KR102037405B1 - 저분자 메틸셀룰로오스 기반의 비경구 생리활성물질 전달용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 저분자 메틸셀룰로오스만을 기반으로 하는 마이셀을 이용한 비경구 생리활성물질 전달용 조성물 및 생리활성물질 전달체에 관한 것이다.
본 발명에 의한 생리활성물질 전달체는 기존 중량 평균 분자량 10~20 kDa인 저분자 메틸셀룰로오스에서 해결하지 못한 체외 배출 문제를 완전히 해결할 수 있어 안전성이 향상되고, 마이셀이 형성되어 난용성 약물의 가용화가 가능함으로써 서방형 비경구 약물 전달에 매우 유용하리라 기대된다.

Description

저분자 메틸셀룰로오스 기반의 비경구 생리활성물질 전달용 조성물{Parenteral bioactive substance delivery composition based on low molecular methylcellulose}

본 발명은 저분자 메틸셀룰로오스 기반의 마이셀 입자, 비경구 생리활성물질 전달용 조성물 및 생리활성물질 전달체에 관한 것이다.

물에 잘 녹지 않는 대부분의 난용성 약물을 가용화하여 체내로 전달하는 약물 전달 시스템에 있어. 여려 종류의 계면활성제나 알콜 계열 등의 첨가물을 사용한 약물 전달 기술, 폴리머를 이용한 약물 전달 기술, PEG-PLGA 등 친수성 블록과 소수성 블록 성질을 가지는 두 가지 이상의 고분자 블록을 합친 공중합체를 이용한 약물 전달 기술 등이 대부분이다[비특허문헌 1,2].

이러한 난용성 약물의 가용화 방법은, 체내 혈관에 주사하기 위해서 여려 종류의 계면활성제나 알콜 계열 등의 첨가물을 넣기 때문에 신경계통과 소화계통에 부작용이 유발된다고 보고되고 있다.

또한, 공중합체를 이용한 약물 전달 기술의 경우에는 공중합체 단위의 합성 고분자의 생체적합성 부족, 공정이 복잡한 문제가 제기되었다. 게다가, 높은 분자량으로 인한 생체에서 배출 효율이 감소되었다.

따라서, 난용성 약물을 상기와 같은 문제점 없이 생체적합성 및 생분해성을 높인 약물 전달체로 사용할 수 있는 새로운 제제 개발이 절실한 실정이다.

Kanjiro Miyata, R. James Christie, Kazunori Kataoka, Polymeric micelles for nano-scale drug delivery, Reactive and Functional Polymers, Volume 71, Issue 3, March 2011, Pages 227-234 Kataoka Kazunori, Kwon Glenn S, Yokoyama Masayuki, Okano Teruo, Sakurai Yasuhisa, Block copolymer micelles as vehicles for drug delivery, Journal of Controlled Release, Volume 24, Issues 1-3, 1 May 1993, Pages 119-132

이에, 본 발명자들은 기존 중량 평균 분자량 10~20 kDa인 저분자 메틸셀룰로오스에서 해결하지 못한 신장 독성 문제를 완전히 해결할 수 있어 안전성이 향상되고, 마이셀이 형성되어 가용화할 수 있는 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스를 기반으로 비경구 생리활성물질 전달용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스를 포함하는 생리활성물질 전달용 마이셀 입자를 제공하는데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 신장 독성 문제를 해결한 서방형 비경구 생리활성물질 전달용 조성물을 제공하는데 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스를 포함하는 마이셀 내에 생리활성물질이 담지된 생리활성물질 전달체를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스 및 생리활성물질을 포함하는 피부 외용제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 다음과 같다.

폴리머에 의해 형성되는 “마이셀”은 일반적으로 수용액 상에서 양친성 고분자의 자기집합(self-assembly)으로 형성되며 이들의 독특한 코어-쉘(core-shell) 구조를 가지며, 상기 코어에 난용성 약물이 봉입될 수 있다. 친수성을 가지는 친수성 잔기과, 소수성을 가지는 소수성 블록으로 이루어져, 친수성과 소수성을 동시에 지니고 있는 양친성 고분자를 사용한다. 이러한 양친성 고분자가 수용액 상에 분산되면, 소수성 블록에 의한 소수성 상호 작용으로 물과의 접촉을 최소화하고 자유 에너지를 안정화하기 위해 스스로 뭉치는 경향(즉, 자기집합)을 보인다. 이렇게 뭉쳐진 소수성 블록에 의해 미세 코어를 형성하고, 상기 미세 코어 주위를 친수성 블록에 의해 쉘(shell)을 형성하여 분자간 물리적 결합을 하고 있는 고분자 마이셀을 형성한다. 상기 고분자 마이셀은 친수성 블록에 의해 수용액에 대한 용해도가 증가된다. 본 발명에서의 “마이셀”은 중량 평균 분자량이 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스에 의해 자기 집합된 형태로, 첨부도면 도 9에 나타낸 바와 같이, 하이드록실 그룹(hydroxyl group)의 친수성 블록, 메톡사이드 그룹(methoxide group)의 소수성 블록이 코어-쉘 구조로 형성되며, 이의 평균 입자 크기는 50 내지 400 nm 또는 100 내지 350 nm이다.

"생분해성"은 블록 공중합체가 신체 내에서 화학적으로 분해되어서 비독성 화합물을 형성할 수 있음을 의미한다. 분해속도는 생리활성물질(약물 등) 방출 속도와 동일 또는 상이하다.

"생체적합성"이란 바람직하지 않은 후속효과 없이 인체와 상호작용하는 기능을 의미한다.

"지속적 방출"이란 소정의 기간에 걸쳐 생리활성물질(약물 등)의 계속적인 방출을 언급한다.

"제어된 방출"이란 본 발명의 생리활성물질(약물 등) 전달 제형에 따라 전달되는 생리활성물질의 속도 및/또는 양의 조절을 언급한다. 제어된 방출은 연속적 또는 불연속적이고/거나 선형 또는 비선형일 수 있다. 이것은 하나 이상의 유형의 중합체 조성물, 생리활성물질(약물 등) 로딩, 부형제 또는 분해 개선제, 또는 다른 개질제의 포함, 단독으로, 조합하여 또는 연속으로 투여시켜 요망되는 효과를 제공하는 것을 이용하여 달성될 수 있다.

“생리활성물질”은 유기체(사람 또는 사람이 아닌 동물)에 투여될 때 국소적 및/또는 전신적 작용에 의해 요망되는 약리학적, 면역원성 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 임의의 화합물 또는 조성물을 언급한다. 따라서 상기 용어는 전통적으로 약물, 백신, 및 단백질, 펩티드, 호르몬, 핵산, 유전자 구성물 등과 같은 분자를 포함하는 생체 약제로서 간주되는 화합물 또는 화학물질을 포함한다. 또한, 약물 외에 미백, 항산화, 보습, 자외선 차단, 컨디셔닝, 항염, 주름 개선, 탄력 증진 등 화장료의 활성성분(유효성분)으로 포함될 수 있다.

