방해되지 않고, 라이신의 생산량은 감소하면서 쓰레오닌의 생산량은 증가시킬 수 있음을 특징으로 한다.
상기 변이위치에 의해 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 효소 활성이 약화되어, 균주의 성장속도의 지연 없이도 라이신의 생산량 감소 및 쓰레오닌 생산량 증가를 가져올 수 있다.
본 출원의 변이형 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 포함하는 미생물은 야생형 또는 비변형 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 활성을 갖는 단백질을 포함하는 미생물에 비하여 라이신의 생산능이 감소하고, 쓰레오닌의 생산능이 향상되므로, 이들 미생물로부터 쓰레오닌을 고수율로 수득할 수 있다.
본 출원에서 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예로는, 본 출원에서 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
상기 미생물은, 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 변이형 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 도입은 형질전환에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 출원의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하여 라이신 또는 쓰레오닌 또는 상기 아미노산인 라이신 또는 쓰레오닌 유래의 아미노산을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
상기 코리네박테리움속 미생물은 구체적으로, 상기 L-쓰레오닌의 생합성 경로를 강화시키기 위해, 예를 들면, 쓰레오닌 합성효소를 코딩하는 thrC, 포스포에놀 파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자, 포도당 유입에 관여하는 galP 유전자, 리신-민감성 아스파르토키나아제 3(lysine-sensitive aspartokinase 3)를 코딩하는 lysC 유전자, 호모세린 탈수소효소(homoserine dehydrogenase)를 코딩하는 hom 유전자 또는 옥살로아세테이트(Oxaloacetate) pool 증가를 유도하는 pyc 유전자 등의 발현은 미생물 내에서 강화 또는 증가될 수 있다.
상기 L-쓰레오닌에 대한 피드백 저해를 해제시키기 위해, 예를 들면, lysC 유전자, hom 유전자 또는, 아스파르토키나아제 및 호모세린 탈수소효소 1의 이중 기능성을 가지는(Bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1) thrA 유전자 등에 유전자 변이를 도입할 수 있다.
상기 L-쓰레오닌의 생합성 경로를 약화시키는 유전자를 불활성화시키기 위해, 예를 들면, L-쓰레오닌 생합성 중간체인 옥살로아세테이트(OAA)를 포스포에놀 파이루베이트(PEP)로 전환하는데 관여하는 pckA 유전자, lysC 유전자를 억제하는 tyrR 유전자, 포도당 유입에 관여하는 galP 유전자의 발현을 억제하는 galR 유전자 또는 DNA-결합 전사 이중 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)인 mcbR 유전자 등의 발현은 미생물 내에서 약화 또는 불활성화 될 수 있다.
상기 L-쓰레오닌 오페론의 활성을 증가시키기 위해, 아스파르토키나아제(aspartokinase), 호모세린디히드로게나아제(homoserine dehydrogenase), 호모세린 키나아제(homoserine kinase) 및 쓰레오닌 신타아제(threonine synthase)를 코딩하는 유전자로 구성된 쓰레오닌 오페론(일본 공개특허 제2005-227977호)을 포함하는 플라스미드 또는 대장균 유래의 쓰레오닌 오페론 등을 미생물에 도입하여(TURBA E, et al, Agric. Biol. Chem. 53:2269~2271, 1989), 미생물 내에서 쓰레오닌 오페론 발현을 증가시킬 수 있다.
또한, L-쓰레오닌 유사체인 α-아미노-β-히드록시 발레르산 또는 D,L- 쓰레오닌 히드록사메이트 등에 대하여 내성을 부여할 수 있다.
또한, L-쓰레오닌과 공통된 전구체를 가지는 L-라이신의 생합성 경로에 작용하는 유전자인 dapA(디하이드로피콜린산 신테이즈: dihydrodipicolinate synthase), lysA(디아미노피멜산 디카복실레이즈: Diaminopimelate decarboxylase), 또는 ddh(디아미노피멜산 디하이드로게나아제: diaminopimelate dehydrogenase) 유전자를 약화시킬 수 있다.
그러나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 유전자 발현 조절 방법으로 L-쓰레오닌 생산능을 강화할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "강화/증가"는 내재적 활성에 비하여 활성이 증가되는 것을 모두 포함하는 개념이다.
이러한 유전자 활성의 강화 또는 증가는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 유전자의 세포 내 카피수 증가; 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법; 유전자의 활성이 강화되도록 해당 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법; 및 미생물에 외래 유전자를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "불활성화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 약화되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다.
이러한 유전자 활성의 불활성화 또는 약화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 유전자의 활성이 제거된 경우를 포함하여 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 해당 단백질의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법(예컨대, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법); 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
예를 들면, lysC, hom, 또는 pyc의 활성강화를 위해 유전자의 세포 내 카피수 증가; 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법; 유전자의 활성이 강화되도록 해당 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법; 및 미생물에 외래 유전자를 도입하는 방법 등으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니며, 활성 강화 또는 증가를 위하여 공지된 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
예를 들면, dapA, ddh, 또는 lysA의 활성 약화를 위해 상기 유전자의 활성이 제거된 경우를 포함하여 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 해당 단백질의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법(예컨대, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법); 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법 등으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니며, 활성 약화를 위하여 공지된 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물에 다음의 변이형 폴리펩티드 중 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 추가로 포함되는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 80의 아미노산 서열에서 119번째 아미노산이 타이로신에서 페닐알라닌으로 치환된 디하이드로피콜린산 신테이즈 (dihydrodipicolinate synthase) 변이형 폴리펩티드, 서열번호 81의 아미노산 서열에서 302번째 아미노산이 아르기닌에서 알라닌으로 치환된 디아미노피멜산 디카복실레이즈(Diaminopimelate decarboxylase)변이형 폴리펩티드; 및 서열번호 82의 아미노산 서열에서 169번째 아미노산이 쓰레오닌에서 류신으로 치환된 디아미노피멜산 디하이드로게나아제(diaminopimelate dehydrogenase)변이형 폴리펩티드 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 서열번호 80의 아미노산 서열에서 119번째 아미노산이 타이로신에서 페닐알라닌으로 치환된 디하이드로피콜린산 신테이즈 (dihydrodipicolinate synthase) 변이형 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 65일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 디하이드로피콜린산 신테이즈 (dihydrodipicolinate synthase, dapA)는 라이신과 쓰레오닌의 공통전구체인 아스파틸 세미알데하이드(Aspartyl semialdehyde)로부터 라이신을 생합성하기 위한 효소로서, 상기 119번째 아미노산 서열이 타이로신에서 페닐알라닌으로 치환됨에 따라 디하이드로피콜린산 신테이즈의 기능이 약화됨에 따라 라이신의 생산능은 감소될 수 있다. 본 출원의 실시예에서 상기 변이형 폴리펩티드를 도입함으로 인하여 라이신의 생산량은 감소되고 쓰레오닌의 생산량이 증가됨을 확인할 수 있었다.
상기 서열번호 81의 아미노산 서열에서 302번째 아미노산이 아르기닌에서 알라닌으로 치환된 디아미노피멜산 디카복실레이즈(Diaminopimelate decarboxylase)변이형 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 70일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 디아미노피멜산 디카복실레이즈(Diaminopimelate decarboxylase, lysA)는 라이신 생합성에 작용하는 마지막 효소로서, 상기 302번째 아미노산 서열이 아르기닌에서 알라닌으로 치환됨에 따라 디아미노피멜산 디카복실레이즈의 기능이 약화됨에 따라 라이신의 생산능은 감소될 수 있다. 본 출원의 실시예에서 상기 변이형 폴리펩티드를 도입함으로 인하여 라이신의 생산량은 감소되고 쓰레오닌의 생산량이 증가됨을 확인할 수 있었다.
