[go: up one dir, main page]

KR102078806B1 - 신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법 - Google Patents

신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102078806B1
KR102078806B1 KR1020150034030A KR20150034030A KR102078806B1 KR 102078806 B1 KR102078806 B1 KR 102078806B1 KR 1020150034030 A KR1020150034030 A KR 1020150034030A KR 20150034030 A KR20150034030 A KR 20150034030A KR 102078806 B1 KR102078806 B1 KR 102078806B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
formula
drug
polyphosphazene
ppm
lysine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020150034030A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150107650A (ko
Inventor
손연수
전용주
프라카쉬 구다 아바지
Original Assignee
(주)씨앤팜
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)씨앤팜 filed Critical (주)씨앤팜
Priority to JP2016575280A priority Critical patent/JP6659021B2/ja
Priority to US15/125,543 priority patent/US10336867B2/en
Priority to EP20155255.1A priority patent/EP3735989A1/en
Priority to CN201580026199.8A priority patent/CN106459420B/zh
Priority to ES15760898T priority patent/ES2786309T3/es
Priority to CN202010184462.9A priority patent/CN111281979A/zh
Priority to PCT/KR2015/002488 priority patent/WO2015137777A1/ko
Priority to EP15760898.5A priority patent/EP3118244B1/en
Publication of KR20150107650A publication Critical patent/KR20150107650A/ko
Priority to JP2019045513A priority patent/JP6867084B2/ja
Priority to US16/430,230 priority patent/US10584214B2/en
Priority to US16/430,244 priority patent/US10590243B2/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102078806B1 publication Critical patent/KR102078806B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G79/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen, and carbon with or without the latter elements in the main chain of the macromolecule
    • C08G79/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen, and carbon with or without the latter elements in the main chain of the macromolecule a linkage containing phosphorus
    • C08G79/025—Polyphosphazenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/605—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the macromolecule containing phosphorus in the main chain, e.g. poly-phosphazene
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G81/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers in the absence of monomers, e.g. block polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G2261/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbon-to-carbon link in the main chain of the macromolecule
    • C08G2261/10—Definition of the polymer structure
    • C08G2261/12—Copolymers
    • C08G2261/128—Copolymers graft
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2205/00—Polymer mixtures characterised by other features
    • C08L2205/05—Polymer mixtures characterised by other features containing polymer components which can react with one another

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Abstract

본 발명은, 친수성인 폴리에틸렌글리콜과 스페이서(spacer) 그룹으로 라이신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 도입한 양이온성 선형 폴리포스파젠 화합물, 상기 화합물에 소수성 약물을 화학적으로 결합시킨 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 암 조직 선택성이 탁월하고 독성이 아주 낮아 항암제로 실용화 가능성이 높은 신물질이다.

Description

신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법{NOVEL CATIONIC POLYPHOSPHAZENE COMPOUNDS, THEIR DRUG CONJUGATES AND PREPARATION METHOD THEREOF}
본 발명은 탁월한 암 조직 선택성과 생체적합성을 갖는 양이온성 선형 폴리포스파젠 약물전달체 화합물을 합성하고 여기에 소수성 항암제를 화학적으로 결합시킨 컨쥬게이트 화합물 및 그들의 제조 방법에 관한 것이다.
현재 임상에서 사용되고 있는 대부분의 항암제들은 분자량이 1000 미만인 소분자량의 단량체이다. 특히 이들 단량체의 항암제들을 정맥주사 할 경우 체내에서 정상세포와 암세포에 대한 선택성이 없어 심한 독성과 부작용을 동반하고, 약물이 혈중에 머무는 반감기(1~2시간)가 짧아 지속적인 치료효과를 기대할 수가 없어서 항암치료에 한계가 되고 있다. 따라서 최근의 항암제 신약 개발에 있어 극복해야 할 가장 핵심적인 기술은, 항암제 약물을 암 부위에 선택적으로 전달하는 암 표적화(tumor targeting) 기술과 암 부위에 도달된 약물이 적기에 적당한 속도로 항암제를 방출케 하는 방출제어기술이다. 이러한 항암제 치료의 한계를 극복하려는 연구 노력이 지난 수십 년간 세계적으로 활발하게 이루어져 왔고, 그 결과 고분자 약물전달체를 이용하는 것이 가장 효과적이고 실용적이라는 것을 알게 되어 최근에는 고분자 치료법 (polymer therapy)이라는 새로운 분야가 탄생하기에 이르렀다(R. Haag, F. Kratz, Angew. Chem. Int. Ed. 45(2006)1198-1215).
지금까지 약물전달체로 사용되고 있는 고분자는 대부분 유기계 고분자이다. 수많은 천연 또는 합성 고분자들이 약물전달체로 연구/시도 되었으나 실용화 가능성이 있는 고분자는 극소수에 불과하였다. 그 이유는 고분자 물질이 특히 항암제 전달체로 사용되려면, 위에서 설명된 항암제를 운반하는 약물전달체의 암 선택성과 약물방출속도 이외에 수용성, 생분해성, 고분자 자체의 생체독성, 약물과의 상용성 등 다양한 물성을 동시에 만족시켜야 하기 때문이다.
본 발명자들은 이러한 상황에 대처하여 오래전부터 유기계 탄소가 아닌 무기계 질소(N)와 인(P)이 번갈아 공액결합으로 연결된 폴리포스파젠 (polyphosphazene)이라고 하는 무기 고분자 골격에 다양한 유기그룹을 도입함으로서 다양한 물성의 유기/무기 하이브리드 약물전달체를 설계할 수 있음을 발견(Youn Soo Sohn, et al. Macromolecules, 1995, 28, 7566) 하고 지난 10 여년간 새로운 암조직 선택성 고분자형 항암제 개발에 총력을 경주하고 있다. 특히 본 연구 초기에는 다양한 분자량의 친수성 폴리에틸렌글리콜(PEG: poly(ethylene glycol))과 다양한 여러 형태의 소수성 올리고펩타이드 (oligopeptide)를 도입시켜 양친성 폴리포스파젠을 합성함으로서 온도 감응성 등 다양한 물성을 갖는 지능형 약물전달체를 개발하였다. 이러한 양친성 폴리포스파젠은 온도감응성 마이셀, 하이드로젤 등 다양한 나노구조체를 형성하지만 소수성 올리고펩타이드로 인한 물에 대한 용해도의 감소 및 독성의 발현 등 생체적합성에 문제가 발생함으로서 실용화에 어려움이 있음을 알게 되었다. 모든 양친성 고분자는 수용액에서 가열할 경우 용매인 물분자와의 친화력이 떨어져 일정 온도에 이르면 고분자가 침전으로 떨어지는데 이때의 이온도를 저임계용액온도(lower critical solution temperature)라 한다. 정맥주사용 약물전달체로 사용하려면 저임계용액온도가 체온보다 훨씬 높아야(50 ℃이상) 안전한데 이들 양친성 폴리포스파젠은 대부분 수용액에서 이 온도가 체온보다 낮아 피하 주사 등 국부전달용 항암제 전달체로는 적합하지만 정맥 주사용 약물전달체로는 사용이 불가능 하였다.
한편, 대표적인 소수성 항암제인 탁세인 계 항암제, 즉 파클리탁셀 및 도세탁셀은 현재 임상에서 유방암, 난소암, 소세포 폐암 등 여러 종류의 암에 우수한 치료 효과를 나타내어 가장 널리 사용되는 항암제 중 하나이다. 그러나 이들 탁세인 계 항암제는 소수성이 강하여 물에 대한 용해도(< 1 μg/ml)가 아주 낮기 때문에 그대로 주사제로 사용되지 못하고, 계면활성제인 폴리조베이트 80(Polysorbate 80) 또는 크레머포어 (Cremophore EL)와 에틸알콜로 제제되어 사용되고 있다. 하지만 그렇게 제제화 된 탁세인 계 항암제는 용해제로 사용되는 계면활성제와 알콜에 기인하는 신경 독성 등의 부작용과 탁세인 계 항암제 자체의 강한 독성 때문에 그 사용이 크게 제한되고 있다.
따라서 이러한 문제들을 해결하기 위하여 특히 지난 10 여년간 세게적으로 많은 연구가 다방면으로 진행되고 있는데, 그 중에서도 특히 최근에는 유기계 고분자 마이셀 등 다양한 나노 구조체들을 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 친수성 블록과 소수성 블록으로 구성된 양친성 고분자 마이셀의 경우, 소수성 그룹이 마이셀 내부의 핵을 이루기 때문에 탁세인과 같은 소수성 약물을 마이셀의 핵 내부에 효율적으로 포집하여 가용화할 수 있다. 또한 탁세인 분자에 폴리에틸렌글리콜과 같은 친수성기를 직접 화학적으로 결합시켜 가용화한 컨쥬게이트형 항암제와, 수용성 폴리글루탐산에 파클리탁셀을 결합시킨 고분자 컨쥬게이트형 항암제 등 여러 종류의 고분자형 항암제가 현재 임상 시험 단계에 들어가 있다.
이와 같이 소분자량의 항암제를 고분자에 컨쥬게이션 시킨 고분자형 예비약물(prodrug)은 약물의 체내 체류시간을 연장하고, 암조직의 특성과 고분자 입자의 "향상된 투과보전(enhanced permeability and retention(EPR))효과 (Maeda H, et al. J. Control. Release 65 (2000) 271-284)"에 의해 암조직 선택성을 부여하며, 약물방출 속도를 제어함으로서 치료 효과를 극대화 하고, 또한 독성을 획기적으로 줄일 수 있다는 점에서 가장 합리적인 접근방법으로 기대되고 있다. 지금까지의 연구 보고에 의하면, 고분자 나노입자의 경우 "향상된 투과보전(EPR) 효과"에 의하여 암 선택성을 나타내려면 고분자 입자의 크기가 50~200 nm 정도는 되어야 하는 것으로 알려져 있다 (Torchilin V. P., J. Control. Release 73 (2001) 137-172). 또한 최근 유전자 전달체에 대한 연구에 따르면, 양이온성 고분자의 경우 음이온의 성질을 띠고 있는 세포내에 투과효율이 크게 향상된다는 사실이 알려져 있다(Gabrielson, N.P.; Park, D. W. J. Control. Release 136 (2009) 54-61). 그러나 현재 가장 진전된 제III상 임상시험 중에 있는 폴리글루멕스(poliglumex)는, 폴리글루탐산에 파클리탁셀을 에스터 결합으로 컨쥬게이션 시킨 예비약물로서 강한 음이온을 띄고 있는데, 파크리탁솔을 최대 30%까지 녹일 수 있는 특징을 가지고 있으나 암조직 이외의 다른 기관에 더 많이 축적되는 단점(Wallace S.; Li C. Adv. Drug Deliv. Rev. 60 (2008) 886-898)을 가지고 있어 실용화가 지연되고 있다.
R. Haag, F. Kratz, Angew. Chem. Int. Ed. 45(2006)1198-1215)
따라서, 본 발명의 목적은 탁월한 암조직 선택성을 나타내는 새로운 양이온성 폴리포스파젠계 약물전달체 화합물 및 이들 폴리포스파젠계 약물전달체 화합물에 항암제를 화학적으로 결합시킨 컨쥬게이트형 화합물 그리고 그들의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 전술한 기술적 배경 하에서 보다 탁월한 암 조직 선택성을 나타내는 항암제 약물 전달체를 개발하기 위해 노력하던 중, 폴리포스파젠 골격에 용해제로 친수성인 폴리에틸렌글리콜과, 소수성 항암제를 상기 고분자에 화학결합으로 연결시킬 수 있는 다중작용기를 가지고 있는 스페이서(spacer) 그룹으로 아미노산, 아미노산을 포함하는 올리고펩타이드 및 선형 아미노알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 도입하여 새로운 약물전달용 폴리포스파젠 화합물을 합성하였다. 이렇게 합성된 약물전달용 폴리포스파젠 화합물은 양이온(cation)성과 체내 잔류시간이 매우 길어(3일 이상) 암 조직 선택성을 갖는다는 사실을 발견하였다. 또한 이 화합물에 산성조건에서 약물을 방출할 수 있는 링커(linker)를 사용하여 소수성 항암제를 컨쥬게이션 시킴으로써 암 조직 선택성이 탁월하며, 생분해성을 갖고, 암조직에서 약물의 조절 방출이 가능한 스마트 고분자형 컨쥬게이트 화합물을 합성할 수 있었다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 선형의 폴리포스파젠 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015023957433-pat00001
상기 식에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, S는 스페이서 그룹으로 라이신, 알지닌, 글루타민, 아스파라진, 타이로신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 알지닌을 포함하는 올리고펩타이드, 글루타민을 포함하는 올리고펩타이드, 아스파라진을 포함하는 올리고펩타이드, 타이로신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, l은0~0.9이고 m은 0.1~1이며 l+m = 1이다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물을 제공한다.
[화학식 2]
Figure 112015023957433-pat00002
상기 식에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, S는 스페이서 그룹으로 라이신, 알지닌, 글루타민, 아스파라진, 타이로신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 알지닌을 포함하는 올리고펩타이드, 글루타민을 포함하는 올리고펩타이드, 아스파라진을 포함하는 올리고펩타이드, 타이로신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, L은 상기 스페이서 그룹과 상기 약물을 화학결합으로 연결시킬 수 있는 링커(linker) 를 나타내며, D는 OH 또는 NH2 작용기를 갖는 약물이고, x와 y는 각각 0~0.5이고, z는 0보다 크고 1.0이하이며, x+y+z = 1 이다.
또한 본 발명은 (a) 출발물질인 6염화 고리형 포스파젠을 열 중합하여 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체를 합성한 후 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨 염과 반응시켜 폴리포스파젠 고분자 중간체를 얻는 단계;
(b) 상기 폴리포스파젠 고분자 중간체를 라이신 에스터, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드의 에스터, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군에서 선택되는 1종과 반응시켜 친수성 양이온성(cationic) 폴리포스파젠 고분자 약물전달체를 제조하는 단계;
(c) OH, 또는 NH2작용기를 갖는 약물을 링커(linker)를 이용하여 폴리포스파젠 고분자에 화학결합으로 결합시키기 용이한 약물 전구체(precursor)를 제조하는 단계; 및
(d) 상기 (b) 단계의 폴리포스파젠 고분자 약물전달체에 상기 (c) 단계의 약물 전구체(precursor)를 도입하여 상기 화학식 2의 화합물을 얻는 단계; 를 포함하는 상기 화학식 2의 화합물의 제조 방법을 제공한다.
또 본 발명은 (a) 출발물질인 6염화 고리형 포스파젠을 열 중합하여 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체를 합성한 후 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨 염과 반응시켜 폴리포스파젠 고분자 중간체를 얻는 단계;
(b) 상기 폴리포스파젠 고분자 중간체를 스페이서 그룹인 라이신 에스터, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드의 에스터, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종과 반응시켜 친수성 양이온성(cationic) 폴리포스파젠 고분자 약물전달체를 제조하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 의 폴리포스파젠 고분자 약물전달체의 스페이서 그룹에 링커를 먼저 결합시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 폴리포스파젠 고분자 약물전달체의 링커에 OH 또는 NH2 작용기를 갖는 약물을 결합시켜 상기 화학식 2의 화합물을 얻는 단계; 를 포함하는 상기 화학식 2의 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 선형 폴리포스파젠 화합물은 매우 높은 암조직 선택성을 갖는 효과가 있다. 또한 본 발명의 선형 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물은 종래의 유기계 고분자를 이용한 컨쥬게이트 약물과는 달리 체내의 간, 신장 등 주요기관에는 많이 쌓이지 않고 혈액 내에서 장기간 순환하며, 특히 암조직에 선택적으로 다량 축적되는 탁월한 암 조직 선택성을 나타내며, 중성의 혈액이나 조직에서는 소수성 항암제를 방출하지 않고 산성의(pH= 4~7) 암조직에서만 선택적으로 독성이 높은 항암제를 방출함으로써 체내에서 항암제에 의한 독성을 획기적으로 낮추는 등 항암제로서 탁월한 물성을 갖는 효과가 있다.
이와 같이 본 발명의 폴리포스파젠 화합물 및 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물은 실용화 가능성이 매우 높은 신물질이다.
도 1. 실시예 1의 폴리포스파젠 화합물의 입도분포를 나타낸 도면이다. (평균직경 = 3.0nm)
도 2. 실시예 1의 폴리포스파젠 화합물의 양이온성을 나타내는 제타전위 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 3. 실시예 14의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물의 입도분포를 나타낸 도면이다. (평균직경 = 60nm)
도 4. 실시예 14의 폴리포스파젠-파클리탁셀 컨쥬게이트 화합물의 파이렌 형광을 이용한 마이셀 임계농도(CMC) 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 5. 실시예 20의 폴리포스파젠-파클리탁셀 컨쥬게이트 화합물의 분자량 변화를 나타낸 도면이다. 여기에서 (a)는 pH 7.4, (b) pH 5.4에서의 결과이다.
도 6. (a) A549 암세포를 이식한 마우스에 실시예 1의 폴리포스파젠 화합물에 형광염료인 Cy5.5로 표지한 약물 전달체를 혈액주사한 후 12시간, 24시간, 48 시간, 72시간 경화 후 각 기관을 분리하여 찍은 ex vivo NIR 형광 이미지를 나타낸 도면이다. 여기에서 1은 간, 2는 폐, 3은 콩팥, 4는 비장, 5는 암조직, 6은 근육을 나타낸다. (b) 는 12시간, 24 시간, 48 시간, 및 72 시간에 추출한 전체 혈액(WB)과 혈장(PL)의 NIR 형광 이미지를 나타낸 도면이다.
도 7. 실시예 14의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물을 형광염료Cy 5.5로 표지한 후 SCC7 암세포를 이식한 마우스에 주입한 다음 24시간, 48시간후 조직 분포를 비교하였다. 여기에서 1은 간, 2는 폐, 3은 비장, 4는 콩팥, 5는 심장, 6은 암조직을 나타낸다.
도 8. 앞의 도 7에서 실시한 조직분포 실험에서 얻은 각 조직의 형광 세기를 약물로 처리되지 않은 대조군 마우스의 같은 조직의 형광세기의 비율을 측정해서 정량적인 조직분포를 표시한 도면이다.
도 9. 실시예 14의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물의 Sprague-Dawly 랫트를 이용한 약물동력학 실험 결과 중 도세탁셀의 시간에 따른 플라즈마 농도 프로파일을 표시한다.
도 10. BALB/C 누드 마우스를 이용한 실시예 14의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물의 위암 세포주 MKN-28에 대한 이종이식(xenograft) 시험결과이다.
도 11. 상기 도10에서 약물 투여 시작부터 시험 종료까지 40일간의 누드 마우스의 체중변화를 보여준다.
도 12. A549 암세포를 이식한 마우스를 이용한 이종이식(xenograft) 항암활성에 대한 실험 결과이다.
본 발명의 구성 및 작용을 좀더 자세히 설명한다. 본 발명은 아래 설명으로 구체화 되지만 그로 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 선형의 폴리포스파젠 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015023957433-pat00003
상기 식에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, S는 스페이서 그룹으로 라이신, 알지닌, 글루타민, 아스파라진, 타이로신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 알지닌을 포함하는 올리고펩타이드, 글루타민을 포함하는 올리고펩타이드, 아스파라진을 포함하는 올리고펩타이드, 타이로신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, l은0~0.9이고 m은 0.1~1이며 l+m = 1이다.
상기 본 발명의 폴리포스파젠 화합물은, 친수성이면서 다기능성기(multifunctional group)를 보유하고 있는 라이신 또는 라이신을 포함하는 친수성 올리고펩타이드와 친수성 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 포스파젠 골격에 도입한 것으로, 종래의 양친성 폴리포스파젠과 달리 저임계용액온도가 100 ℃ 이하에서는 관찰되지 않는다. 또한 체내 혈액 반감기가 획기적으로 연장됨과 동시에 고분자의 독성도 획기적으로 개선되고 특히 놀라운 것은 폴리포스파젠 자체가 높은 암조직 선택성을 나타낸다는 것이다. 이러한 폴리포스파젠 자체의 암조직 선택성은 아직 확실치는 않지만 아마도 고분자에 결합되어 있는 라이신의 아민기로 인한 포스파젠 고분자의 양이온성과 폴리에틸렌글리콜로 인한 혈액내에서의 장기순환(long circulation)에 기인하는 것으로 추정된다.
상기 라이신을 포함하는 친수성 올리고펩타이드의 바람직한 예로 글라이실라이신을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물을 제공한다.
[화학식 2]
Figure 112015023957433-pat00004
상기 식에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, S는 스페이서 그룹으로 라이신, 알지닌, 글루타민, 아스파라진, 타이로신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 알지닌을 포함하는 올리고펩타이드, 글루타민을 포함하는 올리고펩타이드, 아스파라진을 포함하는 올리고펩타이드, 타이로신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, L은 상기 스페이서 그룹과 상기 약물을 화학결합으로 연결시킬 수 있는 링커(linker) 를 나타내며, D는 OH 또는 NH2 작용기를 갖는 약물이고, x와 y는 각각 0~0.5이고, z는 0보다 크고 1.0이하이며, x+y+z = 1 이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 S는 라이신 또는 라이신을 포함하는 다이펩타이드 내지 트라이펩타이드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서,
상기 S는 아미노에탄올 또는 아미노프로판올인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는 상기 약물은 소수성 항암제이다.
상기 소수성 항암제는 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 켐토테신(camptothecin) 및 [(트란스-1,2-디아미노사이클로헥산)백금(II)]으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 화학식 2는 하기 화학식 3 내지 5 중 어느 하나로 표시로 될 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112015023957433-pat00005
[화학식 4]
Figure 112015023957433-pat00006
상기 화학식 3 및 4에서, n은 3내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, D는 도세탁셀, 파클리탁셀, 켐토테신(camptothecin) 및 [(트란스-1,2-디아미노사이클로헥산)백금(II)]으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 나타내며, R은 C1-6의 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 또는 OCH2Bz이다. 여기서, x와 y는 각각 0~0.5, z는 0보다 크고 1.0 이하의 값을 가지며, x+y+z = 1 이고,
[화학식 5]
Figure 112015023957433-pat00007
상기 화학식 5에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, D 는 도세탁셀, 파클리탁셀 및 켐토테신으로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 나타내고, R'는 t-Boc 또는 CBZ 그룹을 나타내며 여기서, x와 y는 각각 0~0.5, z는 0보다 크고 1.0 이하의 값을 가지며, x+y+z = 1 이다.
이하 각 성분을 구체적으로 설명한다.
[약물전달체]
본 발명에서 합성한 약물 전달체 폴리포스파젠 화합물은 탄소-탄소 결합이 골격을 이루는 유기계 고분자와 달리 무기계 원소인 인(P)과 질소(N)의 공액결합이 고분자 골격을 이루고, 인 원자에 친수성 폴리에틸렌글리콜과 항암제 약물을 화학적 결합시킬 수 있는 스페이서 그룹으로 라이신 또는 라이신을 포함하는 올리고펩타이드류 또는 선형 아미노알콜이 곁가지로 도입된 새로운 무기/유기 하이브리드형 고분자 화합물이다. 도입된 라이신 또는 이를 함유하는 펩타이드는 아미노산의 고유 pKa값에 따라서 폴리포스파젠 고분자체에 양이온성을 부여 할 수 있다. 이 양이온성은 스페이서로 도입된 아미노산의 종류에 따라 조절 가능하다. 본 발명에서 사용된 폴리에틸렌글라이콜은 분자량 300~2000의 범위의 메톡시폴리에틸렌 글라이콜을 사용하였으며, 그 함유량은 0.5~1.8의 비율로 도입되었으며, 이 도입 비율은 합성된 고분자 화합물의 용해도 및 체내 거동, 또는 가수분해되는 속도에 따라 그 용도에 맞게 조절할 수 있다. 또한 약물의 컨쥬게이션 비율에 따라서도 변화시킬 수 있으며, 약물이 컨쥬게이션된 폴리포스파젠 고분자 화합물에 양이온성 조절을 위해서도 변화시킬 수 있다. 폴리포스파젠 고분자 화합물의 분자량은 반복 단위체(NP)의 개수에 따라 정해지며, 같은 반복 단위를 갖는 경우에도 도입된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량에 따라서도 조절 가능하다. 본 발명의 곁가지형 고분자(branched polymer) 화합물은 일반 유기계 선형 고분자에 비하여 높은 분자량을 갖지만 작은 수화 볼륨을 갖는 특징을 갖는다. 즉, 원자의 밀집도가 일반 선형 고분자 화합물에 비하여 매우 높기 때문에 볼륨에 비하여 높은 분자량을 갖는 특징을 갖는다. 이러한 특징 때문에 상대적으로 작은 크기를 갖는 마이셀을 형성하는 경우에도 높은 암조직 선택성을 유지하는 고분자 화합물을 얻을 수 있다.
[항암제 약물]
본 발명의 곁가지형 폴리포스파젠 고분자 화합물에 결합되는 약물은 OH 또는 NH2작용기를 최소한 하나 이상 가지고 있는 약물로 바람직하게는 소수성 항암제로 크게 탁세인(taxan)계 약물, 켐토테신 (camptothecin)계 약물 및 백금착물계 약물을 주로 사용하였지만 이에 한정하지는 않는다. 즉, 여기서 예를 든 두 가지 계열의 약물들 외에도 OH, NH2 등의 작용기를 가지고 있는 어떠한 항암제들도 본 약물전달체-스페이서-링커 시스템에서는 도입이 가능하며, 본 발명의 예시는 입체장애 때문에 반응성이 떨어지는 것으로 알려진 대표적은 두 가지 계열의 약물들에 대한 예들을 이용하여 설명하였다.
앞에서 설명된 본 발명의 친수성 선형 포스파젠 고분자에 소수성 탁세인 계 항암제를 화학적으로 결합시킨 폴리포스파젠-탁세인계 약물 컨쥬게이트 화합물은 아직 세계적으로 보고된바 없는 완전히 새로운 형태의 정맥주사용 고분자 항암제로서 그 분자량 분포를 약 3,000 내지 300,000 Da까지 조절 가능하며, 특히 분자량이 30,000 내지 100,000 Da 범위의 고분자를 분리해 냄으로써 생체적합성과 효율성을 극대화 할 수 있었다. 본 발명의 친수성 폴리포스파젠 화합물 자체는 마이셀을 형성할 수 없으나 소수성 탁세인계 항암제 분자가 결합된 컨쥬게이트- 약물 화합물은 약 20 nm ~100 nm 크기의 마이셀 입자들을 형성함으로써 상술한 "향상된 투과보전(EPR) 효과"와 본 폴리포스파젠-탁세인계 약물 컨쥬게이트 화합물의 마이셀의 껍질(shell)을 형성하는 폴리에틸렌글리콜에 의한 혈중 장기순환성(long circulation) 등에 의하여 탁월한 암 조직 선택성을 확보할 수 있었다. 마지막으로 우수한 항암효과를 위하여 가장 중요한 암 조직에 도달한 폴리포스파젠-탁세인계 약물 컨쥬게이트 화합물로부터 항암성분인 탁세인계 약물의 적기 방출을 유도하기 위하여 암조직/세포의 산성(pH= 4~7) 환경에서만 분해 가능한 무수아코니틱산과 같은 링커(linker)를 이용하여 포스파젠 고분자와 탁세인계 약물을 연결함으로서 포스파젠-탁세인계 약물 컨쥬게이트가 혈중 및 정상조직에서는 분해하지 않고 암조직/세포에 도달한 후에만 탁세인계 항암제를 방출할 수 있도록 설계함으로서 탁월한 항암효과와 동시에 체내에서 약물에 의한 독성을 획기적으로 낮출 수 있는 이상형의 새로운 고분자 컨쥬게이트 물질의 합성을 완성하였다.
아래 화학식 6의 도세탁셀은 2, 7, 10, 2' 위치에 4개의 OH 그룹을 가지고 있으며, 이 중 가장 반응성이 좋은 2' 위치의 OH 그룹을 이용하여 링커 그룹과 에스터 결합(-COOD-)을 시키고, 다시 이 링커와 폴리포스파젠의 스페이서와 아마이드 결합(-CONH-) 반응을 시켜서 컨쥬게이션 시킨다.
[화학식 6]
Figure 112015023957433-pat00008
파클리탁셀의 경우에도 마찬가지고 가장 반응성이 좋은 2' 위치의 OH를 이용하여 링커와 에스터 결합으로 반응시킨 후, 이 링커를 이용하여 폴리포스파젠에 도입된 스페이서에 아마이드 결합으로 반응을 시켜 컨쥬게이션 시킨다.
이때, 링커를 사용하는 이유는 입체장애가 많이 생기는 약물을 에스터 결합으로 직접 고분자에 컨쥬게이션 시키는 경우에는 수율이 매우 떨어지며, 여러 종류의 이성질체가 생길 수 있는 문제점을 가지고 있다. 특히 도세탁셀의 경우 반응시간이 24시간 이상 길어지면, 자체의 이성질체가 생길 위험이 매우 높기 때문에, 링커를 도입하여 단분자간의 빠른 반응을 이용하여 빠른 시간내에 높은 수율로 링커를 도입하고, 도입된 링커의 높은 반응성을 이용하여 폴리포스파젠에 빠른 시간내에 높은 수율로 반응시킬 수 있기 때문이다.
본 발명에서 사용한 켐토테신 계의 약물은 다음 예시의 화합물들 포함하지만 이것들만 의미하는 것은 아니며, 약학적으로 활성이 있는 유도체들을 모두 포함한다. 특히, 켐토테신(camptothecin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 그리고 벨로테칸(belotecan)의 켐토테신 계의 약물을 포함할 수 있다.
[스페이서(S)]
본 발명에서는 링커와 화학결합을 할 수 있는 스페이서 그룹을 도입하였다. 스페이서 그룹은 링커와의 결합에 사용할 수 있는 1차 아민기와 폴리포스파젠 고분자 골격에 결합(graft)이 가능한 1차 아민기 또는 알코올기를 가지고 있는 아미노산류, 즉 라이신, 알지닌, 글루타민, 아스파라진, 타이로신 및 이들을 포함하는 올리고펩타이드 또는 선형 아미노알콜로부터 선택되는 1종이다. 바람직하게는 라이신 또는 라이신을 포함하는 올리고머이다. 이러한 아미노산은 염기성 아미노산류로 분류되는 아미노산이며, 염기성 아미노산이 도입되는 경우에는 그 아미노산의 고유 pKa 값에 따라 특정 pH에서 고분자체에 양이온성을 부여하는 특징을 가지고 있다. 또한 단순한 아미노산류 만을 포함하는 것은 아니며, 두 개 이상의 아미노산 조합을 통해서 스페이서를 도입할 수 있다. 예를 들면, 글라이실-라이신(Gly-Lys), 알라닐-라이신(Ala-Lys) 또는 이러한 아미노산류를 이용한 조합인 트라이펩타이드 등이 사용될 수 있다. 또한, 특정 조합의 아미노산 또는 펩타이드의 경우에는 보호기인 카르복실 에스터를 가수분해하여, 링커를 도입하지 않고 약물을 직접 도입할 수도 있다. 이에 사용할 수 있는 대표적인 아미노산은 라이신이며, 실시예에서도 그 예를 보였다.
[링커( linker )]
고분자를 이용한 컨쥬게이트형 항암제의 경우에는 약물의 조절 방출이 약물의 활성에 있어서 가장 중요한 역할을 한다.
본 발명에서는 약물 부분과 고분자 약물전달체를 연결 시켜주는데 있어서 아마이드 결합(-CONH-) 및/또는 에스터 결합(-COO-) 중에서 링커와 약물의 종류에 따라서 선택하여 사용하였다. 이는 기존에 알려진 산-자극 감응성 무수아코니틱산을 링커(linker) 를 사용한 기존 약물전달시스템과의 차별점이며, 이에 따라서 효율적인 약물의 조절 방출이 가능하게 되었다. 또한 약물중 아민작용기를 갖지 않는 약물들에 대하여서도 사용할 수 있는 링커이기 때문에 약물의 적용범위를 획기적으로 높인 스페이서-링커 시스템이다.
이 반응은 일반적인 커플링(coupling) 반응 조건에서 모두 수행이 가능하며, 디클로로메탄, 클로로포름, 아세토니트릴, 1,4-다이옥산, 다이메틸포름아마이드, 그리고, 테트라하이드로퓨란 등 반응에 영향을 미치지 않는 어떠한 종류의 유기용매도 사용이 가능하다. 단, 링커 도입시에 에스터 결합을 만들기 위해 생성되는 중간체 물질들의 불안정성 때문에 전체 반응은 잘 건조된 용매와 아르곤 기류하에서 진행해야 하며, 생성된 불안정한 중간체의 반응 효율을 증가 시키기 위해 저온(-10~0 ℃)을 유지하며 반응을 진행시켰다. 또한, 무수시스아코니틱산의 경우에는 염기 조건에서 무수물 고리가 열리는 특징이 있기 때문에 이성질체가 생길 수 있는 가능성이 있으므로 일반적으로 에스터 결합 형성에 사용하는 염기성의 DMAP(dimethylaminopyridine) 촉매 대신에 DPTS(dimethylaminopyridine/p-toluene sulfonic acid, 0.1-1.0 당량) 를 사용하여 중성 상태에서 촉매역할을 할 수 있는 반응 조건을 선택하여 반응하였다. 이를 이용하여 복합체를 형성시킬 수 있는 약물들은 올리고펩타이드(oligopeptides), 폴리펩타이드(polypeptides), 단분자 약물들, 항체(antibody), 뉴클레오타이드(nucleotide), 리피드(lipid) 계열 등 -OH 또는 -NH2의 작용기를 가지고 있는 어떠한 물질도 가능하다. 가장 선호되는 스페이서-링커-약물의 결합 종류는 아마이드(스페이서-링커)/에스터(링커-스페이서) 결합이며, 아마이드(스페이서-링커)/아마이드(링커-스페이서), 그리고 에스터(스페이서-링커)/에스터(링커-스페이서) 결합도 가능하다.
본 발명에서 사용한 링커의 경우 아래 화학식 7 내지 11에 해당하는 다양한 고리형 무수물 계열의 링커를 사용할 수 있으며 바람직하게는 아래 화학식 7의 아코니틱 무수물을 사용한다.
[화학식 7]
Figure 112015023957433-pat00009
[화학식 8]
Figure 112015023957433-pat00010
[화학식 9]
Figure 112015023957433-pat00011