"약물"은 생활성을 가지며 치료용으로 사용 또는 개조되는 유기 또는 무기 화합물이나 물질을 의미한다. 난용성 약물, 친수성 약물, 저분자 약물, 고분자 약물, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 및 유전자 치료제가 광의의 약물 정의에 포함된다.

"펩티드" "폴리펩티드" "올리고펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 또는 단백질 약물을 말할 때 동일하게 사용될 수 있으며 특정 분자량, 펩티드 서열 또는 길이, 생활성 또는 치료분야에 국한되지 않는다.

"치료적 효과"란 당해 방법에 따라 치료된 피검체, 사람 또는 동물의 병에서의 임의의 개선을 의미하며, 예방 또는 방지 효과, 또는 물리적 조사, 실험실용 또는 기계적 방법에 의해 탐지될 수 있는 질병, 질환 또는 병의 징후 및 증상의 중증도에 있어서의 임의의 경감을 수득하는 것을 포함한다.

특정 질병 또는 질환과 관련하여 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"이란 (i) 질병, 질환 및/또는 병에 걸리기 쉬우나 아직 병에 걸린 것으로 진단되지 않은 동물 또는 사람에서 질병, 질환 또는 병이 발생하는 것을 예방하고; (ii) 질병, 질환 또는 병을 억제하고, 즉 이의 진행을 억제하고; 및/또는 (iii) 질병, 질환 또는 병을 경감시키고, 즉 질병, 질환 및/또는 병의 퇴화를 야기하는 것을 언급한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스를 포함하는 생리활성물질 전달용 마이셀 나노입자 및 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스를 포함하는 서방형 비경구 생리활성물질 전달용 조성물에 관한 것이다.

메틸셀룰로오스의 경우 하기 화학식 1과 같은 단량체를 기본으로 하는 다당류이며, 메틸기의 치환 정도(DS, Degree of saturation)가 1.5-1.9이며, 80 ℃, 2% 메틸셀룰로오스 수용액에서 15 cPs의 점성을 가지며, 대략 중량 평균 분자량 14,000 Mw(60 kDa)의 특성을 가진다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 수소 또는 메틸이다.

본 발명에 따른 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스(MC)는 치환도가 1.5~1.9이며, 낮은 온도의 수용액에서 잘 녹는 성질을 가지고 있다. 이러한 메틸셀룰로오스의 소수성 부분인 메톡사이드 그룹(methoxide group)이 난용성 물질 주변을 둘러싼 핵(코어)을 형성하고, 친수성 부분은 물과 닿는 표면을 형성하여 마이셀을 이룸으로써[도 9] 물에 녹게 되는데, 이를 가용화(solubilization)라 한다.

본 발명자들은 효소 처리를 통해 메틸셀룰로오스 중량 평균 분자량을 6~9.5 kDa으로 현저히 감소시킴으로써, 마이셀 형성 및 체외 배출로 신장 독성 문제를 해결할 수 있었다.

본 발명의 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa의 저분자량 메틸셀룰로오스는 예를 들어, 셀룰라아제(cellulase) 등의 효소 처리를 통해 분자량을 감소시켜 수득할 수 있다.

본 발명의 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa의 메틸셀룰로오스에 대하여, 본 명세서에서는 "저분자 메틸셀룰로오스" 또는 “LMwMC”로 표현하기도 한다. 또한, 본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스는 마이셀을 형성하는 범위 내에 속하는 메틸셀룰로오스 유도체도 포함한다.

특히, 본 발명의 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스(LMwMC)를 포함하는 마이셀 입자는 마이셀 내에 체내로 전달하고자 하는 생리활성물질을 봉입(또는 담지)시킬 수 있다.

이때, LMwMC와 생리활성물질의 혼합 비율은 10~25 : 1의 중량비가 바람직하며, 생리활성물질이 너무 적으면 생리활성물질이 담지된 마이셀 나노 입자가 충분히 형성되지 않아 가용화가 되지 않을 수 있다는 문제가 있고, 생리활성물질이 너무 많으면 생리활성물질을 포함하지 않은 불필요한 메틸셀룰로오스 마이셀 나노 입자가 증가하여 물질의 독성을 증가시키거나, 치료의 효율성을 감소시킨다는 문제가 있다.

본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스를 이용하여 형성된 마이셀로부터 생리활성물질(예, 약물(항암제))가 능동 확산에 의해 방출된다. 또한, 일정시간이 지난 후 마이셀의 안정성 감소로 인한 분해로 인해 남아있는 약물이 방출되기도 한다. 체내에서 EPR effect(Enhanced permeability and retention effect)에 의해 암세포로 전달되어 세포 내로 약물을 전달하게 된다.

실시예 1에서 확인한 바와 같이, 저분자 메틸셀룰로오스로 이루어진 마이셀은 체내에서 서서히 분해가 일어나 인체에 무해한 저분자 물질로 변화되어 스스로 체외로 배출되기 때문에 일정기간 약물의 방출 후 별도의 외과적 제거 수술 과정 등이 필요 없다. 그리고 이러한 배출은 주로 신장을 통해 이루어진다.

본 발명에 따른 저분자 메틸셀룰로오스는 생체흡수성, 생분해성, 생체적합성으로 제형화할 수 있다.

상기“생체흡수성”이라 함은 중합체가 체내에서, 분산된 중합체 분자의 분해 또는 분해 없이, 초기 적용에서 사라질 수 있음을 의미하는 것이다. 생체분해성은 가수분해 또는 효소 분해에 의해 중합체가 체내에서 파쇄 또는 분해될 수 있음을 의미한다.

상기 “생체적합성”이라 함은 성분 모두가 체내에서 무독성임을 의미한다.

본 발명의 생리활성물질 전달용 조성물은 당해 생리활성물질 전달 시스템에 포함된 생리활성물질이 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달(예: 이식, 체강 또는 가능한 공간에 넣는 것, 신체의 조직 표면을 코팅 또는 이식 가능한 장치의 표면을 코팅함으로써)될 수 있지만, 특히 상기 조성물은 비경구로 전달되는 것이 바람직하다.

상기 '비경구'란 근육내, 복막내, 복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 포함한다.

본 발명의 조성물은 대표적으로 주사 제형으로 제제화될 수 있다.

저분자 메틸셀룰로오스를 주사 제형의 생리활성물질 전달체로 응용하기 위해서는 신체 외부로 쉽게 배출되기 위한 낮은 분자량을 가지고 있어야 하는데, 본 발명에서는 저분자의 메틸셀룰로오스를 사용함으로써, 마이셀의 요건 중 하나인 낮은 분자량을 유지할 수 있게 되는 것이다.

본 발명의 주사 가능한 조성물은 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유 동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다.예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체내 임의의 체강 또는 가능한 공간 내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다. 기타 적용에서, 개방 외과술 또는 외상 창상, 화상, 또는 피부 또는 기타 조직 표면에 국소 적용할 수 있다.

