KR102107812B1

KR102107812B1 - 인지기능 및 기억력 개선용 실크 유래 펩타이드의 제조방법

Info

Publication number: KR102107812B1
Application number: KR1020190141469A
Authority: KR
Inventors: 이지원
Original assignee: 주식회사 네이처센스 농업회사법인
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2020-05-07
Anticipated expiration: 2039-11-07

Abstract

본 발명은 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 실크 유래 펩타이드의 제조방법은 실크 피브로인을 용해시키는 용해 단계; 상기 실크 피브로인 용해물에 플라보자임(Flavourzyme), 파파인(Papain), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 베론-더블유(Veron), 수미자임(Sumizyme), 징지바인(zingibain), 칼파인(Calpain), 프로테아제NP(Protease NP), 발리다제(Validase) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 단백질 가수분해 효소로 처리하여 가수분해하는 단계; 및 단백질 가수분해 효소를 제거하는 효소 제거단계를 포함하는 것일 수 있다.

Description

인지기능 및 기억력 개선용 실크 유래 펩타이드의 제조방법{PREPARATION METHOD OF SILK-DERIVED PEPTIDE FOR IMPROVING COGNITIVE FUNCTION AND MEMORY}

본 발명은 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 누에고치 즉, 실크 중 피브로인을 효소 가수분해 하여 보다 효과적으로 실크 유래 펩타이드를 제조할 수 있는 방법을 제공한다.

현대사회에서 기능성 소재 분야는 신소재를 찾는 방법 이외에 기존의 소재에서 필요로 하는 유효성분을 특정하여 정제 및 분리함으로서 필요에 맞는 형태로 제공할 수 있도록 하고 있다.

한편, 누에고치는 섬유상 단백질인 피브로인과 그것을 둘러싸고 있는 고무상 단백질인 세리신으로 구성되어 있다. 실크 단백질의 아미노산은 글라이신(glycine), 알라닌(alanine), 세리신(sericine), 티로신(tyrosine) 등으로서 주요 아미노산이 90% 이상을 차지하고 있다. 이러한 단백질을 최근에는 기능성 식품이나 음료의 소재로 이용하기 위한 개발이 활발히 진행되고 있다. 그러나 이제까지의 기술들은 누에고치로 채취되는 견단백질을 별다른 처리 공정을 거치지 아니하고 원형그대로 사용하였거나 용해된 피브로인 수용액의 정제를 투석(Dialysis)에 의해 정제하는 방법을 사용하였으므로 대량 생산시 생산의 수율이 저하되는 비경제적인 면이 있었으며 견단백질이 가지고 있는 섬유상의 구조적인 특징 및 아미노산의 배열 등으로 인체 내에서의 분해의 지연이나 분해가 어려워 흡수율이 저하되어 기능성 식품 소재로서의 가치가 떨어지는 등의 문제점이 내포되어 있다.

실크 아미노산의 제조 기술은 크게 산 가수분해방법과 효소분해방법이 알려져 있다. 일본에서는 이 실크 단백질을 산, 알칼리 또는 효소적 가수분해를 통해 저분자 펩타이드 또는 아미노산 형태로 분해하여 소화흡수를 용이하게 하는 방식으로 식용화하고 있다. 그 중 효소분해법은 효소의 단백질의 특정 결합에 관여하여 결합고리를 절단하게 되므로, 견단백질이 아미노산까지 분해되는 분해율이 매우 낮은데 비하여 산가수분해법은 거의 대부분이 아미노산이나 펩타이드까지 분해가 된다. 실제 대량생산 공정상에서 볼 때 효소분해법은 공정이 간단한데 비하여 분해율이 낮고, 그로 인한 수율이 저조하며, 인체 흡수율이 낮은데 비하여, 산가수분해법으로 생산된 실크 아미노산은 인체 흡수율 거의 90% 정도로 흡수되기 효과적인 형태로 구성되어 있으며, 인체에 유용한 생리활성을 가지는 기능적 아미노산은 더 많이 함유되어 있다.

본 발명에서 제시된 실크단백질의 산가수분해법은 산가수분해물의 아미노산 조성 및 생리활성을 나타내는 기능적 성분의 함량에서 더 우위를 차지하는 제품을 생산할 수 있는 새로운 것이다.