[화학식 10]
Figure 112015023957433-pat00012

[화학식 11]
Figure 112015023957433-pat00013
산성 조건 (pH=5.5)에서 약물의 방출이 쉽게 일어나는 것으로 알려진 링커인 무수아코니틱산의 경우에는 일반적으로 아래 반응식 1과 같은 반응 경로에 따라 합성된다. 하지만 이러한 합성방법의 경우에는 도식과 같이 약물을 방출할 수 없는 이성질체가 생길 수 있는 문제점을 가지고 있으며, 약물이 붙는 위치에 따라 약물의 방출 속도가 달라져 그 비율을 조절하는 것이 어려우며, 또한 그 비율에 따라 항암 활성이 달라지는 문제점을 가지고 있다. 특히, 스페이서/링커 그리고 링커/약물의 결합이 모두 아마이드 결합으로 연결되는 경우에는 가수분해에 의한 약물의 방출이 매우 어려운 이성질체(반응식 3-inactive)가 생성되기 때문에 약물의 효율성이 떨어지는 문제점을 가지고 있다.
[반응식 1]
Figure 112015023957433-pat00014
또한 반응식 2의 경우에는 모두 에스터 결합으로 연결되는 링커로 작용하는 경우이며, 이 경우에도 비활성(inactive) 조합이 생길수 있으나 에스터 결합의 체내에서의 효소에 의한 가수분해 때문에 약물의 방출이 가능하기는 하지만, 이 경우에도 특정 조건인 산성 조건에서의 약물의 조절 방출이 다소 어려운 이성질체가 생성되는 단점이 있다. 또한, 약물의 -OH 기를 이용하여 무수물 고리를 개환하는 반응의 경우 친핵기로 작용하는 쪽이 과량으로 사용해야 하며, 특히나 입체 장애가 많이 생기는 약물의 경우에는 더 많은 량의 약물을 사용해야 하는 단점이 있다. 본 발명에 사용한 탁세인 계의 약물의 경우에는 적게는 20배 이상을 사용해야만 반응이 완결되는 것을 확인하였다. 이러한 경우 약물을 기초로 한 수율이 5 % 이하로 매우 낮기 때문에 상업화에 있어서 매우 큰 문제로 작용할 수 있다.
[반응식 2]
Figure 112015023957433-pat00015

반면에 본 발명의 합성 경로에 해당하는 다음 반응식 3은 일예로 무수아코니틱산의 고리를 먼저 개환하지 않고, 가지부분의 카르복실산 부분을 약물과 먼저 반응시킨 후 무수물의 고리를 과량의 NHS(N-hydroxy succinimide)를 이용하여 개환하거나 1차 아민을 가지고 있는 스페이서가 도입된 고분자를 이용하여 직접 고리를 개환할 수 있다. 이때, NHS를 이용하여 고리를 개환하게 되면, 일반적으로 알려진 활성 에스터(active ester)를 형성하게 되고, 1차 아민을 가지고 있는 물질과 더 이상의 시약없이 염기 조건하에서 쉽게 아마이드 결합을 형성할 수 있는 유도체를 얻을 수 있다. 이 반응의 또 다른 장점은 비교적 수율이 낮은 과정인 에스터 결합을 만드는 과정에서 링커 그룹을 과량으로 사용하여 약물의 낭비를 막을 수 있으며, 반응의 종결점을 비교적 간단한 TLC 방법을 이용하여 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 기존의 알려진 반응방법과는 다르게 무수물 고리의 개환을 나중에 시키기 때문에 약물의 방출이 어려운 이성질체가 생기지 않는다는 장점을 가진 새로운 합성 방법이다.
[반응식 3]
Figure 112015023957433-pat00016