특히, 본 발명은 체내의 특정 부위에 주입하였을 때 약물이 체내에서 서서히 방출되도록 하는 서방형 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물은 생리활성물질의 지속적 및 제어된 방출 매트릭스로서 사용하기에 적합하다. 당해 매트릭스가 여기에 균질하게 함유된 하나 이상의 생리활성물질과 커플링될 경우, 생분해성 서방성 생리활성물질 전달 시스템이 제공된다.

본원에 사용된 용어 "서방성(sustained release)"(즉, 지속적 방출 또는 제어된 방출)은 사람 또는 기타 포유동물에 도입되거나, 또는 개방된 상처, 화상 또는 조직 표면에 또는 체강 또는 잠재성 체내 공간내 도입되어, 예정된 시간에 걸쳐 하나 이상의 생리활성물질 스트림을 예정된 시간에 걸쳐 목적하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 치료 수준에서 지속적으로 방출하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서는 봉입된 생리활성물질(약물)의 대부분이 initial burst 없이 약 21~25일 동안 지속적으로 약물 방출이 가능함을 확인하였다.

또한, 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 생리활성물질 전달용 조성물은 일정 기간이 경과하면 인체에 무해한 물질로 분해되어 신장을 통해 체외로 배출되므로, 일반적인 주사기나 카데터를 이용하여 본 발명에 따른 조성물을 체내의 특정 부위에 주입한 경우, 생리활성물질(약물)이 서서히 방출되어 순환 혈액 내에서 생리활성물질(약물)이 일정 농도로 장기간 유지되므로 생리활성물질의 효능 발현이 우수할 뿐만 아니라, 생리활성물질(약물) 전달체 제거를 위한 별도의 외과적 제거 수술 과정 등이 필요 없는 장점이 있다.

따라서, 본 발명의 서방형 생리활성물질 전달체에 따라, 생리활성물질이 대상체의 표적 부위에 제어된 방식으로 방출될 수 있다.

일 구체예에서, 마이셀을 사용하여 생리활성물질의 대상체로의 부위-특이적 방출을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 마이셀은 대상체에 투여될 수 있는 하나 이상의 생리활성물질을 포함하여, 생리활성물질이 마이셀로부터의 확산 및/또는 마이셀의 분해에 의해 방출된다.

이때, 조성물의 투여 값은 치료되는 질병, 질환 또는 병의 유형 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 임의의 특정 대상체에 대하여, 특정 용량 섭생이 개개인의 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 지시하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 함을 추가로 이해해야 한다. 생체 내 투여는 세포 배양에서의 시험관 내 방출 연구 또는 생체 내 동물 모델에 기초할 수 있다.

이처럼, 본 발명의 조성물은 제어된 방식으로 생리활성물질을 방출시키기 때문에, 생리활성물질의 최적의 전달을 제공한다. 제어된 전달 결과, 생리활성물질이 요망되는 기간 동안 전달된다. 보다 느리고 보다 불변의 전달 속도는 바꾸어 말해 생리활성물질이 동물에게 투여되어야 하는 빈도의 감소를 초래할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스는 높은 생체적합성 및 생분해성 특성을 가지고 있고, 장기간의 서방성 제제에 적합하며, 생리활성물질의 안정성 및 효과를 높여 생리활성물질의 전달체로서 매우 유용하다.

본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스를 전체 조성물 100중량%에 대하여 0.01 내지 90 중량%일 수 있다. 구체적으로는, 전체 조성에 대해 약 0.1 내지 80 중량%, 보다 구체적으로는 약 0.1 내지 70 중량%, 더욱 구체적으로는 약 0.1 내지 60 중량% 일 수 있다, 또한, 투여량의 경우 1일에 0.5 ~ 100 mg/kg으로, 1회 또는 수회 나누어 투여될 수 있으나, 질환 증상의 정도, 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 상기 저분자 메틸셀룰로오스 외에 생리활성물질, 의약품, 화장품 또는 건강식품에 허용가능한 담체를 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 마이셀은 서방성 생리활성물질 전달체에 효과적으로 사용될 수 있다. 특히, 난용성 약물 전달에 더욱 효과적이다.

상기 난용성 약물은 수용해도가 낮아 가용화하기 어려운 약물을 지칭하는 것으로, 소수성 약물을 의미하기도 하며, 예를 들어 항암제 또는 동맥경화증, 고지혈증 등과 같은 심혈관계 질환 치료제 등이 있으나 이에 한정되지 않고, 가용화가 어려운 모든 난용성 약물을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 난용성 약물은 예를 들어 파클리탁셀, 도세탁셀, 타목신, 아나스테로졸, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이마티닙, 이리노테칸, 플록수리딘, 비노렐빈, 겜시타빈, 루프롤리드(leuprolide), 플루타미드, 졸레드로네이트, 메토트렉세이트, 캄토테신, 시스플라틴, 빈크리스틴, 히드록시우레아, 스트렙토조신, 발루비신, 로바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 아트로바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 또는 로수바스타틴 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

난용성 약물 외에 본 발명의 마이셀에 포함될 수 있는 약물 물질로는 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항신생물제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항바이러스제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 조직 또는 세포 응집물, 및 이들의 조합물이 있다. 뿐만 아니라, 암 화학요법제, 예컨대 시토킨, 케모킨, 림포킨 및 실제로 정제된 핵산, 및 백신, 예컨대 약독화된 인플루엔자 바이러스가 있다. 혼입될 수 있는 실제로 정제된 핵산은 게놈 핵산 서열, cDNA 엔코딩 단백질, 발현 벡터, 상보적인 핵산 서열과 결합하여 번역 또는 전사를 억제하는 안티센스 분자 및 리보자임을 포함한다. 이처럼, 기본적으로 사용될 수 있는 약물의 종류에는 제한이 없다.

또한, 생리활성물질을 마이셀에 봉입(담지)시킬 수 있는 다양한 기술이 공지되어 있다.

생리활성물질은 상기 마이셀에 약 0.01 내지 약 100 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 약 95 중량%, 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 70 중량%로 포함된다. 마이셀에 포함된 생리활성물질의 양 또는 농도는 생리활성물질의 흡수·비활성화 및 배출 속도에 따라 달라질 것이다.

일 구현예에서, 상기와 같은 방법으로 제조된, 본 발명의 마이셀은 정맥 주사를 통해 체내로 들어가 혈류를 타고 순환하다가 EPR(Enhanced permeability and retention) effect 에 의해 암 조직을 이루는 세포가 느슨해지는 성질을 통해 종양이 있는 표적 부위에 전달되며, 시간이 지남에 따라 마이셀에 함유된 생리활성물질(약물)가 능동 확산되거나, 마이셀이 분해됨으로써 표적 부위에 제어된 수단으로 방출될 것이다.

본 발명은 또한, 중량 평균 분자량 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스를 포함하는 마이셀 내에 생리활성물질이 봉입(담지)된 생리활성물질 전달체를 포함한다.

상기에서 마이셀 입자 및 생리활성물질 전달용 조성물과 관련하여 기술한 모든 내용이 생리활성물질 전달체에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.

여기서 상기 생리활성물질을 필요로 하는 대상체(환자)에게 도입시키는 것을 포함하는 질병, 질환 또는 병을 치료하는 방법 및 본 발명의 전달 시스템을 제조하는 방법도 포함한다.