단백질원의 가수분해를 통하여 생산되는 기능성 펩타이드의 시장 및 그 연구개발은 현재 일본이 가장 앞서고 있지만 아직 펩타이드 식품의 응용범위는 아직 제한되어 있으며 시장도 형성단계에 있다. 현재 일본에서 상품화된 기능성 펩타이드 식품은 소화흡수 촉진 기능성, 실크 가수분해물의 단백질 분자량의 분포 및 소화에 관한 연구, 실크 피브로인의 혈청콜레스테롤 억제효과, 콜레스테롤의 대사에 있어서 함황아미노산의 중요성, 칼슘흡수촉진 및 골다공증 예방, 알코올 흡수저해 기능성, 고혈압 예방 기능성, 항산화 기능성, 항알레르기 기능성 등이 계속 연구되고 있는 것으로 알려져 있다.

그리고 실크 피브로인의 또 다른 기능성 연구로서 기포성의 식품가공에의 이용 및 견직물 잔사의 식품소재로서의 응용에 관한 연구결과도 보고되어 있다. 그러나 이들 생리활성에 대한 체계적인 연구가 되어 있는 것이 아니라 가수분해물을 동물에 투여하여 활성을 확인하는 정도이거나(항당뇨, 알콜대사촉진, 콜레스테롤 저하작용 등) 주요 아미노산이 나타낼 수 있는 활성이 가수분해물에서도 나타날 것으로 추정하는 정도이다. 본 발명에서 제시된 제품의 기능성은 유전자의 손상을 억제시켜주는 항암, 항유전 독성 등이다.

KR 10-2001-0079286 A KR 10-2001-0105931 A

본 발명의 목적은 가수분해 효소를 이용하여 보다 효과적으로 실크 유래 펩타이드를 생산할 수 있는 실크 유래 펩타이드의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

또한 인지기능 개선 효과, 특히 초기 개선효과가 우수한 실크 유래 펩타이드의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 따라 제조된 실크 유래 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 실크 유래 펩타이드의 제조방법은 실크 피브로인을 용해시키는 용해 단계; 상기 실크 피브로인 용해물에 플라보자임(Flavourzyme), 파파인(Papain), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 베론-더블유(Veron), 수미자임(Sumizyme), 징지바인(zingibain), 징지바인(zingibain), 칼파인(Calpain), 프로테아제NP(Protease NP), 발리다제(Validase) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 단백질 가수분해 효소로 처리하여 가수분해하는 단계; 및 단백질 가수분해 효소를 제거하는 효소 제거단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 있어서, 상기 단백질 가수분해 효소는 우마미자임(Umamizyme)을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 있어서, 상기 효소 제거단계는 열처리 하여 효소의 활성을 제거하는 것일 수 있다.

상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 있어서, 상기 실크 유래 펩타이드는 기억력 개선용인 것일 수 있다.

상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 있어서, 상기 실크 유래 펩타이드는 인지기능장애 예방 또는 개선용인 것일 수 있다.

상기 인지기능장애는 치매, 학습장애, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증, 섬망, AIDS 유발 치매, 빈스완거 병, 루이소체 치매, 전두측두엽성 치매, 경도 인지 장애, 다발성 경색성 치매, 픽병, 의미치매, 알츠하이머성 치매 또는 혈관성 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 실크 유래 펩타이드의 제조방법은 실크 피브로인을 용해시키는 용해 단계; 상기 실크 피브로인 용해물에 플라보자임(Flavourzyme), 파파인(Papain), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 베론-더블유(Veron), 수미자임(Sumizyme), 징지바인(zingibain), 칼파인(Calpain), 프로테아제NP(Protease NP), 발리다제(Validase) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 단백질 가수분해 효소로 처리하여 가수분해하는 단계; 및 단백질 가수분해 효소를 제거하는 효소 제거단계를 포함하는 것일 수 있다.