상기 서열번호 82의 아미노산 서열에서 169번째 아미노산이 쓰레오닌에서 류신으로 치환된 디아미노피멜산 디하이드로게나아제(diaminopimelate dehydrogenase)변이형 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 75일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 디아미노피멜산 디하이드로게나아제(diaminopimelate dehydrogenase, ddh)는 라이신의 생합성에 작용하는 효소로서, 상기 169번째 아미노산이 쓰레오닌에서 류신으로 치환됨에 따라 디아미노피멜산 디하이드로게나아제의 기능이 약화됨에 따라 라이신의 생산능은 감소될 수 있다. 본 출원의 실시예에서 상기 변이형 폴리펩티드를 도입함으로 인하여 라이신의 생산량은 감소되고 쓰레오닌의 생산량이 증가됨을 확인할 수 있었다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 기술된 미생물을 배지에서 배양하는 단계을 포함하는, 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산의 생산 방법을 제공한다.
또한, 상기의 생산방법은 상기 배양된 미생물 또는 배양된 배지로부터 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산의 생산 방법을 제공한다.
상기 미생물은 상기 설명한 바와 같이 본 출원의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 또한, 상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 글루타미쿰은 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산을 생산하는 미생물일 수 있다. 상기 쓰레오닌 유래 L-아미노산은 쓰레오닌 유래 L-아미노산뿐만 아니라 이의 유도체도 포함할 수 있다. 예를 들어 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린, O-포스포-L-호모세린, L-메티오닌 및/또는 L-글리신일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린 및/또는 L-메티오닌 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산은, 본 출원의 기술된 미생물이 생산한 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산 배양액이거나, 정제된 형태일 수 있다. 또한 그 자체 형태뿐 아니라, 이의 염 형태도 모두 포함함은 당업자에게 자명하다.
상기 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산을 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다
상기 방법에 있어서 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20℃ 내지 45℃ 구체적으로는 25℃내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 아미노산, 일 구체예로, 쓰레오닌 또는 라이신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 산물을 수득할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적 물질인 쓰레오닌 또는 쓰레오닌 유래 L-아미노산을 회수 할 수 있다. 또한, 상기 회수 단계는 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 약화시킨 신규한 변이형 폴리펩티드를 이용할 경우 야생형 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 가진 균주 대비 성장속도의 지연 없이 라이신의 생산량을 감소시키고 쓰레오닌의 생산량을 증가시킬 수 있어 쓰레오닌의 대량 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: dapB 유전자 ORF 내 변이 도입용 벡터 라이브러리 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 dapB 유전자의 발현량 또는 이의 활성이 약화된 변이체를 발굴하기 위한 목적으로 아래의 방법으로 라이브러리를 제작하였다.
먼저 dapB (747 bp) 유전자를 포함하는 DNA 단편 (747 bp)의 kb 당 0-4.5 개를 변이를 도입하기 위한 목적으로 GenemorphII Random Mutagenesis Kit (Stratagene)을 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 (WT)의 염색체를 주형으로 하고 프라이머 서열번호 5 및 6을 이용하여 Error-prone PCR을 수행하였다. 구체적으로, WT 균주의 염색체 (500 ng), 프라이머 5 및 6 (각각 125 ng), Mutazyme II reaction buffer (1Х), dNTP mix (40 mM), Mutazyme II DNA polymerase (2.5U)을 포함하는 반응액은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 2분 중합을 25회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 유전자 단편은 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)을 이용하여 pCRII 벡터에 연결하였고, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하였고, 염기서열을 분석한 결과 0.5 mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 최종적으로 약 10,000 개의 형질전환 된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pTOPO-dapB(mt) 라이브러리로 명명하였다.
실시예 2: dapB 결손주 제작 및 성장속도를 기반으로 dapB 변이주 스크리닝
야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에서 dapB 유전자가 결손된 균주를 제작하기 위하여 아래와 같이 dapB 유전자가 결손된 벡터 pDZ-ΔdapB 를 제조하였다. 구체적으로, dapB 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 300bp) pDZ 벡터(대한민국특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태로 제작되었다. 보고된 dapB 유전자의 염기서열(서열번호 2)에 근거하여 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SalI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 7 및 8 와 이들로부터 각각 300 bp 떨어진 위치에서 프라이머 서열번호 9 및 10 를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 7 및 9을 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 동일한 방법으로 gltA 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 8 및 10 를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 40초 중합을 30회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다.
한편 제한효소 SalI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 7 및 8 를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-ΔdapB라 명명하였다.
상기 제작된 벡터 pDZ-ΔdapB를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기펄스법(Van der Rest et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 52:541-545, 1999)으로 형질전환하여 상동염색체 재조합에 의해 dapB 유전자가 결손된 균주를 제작하였다. 이와 같이 dapB 유전자가 결손된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 13032::ΔdapB라고 명명하였다.
또한, 13032::ΔdapB 균주를 대상으로 pTOPO-dapB(mt) 라이브러리를 전기펄스법으로 형질전환하고 카나마이신(25mg/l)이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 100개의 콜로니를 확보하였다. 확보한 100주의 균주에 대하여 L-라이신 생산능 테스트를 진행하였다. 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 획득한 100주의 균주를 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 L-라이신 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
라이신 생산배지 (pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
13032 및 13032::ΔdapB 균주를 대조구로 이용하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용하여 라이신의 생산량을 측정하였다. 야생형인 13032 균주 대비 L-라이신 농도는 감소하면서 13032::ΔdapB 균주보다는 L-라이신 농도가 높게 나오는 균주 6종을 선별하고, 6주에 대한 아미노산의 배양액 내 농도를 표 1에 나타내었다. 상기 선별된 6종의 균주는 13032::dapB(mt)-1 내지 6으로 명명하였다. 그 외 94종의 콜로니들은 대조구로 이용된 13032보다 L-라이신 농도가 높거나 13032::ΔdapB 균주와 같은 수준을 보였다. 또한 13032::ΔdapB 균주의 생장속도가 13032 대비 크게 감소하는 반면, 선별된 6종의 균주는 13032::ΔdapB 보다는 높은 생장 속도를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112019098799398-pat00001
표 1의 결과와 같이, 선별된 6종의 균주는 L-라이신 농도가 WT 균주보다는 적으면서 13032::ΔdapB 균주보다는 높게 나오는 결과를 보였다.
실시예 3: dapB 변이주 6종 염기서열 확인
6종의 선별 균주 13032::dapB(mt)-1 내지 6의 dapB 유전자 염기서열을 확인하기 위하여 실시예 1에 명시된 프라이머를 (서열번호 5 및 6) 이용하여 염색체 내 dapB 유전자를 포함한 DNA 단편을 PCR 증폭하였다. PCR 조건은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 40초 중합을 30회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 유전자의 염기서열을 분석한 결과 6종의 균주 중 차례로 13032::dapB(mt)-1은 서열번호 2의 37~39번째 염기서열이 기존 CGT에서 AAC로 바뀐, N 말단에서부터 13번째 아미노산인 아르기닌이 아스파라긴으로 치환된 형태의 변이체, 13032::dapB(mt)-2는 서열번호 2의 106~108번째 염기서열이 기존 GTC에서 ATC로 바뀐, N 말단에서부터 36번째 아미노산인 발린이 메티오닌으로 치환된 형태의 변이체, 13032::dapB(mt)-3은 서열번호 2의 175~177번째 염기서열이 기존 GCT에서 CTG로 바뀐, N 말단에서부터 59번째 아미노산인 알라닌이 류신으로 치환된 형태의 변이체, 13032::dapB(mt)-4는 서열번호 2의 235~237번째 염기서열이 기존 ACG에서 GCA로 바뀐, N 말단에서부터 79번째 아미노산인 쓰레오닌이 알라닌으로 치환된 변이체, 13032::dapB(mt)-5는 서열번호 2의 433~435번째 염기서열이 ACG에서 GCG로 바뀐, N 말단에서부터 145번째 아미노산인 쓰레오닌이 알라닌으로 치환된 변이체, 마지막으로 13032::dapB(mt)-6은 서열번호 2의 414번째 염기서열이 G에서 C로 바뀐, N 말단에서부터 138번째 아미노산인 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체임을 확인하였다.