즉, 본 발명은 중량 평균 분자량이 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스를 포함하는 마이셀 및 목적하는 생리활성물질을 포함하는 서방성 생리활성물질 방출용 약학적 조성물을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 중량 평균 분자량이 6~9.5 kDa인 메틸셀룰로오스 및 생리활성물질을 포함하는 피부외용제를 포함할 수 있다.

상기에서 마이셀 입자 및 생리활성물질 전달용 조성물과 관련하여 기술한 모든 내용이 피부 외용제에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.

본 명세서에서 “피부 외용제”란 피부에 적용하는 조성물 전반을 포괄하는 개념이고, 예를 들어, 기초 화장료, 메이크업 화장료, 모발용 화장료 등 각종 화장료; 연고제, 크림제, 로션제, 젤제, 패취제 등 의약품 및 의약부외품을 포함한 피부 외용으로 적용되는 약학 조성물 등을 포함하는 개념이다.

상기 외용제 중에 사용되는 본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스의 함량은 원하는 생리활성물질 전달력을 확보할 수 있기만 하면 특별히 한정되는 것은 아니며, 원하는 정도에 따라서 당업자라면 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어 전체 조성 100 중량%에 대해 0.01 내지 90 중량%일 수 있다. 구체적으로는, 전체 조성에 대해 약 0.1 내지 80 중량%, 보다 구체적으로는 약 0.1 내지 70 중량%, 더욱 구체적으로는 약 0.1 내지 60 중량% 일 수 있다. 상기 화장료는 화장료로서 공지된 임의의 제형일 수 있으며, 예를 들어 스킨, 에멀젼, 크림, 선크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 마스크팩, 폼클렌저, 바디클렌저, 유연화장수, 아이라이너, 샴푸, 린스, 비누, 정발제, 양모제, 헤어크림, 헤어 스타일링 젤, 윤활제, 치약 및 물티슈로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 비경구 생리활성물질 전달 시스템은 종래 난용성 물질을 가용화하기 위해 오일류나 기타 첨가물을 넣었던 과는 달리 저분자량의 천연 고분자 메틸셀룰로오스만을 기반으로 가용화하는데 사용되었으며 독성 문제가 없어 생체적합성 및 생분해성이 우수하며 부작용 없이 생체 내에 원하는 생리활성물질을 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스는 난용성 물질을 가용화하는 새로운 생리활성물질 전달 제재로 활용될 수 있다.

도 1은 셀룰라아제 효소 중에서도 엔도셀룰라아제가 다당류의 안쪽 사슬부터 자르는 원리를 나타낸 것이다.
도 2는 저분자량 다당류로 제조되는 과정 전 제조예에서 사용된 60 kDa 분자량을 가지는 메틸셀룰로오스의 GPC(Gel Permeation Chromatography)로 측정한 것이다.
도 3은 4% 메틸셀룰로오스 수용액에 셀룰라아제 효소 처리 후 3일간 반응시킨 후에 GPC(Gel Permeation Chromatography)로 측정한 결과로, 약 9,000 Mw(15 kDa) 분자량을 가짐을 보여준다.
도 4는 셀룰라아제 효소 처리 후에 투석막(Spectrum Lab. 社, 여과한계: 6~8 kDa)에 걸러진 메틸셀룰로오스 수용액을 동결건조 후 GPC(Gel Permeation Chromatography)로 측정한 결과로, 약 5,294 Mw(8.5 kDa) 분자량을 가짐을 보여준다.
도 5는 제조예에서 최종적으로 얻어지는 파우더(고체) 형태의 평균 8.5 kDa 분자량을 가지는 메틸셀룰로오스를 나타낸 것이다.
도 6은 제조예 1에 따른 저분자 메틸셀룰로오스의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 제조예 1의 저분자 메틸셀룰로오스의 CMC(Critical micelle concentration) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 제조예 1의 저분자 메틸셀룰로오스 농도에 따른 세포독성을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 형성된 마이셀을 나타낸 것이다.
도 10a는 약물 봉입 없이 제조예 1의 저분자 메틸셀룰로오스만으로 마이셀을 형성한 경우의 투과전자현미경(TEM) 결과 및 DLS 결과를 나타낸 것이다. `
도 10b는 도세탁셀(DTX) 1 mg이 봉입된 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀을 형성한 경우의 투과전자현미경(TEM) 결과 및 DLS 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 DTX의 머무름 시간(retension time)을 알아보기 위한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 3.9ug/ml ~ 500ug/ml와 같은 농도별로 DTX가 함유된 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀을 HPLC 분석한 결과이다.
도 13은 본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스에 도세탁셀이 봉입된 제형(실시예 1의 마이셀)의 약물 방출율을 나타낸 것이다.
도 14는 도세탁셀만 처리한 경우 및 본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스에 도세탁셀이 봉입된 제형(실시예 1의 마이셀)을 처리한 경우의 570nm 파장대에서의 흡광도[cell viability]를 나타낸 것이다.
도 15는 B16F10 흑색종 종양 암세포를 C57BL/6 마우스의 오른쪽 대퇴부 피하에 동종이식하여 제작된 종양동물모델에 대조군과 치료군 종양 내 주사(local injection; intratumoral injection; 종양 부위에 직접 주사) 후 종양 크기를 나타낸 그래프이다.
도 16은 종양동물모델에 대조군과 치료군(실시예 1의 마이셀) 종양 내 주사(local injection; 종양 부위에 직접 주사) 후 14일째 종양 크기를 확인하기 위한 마우스 사진이다
도 17은 종양동물모델에 대조군과 치료군(실시예 1의 마이셀) 종양 내 주사(local injection; 종양 부위에 직접 주사) 후 14일 동안 체중 변화를 확인한 그래프이다
도 18은 종양동물모델에 대조군과 치료군(실시예 1의 마이셀) 종양 내 주사(local injection; 종양 부위에 직접 주사) 후 22일 동안 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 19는 제조예 1의 저분자 메틸셀룰로오스 125 mg/kg 투여군에 대한 신장 독성 시험 결과, 독성이 없음을 보여준 표이다.
도 20은 종양동물모델에 대조군과 치료군(실시예 1의 마이셀) 정맥 주사 후 14일 동안 종양 크기를 나타낸 그래프이다.
도 21은 종양동물모델에 대조군과 치료군(실시예 1의 마이셀) 정맥 주사 후 14일 동안 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 22는 종양동물모델에 대조군과 치료군(실시예 1의 마이셀) 정맥 주사 후 25일 동안 생존율을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식이 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 ]

제조예 : 중량 평균 분자량 8.5 kDa의 저분자 메틸셀룰로오스의 제조

200ml 3차 증류수에 8 g의 메틸셀룰로오스(분자량: 60kDa)[Sigma aldrich 社]를 넣어 총 4%의 용액으로 만들었다. 메틸셀룰로오스 수용액을 80 ℃, 210RPM, 30분간 교반하여 분산도를 높였다. 메틸셀룰로오스 수용액을 저온실(4 ℃)에서 1시간 교반함으로써. 물 속에서 메틸셀룰로오스의 용해도가 다시 높아졌다. 그런 다음, 메틸셀룰로오오스 수용액을 실온(24~25 ℃), 210RPM, 30분 교반하였다.