실크(silk)란 누에가 만든 고치로부터 얻어지는 섬유를 말하며, 이것을 원료로 한 견사로 제조한 제품을 총칭한다. 넓은 뜻으로는 작잠사 등의 야잠사, 견 방사를 원료한 견 제품을 포함하여 가리키기도 한다. 보통 견이라고 부르는 가잠견(true silk)은 사육 견(cultivated or domestic silk)이라고도 한다. 한편 본 발명에서 말하는 누에고치는 실크를 포함하는 개념으로 정의한다.

실크 섬유는 피브로인과 세리신으로 구성되어 있으며, 그 밖에 소량의 뇌질, 지방질 및 무기염류를 함유하고 있다. 실크의 구성성분은 피브로인과 세리신이고 이들은 섬유모양의 단백질이다. 이것은 천연의 상태에서는 생체 고분자로 구성되어 있다. 보통 분자량이 10,000이상인 화합물은 섬유, 막(membrance) 또는 덩이모양이다. 실크는 고분자의 단백질이고, 단백질은 아미노산으로 되어있으며, 아미노산은 탄소에 아미노기(-NH₂)와 카르복실기(-COOH)가 결합되어 단순한 알파 아미노산으로 구성된다.

그리고 수 많은 아미노산들이 사슬고리를 가지고 염주모양으로 연결된 고분자를 폴리펩타이드라 한다. 결국 두 개의 아미노산의 -NH₂와 -COOH가 반응하여 물(H₂O)이 빠져나가게 되고 평행으로 배열하여 섬유화가 이루어진다.

피브로인을 이루는 아미노산은 글라이신(측쇄 -H), 알라닌(-CH₃)이 많은데 이들 아미노산은 분자의 측쇄가 짧은 것이 특색이다. 그리고 세린(측쇄-CH₂OH), 티로신(측쇄-CH(OH)CH₂)를 합하면 90% 이상이다. 그리고 산성 아미노산(아스파르트산, 글루탐산)과 여기성 아미노산(라이신, 알라닌, 히스디틴)의 함량이 적은 것이 세리신의 아미노산 조성과의 차이이다. 이들 아미노산을 서로 다른 연결조합으로 결합하면 폴리펩타이드를 형성한다. 피브로인을 가수분해시키면 아미노산이 되고, 분자량이 30 내지 50만으로부터 3,000 내지 3,500의 알파 아미노산이 결합하여 한 가닥의 분자를 구성한다.

본 발명에서 말하는 실크 유래 펩타이드는 체내에 흡수될 수 있는 정도의 크기로 상기 실크에서 유래한 실크 피브로인을 일정한 아미노산 서열을 가지는 것으로 가수분해하여 가공된 것을 말한다.

또한 본 발명에서 말하는 실크 유래 펩타이드는 실크 단백질로도 표현될 수 있고 같은 의미로 사용될 수 있다.

바람직하게 실크 유래 펩타이드의 제조방법은 실크 피브로인을 용해시키는 용해 단계 이전에, 누에고치와 정제수를 혼합하고 열처리하여 세리신(sericin)이 제거하고 실크 피브로인을 수득하는 세리신 제거단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 세리신 제거단계는 실크 피브로인을 감싸고 있는 세리신을 제거하는 단계를 말한다. 세리신은 극성 아미노산을 포함하고 있으므로, 정제수에 열처리를 하면서 제거하는 것이 일반적이다. 특히 높은 온도에서 세리신 제거단계를 진행할수록 세리신 제거의 공정효율이 증가하지만, 97 ℃를 초과하는 온도에서는 피브로인에 대한 손실이 발생하기 때문에 온도를 무제한으로 높일 수 없다는 문제가 있다.

상기 실크 피브로인 유래 펩타이드의 제조방법에 있어서, 상기 세리신 제거단계는 점증제 및 첨가제를 포함하는 것이고, 30 내지 70℃로 열처리하는 것일 수 있다.

상기 세리신 제거단계는 점증제 및 첨가제를 포함하면서 30 내지 70℃에서 열처리를 진행하는 경우 열처리하면서, 동일한 온도에서, 점도를 높이지 않은 경우에 비하여 세리신 제거공정이 훨씬 빨라질 수 있다. 특히 점도를 높이는 경우 피브로인의 손실이 발생하지 않는다는 장점이 있다.