또한 본 발명은 상기 선형 폴리포스파젠 화합물 및 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물의 제조방법을 제공한다.
이때 필요에 따라 사용되는 약물, 스페이서, 링커에 대해 구체적인 예를 들어 설명하나, 본 발명이 이들 예들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 선형 폴리포스파젠 고분자 화합물은 3가의 질소(N)와 5가의 인(P)으로 구성된 포스파젠 기본 단위 골격(-N=P-)의 인 원자에 친수성이 강한 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 먼저 결합시킨 후 1차 아민기 2개와 카르복실기 1개를 갖고 있는 다기능성(multifunctional) 라이신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드 또는 선형 아미노알콜을 결합시켜 합성한다. 이렇게 합성한 폴리포스파젠 화합물의 곁가지 그룹인 다기능성 라이신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드 또는 선형 아미노알콜을 스페이서로 사용하고 무수 아코니틱산을 링커로 사용하여 탁세인 계, 백금 착물 계 또는 켐토테신 계 등의 소수성 항암제를 폴리포스파젠 고분자에 연결시키면 새로운 고분자형의 선형 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트 화합물은 암 조직에 선택적으로 다량 축적되는 탁월한 암조직 선택성을 나타내는데, 상기 화학식 2의 x, y, z의 값을 조절함으로써 물에 대한 용해도가 높고, 체내 체류시간이 길며, 암조직 선택성이 탁월한 항암제를 제조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 라이신, 알지닌, 글루타민, 아스파라진 또는 타이로신을 포함하는 올리고펩타이드로부터 선택되는 1종의 스페이서는 바람직하게는 라이신 및 글라이신을 포함하는 올리고펩타이드로, 예를 들어 다이펩타이드 내지 트라이펩타이드이다. 더욱 바람직하게는 글라이실라이신으로 구성된 다이펩타이드이다. 이 때, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 올리고펩타이드에서 라이신은 탁세인 계 항암제(D)와 연결되는 말단 부위에 위치하는 것이 바람직하다. 구체적으로 예를 들면 상기 화학식 1에서 S는 라이신, 글라이실라이신, 라이신 에스터 또는 글라이실라이신 에스터일 수 있고, 바람직하게는 상기 S는 라이신, 라이신 C1 - 6알킬에스터 또는 글라이실라이신 C1 - 6알킬에스터이며, 더욱 바람직하게는 상기 S는 라이신 에틸에스터 또는 글라이실라이신 에틸에스터이다.
또한 선형 아미노알콜로부터 선택되는 1종의 스페이서는 바람직하게는 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올, 아미노헥산올이며 더욱 바람직하게는 아미노에탄올과 아미노프로판올이다.
본 발명에서 탁세인계 항암제(D)는 라이신의 아민기 또는 카르복실기를 통해 고분자에 연결되는데, 상기 항암제가 라이신의 카르복실기에 연결되는 경우, 라이신의 아민기는 아민 보호기(예: t-Boc, FMOC, CBZ 그룹)로 보호되어 있는 것이 바람직하다.
상기 화학식 2에서 L은 스페이서(S)와 항암제(D)를 화학적으로 연결시키는 링커로, 시스 아코니틱 무수물, 석시닐 무수물, 또는 말레익 무수물등을 나타내며, 더욱 바람직하게는 상기 L은 아코니틱 무수물이다.
한편 본 발명에서 항암제(D)로는 탁세인 계 항암제, 켐토테신 계 항암제 또는 백금착물계 항암제를 사용하며, 예를 들면 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 켐토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 벨로테칸, 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 컨쥬게이트 화합물은 분자량이 약 3,000~300,000의 값을 가지며, 바람직하게는 30,000~100,000의 값을 갖고, 수용액에서 잘 녹으며 평균 입자의 직경이 20~200 nm 크기의 비교적 큰 마이셀 입자들을 형성한다. 본 발명의 고분자 마이셀형 컨쥬게이트 화합물은 상술한 "향상된 투과보전(EPR) 효과"에 의하여 탁월한 암조직 선택성을 나타낸다.
이러한 본 발명의 폴리포스파젠 및 폴리포스파젠-탁세인 컨쥬게이트 화합물은 다음의 4단계를 포함하는 합성공정에 의해 제조될 수 있다.
(a) 출발물질인 6염화 고리형 포스파젠을 열 중합하여 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체를 합성한 후 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨 염과 반응시켜 폴리포스파젠 고분자 중간체를 얻는 단계;
(b) 상기 폴리포스파젠 고분자 중간체를 라이신 에스터, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드의 에스터, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군에서 선택되는 1종과 반응시켜 친수성 양이온성(cationic) 폴리포스파젠 고분자 약물전달체를 제조하는 단계;
(c) OH, 또는 NH2작용기를 갖는 약물을 링커(linker)를 이용하여 폴리포스파젠 고분자에 화학결합으로 결합시키기 용이한 약물 전구체(precursor)를 제조하는 단계; 및
(d) 상기 (b) 단계의 폴리포스파젠 고분자 약물전달체에 상기 (c) 단계의 약물 전구체(precursor)를 도입하여 하기 화학식 2의 화합물을 얻는 단계:
[화학식 2]
Figure 112015023957433-pat00017
상기 식에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, S는 스페이서 그룹으로 라이신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, L은 상기 스페이서 그룹과 상기 약물을 화학결합으로 연결시킬 수 있는 링커(linker) 를 나타내며, D는 OH 또는 NH2 작용기를 갖는 약물이고, x와 y는 각각 0~0.5이고, z는 0보다 크고 1.0이하이며, x+y+z = 1 이다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서,
상기 OH 또는 NH2작용기를 갖는 약물은 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 켐토테신(camptothecin) 및 [(트란스-1,2-디아미노사이클로헥산)백금(II)] 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 (a) 내지 (d)까지 4단계 반응은 약물의 구조에 따라 약간의 변화를 줄 수 있다. 예를 들면 백금 착물계 항암제의 경우 (c)단계에서 약물과 링커를 미리 반응시켜 전구체를 만든 다음 (d) 단계에서 전구체를 폴리포스파젠 고분자에 도입하는 대신, (c)단계에서 링커를 먼저 고분자에 결합시킨 후 (d)단계에서 약물을 고분자의 링커와 결합시킬 수도 있다.
다음의 모든 제조 과정은 수분이 들어가지 않도록 진공 및 질소라인을 이용하여 수행하는 것이 바람직하며, 반응에 사용하는 각종 용매는 수분을 충분히 제거하여 사용함이 바람직하다.
이하에서 제조 과정에 대해 상세하게 설명한다.
(a) 단계
우선, 아래의 화학식 12로 표시되는 6염화 고리형 포스파젠 삼합체 즉, (N=PCl2)3을 문헌에 제시된 방법(Youn Soo Sohn, et al. Macromolecules, 28, 7566(1995))에 따라 열 중합시켜, 평균 분자량이 104 ~ 105 범위인, 화학식 13으로 표시되는 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체 (N=PCl2)n 을 얻는다.
[화학식 12]
Figure 112015023957433-pat00018
[화학식 13]
Figure 112015023957433-pat00019
상기 화학식 13에서, n은 폴리포스파젠의 중합도로 3 내지 300의 정수이다.
하기 화학식 14의 모노메톡시폴리에틸렌글리콜을 톨루엔과 물의 아조트로피 현상을 이용하여 수분을 제거시킨 후 알칼리금속인 나트륨과 반응시켜 화학식 15의 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨염으로 만든 다음, 트리에틸아민의 존재 하에서 화학식 13의 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체와 반응시킨다.
[화학식 14]
Figure 112015023957433-pat00020
[화학식 15]
Figure 112015023957433-pat00021
상기 화학식 14 및 15에서, a 는 MPEG의 중합도로 7 내지 22이다
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 a는 7~ 22가 될 수 있다.
상기 반응을 좀 더 상세히 설명하면, 먼저 상기 화학식 12의 6염화 포스파젠 삼합체 (N=PCl2)3 와 이에 대하여 3~10 중량%에 해당하는 양의 무수 염화알루미늄 (AlCl3)을 파이렉스 반응관에 넣고 진공상태에서 밀봉한 다음, 10~20 rpm 으로 회전시키며 230~250 ℃에서 3~5시간 동안 용융반응 시키면 화학식 13의 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체를 얻는다. 다음 화학식 14의 모노메톡시폴리에틸렌글리콜을 1.2~1.5 당량의 나트륨 금속 조각과 함께 임의의 유기용매, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란 (THF), 벤젠, 톨루엔 등의 용매에서 반응시켜 화학식 15의 알콕시드형의 나트륨 염으로 만든다. 이렇게 만든 화학식 15의 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨염 용액을 같은 용매에 녹인 화학식 13의 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체 1 몰(1 반복단위)에 0.5~1.8 당량 적가한다. 이 때, 반응용매는 상기 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 될 수 있으며, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 클로로포름 등의 용매 중에서 수행될 수 있다. 화학식 13의 폴리디클로로포스파젠 용액을 0℃ 이하의 낮은 온도로 냉각시킨 후 화학식 15의 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨염 용액을 서서히 부가하는데, 바람직하게는 0 ℃ 이하에서 2~8시간 동안 반응시킨 후, 실온에서 6~24시간 동안 반응시켜 폴리에틸렌글리콜이 0.5~1.8 당량 치환된 하기 화학식 16의 고분자 중간체를 제조할 수 있다. 상기 저온에서 반응을 수행하기 위해서는 예를 들어, 얼음-중탕조를 이용하여 수행할 수 있다.
[화학식 16]
Figure 112015023957433-pat00022
화학식 16에서, n은 폴리포스파젠의 중합도로 3 내지 300의 정수이고, a는 MPEG의 중합도로 7 내지 22 이며, b는 MPEG의 치환량으로 0.5~1.8 이다.
(b) 단계
상기 화학식 16의 폴리포스파젠 고분자 중간체의 미 치환된 2-b개의 염소에 대하여, 1.5~1.8 당량의 라이신 에스터 또는 라이신을 포함하는 올리고펩타이드의 에스터와 6당량의 트라이에틸아민을 임의의 유기용매, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란, 클로로포름 또는 다이클로로메테인 용매에 녹인 혼합용액을 위의 반응액에 적가하고, 40~60 ℃에서 12시간 내지 3일간 환류 반응시킨다. 이 때, 상기 라이신 에스터로는 예를 들어 하기 화학식 17로 표시되는 물질을 사용할 수 있고, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드의 에스터로는 하기 화학식 18로 표시되는 물질을 사용할 수 있다. 이때, 글라이신 부분은 글라이신 외에 루이신, 페닐알라닌, 아이소루이신, 발린 등의 아미노산류로 대체될 수 있다.
[화학식 17]
Figure 112015023957433-pat00023
[화학식 18]
Figure 112015023957433-pat00024
상기 화학식 17 및 18에서, R은 C1-6의 선형, 가지형 또는 고리형 알킬, 또는 OCH2Bz이고, R'는 아민 그룹의 보호기인 t-Boc (tert-butoxycarbonyl), Fmoc(fluorenylmethyloxycarbonyl) 또는 CBZ (carbozenyloxy) 그룹을 나타낸다.
본 발명에서, 상기 R의 구체적인 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, 또는 t-부틸 등을 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
이어서 반응용액을 원심분리 또는 여과하여 부산물로 생성된 과량의 침전물들(예: Et3NHCl 또는 NaCl)을 제거한 후 여액을 감압 농축하고, 여기에 다시 에탄올을 첨가하여 다시 감압 농축 한다. 이 작업을 2회 반복하여 유기계 용매를 완전히 제거한 후에 오일 상태의 반응 혼합물을 다시 소량의 에탄올(100ml)에 녹인 후 다량의 물(900ml)을 첨가하여 저온에서 재결정한다. 3시간 후 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 이용하여 필터하여, 침전물을 제거한다. 이 용액을 다시 0.2 um, 그리고 0.1㎛ 멤브레인을 이용하여 100 nm이상의 고분자 내지는 침전물들을 모두 제거한 후에, 한외여과막 장비와 한외여과막(MWCO=3,000 Da)를 이용하여 저분자량의 불순물들을 제거한다. 이때, 처음 3회 디솔팅작업에서는 물:에탄올 3:1 부피 비율의 용액으로 씻고, 이후 순수한 물로 6회 이상 세척작업, 정제작업, 그리고 농축작업을 거쳐 고농도의 고분자 용액을 얻는다. 이렇게 얻어진 폴리포스파젠 고분자 용액을 동결건조하여 폴리포스파젠 고분자 유도체, 예를 들면 하기 화학식 19 또는 화학식 20의 폴리포스파젠계 고분자 유도체를 얻을 수 있다.
[화학식 19]
Figure 112015023957433-pat00025
[화학식 20]
Figure 112015023957433-pat00026
상기 화학식 19 및 20에서, n은 폴리포스파젠의 중합도로 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌클리콜을 나타내고, b는 0.5 ~ 1.8의 값을 갖는다. 또한 R은 C1-6 의 선형, 가지형 또는 고리형 알킬, 또는 OCH2Bz이고, R'는 아민 그룹의 보호기인 t-Boc, Fmoc 또는 CBZ 그룹을 나타낸다.
(c) 단계
상기 (b)단계서 합성한 폴리포스파젠 고분자 약물전달체에 탁세인과 같은 소수성 항암제를 화학적으로 직접 결합시키는 일은 고분자 및 약물의 화학구조상 용이하지 않을 뿐만 아니라 설사 결합시켜 컨쥬게이트를 만들 더라도 체내에서 약물이 고분자 전달체로부터 용이하게 떨어져 나올 수 있도록 적당한 링커(L)를 사용하여 고분자 약물전달체와 항암제를 연결시켜 컨쥬게이트를 합성하여야 한다. 컨쥬게이트 형 항암제 합성에 있어서 링커의 역할은 매우 주요하다. 특히 본 발명에 있어서 링커 그룹은 폴리포스파젠 고분자 약물전달체의 기능기(-COOH, -NH2)와 탁세인 항암제의 기능기(-OH, -NH2)를 이용하여 쉽게 연결 할 수 있어야 하며, 더욱 중요한 것은 이렇게 합성된 컨쥬게이트 항암물질이 체내 주입시 혈중에서는 항암제를 방출하지 않고 암조직에 도달 한 후에는 항암제를 바로 방출 할 수 있어야 하기 때문이다. 본 발명에서는 아래 화학식 7의 무수아코니틱산이 특히 탁세인 항암제 컨쥬게이트 합성에 최적의 링커임을 발견하고 다음과 같이 탁세인과 무수아코니틱산이 결합된 전구체를 합성하였다.
무수아코니틱산(2.0mmol, 312mg )과 도세탁셀(1.0mmol, 803mg)을 아르곤 기류하에서 섞은 후 저온으로 냉각시킨다. 여기에 THF 또는 디클로로메틸렌클로라이드 용매로 용해시키고 혼합한 후 저온(0˚C)을 유지하며, DIC (2.0mmol, 0.252g), DPTS (2.0mmol, 0.58g)를 차례로 넣어서 중성상태에서 무수아코니틱산의 카르복시산과 도세탁셀의 -OH(2')를 에스터 결합으로 12시간 동안 반응시킨다. 12시간 후 TLC를 이용하여 반응이 종결된 것을 확인한 후, NHS(N-hydroxysuccinimide)를 DIPEA와 함께 과량으로 첨가하여 무수아코니틱산의 무수고리를 개환한다. 무수아코니틱산의 고리는 염기성 용액에서 -OH 작용기 또는 -NH2 작용기에 의해 개환 반응이 쉽게 일어나는 것으로 알려져 있다. 첨가후 다시 12시간 동안 반응을 시키고, 반응액을 0℃로 3시간 동안 냉각 시킨다. 그 후 반응용액을 감압 필터하여 녹지 않은 불순물을 제거한다. 그후 감압증류하여 사용한 유기 용매를 모두 제거하고, 오일 상태의 반응 혼합물을 얻는다. 여기에 에탄올 (50ml)를 첨가하여 완전히 녹인후 다량의 물(500ml)를 첨가한 후 냉장고에서 3시간 동안 재결정한다. 상등액을 따라버리는 작업을 2회 반복한 후 오일 상태의 반응 물에 메틸렌클로라이드 300ml를 첨가하여 완전히 용해시킨다. 이 용액을 분별깔대기로 옮긴후 포화된 소금물(100ml)을 이용하여 3회 세척한다. 세척후 유기층을 모으고, 이 유기층을 무수 NaHCO3을 이용하여 건조한 후 감압필터하고 감압증류하여 -NH2 작용기를 갖는 스페이서(S)에 직접 아마이드 결합으로 결합시켜 링커가 도입된 약물 전구체를 95 % 이상의 고 수율로 얻을 수 있었다.
[화학식 7]
Figure 112015023957433-pat00027