상기 6종의 균주들 중 L-라이신의 생산량이 WT 균주인 13032 대비 감소하면서 13032:: ΔdapB와는 가장 유사하게 L-라이신의 생산량이 적으면서 생장속도는 WT 균주인 13032와 유사한 13032::dapB(mt)-1 균주를 가장 우수한 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성 약화 균주로 선별하였다.
실시예 4: dapB 유전자의 13번째 아미노산인 아르기닌이 다른 아미노산으로 치환된 다양한 균주 제작
상기 아미노산 서열1에서 13번째 아미노산의 위치에, 야생형이 가지는 아르기닌을 제외한 타 proteogenic 아미노산으로의 치환을 시도하였다.
실시예 3에서 확인한 변이인 R13N을 포함한 19종의 이종성 염기 치환변이들을 도입하기 위하여 각각의 재조합 벡터를 아래와 같은 방법으로 제작하였다.
먼저, WT 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 dapB 유전자의 36~39번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 600bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SalI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 11 및 12을 합성하였다. 19종의 이종성 염기 치환변이들을 도입하기 위하여 dapB 유전자의 36~39번째 염기서열을 치환하기 위한 프라이머 서열번호 13~50을 합성하였다.
구체적으로, pDZ-dapB(R13N) 플라스미드는 dapB 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 600bp) pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태로 제작되었다. WT균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 11 및 13을 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 40초 중합을 30회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 dapB 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 12 및 14를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.
한편 제한효소 SalI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 11 및 12 를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-dapB(R13N)로 명명하였다.
동일한 방법으로 프라이머 서열번호 11 및 15, 12 및 16을 이용하여 pDZ-dapB(R13G), 프라이머 서열번호 11 및 17, 12 및 18을 이용하여 pDZ-dapB(R13A), 프라이머 서열번호 11 및 19, 12 및 20을 이용하여 pDZ-dapB(R13V), 프라이머 서열번호 11 및 21, 12 및 22을 이용하여 pDZ-dapB(R13L), 프라이머 서열번호 11 및 23, 12 및 24를 이용하여 pDZ-dapB(R13I), 프라이머 서열번호 11 및 25, 12 및 26을 이용하여 pDZ-dapB(R13M), 프라이머 서열번호 11 및 27, 12 및 28을 이용하여 pDZ-dapB(R13F), 프라이머 서열번호 11 및 29, 12 및 30을 이용하여 pDZ-dapB(R13W), 프라이머 서열번호 11 및 31, 12 및 32를 이용하여 pDZ-dapB(R13P), 프라이머 서열번호 11 및 33, 12 및 34를 이용하여 pDZ-dapB(R13S), 프라이머 서열번호 11 및 35, 12 및 36을 이용하여 pDZ-dapB(R13T), 프라이머 서열번호 11 및 37, 12 및 38을 이용하여 pDZ-dapB(R13C), 프라이머 서열번호 11 및 39, 12 및 40을 이용하여 pDZ-dapB(R13Y), 프라이머 서열번호 11 및 41, 12 및 42을 이용하여 pDZ-dapB(R13Q), 프라이머 서열번호 11 및 43, 12 및 44을 이용하여 pDZ-dapB(R13D), 프라이머 서열번호 11 및 45, 12 및 46을 이용하여 pDZ-dapB(R13E), 프라이머 서열번호 11 및 47, 12 및 48을 이용하여 pDZ-dapB(R13K), 프라이머 서열번호 11 및 49, 12 및 50을 이용하여 pDZ-dapB(R13H)를 제작하였다.
dapB 변이 도입에 따른 라이신 농도 및 생장속도를 보다 명확히 하기 위하여 각각 제작된 벡터를 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주(대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 dapB 유전자에 이종성 염기치환변이들이 도입된 균주 19종은 KCCM11016P::dapB (R13N), KCCM11016P::dapB (R13G), KCCM11016P::dapB (R13A), KCCM11016P::dapB (R13V), KCCM11016P::dapB (R13L), KCCM11016P::dapB (R13I), KCCM11016P::dapB (R13M), KCCM11016P::dapB (R13F), KCCM11016P::dapB (R13F), KCCM11016P::dapB (R13W), KCCM11016P::dapB (R13P), KCCM11016P::dapB (R13S), KCCM11016P::dapB (R13T), KCCM11016P::dapB (R13C), KCCM11016P::dapB (R13Y), KCCM11016P::dapB (R13Q), KCCM11016P::dapB (R13D), KCCM11016P::dapB (R13E), KCCM11016P::dapB (R13K)로 각각 명명하였다.
실시예 5: dapB 변이주에 대한 라이신 생산능 분석
KCCM11016P 균주를 대조군으로 사용하여 선별균주 19종을 아래와 같은 방법으로 배양하여 당소모속도, 라이신 생산 수율, 쓰레오닌 생산 수율을 측정하였다.
먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30˚C에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32˚C에서 72 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다. 배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)를 이용하여 L-라이신과 L-쓰레오닌의 농도를 측정하였다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
라이신 및 쓰레오닌 생산능, 및 당 소모속도의 측정 결과는 하기 표 2와 같다.
라이신 및 쓰레오닌 생산능
균주 LYS 농도
(g/L)		 Thr 농도
(g/L)		 당 소모속도
(g/hr)
KCCM11016P 43.4 1.2 4.53
KCCM11016P::dapB(R13N) 20.0 2.2 4.30
KCCM11016P::dapB(R13G) 10.5 0.8 2.10
KCCM11016P::dapB(R13A) 15.7 0.6 1.57
KCCM11016P::dapB(R13V) 11.1 1.0 1.23
KCCM11016P::dapB(R13L) 14.6 0.9 2.30
KCCM11016P::dapB(R13I) 20.0 1.2 1.23
KCCM11016P::dapB(R13M) 24.3 0.8 1.75
KCCM11016P::dapB(R13F) 18.3 1.1 2.93
KCCM11016P::dapB(R13W) 19.4 0.9 2.51
KCCM11016P::dapB(R13P) 27.6 1.0 2.60
KCCM11016P::dapB(R13S) 30.5 1.4 4.40
KCCM11016P::dapB(R13T) 31.4 1.5 4.51
KCCM11016P::dapB(R13C) 37.0 1.3 4.20
KCCM11016P::dapB(R13Y) 28.9 1.6 4.23
KCCM11016P::dapB(R13Q) 27.7 1.8 4.38
KCCM11016P::dapB(R13D) 21.5 1.0 2.75
KCCM11016P::dapB(R13E) 26.8 1.0 2.86
KCCM11016P::dapB(R13K) 40.1 1.2 4.40
KCCM11016P::dapB(R13H) 42.3 1.1 4.52
서열번호 1의 13번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩타이드를 포함하는 균주의 경우, 치환된 아미노산이 극성을 띠는 경우 (S, T, C, Y, N, Q, K) 균주의 생장은 산업상 활용가능한 수준으로 유지되면서 라이신 생산능이 약화되고 쓰레오닌의 생산능이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 그 중 R13N 변이 도입주의 경우 가장 균주의 생장은 KCCM11016P 과 유사하면서 라이신 생산능이 가장 하락하고 쓰레오닌의 생산능은 가장 크게 상승한 것을 볼 수 있었다.