상기 실크 피브로인 유래 펩타이드의 제조방법에 있어서, 상기 세리신 제거단계에서 누에고치와 정제수의 혼합물은 점도가 1.2 내지 120 cP인 것일 수 있다.

상기 점도 범위에 의하는 경우 세리신 제거공정에 있어서 세리신이 빠르게 제거될 수 있을 뿐만 아니라 피브로인의 손실이 거의 없다는 장점을 가진다.

바람직하게 상기 실크 피브로인 유래 펩타이드의 제조방법에 있어서, 상기 세리신 제거단계는 누에고치와 정제수의 혼합물은 점도가 1.3 내지 40 cP이고, 98 내지 100℃에서 2 내지 10분 간 열처리 하는 1차 열처리 단계 및 30 내지 40℃로 열처리하는 2차 열처리 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 1차 열처리 단계는 피브로인이 용해되는 온도이지만, 누에고치와 정제수의 혼합물에 대한 점도를 1.3 내지 40 cP로 조절하여 열처리를 개시하는 경우 피브로인의 손실이 발생하지 않을 수 있다.

이후 상대적으로 낮은 2차 열처리 단계를 진행하는 경우 빠르게 세리신이 제거될 수 있다.

상기 1차 열처리 단계에 있어서 누에고치와 정제수의 혼합물에 대한 점도가 1.3 cP 미만인 경우 급격한 피브로인의 손실이 발생하는 문제가 있다. 반면 점도가 40 cP를 초과하는 경우에는 1차 열처리 단계에 불구하고 세리신 제거에 대한 공정개선 효과가 나타나지 않을 수 있다.

따라서 상기 점도 범위를 유지하면서 1차 열처리 및 2차 열처리 공정에 의하는 경우 세리신을 보다 효과적으로 제거하면서도 피브로인에 대한 손실이 발생하지 않아 세리신 제거공정의 효율을 높일 수 있다.

상기 첨가제를 포함하는 경우 피부로인에 대한 소실을 최소화 시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이후 단계에서 기억력 및 인지기능 개선효과를 나타내는 피브로인 가수분해물, 즉 실크 피브로인 유래 펩타이드에 대한 수득률을 높일 수 있다.

바람직하게 상기 첨가제는 자일나아제를 포함하고, 상기 자일나아제 100 중량부에 대하여, 소르비톨 10 내지 100 중량부; 만니톨 1 내지 10 중량부; 칼락토오스 0.1 내지 5 중량부가 포함되는 것일 수 있다.

상기 범위에 의하는 경우 세리신 제거 단계에서 피브로인의 손실을 줄이고, 가수분해 단계에서 인지기능개선 효과를 가지는 실크 피브로인 유래 펩타이드의 수득량이 높아지고, 인지기능 및 기억력 개선효율이 개선될 수 있다.

상기 용해 단계는 실크 피브로인이 정제수, 유기용매 기타 액체에 혼합된 상태가 되도록 제조하는 것을 말한다.

상기 가수분해 단계는 실크 피브로인 용해물에 플라보자임(Flavourzyme), 파파인(Papain), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 베론-더블유(Veron), 수미자임(Sumizyme), 징지바인(zingibain), 칼파인(Calpain), 프로테아제NP(Protease NP), 발리다제(Validase) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 처리하여 가수분해 하는 것을 말한다.

바람직하게 상기 가수 분해 효소는 파파인, 징지바인, 칼파인 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 인지기능 및 기억력 개선 효과가 높은 실크 피브로인 펩타이드를 생산하게 할 수 있다.

더 바람직하게 상기 가수 분해 효소는 파파인을 포함하고, 파파인 100 중량부에 대하여 징지바인 10 내지 50 중량부, 칼파인 5 내지 30 중량부를 혼합시킨 혼합 효소를 사용한 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 인지기능 및 기억력 개선 효과가 우수할 뿐만 아니라, 짧은 기간 내에 인지기능 및 기억력 개선효과가 급격하게 높아지는 효과를 낼 수 있다. 따라서 상대적으로 단기간 내에 인지기능 및 기억력 개선효과가 나타날 수 있는 실크 피브로인 펩타이드를 생산하게 할 수 있다.