(d) 단계
상기 (b)단계에서 얻어진 폴리포스파젠 고분자 약물전달체에 소수성 항암제, 예를 들면 탁세인계 항암제를 결합시켜 본 발명의 화학식 2로 표시되는 선형 폴리포스파젠-항암제 컨쥬게이트 를 얻는다. 이 때 폴리포스파젠 고분자 유도체에 탁세인 항암제를 결합시키는 방법에는, 폴리포스파젠 고분자의 라이신 아민기와 아코니틱 링커를 이용하여 아마이드 결합으로 연결시키는 방법과, 폴리포스파젠 고분자의 라이신 카르복실기와 탁세인의 2'-알콜기를 에스터 결합으로 연결하는 방법 등 2가지가 있다. 따라서 본 (d) 단계는 하기의 2가지 방법으로 수행될 수 있다.
먼저 아마이드 결합방법의 경우, 상기 얻어진 폴리포스파젠 고분자 유도체, 예를 들어 화학식 19 또는 화학식 20의 고분자 유도체에 아민 보호기(t-Boc)를 삼불화아세트산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드의 2:1 혼합용액을 이용하여 6시간 이상 반응시켜 보호기를 제거한 후, 반응용액을 트라이에틸 아민을 이용하여 중화한 후에 감압 증류하여 농축한다. 이 농축액을 NaHCO3 포화용액에 다시 녹여 한외여과막(예: MWCO = 3,000)을 이용하여 물/에탄올의 혼합용액으로 3회 그리고 순수한 물로 6회 씻는 작업과 정제 작업을 거친후 200ml 이하로 농축하여 동결건조한다.
이렇게 건조된 포스파젠계 고분자와 여기에 도입하고자 하는 항암제, 예를들면 도세탁셀과 연결기 링커(linker), 예를들면 무수아코니틱산을 미리 반응시켜 활성화 된 에스터 형태로 제조된 아코니틱탁세인-NHS(N-hydroxysuccinimidyl) 에스터를 12시간동안 염기성 조건에서 반응 시켜준다. 12시간 후 감압 증류하여 농축하고, 다시 에탄올에 녹여 감압농축하여 사용한 용매 및 DIPEA (diisopropylethylamine) 를 모두 제거한다(37˚C, 5 mmbar). 용매가 모두 제거된 고분자 혼합물을 에탄올 50ml를 이용하여 깨끗이 녹인후에 물 950ml 를 첨가한 후 냉장고에서 3시간 동안 재결정한다. 3시간 후 용액을 감압필터하여 얻어진 용액을 한외여과막 장치를 이용하여, 위와 같은 방법으로 에탄올 30% 수용액을 이용하여 5회 세척하고, 다시 순수한 물을 이용하여 6회 이상 세척하여, 정제 작업과 미 반응 약물을 모두 제거하고, 추가로 사용한 에탄올을 모두 제거하여 원하는 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트를 합성하였다. 이때 투석횟수는 투석되어 나오는 여액의 UV spectrum을 측정하여 도세탁셀의 잔류량이 0.1%이하가 될 때까지 세척하였다.
[화학식 3]
Figure 112015023957433-pat00028
[화학식 4]
Figure 112015023957433-pat00029
상기 화학식 3 및 4에서, n은 폴리포스파젠의 중합도로 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, L은 스페이서와 약물을 화학결합으로 연결시킬 수 있는 링커(linker) 를 나타내며 D는 탁세인 계, 켐토테신 계 또는 백금착물 계의 항암제를 나타내며, R은 C1-6의 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 또는 OCH2Bz이다. 여기서, x와 y는 각각 0~0.5이고 z는 0보다 크고 1.0이하의 값을 가지며, x+y+z = 1 이다.
다음 에스터 결합방법으로는, 얻어진 폴리포스파젠 고분자 유도체의 라이신의 에스터를 알칼리로 가수분해하여 산성화 한 후 탁세인 분자와 직접 에스테르화 반응시켜 수행될 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 상기 화학식 16의 폴리포스파젠 고분자 유도체를 메탄올에 녹인 후 에스터 그룹을 KOH 또는 NaOH(1.5~2배 과량)를 이용하여 가수분해하여 금속염형태의 폴리포스파젠을 얻는다. 메탄올을 감압증류하여 제거한 후 고체상태의 반응혼합물을 물(100ml)에 녹인 후 분별깔대기로 옮긴다. 이 용액에 메틸렌클로라이드 또는 클로로포름(300ml)를 첨가한 후 유기산용액을 서서히 첨가하여 서서히 산성화 시킨다. 물층의 pH를 대략 4~3정도 떨어뜨린 후 첨가한 유기 용매로 고분자를 추출한다. 유기용매를 이용하여 3회 더 추출하여 모은 유기용매 층을 무수 NaHCO3를 이용하여 건조하고, 이를 필터한 후 감압여과하여 가수분해된 고분자를 얻는다. 가수 분해된 포스파젠계 고분자와 탁세인(예: 파클리탁셀)을 테트라하이드로퓨란 등의 임의의 유기용매에 녹인 후 N,N'-디시클로헥실카보디이미드와 트리에틸아민을 첨가하여 탁세인을 고분자체에 에스터 결합으로 컨쥬게이션 시킨다. 박층크로마토그라피법(예: CHCl3:MeOH = 10:1)을 이용하여 반응이 끝났음을 확인한 다음, 감압여과, 감압증류 하여 반응 용액을 농축시킨 후, 마지막으로 투석막(예: MWCO = 3,500)을 이용하여 분리 정제하고 동결 건조하면 본 발명의 컨쥬게이트 화합물, 예를 들어 하기 화학식 5의 폴리포스파젠-탁세인 컨쥬게이트 화합물을 얻을 수 있다.
[화학식 5]
Figure 112015023957433-pat00030
상기 화학식 5에서, n은 폴리포스파젠의 중합도를 나타내는 값으로 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, D 는 도세탁셀, 파클리탁셀 및 켐토테신으로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 나타내고, R'는 t-Boc, Fmoc 또는 CBZ 그룹을 나타낸다. 여기서, x와 y는 각각 0~0.5, z는 0보다 크고 1.0 이하의 값을 가지며, x+y+z = 1 이다.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 실시예 및 실험예를 들어 설명하나, 본 발명의 권리범위가 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예에서는 Perkin-Elmer C, H, N 분석기로 탄소, 수소 및 질소의 원소 분석을 수행하였다. 수소의 핵자기 공명 스펙트럼과 인 핵자기 공명 스펙트럼은 Varian Gemini-500 NMR Spectrometer를 사용하여 얻었다. 수용액 중에서의 나노 입자의 입도 분포는 Malvern Zetasizer (Nano-ZS)를 사용하여 측정하였다.
실시예
폴리포스파젠 화합물(약물전달체)의 합성.
실시예 1. [ NP ( MPEG550 ) 1.5 ( LysEt ) 0.5 ] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, 11.54 g, 100 mmol)에 촉매인 3염화알루미늄 (AlCl3 , 7.5 wt %)을 첨가한 후 기존방법(Sohn Y. S. et al. Macromolecules 1995, 28, 7566) 대로 250 °C에서 5 시간 동안 용융 중합하여 폴리디클로로포스파젠 ([NPCl2]n)을 합성하였다. 한편, 분자량 550의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG550) (82.5 g, 150.0 mmol)과 나트륨(Na) 금속(4.9 g, 200.4 mmol)을 건조된 톨루엔 용매에 넣고 아르곤 기류 하에서 6시간 동안 120˚C에서 교반하여 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨염을 제조하였다. 위에서 만들어진 폴리디클로로포스파젠을 유리반응기에 옮긴 후 여기에 건조된 테트라하이드로퓨란 (100 ml)을 넣고 녹인 다음, 얼음 중탕(0℃)에서 앞서 제조한 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨염 용액을 60분 동안 적가하였다. 1시간 후에 얼음 중탕을 제거하고, 상온에서 12시간 동안 계속 반응시켜 MPEG550이 치환된 포스파젠 고분자 중간체 반응용액을 얻는다. 별도의 용기에서 건조된 클로로포름 용매(200 mL)에서 건조된 트라이에틸아민 (71.6 ml, 516 mmol)으로 중화한 Boc-lysine 에틸에스터 (N α -BocLysEt, 20.5g, 75.0 mmol)를 위의 고분자 반응용액에 서서히 가한 후, 상온에서 24시간 반응시켰다. 이 반응 용액을 여과하여 생성된 과량의 침전물 (NEt3·HCl 또는 NaCl)을 제거하고, 여액을 감압 농축한 후 다시 소량의 에탄올에 녹여 2회 감압 건조한다. 감압 건조 후 다시 물에 녹여 녹지 않는 침전물을 제거한 후 한외여과막(CE, MWCO=3,000)을 이용하여, 분자량 3000이하의 불순물을 제거한다. 증류수를 이용하여 5회이상 세척한 고분자 용액을 동결 건조하여 폴리포스파젠 고분자 유도체를 얻었다. 그 다음 폴리포스파젠 고분자 유도체로부터 보호기(t-Boc)를 제거하기 위하여, 상기 유도체를 30%(v/v) 트라이플루오로 아세틱산이 녹아있는 메틸렌클로라이드(200ml)에 다시 녹인 후, 6시간 동안 반응시켜 라이신 아민기의 보호기인 터셔리부틸옥시카보닐기가 완전히 제거된 약물 컨쥬게이션 용의 순수한 폴리포스파젠 유도체 [NP(MPEG550)1.5(LysEt)0.5]n 를 얻었다(수율 65 %, 3.37 g).
1H-MNR을 이용하여 라이신의 알파아민의 탈보호반응을 확인한 후 반응용액을 얼음 중탕하에 냉각시킨 후 트리아에틸아민을 첨가하여 용액을 중화시킨다. 완전히 중화된 것을 확인한 후에 감압증류기를 이용하여 유기 용매를 완전히 제거하고, 다시 고분자 용액에 NaHCO3용액을 첨가하여 완전히 녹인다. 완전히 녹지 않을 경우에는 멤브레인 필터를 이용하여 녹지 않는 불순물을 제거한다.
이때, 진한 고분자 용액은 멤브레인 필터가 어렵기 때문에 0.45㎛, 0.2㎛, 그리고 0.1㎛의 순서로 필터를 하여 깨끗한 고분자 용액을 얻는다.
이렇게 얻어진 고분자 용액은 우선 한외여과막을 이용하여 디솔팅(desalting) 작업을 한다. 디솔팅작업이 이루어진 고분자 용액은 다시 다양한 MWCO 값을 갖는 한외여과막을 이용하여 원하는 범위의 분자량을 갖는 고분자물질을 선택적으로 추출한다. 본 발명에서 사용한 한외여과막은 3 kDa, 30 kDa, 100 kDa, 300kDa의 MWCO 값을 갖는 한외여과막을 사용하여 원하는 분자량범위를 갖는 폴리포스파젠 고분자를 추출하여 사용하였다. 이때 고분자의 총 수율은 90%, 분자량별 수득률은 각각 (20, 30, 5, 30, 5%)의 수득률로 고분자 물질을 얻는다.
조성식: C83H170N4O41P2
원소분석 이론값(%):C,51.33; H, 8.82; N, 2.88.
측정값(%): C, 51.66; H, 8.59; N, 2.83.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 1.5H, Lys-OCH2 CH 3 ), 2.49 (br, 1.00H, suucinyl-CH 2 ), 2.90 (br, 1.00H, Lys-ε-CH 2 ), 3.38 (s, 4.50H, MPEG550-OCH 3 ), 3.65 (br, 66.0H, MPEG550-OCH 2 CH 2 ), 4.4(s, 1H, Lysine-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 2. [ NP ( MPEG750 ) 1.5 ( LysEt ) 0.5 ] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, 11.54 g, 100 mmol), MPEG750 (112.5 g, 150 mmol), 트리에틸아민(80.0 ml, 600 mmol), Boc-lysine에틸에스터 (Nα-BocLysEt, 20.5 g, 75.0 mmol)를 사용하여 실시예 1과 같은 방법으로 폴리포스파젠 고분자 유도체를 합성하였다. 합성한 고분자는 실시예 1과 같은 방법으로 한외여과막과 장비을 이용하여 3~30kDa, 30~100kDa, 100~300kDa, 그리고 300kDa이상의 분자량 별로 분리 분취하였다.
[NP(MPEG750)1.5(LysEt)0.5]n 를 얻었다 (수율, 74%).
조성식: C107H218N4O53P2 .
원소분석 이론값(%): C,52.01; H, 8.89; N, 2.27. 측정값(%): C, 51.30; H, 8.99; N, 2.363.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 1.50H, Lys-OCH2 CH 3 ), 1.39-1.98 (br, 3.00H, Lys-CH 2 ), 2.90 (br, 1H, Lys-ε-CH 2 ), 3.38 (s, 4.50H, MPEG750-OCH 3 ), 3.65 (br, 98.0H, MPEG750-OCH 2 CH 2 ), 4.01(bs, 6H, MPEG 750-CH2), 4.45(m, 0.5H, Lys-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 3. [ NP ( MPEG1000 ) 1.5 ( LysEt ) 0.5 ] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, 11.54 g, 100 mmol), MPEG1000 (150 g, 150 mmol), 트리에틸아민(80.0 ml, 600 mmol), Nα-BocLysEt, (20.5 g, 75.0 mmol)를 사용하여 실시예 1과 같은 방법으로 폴리포스파젠 고분자 유도체를 합성하였다. 합성한 고분자는 실시예 1과 같은 방법으로 한외여과막과 장비를 이용하여 3~30kDa, 30~100kDa, 100~300kDa, 그리고 300kDa이상의 분자량 별로 분리 분취하였다.
[NP(MPEG1000)1.5(LysEt)0.5]n 를 얻었다(수율, 74%).
조성식: C143H290N4O71P2,
원소분석 이론값(%): C, 52.62; H, 8.96; N, 1.72. 측정값(%): C, 53.01; H, 8.70; N, 1.93.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 1.50H, Lys-OCH2 CH 3 ), 1.39-1.98 (br, 3.00H, Lys-CH 2 ), 2.90 (br, 1H, Lys-ε-CH 2 ), 3.38 (s, 4.50H, MPEG750-OCH 3 ), 3.65 (br, 130.0H, MPEG1000-OCH 2 CH 2 ), 4.45(m, 0.5H, Lys-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 4. [ NP ( MPEG550 ) 1.25 ( LysEt ) 0.75 ] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, 11.54 g, 100 mmol), MPEG550 (69.0g, 126 mmol), 트리에틸아민(80.0 ml, 600 mmol), Nα-BocLysEt (27.4g, 100mmol)를 사용하여 실시예 1과 같은 방법으로 폴리포스파젠 고분자 유도체를 합성하였다. 합성한 고분자는 실시예 1과 같은 방법으로 한외여과막과 장비을 이용하여 3~30 kDa, 30~100 kDa, 100~300kDa, 그리고 300 kDa이상의 분자량 별로 분리 분취하였다.
[NP(MPEG550)1.25(LysEt)0.75]n 를 얻었다(수율, 74%).
조성식: C74 .5H153N5O 35.5P2
원소분석 이론값(%): C, 51.14; H 8.82; N, 4.14. 측정값(%): C, 50.87; H, 9.028; N, 4.31.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 2.25H, Lys-OCH2CH3), 1.39-1.98 (br, 4.50H, Lys-CH2), 2.90 (br, 1.5H, Lys-ε-CH2), 3.38 (s, 3.75H, MPEG750-OCH3), 3.65 (br, 82.5H, MPEG550-OCH2CH2), 4.45(m, 0.7H, Lys-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 5. [ NP ( MPEG550 ) 1.0 ( LysEt ) 1.0 ] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, 11.54 g, 100 mmol), MPEG550 (55.0g, 100 mmol), 트리에틸아민(80.0 ml, 600 mmol), Nα-BocLysEt, (35.6g, 130mmol)를 사용하여 실시예 1과 같은 방법으로 폴리포스파젠 고분자 유도체를 합성하였다. 합성한 고분자는 실시예 1과 같은 방법으로 한외여과막과 장비을 이용하여 3~30kDa, 30~100kDa, 100~300kDa, 그리고 300kDa이상의 분자량 별로 분리 분취하였다. [NP(MPEG550)1.0(LysEt)1.0]n 를 얻었다(수율, 74%).
조성식: C66H136N6O30P2
원소분석 이론값(%): C, 50.95; H, 8.81; N, 5.40. 측정값(%): C, 50.29; H, 8.95; N, 5.51.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 3.00H, Lys-OCH2 CH 3 ), 1.39-1.98 (br, 6.00H, Lys-CH 2 ), 2.90 (br, 2.0H, Lys-ε-CH 2 ), 3.38 (s, 3.0H, MPEG750-OCH 3 ), 3.65 (br, 66.0H, MPEG500-OCH 2 CH 2 ), 4.45(m, 1.0H, Lys-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 6. [ NP ( MPEG550 ) 1.50 ( GlyLysEt ) 0.50 ] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, 11.54 g, 100 mmol), MPEG550 (82.5 g, 150 mmol), 트리에틸아민(80.0 ml, 600 mmol), Gly(Nε-BocLysEt(24.8 g, 90 mmol)를 사용하여 실시예 1과 같은 방법으로 폴리포스파젠 고분자 유도체를 합성하였다. 합성한 고분자는 실시예 1과 같은 방법으로 한외여과막과 장비을 이용하여 3~30kDa, 30~100kDa, 100~300kDa, 그리고 300kDa이상의 분자량 별로 분리 분취하였다.
[NP(MPEG550)1.5(GlyLysEt)0.5]n 를 얻었다(수율, 74%).
조성식: C85H173N5O42P2.
원소분석 이론값(%): C, 51.06; H, 8.72; N,3.50측정값(%): C, 50.75; H, 8.82; N, 3.61.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 3.00H, Lys-OCH2CH3), 1.39-1.98 (br, 6.00H, Lys-CH2), 2.90 (br, 2.0H, Lys-ε-CH2), 3.38 (s, 3.0H, MPEG750-OCH3), 3.65 (br, 66.0H, MPEG500-OCH2CH2), 3.92(bs, 2H, Gly-CH2), 4.45(m, 1.0H, Lys-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 7. [ NP ( MPEG550 ) 1.5 ( N α - BocLys ) 0.5 ] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, 11.54 g, 100 mmol), MPEG550 (82.5 g, 150 mmol), 트리에틸아민(80.0 ml, 600 mmol), Nα-BocLysEt(20.5g, 75 mmol)를 사용하여 실시예 1과 같은 방법으로 폴리포스파젠 스페이서의 아민그룹이 보호된 고분자 유도체를 합성하였다. 합성한 유도체(10g, 10mmol), NaOH(0.4g, 10mmol)을 메탄올 용매에 녹여 4시간 동안 상온에서 반응 보내서 가수분해한다. 가수분해는 1H-NMR을 이용하여 확인하고, 가수분해가 확인된 고분자 용액은 감압증류하여 고체 상태의 고분자를 얻는다. 이 고체를 증류수에 녹인 후 유기산 용액을 이용하여 pH를 3이하로 떨어뜨린 후 클로로포름 또는 메틸린클로라이드 용매를 이용하여 3회 추출한다. 추출한 유기층은 무수 NaHCO3를 이용하여 건조하고, 건조된 유기층은 다시 감압증류하여 카르복시산 형태의 폴리포스파젠 고분자를 얻는다. (수율: 95% 이상)
조성식: C86H174N4O43P2 .
원소분석 이론값(%): C, 51.28; H, 8.71; N, 2.78. 측정값(%): C, 51.02; H, 8.94; N, 2.91.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.32(s, 4.5H, Boc-CH3),
1.39-1.98 (br, 6.00H, Lys-CH 2 ), 2.90 (br, 2.0H, Lys-ε-CH 2 ), 3.38 (s, 3.0H, MPEG550-OCH 3 ), 3.65 (br, 66.0H, MPEG550-OCH 2 CH 2 ), 4.45(m, 1.0H, Lys-CH).
실시예 8. [NP( MPEG550 )( AE )] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, (2.0 g, 5.72 mmol), 촉매인 3염화알루미늄 (AlCl3, 7.0 wt %), 분자량 550의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG550) (9.48 g, 17.2 mmol)과 나트륨(Na) 금속(0.59 g, 25.7 mmol)을 실시예 1과 같은 방법으로 반응시켜 MPEG550이 치환된 포스파젠 고분자 중간체 용액을 얻는다. 한편 2-아미노에탄올(AE) (1.30 g, 21.3 mol)과 수화나트륨 (0.61 g, 25.4 mmol)을 건조된 테트라하이드로퓨란 (50 ml) 용매에서 상온에서 5시간 반응시키면 노란색 2-아미노에탄올의 나트륨염이 침전으로 떨어진다. 이 침전을 여과하여 에틸이써(ethylether)로 충분히 씻은 후 디메칠설퍼옥사이드(DMSO)(50 ml) 용매에 녹인 후 이 용액을 위의 MPEG550이 치환된 포스파젠 중간체 용액에 서서히 가한 후 약 50 oC에서 24시간 반응시킨다. 반응액으로부터 부산물인 염화나트륨을 여과/제거한 후 여과액을 셀루로스 멤브레인(MWCO: 3.5 kDa)을 이용하여 투석한 후 동결건조하면 새로운 기능성 폴리포스파젠고분자 [NP(MPEG550)(AE)]n를 얻는다(수율: 70%).
조성식: C27H57N2O14P.H2O
원소분석 이론값(%): C, 47.45; H, 8.64; N, 4.10; 측정값(%): 47.38; H, 8.61; N, 3.95.
수소핵자기 공명 스펙트럼(D2O)(δ, ppm): 3.26 (s, 3H, OCH3 of MPEG), 3.50-3.52(m, 4H, (CH2)2 of aminoethanol), 3.54-3.81 (brm, 46H, CH2 of MPEG), 3.83-4.10 (brm, 2H, -P-O-CH2- of MPEG).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -2.66 (O-P-O).
실시예 9. [NP( MPEG750 )( AE )] n 의 합성
6염화포스파젠 삼합체 ([NPCl2]3, (2.0 g, 5.72 mmol), 촉매인 3염화알루미늄 (AlCl3, 7.0 wt %), 분자량 550의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG750) (12.9 g, 17.2 mmol), 나트륨(Na) 금속 (0.59 g, 25.7 mmol), 2-아미노에탄올(AE) (1.30 g, 21.3 mol) 및 수화나트륨 (0.61 g, 25.4 mmol)을 실시예 8과 같은 방법으로 반응시켜 MPEG750이 치환된 포스파젠 고분자 [NP(MPEG750)(AE)]n (수율: 78%)를 얻는다.
조성식: C35H73N2O18P.H2O
원소분석 이론값(%): C, 48.89; H, 8.73; N, 3.26; 측정값(%): C, 48.02; H, 8.96; N, 3.55.
수소핵자기 공명 스펙트럼(D2O)(δ, ppm): 3.41 (s, 3H, OCH3 of MPEG), 3.49-3.53 (m, 4H, (CH2)2 of aminoethanol), 3.57-3.83 (brm, 62H, CH2 of MPEG), 3.83-4.05 (brm, 2H, -P-O-CH2- of MPEG).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -3.95 (O-P-O).
항암제-링커 전구체의 합성
실시예 10. 2'- Aconitic - docetaxel NHS ester 의 합성
Aconitic anhydride (20mmol, 3.12g), DPTS (6.0g, 20mmol)과 도세탁셀(8.03g, 10.0 mmol)을 4시간동안 진공건조한 후 저온 (-10 ℃)으로 냉각시킨 후 잘 건조된 테트라하이드로퓨란 (100 ml)를 첨가하여 반응물을 완전히 녹인다. 반응물을 완전히 녹인 후 마찬가지로 잘 건조된 테르라하이드로퓨란에 녹인 DCI (20 mmol, 2.5g)을 20분 동안 서서히 첨가한다. -10℃를 유지한 채 6시간 반응 보낸 후 다시 0 ℃에서 6~12시간 반응을 보낸다. 반응의 진행 과정은 TLC(전개용매, MC: MeOH=95:5)를 이용하여 rf값이 0.4 정도인 도세탁셀의 점이 사라지는 것을 이용하여 확인하였다. 미반응 도세탁셀이 사라지는 것을 확인한 후 다시 한번 HPLC를 이용하여 최종 반응의 완결을 확인 한 후 이 반응 용액에 과량의 N-하이드록시석신이마이드(NHS, 11.5 g, 100 mmol)와 염기로는 DIPEA(diisopropyl ethyl amine)를 과량(5~10배)으로 첨가하여, basic 조건으로 만들어 추가로 12시간 동안 반응을 더 보냈다. 12 시간후, 반응 혼합물을 감압건조 하여 고체 상태의 반응 혼합물을 얻고, 이 혼합물을 다시 소량의 에탄올(50ml)에 녹인 후 과량의 물(950ml)을 첨가하여 0 ℃에서 3시간 동안 재결정 한다. 그 후, 상등액을 따라버린 후 진한갈색의 오일을 클로로포름 또는 메틸렌클로라이드 등의 유기 용매에 녹인다. 이 용액을 분별깔대기로 옮긴 후 소금물/산성(사이트릭산, pH=2)/염기성(NaHCO3, pH=9)/소금물의 순으로 세척한 후 유기층을 건조제(MgSO4)를 이용하여 건조한 후 필터, 그리고 감압증류하여 원하는 2'-aconitic-docetaxel-NHS ester를 얻을 수 있었다.
조성식: C53H60N2O21
원소분석 이론값(%): C, 59.99; H, 5.70; N, 2.64. 측정치 (%): C, 60.07; H, 5.86; N, 2.71.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.13 ppm (s, 3H, C17-CH3), 1.24ppm(s, 3H, C16-CH3), 1.34ppm(s, 9H, C60-t Bu), 1.75 ppm (s, 3H, C19-CH3), 1.96ppm(s, 3H, C18-CH3), 2.18ppm(d, 2H, C14-CH2), 2.43ppm(s, 3H, C22-CH3), 2.64(t, 4H, NHS-CH2CH2), 2.92(s, 2H, aconitic-CH2), 4.21 ppm (d, 1H, C20-CHa), 4.24ppm(m, 1H, C7-CH), 4.32ppm(d, 1H, C20-CHb), 4.95ppm(dd, 1H, C5-CH), 5.23ppm(d, 1H, C10-CH), 5.40ppm(d, 1H, C30-CH), 5.69 ppm (d, 1H, C2-CH), 6.40-6.68(m, 1H, aconitic-CH), 7.51 ppm (m, 2H, C33, C27-CH), 7.53 (m, 6H, C32, C34-CH; C31, C35-CH; C26, C28-CH), 8.12(d, 2H, C25, C29-CH).
실시예 11. 2'- Aconitic - paclitaxel - NHS 에스터의 합성
아코니틱 무수물(3.12g, 20mmol), 파클리탁셀(8.53g, 10mmol), DPTS (5.88g, 20mmol,), NHS (100mmol, 11.5g), DIC(20mmol, 2.52g), 그리고 DIPEA (10ml)를 이용하여 실시예 6과 같은 방법으로 2'-Aconitic-paclitaxel-NHS 에스터를 얻는다.
조성식: C55H58N2O19 .