목표하는 메틸셀룰로오스의 단위는 30 Units/ml이며, 효소의 효과가 105 Units/mg인 엔도셀룰라아제(Worthington 社) 51.75 mg을 상기 메틸셀룰로오스 수용액에 넣었다. 메틸셀룰로스 수용액을 실온(24~25 ℃), 210RPM의 교반기에서 3일간 보관하였다. 셀룰라아제 효소의 역할이 다당류 사슬의 안쪽부터 자르는 엔도셀룰라아제 이기 때문에 3일 이후의 셀룰라아제의 활성도는 계속 유지되지 않는다. 따라서, 3일째 메틸셀룰로오스 수용액 안에 있는 셀룰라아제를 불활성화시키기 위해서 교반기의 온도를 80 ℃로 올린 후 10~15분 교반하였다. 온도를 올리게 되면 물에서의 메틸셀룰로오스의 용해도가 낮아지므로 다시 저온실(4 ℃)에서 1시간 교반하여 메틸셀룰로오스의 용해도를 높였다. 이어서, 메틸셀룰로스 수용액을 0.22 ㎛ PVDF(Polyvinylidene fluoride) 필터로 1차적으로 큰 고분자들을 걸렸다. 필터를 거친 메틸셀룰로오스 수용액을 투석막(Spectrum Lab. 社, 여과한계: 6~9.5 kDa)에 넣고 3차 증류수에서 2일간 저온실(4 ℃)에서 투석하였다. 2일 후, 투석막은 빼고 투석막 바깥의 3차 증류수를 모아서 하루 동안 동결냉장고(-70 ℃)에 보관하였다(저분자량의 메틸셀룰로오스가 필요하므로 투석막 바깥의 용액을 수집). 얼려진 용액을 5~7일간 -76 ℃, 20~24 mTorr 동결건조기에서 수분만 기화하였다. 동결건조 후 얻어진 중량 평균 분자량 8.5 kDa의 저분자량 메틸셀룰로오스 파우더만 수집하였다.

실시예 1: 중량 평균 분자량 8.5 kDa의 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀 제조 및 특성 분석

상기 수득한 저분자 메틸셀룰로오스만을 사용하여 마이셀을 제조하여 그 특성을 분석하였다.

마이셀은 얇은 막 수화법(Thin-film hydration method)을 이용하여 제조하였다.

우선, 1 mg의 도세탁셀(DTX)과 20 mg의 중량 평균 분자량 8.5 kDa 저분자 메틸셀룰로오스(LMwMC)가 담긴 바이알에 각각 HFP(hexafluoro-2-propanol) 1 ml에 녹인 후, 회전증발농축기(Rotary evaporator)에 두 용액을 혼합하였다. Thin-film을 형성하기 위해 36 ℃에서 HFP가 증발될 때까지 천천히 회전시켰다. 형성된 thin-film을 수용액 상태로 만들기 위해 3차 증류수 3 ml를 첨가 후 50℃에서 10분간 천천히 회전시켜 분산도를 높였다. 마지막으로 영하 4 ℃의 조건에서 30분간 천천히 회전시켜 용해도를 높이면 항암제가 봉입된 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀을 포함하고 있는 수용액이 완성되었다.

(1) CMC(Critical micelle concentration) 측정

DPH(1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene, Mw=232.32) 5 ug을 HFP(Hexafluoro-2-propanol)에 녹여 0.86 mM의 stock solution을 만들고, 저분자 메틸셀룰로오스 2.5 mg을 HFP 1 ml에 녹여, 2.4 ug까지 serial dilution시켜서 2.5 mg/ml~2.4 ug/ml의 샘플을 만들었다. 각각의 저분자 메틸셀룰로오스 샘플을 유리 비이커에 넣고, 거기에 5uM의 stock solution을 넣은 뒤 얇은 막 수화법으로 컨쥬게이션(conjugation)시켰다. 먼저, 섞인 두 용액을 evaprator로 증발시킨 후 3 ml의 2차 증류수를 넣고 47 ℃에서 10분간 회전시켜 분산도를 높였다. 그 후 30분간 ice에 넣고 회전시켜 용해도를 높이고, 완성된 샘플을 각각 따서 96 well DC plate에 깔고 excitation 355nm, emission 428nm에서 UV/Vis fluorescence spectrophotometer(Infinite M200Pro, TECAN, Switzerland)로 흡광도를 측정하여 마이셀이 어느 농도에서 잘 발생되는지 알아보았다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 0.0526 mg/ml의 농도 이상부터 평균 8.5 kDa의 저분자 메틸셀룰로오스의 마이셀 형성이 확인되었다.

(2) 세포독성 분석

24-well plate의 각 well에 2 X 10⁴개 만큼의 B16F10 mouse skin melanoma cell line[Korean cell line bank에서 입수]이 함유되도록 계산하여 총 500ul의 complete media를 깔아주었다(Seeding). 5% CO₂, 37 ℃의 환경에서 24시간 동안 세포를 키웠다. 통계적 유의성을 위해 각 그룹의 well 수는 4개로 하였으며, 아무 처리도 하지 않은 대조군과 저분자 메틸셀룰로오스의 농도를 달리한 처리군(62.5, 125, 250, 500, 1000 ug/PBS 1ml)들을 각 well에 50ul씩 처리한 후 다시 24시간 동안 5% CO₂, 37 ℃의 환경에서 인큐베이션시켰다(Treating). 24시간이 지나면 각 well에 들어있는 용액을 모두 제거하고 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide): Media를 1ml : 9ml 비율로 섞은 complete media를 각 well당 500 ul씩 넣어준 후 2시간 동안 5% CO₂, 37 ℃의 환경에서 인큐베이션시켰다. 2시간이 지나면 각 well에 들어있는 complete media를 빼내고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 500 ul씩 각 well에 넣어주고, 15분간 37 ℃에 인큐베이션 후 UV spectrophotometer를 이용하여 shaking 5초 후 570 nm의 파장대에서 흡광도를 측정하였다.

세포 독성 실험 결과를 도 8에 나타내었다. 본 발명의 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀은 세포의 생존률에 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다.

(3) 마이셀 크기 확인

메틸셀룰로오스 마이셀은 제조한 저분자 메틸셀룰로오스 10 mg를 증류수 1ml에 녹여서 제조하였다.

1 mg 도세탁셀이 함유된 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀은 상기에 기재된 얇은 막 수화법을 이용한 마이셀 제조과정과 같이 제조하였으며, 각각 첨가해주는 도세탁셀과 메틸셀룰로오스의 양만 다르게 하여 동일한 방법으로 제조하였다. 즉, 1 mg 함유 마이셀의 경우 1 mg의 도세탁셀과 20 mg의 저분자 메틸셀룰로오스를 사용하였다.

이렇게 제조된 각각의 마이셀들을 투과전자현미경을 사용하여 모양을 확인하였다.