상기 단백질 가수분해 효소를 제거하는 효소 제거단계는 가수분해 단계 이후 효소를 제거하거나 효소의 활성을 제거하는 것을 말하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 사용할 수 있는 모든 형태의 것을 포함하는 것으로 정의한다.

또한 상기 효소 제거단계는 열처리 하여 효소의 활성을 제거하는 것일 수 있다.

상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 있어서, 상기 단백질 가수분해 효소는 우마미자임(Umamizyme)을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 우미자임을 포함하는 경우 가수분해물의 흡수율과 인지기능 개선에 대한 유효성분의 활성이 증대되어 보다 짧은 시간에 적은 함량으로 인지기능 및 기억력 개선효과가 나타나게 할 수 있다.

바람직하게 상기 가수 분해 효소는 파파인을 포함하고, 파파인 100 중량부에 대하여 징지바인 10 내지 50 중량부, 칼파인 5 내지 30 중량부, 우마미자임 1 내지 20 중량부를 혼합시킨 혼합 효소를 사용한 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 가수분해물의 흡수율과 인지기능 개선에 대한 유효성분의 활성이 크게 증가한 실크 유래 펩타이드를 제조할 수 있다.

상기 효소 제거단계는 열처리 하여 효소의 활성을 제거하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 인지기능 및 기억력 개선용 식품은 상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 따라 제조된 실크 유래 펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 말하는 인지기능 및 기억력 개선은 단순히 인지기능 (cognitive function) 및 기억력의 둔화가 회복되거나 보다 개선되는 의미뿐만 아니라. 뇌 신경질환에 의하여 발생한 인지기능 및 기억력 저하의 현상이 예방 또는 개선되는 것을 포함하는 것으로 정의한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 뇌 신경질환 예방 및 개선용 의약품은 상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 따라 제조된 실크 유래 펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 말하는 상기 뇌 신경질환은 치매, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증 등과 같은 신경 퇴행성 질환, 허혈성 뇌졸중 등과 같은 허혈 또는 재관류에 의한 질환, 우울증, 정신분열증 및 심적 외상후 스트레스 장애와 같은 정신 질환을 모두 포함하는 것으로 정의한다.

본 발명에 따른 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 의하는 경우 가수분해 효소를 이용하여 보다 효과적으로 실크 유래 펩타이드를 생산할 수 있다.

또한 상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 의하는 경우 인지기능 개선 효과, 특히 초기 개선효과가 우수한 실크 유래 펩타이드를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 실크 유래 펩타이드는 상기 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 따라 제조된 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 실크 유래 펩타이드의 제조방법에 대한 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 실크 펩타이드에 관한 인지기억평가실험 결과에 관한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 실크 펩타이드의 허혈에 의한 뇌경색 부위에 대한 효과실험 결과에 대한 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예: 실크 유래 펩타이드의 제조]

용해시킨 실크 피브로인을 정제수와 혼합하고 하기의 [표 1]과 같은 조성에 따른 단백질 가수분해 효소 T1 내지 T11을 1w% 처리하고, 5 시간 동안 가수분해를 진행하였다. 그 이후 10분간 열처리를 하여 효소의 활성을 제거한 뒤 동결건조 하여 [표 2]와 같은 분말상을 제조하였다.

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11
플라보자임	100	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
프로타맥스	-	100	-	-	-	-	-	-	-	-	-
파파인	-	-	100	100	100	100	100	100	100	100	100
징지바인	-	-	-	5	10	30	50	60	30	30	30
칼파인	-	-	-	5	10	20	30	40	20	20	20
우마미자임	-	-	-	-	-	-	-	-	0.5	10	25

(단위: 중량부)

	NF1	NF2	NF3	NF4	NF5	NF6	NF7	NF8	NF9	NF10	NF11
처리효소	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10	T11

[실험예: 기억력 및 인지기능 개선 효과에 관한 실험]

실험예1: 인지기능 개선에 대한 동물 모델 실험

A. 실험 동물의 준비

실험 동물은 웅성 백서 (Sprague Dawley, 140 내지 180 g, 대한실험동물센터)로서, 이들은 일정한 환경 (실내온도 25±1℃, 상대습도 60±10%)에서 일주일 동안 하나의 사육 상자 당 4 마리씩 넣어 물은 제한 없이 제공하였으며, 이때, 몸무게의 80%를 유지하도록 제한 급식을 실시하였다. 본 실험에서는 총 50 마리를 사용하였다. 훈련 3일 전부터 5분씩 미로에 적응시켜 검사를 진행하였다.