또한, R13S, R13T, R13C, R13Y, R13Q, R13K 변이 균주 또한 균주의 생장이 유지되면서 라이신의 생산능은 감소되는 반면 쓰레오닌의 생산능이 향상 된 것을 볼 수 있었다.
반면 나머지 성질의 아미노산으로 치환된 경우 쓰레오닌 생산능이 감소되거나, 균주의 당소모속도 또한 대조군과 동등하거나, 그렇지 않으면 크게 하락하여 산업상 활용 불가능한 수준인 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과로, 본 출원의 변이를 도입하는 경우, 균주의 생장은 적정 수준으로 유지되면서 라이신 수율만 감소시키고 쓰레오닌 생산성 향상에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이 결과는 디하이드로디피콜산 리덕타아제의 활성 조절을 통하여, 라이신 생합성 경로의 약화로 인한 세포벽 합성의 저해로 야기되는 균주의 생장속도는 유지시키면서 적절한 수준으로 라이신 생산능을 감소시키고, 동시에 그로 인한 탄소의 흐름을 쓰레오닌으로 보내줌으로써 쓰레오닌의 생산능을 향상시킬 수 있다는 결과를 확인할 수 있었다.
실시예 6: 코리네박테리움속 미생물 ATCC 13032 기반 dapB 유전자의 13번째 아미노산인 아르기닌이 아스파라긴으로 치환된 균주 제작
13번째 아미노산이 아스파라긴으로 치환된 변이체의 효과를 야생형 균주에서 재확인하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032가 내재적으로 갖는 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 아미노산 서열(서열번호 1)에서 13번째 아미노산인 아르기닌을 아스파라긴으로 치환하였다.
구체적으로, 실시예 4에서 제작한 pDZ-dapB(R13N) 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 dapB 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 13032::dapB(R13N)로 명명하였다.
실시예 7: 코리네박테리움속 미생물 ATCC13032 기반 dapB 변이주에 대한 쓰레오닌 및 라이신 생산능 분석
실시예 1에서 사용한 13032::ΔdapB 균주와 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주를 대조군으로 사용하여 상기 실시예 6에서 제작된 13032::dapB(R13N) 균주를 아래와 같은 방법으로 배양하여 당소모속도, 쓰레오닌 및 라이신 생산 수율을 측정하였다.
먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30˚C에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32˚C에서 24 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다. 배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)를 이용하여 L-라이신과 L-쓰레오닌의 농도를 측정하였다.
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.2)
포도당 30g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 40g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5g, Leucine 400mg, CaCO3 20g(증류수 1 리터 기준).
배양 결과 쓰레오닌 및 라이신 생산능, 당 소모속도 측정 결과는 하기 표 3와 같다.
쓰레오닌 및 라이신 농도, 당 소모속도 측정
균주 LYS 농도
(g/L)		 Thr 농도
(g/L)		 당 소모속도
(g/hr)
13032 1.2 0.0 4.53
13032::ΔdapB 0.0 0.1 1.31
13032::dapB(R13N) 0.2 0.2 4.06
dapB 유전자가 결손된 균주의 경우 모균주 대비 라이신 농도는 감소하고, 쓰레오닌 농도는 소폭 증가했으나 배양 후반까지 당을 소모하지 못하였다. 즉, dapB 유전자가 결실되어 라이신 생합성능이 없는 경우는 균주의 생장이 억제되어 산업상 활용하기 어렵다고 볼 수 있었다.
서열번호 1의 13번째 아르기닌이 아스파라긴으로 치환된 변이형 폴리펩타이드를 포함하는 13032::dapB(R13N) 균주의 경우, 균주의 생장은 산업상 활용 가능한 수준으로 유지되면서 라이신 농도가 감소하고, 쓰레오닌 농도는 증가함을 확인하였다. 즉, 본 출원의 변이를 도입하는 경우, 쓰레오닌 농도는 향상시키면서 부산물인 라이신은 감소시키는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
이 결과로 인하여 dapB 유전자의 변이 도입을 통해 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 약화시킬 때, 쓰레오닌과 라이신의 공통 전구체인 아스파틸 세미알데하이드로부터 탄소의 흐름이 라이신 생합성 쪽 흐름으로 가는 것을 줄임으로써 쓰레오닌의 생합성 쪽 경로로 흐르도록 하여 쓰레오닌 생산량을 증가시키고 부산물인 라이신 생산량을 저감시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 8: 코리네박테리움속 미생물 ATCC13869 기반 dapB 유전자의 13번째 아미노산인 아르기닌이 아스파라긴으로 치환된 균주 제작
13번째 아미노산이 아스파라긴으로 치환된 변이체의 효과를 야생형 균주에서 재확인하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 미생물이 내재적으로 갖는 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 아미노산 서열(서열번호 51)에서 13번째 아미노산인 아르기닌을 아스파라긴으로 치환하였다(서열번호 53).
구체적으로, 실시예 5에서 확인한 변이인 R13N을 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주에 도입하기 위한 재조합 벡터를 아래와 같은 방법으로 제작하였다.
먼저, 13869 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하는 점만 실시예 4와 상이하고, 나머지는 실시예 4에서와 동일한 프라이머와 방법을 사용하여 pDZ-dapB(R13N)-13869 플라스미드를 제작하였다.
이렇게 제작된 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 dapB 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 13869::dapB(R13N)로 명명하였다.
실시예 9: 13869 기반 dapB 결손주 제작
실시예 1에서 제작한 pDZ-ΔdapB를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 전기펄스법(Van der Rest et al., Appl. Microbial. Biotecnol. 52:541-545, 1999)으로 형질전환하여 상동염색체 재조합에 의해 dapB 유전자가 결손된 균주를 제작하였다. 이와 같이 dapB 유전자가 결손된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 13869::ΔdapB라고 명명하였다.
실시예 10: 13869 기반 dapB 변이주에 대한 쓰레오닌 및 라이신 생산능 분석
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 및 실시예 9에서 제작한 13869:: ΔdapB 균주를 대조군으로 사용하여 실시예 8에서 제작된 13869::dapB(R13N) 균주를 앞선 실시예들와 같은 방법으로 배양하여 당소모속도, 쓰레오닌 및 라이신 생산 수율을 측정하였다.
배양 결과 쓰레오닌 및 라이신 생산능, 당 소모속도 측정 결과는 하기 표 4와 같다.
쓰레오닌 및 라이신 농도, 당 소모속도 측정
균주 LYS 농도
(g/L)		 Thr 농도
(g/L)		 당 소모속도
(g/hr)
13869 0.9 0.0 4.53
13869::ΔdapB 0.0 0.2 1.31
13869::dapB(R13N) 0.3 0.3 4.17
dapB 유전자가 결손된 균주의 경우 모균주 대비 라이신 농도는 감소하고, 쓰레오닌 농도는 소폭 증가했으나 배양 후반까지 당을 소모하지 못하였다. 즉, dapB 유전자가 결실되어 라이신 생합성능이 없는 경우는 균주의 생장이 억제되어 산업상 활용하기 어렵다고 볼 수 있다. 서열번호 53과 같이 13번째 아르기닌이 아스파라긴으로 치환된 변이형 폴리펩타이드를 포함하는 13869::dapB(R13N) 균주의 경우, 균주의 생장은 산업상 활용 가능한 수준으로 유지되면서 라이신 농도가 감소하고, 쓰레오닌 농도는 증가함을 확인하였다.