원소분석 이론값(%): C, 62.85; H, 5.56; N,2.67 측정치 (%): C, 61.90; H, 5.75; N, 2.80.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.13 ppm (s, 3H, C17-CH3), 1.24 ppm (s, 3H, C16-CH3), 1.34 ppm (s, 9H, C60-t Bu), 1.75 ppm (s, 3H, C19-CH3), 1.96 ppm (s, 3H, C18-CH3), 2.18 ppm (d, 2H, C14-CH2), 2.43 ppm (s, 3H, C22-CH3), 2.64(t, 4H, NHS-CH2CH2), 2.92(s, 2H, aconitic-CH2), 4.21 ppm (d, 1H, C20-CHa), 4.24 ppm (m, 1H, C7-CH), 4.32 ppm (d, 1H, C20-CHb ), 4.95 ppm (dd, 1H, C5-CH), 5.23 ppm (d, 1H, C10-CH), 5.40 ppm (d, 1H, C30-CH), 5.69 ppm (d, 1H, C2-CH), 6.40-6.68(m, 1H, aconitic-CH), 7.51 ppm (m, 2H, C33, C27-CH), 7.53 (m, 6H,C32, C34-CH; C31, C35-CH; C26, C28-CH), 8.12(d, 2H, C25, C29-CH).
실시예 12. 2'- Aconitic - camptothecin - NHS 에스터의 합성
아코니틱 무수물(20mmol, 3.12g), 켐토테신(10mmol, 3.48g), DPTS (20mmol, 5.88g), NHS (100mmol, 11.5g), DIC(20mmol, 2.52g), 그리고 DIPEA (10ml)를 이용하여 실시예 6과 같은 방법으로 2'-Aconitic-camptothecin-NHS 에스터를 얻는다.
조성식: C30H23N3O11
원소분석 이론값(%): C, 59.90; H, 3.85; N, 6.99. 측정치 (%): C, 60.29.; H, 3.98; N, 6.57.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 0.9(t, 3H, C18-CH3), 2.0(m, 2H, C19-CH2), 2.64(t, 4H, NHS-CH2CH2), 2.92(s, 2H, aconitic-CH2), 4.20(d, 2H, C5-CH2), 4.76(m, 2H, C22-CH2), 6.40-6.68(m, 1H, aconitic-CH), 6.70(s, 1H, C14-CH), 7.59 (s, 1H, C11-CH), 7.80 (m, 2H, C12-CH; C7-CH), 8.0 (m, 2H, C9-CH; C12-CH)
실시예 13. 2’- Aconitic - glycamptothecin 합성
t-Boc-glycine (0.5g, 2.85 mmol)과 camptothecin(CPT) (0.5g, 1.43 mmol)을 무수염화메틸렌(20 ml)에 녹인 후 여기에 DIPC(0.36 ml, 2.85 mmol) 및 DMAP (0.31g, 2.53 mmol)를 가하고 실온에서 16시간 저어주며 반응시킨다. 반응 혼합물을 묽은 염산(pH 2)으로 추출한 후 무수 황상마그네슘으로 건조시킨 다음 회전건조기에서 건조시키면 t-Boc-glycamptothecin이 얻어진다. 이 중간 화합물을 염화메틸렌과 불화아세트산 혼합용매(10ml/10ml)에서 1시간 반응시켜 t-Boc을 제거하여 얻어진 camptothecin-gly-NH2 와 cis-aconitic anhydride (0.57g, 3.63 mmol)를 디메틸포름알데히드(DMF) 용매(2 ml)에 녹인 후 0 oC에서 16시간 반응시킨 다음 이써를 가하여 침전시켜 여과/건조하면 camptothecin 전구체 2’-Aconitic-glycamptothecin가 80% 수율로 얻어진다.
조성식: C28H23N3O10
원소분석 이론값(%): C, 59.84; H, 4.09; N, 7.48; 측정치 (%): C, 59.72; H, 4.01; N, 7.39.
수소핵자기 공명 스펙트럼(DMSO)(δ, ppm): 0.88-0.93 (brm, 3H, -CH3 of CPT-C18), 2.12-2.16(m, 2H, -CH2 of CPT -C-19), 2.86(s, 2H, -CH2 of cis-aconitate), 3.92-4.42 (brm, 2H, -CH2 of glycine), 5 .27(brs, 2H, -CH2 of CPT- C5),5.49 (brs, 2H, -CH2 of CPT-C22), 5.97(s,1H, =CH of cis-aconitate), 7.18-7.21 (m, 1H, =CH of CPT-C14), 7.69-7.72 (m, 1H, =CH of CPT-C11), 7.84-7.89 (m, 1H, =CH of CPT-C10) 8.10-8.21 (m, 2H, =CH of CPT-C12 and C9), 8.68 (brs, 1H, =CH of CPT-C7), 12.3-12.8 (brs, -COOH of cis-aconitatic acid).
폴리포스파젠 -항암제 컨쥬게이트 화합물의 합성
실시예 14. [ NP ( MPEG550 ) 1.5 ( LysEt -2'- aconitic - docetaxel ) 0.5 ] n 의 합성
실시예 1에서 얻어진 폴리포스파젠 유도체(4.85g, 5.0 mmol)를 메틸렌클로라이드에 녹인 후 얼음 탕을 이용하여 냉각시키고, 실시예 8의 2'-아코니틱 도세탁셀 NHS 에스터(2'-aconitic-docetaxel-NHS, 2.65g, 2.5 mmol)을 메틸렌클로라이드에 녹인 후 반응플라스크에 첨가한다. 충분히 냉각된 후, DIPEA(10ml)를 첨가한 후 12시간동안 저온(0~5℃)를 유지하며 반응 시킨다.
12시간 후 반응 용매를 감압증류하여 제거한 후 다시 에탄올에 녹여 감압증류 하는 과정을 2회 반복한다. 감압증류 후 얻어지는 고분자 물질을 다시 소량의 에탄올과 다량의 물에 녹에 재결정한다. 이때, 녹지 않는 침전물들은 멤브레인 필터를 이용하여 제거하고, 마지막으로 깨끗한 용액은 한외여과막을 이용하여 분리 정제한다. 한외여과막을 이용하여 정제 할 때는 초반에는 에탄올 30% (v/v) 용액을 이용하여 5회 세척한 후 다시 순수한 물로 바꾸어 5회 세척, 농축 시킨다. 이렇게 얻어진 농축용액을 동결건조하여, 최종의 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG550)1.5(LysEt-2'-aconitic-docetaxel)0.5]n 을 얻는다. (수율=90%)
조성식: C132H225N5O59P2.
원소분석 이론값(%): C, 54.89; H, 7.85; N, 2.42. 측정값(%): C, 53.62: H, 7.92; N, 2.67.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.13 ppm (s, 1.5H, C17-CH3), 1.24 ppm (s, 1.5H, C16-CH3), 1.34 ppm (bs, 4.1H, C60-t Bu), 1.75 ppm (s, 1.5H, C19-CH3), 1.96 ppm (s, 1.5H, C18-CH3), 2.18 ppm (d, 1.0H, C14-CH2), 2.43 ppm (s, 1.5H, C22-CH3), 4.21 ppm (d, 0.5H, C20-CHa ), 4.24 ppm (m, 0.5H, C7-CH), 4.32 ppm (d, 0.5H, C20-CHb ), 4.95 ppm (dd, 0.5H, C5-CH), 5.23 ppm (d, 0.5H, C10-CH), 5.40 ppm (d, 0.5H, C30-CH), 5.69 ppm (d, 0.5H, C2-CH), 7.51 ppm (m, 1.0H, C33, C27-CH), 7.53 (m, 3.0H, C32, C34-CH; C31, C35-CH; C26, C28-CH), 8.12(d, 0.6H, C25, C29-CH), 1.24(s, 1.5H, Lys-OCH2CH3), 1.29(bs, 1H, Lys-CH2), 1.55 ppm (bs, 1H, Lys-CH2), 1.80(bs, 1H, Lys-CH2), 2.90(br, 1H, Lys-e-CH2), 3.38 ppm (s, 4.50H, CH 3 O-, PEG), and 3.63 ppm (m, 66.0H, -CH 2 CH 2 -O-), 4.4(s, 0.51H, Lysine-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 15. [ NP ( MPEG550 ) 1.5 ( LysEt ) 0.2 ( LysEt -2'- aconitic - docetaxel ) 0.3 ] n 의 합성
실시예 1에서 얻어진 폴리포스파젠 유도체(9.7 g, 10.0 mmol), 실시예 8의 2'-아코니틱 도세탁셀 NHS 에스터 (3.18g, 3.0 mmol) 그리고 DIPEA(5ml)를 이용하여 실시예 14와 같은 방법으로 최종의 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG550)1.5(LysEt)0.2(LysEt-2'-aconitic-docetaxel)0.3]n 을 얻는다. (수율=90%)
조성식: C112 .4 H203N4 .6O 51.8P2.
원소분석 이론값(%): C, 53.79; H, 8.15; N, 2.57. 측정값(%): C, 53.48: H, 8.31; N, 2.64.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.13 ppm (s, 0.9H, C17-CH3), 1.24 ppm (s, 0.9H, C16-CH3), 1.34 ppm (bs, 3.31H, C60-t Bu), 1.75 ppm (s, 0.9H, C19-CH3), 1.96 ppm (s, 0.9H, C18-CH3), 2.18 ppm (d, 0.6H, C14-CH2), 2.43 ppm (s, 0.9H, C22-CH3), 4.21 ppm (d, 0.3H, C20-CHa ), 4.24 ppm (m, 0.3H, C7-CH), 4.32 ppm (d, 0.3H, C20-CHb ), 4.95 ppm (dd, 0.31H, C5-CH), 5.23 ppm (d, 0.3H, C10-CH), 5.40 ppm (d, 0.3H, C30-CH), 5.69 ppm (d, 0.3H, C2-CH), 7.51 ppm (m, 0.6H, C33, C27-CH), 7.53 (m, 1.8H, C32, C34-CH; C31, C35-CH; C26, C28-CH), 8.12(d, 0.6H, C25, C29-CH), 1.24(s, 1.5H, Lys-OCH2CH3), 1.29(bs, 1H, Lys-CH2), 1.55 ppm (bs, 1H, Lys-CH2), 1.80(bs, 1H, Lys-CH2), 2.90(br, 1H, Lys-e-CH2), 3.38 ppm (s, 4.50H, CH 3 O-, PEG), and 3.63 ppm (m, 66.0H, -CH 2 CH 2 -O-), 4.4(s, 0.51H, Lysine-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 16. [ NP ( MPEG750 ) 1.5 ( LysEt ) 0.2 ( LysEt -2'- aconitic - docetaxel ) 0.3 ] n 의 합성
실시예 2의 폴리포스파젠 (12.6.3.6g, 10mmol)과 실시예 11의 2'-아코니틱도세탁셀 NHS 에스터 (5.3g, 5.0 mmol) 그리고 DIPEA(10mml)를 이용하여 실시예 14 와 같은 방법으로 최종 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG750)1.5(LysEt)0.2(LysEt-2'-aconitic-docetaxel)0.3]n를 얻는다. (수율=89 %)
조성식: C136 .4H251N4 .6O63 .8 P2.
원소분석 이론값(%): C, 53.92; H, 8.33; N, 2.12. 측정값(%): C, 53.27: H, 8.45; N, 2.31.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.13 ppm (s, 0.9H, C17-CH3), 1.24 ppm (s, 0.9H, C16-CH3), 1.34 ppm (bs, 3.31H, C60-t Bu), 1.75 ppm (s, 0.9H, C19-CH3), 1.96 ppm (s, 0.9H, C18-CH3), 2.18 ppm (d, 0.6H, C14-CH2), 2.43 ppm (s, 0.9H, C22-CH3), 4.21 ppm (d, 0.3H, C20-CHa ), 4.24 ppm (m, 0.3H, C7-CH), 4.32 ppm (d, 0.3H, C20-CHb ), 4.95 ppm (dd, 0.31H, C5-CH), 5.23 ppm (d, 0.3H, C10-CH), 5.40 ppm (d, 0.3H, C30-CH), 5.69 ppm (d, 0.3H, C2-CH), 7.51 ppm (m, 0.6H, C33, C27-CH), 7.53 (m, 1.8H, C32, C34-CH; C31, C35-CH; C26, C28-CH), 8.12(d, 0.6H, C25, C29-CH), 1.24(s, 1.5H, Lys-OCH2CH3), 1.29(bs, 1H, Lys-CH2), 1.55 ppm (bs, 1H, Lys-CH2), 1.80(bs, 1H, Lys-CH2), 2.90(br, 1H, Lys-ε-CH2), 3.38 ppm (s, 4.50H, CH 3 O-, PEG), and 3.63 ppm (m, 98.0H, -CH 2 CH 2 O-), 4.0(bs, 4H, MPEG 750-CH2), 4.51(s, 0.51H, Lysine-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 17. [ NP ( MPEG1000 ) 1.5 ( LysEt ) 0.2 ( LysEt -2'- aconitic - docetaxel ) 0.3 ] n 의 합성
실시예 3의 폴리포스파젠 (15.6g, 10mmol)과 실시예 8의 2'-아코니틱도세탁셀 active ester (5.3g, 5.0 mmol) 그리고 DIPEA(10mml)를 이용하여 실시예 14와 같은 방법으로, 최종 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG1000)1.5(LysEt)0.2(LysEt-2'-aconitic-docetaxel)0.3]n를 얻는다. (수율=89 %)
조성식: C 172.4 H 323 N 4.6O 48.2 P2 .
원소분석 이론값(%): C, 54.04, H, 8.50; N, 1.68. 측정값(%): C, 53.71: H, 8.74; N, 2.01.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.13 ppm (s, 0.9H, C17-CH3), 1.24 ppm (s, 0.9H, C16-CH3), 1.34 ppm (bs, 3.31H, C60-t Bu), 1.75 ppm (s, 0.9H, C19-CH3), 1.96 ppm (s, 0.9H, C18-CH3), 2.18 ppm (d, 0.6H, C14-CH2), 2.43 ppm (s, 0.9H, C22-CH3), 4.21 ppm (d, 0.3H, C20-CHa ), 4.24 ppm (m, 0.3H, C7-CH), 4.32 ppm (d, 0.3H, C20-CHb ), 4.95 ppm (dd, 0.31H, C5-CH), 5.23 ppm (d, 0.3H, C10-CH), 5.40 ppm (d, 0.3H, C30-CH), 5.69 ppm (d, 0.3H, C2-CH), 7.51 ppm (m, 0.6H, C33, C27-CH), 7.53 (m, 1.8H, C32, C34-CH; C31, C35-CH; C26, C28-CH), 8.12(d, 0.6H, C25, C29-CH), 1.24(s, 1.5H, Lys-OCH2CH3), 1.29(bs, 1H, Lys-CH2), 1.55 ppm (bs, 1H, Lys-CH2), 1.80(bs, 1H, Lys-CH2), 2.90(br, 1H, Lys-ε-CH2), 3.38 ppm (s, 4.50H, MPEG-CH 3 O-), and 3.63 ppm (m, 128H, MPEG-CH 2 CH 2 O), 4.0(bs, 4H, MPEG1000-CH2), 4.51(s, 0.51H, Lysine-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 18. [ NP ( MPEG550 ) 1.0 ( LysEt ) 0.5 ( LysEt -2'- aconitic - docetaxel ) 0.5 ] n 의 합성
실시예 5의 폴리포스파젠 (7.7g, 10mmol)과 실시예 11의 2'-아코니틱도세탁셀 NHS 에스터(6.36g, 6.0 mmol) 그리고 DIPEA(10mml)를 이용하여 실시예 14와 같은 방법으로, 최종 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG550)1.0(LysEt)0.5(LysEt-2'-aconitic-docetaxel)0.5]n를 얻는다. (수율=89 %)
조성식: C 115 H 191 N 7 O 48 P2 ..
원소분석 이론값(%): C,55.21; H, 7.70; N, 3.92. 측정값(%) : C, 54.92: H, 8.01; N, 3.99.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.13 ppm (s, 0.9H, C17-CH3), 1.24 ppm (s, 0.9H, C16-CH3), 1.34 ppm (bs, 3.31H, C60-t Bu), 1.75 ppm (s, 0.9H, C19-CH3), 1.96 ppm (s, 0.9H, C18-CH3), 2.18 ppm (d, 0.6H, C14-CH2), 2.43 ppm (s, 0.9H, C22-CH3), 4.21 ppm (d, 0.3H, C20-CHa ), 4.24 ppm (m, 0.3H, C7-CH), 4.32 ppm (d, 0.3H, C20-CHb ), 4.95 ppm (dd, 0.31H, C5-CH), 5.23 ppm (d, 0.3H, C10-CH), 5.40 ppm (d, 0.3H, C30-CH), 5.69 ppm (d, 0.3H, C2-CH), 7.51 ppm (m, 0.6H, C33, C27-CH), 7.53 (m, 1.8H, C32, C34-CH; C31, C35-CH; C26, C28-CH), 8.12(d, 0.6H, C25, C29-CH), 1.24(s, 3.0H, Lys-OCH2CH3), 1.29(bs, 2H, Lys-CH2), 1.55 ppm (bs, 2H, Lys-CH2), 1.80(bs, 2H, Lys-CH2), 2.90(br, 2H, Lys-e-CH2), 3.38 ppm (s, 3.00H, CH 3 O-, PEG), and 3.63 ppm (m, 44.0H, -CH 2 CH 2 -O-), 4.4(s, 0.51H, Lysine-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 19. [ NP ( MPEG550 ) 1.5 ( GlyLysEt )} 0.2 ( GlyLysEt -2'- aconitic -docetaxel) 0.3 ] n 의 합성
실시예 6 폴리포스파젠 (10.4g, 10mmol)과 실시예 8의 2'-아코니틱도세탁셀 NHS 에스터 (5.3g, 5.0 mmol) 그리고 DIPEA(10mml)를 이용하여 실시예 14와 같은 방법으로 최종 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG550)1.5(GlyLysEt)0.2(GlyLysEt-2'-aconitic-docetaxel)0.3]n를 얻는다. (수율=89 %)
조성식: C114 .4H206N5 .6O52 .8P2.
원소분석 이론값(%): C,53.53; H, 8.09; N, 3.06. 측정값(%): C, 52.98: H, 8.23; N, 3.19.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.13 ppm (s, 0.9H, C17-CH3), 1.24 ppm (s, 0.9H, C16-CH3), 1.34 ppm (bs, 3.31H, C60-t Bu), 1.75 ppm (s, 0.9H, C19-CH3), 1.96 ppm (s, 0.9H, C18-CH3), 2.18 ppm (d, 0.6H, C14-CH2), 2.43 ppm (s, 0.9H, C22-CH3), 4.21 ppm (d, 0.3H, C20-CHa ), 4.24 ppm (m, 0.3H, C7-CH), 4.32 ppm (d, 0.3H, C20-CHb ), 4.95 ppm (dd, 0.31H, C5-CH), 5.23 ppm (d, 0.3H, C10-CH), 5.40 ppm (d, 0.3H, C30-CH), 5.69 ppm (d, 0.3H, C2-CH), 7.51 ppm (m, 0.6H, C33, C27-CH), 7.53 (m, 1.8H, C32, C34-CH; C31, C35-CH; C26, C28-CH), 8.12(d, 0.6H, C25, C29-CH), 1.24(s, 1.5H, Lys-OCH2CH3), 1.29(bs, 1H, Lys-CH2), 1.55 ppm (bs, 1H, Lys-CH2), 1.80(bs, 1H, Lys-CH2), 2.90(br, 1H, Lys-e-CH2), 3.38 ppm (s, 4.50H, CH 3 O-, PEG), and 3.63 ppm (m, 66.0H, -CH 2 CH 2 -O-), 3.98(bs, 2H, Gly-CH2), 4.4(s, 0.51H, Lysine-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 20. [ NP ( MPEG550 ) 1.50 ( LysEt ) 0.2 ( LysEt -2'- succinylpaclitaxel ) 0.3 ] n 의 합성
실시예 1의 폴리포스파젠 (9.7 g, 10.0 mmol), 과 문헌의 알려진 방법대로 합성한 2'-석시닐파클리탁솔 (5.26g, 5.0mmol)을 DCI(20mmol, 2.54g), 와 DIPEA(10mml)를 이용하여 일반적인 에스터 결합 방법을 이용하여 폴리포스파젠 고분자에 화학 결합시켰다. 반응액은 감압여과 후 감압 증류하여 건조한 후 실시예 14와 같은 방법으로 최종 폴리포스파젠-파클리탁솔 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG550)1.50(LysEt)0.2(LysEt-2'-succinylpaclitaxel)0.3]n 를 합성한다. (수율, 90%)
조성식 : C113 .6H202N4 .6O51 .8P2.
원소분석 이론값(%): C, 54.49; H, 8.12; N, 2.57. 측정값(%) : C, 54.15; H, 8.26; N, 2.61.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 1.5H, Lys-OCH2 CH 3 ), 2.49 (br, 1.00H, suucinyl-CH 2 ), 2.90 (br, 1.00H, Lys-ε-CH 2 ), 3.38 (s, 4.50H, MPEG550-OCH 3 ), 3.65 (br, 66.0H, MPEG550-OCH 2 CH 2 ), 1.13(s, 12H), 1.25(s, 12H), 1.35(s, 36H), 1.68(m, 8H), 1.75(s, 12H), 1.86(m, 8H), 1.96(s, 12H), 2.36(m, 20H), 2.60(m, 4H), 3.98(s, 8H), 4.06(d, 8H), 4.30(m, 12H), 4.33(m. 8H), 4.97 (d, 4H), 5.22(m, 4H), 5.36(s, 4H), 5.60(m, 4H), 5.69(m, 8H), 6.20(t, 4H), 7.33(m, 8H), 7.41(m, 8H), 7.52(m, 8H), 7.61(m, 4H), 7.33(m, 4H), 8.12(d, 8H)
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 21. [ NP ( MPEG550 ) 1.50 ( GlyLysEt -2'- succinylpaclitaxel ) 0.50 ] n 의 합성
실시예 6 폴리포스파젠 (10.4g, 10mmol)과 문헌의 알려진 방법대로 합성한 2'-석시닐파클리탁솔 (7.36g, 7.0mmol)을 DCI(20mmol, 2.54g), 와 DIPEA(10mml)를 이용하여 일반적인 에스터 결합 방법을 이용하여 폴리포스파젠 고분자에 화학 결합시켰다. 반응액은 감압여과 후 감압 증류하여 건조한 후 실시예 14와 같은 방법으로 최종 폴리포스파젠-파클리탁솔 컨쥬게이트 화합물 [NP(MPEG550)1.50(GlyLysEt-2'-succinylpaclitaxel)0.50]n 를 합성한다. (수율=80%)
조성식 : C136H226N6O58 P2.
원소분석 이론값(%): C, 55.67; H, 7.76; N, 2.86. 측정값(%): C, 55.36: H, 7.99; N, 2.93.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 1.5H, Lys-OCH2 CH 3 ), 2.49 (br, 1.00H, suucinyl-CH 2 ), 2.90 (br, 1.00H, Lys-ε-CH 2 ), 3.38 (s, 4.50H, MPEG550-OCH 3 ), 3.65 (br, 66.0H, MPEG550-OCH 2 CH 2 ), 1.13(s, 12H), 1.25(s, 12H), 1.35(s, 36H), 1.68(m, 8H), 1.75(s, 12H), 1.86(m, 8H), 1.96(s, 12H), 2.36(m, 20H), 2.60(m, 4H), 3.98(s, 8H), 4.06(d, 8H), 4.30(m, 12H), 4.33(m. 8H), 4.97 (d, 4H), 5.22(m, 4H), 5.36(s, 4H), 5.60(m, 4H), 5.69(m, 8H), 6.20(t, 4H), 7.33(m, 8H), 7.41(m, 8H), 7.52(m, 8H), 7.61(m, 4H), 7.33(m, 4H), 8.12(d, 8H)
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 22. [ NP ( MPEG550 ) 1.50 (N α - BocLys ) 0.2 (N α - BocLys - docetaxel ) 03 ] n 의 합성
실시예 7 폴리포스파젠 (9.57 g, 10.0 mmol), 과 도세탁셀 (10.6 g, 10.0mmol)을 진공건조 한 후 잘 건조된 유기용매인 테트라하이드로퓨란, 메틸렌클로라이드, 또는 클로로포름 등의 유기 용매에 녹인다. 반응용기를 얼음 중탕을 이용하여 냉각 시킨 후, 같은 용매에 녹인 DCI(20mmol, 2.54g), 와 DIPEA(10mml)를 서서히 반응 용기에 첨가한다. 이 상태로 저온(0 ℃)에서 24시간 반응시킨 후 반응액은 감압여과 후 감압 증류하여 건조한 후 실시예 14와 같은 방법으로 최종 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG550)1.50(Nα-BocLys)0.2(Nα-BocLys-docetaxel)03]n를 합성한다. (수율, 60%)
조성식 : C113 .8H204 .2N4 .6O50 .8P2 .
원소분석 이론값(%) : C, 54.42; H, 8.19; N, 2.57. 측정값(%) : C, 55.06; H, 7.98; N, 2.60.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1.25(s, 1.5H, Lys-OCH2 CH 3 ), 2.49 (br, 1.00H, suucinyl-CH 2 ), 2.90 (br, 1.00H, Lys-ε-CH 2 ), 3.38 (s, 4.50H, MPEG550-OCH 3 ), 3.65 (br, 66.0H, MPEG550-OCH 2 CH 2 ), 1.13(s, 12H), 1.25(s, 12H), 1.35(s, 36H), 1.68(m, 8H), 1.75(s, 12H), 1.86(m, 8H), 1.96(s, 12H), 2.36(m, 20H), 2.60(m, 4H), 3.98(s, 8H), 4.06(d, 8H), 4.30(m, 12H), 4.33(m. 8H), 4.97 (d, 4H), 5.22(m, 4H), 5.36(s, 4H), 5.60(m, 4H), 5.69(m, 8H), 6.20(t, 4H), 7.33(m, 8H), 7.41(m, 8H), 7.52(m, 8H), 7.61(m, 4H), 7.33(m, 4H), 8.12(d, 8H)
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 23. [ NP ( MPEG550 ) 1.5 ( LysEt ) 0.2 ( LysEt -2'- aconitic - camptothecin ) 0.3 ] n 의 합성