DLS를 측정하기 위하여 상기 방법으로 만든 각각의 마이셀을 하루 얼려서 약 3-5일 동결건조시켜 만든 파우더에 삼차 증류수 1ml을 넣어 샘플을 만든 후 기계로 사이즈를 측정하였다. 그 결과, 도 10과 같이 도세탁셀을 함유한 마이셀의 경우가 없을 때 보다 더 컴팩트하게 마이셀이 형성된 것을 알 수 있다. 저분자 메틸셀룰로오스에 함유된 도세탁셀의 양이 다름에도 불구하고 PDI(polydispersity) 0.2 이하, 200nm 근처로 수용액 상에서 비슷한 크기의 마이셀이 형성되는 것을 관찰할 수 있다.

투과전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여 DTX와 저분자 메틸셀룰로오스가 구형의 마이셀을 이루어진 것으로, 도 10으로 확인하였으며, DTX를 봉입하지 않은 저분자 메틸셀룰로오스, 1mg DTX을 봉입한 마이셀의 크기는 324.9 nm, 209.98 nm였다. 또한, DLS(Dynamic Light scatter) 방식으로 측정하였을 때도 투과전자현미경 결과와 유사한 결과를 확인하였다.

실시예 2: 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀의 약물 봉입율 측정

HPLC로 약물 봉입율과 약물 함유율을 측정하기 위해 ACN(acetonitrile) based DTX 스탠다드 그래프를 Breeze program(Version 3.30, Waters, Milford, MA)를 이용하여 만들었다(C18 HPLC column 사용).

500 ug DTX/1ml ACN의 serial dilution을 통하여 8개의 샘플을 제조하여 1차 방정식 스탠다드 그래프를 만들었다 (스탠다드 커브의 R제곱 값이 신뢰도를 나타내며, 0.99 이상이므로 이 그래프는 신뢰할 수 있는 기준 그래프이다).

상기 마이셀 제조방법으로 제조한 1 mg 도세탁셀을 함유하고 있는 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀 수용액을 하루 동안 얼린 다음 3-5일 정도 동결건조를 통해 파우더 형태로 만들었다. 이 파우더에 1ml ACN 첨가 후 13000 rpm, 3분 원심분리시키면 저분자 메틸셀룰로오스로부터 분리된 상층액(DTX+ACN)을 추출하여 HPLC용 컬럼에 필터링을 거쳐 넣었다. 이 샘플을 가지고 HPLC기계와 Breeze program(Version 3.30, Waters, Milford, MA)을 통해 약물의 봉입율과 함유율을 측정하였다. HPLC를 통해 측정된 가용화된 수용액 내 약물의 양을 하기 수학식 1과 2에 대입하여 약물 봉입율과 함유율을 계산하였다.

하기 수학식 1과 2에 의해 실시예 1의 마이셀에 대한 약물 봉입율과 약물 함유율 각각 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다.

[수학식 1]

약물 봉입율(%)=가용화된 수용액 내 약물 총량/처음 주입한 약물의 양 × 100

[수학식 2]

약물 함유율(%)=가용화된 수용액 내 약물 총량/가용화된 수용액 중량 × 100

(처음 주입한 것은 엄밀히 말하면, 도세탁셀을 함유한 저분자 메틸셀룰로오스이며, 그 안에 DTX : LMwMC가 1:20의 중량 비율로 마이셀을 형성하고 있기 때문에, HPLC로 약물 함유율을 정량한 결과, 처음 주입량의 약 4~5% 정도로 DTX가 검출되는 것은 바람직한 결과임).

구분 (n=3)	처음 주입한 도세탁셀을 함유하고 있는 저분자 메틸셀룰로오스의 양(ug)	약물 봉입율 (Loading efficiency)	약물 함유율 (Loading contents)
value	1000	71.6±15.0%	4.47±0.67%

도 11은 1 mg의 DTX가 봉입된 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀 샘플 3개를 가지고 HPLC 분석을 통해 몇 초의 피크에서 DTX가 검출되는지, 즉 DTX의 retension time을 알아보기 위해 행해진 실험으로, 실험 결과 3.73초 때 나타나는 피크가 DTX가 검출될 때의 피크라는 것을 알 수 있다. 도 11의 HPLC 분석 결과 그래프에서 3.73초일 때 나타내는 피크가 검출된 DTX의 흡광도 값이라는 것을 알 수 있다.

도 12는 3.9ug/ml ~ 500ug/ml와 같은 농도별로 DTX가 함유된 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀을 가지고 도 11과 같이 HPLC 기계를 사용하여 분석하였다. 이때 도 11의 그래프와 같은 형태의 결과를 얻게 되는데, 다만 농도별로 세로축(흡광도)이 차이가 날 것이다(DTX 양이 많을수록 흡광도가 높게 측정됨). 도 11을 통해 3.73초에서 검출된 피크가 DTX의 양을 나타내는 피크라는 것을 알았으므로, 3.73초에 검출된 흡광도 값을 가지고 1차 방정식 그래프로 변환하여 각 DTX 농도에서의 흡광도에 대한 기준을 잡은 것이다. 즉, 도 12는 앞으로 도 13에서 도세탁셀의 방출율을 측정할 때 DTX의 양이 어느 정도인지 알기 위한 기준 그래프로 사용된다.

실시예 3: 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀의 약물 방출 효능(In vitro release test)

실시예 1의 마이셀에 대한 약물 방출 능력을 확인하기 위해 약물방출시험을 진행하였다.

상기에서 제조한 마이셀을 동결건조시킨, 도세탁셀이 함유된 저분자 메틸셀룰로오스 파우더를 PBS 버퍼에 녹인 용액을 투석막(MWCO: 3,500 Da) 안에 넣고 막의 위아래를 끈으로 단단히 묶어 밀봉시켰다. 이를 release media(5% ACN을 포함하고 있는 saline buffer(pH 7.4))에 넣어 100 RPM, 37도 shaking incubation시켰다. DTX는 ACN에 녹는 성질이 강하므로 투석막 밖으로 빠져 나와 release media에 녹아있을 것이다. 그러므로 설정해둔 시간 대 마다 release media를 새로 교체, 수확한 release media를 HPLC 기계로 약물이 그 안에 얼마나 함유되었는지 정량하였다.

그 결과, 도 13에 도시한 바와 같이, 25일간 약 60%의 약물이 마이셀로부터 서서히 방출됨을 확인하였다.