즉, 본 출원의 변이를 도입하는 경우, 쓰레오닌 농도는 향상시키면서 부산물인 라이신은 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
이 결과를 통하여 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성을 약화시키기 위해 dapB 유전자의 변이 도입을 시킬 경우, 쓰레오닌과 라이신의 공통 전구체인 아스파틸 세미알데하이드로부터 탄소의 흐름이 라이신 생합성 쪽 흐름으로 가는 것을 줄임으로써 쓰레오닌의 생합성 쪽 경로로 흐르도록 하여 쓰레오닌 생산량을 증가시키고 부산물인 라이신 생산량을 저감시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 11: 쓰레오닌 생산주 기반 dapB(R13N) 변이 도입주 제작
dapB(R13N) 변이 도입에 의한 L-쓰레오닌 생산능 변화를 명확히 확인하기 위하여, 쓰레오닌 생산 균주를 제작하였다. 구체적으로, 쓰레오닌 생합성 경로에서 첫번째 중요한 효소로 작용하는 aspartate kinase(lysC)의 피드백 저해(feedback inhibition) 해소를 위해 lysC(L377K) 변이가 도입된 균주를 제작하였다(대한민국 특허 제2009-0094433호). 변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작되었다.
lysC(L377K) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 lysC 유전자의 1128~1131번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 500bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SmaI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 56 및 57을 합성하였다. L377K 이종성 염기 치환변이를 도입하기 위하여 lysC 유전자의 1128~1131번째 염기서열을 치환하기 위한 프라이머 서열번호 58 및 59를 합성하였다.
구체적으로, pDZ-lysC(L377K) 플라스미드는 lysC 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 515, 538bp) pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태로 제작되었다. 13032 균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 56 및 58을 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 40초 중합을 30회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 lysC 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 57 및 59를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.
한편 제한효소 SmaI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 56 및 57 를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-lysC(L377K)로 명명하였다.
상기 제작된 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 lysC 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 CJP1으로 명명하였다. 상기 CJP1은 CA01-2307로 명명되어, 2017년 3월 29일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12000P를 부여받았다
다음으로 상기 제작된 CJP1 균주에 L-트레오닌, L-이소류신 생합성 경로의 공통적 중간체인 호모세린(homoserine)을 생산하는 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase)를 코딩하는 유전자에 변이를 도입하여 강화하였다. 구체적으로, 서열번호 60에서와 같이 1218~1221번째 염기서열이 기존 TTG에서 AAG로 바뀌어, N 말단에서부터 407번째 아미노산인 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 형태의 변이체 hom(R407H) 변이가 도입된 균주를 제작하였다. 변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작하였다.
먼저, 13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 hom 유전자의 1219~1221번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 600bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SalI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 61 및 62을 합성하였다. R407H 이종성 염기 치환변이를 도입하기 위하여 hom 유전자의 1219~1221번째 염기서열을 치환하기 위한 프라이머 서열번호 63 및 64를 합성하였다.
구체적으로, pDZ-hom(R407H) 플라스미드는 hom 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 600bp) pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태로 제작되었다. WT균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 61 및 63을 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 40초 중합을 30회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 hom 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 62 및 64를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.
한편 제한효소 SalI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 61 및 62 를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-hom(R407H)로 명명하였다.
상기 제작된 벡터를 CJP1에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 hom 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 CA09-0900(수탁번호 KCCM12418P)로 명명하였다.
상기 균주의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이 도입을 통한 L-쓰레오닌 생산과 라이신 생산의 변화를 확인하기 위하여, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 를 코딩하는 유전자에 상기 실시예 4에서 확인한 변이를 도입하였다. 구체적으로, R13N 변이를 CA09-0900 균주에 도입하기 위해서 실시예 4에서 제작된 pDZ-R13N 벡터를 전기천공법으로 CA09-0900에 형질전환하고, 실시예 4와 동일한 방법으로 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 염기변이가 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었다. 변이형 염기로 치환된 균주는 CA09-0903로 명명하였다.
상기 균주 CA09-0903은 2019년 4월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12502P 로 기탁번호를 부여받았다.
실시예 12: 쓰레오닌 생산주 기반 dapB 변이주에 대한 쓰레오닌 및 라이신 생산능 분석
실시예 10에서 제작한 CA09-0900 균주를 대조군으로 CA09-0903 균주를 실시예 7과 같은 방법으로 배양하여 쓰레오닌 및 라이신 생산 수율을 측정하였다.
배양 결과 쓰레오닌 및 라이신 생산능 측정 결과는 하기 표 5와 같다.
쓰레오닌 및 라이신 농도 측정
균주 LYS 농도
(g/L)		 Thr 농도
(g/L)
CA09-0900 3.10 2.47
CA09-0903 1.50 3.40
그 결과, 변이를 도입한 균주는 대조군인 CA09-0900 균주 대비 L-라이신의 생산량이 감소하고 L-쓰레오닌 생산량이 1.07 g/L 증가하였고, 따라서 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dapB)의 13번째 아미노산의 치환에 의한 변이 도입을 통한 라이신의 저감과 쓰레오닌의 생산량 증가 효과를 확인 할 수 있었다.
실시예 13: 라이신 경로 추가 약화주 제작 (dapA)
라이신 생합성 경로의 추가 약화에 의한 L-쓰레오닌 생산능 변화를 명확히 확인하기 위하여, 라이신 생합성 경로의 유전자들에 대한 추가 약화를 시켜 실험을 진행하였다. 우선 라이신과 쓰레오닌의 공통 전구체인 아스파틸 세미알데하이드(Aspartyl semialdehyde)로부터 라이신을 생합성하기 위한 첫번째 작용 효소인 디하이드로피콜린산 신테이즈 (dihydrodipicolinate synthase, dapA)의 활성을 약화시켜주는 것으로 문헌에 보고된 변이를 도입하기 위한 균주를 제작하였다(J Mol Biol. 2004 Apr 23;338(2):329-39). 구체적으로, dihydrodipicolinate synthase (dapA)에 서열번호 65와 같이 355~357번째 염기서열이 기존 TAC에서 TTT로 바뀌어 N 말단에서부터 119번째 아미노산인 타이로신이 페닐알라닌으로 치환된 형태의 변이체 dapA(Y119F) 변이가 도입된 균주를 제작하였다(서열번호 80). 변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작되었다.
dapA(Y119F) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 dapA 유전자의 355~357번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 350bp, 610bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SalI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 66 및 67을 합성하였다. Y119F 이종성 염기 치환변이를 도입하기 위하여 dapA 유전자의 355~357번째 염기서열을 치환하기 위한 프라이머 서열번호 68 및 69를 합성하였다.
구체적으로, pDZ-dapA(Y119F) 플라스미드는 dapA 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 350, 610bp) pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태로 제작되었다. 13032 균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 66 및 68을 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 40초 중합을 30회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 dapA 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 67 및 69를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.
한편 제한효소 SalI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 66 및 67 를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-dapA(Y119F)로 명명하였다.
상기 제작된 벡터를 실시예 11에서 제작된 CA09-0903 균주에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 dapA 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 CA09-0903/dapA(Y119F)로 명명하였다.