실시예 1의 폴리포스파젠 (9.7 g, 10.0 mmol)과 앞서 합성한 실시예 12 의 20-aconitic-camptothecin-NHS 에스터 (2.5g, 5.03mmol)을 실시예 14와 같은 방법으로 반응시켜 최종 폴리포스파젠-켐토테신 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG550)1.5(LysEt)0.2(LysEt-2'-aconitic-camptothecin)0.3]n를 합성한다(수율, 75%).
조성식 : C98 .6H180 .8N5 .2O45 .8P2 ..
원소분석 이론값(%) : C, 53.01; H, 8.16; N, 3.26. 측정값(%): C, 52.61; H, 8.42; N, 3.34.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 0.9(t, 3H, C18-CH3), 2.0(m, 2H, C19-CH2), 2.64(t, 4H, NHS-CH2CH2), 2.92(s, 2H, aconitic-CH2), 4.20(d, 2H, C5-CH2), 4.76(m, 2H, C22-CH2), 6.40-6.68(m, 1H, aconitic-CH), 6.70(s, 1H, C14-CH), 7.59 (s, 1H, C11-CH), 7.80 (m, 2H, C12-CH; C7-CH), 8.0 (m, 2H, C9-CH; C12-CH), 1.24(s, 1.5H, Lys-OCH2CH3), 1.29(bs, 1H, Lys-CH2), 1.55 ppm (bs, 1H, Lys-CH2), 1.80(bs, 1H, Lys-CH2), 2.90(br, 1H, Lys-e-CH2), 3.38 ppm (s, 4.50H, CH 3 O-, PEG), and 3.63 ppm (m, 66.0H, -CH 2 CH 2 -O-), 4.4(s, 0.51H, Lysine-CH).
인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3, ppm): δ -0.014 (s), δ -5.551 (s).
실시예 24. [NP( MPEG550 )( LysEt )( aconitic - glycylcamptothecin )] n 의 합성
실시예 5의 약물전달체 [NP(MPEG550)(LysEt)]n (0.5g, 0.25 mmol)와 실시예 13에서 합성한 켐토테신 전구체 CPT-Gly-ACA-NHS 에스터(0.17 g, 0.25 mmol)를 실시예 14와 같은 방법으로 반응시켜 최종 폴리포스파젠-켐토테신 컨쥬게이트 화합물, [NP(MPEG550)(LysEt)(aconitic-glycylcamptothecin)]n를 합성한다(수율: 85 %).
조성식 : C111H191N7O50P2.
수소핵자기 공명 스펙트럼(CDCl3)(δ, ppm): 1H NMR (DMSO, ppm): 0.89-0.92 (brm, 3H, -CH3 of CPT-C18), 1.13-1.58(brm, 6H, -CH2 of lysine), 2.12-2.17(brm, 2H, -CH2 of CPT-C-19), 3.01(s, 2H, -CH2 of cis-aconitate), 3.21 (s, 9H, -OCH3 of MPEG), 3.34-3.54(brm, 144H, -CH2 -CH2 of MPEG),3. 94-4.41(brm, 5H, -CH2 of g lycine, P-NH-CH2 of lysine and =CH of cis-aconitate), 5.29 (brs, 2H, -CH2 of CPT-C5), 5.47(brs, 2H, -CH2 of CPT-C22), 7.15-7.17(m, 1H, =CH of CPT-C14), 7.69-7.72(m, 1H, =CH of CPT-C11), 7.84-7.94(m, 1H, =CH of CPT-C10) 8.10-8.21(m, 2H, =CH of CPT-C12 and CPT-C9), 8.68(brs, 1H, =CH of CPT-C7). 31P NMR (DMSO, ppm): δ-5.19 (O-P-O), 0.85 (O-P-N).
실시예 25. [ NP ( MPEG550 )( AE )( ACA ) Pt (dach)] n 의 합성
실시예 8의 약물전달체 [NP(MPEG550)(AE)]n (1g, 1.5 mmol)를 0.5M 산성 탄산나트륨 수용액(pH = 9.0, 50 ml)에 녹인 후 여기에 cis-aconitic anhydride (2.35g, 15mmol)를 가한 후 4℃에서 5시간 반응시킨 후 셀루로스 멤브레인(MWCO: 3.5 kD)으로 투석하여 정제하면 링커인 아코니틱산(ACA)이 고분자에 결합된 중간체 [NP(MPEG550)(AE)(ACA)]n가 얻어진다. 이 용액에 수산화바륨(1.33 mmol)의 메탄올(20 ml) 용액을 가한 후 상온에서 5시간 저어준 다음 감압 증류하여 건조시킨다. 건조된 고체를 다시 증류수(10 ml)에 녹인 다음 여기에 백금착물 항암성분을 포함하는 황산염 (dach)Pt(SO4) (dach: trans-1,2-diaminocyclohexane) (0.49g, 1.21 mmol)의 수용액(10 ml)을 서서히 가한 후 상온에서 3시간 이상 반응시킨 다음 침전 부산물인 황산바륨을 여과/제거하고 셀루로즈 멤브레인(MWCO: 3.5 kD)으로 투석 후 동결 건조하면 화합물, [NP(MPEG550)(AE)(ACA)Pt(dach)]n를 얻는다(수율:74%).
조성식 : C39H73N4O19PPt.H2O
원소분석 이론값(%): C, 40.83; H, 6.54; N, 4.88. 측정값: C, 40.54; H, 6.34; N, 4.62.
수소핵자기 공명 스펙트럼(D2O, ppm): 1.04-1.20 (brm, 4H, C-4, C-5 of dach), 1.44 (brs, 2H, C-3 of dach), 1.82-1.93 (brm, 2H, C-6 of dach), 2.02-2.52 (brm, 2H, C-1, C-2 of dach), 3.26 (s,3H, OCH3 of MPEG), 3.41-3.45 (m, 6H, CH2 of cis-aconitate and aminoethanol), 3.47-3.81 (brm, 46H, -O-CH2 of MPEG), 3.95-4.21 (brm, 2H, -P-O-CH2- of MPEG), 4.69 (s, 1H, -C=CH- of cis-aconitate).
인 핵자기 공명 스펙트럼(D2O, ppm): -4.53 (O-P-O).
실시예 26. [ NP ( MPEG750 )( AE )( ACA ) Pt (dach)] n 의 합성
실시예 9에서 합성한 약물전달체 [NP(MPEG750)(AE)]n (1g, 1.19 mmol), cis-aconitic anhydride (1.86g, 11.91 mmol), Ba(OH)2.8H2O (0.35g, 1.11mmol) 그리고 (dach)Pt(SO4) (0.4g, 0.99 mmol, pH = -7.2)를 사용하여 실시예 25와 같은 방법으로 고분자 백금착물 화합물, [NP(MPEG750)(AE)(ACA)Pt(dach)]n를 얻는다(수율, 72%).
조성식 : C47H89N4O23PPt.H2O
원소분석 이론값(%): C, 42.65; H, 6.88; N, 4.23. 측정값: C, C, 42.32; H, 7.64; N, 3.88.
수소핵자기 공명 스펙트럼(D2O, ppm): 1.05-1.21 (brm, 4H, C-4, C-5 of dach), 1.47 (brs, 2H, C-3 of dach), 1.80-1.93 (brm, 2H, C-6 of dach), 2.01-2.45 (brm, 2H, C-1, C-2 of dach), 3.27 (s, 3H, -OCH3ofMPEG),3.41-3.45(m,6H,-CH2ofcis-aconitate and aminoethanol), 3.50-3.72 (brm, 62H, -CH2 of MPEG), 3.99-4.13 (brm, 2H, -P-O-CH2 of MPEG), 4.70 (s, 1H, -C=CH- of cis-aconitate).
인 핵자기 공명 스펙트럼(D2O, ppm): -4.52 (O-P-O).
실시예 27. [ NP ( MPEG550 )( LysEt )( ACA ) Pt (dach)] n 의 합성
실시예 5의 약물전달체 [NP(MPEG550)(LysEt)]n (1g, 1.28 mmol), 링커인cis-aconitic anhydride(ACA) (2g, 11.91 mmol) 그리고 Ba(OH)2.8H2O(0.44g, 1.39mmol) 및(dach)Pt(SO4) (0.52g, 1.28mmol)를 실시예 25와 같은 방법으로 고분자 백금 착물 화합물, [NP(MPEG550)(LysEt)(ACA)Pt(dach)]n.를 얻는다(수율, 79%).
조성식 : C45H84N5O20PPt.H2O
원소분석 이론값(%): C, 42.88; H, 6.83; N, 5.56. 측정값: C, 42.63; H, 6.61; N, 5.42.
수소핵자기 공명 스펙트럼(D2O, ppm): 1.07-1.21 (brm, 7H, -CH3, -(CH2)2 of lysine), 1.43-1.48 (brm, 6H, -C-3, -C-4, C-5 of dach), 1.80-1.93 (brm, 8H, -CH2 lysine and -C-6 of dach), 2.02-2.26 (brm, 2H, C-1, C-2 of dach), 2.82 (brs, 2H, -CH2 of cis-aconitate), 3.26 (s, 3H, -OCH3 of MPEG), 3.44-3.72 (brm, 46H, -CH2-CH2 of MPEG), 3.96-4.03 (brm, 3H, -CH2 of ethylester and -N-CH of lysine), 4.62(s, 1H, =CH of cis-aconitate).
실험예
[물성 측정 및 효능시험]
실험예 1. 마이셀 형성에 대한 실험
실시예 1의 폴리포스파젠 화합물 및 실시예 14의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트를 각각 물에 녹여(0.2% wt./wt.) DLS(Dynamic Light Scattering)법으로 이들의 입도와 제타전위(zeta potential, ξ)를 측정하였고, 유의미한 결과를 도 1, 도 2, 및 도 3에 나타내었다.
도 1에서 보면 도세탁셀을 컨쥬게이션 시키기 전에는 폴리포스파젠 고분자의 수용액에서의 평균 입자크기가 3nm~4nm정도로 마이셀을 형성하지 않고 유체역학적입자(hydrodynamic volume)의 크기를 나타내고 있다. 이는 폴리포스파젠에 도입된 라이신 치환기가 pH 7.4에서 양이온성(도 2)을 띄기 때문에 친수성이 강한 유니머(unimer) 상태로 있다가, 소수성 약물인 도세탁셀이 컨쥬게이션 되면 0.2 %의 농도에서 그 평균 직경이 60nm의 크기로 커지는 것이 확인 되었다(도 3). 이와 같이 입자의 평균 직경이 20배 가량 증가하는 것은 폴리포스파젠 약물전달체가 소수성 약물과 컨쥬게이션 되면서 친수성 고분자에서 양친성 고분자로 그 성격이 바뀌어 마이셀을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 마이셀의 크기는, 5~70 ℃의 온도범위에서 5 ℃ 간격으로 측정한 결과, 온도와 상관없이 일정한 입자의 크기를 갖는다는 사실을 확인하였다.
실험예 2. 폴리포스파젠 - 파클리탁셀 컨쥬게이트의 마이셀 임계농도 측정
앞의 실험예 1에서 보듯이 본 발명의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물들은 수용액에서 마이셀을 형성하는데, 이들 약물들이 정맥주사용 마이셀 형태의 주사제로 사용되려면 안정한 마이셀이 형성되어 소수성의 약물을 보호하는 기능을 해야 한다. 이러한 마이셀의 안정도는 마이셀의 임계농도(CMC: critical micelle concentration)로 표시되며, 임계농도의 측정방법에는 여러 가지 방법이 알려져 있으나 pyrene 형광법이 가장 널리 사용되고 있다. 따라서 그 방법 (Kalyanasundoram, K.; Thomas, J. K. J. Am. Chem. Soc., 1988, 99, 2039)에 따라 다음과 같이 시험하였다.
우선, 6 × 10-7 M 의 농도로 pyrene 수용액을 만든 후, 실시예 20의 폴리포스파젠-파글리탁셀 컨쥬게이트를 5.0 ~ 0.0005% (wt/wt)의 농도로 녹인 시료를 만들었다. 형광 분광 분석기를 이용하여 339 nm 파장 (lex)에서의 형광 스펙트럼과 390 nm 파장 (lem)에서의 스펙트럼을 측정한 후 밴드 I의 형광세기와 밴드III의 형광세기의 비를 이용하여 마이셀의 임계농도를 결정하여 그 결과를 도 4에 표시하였다.
이렇게 결정된 실시예 1의 폴리포스파젠-파클리탁셀 컨쥬게이트의 임계농도는 41mg/L의 매우 낮은 농도로 측정되었으며, 정맥주사 할 경우 혈중에서도 마이셀 형태가 유지될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 결과는 약물의 소수성에서 기인된 것이라 추정된다.
실험예3 . 고분자 화합물의 생분해성에 대한 실험
장비: Yonglin GPC systems
유속: 1 ml/min
이동상: 물(8)/아세토나이트릴(2) (0.5% NaNO3 첨가제 첨가)
컬럼: Waters Hydrogel HR column (1ⅹguard, 1ⅹlinear, 2ⅹHR2)
실시예 20의 폴리포스파젠-파클리탁셀 컨쥬게이트 250mg을 pH 5.4와 pH 7.4 의 버퍼(PBS) 용액 5ml에 각각 녹인 후 37 °C의 항온조에서 서서히 교반하면서 정해진 시간 별로 (0.5/ 1/ 2/ 4/ 6/ 8/ 16 Day) 500 μl씩 취하여 동결 건조하였다. 동결 건조된 각 시료에 THF를 첨가하여 잘 녹인 다음 0.45마이크로 시린지 필터로 여과 한 후 그 여과액을 감압 증류하여 진공건조 하였다. 그 다음 0.2% 의 터셔리 부틸암모니움 브로마이드를 함유한 THF를 사용하여 겔 투과 크로마토그래피(GPC:Gel Permeation Chromatography )로 분해된 고분자 분포를 분석하여 도 5에 표시하였다.
도 5에서 보듯이 초기 2일까지는 10,000~15,000 Da정도 분자량이 급격히 감소하지만 4일째부터는 분자량이 서서히 줄어든다. 또한 pH 7.4에서는 pH 5.4에서보다 분해되는 정도가 다소 적은 것을 알 수 있다. 이 같은 결과는 체내조건이 중성과 같은 pH 7.4에서는 폴리머 기본 골격이 상대적으로 안정하고, 암세포가 있는 조직의 pH와 같은 pH 5.4에서는 폴리머 기본 골격이 더 잘 분해된다는 것을 의미하는 것으로, 암세포 조직에서 약물을 체내에 더 잘 방출시킬 수 있는 것으로 추정된다. 그리고 폴리머 기본 골격의 반감기는 약 16일 정도로 긴 시간 동안 몸속에서 오랫동안 순환할 수 있어 약물을 운반하기에 적합한 물질로 예상된다. 또한, 이 반감기에 대한 정보는 정맥 주사용 약물전달체의 체외 배출 시간 조절에 있어서 매우 중요한 의미를 갖는다. 본 발명에서는 다양한 분자량 범위의 고분자를 분리 분취하였으며, 이들의 체내 거동과 배출 그리고 가수분해 되는 반감기를 이용하면, 원하는 시간내에 체외 배출 가능한 고분자형 약물전달체의 합성에 기초 자료가 될 수 있으며, 약물전달체의 분자량 분포와 그 반감기의 상관관계를 이용하여, 약물의 용도에 맞는 약물전달체의 분자량 범위를 선택하여 사용할 수 있다.
실험예 4. 폴리포스파젠 고분자 화합물의 암조직 선택성에 대한 실험
장비: Kodak image station 4000mm digital imaging system (Kodak, New Haven, CT).
Excitation and emition filter: Omega Optical, Battlebor, VT (ex: 560 nm, em: 700 nm).
실험동물은 8주령 CH3/HeN 누드 마우스(nude mouse) (Instityte of Medical Science, Tokyo)을 준비한 후 멸균된 장소에서 멸균된 먹이와 물을 먹이고 자유롭게 운동을 시키며 준비하였다. 암세포(A549) (1x106)를 마우스에 이식한 후 암조직의 크기가 300 mm3 일 때까지 암조직을 키운 다음 마우스를 두 그룹으로 나누었다. 한 그룹은 Cy5.5가 붙어있는 폴리포스파젠 고분자를 주입하고, 다른 한 그룹은 약물 처리하지 않고 대조군으로 사용하였다. 정해진 시간에 마우스를 해부하여 정상근육(part of biceps femoris), 암조직, 간, 콩팥, 폐, 심장, 비장 등 주요 조직을 통 채로 적출하였다. 적출된 조직들의 근적외선(680nm to 720nm) 형광 이미지 (NIR fluorescence image)를 CCD 카메라(Kodak Image Station 4000MM,)로 측정하였다.
실시예 1에서 합성한 폴리포스파젠계 고분자 화합물에 대한 암조직 선택성에 대한 실험을 Kodak image station 4000 mm을 이용한ex vivo 장기분포 실험을 통하여 확인하였다. 앞서 합성한 고분자에 NIRF(near infra-red fluorescence) 물질인 Cy 5.5로 표지한 마우스 모델을 이용하여 고분자 물질의 조직 분포 및 혈액 내 거동을 확인하였다. Cy5.5가 라벨링 되어 있는 폴리포스파젠계 고분자 화합물을 i.v. 로 마우스에 주사한 후 12시간, 24시간, 48시간 그리고 72시간의 시간 간격으로 주요장기인 간(1), 폐(2), 콩팥(3), 비장(4), 암조직(5), 정상조직(6), (도6-a) 그리고 혈액(도6-b)을 각각 적출하여 도6에 나타내었다. 특히 폴리포스파젠 고분자의 조직분포(도 6a)를 보면 형광세기로 보아 타 조직에 비하여 암조직(5)에 월등하게 많이 축적됨을 알 수 있었다. 앞의 실험예 1에서 보여주었듯이 폴리포스파젠 고분자는 친수성이며 입자의 크기도 아주 작은 유니머(unimer)로서 이렇게 우수한 암조직 선택성을 나타내는 이유는 고분자 성분인 라이신의 알파-아민기에 의한 양이온성(도 2 참조)과 입자의 표면을 이루는 폴리에틸렌글리콜에 의한 장기 순환성(long circulation) 때문이라 추정된다.
실험예 5. 폴리포스파젠 - 도세탁셀 컨쥬게이트의 암조직 선택성에 대한 실험
실시예 14에서 합성한 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트에 앞의 실험예 4와 같은 방법으로 Cy 5.5로 표지한 후 마우스 모델을 이용하여 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트의 조직 분포를 비교하였다(도 7). 컨쥬게이트의 조직 분포에 대한 정량은 Cy 5.5가 붙어 있는 시료가 주입된 마우스의 조직과 처리되지 않은 대조군 마우스 조직의 근적외선 형광세기의 비율을 측정해서 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이 24시간과 48시간 모두 암조직에서 높은 형광세기를 나타내는 것을 알 수 있었으며, 다른 기관에는 암조직에 비해 상대적으로 적게 분포하고 있다는 사실을 확인하였다. 또한 24시간 보다는 48시간 경과 후에 더 높은 형광세기를 나타내는 것으로 보아, 폴리포스파젠- 도세탁셀 컨쥬게이트가 혈액 내에서 장시간(>48시간) 순환하며, 특히 암조직에 많이 축적된다는 사실을 확인할 수 있었다. 또한, 각 조직별로 비교 측정한 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트의 조직 분포를 그래프로 나타내면 도 8과 같다. 이 그림에서 보면 본 발명의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물이 체내 어느 주요 조직보다도 암 조직에 압도적으로 축적되고 있고, 따라서 탁월한 암조직 선택성을 나타냄을 분명히 보여주고 있다.
실험예 6. 폴리포스파젠 - 도세탁셀 컨쥬게이트 중의 도세탁셀 함량 측정법
약물의 함량은 1H-NMR(Varian 500Hz)법을 이용한 면적 적분 값의 비율, UV 스펙트럼(Perkin Elmer, Lamda)을 이용한 흡광도법, 그리고 HPLC법 등을 이용하여 측정하였다. 1H-NMR법을 이용할 경우에는 약물함량의 오차범위가 크게 측정이 되는 경향이 있어, UV 스펙트럼 또는 HPLC를 이용하여 약물의 함량을 측정하였다. 고농도이기는 하지만 약물이 폴리포스파젠 골격에 근접해 있기 때문에 NMR 법으로 약물의 함량을 측정하기에는 오차가 범위가 커서 UV 와 HPLC법을 교차 정량하여 약물의 함량을 측정하였다. 우선 1H-NMR을 이용한 방법에서는 폴리포스파젠 내에 있는 MPEG(-OCH2CH2OCH3) 의 터미널 methoxy (3H, -CH3) proton 의 갯수와 도세탁셀 의 7.33 ppm(C10, 2H)의 적분 값을 비교하여 정량 하였다.
UV를 이용한 정량법을 서술하면, 물:아세토니트릴을 1:1로 섞은 용액(10ml)을 이용하여, 도세탁셀(10.0 mg)을 완전히 녹인 후 이를 1/2배씩 6번 희석 즉, 1mg/ml (1mg/ml), 1/2mg/ml(0.5mg/ml), 1/4mg/ml (0.25mg/ml), 1/8mg/ml(0.125mg/ml), 1/16mg/ml(0.0625mg/ml), 1/32mg/ml(0.03225mg/ml)로 희석하여 표준 정량 곡선 그래프를 얻었고, 이를 이용하여 고분자중의 도세탁셀의 함량을 정량하였다. 이때 간섭현상을 나타낼 수 있는 실시예 1과 실시예 11의 아코니틱 그룹의 스펙트럼은 정량에 사용한 230nm 파장에서 흡광이 없음을 확인하였으며, 따라서 이 방법이 고분자내의 도세탁셀의 정량에 가장 적합한 방법임을 확인하였고, 이를 이용하여 정량하였다.
실험예 7. 폴리포스파젠 -2'- 아코니틱 도세탁셀 컨쥬게이트의 in vitro 약물 방출에 대한 실험
장비: Agilent 1100 series with DAD detector (230nm)
컬럼: Agilent Zobax Eclipse Plus C18 column (직경=4.6mm, 길이=150mm, particle size=3.5um)
유속: 1.0 ml/min
이동상 조성: A: 0.1% TFA in H2O; B: Acetonitrile (isocratic method)본 발명에 사용한 약물의 in vitro 환경하에서의 약물 방출 실험은 HPLC를 사용하여 진행하였다. 이때, 정량곡선은 앞서 실험예 5에서 제조한 표준 용액을 이용하여 얻었으며, 3회 반복측정 및 R2 값이 허용가능한 오차범위에 있음을 확인하여 표준 정량 곡선으로 이용하였다.
UV 스펙트럼을 이용하여 약물의 농도를 결정한 용액을 2.0ml HPLC용 바이알에 500 ㎕씩 담는다. 이 바이알을 37˚C 배양기에서 정해진 시간 간격 동안 배양한 후, HPLC를 찍기 전에 다시 500 ul의 아세토나이트릴을 첨가하여 침전물이 없이 완전히 녹인 후, 상기의 도세탁셀 분석법에 따라 방출된 도세탁셀의 양을 정량하였다.
또한 아코니틱 스페이서는 산성 조건에서 약물방출 속도가 빠르기 때문에 이 특징을 확인하기 위해서, 위와 같은 방법으로, pH 5.4, 6.4, 7.4, 에 대한 실험도 진행하였다. 단, pH가 조절된 방출 용매를 사용할 경우에는 아세토나이트릴이 첨가 되면 침전물을 형성할 수 있으므로, 아세토나이트릴을 첨가한 후 0.45 ㎛ 시린지 필터를 이용하여 침전물을 제거한 후 정량하였다.
실험예 8. 폴리포스파젠 - 파클리탁셀 컨쥬게이트의 체외 세포독성에 대한 실험
파클리탁셀 항암제는 유방암 등 여성암에 우수한 치료효과를 나타내므로 본 체외 세포독성 (in vitro cytotoxicity) 시험에서는 유방암(MCF-7)과 난소암(SK-OV3), 그리고 폐암(A549)과 위암(SNU638) 등을 선정하여 암 세포들을 이산화탄소 5 % 및 공기 95 %가 공급되는 37°C의 세포 배양기 안에서 배양한 후 문헌에 보고된 SRB법(Rita Song 외 J. Control. Release 105 (2005) 142-150)에 따라 세포독성을 측정하였다.
실험결과는 아래 표 1(체외 세포독성에 관한 실험결과)에 나타내었다. 표 1에서 보듯이, IC50값은 표준 파클리탁셀 보다 높게 나왔으며, 약물의 컨쥬게이션 양이 많은 실시예 17의 경우 전체적으로 더 높은 세포독성을 나타내었다. 이는 소수성 약물인 파클리탁셀의 컨쥬게이션 량이 많아지게 되면 CMC가 낮아지는 실험 결과와 일치하는 결과이며, IC50 값이 높은 것은 in vitro 실험 조건하에서 약물의 방출속도가 상대적으로 느리다는 것을 나타낸다.
IC50 값(nM) (mean±SD, n=3~4)
MCF-7 SK-OV3 A-549 SNU-638
파클리탁셀 3.47±0.62 15.32±2.6 6.63±2.84 10.89±0.90
실시예 20
실시예 21		 164.8±86.5
316.7±141.1		 587.5±47.8
696.4±141.7		 170.0±48.3
154.3±41.8		 364.4±201.7
541.1±46.6
실험예 9. 폴리포스파젠 - 도세탁셀 컨쥬게이트의 약물동력학에 대한 실험
앞서 합성한 실시예 14의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트의 체내 거동을 확인하기 위하여 현재 임상에서 사용하는 도세탁셀 제제인 탁소텔®(Taxotere, ㈜사노피 아벤티스)을 대조물질로 하여 Sprague-Dawly 랫트를 이용한 약물동력학 실험을 문헌(Jun et al. Int. J. Pharm. 422(2012) 374-380) 방법에 따라 수행하였으며, 도 9에 시간에 따른 도세탁셀의 플라즈마 농도 프로파일을 그리고 표 2에 약물동력학 파라미터를 표시하였다. 표와 그림에서 보면 도세탁셀 기준으로 같은 양(5 mg/kg)을 투여 했음에도 불구하고 초기 농도(C0)가 대조물질인 (8.764 ㎍/ml)에 비하여 본 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트의(0.263 ㎍/ml) 경우 매우 낮은 것으로 보아 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 약물은 거의 중성인 혈중에서는 분해하지 않고 혈중에서 순환하고 있어 거의 독성을 나타내지 않고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 표에서 보면 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트 화합물의 체내 반감기(t1/2)가 대조물질인 탁소텔에 비하여 약 10배 정도 느리고 더구나 약물의 생체이용률을 나타내는 AUClast값은 약 2배에 이름으로서 약효도 우수함을 뒷받침하고 있다.
약동학적 파라미터 탁소텔®(대조물질)
 실시예 12
평균 표준편차 평균 표준편차
C0 (㎍/mL) 8.764 3.221 0.263 0.051
AUClast (㎍·h/mL) 0.651 0.098 1.192 0.380
AUCINF (㎍·h/mL) 0.678 0.098 1.439 0.531
t1 /2 (h) 0.651 0.093 6.115 4.041
Vz (L) 1.758 0.159 7.287 2.231
Cl (L/h) 1.896 0.255 0.984 0.311
실험예 10. 폴리포스파젠 - 도세탁셀 컨쥬게이트의 xenograft 항암활성에 대한 실험
실시예 14의 폴리포스파젠-도세탁셀 컨쥬게이트의 약효를 시험하기 위하여 현재 임상에서 사용하는 도세탁셀 제제인 탁소텔®(Taxotere, ㈜사노피 아벤티스)을 대조물질로 하여 BALB/C누드마우스를 이용하여 인간 암세포주 중에서도 가장 난치암에 속하는 위암 세포주 MKN-28에 대한 in vivo xenograft 실험을 문헌(Jun et al. Int. J. Pharm. 422(2012) 374-380) 방법에 따라 수행하였다. 약물 투여량은 대조물질인 탁소텔의 경우 도세탁셀 기준 최적 투여량으로 알려진 10mg/kg으로 고정하고 본 컨쥬게이트 화합물 투여량은 도세탁셀 기준 10mg/kg 및 20mg/kg으로 하여 3회(day1, 5, 9)투여한 후 30일간 암조직의 크기를 측정하였다. 도10은 MKN28 세포주에 대한 항암활성을 나타내며, 도 11에서는 탁소텔 및 컨쥬게이트 화합물 투여 시작부터 40일간의 실험 쥐들의 체중변화를 나타낸다. 도 10에서 보면 컨쥬게이트 화합물의 항암효과가 대조물질인 탁소텔과 거의 대등함을 알 수 있다. 그러나 보다 중요한 것은 도 11에 표시된 약물투여기간 중 누드마우스들의 체중 변화이다. 즉 도 11에서 자세히 살펴보면 탁소텔의 경우 마우스들의 평균 체중이 약물투여 직후 초기 체중의 약 10%이상 감소하는데 비하여 컨쥬게이트 화합물의 경우 약물 투여 기간 중에도 생리식염수를 투여한 군과 동일하게 체중 증가가 관찰 되는 것으로 보아 약물에 의한 독성이 아주 낮은 것으로 판단된다. 같은 방법으로 수행한 폐암 세포주 A549에 대한 실험결과를 도 12에 표시하였다. 이 그림에서 보면 실시예 12의 컨쥬게이트 약물의 약효가 오히려 대조물질인 탁소텔 보다 우수하게 나타냄을 알 수 있다.