실시예 4: 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀의 in vitro 약효 확인

2x10⁴개 만큼의 B16F10 흑색종(melanoma) 세포가 함유되도록 계산하여 총 500ul의 완전 배지(complete media)를 24 well plate에 깔아주었다(Seeding). 5% CO₂, 37℃의 환경에서 24시간 동안 세포를 키웠다. 아무 처리도 하지 않은 대조군과 PBS만 처리한 그룹 외에 저분자 메틸셀룰로오스를 이용하여 만든 1mg의 항암제(DTX)를 봉입한 마이셀을 항암제 기준으로 각각 5,10,25,50,100,250ug을 PBS 50ul에 녹인 후 각 well에 50 ul씩 넣어주고 다시 5% CO₂, 37℃의 환경에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다(Treating). 통계적 유의성을 위해 각 그룹의 well수는 4개로 하였다. 24시간 후에 각 well에 담긴 약물이 포함된 배지를 제거한 후 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide): Media를 1ml: 9ml 비율로 섞은 완전 배지를 각 well당 500ul씩 넣어준 후 5% CO₂, 37℃의 환경에서 2시간 인큐베이션시켰다. 2시간 후 각 well에 들어있는 500ul의 완전배지를 제거하고 DMSO를 500ul 첨가하여, 15분간 37℃의 환경에서 인큐베이션 후, UV spectrophotometer를 이용하여 shaking 5초 후 570nm의 파장대에서 흡광도를 측정함으로써 세포의 생존율을 확인하였다.

도 14는 MTT 어세이로 측정한 세포 생존율로서, 대조군의 살아있는 세포의 수를 100%로 기준을 잡고, 그에 상대적으로 가해준 약물의 양에 따라 B16F10 세포가 얼마나 죽었는지 나타내는 그래프이다. Free DTX에 비해 DTX-loaded LMwMC가 암세포를 더 효과적으로 죽임으로써 항암 효과가 더 좋다는 결과를 나타내었다. (특히, 5ug의 약물을 사용했을 때 차이가 큰 것으로 보아 적은 양의 약물을 주입해도 치료효과의 차이가 큼을 알 수 있다.)

MTT 용액은 살아있는 세포의 미토콘드리아에서만 보라색을 띄는 formazan 크리스탈을 형성하는데 이 크리스탈이 불용성이라서 DMSO로 녹여 액체로 만들고 여기에 570nm 파장의 빛을 쏘여주면 이 보라색이 강할수록(살아있는 세포가 많아서 생성된 formazan 크리스탈이 많을수록 보라색이 강함) 높은 흡광도가 측정된다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 항암제만 처리하였을 때 보다 저분자 메틸셀룰로스 마이셀에 항암제가 봉입된 제형이 비슷하거나 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 5: 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀의 in vivo 약효 확인( 종양내 주사)

본 실험은 정맥 주사에 앞서 예비 실험한 것으로, 실제 암 부위에 직접적으로 전달하였을 때 약물이 종양 내에서 효과를 발휘함으로써 항암 효과가 어느 정도 되는지 보기 위한 실험이다.

(1) 종양 동물모델 제작

5% CO₂, 37℃의 환경에서 키운 B16F10 흑색종 세포를 6주된 수컷 C57BL/6 쥐에 주입하였다.

먼저, 케타민(ketamine; 100 mg/kg)과 자일라진(xylazine; 10 mg/kg)을 혼합한 마취제 50ul로 마취시킨 후, 왼쪽 뒤 옆구리에 B16F10 흑색종 세포를 피하를 통해 주사하여 종양 동물을 제작하였다. 종양의 부피가 ~100 mm³이 되었을 때 6그룹으로 나누었다.

(2) 종양 크기 확인

종양 동물모델 제작 후 종양 부피가 ~100mm³이 되었을 때 6그룹으로 나눈 날을 day0으로 정하였다. 대조군으로 PBS 50ul를, LMwMC 그룹은 약물이 함유되지 않은 저분자 메틸셀룰로오스 2mg가 든 50ul PBS를 종양 내 주사하였으며, 나머지 약물이 처리된 그룹은 동결건조 후 얻은 1mg DTX이 봉입된 저분자 메틸셀룰로오스 파우더를 각 그룹의 농도에 맞게 PBS에 녹이고 각 쥐마다 50ul씩 day0에 종양 내 주사를 하였다.(Control 그룹은 day0에 50ul의 PBS를 주사하였다. LMwMC 그룹은 2mg의 약물이 포함되지 않은 LMwMC를 PBS 50ul에 녹여서 종양 내 주사하였다. Taxotere(5mg/kg) 그룹은 v/v/v 3.125% Tween80/3.125% ethanol/96.75% PBS 의 비율로 정맥주사 제형으로 제조하여 0.1mg의 도세탁셀이 포함된 50ul를 종양 내 주사하였다. DTX loaded LMwMC (5mg/kg) 그룹은 제조된 1mgDTX loaded LMwMC 파우더를 PBS 500ul에 녹인 후 마리당 50ul를 종양 내 주사하였다. DTX loaded LMwMC (10mg/kg) 그룹은 제조된 1mgDTX loaded LMwMC 파우더를 PBS 250ul에 녹인 후 마리당 50ul를 종양 내 주사하였다. DTX loaded LMwMC (20mg/kg) 그룹은 제조된 1mgDTX loaded LMwMC 샘플 2개를 각각 PBS 125ul에 녹여서 총 250ul의 샘플을 준비하고, 마리당 50ul를 종양 내 주사하였다.) 그 후 2일 간격으로 총 14일 동안 쥐의 꼬리를 잡아 쥐를 고정시킨 후 왼쪽 뒤 옆구리에 있는 종양의 크기를 버니어캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 한 눈금이 1mm 간격으로 되어있는 버니어캘리퍼스의 주축을 사용하여 쥐의 종양 크기를 측정하였다. 종양의 장축과 단축을 측정 후, 하기 수학식 3으로 종양의 부피를 측정하였다.

[수학식 3]

종양의 부피(mm³) =

(a: 장축, b: 단축)

도 15의 데이터는 각 그룹에 해당하는 5마리의 종양 크기의 평균값을 나타낸 것이다.

그 결과, 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하였을 때 저분자 메틸셀룰로스 마이셀에 항암제가 봉입된 제형이 우수한 항암 효과를 확인하였으며, 기존 DTX의 의약품 Taxotere와 비교하였을 때도 저분자 메틸셀룰로스 마이셀에 항암제가 봉입된 제형이 우수한 항암 효과를 확인하였다.

(3) 체중 변화 확인

day0에 종양 내 주사 후, 2일 간격으로 총 14일 동안 각 쥐를 전자저울에 올려둔 뒤 측정되는 값을 관찰하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 대조군은 종양에 의한 스트레스 및 생체 내 손상으로 인해 몸무게 감소하였다. 반면에, 치료군(저분자 메틸셀룰로스 마이셀에 항암제가 봉입된 제형)의 경우에는 특별한 독성 없이 정상적인 몸무게 유지하였다.

(4) 생존율 확인

day0에 종양 내 주사 후, 22일 동안 생존율을 하루 간격으로 일정한 시간(오후 3시)에 관찰하였다.

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하였을 때 치료군(저분자 메틸셀룰로스 마이셀에 항암제가 봉입된 제형, 5, 10, 20 mg/kg)은 농도에 따라 더 높은 생존율을 보였다.

실시예 6: 신장 독성시험

본 연구에서는 평균분자량 8.5kDa MC의 마우스 단회 정맥투여 독성 자료를 얻기 위해, 500mg/kg, 250mg/kg 및 125mg/kg투여군을 중간 및 저용량 투여군으로 설정하여, 수컷 마우스에 단회 정맥 투여 독성 실험을 실시하였다. 관찰기간은 2주이며, 임상 증상, 체중 변화, 신장의 부검소견, 신장 중량, 신장의 조직병리학적 변화를 관찰하였다.