실시예 14: dapA 변이 도입주에 대한 쓰레오닌 및 라이신 생산능 분석
실시예 11에서 제작한 CA09-0903 균주를 대조군으로 CA09-0903/dapA(Y119F) 균주를 실시예 7과 같은 방법으로 배양하여 쓰레오닌 및 라이신 생산 수율을 측정하였다.
배양 결과 쓰레오닌 및 라이신 생산능 측정 결과는 하기 표 6과 같다.
쓰레오닌 및 라이신 농도 측정
균주 LYS 농도
(g/L)		 Thr 농도
(g/L)
CA09-0903 1.50 3.40
CA09-0903/dapA(Y119F) 1.10 4.30
그 결과, dapA(Y119F) 변이를 추가로 도입한 균주는 대조군인 CA09-0903 균주 대비 L-라이신의 생산량이 감소하고 L-쓰레오닌 생산량이 0.90 g/L 증가하였고, 따라서, 추가적으로 디하이드로피콜린산 신테이즈 dapA의 119번째 아미노산 변이체 도입을 통해서, 라이신 생합성 경로의 추가 약화로 인해 라이신 생산능은 더욱 저감되었으며, 쓰레오닌의 생산량이 더욱 증가되는 효과를 확인 할 수 있었다.
실시예 15: 라이신 경로 추가 약화주 제작 (lysA)
라이신 생합성 경로의 추가 약화에 의한 L-쓰레오닌 생산능 변화를 명확히 확인하기 위하여, 라이신 생합성 경로의 유전자들에 대한 추가 약화를 진행하였다. 라이신 생합성에 작용하는 마지막 효소인 디아미노피멜산 디카복실레이즈(Diaminopimelate decarboxylase, lysA)의 활성을 약화시켜주는 것으로 문헌에 보고된 변이를 도입하기 위한 균주를 제작하였다(Biochem Biophys Res Commun. 2018 Jan 8;495(2):1815-1821). 구체적으로, Diaminopimelate decarboxylase (lysA)에 서열번호 70과 같이 904~906번째 염기서열이 기존 CGC에서 GCA로 바뀌어 N 말단에서부터 302번째 아미노산인 아르기닌이 알라닌으로 치환된 형태의 변이체 lysA(R302A) 변이가 도입된 균주를 제작하였다(서열번호 81). 변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작되었다.
lysA(R302A) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 lysA 유전자의 904~906번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 500bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SalI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 71 및 72를 합성하였다. R302A 이종성 염기 치환변이를 도입하기 위하여 lysA 유전자의 904~906번째 염기서열을 치환하기 위한 프라이머 서열번호 73 및 74를 합성하였다.
구체적으로, pDZ-lysA(R302A) 플라스미드는 lysA 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 500 bp) pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태로 제작되었다. 13032 균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 71 및 73을 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 40초 중합을 30회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 lysA 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 72 및 74를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.
한편 제한효소 SalI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 66 및 67 를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-lysA(R302A)로 명명하였다.
상기 제작된 벡터를 실시예 11에서 제작된 CA09-0903 균주에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 lysA 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 CA09-0903/lysA(R302A)로 명명하였다.
실시예 16: lysA 변이 도입주에 대한 쓰레오닌 및 라이신 생산능 분석
실시예 11에서 제작한 CA09-0903 균주를 대조군으로 CA09-0903/lysA(R302A) 균주를 실시예 7과 같은 방법으로 배양하여 쓰레오닌 및 라이신 생산 수율을 측정하였다.
배양 결과 쓰레오닌 및 라이신 생산능 측정 결과는 하기 표 7과 같다.
쓰레오닌 및 라이신 농도 측정
균주 LYS 농도
(g/L)		 Thr 농도
(g/L)
CA09-0903 1.50 3.40
CA09-0903/lysA(R302A) 1.30 3.60
그 결과, lysA(R302A) 변이를 추가로 도입한 균주는 대조군인 CA09-0903 균주 대비 L-라이신의 생산량이 감소하고 L-쓰레오닌 생산량이 0.20 g/L 증가하였고, 따라서, 추가적으로 lysA의 302번째 아미노산 변이체 도입을 통해서, 라이신 생합성 경로의 추가 약화로 인해 라이신의 생산능은 더욱 저감되어있으며, 쓰레오닌의 생산량이 더욱 증가되는 효과를 확인 할 수 있었다.
실시예 17: 라이신 경로 추가 약화주 제작 (ddh)
라이신 생합성 경로의 추가 약화에 의한 L-쓰레오닌 생산능 변화를 명확히 확인하기 위하여, 라이신 생합성 경로의 유전자들에 대한 추가 약화를 진행하였다. 라이신 생합성에 작용하는 효소인 디아미노피멜산 디하이드로게나아제(diaminopimelate dehydrogenase, ddh)의 활성을 약화시켜주기 위한 균주를 제작하였다. 구체적으로, diaminopimelate dehydrogenase (ddh)에 서열번호 75과 같이 505~507번째 염기서열이 기존 ACC에서 CTC로 바뀌어 N 말단에서부터 169번째 아미노산인 쓰레오닌이 류신으로 치환된 형태의 변이체 ddh(T169L) 변이가 도입된 균주를 제작하였다(서열번호 82). 변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작하였다.
ddh(T169L) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 lysA 유전자의 505~507번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 500bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 SalI 인식 부위를 삽입한 프라이머 서열번호 76 및 77를 합성하였다. T169L 이종성 염기 치환변이를 도입하기 위하여 ddh유전자의 505~507번째 염기서열을 치환하기 위한 프라이머 서열번호 78 및 79를 합성하였다.
구체적으로, pDZ-ddh(T169L) 플라스미드는 ddh 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 500 bp) pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태로 제작되었다. 13032 균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편은 프라이머 서열번호 76 및 78을 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR 조건은 94˚C에서 2분간 변성 후, 94˚C에서 1분 변성, 56˚C에서 1분 어닐링, 72˚C에서 40초 중합을 30회 반복한 후, 72˚C에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 ddh 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편은 서열번호 77 및 79를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.
한편 제한효소 SalI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 76 및 77 을 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-ddh(T169L)로 명명하였다.
상기 제작된 벡터를 실시예 11에서 제작된 CA09-0903 균주에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 ddh 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 CA09-0903/ddh(T169L)로 명명하였다.
실시예 16: ddh 변이 도입주에 대한 쓰레오닌 및 라이신 생산능 분석
실시예 11에서 제작한 CA09-0903 균주를 대조군으로 CA09-0903/ddh(T169L) 균주를 실시예 7과 같은 방법으로 배양하여 쓰레오닌 및 라이신 생산 수율을 측정하였다.
배양 결과 쓰레오닌 및 라이신 생산능 측정 결과는 하기 표 8과 같다.