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 하기 화학식 2로 표시되는 선형의 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물:
    [화학식 2]
    Figure 112019083132360-pat00032

    상기 식에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, S는 스페이서 그룹으로 라이신, 알지닌, 글루타민, 아스파라진, 타이로신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 알지닌을 포함하는 올리고펩타이드, 글루타민을 포함하는 올리고펩타이드, 아스파라진을 포함하는 올리고펩타이드, 타이로신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, L은 상기 스페이서 그룹과 상기 약물을 화학결합으로 연결시킬 수 있는 링커(linker) 를 나타내며, D는 OH 또는 NH2 작용기를 갖는 소수성 항암제이고, x와 y는 각각 0~0.5이고, z는 0보다 크고 1.0이하이며, x+y+z = 1 이다.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 S는 라이신 또는 라이신을 포함하는 다이펩타이드 내지 트라이펩타이드인 것을 특징으로 하는 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 S는 아미노에탄올 또는 아미노프로판올인 것을 특징으로 하는 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물.
  5. 청구항 2에 있어서,
    상기 D는 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 켐토테신(camptothecin) 및 [(트란스-1,2-디아미노사이클로헥산)백금(II)]으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물.
  6. 청구항 2에 있어서,
    상기 화학식 2 는 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물:
    [화학식 3]
    Figure 112020001686940-pat00033