평균 분자량 8.5kDa MC의 수컷 마우스 단회 정맥 투여 독성을 평가한 결과, 8.5kDa MC 500mg/kg 투여군에 국한되어, 1례(1/5; 20%)의 사망례가 투여 10일 후에 나타났으며, 250mg/kg, 125mg/kg 투여군에서 사망례는 14일간의 실험기간 동안 나타나지 않았다[도 19].

또한, 다음 표 2는 정맥주사 2주 후에 장기들을 부검한 결과를 정리한 표이며, 각각의 값들은 ‘이상이 관찰된 동물 수/그룹 내 총 동물 수‘를 의미한다(정상군의 5/5는 정상의 동물 수/그룹 내 총 동물 수를 의미한다.). 특히, 125mg/kg 투여군에서는 신장 변색 및 위축 소견 등의 부검 소견 및 세뇨관 국소 괴사 및 섬유화 소견 등의 조직 병리학적 변화 등이 확인되지 않아 신장 독성이 없는 것으로 확인되었다.

그룹	Vehicle control	8.5kDa MC 처리: 125mg/kg
신장
Normal	5/5	5/5
DC-Atrophy	0/5	0/5
1+	0/5	0/5
3+	0/5	0/5

*정도=1+: 약함, 2+:중간, 3+:심함

실시예 7: 저분자 메틸셀룰로오스 마이셀의 in vivo 약효 확인(정맥 주사)

(1) 종양 동물모델 제작

5% CO₂, 37℃의 환경에서 키운 B16F10 흑색종 세포를 6주된 수컷 C57BL/6 쥐에 주입하였다.

먼저, 케타민(ketamine; 100 mg/kg)과 자일라진(xylazine; 10 mg/kg)을 혼합한 마취제 50ul로 마취시킨 후, 왼쪽 뒤 옆구리에 B16F10 흑색종 세포를 피하를 통해 주사하여 종양 동물을 제작하였다. 종양의 부피가 ~100 mm³이 되었을 때 4그룹으로 나누었다.

(2) 정맥 주사 및 종양 크기 확인

종양 동물모델 제작 후 종양 부피가 ~100mm³이 되었을 때 4그룹으로 나눈 날을 day0으로 정하였다. 종양내 주사와 달리 정맥 주사는 한번에 100ul씩 주사하였으며, day0부터 3일 간격으로 2주동안 총 5번 일정한 시간(오후 3시)에 그룹 당 4마리를 주사하였다. control 그룹은 PBS 100ul를, LMwMC그룹은 약물이 함유되지 않은 저분자 메틸셀룰로오스 4mg가 든 100ul PBS를 3일에 한번 간격으로 2주동안 총 5번 정맥 주사하였으며, Taxotere그룹은 0.1mg의 도세탁셀이 포함된 100ul(3.125ul Tween80, 3.125ul ethanol, 93.75ul PBS) 용액을 3일 간격으로 2주동안 총 5번 정맥 주사하였다. v/v/v 3.125% Tween80/3.125% ethanol/96.75% PBS의 비율로 제조하여 0.1mg의 도세탁셀이 포함된 100ul solution을 3일 간격으로 2주 동안 총 5번 정맥 주사하였다. DTX loaded LMwMC(5mg/kg)그룹은 제조된 1mgDTX loaded LMwMC 파우더를 PBS 1000ul에 녹인 후 마리당 100ul를 3일 간격으로 2주동안 총 5번 정맥 주사하였다. 쥐의 종양 크기 확인은 정맥 주사하는 날과 동일하게 3일 간격으로 총 14일 동안 쥐의 꼬리를 잡아 쥐를 고정시킨 후 왼쪽 뒤 옆구리에 있는 종양의 크기를 버니어캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 한 눈금이 1mm 간격으로 되어있는 버니어캘리퍼스의 주축을 사용하여 쥐의 종양 크기를 측정하였다. 종양의 장축과 단축을 측정 후, 하기 수학식 3으로 종양의 부피를 측정하였다.

[수학식 3]

종양의 부피(mm³) =

(a: 장축, b: 단축)

도 20의 데이터는 각 그룹에 해당하는 4마리의 종양 크기의 평균값을 나타낸 것이다.

그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하였을 때 저분자 메틸셀룰로스 마이셀에 항암제가 봉입된 제형이 우수한 항암 효과를 확인하였으며, 기존 DTX의 의약품 Taxotere와 비교하였을 때도 저분자 메틸셀룰로스 마이셀에 항암제가 봉입된 제형이 우수한 항암 효과를 확인하였다. 또한, 도 22에서 보이듯이 Taxotere그룹은 자체 독성이 심하여 항암 효과가 있더라도 생존율이 낮게 관찰되었다.

(3) 체중 변화 확인

쥐의 체중 변화 확인은 정맥주사하는 날과 동일하게 3일 간격으로 총 14일 동안 각 쥐를 전자저울에 올려둔 뒤 측정되는 값을 관찰하였다.

그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, Taxotere그룹은 자체의 독성으로 인해 몸무게가 약 15% 감소하였다. 반면에, 치료군(저분자 메틸셀룰로스 마이셀에 항암제가 봉입된 제형)의 경우에는 특별한 독성 없이 정상적인 몸무게를 유지하였다.

(4) 생존율 확인

day0에 정맥주사 후 생존율을 하루 간격으로 일정한 시간(오후 3시)에 관찰하였다.

그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, Taxotere 그룹의 독성에 의한 높은 사망률에 비해 치료군 에서는 관찰기간 동안 모든 쥐가 생존하였다.

따라서, Taxotere 그룹에 비해 DTX-loaded LMwMC그룹이 낮은 독성과 함께 더 높은 항암 효과를 보임을 확인하였다.

Claims (13)

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4. 마이셀 입자 형태의 중량 평균 분자량 8.5 kDa인 메틸셀룰로오스 및 난용성 약물을 20 : 1의 중량비로 포함하는 서방형 비경구 난용성 약물 전달용 조성물.
   
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6. 제 4 항에 있어서,
   상기 비경구는 근육내, 복막내, 복부내, 피하, 정맥 또는 동맥인 조성물.
   
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8. 중량 평균 분자량 8.5 kDa인 메틸셀룰로오스로 이루어진 마이셀 내에 난용성 약물이 담지되고, 중량 평균 분자량 8.5 kDa인 메틸셀룰로오스 및 난용성 약물을 20 : 1의 중량비로 포함하는 난용성 약물 전달체..
   
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12. 제 8 항에 있어서,
    상기 약물의 봉입율(총 약물량 대비 봉입된 약물량)이 60% 내지 90%인 생리활성물질 전달체.
    
13. 마이셀 입자 형태의 중량 평균 분자량 8.5 kDa인 메틸셀룰로오스 및 난용성 약물을 20 : 1의 중량비로 포함하는 피부 외용제.

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