B. 교대 지연 검사(delayed alternation test)

총 세 개의 통로(왼쪽, 오른쪽, 중앙부)가 있으며, 각 통로 입구는 실험자가 동물의 출입을 통제할 수 있도록 칸막이를 설치한 “ㅠ”자 모양의 미로를 준비하였다.

첫 시행에서는 출발 상자에 1분간 적응시켰다. 첫 시행은 '강제 선택 시행'으로, 칸막이로 한쪽 통로를 막아놓고 반대편 통로에 동물이 들어가면 칸막이로 후방을 막았다. 동물의 사지가 통로 입구를 통과하면 동물이 들어간 것으로 간주하였다. 60초간 동물이 해당 통로에서 먹이를 먹도록 하였다.

다음 시행부터는 '자유 선택 시행'으로 동물이 출발상자에서 출발하여 자유롭게 통로의 방향(왼쪽 혹은 오른쪽)을 선택하도록 하였다. 동물은 바로 이전의 시행에서 들어갔던 통로와 반대편 통로로 들어갔을 경우에만 먹이 보상을 하였다.

시행 간격은 5초 및 20초로 지연 시간(delay)를 두고 구성되며, 매 시행의 제한시간(cut-off time)은 60초로 하였다. 동물이 강화가 주어지는 통로에 정확하게 들어간 횟수와 통로까지 들어가는데 걸린 시간을 측정하였다. 하루에 10 시행식 9일 동안 동일한 절차를 수행하여 평가하였다.

C. 투여 방법

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 실크 펩타이드 NF 1 내지 NF 11을 100 ㎎/㎖의 용액으로 제조하여 구강 투여하였다. 모든 시료들은 증류수에 용해하여 구강 투여하였다.

D. 인지 기억 평가 결과

실크펩타이드 NF 1 내지 NF 11을 투여한 군에 대해 T-maze 실험을 진행한 결과를 하기의 [도 2]에 나타내었다. [도 2]는 시행 간격을 5초로 구성하여 실험을 진행한 것으로, 9일 간의 훈련 기간 동안 성능이 점차적으로 향상되었다.

하기의 [도 2]를 참조하면, NF5 내지 NF7, NF9 내지 NF11에 의하는 경우 인지기능에 대한 향상 효과가 뚜렷하게 나타난다는 점을 확인할 수 있다. 또한 위 제조예에 의하는 경우에는 초반 개선효과도 우수하다는 점을 알 수 있었다.

특히 NF10의 경우 다른 제조예에 비하여 월등히 우수한 투여 초기 인지기능 개선효과를 나타낸다는 점을 알 수 있다. 이는 혼합 가수분해 효소에 의하여 가수분해된 실크 피브로인에서 특정한 시퀀스를 가지는 펩타이드가 일정한 범위로 혼합되어 존재하는 경우 인지기능 개선효과를 가속화 시킴으로서 투여 초기에 빠른 효과를 나타내게 한다는 것으로 이해될 수 있다.

이에 대하여 분석한 결과, 하기의 [일반식 1] 및 [일반식 2]로 표시되는 시퀀스를 포함하는 펩타이드가 동시에 포함되는 경우 위와 같은 가속 효과가 발생할 수 있는 것으로 여겨진다.

[일반식 1]

Tyr-Gly-X₁-X₂

(상기 일반식에서 X₁은 Ala, Tyr, Val 또는 Gln이고, X₂는 Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이다.)

[일반식 2]

Ile-Gly-Z₁-Z₂

(상기 일반식에서 Z₁은 Ala, Tyr, Val 또는 Gln이고, Z₂는 Ala, Tyr, Val 또는 Gly이다.)

따라서 상기 범위에 의하는 경우 인지기능 및 기억력 개선 효과를 가지는 실크 유래 펩타이드를 제공하게 할 수 있으며, 특히 인지기능 및 기억력 개선에 대한 초기 상승효과를 가속화 시킬 수 있고, 기억력 및 인지기능 효과가 더욱 향상된 실크 펩타이드를 제조할 수 있다.