    [화학식 4]
    Figure 112020001686940-pat00034

    상기 화학식 3 및 4에서, n은 3 내지 300 의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, D는 도세탁셀, 파클리탁셀, 켐토테신(camptothecin) 및 [(트란스-1,2-디아미노사이클로헥산)백금(II)]으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 나타내며, R은 C1-6의 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 또는 OCH2Bz이다. 여기서, x와 y는 각각 0~0.5, z는 0보다 크고 1.0 이하의 값을 가지며, x+y+z = 1 이다.
  7. 하기 화학식 5로 표시되는 선형의 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물:
    [화학식 5]
    Figure 112020001686940-pat00060

    상기 화학식 5에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, D는 도세탁셀, 파클리탁셀 및 켐토테신으로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 나타내고, R'는 t-Boc 또는 CBZ 그룹을 나타낸다. 여기서, x와 y는 각각 0~0.5, z는 0보다 크고 1.0 이하의 값을 가지며, x+y+z = 1 이다.
  8. (a) 출발물질인 6 염화 고리형 포스파젠을 열 중합하여 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체를 합성한 후 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨 염과 반응시켜 폴리포스파젠 고분자 중간체를 얻는 단계;
    (b) 상기 폴리포스파젠 고분자 중간체를 라이신 에스터, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드의 에스터, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군에서 선택되는 1종과 반응시켜 친수성 양이온성(cationic) 폴리포스파젠 고분자 약물전달체를 제조하는 단계;
    (c) OH 또는 NH2작용기를 갖는 약물을 링커(linker)를 이용하여 폴리포스파젠 고분자에 화학결합으로 결합시키기 용이한 약물 전구체(precursor)를 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 (b) 단계의 폴리포스파젠 고분자 약물전달체에 상기 (c) 단계의 약물 전구체(precursor)를 도입하여 하기 화학식 2의 화합물을 얻는 단계;
    를 포함하는 하기 화학식 2의 화합물의 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure 112020001686940-pat00036

    상기 식에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, S는 스페이서 그룹으로 라이신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, L은 상기 스페이서 그룹과 상기 약물을 화학결합으로 연결시킬 수 있는 링커(linker) 를 나타내며, D는 OH 또는 NH2 작용기를 갖는 약물이고, x와 y는 각각 0~0.5이고, z는 0보다 크고 1.0이하이며, x+y+z = 1 이다.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 (a) 단계는 화학식 13의 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체를 포함하는 용액을 0 ℃ 미만의 온도로 냉각시킨 후 화학식 15의 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨 염 용액을 서서히 가하여 화학식 16의 폴리포스파젠 고분자 중간체를 제조하는 것을 특징으로 하는 상기 화학식 2의 화합물의 제조 방법:
    [화학식 13]
    Figure 112020001686940-pat00037

    상기 화학식 13에서, n은 3내지 300의 정수이고,
    [화학식 15]
    Figure 112020001686940-pat00038

    상기 화학식 15에서, a 는 7 내지 22의 값이고,
    [화학식 16]
    Figure 112020001686940-pat00039

    상기 화학식 16에서, n은 3 내지 300의 정수이고, a는 7 내지 22의 값이며, b는 0.5~1.8의 값이다.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 (b) 단계는 상기 화학식 16의 폴리포스파젠 고분자 중간체를 라이신 에스터, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드의 에스터, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군에서 선택되는 1종과 반응시켜 하기 화학식 19 또는 화학식 20의 친수성 양이온성 (cationic) 폴리포스파젠 고분자 약물전달체를 제조하는 것을 특징으로 하는 상기 화학식 2의 화합물의 제조방법:
    [화학식 19]
    Figure 112020001686940-pat00040

    [화학식 20]
    Figure 112020001686940-pat00041

    상기 화학식 19 및 20에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌클리콜을 나타내고, b는 0.5 ~ 1.8의 값을 갖는다. 또한 R은 C1-6의 선형, 분지형 또는 고리형 알킬, 또는 OCH2Bz이고, R'는 t-Boc 또는 CBZ 그룹을 나타낸다.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 (c)단계에서 링커는 무수아코니틱산이고, 약물은 탁세인계 또는 켐토테신계 항암제인 것을 특징으로 하는 상기 화학식 2의 화합물의 제조방법.
  12. (a) 출발물질인 6염화 고리형 포스파젠을 열 중합하여 폴리디클로로포스파젠 선형 중합체를 합성한 후 메톡시폴리에틸렌글리콜의 나트륨 염과 반응시켜 폴리포스파젠 고분자 중간체를 얻는 단계;
    (b) 상기 폴리포스파젠 고분자 중간체를 스페이서 그룹인 라이신 에스터, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드의 에스터, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종과 반응시켜 친수성 양이온성(cationic) 폴리포스파젠 고분자 약물전달체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 폴리포스파젠 고분자 약물전달체의 스페이서 그룹에 링커를 먼저 결합시키는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 폴리포스파젠 고분자 약물전달체의 링커에 OH 또는 NH2 작용기를 갖는 약물을 결합시켜 하기 화학식 2의 화합물을 얻는 단계;
    를 포함하는 하기 화학식 2의 화합물의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure 112020001686940-pat00042

    상기 식에서, n은 3 내지 300의 정수이고, MPEG는 평균 분자량 350 내지 1000의 메톡시폴리에틸렌글리콜을 나타내고, S는 스페이서 그룹으로 라이신, 라이신을 포함하는 올리고펩타이드, 아미노에탄올, 아미노프로판올, 아미노부탄올, 아미노펜탄올 및 아미노헥산올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, L은 상기 스페이서 그룹과 상기 약물을 화학결합으로 연결시킬 수 있는 링커(linker) 를 나타내며, D는 OH 또는 NH2 작용기를 갖는 약물이고, x와 y는 각각 0~0.5이고, z는 0보다 크고 1.0이하이며, x+y+z = 1 이다.
  13. 청구항 12 에 있어서,
    상기 OH 또는 NH2작용기를 갖는 약물은 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 켐토테신(camptothecin) 및 [(트란스-1,2-디아미노사이클로헥산)백금(II)] 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 상기 화학식 2의 화합물의 제조방법.
KR1020150034030A 2014-03-14 2015-03-11 신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법 Active KR102078806B1 (ko)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010184462.9A CN111281979A (zh) 2014-03-14 2015-03-13 新型阳离子聚磷腈化合物、聚磷腈-药物偶联化合物和其制备方法
US15/125,543 US10336867B2 (en) 2014-03-14 2015-03-13 Cationic polyphosphazene compound, polyphosphazenes-drug conjugate compound and method for preparing same
EP20155255.1A EP3735989A1 (en) 2014-03-14 2015-03-13 Novel cationic polyphosphazene compound, polyphosphazenes-drug conjugate compound and method for preparing same
CN201580026199.8A CN106459420B (zh) 2014-03-14 2015-03-13 新型阳离子聚磷腈化合物、聚磷腈-药物偶联化合物和其制备方法
ES15760898T ES2786309T3 (es) 2014-03-14 2015-03-13 Nuevos compuesto de polifosfaceno cationico, compuesto de conjugado de fármacos de polifosfacenos y procedimiento para preparar los mismos
PCT/KR2015/002488 WO2015137777A1 (ko) 2014-03-14 2015-03-13 신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법
JP2016575280A JP6659021B2 (ja) 2014-03-14 2015-03-13 新規な陽イオン性ポリホスファゼン化合物、ポリホスファゼン−薬物コンジュゲート化合物およびその製造方法
EP15760898.5A EP3118244B1 (en) 2014-03-14 2015-03-13 Novel cationic polyphosphazene compound, polyphosphazenes-drug conjugate compound and method for preparing same
JP2019045513A JP6867084B2 (ja) 2014-03-14 2019-03-13 新規な陽イオン性ポリホスファゼン化合物、ポリホスファゼン−薬物コンジュゲート化合物およびその製造方法
US16/430,230 US10584214B2 (en) 2014-03-14 2019-06-03 Cationic polyphosphazene compound, polyphosphazenes-drug conjugate compound and method for preparing same
US16/430,244 US10590243B2 (en) 2014-03-14 2019-06-03 Cationic polyphosphazene compound, polyphosphazenes-drug conjugate compound and method for preparing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140030564 2014-03-14
KR20140030564 2014-03-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150107650A KR20150107650A (ko) 2015-09-23
KR102078806B1 true KR102078806B1 (ko) 2020-02-18

Family

ID=54246046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150034030A Active KR102078806B1 (ko) 2014-03-14 2015-03-11 신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법

Country Status (6)

Country Link
US (6) US10336867B2 (ko)
EP (2) EP3118244B1 (ko)
JP (2) JP6659021B2 (ko)
KR (1) KR102078806B1 (ko)
CN (2) CN106459420B (ko)
ES (1) ES2786309T3 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010003105A1 (de) * 2010-03-22 2011-09-22 Zf Lenksysteme Gmbh Servolenkung
KR102078806B1 (ko) * 2014-03-14 2020-02-18 (주)씨앤팜 신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법
US20180311175A1 (en) * 2015-10-28 2018-11-01 University Of Maryland, College Park Multifunctional biodegradable carriers for drug delivery
KR102262329B1 (ko) * 2019-11-29 2021-06-10 한국과학기술연구원 가역적 솔-젤 전이 특성이 변화된 온도감응성 하이드로젤 조성물 및 이의 용도
WO2021113403A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 Onselex Pharmaceuticals, Inc. Polyphosphazene drug carriers
WO2021259847A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Covestro Deutschland Ag Polyurethanes based on terminal diol- and diaminopolyphosphazenes and their hydrogels
US12419961B2 (en) 2021-04-13 2025-09-23 Cnpharm Co., Ltd. Docetaxel-aconitic anhydride conjugate exhibiting anti-tumor activity without in vivo toxicity
US20220323397A1 (en) * 2021-04-13 2022-10-13 Cnpharm Co., Ltd. Docetaxel-Aconitic Anhydride conjugate exhibiting anti-tumor activity without in vivo toxicity
CN116459401B (zh) * 2023-03-29 2024-12-17 浙江大学 一种抗炎、抗菌及ros响应性天然多酚偶联聚磷腈基防腱周粘连水凝胶及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100773029B1 (ko) * 2006-06-16 2007-11-05 이화여자대학교 산학협력단 수용성 미셀을 형성하는 생분해성 고리형 삼합체 포스파젠-탁솔 컨쥬게이트 항암제 및 이의 제조방법
US20130324490A1 (en) * 2010-09-07 2013-12-05 Johannes Kepler Universität Linz Biodegradable, water soluble and ph responsive poly(organo)phosphazenes

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5017673A (en) * 1989-10-12 1991-05-21 Basf Corporation Nonionically stabilized polyester urethane resin for water-borne coating compositions
KR100315630B1 (ko) * 1999-11-17 2001-12-12 박호군 온도변화에 따라 상전이 거동을 갖는 분해성폴리포스파젠계 고분자 및 그 제조방법
KR100499340B1 (ko) * 2003-04-29 2005-07-04 학교법인 이화학당 암 조직 선택성과 생분해성을 갖는폴리포스파젠-백금(ⅱ)착물 복합체 항암제 및 그 제조방법
KR100567396B1 (ko) * 2004-09-22 2006-04-04 이화여자대학교 산학협력단 온도 감응성과 생체 적합성을 갖는 양친성 유기포스파젠계 고분자 및 그 제조 방법
KR100784485B1 (ko) * 2006-01-18 2007-12-11 한국과학기술연구원 생분해성 온도 감응성 폴리포스파젠계 하이드로젤, 그의제조방법 및 그의 용도
KR100746962B1 (ko) * 2006-04-04 2007-08-07 한국과학기술연구원 온도 감응성 포스파젠계 고분자-생리 활성 물질 복합체,그의 제조방법 및 그의 용도
KR20080110473A (ko) * 2007-06-14 2008-12-18 한국과학기술연구원 화학적 가교 결합을 가지는 포스파젠계 고분자 하이드로젤,그의 제조방법 및 그의 용도
KR101083419B1 (ko) 2008-04-28 2011-11-14 (주)씨앤팜 가지형 올리고펩타이드-함유 고리형 포스파젠 삼량체, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 약물 전달체
KR101427781B1 (ko) * 2010-12-20 2014-08-13 (주)씨앤팜 양친성 고리형 포스파젠 삼합체, 양친성 고리형 포스파젠 삼합체로 미셀화한 소수성 약물제제 및 그 제조 방법
WO2013016696A1 (en) 2011-07-28 2013-01-31 Cedars-Sinai Medical Center Antioxidant, neuroprotective and antineoplastic nanoparticles comprising a therapeutic agent on an amphiphilic spacer or an amphiphilic polymer
KR102078806B1 (ko) * 2014-03-14 2020-02-18 (주)씨앤팜 신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100773029B1 (ko) * 2006-06-16 2007-11-05 이화여자대학교 산학협력단 수용성 미셀을 형성하는 생분해성 고리형 삼합체 포스파젠-탁솔 컨쥬게이트 항암제 및 이의 제조방법
US20130324490A1 (en) * 2010-09-07 2013-12-05 Johannes Kepler Universität Linz Biodegradable, water soluble and ph responsive poly(organo)phosphazenes

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017512888A (ja) 2017-05-25
EP3118244A1 (en) 2017-01-18
US10590243B2 (en) 2020-03-17
JP6867084B2 (ja) 2021-04-28
US11180615B2 (en) 2021-11-23
US11912829B2 (en) 2024-02-27
JP6659021B2 (ja) 2020-03-04
ES2786309T3 (es) 2020-10-09
CN111281979A (zh) 2020-06-16
KR20150107650A (ko) 2015-09-23
US20190284346A1 (en) 2019-09-19
EP3735989A1 (en) 2020-11-11
US20250019499A1 (en) 2025-01-16
US20200262981A1 (en) 2020-08-20
US10336867B2 (en) 2019-07-02
CN106459420A (zh) 2017-02-22
US10584214B2 (en) 2020-03-10
EP3118244A4 (en) 2017-10-11
US20220064384A1 (en) 2022-03-03
CN106459420B (zh) 2020-03-27
US20190284345A1 (en) 2019-09-19
US20170037193A1 (en) 2017-02-09
JP2019123878A (ja) 2019-07-25
EP3118244B1 (en) 2020-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102078806B1 (ko) 신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법
Zhong et al. Hyaluronic acid-shelled acid-activatable paclitaxel prodrug micelles effectively target and treat CD44-overexpressing human breast tumor xenografts in vivo
JPH10513187A (ja) 高分子量のポリマーを基剤とするプロドラッグ
CN102060991A (zh) 7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性药物前体及其制备方法
CN103251596A (zh) 7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和纳米颗粒
Wang et al. A charge-conversional intracellular-activated polymeric prodrug for tumor therapy
CN110790924B (zh) 一种三嵌段双亲共聚物及其制备方法、药物-蛋白共递送载体及其制备方法
KR101891655B1 (ko) 페닐보론산이 결합된 고분자를 포함하는 약물 전달체
CN107266384B (zh) 基于2-氨基十六烷酸的n-羧基内酸酐单体和聚氨基酸及其制备方法
CN107951839B (zh) 一种具有电荷可翻转的聚离子型胶束遮蔽体系及其制备方法
CN106620714A (zh) 7‑乙基‑10‑羟基喜树碱‑聚合物偶联药物及其纳米制剂制备方法
US20070292384A1 (en) Water soluble micelle-forming and biodegradable cyclotriphosphazene-taxol conjugate anticancer agent and preparation method thereof
US11007148B2 (en) Amphiphilic block copolymers for delivery of active agents
Gao et al. Hydrotropic polymer-based paclitaxel-loaded self-assembled nanoparticles: preparation and biological evaluation
CN108359052A (zh) 一种藤黄酸-叶酸-hpma高分子聚合物及其制备方法和应用
CN102552930B (zh) 一种具有细胞靶向作用的水溶性紫杉醇衍生物及其制备
KR101562369B1 (ko) 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드 및 그의 제조방법
Fattahi et al. Preparation and physicochemical characterization of camptothecin conjugated poly amino ester–methyl ether poly ethylene glycol copolymer
CN117720716A (zh) 多臂聚乙二醇修饰的强心苷类化合物前药及其用途
Xu et al. Preparation and Characterization of pH Responsive Complex Micelles with Dynamic Boronate Cross-Linking

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

N231 Notification of change of applicant
PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-3-3-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-3-3-R10-R11-asn-PN2301

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

PA0302 Request for accelerated examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D17-exm-PA0302

St.27 status event code: A-1-2-D10-D16-exm-PA0302

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U11-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R17-oth-X000

S14-X000 Exclusive voluntary license recorded

St.27 status event code: A-4-4-S10-S14-lic-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 5

S14-X000 Exclusive voluntary license recorded

St.27 status event code: A-4-4-S10-S14-lic-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 6

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 7

U11 Full renewal or maintenance fee paid

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-4-4-U10-U11-OTH-PR1001 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

Year of fee payment: 7