쓰레오닌 및 라이신 농도 측정
균주 LYS 농도
(g/L)		 Thr 농도
(g/L)
CA09-0903 1.50 3.40
CA09-0903/ddh(T169L) 1.25 3.75
그 결과, ddh(T169L) 변이를 추가로 도입한 균주는 대조군인 CA09-0903 균주 대비 L-라이신의 생산량이 감소하고 L-쓰레오닌 생산량이 0.35 g/L 증가하였고, 따라서, 추가적으로 ddh의 169번째 아미노산이 치환된 변이체 도입을 통해 라이신 생합성 경로의 추가 약화로 인하여 라이신의 생산능은 더욱 저감되고, 쓰레오닌의 생산량은 더욱 증가되는 효과를 확인 할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명 보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터 KCCM12502P 20190425
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A modified polypeptide of dihydrodipicolinate reductase and a method for L- threonine using the same <130> KPA181613-KR <160> 82 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dapB aa seq. <400> 1 Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala 20 25 30 Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala 35 40 45 Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu 50 55 60 Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly 65 70 75 80 Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys 85 90 95 Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val 100 105 110 Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala 115 120 125 Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly 130 135 140 Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala 145 150 155 160 Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser 165 170 175 Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser 180 185 190 Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly 210 215 220 Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val 225 230 235 240 Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 245 <210> 2 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dapB nt seq. <400> 2 atgggaatca aggttggcgt tctcggagcc aaaggccgtg ttggtcaaac tattgtggca 60 gcagtcaatg agtccgacga tctggagctt gttgcagaga tcggcgtcga cgatgatttg 120 agccttctgg tagacaacgg cgctgaagtt gtcgttgact tcaccactcc taacgctgtg 180 atgggcaacc tggagttctg catcaacaac ggcatttctg cggttgttgg aaccacgggc 240 ttcgatgatg ctcgtttgga gcaggttcgc gactggcttg aaggaaaaga caatgtcggt 300 gttctgatcg cacctaactt tgctatctct gcggtgttga ccatggtctt ttccaagcag 360 gctgcccgct tcttcgaatc agctgaagtt attgagctgc 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Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac 34 <210> 57 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt 34 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30 <210> 59 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcc 29 <210> 60 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hom variant aa seq. <400> 60 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 Glu Arg Asp Asp Asp Ala His Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 61 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 atcctctaga gtcgacccaa ctgcagacgt cgaa 34 <210> 62 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 atgcctgcag gtcgacatag acagatttgt ccacg 35 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gtgaccacga tcagatgtgc atcatcatcg cgctc 35 <210> 64 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gcgatgatga tgcacatctg atcgtggtca cccac 35 <210> 65 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dapA variant aa seq. <400> 65 Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr 1 5 10 15 Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp 20 25 30 Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu 35 40 45 Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr 50 55 60 Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Arg Ala Lys Leu Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr 85 90 95 Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu 100 105 110 Leu Val Val Thr Pro Tyr Phe Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu 115 120 125 Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu 130 135 140 Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met 145 150 155 160 Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys 165 170 175 Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala 180 185 190 Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu 210 215 220 Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg 225 230 235 240 Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu 245 250 255 Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn 260 265 270 Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu 275 280 285 Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu 290 295 300 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 atcctctaga gtcgacatga gcacaggttt aacag 35 <210> 67 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 atgcctgcag gtcgacttgc gggtaacctt ccggc 35 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 ttggctcggc ttggaaaaat aaggagttac aacta 35 <210> 69 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 gttgtaactc cttatttttc caagccgagc caagag 36 <210> 70 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lysA variant aa seq. <400> 70 Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro 1 5 10 15 Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val 20 25 30 Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val 35 40 45 Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe 50 55 60 Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 80 Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala 85 90 95 Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala 115 120 125 Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu 130 135 140 Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp 145 150 155 160 Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe 165 170 175 Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu 195 200 205 Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala 210 215 220 Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln 225 230 235 240 Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly 245 250 255 Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala 260 265 270 Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu 275 280 285 Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Ala Ala Ile 290 295 300 Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320 Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly 325 330 335 Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345 350 Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg 355 360 365 Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu 370 375 380 Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410 415 Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425 430 Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445 <210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 atcctctaga gtcgacgaca cgtggtgctg gactc 35 <210> 72 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 atgcctgcag gtcgacagaa acccagaaac ccaaa 35 <210> 73 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 gggcctgcga tagctgcgcc gggctcaaca agcac 35 <210> 74 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 ttgttgagcc cggcgcagct atcgcaggcc cctcc 35 <210> 75 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ddh variant aa seq. <400> 75 Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15 Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly 20 25 30 Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp 35 40 45 Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu 50 55 60 Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala 65 70 75 80 Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro 85 90 95 Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val 100 105 110 Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg 115 120 125 Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp 130 135 140 Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro 145 150 155 160 Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Leu Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu 165 170 175 Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr 180 185 190 His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg 195 200 205 Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu 210 215 220 Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr 225 230 235 240 Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly 245 250 255 Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp 260 265 270 Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met 275 280 285 Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro 290 295 300 Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg 305 310 315 <210> 76 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 atcctctaga gtcgacccaa catccgcgta gcta 34 <210> 77 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 atgcctgcag gtcgacaaga ggcaaggaaa ccac 34 <210> 78 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 gtcttcggat gggaggaggt actggactgc cttttg 36 <210> 79 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 aaggcagtcc agtacctcct cccatccgaa gacgcc 36 <210> 80 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dapA aa seq. <400> 80 Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr 1 5 10 15 Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp 20 25 30 Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu 35 40 45 Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr 50 55 60 Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Arg Ala Lys Leu Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr 85 90 95 Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu 100 105 110 Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu 115 120 125 Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu 130 135 140 Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met 145 150 155 160 Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys 165 170 175 Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala 180 185 190 Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu 210 215 220 Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg 225 230 235 240 Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu 245 250 255 Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn 260 265 270 Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu 275 280 285 Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu 290 295 300 <210> 81 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lysA aa seq. <400> 81 Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro 1 5 10 15 Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val 20 25 30 Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val 35 40 45 Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe 50 55 60 Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 80 Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala 85 90 95 Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala 115 120 125 Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu 130 135 140 Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp 145 150 155 160 Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe 165 170 175 Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu 195 200 205 Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala 210 215 220 Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln 225 230 235 240 Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly 245 250 255 Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala 260 265 270 Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu 275 280 285 Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile 290 295 300 Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320 Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly 325 330 335 Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345 350 Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg 355 360 365 Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu 370 375 380 Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410 415 Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425 430 Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445 <210> 82 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ddh aa seq. <400> 82 Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15 Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly 20 25 30 Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp 35 40 45 Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu 50 55 60 Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala 65 70 75 80 Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro 85 90 95 Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val 100 105 110 Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg 115 120 125 Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp 130 135 140 Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro 145 150 155 160 Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu 165 170 175 Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr 180 185 190 His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg 195 200 205 Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu 210 215 220 Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr 225 230 235 240 Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly 245 250 255 Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp 260 265 270 Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met 275 280 285 Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro 290 295 300 Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val 305 310 315 320

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 13번째 위치에 상응하는 아미노산이 아스파라긴(Asparagine), 쓰레오닌(Threonine), 시스테인(Cysteine), 타이로신(Tyrosine), 세린(Serine), 라이신(Lysine) 또는 글루타민(Glutamine)으로 치환되고, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열과 적어도 80%, 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지며, 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 변이형 폴리펩티드의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 야생형 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성보다 약화된 활성을 갖는, 변이형 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열과 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열은 서열번호 51로 기재되는 아미노산 서열인 것인, 변이형 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3 또는 서열번호 53의 아미노산 서열로 이루어진, 변이형 폴리펩티드.
  5. 제1항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 54의 염기서열로 이루어진, 폴리뉴클레오티드.
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 13번째 위치에 상응하는 아미노산이 아스파라긴(Asparagine), 쓰레오닌(Threonine), 시스테인(Cysteine), 타이로신(Tyrosine), 세린(Serine), 라이신(Lysine) 또는 글루타민(Glutamine)으로 치환되고, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열과 적어도 80%, 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지며, 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 포함하는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열은 서열번호 51인 것인, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) 미생물은 추가적으로 다음의 (1) 내지 (3)의 변이형 폴리펩티드 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) 미생물.
    (1) 디하이드로피콜린산 신테이즈 (dihydrodipicolinate synthase) 활성이 약화된 변이형 폴리펩티드.