실험예 2: 국부적 허혈 유도 동물 모델

상기 NF1, NF2, NF7 및 NF10의 가수분해 효소를 사용하여 제조된 실크 펩타이드에 대한 기억력 및 인지기능 개선효과 정도를 확인하기 위하여 국부적 허혈 유도 동물 모델을 사용하여 허혈로 인한 뇌경색 면적에 미치는 영향을 평가하는 실험을 진행하였다.

A. 약물 처리 및 국부적 허혈 유도 동물 모델의 제작

체중 200 내지 250 g인 웅성 백서 (Sprague-Dawley rat)를 이용하여 국부적 허혈 유도 동물 모델을 제작하였다. 약물은 실험번호 상기 NF1, NF2, NF7 및 NF10 1g/㎏을 허혈 유도 1시간 전에 1회 또는 허혈 유도 1시간 후에 1회 구강 투여하였고(구강 투여군, n=6), 허혈 대조군(n=6)은 약물처리군과 같은 용량의 BG101을 투여하였다. 실험동물에 케타민(ketamine) 30 내지 40 ㎎/㎏을 근육주사 하여 마취시킨 다음에 앙와위에서 목부분에 피부절개를 가하고 경동맥(common carotid artery), 외경동맥(external carotid artery) 및 내경동맥 (internal carotid artery)을 찾아 주위조직과 분리시켰다. 우선 외경동맥의 분지인 상부 상갑선 동맥과 후두와 동맥을 전기 소작시키고, 내경동맥의 분지인 익돌구개(pterygopalatine) 동맥을 전기소작하고 외경동맥을 잘라 4-0 나일론실(ETHICON, INC)을 외경동맥을 통하여 내경동맥으로 삽입한 다음에 경동맥 분지에서 나일론 실이 16 내지 18 ㎜가 들어가게 하여 위치시켜 중대뇌 동맥(Middle Cerebral Artery) 기시부를 폐색하였다.

B. 허혈에 의한 뇌경색 부위 감소 효과 실험

허혈 유도 6시간 후 동물을 단두하여 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌는 전방극 (anterior pole)으로부터 2 ㎜ 간격으로 절편하고, 2% 트리페닐 테트라졸리움 클로라이드 (triphenyl tetrazolium chloride: TTC, Sigma) 용액으로 37℃에서 30분간 반응시킨 후 4% 파라포름알데히드(Sigma) 용액에 넣어 고정시켰다. 염색된 조직절편을 촬영한 후 사진을 MCID image processing system (Imaging Research Inc.)을 이용하여 적색으로 염색된 정상부위와 달리 뇌경색이 발생하여 백색으로 변한 부위의 면적을 측정하였으며, 전체 뇌 절편의 면적 대비 뇌경색 면적 비율을 구한 후 평균치를 계산하였다. 또한 각각의 뇌 절편에서 전체 부피에서 뇌경색 부위가 차지하는 부피의 비율을 측정하였다. 그 결과를 [도 3]에 나타내었다.

상기 도 3을 참조하면 본 발명에서 제공하는 실크 유리 피브로인에 의하는 경우 뇌경색 부위를 감소시킬 수 있다는 점을 확인할 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

실크 피브로인을 용해시키는 용해 단계;
상기 실크 피브로인 용해물에 파파인을 포함하고, 파파인 100 중량부에 대하여 징지바인 10 내지 50 중량부, 칼파인 5 내지 30 중량부를 혼합시킨 혼합 효소를 단백질 가수분해 효소로 처리하여 가수분해하는 단계; 및
단백질 가수분해 효소를 제거하는 효소 제거단계를 포함하는
인지기능 및 기억력 개선용 실크 유래 펩타이드의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 단백질 가수분해 효소는 우마미자임(Umamizyme)을 더 포함하는 것인
인지기능 및 기억력 개선용 실크 유래 펩타이드의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 효소 제거단계는 열처리 하여 효소의 활성을 제거하는 것인
인지기능 및 기억력 개선용 실크 유래 펩타이드의 제조방법.
삭제
삭제
삭제