    (2) 디아미노피멜산 디카복실레이즈(Diaminopimelate decarboxylase) 활성이 약화된 변이형 폴리펩티드
    (3) 디아미노피멜산 디하이드로게나아제(diaminopimelate dehydrogenase) 활성이 약화된 변이형 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 (1) 내지 (3)의 변이형 폴리펩티드 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) 미생물.
    (1) 서열번호 65의 아미노산 서열에서 119번째 아미노산이 타이로신(Tyrosine)에서 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 치환된 디하이드로피콜린산 신테이즈 (dihydrodipicolinate synthase) 변이형 폴리펩티드
    (2) 서열번호 70의 아미노산 서열에서 302번째 아미노산이 아르기닌(Arginine)에서 알라닌(Alanine)으로 치환된 디아미노피멜산 디카복실레이즈(Diaminopimelate decarboxylase)변이형 폴리펩티드; 및
    (3) 서열번호 75의 아미노산 서열에서 169번째 아미노산이 쓰레오닌(Threonine)에서 류신(Leucine)으로 치환된 디아미노피멜산 디하이드로게나아제(diaminopimelate dehydrogenase)변이형 폴리펩티드.
  11. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 비변이형 균주에 비해 L-쓰레오닌(Threonine) 생산능이 증가된 것인, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) 미생물.
  12. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  13. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 13번째 위치에 상응하는 아미노산이 아스파라긴(Asparagine), 쓰레오닌(Threonine), 시스테인(Cysteine), 타이로신(Tyrosine), 세린(Serine), 라이신(Lysine) 또는 글루타민(Glutamine)으로 치환되고, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열과 적어도 80%, 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지며, 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dihydrodipicolinate reductase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 포함하는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌(Threonine)을 생산하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열은 서열번호 51인 것인, L-쓰레오닌(Threonine)을 생산하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계에 배양한 배지 및 미생물로부터 L-쓰레오닌(Threonine)을 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는, L- 쓰레오닌(Threonine)을 생산하는 방법.
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BR112021025705-5A BR112021025705B1 (pt) 2019-09-26 2020-08-06 Polipeptídeo de di-hidrodipicolinato redutase variante, polinucleotídeo, microrganismo transgênico do gênero corynebacterium e método de produção de l-treonina com o uso do mesmo
JP2021570197A JP7311634B2 (ja) 2019-09-26 2020-08-06 ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－スレオニン生産方法
CN202080051611.2A CN114729338B (zh) 2019-09-26 2020-08-06 变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽和使用其生产l-苏氨酸的方法
EP20869104.8A EP3960851A4 (en) 2019-09-26 2020-08-06 MODIFIED POLYPEPTIDE OF DIHYDRODIPICOLINATE REDUCTASE, AND METHOD FOR PRODUCING L-THREONINE USING THE SAME
PCT/KR2020/010419 WO2021060696A1 (ko) 2019-09-26 2020-08-06 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
US17/623,231 US20220356480A1 (en) 2019-09-26 2020-08-06 Variant dihydrodipicolinate reductase polypeptide and method of producing l-threonine using the same
MX2021015842A MX2021015842A (es) 2019-09-26 2020-08-06 Polipeptido variante de dihidrodipicolinato reductasa y procedimiento de produccion de l-treonina mediante el uso del mismo.
ARP200102630A AR120028A1 (es) 2019-09-26 2020-09-22 Variante de polipéptido de dihidrodipicolinato reductasa y procedimiento de producción de l-treonina usando la misma
ZA2021/09712A ZA202109712B (en) 2019-09-26 2021-11-29 Variant dihydrodipicolinate reductase polypeptide and method of producing l-threonine using the same

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021060696A1 (ko) * 2019-09-26 2021-04-01 씨제이제일제당 (주) 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
WO2022225254A1 (ko) 2021-04-20 2022-10-27 씨제이제일제당 (주) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법
WO2023171997A1 (ko) 2022-03-07 2023-09-14 씨제이제일제당 (주) 변이형 l-쓰레오닌 배출 단백질 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
WO2023171996A1 (ko) 2022-03-07 2023-09-14 씨제이제일제당 (주) 변이형 l-쓰레오닌 배출 단백질 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020065932A (ko) * 2000-01-21 2002-08-14 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-라이신의 제조 방법
KR101512432B1 (ko) * 2010-06-15 2015-04-16 백광산업 주식회사 미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법
KR20170047642A (ko) * 2015-10-23 2017-05-08 씨제이제일제당 (주) Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-쓰레오닌을 생산하는 방법

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
JP4168463B2 (ja) * 1996-12-05 2008-10-22 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
US6927046B1 (en) * 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
JP2005227977A (ja) 2004-02-12 2005-08-25 Fuji Heavy Ind Ltd 車販売支援システム、在庫管理サーバ、車販売支援プログラム及び車販売支援方法
DE102004035052A1 (de) * 2004-07-20 2006-02-16 Basf Ag Mikroorganismen zur Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen
JP5048996B2 (ja) 2006-11-10 2012-10-17 昭和電工株式会社 加工性に優れた耐摩耗性アルミニウム合金材およびその製造方法
KR100838038B1 (ko) 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
BRPI0720967A2 (pt) * 2006-12-29 2014-03-11 Evonik Degussa Gmbh Metionina sintases com inibição reduzida de produto.
KR100858913B1 (ko) * 2007-03-09 2008-09-17 한국과학기술원 부위특이적 변이에 의해 제조된 고수율의 ｌ－쓰레오닌생산균주 및 이를 이용한 ｌ－쓰레오닌의 제조방법
KR101485222B1 (ko) * 2012-10-05 2015-01-22 상지대학교산학협력단 ｄａｐＡ 활성 조절을 통해 Ｌ-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산방법
JP2017504329A (ja) * 2014-01-16 2017-02-09 キャリスタ， インコーポレイテッド アミノ酸の増強された産生のための微生物および関連する方法
EP3625351A1 (en) * 2017-05-19 2020-03-25 Zymergen Inc. Genomic engineering of biosynthetic pathways leading to increased nadph
CN107916246A (zh) * 2017-11-17 2018-04-17 江南大学 遗传改造谷氨酸棒杆菌中dhdpr提高赖氨酸产量的方法
KR102233376B1 (ko) * 2019-09-26 2021-03-30 씨제이제일제당 주식회사 메조 디아미노피멜레이트 디하이드로게네이즈 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
KR102126951B1 (ko) * 2019-09-26 2020-06-26 씨제이제일제당 주식회사 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020065932A (ko) * 2000-01-21 2002-08-14 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-라이신의 제조 방법
KR101512432B1 (ko) * 2010-06-15 2015-04-16 백광산업 주식회사 미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법
KR20170047642A (ko) * 2015-10-23 2017-05-08 씨제이제일제당 (주) Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-쓰레오닌을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnology and Bioengineering. 2018, Vol.115, pp.1764-1777 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021060696A1 (ko) * 2019-09-26 2021-04-01 씨제이제일제당 (주) 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
WO2022225254A1 (ko) 2021-04-20 2022-10-27 씨제이제일제당 (주) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법
JP2024510838A (ja) * 2021-04-20 2024-03-11 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
JP7639167B2 (ja) 2021-04-20 2025-03-04 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
WO2023171997A1 (ko) 2022-03-07 2023-09-14 씨제이제일제당 (주) 변이형 l-쓰레오닌 배출 단백질 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
WO2023171996A1 (ko) 2022-03-07 2023-09-14 씨제이제일제당 (주) 변이형 l-쓰레오닌 배출 단백질 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법

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